CN1659438A

CN1659438A - G蛋白偶联受体的配体与方法

Info

Publication number: CN1659438A
Application number: CN038131234A
Authority: CN
Inventors: Y·蒋; F·L·张; N·J·穆尔戈罗; L·罗; J·S·西蒙
Original assignee: Schering Corp
Current assignee: Merck Sharp and Dohme Corp
Priority date: 2002-04-12
Filing date: 2003-04-10
Publication date: 2005-08-24
Anticipated expiration: 2023-04-10
Also published as: US8133980B2; JP2010252805A; US7338772B2; CA2481508A1; AU2003221878A1; EP1532446B1; US7807390B2; EP1532446A4; WO2003087134A3; ATE545866T1; US20030223992A1; EP1532446A2; JP2005528894A; JP4594623B2; JP2010279373A; US20080138348A1; CN1324047C; JP5284313B2; WO2003087134A2; US20110020354A1

Abstract

本发明涉及RF－酰胺肽及其在治疗、预防和治愈神经障碍和代谢紊乱中的用途。本发明也涉及用于调节G蛋白偶联受体的方法以及用于鉴定调节该受体的物质的方法。

Description

G蛋白偶联受体的配体与方法

本申请要求于2002年4月12日申请的、目前审理中的美国临时专利申请第60/372,640号的权益，所述专利申请通过引用全部结合到本文中。

发明领域

本发明涉及G蛋白偶联受体及结合该受体的配体的鉴定。更具体地讲，本发明涉及到利用该受体在筛选系统中鉴定该受体的激动剂和拮抗剂的方法。本发明也涉及该受体新颖的肽配体、编码这类肽配体的核酸以及制备和使用这类肽配体的方法。

发明背景

G蛋白偶联受体(GPCR)介导细胞应答各种信号分子，包括激素、神经递质和局部介质，这些分子具有结构和功能的多样性：包括蛋白质和小肽以及氨基酸和脂肪酸衍生物。

尽管结合受体的信号分子具有化学和功能的多样性，但所有的G蛋白偶联受体，根据DNA测序研究，获知其氨基酸序列具有相似的结构，且几乎肯定为进化上相关的。它们由来回穿行于脂双层七次的单个多肽链组成。这个受体家族的成员不仅已其氨基酸序列保守，而且同G蛋白的功能关系保守，即在细胞外配体存在下将信息放大传送到细胞内部。

G蛋白偶联受体是一类存在于所有细胞膜表面的重要的药物靶，并且与各种各样的治疗类别相关，包括疼痛控制和痛觉缺失、哮喘、炎症、肥胖症、癌症、心血管病、代谢病、病毒病、免疫调节疾病、胃肠疾病与中枢神经系统疾病。估计人类基因组中有超过1,000种G蛋白偶联受体具有潜在的治疗效用。虽然，GPCR在历史上已经成为有价值的药物靶，但到目前为止仅有大约200个研究透彻的GPCR具有已知的配体，其中所述仅有约一半是现在商业化药物的靶。余下的未鉴定出配体的GPCR通常被称为“孤儿GPCR”。

一种特别重要的孤儿G蛋白偶联受体是hRUP4受体，在下文称为SP9155受体。SP9155受体也曾经被称为vc-38_1、AXOR16和GP103。该受体的氨基酸序列以前例如在数个国际申请中已公开，包括PCT/US99/19351(WO 00/11015)、PCT/US99/24065(WO00/22131)、PCT/US99/23687(WO 00/31258)、PCT/US00/16869(WO00/78809)、PCT/JP00/05684(WO 01/16316)和PCT/JP00/09409(WO 01/48189)。然而，在这些公开说明书中没有公开SP9155受体的配体。SP9155受体具有与食欲肽A(orexin A)、食欲肽B和NPFF受体同源的氨基酸序列。已表明食欲肽A和B受体与代谢病如肥胖症有关(Shiraish等，(2000)Physiol.Behav.71：251-61；Mondal等，(1999)Neurosci.Lett.273：45-48和Dun等，(2000)Regul.Pept.96：65-70)。已表明NPFF受体与疼痛控制和痛觉缺失有关(Lake等，(1991)Neurosci.Lett.132：29-32；Kavaliers等，(1992)Peptides 13：603-607和Dong等，(2001)Cell 106：619-632)。因此，对SP9155受体的配体的鉴定将对开发治疗代谢紊乱和神经障碍具有潜在的作用。

神经肽是一类重要的具治疗意义的GPCR配体，在大多数生物体(包括哺乳动物)的神经系统中，这类配体用作信号分子。例如，已显示RF-酰胺神经肽具有不同的功能，包括兴奋心脏(Greenberg等，(1979)，Am.Zoologist 19：163-167和Groome等，(1994)Biol.Bull.186：309-318)、控制肌肉收缩(Bowman等，(1996)Peptides 17：381-387和Franks等，(1994)Parasitology 108：229-236)、无脊椎动物的神经调节(Brownlee等，(1995)Parasitology 111：379-384和Cottrell等，(1983)Nature 304：638-640)以及脊椎动物的抗阿片效应(Kavaliers等，(1985)Neuroendocrinology 40：533-535和Yang等，(1985)Prog.Clin.Biol.Res.192：313-322)。因此，对与神经肽如RF-酰胺结合的GPCR的鉴定也将可用于开发潜在的治疗药物。

发明概要

本发明人在前已阐明了鉴定孤儿GPCR SP9155的配体的需要，使得有方法可筛选该受体的激动剂和拮抗剂。另外，本发明人也已鉴定出SP9155的新型肽配体和编码SP9155配体的cDNA。

本发明提供一种鉴定SP9155的激动剂或拮抗剂的方法，所述方法包括下述步骤：(a)在已知量的标记SP9155配体存在下，使SP9155或其功能片段与需要测试所述激动剂或拮抗剂存在的样品接触；和(b)测量所述配体与所述受体特异性结合的量。在所述方法中，与不存在所述样品的情况下测得的结果相比，测量到所述标记配体与所述受体的结合显著降低，则所述样品被鉴定为含有激动剂或拮抗剂。优选所述配体是包含SEQ ID No：4-11或SEQ ID No：13-18中任一个的氨基酸序列的多肽。优选所述多肽是羧基末端酰胺化的。优选所述受体包含SEQ ID No：2或SEQ ID No：20的氨基酸序列。优选所述SP9155受体的来源是从表达所述受体的哺乳动物细胞中分离到的细胞膜。

本发明也提供一种鉴定SP9155受体或其功能片段的激动剂或拮抗剂的方法，所述方法包括下述步骤：(a)在已知量的SP9155配体存在下，使表达所述受体的细胞与需要测试所述激动剂或拮抗剂存在的样品接触；和(b)测量所述细胞的钙活动化。在所述方法中，与不存在所述样品的情况下测得的结果相比，测量到钙活动化显著降低，则所述样品被鉴定为含有拮抗剂；而与不存在所述样品的情况下测得的结果相比，测量到钙活动化显著增加，则所述样品被鉴定为含有激动剂。优选细胞的钙活动化如下测量：使钙与钙指示剂接触，然后测量所述指示剂的荧光，所述钙指示剂例如1-[2-氨基-5-(2，7-二氯-6-羟基-3-氧-9-呫吨基)苯氧基]-2-(2′-氨基-5′-甲基苯氧基)乙烷-N，N，N′，N′-四乙酸，五乙酰氧基甲酯(Fluor-3-AM)。优选所述配体是包含SEQ ID NO：4-11或SEQ ID NO：13-18中任一个的氨基酸序列的多肽。优选所述多肽是羧基末端酰胺化的。优选所述SP9155受体包含SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：20的氨基酸序列。

本发明提供小鼠RF-酰胺前体和人RF-酰胺前体，所述前体分别包含SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4以及SEQ ID NO：12和SEQ IDNO：13所示的氨基酸序列和核苷酸序列。人前体和小鼠前体分别包括若干个较小的内部肽，优选为抗原肽，优选包含SEQ ID NO：5-11和SEQ ID NO：12-18中任一个所示的氨基酸序列。人前体在脑、心脏和肝脏组织中表达。本发明也提供一种分离的抗原多肽，所述抗原多肽包含选自SEQ ID NO：4(人前体)和SEQ ID NO：13(小鼠前体)的氨基酸序列的7个或更多个连续残基。在优选的实施方案中，所述多肽是标记的。所述多肽可包含一个未修饰或修饰的(如酰胺化)羧基末端。本发明也包括特异性结合本发明多肽的抗体分子。

本发明也提供一种编码前体多肽(SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：13)的分离的核酸，所述核酸最好分别包含SEQ ID NO：3或SEQ IDNO：12所示的核苷酸序列。还提供一种编码抗原多肽、优选编码包含选自SEQ ID NO：4(人前体)和SEQ ID NO：13(小鼠前体)的氨基酸序列的7个或更多个连续残基的抗原多肽的分离的核酸。优选所述核酸包含SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：12所示的核苷酸序列中的21或更多个连续核苷酸。

本发明还提供包含本发明核酸的重组载体和包含所述载体的宿主细胞。

小鼠SP91 55受体(如SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20)及其任何功能片段以及包含SEQ ID NO：20所示的氨基酸序列的7个或更多个连续残基的肽和编码所述肽的核酸(如包含SEQ ID NO：19所示的核苷酸序列的21或更多个连续核苷酸的核酸)是本发明的另一方面。

本发明还提供一种制备本发明多肽的方法，所述方法包括在载体中存在的核酸表达的条件下，培养包含本发明载体的宿主细胞。优选从所述培养物中分离所述多肽。

本发明也提供一种使包含选自SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：13的氨基酸序列的7个或更多个连续残基的抗原肽与识别所述肽的抗体分子结合的方法，所述方法包括使所述肽与所述抗体分子接触的步骤。

本发明也提供一种治疗或预防患者的由SP9155受体介导的医学病症的方法，所述方法包括给予所述患者包括识别本发明多肽的抗体分子以及药学上可接受的载体的药用组合物的步骤。所述方法可以用来治疗疼痛或肥胖症等医学病症。

本发明的RF-酰胺肽尤其可用于结合并调节G蛋白偶联受体(GPCR)的活性，所述受体如人SP9155受体(如SEQ ID NO：1和2；另见WO 00/11015、WO 00/22131、WO 00/31256、WO 00/78809、WO 01/16316和WO 01/48189)或小鼠SP9155受体(如SEQ ID NO：19和20)。人SP9155受体在脑、心脏、肾脏和结肠组织中表达。本发明的RF-酰胺肽也可以用作抗原肽，以产生识别人前体和小鼠前体或其任何亚序列的抗体分子。

发明详述

试验

本发明包括发现SP91 55受体或其功能片段的激动剂和拮抗剂可用于治疗和处理多种由受体与其配体结合所介导的医学病症的试验，所述医学病症例如代谢紊乱(如肥胖症)或中枢神经系统(CNS)疾病(如疼痛)。具体地讲，本发明的SP9155受体或其功能片段和RF-酰胺肽配体能用于这类筛选方法中。本质上，这些方法包括使SP9155受体(如SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：20)或其功能片段同SP9155配体(如SEQ ID NO：4-11和SEQ ID NO：13-18中任一个或其任何亚序列)与需要测试SP9155受体激动剂或拮抗剂存在的样品接触。

“样品”或“侯选物”是指在实验或测定中评价例如激动或拮抗SP9155受体(如SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：20)或其功能片段的能力的组合物。样品可以包括小分子、肽、核苷酸、多核苷酸、亚原子微粒和放射物(如α粒子、β粒子、γ射线、X射线)和抗体分子。

拮抗剂和激动剂可以调节SP9155受体(如SEQ ID NO：2或SEQID NO：20)或其功能片段结合配体例如RF-酰胺肽(如SEQ ID NO：4-11和SEQ ID NO：13-18中任一个或其任何亚序列)的能力，和/或调节SP9155受体或其功能片段产生胞内信号(如G蛋白偶联、钙活动化)的能力。

优选两个基本类型的筛选系统，即标记配体的结合试验和“功能”分析。通过用可检测标记(如¹²⁵I或³H)标记SP9155受体的配体(如SEQ ID NO：4-11和SEQ ID NO：13-18中任一个或其任何亚序列)或已知的SP9155受体激动剂或拮抗剂，可以获得结合试验中所用的标记配体。通常，使给定量的本发明SP9155受体(如SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：20)与增量的标记配体(如³H-p52)接触，在通过洗涤除去未结合的标记配体后，测定标记配体的结合量。由于标记配体的量是增加的，因此终点是达到所有受体结合位点都被占用或被饱和。通过大量超量的未标记配体，可消除标记配体的特异性受体结合。

优选使用其中所述标记配体与所述受体的非特异性结合最小的试验系统。非特异性结合占所述标记配体总结合的量通常小于50％、优选小于15％、更优选小于10％。

术语“SP9155受体的配体”包括本发明的RF-酰胺肽，例如，如表1中所述(如SEQ ID NO：4-11或SEQ ID NO：13-18中任一个)或其任何类似物。所述术语也包括含任何来自SEQ ID NO：4或SEQ IDNO：13的7个或更多个连续氨基酸的肽(下面有讨论)。优选所述肽配体是羧基末端酰胺化的。

原则上，利用本发明的可溶性受体可实施本发明的结合试验，例如，在由标准的大肠杆菌表达系统方法制备和重折叠后，可以例如使用抗所述受体的抗体，使所得受体-标记配体复合物沉淀。随后对所述沉淀物进行洗涤，并且可以测量所述结合标记受体的量。

然而，优选将编码本发明SP9155受体的核酸转化或转染到适当的宿主细胞(例如HEK293或CHO)中，其中所述受体掺入到细胞膜中。然后可以从所述细胞中分离膜部分，作为供试验用的受体源。优选所述标记配体与未转染的宿主细胞的细胞膜部分的特异性结合可忽略不计。

本发明的结合试验可用于鉴定SP9155受体或其功能片段的激动剂和拮抗剂，因为，通常它们两者均调节所述标记配体与所述受体的结合。

在基础的结合测定中，SP9155受体激动剂或拮抗剂的鉴定方法包括下述步骤：(a)在已知量的标记SP9155受体的配体(如SEQ ID NO：4-11或SEQ ID NO：13-18中任一个或其任何亚序列)存在下，使SP9155受体(如SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：20或其功能片段)与样品接触；和(b)测量所述配体与所述受体特异性结合的量。

与不存在所述样品的情况下测得的结果相比，测量到所述配体与所述受体的结合显著降低，则所述样品可被鉴定为含有激动剂或拮抗剂。

在本发明的一个实施方案中，上述方法包括在独立的对照实验中进行的额外步骤：(c)在已知量的标记配体存在下，使SP9155受体或其功能片段与已知是SP9155受体激动剂或拮抗剂的化合物接触；和(d)测量所述标记配体与所述受体结合的量。

细胞试验或功能分析也可以用于测定样品中是否含有SP9155受体的激动剂或拮抗剂。在这些试验中，可利用公开的方法评价样品调节SP9155受体(如SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：20)介导的细胞参数的能力；这些参数包括但不限于由受体激活的胞内第二信使途径、细胞生长速率的变化、激素的分泌、钙的活动化等。这些方法的实例包括测定所述配体对以下受体介导的抑制的影响：毛喉素刺激的胞内cAMP产生(Parker等，(1995)Mol.Brain Res.34：179-189)、受体刺激的Ca²⁺活动化和促有丝分裂效应(Sethi等，(1991)Cancer Res.51：1674-1679)以及肌醇磷酸的产生和MAP激酶的诱导(Wang等，(1998)Biochemistry 37：6711-17)。在优选的实施方案中，可利用荧光成像读板仪(FLIPR)试验，测定表达SP9155受体的细胞的钙活动化，例如，Zhang等，(2001)Journal of Biol.Chem.276(11)：8608-8615中所描述的那样。一般而言，FLIPR试验包括下述步骤：(a)在已知量的SP9155受体的配体(如SEQ ID NO：4-11或13-18中任一个或其任何亚序列)存在下，使表达SP9155受体(如SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：20或其功能片段)的细胞(如HEK293细胞或CHO细胞)与样品接触；和(b)测定所述细胞的钙活动化。

将细胞暴露于钙指示剂可测定钙活动化，所述指示剂如Fluor-3-Am(Molecule Probes；Eugene，OR；1-[2-氨基-5-(2，7-二氯-6-羟基-3-氧-9-呫吨基)苯氧基]-2-(2′-氨基-5′-甲基苯氧基)乙烷-N，N，N′，N′-四乙酸，五乙酰氧基甲酯)。在Ca²⁺离子存在下，该指示剂发出荧光。通过例如用荧光成像读板仪分析所述细胞，可以对荧光进行检测。

与不存在所述样品的情况下测得的结果相比，测量到钙活动化显著降低，则所述样品可被鉴定为含有拮抗剂；而与不存在所述样品的情况下测得的结果相比，测量到钙活动化显著增加，则所述样品可被鉴定为含有激动剂。

分子生物学

本发明的多肽和核酸的氨基酸序列和核苷酸序列示于所附序列表中，而且概述于下面的表1中。

表1.本发明的多肽和核酸

多肽或多核苷酸	序列识别号
多肽或多核苷酸	序列识别号	人SP9155-核苷酸序列	SEQ ID NO：1
人SP9155-氨基酸序列	SEQ ID NO：2	人SP9155-核苷酸序列	SEQ ID NO：1

小鼠SP9155-氨基酸序列

SEQ ID NO：20

通常，前体在体内识别位点上被切割，例如被蛋白酶(如弗林蛋白酶或激素原转化酶)切割，产生包含羧基末端Arg-Phe(RF)基序的RF-酰胺肽。所述羧基末端随后可由细胞酰胺酶酰胺化，产生一个Arg-Phe-C(＝O)-NH₂(RF-酰胺)基序。具有SEQ ID NO：4-11和SEQ IDNO：13-18中任一个的氢基酸序列的肽可包含一游离的、未经修饰的羧基末端，或者优选包含酰胺化羧基末端。

标有“*”号的SEQ ID NO：5-11行括号内数字表示这些肽所来源的人前体(SEQ ID NO：4)的部分。同样，标有“*”号的SEQ ID NO：14-18行括号内数字表示这些肽所来源的小鼠前体(SEQ ID NO：13)的部分。标有号的括号内数字表示编码所示肽的相应人或小鼠前体基因的核苷酸。

虽然SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：12所示的核苷酸序列是脱氧核糖核苷酸，但包含相应核糖核苷酸序列的核酸也在本发明的范围之内。包括SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：12的反义链或其任何亚序列的核酸也在本发明的范围之内。

在人SP9155基因中，已鉴定出若干个编码单核苷酸多态性(cSNP)。每个cSNP(即g154a-G52S；t181g-F61V；t206g-V69G；g208t-V70L；t447g-H149Q；g748t-G250C；t1031c-L344S；c1111t-R371W；g1162a-G388R和c1228t-L410F)示于所附序列表中。此外，在人前体中，已鉴定出若干个cSNP。每个也示于所附序列表中的cSNP概述于下面的表2中。

表2.人前体的编码单核苷酸多态性

cSNP(SEQ ID NO：3)	氨基酸序列变异(SEQ ID No：4)
cSNP(SEQ ID NO：3)	氨基酸序列变异(SEQ ID No：4)	76：g或c	26：Gln或Glu

103：g或a	35：Arg或Gly
103：g或a	35：Arg或Gly	139：c或t	47：Pro或Ser
203：t或a	68：His或Leu	139：c或t	47：Pro或Ser
203：t或a	68：His或Leu	239：a或g	80：Gly或Glu

依照本发明，可使用本领域内的常规分子生物学技术、微生物学技术和重组DNA技术等。这些技术在文献中已作充分地说明。参见如Sambrook，Fritsch & Maniatis， Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，New York(本文中″Sambrook等，1989″)； DNA Cloning：A Practical Approach，第I卷和第II卷(D.N.Glover主编，1985)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait主编，1984)； Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames和S.J.Higgins编著(1985))； Transcription And Translation(B.D.Hames和S.J.Higgins编著(1984))； Animal Cell Culture(R.I.Freshney主编，(1986))；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press，(1986))；B.Perbal， A Practical Guide To Molecular Cloning(1984)；F.M.Ausubel等(编著)， Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，Inc.(1994)。

对于本发明的目的，术语“RF-酰胺”或“RF-酰胺肽”或“RF-酰胺多肽”包括本发明的任何肽(例如参见表1)或其任何形式的任何类似物。例如，所述术语包括含酰胺化羧基末端和含未修饰的羧基末端的肽。

术语“SP9155”或“SP9155受体”包括人受体(如SEQ ID NO：1和2)和小鼠受体(如SEQ ID NO：19和20)。

术语“受治疗者”或“患者”是指任何生物体，优选动物，更优选哺乳动物(如小鼠、大鼠、兔、牛、狗、猫、牛、黑猩猩、大猩猩)，最优选人。

本发明包括本发明RF-酰胺肽的重组形式。术语“重组体”可表示天然并不邻接且彼此融合在一起的两种或更多种的核酸或蛋白。所述术语也可以指因人为干涉而改变(如翻译后修饰或突变)的核酸或蛋白。例如，野生型密码子可被编码相同氨基酸残基的冗余密码子或保守置换所取代，同时引入或去除核酸序列识别位点。同样，可以将编码所需功能的核酸区段融合在一起，产生自然界中并不存在的、编码所需功能组合的一种遗传实体。虽然限制性酶识别位点通常是所述人工操作的靶，但是也可以设计引入其他的位点特异性靶，如启动子、DNA复制位点、调节序列、控制序列或其它有用的特征。如下所述，也可掺入用于检测或纯化的编码附加表位的序列。

“多核苷酸序列”、“核酸序列”或“核苷酸序列”是核酸如DNA或RNA中连续的两个或更多个核苷酸碱基(也称为“核苷酸”)。

本发明包括表1中所述的任何多核苷酸的核酸片段(如SEQ IDNO：3或12)。核酸“片段”包括例如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：12中任一个的以下数目的连续核苷酸：至少约12、15、18或21(如22、23或24)，通常至少约25(如26、27、28、29、30、31、32、33或34)，优选至少约35(如36、37、38、39、40、41、42、43或44)，更优选至少约45(如46、47、48、49、50、51、52、53或54)，最优选至少约55或更多个(如56、57、58、59、60、100、200、300、400、500、1000或1200)。

短核酸片段(如介于约10个核苷酸和约100个核苷酸之间)也可以被称为“寡核苷酸”。寡核苷酸能用作PCR扩增的引物。本文所用的DNA“扩增”可表示使用聚合酶链式反应(PCR)使DNA序列混合物中的特殊DNA序列的浓度增加。有关PCR的描述，参见Saiki等，(1988)Science 239：487。通过掺入如³²P-核苷酸、³H-核苷酸、¹⁴C-核苷酸、³⁵S-核苷酸或是已共价缀合了标记(如生物素)的核苷酸，可以标记寡核苷酸和核酸片段。在一个实施方案中，标记的寡核苷酸可用作检测核酸存在的探针。在另一个实施方案中，寡核苷酸(可标记它们中的一个或两个)可用作PCR引物，以克隆全长基因或者基因片段，或者检测核酸的存在。通常，寡核苷酸可合成制备，优选在核酸合成仪上合成。

“蛋白质序列”、“肽序列”或“多肽序列”或“氨基酸序列”可以指蛋白质、肽或多肽中连续的两个或更多个氨基酸。

“蛋白质”、“肽”或“多肽”包括氨基酸的连续序列段。本发明的优选肽包括在表1中所述的肽及其变异体(如羧基末端酰胺化变异体)和片段。所述片段优选包含SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：13中任一个以下数目的氨基酸残基：至少约4、5、6或7(如8、9、10或11)，优选至少约12(如13、14、15、16、17、18或19)，更优选至少约20(如21、22、23、24、25、26、27、28或29)，最优选至少约30(如31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、50、60、70、80、90、100、124或136)或更多个。如以下所讨论的，所述肽可用作抗原，以产生识别RF-酰胺肽前体肽(如SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：13)的抗体分子或其任何片段。

本发明的多肽可由完整肽的蛋白酶剪切、化学合成或应用重组DNA技术制备，并且不限于由蛋白酶切割位点描述的多肽。所述多肽用作抗原，可单独或者交联或缀合到载体分子，以使其更具免疫原性，诱发抗体及其片段的产生。抗体可用于如供免疫亲和纯化等用的免疫测定中。

术语“分离的核酸”或“分离的多肽”可分别指如RNA或DNA分子或混合聚合物的核酸或多肽，所述核酸或多肽可部分或完全地从其它的成分中，通常从细胞或重组DNA表达系统中分离得到。这些成分包括但不限于细胞膜、细胞壁、核糖体、聚合酶、血清组分和侧翼基因组序列。因而所述术语包括已从天然环境中取出的核酸、也包括重组体或克隆DNA分离物以及化学合成的类似物或异种系统生物合成的类似物。

分离的核酸或多肽最好是基本同源的分子成分，但可以包含若干异质成分。

术语“大致纯的”可指RF-酰胺肽、核酸或其它物质不含其它污染蛋白质、核酸及其它来自原始生物体或重组DNA表达系统的生物学物质。纯度可由标准方法测定，通常纯度超过至少约50％，优选至少约75％，更优选至少约90％，最优选至少约95％(如约100％)。纯度评价基于质量或摩尔数。

本发明还包括其氨基酸或核苷酸序列分别与表1中叙述的蛋白质和核酸序列有序列同一性或相似性的蛋白质和核酸。序列“同一性”是指相比较的两个核苷酸序列或氨基酸序列之间完全匹配。序列“相似性”或“同源性”是指相比较的两个多肽的氨基酸间的完全匹配和不完全相同的、生物化学上相关的氨基酸之间的完全匹配。生物化学相关的氨基酸共享相似的性质并可互换。具有相似性质并可互换的氨基酸是本领域众所周知的。例如，可互换的极性/亲水性氨基酸包括天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、半胱氨酸、苏氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸和谷氨酸；可互换的非极性/疏水性氨基酸包括甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸；可互换的酸性氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；可互换的碱性氨基酸包括组氨酸、赖氨酸和精氨酸。

可通过已知方法容易地计算出序列“同一性”和“相似性”，所述已知方法包括但不限于以下文献中介绍的那些方法：( Computational Molecular Biology，Lesk，A.M.主编，Oxford UniversityPress，New York，1988； Biocomputing：Informatics and Genome Projects，Smith，D.W.主编，Academic Press，New York，1993； Computer Analysis of Sequence Data，第I部，Griffin，A.M.和Griffin，H.G.主编，HumanaPress，New Jersey，1994； Sequence Analysis in Molecular Biology，yonHeinje，G.主编，Academic Press，1987；和 Sequence Analysis Primer，Gribskov，M.和Devereux，J.主编，M Stockton Press，New York，1991；和Carillo，H.等，(1988)，SIAM J.Applied Math.，48：1073。设计优选同一性测定方法，以给出所测序列间的最大匹配。同一性和相似性的测定方法已编纂成公众可得到的计算机程序。测定两序列间同一性和相似性的优选计算机程序方法包括但不限于GCG程序包(Devereux，J.等，(1984)Nucleic Acids Research 12(1)：387)、BestFit、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul，S.F.等，(1990)J.Mol.Biol.215：403-410。所述BLASTX程序公众可得自NCBI以及其它资源( BLAST Manual，Altschul，S.等，NCBI NLM NIH Bethesda，MD 20894；Altschul，S.等，(1990)J.Mol.Biol.215：403-410。也可以用熟知的史密斯沃特曼(Smith Waterman)算法来测定同一性。

多肽序列比较的优选参数包括下列参数：

1)算法：Needleman等，(1970)，J.Mol.Biol.48：443-453

比较矩阵：BLOSSUM62，得自Hentikoff等，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.89：10915-10919

空位罚分(Gap Penalty)：12

空位长度罚分(Gap Length Penalty)：4

具备这些参数的有用程序称为“gap”程序，公众可得自GeneticsComputer Group，位于Madison，WI。上述参数为肽比较的默认参数(连同无末端空位罚分一起)。

使用gap程序，优选的多核苷酸比较参数包括下列参数：

1)算法：Needleman等，(1970)J.Mol.Biol.48：443-453

比较矩阵：匹配＝+10，错配＝0

空位罚分：50

空位长度罚分：3

本发明包括编码表1中描述的多肽(如SEQ ID NO：4-11和SEQ IDNO：13-18)的核酸(如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：12)、其片段(上文所讨论的)及与其杂交的核酸。核酸优选在低严格性条件下杂交，更优选在中等严格性条件下杂交，最优选在高严格性条件下杂交。在适宜的温度和溶液离子强度条件下，当一条单链核酸分子可退火至另一条核酸分子时，所述核酸分子可与另一核酸分子如cDNA、基因组DNA或RNA“杂交”(参见Sambrook等，同上)。温度和离子强度条件决定杂交的“严格性”。通常，低严格性杂交条件可以是55℃、5X SSC、0.1％SDS、0.25％乳汁并且不含甲酰胺；或30％甲酰胺、5X SSC、0.5％SDS。通常，中等严格性杂交条件与低严格性条件相似，只是在40％甲酰胺、5X SSC或6X SSC条件下进行杂交。高严格性杂交条件与低严格性条件相似，只是可以在50％甲酰胺、5XSSC或6X SSC和任选在较高的温度(如57℃、59℃、60℃、62℃、63℃、65℃或68℃)下进行杂交。通常，SSC为0.15M氯化钠和0.015M柠檬酸钠。杂交需要两核酸链含有互补序列，虽然根据杂交的严格性，碱基间的错配是可能的。适宜的核酸杂交严格性取决于核酸的长度和互补的程度，所述程度的可变度是本领域众所周知的。两个核苷酸序列间的相似性或同源性程度越高，核酸可杂交的严格性也越高。通常，在至少约30个核苷酸的序列段上有至少约55％同一性，优选在至少约25个核苷酸内有至少约65％同一性，更优选在约20个核苷酸或以上有至少约75％到约95％或更高的同一性时，可发生选择性杂交。对于长度大于100个核苷酸的杂交体，已有计算其解链温度的方程式(参见Sambrook等，同上，9.50-9.51)。对于较短核酸即寡核苷酸的杂交，错配发生的位置变得更加重要，且寡核苷酸的长度决定它的特异性(参见Sambrook等，同上，11.7-11.8)。

需要进一步指出的是，编码两条多肽的两条核酸是基本相同的，即第一条核酸编码的多肽与第二条核酸编码的多肽具有免疫学交叉反应性。通常，如这两条肽主要由于保守取代而不同时，可认定一条多肽与第二条多肽是基本相同。

本发明也包括含核苷酸序列的核酸和含氨基酸序列的多肽，其序列与表1中的参比核苷酸序列和参比氨基酸序列有至少约70％同一性，优选至少约80％同一性，更优选至少约90％同一性，最优选至少约95％同一性(如95％、96％、97％、98％、99％、100％)。本发明也包括含氨基酸序列的多肽，其序列与表1中的参比氨基酸序列(如SEQ ID NO：4-11和SEQ ID NO：13-18)有至少约70％相似性或同一性，优选至少约80％相似性或同一性，更优选至少约90％相似性或同一性，最优选至少约95％相似性或同一性(如95％、96％、97％、98％、99％、100％)。此外，本发明包括编码多肽的核酸，这些多肽的氨基酸序列与那些在表1中所述的氨基酸序列(如SEQ ID NO：4-11和SEQID NO：13-18)有至少约70％相似性或同一性，优选至少约80％相似性或同一性，更优选至少约90％相似性或同一性，最优选至少约95％同一性或相似性(如96％、97％、98％、99％、100％)。

某些自然的变异体与本发明的RF-酰胺肽的氨基酸序列有大致氨基酸序列同源性。在本发明中，氨基酸序列同源性或序列同一性可由优化残基匹配，必要时，引入所需的空位来决定。通常，同源氨基酸序列在各自相应序列中包括等位基因、多态性和种间变异。通常，同源蛋白质或肽与所述RF-酰胺肽的氨基酸序列的同源性将由约25-100％(如果可以引入空位的话)到约50-100％(如果包括保守取代)。所观察到的同源性通常是至少约35％，优选至少约50％，更优选至少约75％，最优选至少约80％或以上。参见Needleham等，(1970)J.Mol.Biol.48：443-453；Sankoff等， Time Warps，String Edits，and Macromolecules：The Theory and Practice of Sequence Comparison，1983，Addison-Wesley，Reading，MA；及IntelliGenetics公司软件包，MountainView，CA和the University of Wisconsin Genetics Computer Group，Madison，WI。

可用标准方法制备编码RF-酰胺肽或其片段的核酸。例如可利用诸如以下的方法化学合成DNA：Matteucci等的亚磷酰胺固相支持法(1981)(J.Am.Chem.Soc.103：3185)、Yoo等的方法(1989)(J.Biol.Chem.764：17078)或其它熟知的方法。如下所述，也可按顺序连接一系列含成对合成寡核苷酸的寡核苷酸盒合成DNA。

当然，由于遗传密码的简并性，许多不同的核苷酸序列可以编码本发明的RF-酰胺肽。选择可优化在原核或真核系统中表达的密码子。当然，本发明也包括这样的简并变异体。此外，可容易地通过核苷酸取代、核苷酸缺失、核苷酸插入和核苷酸序列段倒位等，修饰编码本发明的RF-酰胺肽的核酸。这样的修饰可产生可编码其免疫原性或抗原活性与野生型肽相同的抗原的新的DNA序列。这些修饰序列可用于制备野生型或突变型肽或增强重组DNA系统的表达。

本发明的核酸可与控制转录(如启动子；如在下文所讨论的)、翻译(如Kozak序列，(Kozak(1991)J.Biol.Chem.255：19867-19870或Kozak(1991)J.Cell.Biol.115：887-903)和/或DNA复制(如复制起点如ori)的DNA序列段在操作上连接。

当核酸指导RNA聚合酶介导的转录编码序列成为RNA、优选mRNA，随后RNA可被剪接(如果含有内含子的话)且任选翻译成由所述编码序列编码的蛋白时，所述核酸序列“处于转录和/或翻译控制序列的控制之下”、“与转录和/或翻译控制序列功能性连接”、“与转录和/或翻译控制序列在操作上连接”和/或“与转录和/或翻译控制序列在操作上相关”。

术语“表达”是指允许或促使基因即RNA或DNA序列中的信息变成表现形式；如通过激活参与相应基因转录和翻译的细胞功能而产生蛋白质。或者，基因可在体外表达；含有所述基因的DNA可由重组RNA聚合酶进行转录，并且任选由如兔网织红细胞裂解物进行翻译(Promega Corporation，Madison，WI)。DNA序列可在细胞内或由细胞表达，或者在体外表达，产生“表达产物”如RNA(如mRNA)和蛋白质。表达产物本身也可以称为是“已表达”的。

插入了本发明核酸的载体包括微生物质粒、病毒、噬菌体、整合型DNA片段及其它能将核酸导入宿主基因组的媒介物。质粒为最常用载体的形式，然而具有相似功能而且本领域已知或将为本领域所知的所有其它形式载体也适用本发明。参见例如Pouwels等，(1985和增刊) Cloning Vectors：A Laboratory Manual，Elsevier，N.Y.，和Rodriguez等(主编)， Vectors：A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses，1988，Buttersworth，Boston，MA。

如果DNA和载体的末端都包含匹配的限制性位点，则可容易地完成将编码RF-酰胺肽或编码SP9155受体或其功能片段的DNA插入载体中。如果DNA不能插入到载体中，则可能有必要修饰DNA和/或载体的末端，所述修饰可通过重新消化限制性内切核酸酶切割产生的单链DNA的突出端而产生平头末端，或者通过用适当的DNA聚合酶(如Klenow)补平单链末端达到同样的效果。或者，所需的位点可由在末端上连接核苷酸序列(接头)而产生。这些接头可包含决定所需限制性位点的特异性寡核苷酸序列。利用聚合酶链式反应(PCR)也能产生限制性位点。参见例如Saiki等，Science 239：487(1988)。如果有必要，经切割的载体和DNA片段也可通过同聚物加尾反应进行修饰。

本发明中使用的重组表达载体通常为自我复制型DNA或RNA构建体，其包含编码RF-酰胺肽或编码SP9155受体或其功能片段的核酸，通常在匹配宿主细胞中与能够调节核酸表达的合适遗传控制元件在操作上连接。遗传控制元件可包括原核启动子系统或真核启动子表达控制系统，通常包括转录启动子、任选控制转录起始的操纵子、提高mRNA表达水平的转录增强子、编码合适核糖体结合位点的序列以及终止转录和翻译的序列。可以用来控制基因表达的启动子包括但不限于色氨酸(trp)启动子系统(Goeddel等，(1980)NucleicAcids Res.8：4057)、λP_L启动子系统(Shimatake等，(1981)Nature292：128)、巨细胞病毒(CMV)启动子(美国专利第5,385,839号和第5,168,062号)、SV40早期启动子区(Benoist等，(1981)Nature290：304-310)、劳氏肉瘤病毒3′长末端重复中所包含的启动子(Yamamoto等，Cell(1980)22：787-797)、疱疹胸苷激酶启动子(Wagner等，(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：1441-1445)、金属硫蛋白基因调节序列(Brinster等，(1982)Nature 296：39-42)、β-内酰胺酶启动子(Villa-Komaroff等，(1978)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75：3727-3731)或tac启动子(DeBoer等，(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：21-25)；另见《科学美国人》之“重组细菌的有益蛋白质”(1980)242：74-94；酵母或其它真菌的启动子元件如Gal4启动子、ADC(醇脱氢酶)启动子、PGK(磷酸甘油激酶)启动子或碱性磷酸酶启动子也可与本发明核酸在操作上连接。表达载体也可包含复制起点，使得所述载体可以在宿主细胞内独立复制。

术语“宿主细胞”可指任何有机体的任何细胞，以任何方式选择、修饰、转染、转化、生长、使用或操作，而由细胞产生如基因、DNA或RNA分子、载体、蛋白质或酶等表达物或复制物。优选的宿主细胞包括细菌细胞如大肠杆菌(E.coli)(如BL21(DE3)、DH5或HB101)和真核细胞(如HEK293细胞或CHO细胞)。

术语“转化”可指将核酸(如SEQ ID NO：3或12、其片段或编码SEQ ID NO：4-11和SEQ ID NO：13-18中任一个或其任何片段的核酸)导入细胞。导入的基因或序列可被称为“克隆”。接受导入的DNA或者RNA的宿主细胞必定是“已转化的”且是“转化子”或者是“克隆”。导入宿主细胞的DNA或RNA可来自任何来源，包括与宿主细胞同属或同种的细胞，或者不同属或不同种的细胞。

编码本发明RF-酰胺肽的核酸可通过常规方法在原核细胞或真核细胞中进行表达。虽然大肠杆菌宿主细胞是最常用的原核系统，但许多其它的细菌如多种假单胞菌属(Pseudomonas)菌株和芽孢杆菌属(Bacilus)菌株是本领域已知的，也可使用。可表达编码RF-酰胺肽或SP9155受体或其功能片段的核酸的合适宿主细胞包括原核细胞和高等真核细胞。原核细胞包括革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌，如大肠杆菌和枯草芽孢杆菌(B.subtilis)。高等真核生物包括建立的动物细胞的组织培养细胞系、非哺乳动物来源的如昆虫细胞和鸟类细胞、哺乳动物来源的如人类、灵长类和啮齿动物的细胞。

原核宿主-载体系统包括各种各样的许多不同种的载体。用于扩增DNA的代表性载体是pBR322或其许多衍生物(如pUC 18或19)。可以用于表达RF-酰胺肽的载体包括但不限于包含以下启动子的载体：lac启动子(pUC系列)；trp启动子(pBR322-trp)；Ipp启动子(pIN系列)；λ-pP或pR启动子(pOTS)；或者杂合启动子如ptac(pDR540)。参见Brosius等，“应用λ-，trp-，lac-和Ipp-衍生启动子的表达载体”，载于Rodriguez和Denhardt(主编) Vectors：A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses，1988，Buttersworth，Boston，第205-236页。本发明的肽可在大肠杆菌/T7表达系统中高水平表达，所述表达系统公开于美国专利第4,952,496号、第5,693,489号和第5,869,320号和Davanloo，P.等，(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：2035-2039；Studier，F.W.等，(1986)J.Mol.Biol.189：113-130；Rosenberg，A.H.等，(1987)Gene 56：125-135；和Dunn，J.J.等，(1988)Gene 68：259。

也可用高等真核组织培养细胞重组制备本发明的RF-酰胺肽。虽然可以使用任何高等真核组织培养细胞系，包括昆虫杆状病毒表达系统，然而优选哺乳动物细胞。所述细胞的转化或转染以及繁殖已成为常规方法。有用的细胞系实例包括人胚肾(HEK293)细胞、HeLa细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系、幼龄大鼠肾(BRK)细胞系、昆虫细胞系、鸟类细胞系和猴(COS)细胞系。所述细胞系的表达载体通常包括复制起点、启动子、翻译起始位点、RNA剪切位点、聚腺苷酸化位点和/或转录终止位点。这些载体还常包含有选择基因或扩增基因。合适表达载体可以是质粒、病毒或携带的启动子来源于以下病毒的反转录病毒：例如腺病毒、SV40、细小病毒、痘苗病毒或巨细胞病毒。合适表达载体的代表性实例包括PCR^3.1、pCDNA1、pCD(Okayama等，(1985)Mol.Cell Biol.5：1136)、pMClneo Poly-A(Thomas等，(1987)Cell 51：503)、pREP8、pSVSPORT及其衍生物以及杆状病毒载体如pAC373或pAC610。

本发明也包括含本发明多肽和多核苷酸以及另一种多肽或多核苷酸部分的融合物，所述部分可被称为“标志”。本发明的融合物可以包含表1所述的任何多核苷酸或多肽或其任何亚序列或片段。可以方便地构建本发明的融合多肽，例如将本发明的多核苷酸或其片段插入到如上所述的表达载体中。本发明的融合物可以包含便于纯化或检测的标志。所述标志包括谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、六组氨酸(His6)标志、麦芽糖结合蛋白(MBP)标志、血凝素(HA)标志、纤维素结合蛋白(CBP)标志和myc标志。也可用可检测标记或标志如³²P、³⁵S、¹⁴C、³H、^99mTc、¹¹¹In、⁶⁸Ga、¹⁸F、¹²⁵I、¹³1I、¹¹³mIn、⁷⁶Br、⁶⁷Ga、^99mTc、¹²³I、¹¹¹In和⁶⁸Ga等标记本发明的多肽。构建和使用所述的融合物的方法在本领域中是非常便利和熟知的。

多肽中的修饰(如翻译后修饰)常常是其功能如何形成的原因。例如，对于宿主中表达克隆基因制备的多肽，修饰的性质和程度，很大部分将由宿主细胞的翻译后修饰能力和存在于多肽的氨基酸序列中的修饰信号决定。例如，众所周知的是，糖基化通常不会在细菌宿主如大肠杆菌中发生。因此，如果需要糖基化，可在能进行糖基化的宿主中表达多肽，通常为真核细胞。昆虫细胞常常进行翻译后糖基化，这点与哺乳动物细胞的糖基化是一样的。因为这一原因，已经开发出昆虫细胞表达系统，以有效地表达具有天然糖基化形式的哺乳动物蛋白质。或者，去糖基化酶可以用来去除在真核表达系统中制备期间连接的糖。

其它的修饰也包括在多肽羧基末端添加酰胺或脂族酯。本发明也包括含有修饰的RF-酰胺肽的类似物，所述修饰例如掺入非天然氨基酸残基或磷酸化氨基酸残基如磷酸酪氨酸、磷酸丝氨酸或磷酸苏氨酸残基。其它可能的修饰包括磺化、生物素化或其添加其它部分，特别是那些分子形态与磷酸酯基团相似的部分。

本发明的肽也可环化。具体地讲，本发明肽的氨基和羧基末端残基或两个内部残基可以融合产生环化肽。优选可在所述肽的羧基末端游离时进行环化。当氨基末端游离时也可进行肽的环化。肽的环化方法在本领域中是容易的和非常熟知的；例如参见Gurrath等，(1992)Eur.J.Biochem 210：911-921。

本发明的RF-酰胺肽可以添加聚合物以增加所述肽在患者体内的半寿期。优选的聚合物包括聚乙二醇(PEG)(如分子量为2kDa、5kDa、10kDa、12kDa、20kDa、30kDa或40kDa的PEG)，葡聚糖和单甲氧基聚乙二醇(mPEG)。

人们将会认识到，在特定多肽的数个位点上，可以存在相同或不同程度的同一类型修饰。另外，特定的多肽也包括多种类型的修饰。

本发明的RF-酰胺肽的类似物可由化学合成或者利用以下方法制备：定点诱变(Gillman等，(1979)Gene 8：81；Roberts等，(1987)Nature，328：731或Innis(主编)，1990， PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications，Academic Press，New York，NY，或聚合酶链式反应方法PCR；Saiki等，(1988)Science 239：487，如Daugherty等示例的修饰编码肽的核酸(1991)(Nucleic Acids Res.19：2471)等方法。可以设想添加用于纯化或检测重组产物的附加表位。

其它的类似物可通过利用本领域已知的试剂进行制备，此类试剂的用途在于通过活性侧基与蛋白质交联。优选的交联剂衍生化位点是游离的氨基或羧基、糖部分和半胱氨酸残基。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”包含所有这样的修饰，特别是那些由宿主细胞表达多核苷酸合成的多肽中存在的修饰。

蛋白质纯化

通常，在培养物(如液体培养物，例如luria肉汤)中生长的宿主细胞中表达编码多肽的核酸可以制备本发明的肽。例如，核酸可能是宿主细胞中存在的载体(例如质粒)的一部分。表达后，可从培养的细胞中分离出本发明的肽。包括但不限于盐或乙醇沉淀、亲和层析(例如利用如上所讨论的缀合了纯化标记肽)、制备型圆盘凝胶电泳、等点聚焦、高压液相层析(HPLC)、反相HPLC、凝胶过滤、阳离子和阴离子交换和分配层析和逆流分布等标准分离方法全都可以纯化本发明的肽。这些纯化方法在本领域已非常熟知并已公开，例如“蛋白质纯化指南”， Methods in Enzymology，第182卷，M.Deutscher主编，1990，Academic Press，New York，NY。

遵循纯化步骤来进行如下描述的受体结合活性测定。特别当RF-酰胺肽由细胞或组织中分离出来时，测定系统中优选包含一个或多个蛋白水解酶的抑制剂，例如甲苯磺酰氟(PMSF)、Pefabloc SC、抑胃酶肽、亮抑蛋白酶肽、胰凝乳蛋白酶抑制剂和乙二胺四乙酸(EDTA)。

抗体分子

本发明RF-酰胺肽的抗原(如免疫原)片段，无论是否可以结合SP9155或其功能片段，均在本发明的范围之内。所述抗原肽可用于制备识别RF-酰胺肽前体的抗体分子或其任何片段。

虽然并不总是必需的，但是当RF-酰胺肽用作抗原以在免疫感受态宿主中诱发抗体产生时，首先优选通过下述方法使较小的抗原片段更具免疫原性：与免疫原性载体分子(即具有在宿主动物中独立诱发免疫应答性质的大分子，如白喉毒素或破伤风毒素)交联或串联、或偶联。因为小的多肽片段有时只用作半抗原(能特异性结合抗体但不能诱发抗体产生的分子，即它们不具有免疫原性)，所以可能需要与载体分子交联或缀合。所述片段与免疫原性载体分子的缀合可使其通过通常称为“载体效应”而更具免疫原性。

载体分子包括如蛋白质和天然的或合成的聚合物如多肽、多糖、脂多糖等。特别优选为蛋白载体分子，包括但不限于匙孔血蓝蛋白和哺乳动物血清蛋白如人丙种球蛋白或牛丙种球蛋白、人血清白蛋白、牛血清白蛋白或兔血清白蛋白、或甲基化蛋白或此类蛋白的其它衍生物。其它的蛋白载体对本领域的技术人员将是显而易见的。对于将要诱发抗所述片段的抗体的宿主动物而言，蛋白载体优选为外源的。

利用本领域已熟知的方法可以共价偶联载体分子；选择准确的方法将由使用的载体分子的性质决定。当免疫原性载体分子是蛋白质时，可利用如水溶性碳二亚胺例如二环己基碳二亚胺或戊二醛来偶联本发明的片段。

这类偶联剂可不使用单独的载体分子，将片段与自身交联。如此交联而成的聚集体也可增加免疫原性。利用已知的佐剂，单独使用或与偶联作用或聚集联合使用，也能增加免疫原性。

接种动物用的佐剂包括但不限于佐剂65(含有花生油、二缩甘露醇一油酸酯和一硬脂酸铝)；弗氏完全或不完全佐剂；矿物凝胶如氢氧化铝、磷酸铝和明矾；表面活性剂如十六胺、十八胺、溶血卵磷脂、二甲基二(十八烷基)溴化铵、N,N-二(十八烷基)-N′，N′-双(2-羟甲基)丙二胺、甲氧基十六烷基甘油和多元醇；聚阴离子如吡喃、硫酸葡聚糖、聚IC、聚丙烯酸和卡波普；肽类如胞壁酰二肽、二甲基甘氨酸和吞噬作用激素；以及油乳剂。多肽也可在掺入脂质体及其它微载体后给药。

有关佐剂和免疫测定的各方面信息已公开，例如以下系列丛书所公开的： Practice and Theory of Enzyme Immunoassays，第3版，P.Tijssen，1987，Elsevier，New York。其它涵盖了多克隆抗血清制备方法的有用参考文献包括 Microbiology，1969，Hoeber Medical Division，Harper和Row；Landsteiner， Specificity of Serological Reactions，1962，Dover Publications，New York，和Williams等， Methods in Immunology and Immunochemistry，第1卷，1967，Academic Press，New York。

本发明的抗RF-酰胺肽“抗体分子”包括但决不限于抗RF-酰胺肽抗体(如单克隆抗体、多克隆抗体、双特异性抗体和抗独特型抗体)和片段，优选抗原结合片段或其功能片段，如Fab抗体片段、F(ab)₂抗体片段、Fv抗体片段(如V_H或V_L)、单链Fv抗体片段和dsF_V抗体片段。此外，本发明的抗体分子可以是完全的人抗体、小鼠抗体、兔抗体、鸡抗体、人/鼠嵌合抗体或人源化抗体。

本发明的抗RF-酰胺肽抗体分子优选识别本发明的人或小鼠RF-酰胺肽；然而，本发明包括识别不同种来源、优选哺乳动物(如大鼠、兔、山羊或狗)的RF-酰胺肽的抗体分子。本发明也包括含本发明的RF-酰胺肽和一种或多种抗体分子的复合物。此类复合物可简单地由抗体分子及其关连肽接触制备。

多种方法可用于制备本发明的抗体分子。在优选的实施方案中，本发明的抗体可由类似于公开在美国专利第5,625,126号、第5,877,397号、第6,255,458号、第6,023,010号和第5,874,299号的方法制备。产生单克隆、完全的人抗RF-酰胺肽抗体的杂交瘤细胞可以由本领域中通常已知的方法制备。这些方法包括但不限于由Kohler等，(1975)(Nature 256：495-497)原创开发的杂交瘤技术以及trioma技术(Hering等，(1988)Biomed.Biochim.Acta.47：211-216和Hagiwara等，(1993)Hum.Antibod.Hybridomas 4：15)、人B细胞杂交瘤技术(Kozbor等，(1983)Immunology Today 4：72和Cote等，(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 80：2026-2030)和EBV杂交瘤技术(Cole等， Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy。Alan R.Liss，Inc.，第77-96页，1985)。再者，酶联免疫吸附测定(ELISA)法可以用来测定杂交瘤细胞是否表达抗RF-酰胺肽的抗体。

也可重组制备本发明的抗RF-酰胺肽的抗体分子(如在上述讨论的大肠杆菌/T7表达系统中制备)。在这个实施方案中，编码本发明的抗体分子的核酸(如V_H或V_L)可插入到偏爱的质粒中并在大肠杆菌/T7系统中表达。有数个本领域中已知的方法可制备重组抗体。一个例子是美国专利第4,816,567号公开了一种制备重组抗体的方法。

术语“单克隆抗体”包括得自大致同源的抗体群的抗体，即所述群的各个抗体除可能少量的天然存在的突变之外是相同的。单克隆抗体是高度特异性的，可针对抗单个抗原位点。单克隆抗体的优势是可由杂交瘤细胞培养合成，本质上无其它免疫球蛋白的污染。修饰语“单克隆”指抗体的性质包含于大致同源的抗体群中，并且不需要任何特别方法制备抗体。如上所述，依照本发明使用的单克隆抗体可由Kohler等，(1975)Nature 256：495描述的杂交瘤方法制备。

术语“多克隆抗体”包括在一个或多个其它的不全同抗体存在下制备的抗体。一般而言，在其它几种制备不全同抗体的B淋巴细胞存在下，由B淋巴细胞产生多克隆抗体。通常，可直接由免疫的动物获得多克隆抗体。

“双特异性抗体”包含两种不同的可结合独特抗原的抗原结合区。双特异性抗体以及所述抗体的制备方法和使用方法在本领域中是常规的和熟知的。

抗独特型抗体或抗独特型是抗另一抗体分子的抗原结合区或可变区(称作独特型)的抗体。如由Jerne等公开的(Jerne，N.K.，(1974)Ann.Immunol.(巴黎)125c：373和Jerne，N.K.等，(1982)EMBO 1：234)，用表达特定抗原(如RF-酰胺肽)的互补位(抗原结合位点)的抗体分子免疫接种将产生一组抗抗体，其中一些与抗原共享互补位的互补结构。用抗独特型抗体的亚类免疫接种，将依次产生抗体的亚类或能与初始抗原反应的免疫细胞亚集。

术语“完全人抗体”是指仅包含人免疫球蛋白序列的抗体。同样，“小鼠抗体”是指仅包含小鼠免疫球蛋白序列的抗体，“鸡抗体”是指仅包含鸡免疫球蛋白序列的抗体。

“人/小鼠嵌合抗体”是指包含有小鼠可变区(V_H和V_L)融合到人恒定区的抗体。

“人源化”抗RF-酰胺肽抗体也包括在本发明范围内。非人类(如鼠或鸡)抗体的人源化形式是嵌合免疫球蛋白，包含非人类免疫球蛋白的最低限度的序列。多数情况下，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中受体的互补决定区的残基被由具有所需的特异性、亲合性和结合能力的非人类(供体抗体)如小鼠、鸡、大鼠或兔等的互补决定区取代。在某些例子中，人免疫球蛋白的Fv构架残基也被相应的非人类残基所取代。

“单链Fv”或“sFv”抗体片段包含抗体的V_H区和/或V_L区，其中这些区存在于单多肽链中。一般而言，sFv多肽在V_H区和/或V_L区间还包含一个多肽接头，可使sFv形成所需的抗原结合结构。描述制备单链抗体的技术(美国专利第5,476,786号；第5,132,405号和第4,946,778号)适合于制备抗RF-酰胺肽特异性单链抗体。有关sFv的综述参见Pluckthun The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Rosenburg和Moore主编，Springer-Verlag，N.Y.，第269-315页(1994)。

“二硫化物稳定的Fv片段”和“dsFV”包括通过二硫键连接的、具有可变区重链(V_H)和/或可变区轻链(V_L)的分子。

包括在本发明范围内的抗体片段也包括F(ab)₂片段，它可由IgG酶解如由胃蛋白酶酶解制备。Fab片段可由例如用二硫苏糖醇和巯基乙胺还原F(ab)₂制备。Fab片段是通过二硫键添加到V_H-C_H1链上的V_L-C_L链。F(ab)₂片段是两个Fab片段，进而依次经二个硫键添加而成。F(ab)₂分子的Fab部分包括位于二硫键间的Fc区。

Fv片段是V_L区或V_H区。

根据重链恒定区的氨基酸序列，免疫球蛋白可分为不同的类别。至少有五种主要的免疫球蛋白类别：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且它们可进一步分为亚类(同种型)，如IgG-1、IgG-2、IgG-3和IgG-4；IgA-1和IgA-2。

本发明的抗RF-酰胺肽抗体分子也可与化学部分缀合。化学部分尤其可以是聚合物、放射性核素或细胞毒性因子。优选的化学部分是可增加抗体分子在患者体内半寿期的聚合物。合适的聚合物包括但决不限于聚乙二醇(PEG)(如分子量为2kDa、5kDa、10kDa、12kDa、20kDa、30kDa或40kDa的PEG)、葡聚糖和单甲氧基聚乙二醇(mPEG)。美国专利第6,133,426号描述的制备PEG化抗IL8抗体方法，可用于本发明的PEG化抗RF-酰胺肽抗体的制备，所述文献通过引用结合到本文中。Lee等，(1999)(Bioconj.Chem.10：973-981)公开了PEG缀合的单链抗体。Wen等，(2001)(Bioconj.Chem.12：545-553)公开了抗体与连接放射性金属螯合剂(二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)的PEG缀合的方法。

本发明的抗体分子可以缀合放射性同位素标记如⁹⁹Tc、⁹⁰Y、¹¹¹In、³²P、¹⁴C、¹²⁵I、³H、¹³¹I、¹¹C、¹⁵O、¹³N、¹⁸F、³⁵S、⁵¹Cr、⁵⁷To、²²⁶Ra、⁶⁰Co、⁵⁹Fe、⁵⁷Se、¹⁵²Eu、⁶⁷CU、²¹⁷Ci、²¹¹At、²¹²Pb、⁴⁷Sc、¹⁰⁹Pd、²³⁴Th和⁴⁰K以及非放射性同位素标记如¹⁵⁷Gd、⁵⁵Mn、⁵²Tr、⁵⁶Fe。

本发明的抗体分子也可以缀合荧光标记或化学发光标记，包括荧光团如稀土元素螯合物、荧光素及其衍生物、罗丹明及其衍生物、异硫氰酸酯、藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯二醛、荧光胺、¹⁵²Eu、丹酰、伞形酮、萤光素、鲁米诺标记、异鲁米诺标记、芳香吖啶酯标记、咪唑标记、吖啶盐标记、草酸酯标记、发光蛋白质标记、2，3-二氢2，3-二氮杂萘二酮、生物素/亲和素、自旋标记和稳定的自由基。

抗体分子也可以缀合细胞毒性因子如白喉毒素、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)外毒素A链、蓖麻毒蛋白A链、相思豆毒蛋白A链、莫迪毒蛋白A链、α-八叠球菌素、Aleurites fordii蛋白及化合物(如脂肪酸)、dianthin蛋白、Phytoiacca americana蛋白PAPI、PAPII和PAP-S、momordica charantia抑制剂、麻疯树毒蛋白、巴豆毒蛋白、saponaria officinalis抑制剂、丝林霉素、局限曲菌素、酚霉素和伊诺霉素。

可利用本领域已知的任何方法将本发明的抗体分子与各种成分缀合，包括那些由Hunter等，(1962)Nature 144：945；David等，(1974)Biochemistry 13：1014；Pain等，(1981)J.Immunol.Meth.40：219和Nygren，J.，(1982)Histochem.and Cytochem.30：407描述的方法。

抗体的缀合方法在本领域中是常规和非常熟知的。

药用组合物

以治疗为目的，本发明的RF-酰胺肽和抗体分子可优选以药用组合物形式给予患者。药用组合物优选包括药学上可接受的载体。RF-酰胺肽和抗体分子可用于治疗性(如在药用组合物内)刺激或阻断SP9155受体的活性，从而治疗由所述受体引起或介导的任何医学病症。阻断本发明的RF-酰胺肽和SP9155受体的结合可以阻断所述肽在所述受体上的活性效应。如上所讨论的，SP9155受体已经与代谢紊乱如肥胖症和如疼痛和痛觉缺失等机制有联系。

药学上可接受的载体在本领域中是常规的和非常熟知的。实例包括水性或非水性载体、稳定剂、抗氧化剂、溶剂、分散介质、包衣、抗微生物剂、缓冲液、血清蛋白、等渗和吸收延迟剂以及生理兼容物质等。载体优选适合于注射到患者体内。一般而言，这类利于胃肠外给药的药用组合物已经熟知；如 Remington’s Pharmaceutical Science，第17版，(Mack Publishing Company，Easton，PA，1990)。

在本发明药用组合物中可用的水性和非水性载体的实例包括水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其适合的混合物、植物油如橄榄油和注射用有机脂如油酸乙脂。使用包衣材料如卵磷脂，在分散情况下保持所需的颗粒大小以及使用表面活性剂等可维持适当的流动性。

本发明的药用组合物可与第二药用组合物或物质联合给药。在优选的实施方案中，第二组合物为减肥药或镇痛药。当使用联合疗法时，两组组合物可配制成同时递药的一种组合物或者独立配制成两种或两种以上的组合物(如药盒)。

减肥药可以包括西布曲明、芬特明或奥利司他。

镇痛药包括阿斯匹林、acetominophen、可待因、吗啡、aponorphine、去甲吗啡、埃托啡、丁丙诺啡、氢可酮、消旋啡烷、左啡诺、butorphand、美沙酮、德美罗、布洛芬或盐酸羟考酮。

本发明的药用组合物也可包括其它类型的物质，包括用本文描述的测定方法鉴定的有机小分子和抑制配体类似物。

制剂通常呈单位剂量形式，并可以用药剂学领域中众所周知的任何方法制备。参见Gilman等(编著)(1990)， The Pharmacological Bases of Therapeutics，第8版，Pergamon Press；和 Remington’s Pharmaceutical Sciences，参见上文，Easton，Penn.；Avis等(编著)(1993) Pharmaceutical Dosage Forms：Parenteral Medications Dekker，New York；Lieberman等(编著)(1990) Pharmaceutical Dosage Forms：Tablets，Dekker，NewYork；和Lieberman等(编著)(1990)， Pharmaceutical Dosage Forms： Disperse Systems Dekker，New York。

考虑到多种因素可能改变所述治疗物质的作用，如患者的病症、体重、性别和饮食、任何感染的严重程度、给药时间及其它临床因素等，因此，包括治疗应用的给药方案将由主治医师决定。

通常，测定治疗剂量由低水平开始逐步增加，直至达到最优化安全性和功效。剂量可以根据给药后变小的分子形状和可能减少的半寿期(清除时间)进行调整。

本发明组合物的“有效量”可以是改善一个或多个熟知的参数的量，这些参数表征了SP9155受体或其功能片段引起或介导的医学病症。

这类物质具体的治疗性给药方案是本领域众所周知的。本发明的药用组合物可以通过例如胃肠外途径(如静脉注射、肌内注射、皮下注射、瘤内注射或输注)或非胃肠外途径给药(如口服、肺部给药或局部给药)。

组合物可用本领域已知的医学装置给药。例如，在一个优选的实施方案中，本发明的药用组合物可通过皮下针头注射给药。

本发明的药用组合物也可通过无针头皮下注射装置给药。这类装置公开于美国专利第5,399,163号；第5,383,851号；第5,312,335号；第5,064,413号；第4,941,880号；第4,790,824号或第4,596,556号。

熟知的可用于本发明的植入物和模块的实例包括：美国专利第4,487,603号，公开了用于以可控速率分散药物的可植入微输注泵；美国专利第4,447,233号，公开了用于精确以输注速率递药的药物输注泵；美国专利第4,447,224号，公开了用于连续递药的变化流量可植入输注装置；美国专利第4,439,196号，公开了具有多区室的渗透性递药系统。

反义分子

本发明也包括能特异性与编码本发明的RF-酰胺肽的核酸(如基因组DNA或mRNA)杂交的反义寡核苷酸，本发明的RF-酰胺肽优选具有SEQ ID NO：4-11或SEQ ID NO：13-18中任一个或其亚序列限定的氨基酸序列，以阻止所述核酸的表达。

本发明还提供药用组合物，所述药用组合物包含(a)有效量的寡核苷酸，以调节SP9155受体活性，所述寡核苷酸可穿过细胞膜并与细胞中编码本发明RF-酰胺肽的mRNA特异性结合，从而阻止其翻译；和(b)药学上可接受的、能穿过细胞膜的载体。在一个实施方案中，所述寡核苷酸与使mRNA失活的物质(如核酶)偶联。

实施例

以下实施例仅用于举例说明本发明，而不应认为以任何方式限制本发明的范围。

缩写

GenScan：基因预测算法(Burge等，(1997)J.Mol.Biol.268(1)：78-94)。

Human virtual transcripts database(VTS)：运行GenScan，从公开数据库获得的人类基因组DNA中预测基因或外显子。VTS是一个所有的已预测的人类基因或外显子的收集库。VTS的DNA和蛋白质版本均已产生。

实施例1：人RF-酰胺肽前体蛋白的鉴定。

RF-酰胺肽是熟知的神经肽家族成员，并且由羧基末端带“RFG(K/R)”基序的前肽衍生。一般而言，“G(K/R)”是蛋白酶消化和酰胺化信号。如果发生蛋白水解消化和酰胺化步骤，则前肽被加工成带RF-酰胺羧基末端的成熟肽。

因为大多数RF-酰胺肽前体含有不止一个RFG(K/R)基序，所以需搜索VTS蛋白质数据库中具有一个或多个RFGR基序的肽。我们鉴定出VTS164407，发现它包含一个具有两个RFG(K/R))基序的外显子。进一步分析揭示这个外显子包含一个开始部位的起始密码子和一个末端部位的终止密码子。用PSORT(蛋白质亚细胞定位预测的免费软件，Nakai等，(1999)Trends Biochem.Sci.24(1)：34-36)分析所述外显子，预测此外显子具有前导肽而无跨膜结构域，表明所述外显子编码分泌型蛋白。所述外显子可被称为“RF-酰胺肽前体”。

一般而言，因为RF-酰胺肽前体也是可分泌的，所以可分离出编码所述基因的cDNA。在基因组外显子和cDNA克隆间鉴别出一个核苷酸的差异。这个差异可表现出多态性。其核苷酸序列和相应推导出的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4。

实施例2：人RF-酰胺肽前体基因的小鼠同源基因的鉴定。

利用人RF-酰胺肽前体基因作为查询序列，通过BLAST搜索公开的已表达序列标志(EST)数据库，鉴定出人RF-酰胺肽前体基因的小鼠同源基因。在所述搜索中，鉴定出与人RF-酰胺肽前体同源的小鼠EST BF167714。另外，利用人RF-酰胺肽前体基因作为查询序列，搜索公开的小鼠基因组DNA数据库，再者，通过与第一轮搜索鉴定的小鼠同源基因的序列比对鉴定，第二轮搜索鉴定出小鼠同源基因。小鼠全长RF-酰胺肽前体基因由鉴定的克隆中推导获得。

基于推导出的小鼠RF-酰胺肽前体DNA序列，克隆了小鼠RF-酰胺肽前体的cDNA。其核苷酸序列和相应推导出的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13。

实施例3：源自人和小鼠的RF-酰胺肽前体基因的可能的功能肽。

我们根据RFG(K/R)可能位于羧基末端的假设，推导出以下可能的功能性RF-酰胺肽。

源于人RF-酰胺肽前体的肽如下：

人P51：EHAGCRFRF-酰胺(SEQ ID NO：5)

人P242：GLQTSGREHAGCRFRF-酰胺(SEQ ID NO：6)

人P552：ASQPQALLVIARGLQTSGREHAGCRFRF-酰胺(SEQ IDNO：7)

人P52：GGFSFRF-酰胺(SEQ ID NO：8)

人P513：KGGFSFRF-酰胺(SEQ ID NO：9)

人P517：KKGGFSFRF-酰胺(SEQ ID NO：10)

人P518：TSGPLGNLAEELNGYSRKKGGFSFRF-酰胺(SEQ IDNO：11)

源于小鼠RF-酰胺肽前体的肽如下：

小鼠P51：EHTGFRL-酰胺(SEQ ID NO：14)

小鼠P52：GGFSFRF-酰胺(SEQ ID NO：15)

小鼠P513：KGGFSFRF-酰胺(SEQ ID NO：16)

小鼠P517：RKGGFSFRF-酰胺(SEQ ID NO：17)

小鼠P518：ASGPLGTLAEELSSYSRRKGGFSFRF-酰胺(SEQ IDNO：18)

实施例4：试验。

a. 胞内Ca²⁺ 浓度测定。

在以下实施例中，用荧光成像读板仪(FLIPR)试验测定出人P518、P517、P52、P513和P51是人SP9155受体的配体。如下所讨论的，所述试验适于测定样品是所述受体的激动剂还是所述受体的拮抗剂。

使用SuperFect转染试剂，用携带SP9155受体cDNA的表达载体或缺乏SP9155受体DNA的表达载体转染在含10％FCS的DMEM培养基中生长到80-90％汇合的HEK293细胞。第二天，将细胞用胰蛋白酶从培养板上消化下来并用不含Ca²⁺/Mg²⁺的PBS洗涤。然后，将细胞按每100μl培养基35,000个细胞的密度接种到用多聚-D-赖氨酸(Becton Dickinson)预包被的96孔板内。转染后第三天，去除细胞中的培养基，加入100μl含4μM Fluo-3、AM(Molecular Probes)、20mMHepes pH7.4、0.1％(w/v)BSA和250mM丙磺舒的Hank氏平衡盐溶液(不含酚红)，在37℃、5％CO₂的条件下孵育1小时。然后将细胞用150μl含HANK氏BSS、40mM Hepes pH7.4和250mM丙磺舒的洗涤缓冲液洗涤三次。最后一次洗涤后，加入100μl洗涤缓冲液，并且在加入40μl含有各自相应的肽洗涤缓冲液后测定Ca²⁺流出。Ca²⁺流出可用FLIPR仪器(Molecular Device)测定。

这些试验所获得的数据示于下表3：

表3：肽的效价

配体¹	EC₅₀(nM)²
配体¹	EC₅₀(nM)²	人P518(SEQ ID NO：11)	7.0±3.0
人P517(SEQ ID NO：10)	235±6	人P518(SEQ ID NO：11)	7.0±3.0
人P517(SEQ ID NO：10)	235±6	人P52(SEQ ID NO：8)	245±58
人P513(SEQ ID NO：9)	258±20	人P52(SEQ ID NO：8)	245±58
人P513(SEQ ID NO：9)	258±20	人P51(SEQ ID NO：5)	1560±170

¹每一待测肽均为羧基末端酰胺化的。

²数值表示平均值+标准偏差；n＝5

FLIPR试验也可用于筛选样品的激动剂或拮抗剂活性。在这些试验中，使试验细胞可同时与肽配体(或与任何其它SP9155受体的配体)和样品接触。阴性对照实验可以包括使试验细胞与配体和空白样品(如水或其它已知不是激动剂或拮抗剂的物质)接触。阳性对照实验可以包括使试验细胞与配体和已知能激动或拮抗SP9155受体/配体结合的物质接触。

根据样品降低由配体/受体结合引起的Ca²⁺活动化程度的能力(即减少FLIPR信号)，并将其与无样品时进行的相同实验所获得的结果进行比较，样品可被鉴定为含有拮抗剂。相反，根据样品增加由配体/受体结合引起的Ca²⁺活动化程度的能力(即增加FLIPR信号)，并将其与无样品时进行的相同实验所获得的结果进行比较，样品可被鉴定为含有激动剂。

b. 放射性配体结合试验。

在本实施例中，用放射性配体结合试验测定人P518是人SP9155受体的配体。如下所讨论的，所述试验适于测定样品是激动剂还是拮抗剂。

进行放射性配体结合试验以测试SP9155受体在培养细胞中表达时结合3H-标记的P518的能力。SP9155的可读框克隆在表达载体pCR3.1(pCR3.1-SP9155)中。用pCR3.1-SP9155或单独用pCR3.1(模拟转染)转染COS-7细胞。转染后两天，将正常生长培养基DMEM/10％FCS更换为Opti-MEM或DMEM-Opti-MEM/5％FCS。允许细胞再生长一天，然后制备用于结合实验的细胞膜。1μM未标记的P518用于测定非特异性结合。自转染总共三天后，用转染细胞制备细胞膜，并且观察到其特异性结合³H-P518。

对于饱和结合，将150μl含24μg细胞膜的结合测定缓冲液(HepespH7.4、10mM CaCl₂、10mM MgCl₂、0.05％不含脂肪酸的BSA(w/v)，置于冰上保持低温)和50μl含2％(v/v)DMSO冷却的P518(1μM)的结合测定缓冲液混合。按递增浓度加入³H-P518/乙醇到测定物中。反应物在4℃孵育1小时，同时缓慢地旋转。用Multiscreen FB滤膜(Millipore)过滤所述结合测定物，Multiscreen FB滤膜在室温下用50μl结合测定缓冲液预先浸泡1小时，滤液用100ul 50mM Tris-Cl pH7.5(冰冷)洗涤两次。向滤液中加入50μl闪烁液，进行计数，以检测结合的放射性配体。

对于放射性配体竞争性试验，可将160μl含适当细胞膜的结合测定缓冲液与201μl含6％DMSO(v/v)和不同浓度的侯选竞争化合物的结合测定缓冲液混合。最终加入20μl含6％DMSO(v/v)和1μl ³H-P518/乙醇(NEN，50nM)的结合测定缓冲液，启动结合反应。放射性配体的终浓度为0.25nM。孵育条件与上述饱和试验所用的条件相同。根据样品降低所述配体与所述受体结合的能力，并将其与无样品时进行的相同实验所获得的结果进行比较，样品可被鉴定为含有激动剂或拮抗剂。

阴性对照实验可以包括使所述细胞膜与配体和空白样品(如水或其它已知不是激动剂或拮抗剂的物质)接触。阳性对照实验可以包括使试验细胞与配体和已知能激动或拮抗SP9155受体/配体结合的物质接触。

**********************************

本发明不受本文描述的具体实施方案范围的限制。事实上，根据上述说明书和附图，对本发明进行除以上所述以外的各种修改对本领域技术人员而言将会是显而易见的。这样的修改将落入所附权利要求的范围之内。

在本申请中引用了专利、专利申请、出版物、产品说明书和方案，其公开内容通过引用全部结合到本文中用于所有目的。

序列表

<110>先灵公司(Schering Corporation)

<120>G蛋白偶联受体的配体与方法

<130>CN01530-WI

<140>PCT/US03/11159

<141>2003-04-10

<150>60/372,640

<151>2002-04-12

<160>20

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>1296

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<220>

<221>CDS

<222>1..1296

<223>

<220>

<221>变异体

<222>154

<223>r

<220>

<221>变异体

<222>181

<223>k

<220>

<221>变异体

<222>206

<223>k

<220>

<221>变异体

<222>208

<223>k

<220>

<221>变异体

<222>447

<223>k

<220>

<221>变异体

<222>748

<223>k

<220>

<221>变异体

<222>1031

<223>y

<220>

<221>变异体

<222>1111

<223>y

<220>

<221>变异体

<222>1162

<223>r

<220>

<221>变异体

<222>1228

<223>y

<400>1

atg cag gcg ctt aac att acc ccg gag cag ttc tct cgg ctg ctg cgg 48

Met Gln Ala Leu Asn Ile Thr Pro Glu Gln Phe Ser Arg Leu Leu Arg

1 5 10 15

gac cac aac ctg acg cgg gag cag ttc atc gct ctg tac cgg ctg cga 96

Asp His Asn Leu Thr Arg Glu Gln Phe Ile Ala Leu Tyr Arg Leu Arg

20 25 30

ccg ctc gtc tac acc cca gag ctg ccg gga cgc gcc aag ctg gcc ctc 144

Pro Leu Val Tyr Thr Pro Glu Leu Pro Gly Arg A la Lys Leu Ala Leu

35 40 45

gtg ctc acc ggc gtg ctc atc ttc gcc ctg gcg ctc ttt ggc aat gct 192

Val Leu Thr Gly Val Leu Ile Phe Ala Leu Ala Leu Phe Gly Asn Ala

50 55 60

ctg gtg ttc tac gtg gtg acc cgc agc aag gcc atg cgc acc gtc acc 240

Leu Val Phe Tyr Val Val Thr Arg Ser Lys Ala Met Arg Thr Val Thr

65 70 75 80

aac atc ttt atc tgc tcc ttg gcg ctc agt gac ctg ctc atc acc ttc 288

Asn Ile Phe Ile Cys Ser Leu Ala Leu Ser Asp Leu Leu Ile Thr Phe

85 90 95

ttc tgc att ccc gtc acc atg ctc cag aac att tcc gac aac tgg ctg 336

Phe Cys Ile Pro Val Thr Met Leu Gln Asn Ile Ser Asp Asn Trp Leu

100 105 110

ggg ggt gct ttc att tgc aag atg gtg cca ttt gtc cag tct acc gct 384

Gly Gly Ala Phe Ile Cys Lys Met Val Pro Phe Val Gln Ser Thr Ala

115 120 125

gtt gtg aca gaa atc ctc act atg acc tgc att gct gtg gaa agg cac 432

Val Val Thr Glu Ile Leu Thr Met Thr Cys Ile Ala Val Glu Arg His

130 135 140

cag gga ctt gtg cat cct ttt aaa atg aag tgg caa tac acc aac cga 480

Gln Gly Leu Val His Pro Phe Lys Met Lys Trp Gln Tyr Thr Asn Arg

145 150 155 160

agg gct ttc aca atg cta ggt gtg gtc tgg ctg gtg gca gtc atc gta 528

Arg Ala Phe Thr Met Leu Gly Val Val Trp Leu Val Ala Val Ile Val

165 170 175

gga tca ccc atg tgg cac gtg caa caa ctt gag atc aaa tat gac ttc 576

Gly Ser Pro Met Trp His Val Gln Gln Leu Glu Ile Lys Tyr Asp Phe

180 185 190

cta tat gaa aag gaa cac atc tgc tgc tta gaa gag tgg acc agc cct 624

Leu Tyr Glu Lys Glu His Ile Cys Cys Leu Glu Glu Trp Thr Ser Pro

195 200 205

gtg cac cag aag atc tac acc acc ttc atc ctt gtc atc ctc ttc ctc 672

Val His Gln Lys Ile Tyr Thr Thr Phe Ile Leu Val Ile Leu Phe Leu

210 215 220

ctg cct ctt atg gtg atg ctt att ctg tac agt aaa att ggt tat gaa 720

Leu Pro Leu Met Val Met Leu Ile Leu Tyr Ser Lys Ile Gly Tyr Glu

225 230 235 240

ctt tgg ata aag aaa aga gtt ggg gat ggt tca gtg ctt cga act att 768

Leu Trp Ile Lys Lys Arg Val Gly Asp Gly Ser Val Leu Arg Thr Ile

245 250 255

cat gga aaa gaa atg tcc aaa ata gcc agg aag aag aaa cga gct gtc 816

His Gly Lys Glu Met Ser Lys Ile Ala Arg Lys Lys Lys Arg Ala Val

260 265 270

att atg atg gtg aca gtg gtg gct ctc ttt gct gtg tgc tgg gca cca 864

Ile Met Met Val Thr Val Val Ala Leu Phe Ala Val Cys Trp Ala Pro

275 280 285

ttc cat gtt gtc cat atg atg att gaa tac agt aat ttt gaa aag gaa 912

Phe His Val Val His Met Met Ile Glu Tyr Ser Asn Phe Glu Lys Glu

290 295 300

tat gat gat gtc aca atc aag atg att ttt gct atc gtg caa att att 960

Tyr Asp Asp Val Thr Ile Lys Met Ile Phe Ala Ile Val Gln Ile Ile

305 310 315 320

gga ttt tcc aac tcc atc tgt aat ccc att gtc tat gca ttt atg aat 1008

Gly Phe Ser Asn Ser Ile Cys Asn Pro Ile Val Tyr Ala Phe Met Asn

325 330 335

gaa aac ttc aaa aaa aat gtt ttg tct gca gtt tgt tat tgc ata gta 1056

Glu Asn Phe Lys Lys Asn Val Leu Ser Ala Val Cys Tyr Cys Ile Val

340 345 350

aat aaa acc ttc tct cca gca caa agg cat gga aat tca gga att aca 1104

Asn Lys Thr Phe Ser Pro Ala Gln Arg His Gly Asn Ser Gly Ile Thr

355 360 365

atg atg cgg aag aaa gca aag ttt tcc ctc aga gag aat cca gtg gag 1152

Met Met Arg Lys Lys Ala Lys Phe Ser Leu Arg Glu Asn Pro Val Glu

370 375 380

gaa acc aaa gga gaa gca ttc agt gat ggc aac att gaa gtc aaa ttg 1200

Glu Thr Lys Gly Glu Ala Phe Ser Asp Gly Asn Ile Glu Val Lys Leu

385 390 395 400

tgt gaa cag aca gag gag aag aaa aag ctc aaa cga cat ctt gct ctc 1248

Cys Glu Gln Thr Glu Glu Lys Lys Lys Leu Lys Arg His Leu Ala Leu

405 410 415

ttt agg tct gaa ctg gct gag aat tct cct tta gac agt ggg cat taa 1296

Phe Arg Ser Glu Leu Ala Glu Asn Ser Pro Leu Asp Ser Gly His

420 425 430

<210>2

<211>431

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>52

<223>Ser或Gly

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>410

<223>Phe或Leu

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>388

<223>Arg或Gly

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>371

<223>Trp或Arg

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>344

<223>Ser或Leu

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>250

<223>Cys或Gly

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>149

<223>Gln或Lys

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>70

<223>Leu或Val

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>69

<223>Gly或Val

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>61

<223>Val或Phe

<400>2

Met Gln Ala Leu Asn Ile Thr Pro Glu Gln Phe Ser Arg Leu Leu Arg

1 5 10 15

Asp His Asn Leu Thr Arg Glu Gln Phe Ile Ala Leu Tyr Arg Leu Arg

20 25 30

Pro Leu Val Tyr Thr Pro Glu Leu Pro Gly Arg Ala Lys Leu Ala Leu

35 40 45

Val Leu Thr Xaa Val Leu Ile Phe Ala Leu Ala Leu Xaa Gly Asn Ala

50 55 60

Leu Val Phe Tyr Xaa Xaa Thr Arg Ser Lys Ala Met Arg Thr Val Thr

65 70 75 80

Asn Ile Phe Ile Cys Ser Leu Ala Leu Ser Asp Leu Leu Ile Thr Phe

85 90 95

Phe Cys Ile Pro Val Thr Met Leu Gln Asn Ile Ser Asp Asn Trp Leu

100 105 110

Gly Gly Ala Phe Ile Cys Lys Met Val Pro Phe Val Gln Ser Thr Ala

115 120 125

Val Val Thr Glu Ile Leu Thr Met Thr Cys Ile Ala Val Glu Arg His

130 135 140

Gln Gly Leu Val Xaa Pro Phe Lys Met Lys Trp Gln Tyr Thr Asn Arg

145 150 155 160

Arg Ala Phe Thr Met Leu Gly Val Val Trp Leu Val Ala Val Ile Val

165 170 175

Gly Ser Pro Met Trp His Val Gln Gln Leu Glu Ile Lys Tyr Asp Phe

180 185 190

Leu Tyr Glu Lys Glu His Ile Cys Cys Leu Glu Glu Trp Thr Ser Pro

195 200 205

Val His Gln Lys Ile Tyr Thr Thr Phe Ile Leu Val Ile Leu Phe Leu

210 215 220

Leu Pro Leu Met Val Met Leu Ile Leu Tyr Ser Lys Ile Gly Tyr Glu

225 230 235 240

Leu Trp Ile Lys Lys Arg Val Gly Asp Xaa Ser Val Leu Arg Thr Ile

245 250 255

His Gly Lys Glu Met Ser Lys Ile Ala Arg Lys Lys Lys Arg Ala Val

260 265 270

Ile Met Met Val Thr Val Val Ala Leu Phe Ala Val Cys Trp Ala Pro

275 280 285

Phe His Val Val His Met Met Ile Glu Tyr Ser Asn Phe Glu Lys Glu

290 295 300

Tyr Asp Asp Val Thr Ile Lys Met Ile Phe Ala Ile Val Gln Ile Ile

305 310 315 320

Gly Phe Ser Asn Ser Ile Cys Asn Pro Ile Val Tyr Ala Phe Met Asn

325 330 335

Glu Asn Phe Lys Lys Asn Val Xaa Ser Ala Val Cys Tyr Cys Ile Val

340 345 350

Asn Lys Thr Phe Ser Pro Ala Gln Arg His Gly Asn Ser Gly Ile Thr

355 360 365

Met Met Xaa Lys Lys Ala Lys Phe Ser Leu Arg Glu Asn Pro Val Glu

370 375 380

Glu Thr Lys Xaa Glu Ala Phe Ser Asp Gly Asn Ile Glu Val Lys Leu

385 390 395 400

Cys Glu Gln Thr Glu Glu Lys Lys Lys Xaa Lys Arg His Leu Ala Leu

405 410 415

Phe Arg Ser Glu Leu Ala Glu Asn Ser Pro Leu Asp Ser Gly His

420 425 430

<210>3

<211>411

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<220>

<221>CDS

<222>1..411

<223>

<220>

<221>变异体

<222>76

<223>s

<220>

<221>变异体

<222>103

<223>r

<220>

<221>变异体

<222>139

<223>y

<220>

<221>变异体

<222>203

<223>w

<220>

<221>变异体

<222>239

<223>r

<400>3

atg gta agg cct tac ccc ctg atc tac ttc ctc ttc ctg ccg ctg ggc 48

Met Val Arg Pro Tyr Pro Leu Ile Tyr Phe Leu Phe Leu Pro Leu Gly

1 5 10 15

gcc tgc ttc cct cta ctg gac aga aga gag ccc aca gac gcc atg ggt 96

Ala Cys Phe Pro Leu Leu Asp Arg Arg Glu Pro Thr Asp Ala Met Gly

20 25 30

ggc ctc gga gct gga gaa cgc tgg gcc gac ctg gcc atg ggg ccc cga 144

Gly Leu Gly Ala Gly Glu Arg Trp Ala Asp Leu Ala Met Gly Pro Arg

35 40 45

ccc cac tcc gtg tgg ggt tcc tct cgg tgg ctg aga gct tca cag cca 192

Pro His Ser Val Trp Gly Ser Ser Arg Trp Leu Arg Ala Ser Gln Pro

50 55 60

cag gcc ctg ctt gtc ata gcc agg ggg ctg cag aca tcg ggc aga gag 240

Gln Ala Leu Leu Val Ile Ala Arg Gly Leu Gln Thr Ser Gly Arg Glu

65 70 75 80

cat gct ggc tgc aga ttc cgc ttc ggg agg cag gac gaa ggc agt gag 288

His Ala Gly Cys Arg Phe Arg Phe Gly Arg Gln Asp Glu Gly Ser Glu

85 90 95

gcc acc ggc ttc ctc cct gct gcg ggg gag aag acc agc ggc ccg tta 336

Ala Thr Gly Phe Leu Pro Ala Ala Gly Glu Lys Thr Ser Gly Pro Leu

100 105 110

ggg aac ctg gct gag gag ctc aat ggc tac agc agg aag aaa ggc ggc 384

Gly Asn Leu Ala Glu Glu Leu Asn Gly Tyr Ser Arg Lys Lys Gly Gly

115 120 125

ttc agc ttc cgc ttc ggt cgg cgg tga 411

Phe Ser Phe Arg Phe Gly Arg Arg

130 135

<210>4

<211>136

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>47

<223>Ser或Pro

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>80

<223>Gly或Glu

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>68

<223>His或Leu

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>35

<223>Arg或Gly

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>26

<223>Gln或Glu

<400>4

Met Val Arg Pro Tyr Pro Leu Ile Tyr Phe Leu Phe Leu Pro Leu Gly

1 5 10 15

Ala Cys Phe Pro Leu Leu Asp Arg Arg Xaa Pro Thr Asp Ala Met Gly

20 25 30

Gly Leu Xaa Ala Gly Glu Arg Trp Ala Asp Leu Ala Met Gly Xaa Arg

35 40 45

Pro His Ser Val Trp Gly Ser Ser Arg Trp Leu Arg Ala Ser Gln Pro

50 55 60

Gln Ala Leu Xaa Val Ile Ala Arg Gly Leu Gln Thr Ser Gly Arg Xaa

65 70 75 80

His Ala Gly Cys Arg Phe Arg Phe Gly Arg Gln Asp Glu Gly Ser Glu

85 90 95

Ala Thr Gly Phe Leu Pro Ala Ala Gly Glu Lys Thr Ser Gly Pro Leu

100 105 110

Gly Asn Leu Ala Glu Glu Leu Asn Gly Tyr Ser Arg Lys Lys Gly Gly

115 120 125

Phe Ser Phe Arg Phe Gly Arg Arg

130 135

<210>5

<211>9

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>5

Glu His Ala Gly Cys Arg Phe Arg Phe

1 5

<210>6

<211>16

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>6

Gly Leu Gln Thr Ser Gly Arg Glu His Ala Gly Cys Arg Phe Arg Phe

1 5 10 15

<210>7

<211>28

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>7

Ala Ser Gln Pro Gln Ala Leu Leu Val Ile Ala Arg Gly Leu Gln Thr

1 5 10 15

Ser Gly Arg Glu His Ala Gly Cys Arg Phe Arg Phe

20 25

<210>8

<211>7

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>8

Gly Gly Phe Ser Phe Arg Phe

1 5

<210>9

<211>8

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>9

Lys Gly Gly Phe Ser Phe Arg Phe

1 5

<210>10

<211>9

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>10

Lys Lys Gly Gly Phe Ser Phe Arg Phe

1 5

<210>11

<211>26

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>11

Thr Ser Gly Pro Leu Gly Asn Leu Ala Glu Glu Leu Asn Gly Tyr Ser

1 5 10 15

Arg Lys Lys Gly Gly Phe Ser Phe Arg Phe

20 25

<210>12

<211>375

<212>DNA

<213>未知

<220>

<223>小鼠

<220>

<221>CDS

<222>1..375

<223>

<400>12

atg agg ggc ttc cgg cct ttg ctt tcc cta ctt ctc cct ctg agt gcc 48

Met Arg Gly Phe Arg Pro Leu Leu Ser Leu Leu Leu Pro Leu Ser Ala

1 5 10 15

tgc ttt ccc ctg ctg gac aga agg gga ccc aca gac atc ggt gac atc 96

Cys Phe Pro Leu Leu Asp Arg Arg Gly Pro Thr Asp Ile Gly Asp Ile

20 25 30

gga gcc agg atg aac tgg gcc cag ctg gct gag gga cat ccc ccc aac 144

Gly Ala Arg Met Asn Trp Ala Gln Leu Ala Glu Gly His Pro Pro Asn

35 40 45

tcg gtt caa aat cca cag cca cag gcc ctg ctt gtg gtg gcc agg gag 192

Ser Val Gln Asn Pro Gln Pro Gln Ala Leu Leu Val Val Ala Arg Glu

50 55 60

cag cag gcc tcc cac agg gag cac acc ggc ttc cgt cta ggg agg caa 240

Gln Gln Ala Ser His Arg Glu His Thr Gly Phe Arg Leu Gly Arg Gln

65 70 75 80

gac ggt agc agt gag gcc gca ggg ttc ctg ccc gcc gac tcg gag aag 288

Asp Gly Ser Ser Glu Ala Ala Gly Phe Leu Pro Ala Asp Ser Glu Lys

85 90 95

gcc agc ggc cct ctg ggg act ctg gca gag gag ctg agc agc tac agc 336

Ala Ser Gly Pro Leu Gly Thr Leu Ala Glu Glu Leu Ser Ser Tyr Ser

100 105 110

cgg agg aag gga ggc ttc agc ttc cgc ttt gga cgg tga 375

Arg Arg Lys Gly Gly Phe Ser Phe Arg Phe Gly Arg

115 120

<210>13

<211>124

<212>PRT

<213>未知

<220>

<223>小鼠

<400>13

Met Arg Gly Phe Arg Pro Leu Leu Ser Leu Leu Leu Pro Leu Ser Ala

1 5 10 15

Cys Phe Pro Leu Leu Asp Arg Arg Gly Pro Thr Asp Ile Gly Asp Ile

20 25 30

Gly Ala Arg Met Asn Trp Ala Gln Leu Ala Glu Gly His Pro Pro Asn

35 40 45

Ser Val Gln Asn Pro Gln Pro Gln Ala Leu Leu Val Val Ala Arg Glu

50 55 60

Gln Gln Ala Ser His Arg Glu His Thr Gly Phe Arg Leu Gly Arg Gln

65 70 75 80

Asp Gly Ser Ser Glu Ala Ala Gly Phe Leu Pro Ala Asp Ser Glu Lys

85 90 95

Ala Ser Gly Pro Leu Gly Thr Leu Ala Glu Glu Leu Ser Ser Tyr Ser

100 105 110

Arg Arg Lys Gly Gly Phe Ser Phe Arg Phe Gly Arg

115 120

<210>14

<211>7

<212>PRT

<213>未知

<220>

<223>小鼠

<400>14

Glu His Thr Gly Phe Arg Leu

1 5

<210>15

<211>7

<212>PRT

<213>未知

<220>

<223>小鼠

<400>15

Gly Gly Phe Ser Phe Arg Phe

1 5

<210>16

<211>8

<212>PRT

<213>未知

<220>

<223>小鼠

<400>16

Lys Gly Gly Phe Ser Phe Arg Phe

1 5

<210>17

<211>9

<212>PRT

<213>未知

<220>

<223>小鼠

<400>17

Arg Lys Gly Gly Phe Ser Phe Arg Phe

1 5

<210>18

<211>26

<212>PRT

<213>未知

<220>

<223>小鼠

<400>18

Ala Ser Gly Pro Leu Gly Thr Leu Ala Glu Glu Leu Ser Ser Tyr Ser

1 5 10 15

Arg Arg Lys Gly Gly Phe Ser Phe Arg Phe

20 25

<210>19

<211>1302

<212>DNA

<213>未知

<220>

<223>小鼠

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1302)

<223>

<400>19

atg cag gcg ctc aac atc acc gcg gag cag ttt tcc cgg ctg ctg agc 48

Met Gln Ala Leu Asn Ile Thr Ala Glu Gln Phe Ser Arg Leu Leu Ser

1 5 10 15

gca cac aac ctg act cgg gaa cag ttc att cat cgc tat ggg ctg cga 96

Ala His Asn Leu Thr Arg Glu Gln Phe Ile His Arg Tyr Gly Leu Arg

20 25 30

ccg ctg gtc tac acc ccg gag ctg ccc gcg cgc gct aaa ctg gcc ttt 144

Pro Leu Val Tyr Thr Pro Glu Leu Pro Ala Arg Ala Lys Leu Ala Phe

35 40 45

gcg ctg gct gga gca ctc att ttt gcc ctg gcg ctc ttt ggc aac tct 192

Ala Leu Ala Gly Ala Leu Ile Phe Ala Leu Ala Leu Phe Gly Asn Ser

50 55 60

ctg gtc atc tat gtg gtg acc cgc agc aag gcc atg cac acc gtc acc 240

Leu Val Ile Tyr Val Val Thr Arg Ser Lys Ala Met His Thr Val Thr

65 70 75 80

aac atc ttc atc tgc tct ctg gca ctc agt gat ctg ctc att gcc ttc 288

Asn Ile Phe Ile Cys Ser Leu Ala Leu Ser Asp Leu Leu Ile Ala Phe

85 90 95

ttc tgc atc ccc gtc acg atg ctc cag aac atc tcc gac aag tgg ctg 336

Phe Cys Ile Pro Val Thr Met Leu Gln Asn Ile Ser Asp Lys Trp Leu

100 105 110

ggt ggt gcc ttc atc tgc aag atg gtg ccc ttc gtc cag tcc act gct 384

Gly Gly Ala Phe Ile Cys Lys Met Val Pro Phe Val Gln Ser Thr Ala

115 120 125

gtt gtg acg gaa atc ctc acc atg act tgc atc gct gtt gag agg cac 432

Val Val Thr Glu Ile Leu Thr Met Thr Cys Ile Ala Val Glu Arg His

130 135 140

caa gga ctc atc cat cct ttt aaa atg aag tgg cag tac act acc cga 480

Gln Gly Leu Ile His Pro Phe Lys Met Lys Trp Gln Tyr Thr Thr Arg

145 150 155 160

agg gct ttc aca atc ttg ggt gtg gtc tgg ttg gca gcc atc atc gta 528

Arg Ala Phe Thr Ile Leu Gly Val Val Trp Leu Ala Ala Ile Ile Val

165 170 175

gga tca ccc atg tgg cac gta caa cgc ctc gag att aag tat gac ttc 576

Gly Ser Pro Met Trp His Val Gln Arg Leu Glu Ile Lys Tyr Asp Phe

180 185 190

ctc tat gag aaa gaa cat gtc tgc tgt ttg gaa gag tgg gcc agc ccc 624

Leu Tyr Glu Lys Glu His Val Cys Cys Leu Glu Glu Trp Ala Ser Pro

195 200 205

atg cac cag aga atc tac acc acc ttc atc ctc gtc atc ctc ttc ctc 672

Met His Gln Arg Ile Tyr Thr Thr Phe Ile Leu Val Ile Leu Phe Leu

210 215 220

ctg ccg ctt gtg gtg atg ctt gtc ctc tac agc aag att ggc tat gaa 720

Leu Pro Leu Val Val Met Leu Val Leu Tyr Ser Lys Ile Gly Tyr Glu

225 230 235 240

ctg tgg atc aag aag aga gtt gga gac agt tca gca ctt cag act atc 768

Leu Trp Ile Lys Lys Arg Val Gly Asp Ser Ser Ala Leu Gln Thr Ile

245 250 255

cac ggg aaa gaa atg tcc aaa ata gcc agg aag aag aag cgg gct gtc 816

His Gly Lys Glu Met Ser Lys Ile Ala Arg Lys Lys Lys Arg Ala Val

260 265 270

gtt atg atg gtg aca gtg gtg gct ctc ttc gct gcg tgc tgg gca cct 864

Val Met Met Val Thr Val Val Ala Leu Phe Ala Ala Cys Trp Ala Pro

275 280 285

ttc cat gtt gtt cac atg atg gtt gag tac agt aac ttt gaa aaa gag 912

Phe His Val Val His Met Met Val Glu Tyr Ser Asn Phe Glu Lys Glu

290 295 300

tat gat gat gtc aca atc aag atg gtt ttt gct gtt gca caa aca att 960

Tyr Asp Asp Val Thr Ile Lys Met Val Phe Ala Val Ala Gln Thr Ile

305 310 315 320

ggc ttt ttc aac tcc atc tgt aat ccc ttt gtg tat gca ttt atg aat 1008

Gly Phe Phe Asn Ser Ile Cys Asn Pro Phe Val Tyr Ala Phe Met Asn

325 330 335

gaa aac ttc aaa aag aat ttt ttg tct gcg gtt tgt tat tgc ata gta 1056

Glu Asn Phe Lys Lys Asn Phe Leu Ser Ala Val Cys Tyr Cys Ile Val

340 345 350

aaa gaa acc ttc tcc cca gga cag aag cct gga aat tct ggg att tca 1104

Lys Glu Thr Phe Ser Pro Gly Gln Lys Pro Gly Asn Ser Gly Ile Ser

355 360 365

atg atg caa aag aga gca aag tta tca cga tca cag cgt cca gtg gcg 1152

Met Met Gln Lys Arg Ala Lys Leu Ser Arg Ser Gln Arg Pro Val Ala

370 375 380

gaa gcc aaa gga gac tta ttc agc gat gcc aac gtt gat gtc aaa ttg 1200

Glu Ala Lys Gly Asp Leu Phe Ser Asp Ala Asn Val Asp Val Lys Leu

385 390 395 400

tgt gag cag cca ggg gag aaa agg caa ctc aag cga cag ctt gcc ttc 1248

Cys Glu Gln Pro Gly Glu Lys Arg Gln Leu Lys Arg Gln Leu Ala Phe

405 410 415

ttt agt tct gaa ctt tct gaa aac tct act ttc ggc agt gga cat gaa 1296

Phe Ser Ser Glu Leu Ser Glu Asn Ser Thr Phe Gly Ser Gly His Glu

420 425 430

ctg taa 1302

Leu

<210>20

<211>433

<212>PRT

<213>未知

<220>

<223>小鼠

<400>20

Met Gln Ala Leu Asn Ile Thr Ala Glu Gln Phe Ser Arg Leu Leu Ser

1 5 10 15

Ala His Asn Leu Thr Arg Glu Gln Phe Ile His Arg Tyr Gly Leu Arg

20 25 30

Pro Leu Val Tyr Thr Pro Glu Leu Pro Ala Arg Ala Lys Leu Ala Phe

35 40 45

Ala Leu Ala Gly Ala Leu Ile Phe Ala Leu Ala Leu Phe Gly Asn Ser

50 55 60

Leu Val Ile Tyr Val Val Thr Arg Ser Lys Ala Met His Thr Val Thr

65 70 75 80

Asn Ile Phe Ile Cys Ser Leu Ala Leu Ser Asp Leu Leu Ile Ala Phe

85 90 95

Phe Cys Ile Pro Val Thr Met Leu Gln Asn Ile Ser Asp Lys Trp Leu

100 105 110

Gly Gly Ala Phe Ile Cys Lys Met Val Pro Phe Val Gln Ser Thr Ala

115 120 125

Val Val Thr Glu Ile Leu Thr Met Thr Cys Ile Ala Val Glu Arg His

130 135 140

Gln Gly Leu Ile His Pro Phe Lys Met Lys Trp Gln Tyr Thr Thr Arg

145 150 155 160

Arg Ala Phe Thr Ile Leu Gly Val Val Trp Leu Ala Ala Ile Ile Val

165 170 175

Gly Ser Pro Met Trp His Val Gln Arg Leu Glu Ile Lys Tyr Asp Phe

180 185 190

Leu Tyr Glu Lys Glu His Val Cys Cys Leu Glu Glu Trp Ala Ser Pro

195 200 205

Met His Gln Arg Ile Tyr Thr Thr Phe Ile Leu Val Ile Leu Phe Leu

210 215 220

Leu Pro Leu Val Val Met Leu Val Leu Tyr Ser Lys Ile Gly Tyr Glu

225 230 235 240

Leu Trp Ile Lys Lys Arg Val Gly Asp Ser Ser Ala Leu Gln Thr Ile

245 250 255

His Gly Lys Glu Met Ser Lys Ile Ala Arg Lys Lys Lys Arg Ala Val

260 265 270

Val Met Met Val Thr Val Val Ala Leu Phe Ala Ala Cys Trp Ala Pro

275 280 285

Phe His Val Val His Met Met Val Glu Tyr Ser Asn Phe Glu Lys Glu

290 295 300

Tyr Asp Asp Val Thr Ile Lys Met Val Phe Ala Val Ala Gln Thr Ile

305 310 315 320

Gly Phe Phe Asn Ser Ile Cys Asn Pro Phe Val Tyr Ala Phe Met Asn

325 330 335

Glu Asn Phe Lys Lys Asn Phe Leu Ser Ala Val Cys Tyr Cys Ile Val

340 345 350

Lys Glu Thr Phe Ser Pro Gly Gln Lys Pro Gly Asn Ser Gly Ile Ser

355 360 365

Met Met Gln Lys Arg Ala Lys Leu Ser Arg Ser Gln Arg Pro Val Ala

370 375 380

Glu Ala Lys Gly Asp Leu Phe Ser Asp Ala Asn Val Asp Val Lys Leu

385 390 395 400

Cys Glu Gln Pro Gly Glu Lys Arg Gln Leu Lys Arg Gln Leu Ala Phe

405 410 415

Phe Ser Ser Glu Leu Ser Glu Asn Ser Thr Phe Gly Ser Gly His Glu

420 425 430

Leu

Claims

1.一种鉴定SP9155受体激动剂或拮抗剂的方法，所述方法包括：

(a)在已知量的标记SP9155受体的配体的存在下，使SP9155受体或其功能片段与需要测试所述激动剂或拮抗剂存在的样品接触；和

(b)测定特异性结合所述受体的配体量；

其中与不存在所述样品的情况下测得的结果相比，测量到所述标记配体与所述受体的结合显著降低，则所述样品被鉴定为含有拮抗剂或激动剂。

2.权利要求1的方法，其中所述标记配体是包含选自SEQ ID NO：4-11和SEQ ID NO：13-18的氨基酸序列的羧基末端酰胺化多肽。

3.权利要求1的方法，其中所述受体包含SEQ ID NO：2或SEQID NO：20的氨基酸序列。

4.权利要求1的方法，其中所述受体的来源包含从含有所述受体的哺乳动物细胞中分离的膜。

5.一种鉴定SP9155受体激动剂或拮抗剂的方法，所述方法包括：

(a)在已知量的SP9155受体的配体的存在下，使表达SP9155受体或其功能片段的细胞与需要测试所述激动剂或拮抗剂存在的样品接触；和

(b)测定所述细胞的钙活动化；

其中与不存在所述样品的情况下测得的结果相比，测量到钙活动化显著降低，则所述样品被鉴定为含有拮抗剂；并且其中与不存在所述样品的情况下测得的结果相比，测量到钙活动化显著增加，则所述样品被鉴定为含有激动剂。

6.权利要求5的方法，其中所述配体是包含选自SEQ ID NO：4-11和SEQ ID NO：13-18的氨基酸序列的羧基末端酰胺化多肽。

7.权利要求5的方法，其中所述受体包含SEQ ID NO：2或SEQID NO：20的氨基酸序列。

8.权利要求5的方法，其中通过使钙与钙指示剂接触，然后测量所述指示剂的荧光，来测量钙活动化。

9.权利要求8的方法，其中所述钙指示剂是1-[2-氨基-5-(2，7-二氯-6-羟基-3-氧-9-呫吨基)苯氧基]-2-(2′-氨基-5′-甲基苯氧基)乙烷-N，N，N′，N′-四乙酸，五乙酰氧基甲酯。

10.一种制备多肽的方法，所述方法包括在编码抗原多肽的核酸表达的条件下，培养包含重组载体的宿主细胞，所述载体包含编码抗原多肽的核酸，所述抗原多肽包含SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：13的7个或7个以上的连续氨基酸。

11.权利要求10的方法，其中从所述培养物中分离所述多肽。

12.一种在抗原肽与抗体分子之间形成复合物的方法，所述抗原肽包含选自SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：13的氨基酸序列的7个或7个以上的连续残基，而所述抗体分子特异性结合所述肽，所述方法包括使所述肽与所述抗体分子接触。

13.一种治疗或预防患者的由SP9155受体介导的医学病症的方法，所述方法包括给予所述患者包含抗体或其抗原结合片段以及药学上可接受的载体的药用组合物，所述抗体或其抗原结合片段特异性结合包含SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：13的7个或7个以上的连续氨基酸的多肽。

14.权利要求13的方法，其中所述医学病症选自疼痛和肥胖症。

15.一种分离的抗原多肽，所述抗原多肽包含选自SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：13的氨基酸序列的7个或7个以上的连续残基。

16.一种分离的多肽，所述多肽包含选自SEQ ID NO：4-11和SEQID NO：13-18的氨基酸序列。

17.权利要求15的分离的抗原多肽，所述多肽是羧基末端酰胺化的。

18.一种抗体或其功能片段，所述抗体或其功能片段特异性结合权利要求15的多肽。

19.一种分离的核酸，所述核酸编码权利要求15的多肽。

20.权利要求19的核酸，所述核酸编码包含选自SEQ ID NO：4-11和SEQ ID NO：13-18的氨基酸序列的多肽。

21.权利要求20的核酸，所述核酸包含选自SEQ ID NO：3和SEQID NO：12的核苷酸序列。

22.一种重组载体，所述重组载体包含权利要求19的核酸。

23.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含权利要求22的载体。

24.一种药用组合物，所述药用组合物包含权利要求15的多肽和药学上可接受的载体。

25.一种药用组合物，所述药用组合物包含权利要求18的抗体分子和药学上可接受的载体。