MXPA04009959A - Ligandos del receptor acoplado a la proteina g y metodos. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere a peptidos RF-amida y a su uso para tratar, prevenir y curar trastornos medicos neurologicos y metabolicos; la invencion tambien se refiere a metodos para modular un receptor acoplado a la proteina G y para identificar sustancias que modulan al receptor.

Description

t LIGANDOS DEL RECEPTOR ACOPLADO A LA PROTEINA G Y METODOS Esta solicitud reclama el beneficio de la solicitud de patente provisional de los Estados Unidos No. 60/372,640, presentada el 12 de abril del 2002, actualmente pendiente, la cual se incorpora en la presente invención como referencia en su totalidad.

CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se refiere a un receptor acoplado a la proteína G y a la identificación de ligandos que se unen al receptor. Más particularmente, ésta se refiere a métodos para utilizar el receptor en sistemas de selección para identificar agonistas y antagonistas del receptor. La invención también se refiere a los ligandos peptídicos novedosos del receptor, ácidos nucleicos que codifican los ligandos peptídicos así como a métodos para elaborar y utilizar los ligandos peptídicos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION Los receptores acoplados a la proteína G (GPCRs) median las respuestas celulares a una enorme diversidad de moléculas de señalización, incluyendo hormonas, neurotransmisores, y mediadores locales, los cuales son tan variados en estructura como lo son en función: la lista incluye proteínas y péptidos pequeños, así como aminoácidos y derivados de ácidos grasos. A pesar de la diversidad química y funcional de las moléculas de señalización que se unen a éstos, todos los receptores acoplados a la proteína G cuyas secuencias de aminoácidos son conocidas a partir de los estudios de secuenciación de ADN tienen una estructura similar y están casi indudablemente relacionados de manera evolutiva. Estos consisten de una cadena polipeptídica sencilla que atraviesa siete veces hacia atrás y hacia adelante a través de la bicapa lipídica. Los miembros de esta familia de receptores tienen conservada no nada más su secuencia de aminoácidos sino también su relación funcional con las proteínas G por medio de la cual éstas transmiten dentro del interior de la célula el mensaje de que está presente un ligando extracelular. Los receptores acoplados a la proteína G son una clase importante de blancos de fármacos que existen en la superficie membranal de todas las células y están asociados con una amplia variedad de categorías terapéuticas, incluyendo control del dolor y analgesia, asma, inflamación, obesidad, cáncer, enfermedades cardiovasculares, metabólicas, virales, inmunomoduladoras, gastrointestinales y del sistema nervioso central. Se han estimado que son más de 1 ,000 los GPCRs en el genoma humano con utilidad terapéutica potencial. No obstante que los GPCRs han sido históricamente blancos valiosos de fármacos, hasta la fecha existen solamente aproximadamente 200 GPCRs bien caracterizados con ligandos conocidos, de los cuales solamente aproximadamente la mitad son actualmente blancos de fármacos comerciales. Los GPCRs remanentes, para los cuales no se ha identificado un ligando, se refieren típicamente como "GPCRs huérfanos". Un GPCR huérfano de particular interés es el receptor hRUP4, en adelante referido como el receptor SP9155. El receptor SP9155 también ha sido referido como vc-38_1 , AXOR16 y como GP103. La secuencia de aminoácidos de este receptor se ha descrito previamente, por ejemplo, en diversas Solicitudes Internacionales incluyendo PCT/US99/19351 (WO 00/11015), PCT/US99/24065 (WO 00/22131 ), PCT/US99/23687 (WO 00/31258), PCT/USOO/16869 (WO00/78809), PCT/JPOO/05684 (WO 01/16316) y PCT/JP00/09409 (WO 01/48189). No obstante, estas publicaciones no describen un ligando para el receptor SP9155. El receptor SP9155 tiene homología de secuencia de aminoácidos con la orexina A, orexina B y con los receptores NPFF. Se ha mostrado que los receptores de la orexina A y B están implicados en enfermedades metabólicas tales como la obesidad (Shiraishi, et al., (2000) Physiol. Behav. 71: 251-61; Mondal, et al., (1999) Neurosci. Lett. 273: 45-48 y Dun, et al., (2000) Regul. Pept. 96: 65-70). Se ha mostrado que los receptores NPFF están implicados en el control del dolor y la analgesia (Lake, et al., (1991) Neurosci. Lett. 132: 29-32; Kavaliers, et al., (1992) Peptides 13: 603-607 y Dong, et al., (2001 ) Cell 106: 619-632). Por consiguiente, la identificación de un ligando para el receptor SP9155 podría ser potencialmente útil en el desarrollo de terapias para trastornos metabólicos y neurológicos. Los neuropéptidos son una clase terapéuticamente importante de ligandos GPCR los cuales se utilizan como moléculas de señalización en el sistema nervioso de la mayoría de los organismos, incluyendo mamíferos. Por ejemplo, se ha mostrado que los neuropéptidos RF-amida tienen diversas funciones incluyendo cardioexcitación (Greenberg, et al., (1979), Am. Zoologist 19: 163-167 y Groóme, et al., (1994) Biol. Bull. 186: 309-318), control de la contracción muscular (Bowman., et al., (1996) Peptides 17: 381-387 y Franks, et al., (1994) Parasitology 108: 229-236), neuromodulación en invertebrados (Brownlee, et al., (1995) Parasitology 11 : 379-384 y Cottrell, et al., (1983) Nature 304: 638-640) así como efectos anti-opioides en vertebrados (Kavaliers, et al., (1985) Neuroendocrinology 40: 533-535 y Yang, et al., (1985) Prog. Clin. Biol. Res. 192: 313-322). Por consiguiente, la identificación de los GPCRs a los cuales se unen los neuropéptidos tales como las RF-amidas también podría ser útil en el desarrollo de terapéuticos potenciales.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION Los presentes inventores han dirigido las necesidades precedentes mediante la identificación del ligando del GPCR huérfano SP9155 lo cual permite el desarrollo de métodos para seleccionar agonistas y antagonistas del receptor. Además, los presentes inventores también han identificado ligandos peptídicos novedosos para SP9155 y el ADNc el cual codifica a los ligandos SP9155. La presente invención provee un método para identificar un agonista o antagonista de SP9155 que comprende los pasos de (a) poner en contacto el SP9155 o un fragmento funcional del mismo, en la presencia de una cantidad conocida del ligando SP9155 marcado, con una muestra a ser evaluada para la presencia de dicho agonista o antagonista; y (b) medir la cantidad del ligando que se une específicamente al receptor. En el método, la muestra se identifica como que contiene un agonista o antagonista mediante la medición de la unión sustancialmente reducida del ligando al receptor, en comparación con la que se podría medir en la ausencia de la muestra. Preferiblemente el ligando es un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de cualesquiera de SEQ ID NOs: 4-11 ó 13-18. Preferiblemente, el polipéptido está amidado en el carboxi-terminal. Preferiblemente, el receptor comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 20. Preferiblemente, la fuente del receptor SP9 55 es una membrana aislada a partir de una célula de mamífero que expresa el receptor. La invención también provee un método para identificar un agonista o antagonista de un receptor SP9155 o un fragmento funcional del mismo que incluye el paso de (a) poner en contacto una célula que expresa el receptor en la presencia de una cantidad conocida del ligando SP9155, con una muestra a ser evaluada para la presencia de dicho agonista o antagonista; y (b) medir la movilización del calcio por la célula. En el método, la muestra se identifica como que contiene un antagonista mediante la medición de la movilización sustancialmente reducida del calcio, en comparación con la que se podría medir en la ausencia de dicha muestra y la muestra se identifica como que contiene un agonista mediante la medición de la movilización sustancialmente incrementada del calcio, en comparación con la que se podría medir en la ausencia de dicha muestra. Preferiblemente, la movilización del calcio por la célula se mide mediante el contacto del calcio con un indicador del calcio, tal como pentaacetoximetilo éster del ácido 1-[2-Amino-5-(2, 7-dicloro-6-hidroxi-3-oxi-9-xantenil)fenoxi]-2-(2'-amino-5'-metüfenoxi)etan-N,N,N',N'-tetraacético (Fluor-3-??), y luego midiendo la fluorescencia del indicador. Preferiblemente el ligando es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de cualesquiera de SEQ ID NOs: 4-11 ó 13-18. Preferiblemente, el polipéptido está amidado en el carboxi-terminal. Preferiblemente el receptor SP9155 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o de SEQ ID NO: 20. La presente invención provee un precursor RF-Amida, a partir tanto de ratones como de humanos, que comprende las secuencias de aminoácidos y de nucleótidos establecidas en SEQ ID NOs: 3 y 4 y en SEQ ID NOs: 12 y 13, respectivamente. Cada uno de los precursores de humano y de ratón incluye varios péptidos más pequeños, internos, preferiblemente péptidos antigénicos, los cuales, preferiblemente, comprenden la secuencia de aminoácidos establecida anteriormente en cualesquiera de SEQ ID NOs: 5-11 y 12-18. El precursor de humano se expresa en tejidos cerebrales, cardiacos y hepáticos. También se provee un polipéptido aislado, antigénico que comprende 7 o más residuos contiguos de una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir de SEQ ID NOs: 4 (precursor de humano) y 13 (precursor de ratón). En modalidades preferidas, los polipéptidos están marcados. Los polipéptidos pueden comprender un carboxi terminal no modificado o modificado (por ejemplo, amidado). La invención también incluye moléculas de anticuerpo que se unen específicamente a los polipéptidos de la invención. La invención también provee un ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido precursor (SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 13) el cual, preferiblemente, comprende la secuencia de nucleótidos establecida anteriormente en SEQ ID NO: 3 o en SEQ ID NO: 12, respectivamente.

También se provee un ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido antigénico, preferiblemente un polipéptido antigénico, que comprende 7 o más residuos contiguos de una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir de SEQ ID NOs: 4 (precursor de humano) y 13 (precursor de ratón).

Preferiblemente, el ácido nucleico comprende 21 o más nucleótidos contiguos a partir de la secuencia nucleotídica establecida anteriormente en SEQ ID NO: 3 o en SEQ ID NO: 12. La invención provee adicionalmente un vector recombinante que comprende los ácidos nucleicos de la invención y una célula hospedera que comprende el vector. El receptor SP9155 de ratón (por ejemplo, SEQ ID NOs: 19 y 20) s y cualquier fragmento funcional del mismo es una parte adicional de la presente invención junto con los péptidos que comprenden 7 o más residuos contiguos a partir de la secuencia de aminoácidos establecida anteriormente en SEQ ID NO: 20 y de los ácidos nucleicos de codifican los péptidos (por ejemplo, ácidos nucleicos que comprenden 21 o más nucleótidos contiguos a partir de la secuencia nucleotídica establecida en SEQ ID NO: 19). La invención provee adicionalmente un método para elaborar un polipéptido de la invención que comprende cultivar una célula hospedera que comprende un vector de la invención bajo condiciones en las cuales se expresa el ácido nucleico presente en el vector. Preferiblemente, el polipéptido se aisla a partir del cultivo. La presente invención también provee un método para unir un péptido antigénico que comprende 7 o más residuos contiguos de una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir de SEQ ID NOs: 4 y 13 con una molécula de anticuerpo la cual reconoce al péptido incluyendo el paso de poner en contacto al péptido con la molécula del anticuerpo. La presente invención también provee un método para tratar o prevenir una condición médica en un sujeto mediada por el receptor SP9155 que incluye el paso de administrar, al sujeto, una composición farmacéutica la cual incluye una molécula de anticuerpo la cual reconoce a un polipéptido de la invención junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable. El método se puede utilizar para tratar una condición médica tal como dolor u obesidad. Los péptidos RF-amida de la invención pueden ser útiles, entre otras funciones, para la unión y modulación de la actividad de los receptores acoplados a la proteína G (GPCRs) tales como el receptor SP9155 de humano (por ejemplo, SEQ ID NOs: 1 y 2; véase también WO 00/1 1015, WO00/22131 , WO 00/31256, WO 00/78809, WO 01/16316 y WO 01/48189) o el receptor SP9 55 de ratón (por ejemplo, SEQ ID NOs: 9 y 20). El receptor SP9155 de humano se expresa en el tejido cerebral, cardiaco, renal y en el colon. Los péptidos RF-amida de la invención se pueden utilizar como péptidos antigénicos para la generación de moléculas de anticuerpo las cuales reconocen a los precursores de humano y de ratón o a cualquier subsecuencia de los mismos.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Ensayos La presente invención incluye ensayos para el descubrimiento de agonistas y antagonistas del receptor SP9155 o un fragmento funcional de los mismos que pueden ser útiles en el tratamiento y manejo de una variedad de condiciones médicas mediadas por la unión del receptor a sus ligandos tales como trastornos metabólicos (por ejemplo, obesidad) o condiciones del SNC (por ejemplo, dolor). Específicamente, el receptor SP9155 o un fragmento funcional del mismo y los ligandos del péptido RF-amida de esta invención se pueden emplear en dichos métodos de selección. Esencialmente, estos métodos implican el contacto de un receptor SP9155 (por ejemplo, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 20) o de un fragmento funcional del mismo con un ligando SP9155 (por ejemplo, cualesquiera de SEQ ID NOs: 4-11 y 13-18 o cualquier subsecuencia de las mismas) y una muestra a ser evaluada para la presencia de un agonista o antagonista del receptor SP9155. "Muestra" o "sustancia candidato" se refiere a una composición la cual se evalúa en una prueba o ensayo, por ejemplo, para su capacidad de agonizar o antagonizar al receptor SP9155 (por ejemplo, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 20) o un fragmento funcional del mismo. Las muestras pueden incluir sustancias incluyendo moléculas pequeñas, péptidos, nucleótidos, polinucleótidos, partículas subatómicas y radiación (por ejemplo, partículas a, partículas ß, radiación ?, rayos X) y moléculas de anticuerpo. Los antagonistas y agonistas pueden modular la capacidad del receptor SP9155 (por ejemplo, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 20) o de un fragmento funcional del mismo para unirse a un ligando tal como un péptido RF-Amida (por ejemplo, cualesquiera de SEQ ID NOs: 4-11 y 13-18 o cualquier subsecuencia de las mismas) y/o modular la capacidad del receptor SP9 55 o de un fragmento funcional del mismo para producir señales intracelulares (por ejemplo, acoplamiento a la proteína G, movilización de calcio). Se prefieren dos tipos básicos de sistemas de selección, un ensayo de unión al ligando marcado y un ensayo "funcional". Un ligando marcado para uso en el ensayo de unión se puede obtener mediante el marcado del ligando del receptor SP9155 (por ejemplo, cualesquiera de SEQ ID NOs: 4-11 y 13-18 o cualquier subsecuencia de las mismas) o un agonista o antagonista conocido del receptor SP9155 con una marca detectable (por ejemplo, 25l o 3H). Típicamente, una cantidad dada de un receptor SP9155 de la invención (por ejemplo, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 20) se pone en contacto con cantidades en incremento del ligando marcado (por ejemplo, 3H-p52), y la cantidad del ligando unido, marcado se mide después de la remoción del ligando no unido, marcado mediante lavado. Conforme la cantidad del ligando marcado se incrementa, eventualmente se alcanza un punto en el cual todos los sitios de unión al receptor están ocupados o saturados. La unión específica del receptor al ligando marcado se elimina mediante un gran exceso de ligando no marcado. Preferiblemente, se utiliza un sistema de ensayo en el cual la unión no específica del ligando marcado al receptor es mínima. La unión no específica típicamente es menor que el 50%, preferiblemente menor que el 15%, y más preferiblemente menor que el 10% de la unión total del ligando marcado. El término "ligando del receptor SP9155" incluye los péptidos RF-Amida de la invención, por ejemplo, como se estableció anteriormente en el cuadro 1 (por ejemplo, cualesquiera de las SEQ ID NOs: 4-11 ó 13-18) o cualquier análogo de los mismos. El término también incluye cualquier péptido que comprende 7 o más aminoácidos contiguos a partir de SEQ ID NO: 4 o a partir de SEQ ID NO: 13 (como se discute a continuación). Preferiblemente, los ligandos peptídicos están carboxi-terminalmente amidados.

En principio, un ensayo de unión de la invención se puede llevar a cabo utilizando un receptor soluble de la invención, por ejemplo, siguiendo la producción y el replegamiento mediante métodos estándares a partir de un sistema de expresión en E. coli, y el complejo receptor-ligando marcado resultante se puede precipitar, por ejemplo, utilizando un anticuerpo en contra del receptor. Posteriormente el precipitado se puede lavar y se puede medir la cantidad del ligando unido marcado. No obstante, preferiblemente, un ácido nucleico que codifica el receptor SP9155 de la invención se transforma o se transfecta dentro de una célula hospedera apropiada (por ejemplo, HEK293 o CHO), por medio del cual el receptor será incorporado dentro de la membrana de la célula. Posteriormente se puede aislar una fracción membranal a partir de la célula y se utiliza como una fuente del receptor para el ensayo. Preferiblemente, la unión específica del ligando marcado a una fracción membranal a partir de la célula hospedera no transfectada será insignificante. Los ensayos de unión de esta invención se pueden utilizar para identificar tanto agonistas como antagonistas del receptor SP9155 o un fragmento funcional de los mismos debido a que, en general, ambos modularán la unión del ligando marcado al receptor. En el ensayo de unión básico, el método para identificar un agonista o antagonista del receptor SP9155 incluye los pasos de (a) poner en contacto un receptor SP9155 (por ejemplo, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 20 o un fragmento funcional de las mismas), en la presencia de una cantidad conocida del ligando del receptor SP9155 marcado (por ejemplo, cualesquiera de SEQ ID NOs: 4-11 y 13-18 o cualquier subsecuencia de las mismas), con una muestra; y (b) medir la cantidad del ligando específicamente unido al receptor. La muestra se puede identificar como que contiene un agonista o antagonista mediante la medición de la unión sustancialmente reducida del ligando al receptor, en comparación con la que se podría medir en la ausencia de la muestra. En una modalidad de la invención, el método precedente incluye pasos adicionales los cuales se llevan a cabo en un experimento control separado: (c) poner en contacto un receptor SP9155 o un fragmento funcional del mismo, en la presencia de una cantidad conocida de ligando marcado, con un compuesto que se sabe que es un agonista o antagonista del receptor SP9155; y (d) medir la cantidad del ligando marcado unido al receptor. Los ensayos celulares o funcionales también se pueden utilizar para determinar si una muestra contiene un agonista o antagonista del receptor SP9 55. En estos ensayos, se evalúa la capacidad de una muestra para modular un parámetro celular el cual es mediado por el receptor SP9155 (por ejemplo, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 20); dichos parámetros incluyen, pero no se limitan a, rutas intracelulares de segundos mensajeros activadas vía los receptores, cambios en la velocidad del crecimiento celular, secreción de hormonas, movilización del calcio, etcétera, utilizando métodos publicados. Los ejemplo de dichos métodos incluyen la medición de los efectos de los ligandos sobre la inhibición mediada por el receptor de la producción de AMPc intracelular estimulada porforskolina (Parker, et al., (1995) Mol. Brain Res. 34: 179-189), movilización del Ca2+ estimulada por el receptor y efectos mitogénicos (Sethi, et al., (1991) Cáncer Res. 51 : 1674-1679), y producción de inositol fosfato e inducción de la MAP cinasa (Wang, et al., (1998) Biochemistry 37: 6711-17. En modalidades preferidas, la movilización del calcio en las células que expresan el receptor SP9155 se determina utilizando un ensayo en lector de placas para representación fluorométrica (FLIPR), por ejemplo, como se describe en Zhang, et al., (2001) Journal of Biol. Chem. 276 (11): 8608- 8615. En general, el ensayo FLIPR incluye los pasos de: (a) poner en contacto una célula (por ejemplo, célula HEK293 o célula CHO) que expresa un receptor SP9155 (por ejemplo, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 20 o un fragmento funcional de las mismas), en la presencia de una cantidad conocida del ligando del receptor SP9155 (por ejemplo, cualesquiera de SEQ ID NOs: 4-11 y 13-18 o cualquier subsecuencia de las mismas), con una muestra; y (b) medir la movilización de calcio por la célula. La movilización del calcio se puede medir mediante la exposición de la célula a un indicador de calcio tal como Fluor-3-Am (Molecular Probes; Eugene, OR; pentaacetoximetilo éster del ácido 1-[2-Amino-5-(2,7- dicloro-6-hidroxi-3-oxi-9-xantenil)fenoxi]-2-(2'-amino-5,-metilfenoxi)etan-N,N,N,,N'-tetraacético). En la presencia de Ca2+, el indicador fluoresce. La florescencia se puede detectar mediante el análisis de las células, por ejemplo, con un lector de placas para representación fluorométrica.

La muestra se puede identificar como que contiene un antagonista mediante la medición de la movilización sustancialmente reducida del calcio, en comparación con la que se podría medir en la ausencia de la muestra y la muestra se puede identificar como que contiene un agonista mediante la medición de la movilización sustancialmente incrementada del calcio, en comparación con la que se podría medir en la ausencia de la muestra.

Biología molecular Las secuencias de aminoácidos y de nucleótidos de los polipéptidos y ácidos nucleicos de la invención aparecen en el listado de secuencia como se resume, a continuación, en el cuadro 1.

CUADRO 1 Polipéptidos y ácidos nucleicos de la invención Típicamente, los precursores se escinden, in vivo, en un sitio de reconocimiento, por ejemplo mediante una proteasa (por ejemplo, una furin proteasa o prohormona convertasa), para producir un péptido RF-Amida el cual incluye el motivo carboxi-terminal Arg-Phe (RF). El carboxi-terminal se puede amidar subsecuentemente mediante amidasas celulares para crear un motivo Arg-Phe-C(=0)-NH2 (RF-amida). Los péptidos con una secuencia de aminoácidos de cualesquiera de SEQ ID NOs: 4-11 y 13-18 pueden comprender un carboxi-terminal libre, no modificado o, preferiblemente, un carboxi-terminal amidado. Los números en paréntesis en las hileras de las SEQ ID NOs: 5- 11 los cuales están marcados por "*" indican la porción del precursor humano (SEQ ID NO: 4) a partir de la cual se derivan los péptidos. De manera similar, los números en paréntesis en las hileras de las SEQ ID NOs: 14-18 los cuales están marcados por "*" indican la porción del precursor de ratón (SEQ ID NO: 13) a partir de la cual se derivan los péptidos. Los números en paréntesis marcados por "t" indican los nucleótidos del gen precursor de humano o de ratón correspondiente el cual codifica el péptido indicado. No obstante que las secuencias nucleotídicas establecidas en SEQ ID NOs: 3 y 12 son deoxirribonucleótidos, ácidos nucleicos que comprenden las secuencias correspondientes de ribonucleótidos, también se encuentran dentro del alcance de la presente invención. Los ácidos nucleicos que incluyen la cadena anti-sentido de las SEQ ID NOs: 3 y 12 o cualquier subsecuencia de las mismas también están dentro del alcance de la presente invención. Se han identificado diversos polimorfismo codificados por nucleótidos particulares (cSNPs) en el gen SP9155 de humano. Cada cSNP (por ejemplo, g154a-G52S; t181g-F61V; t206g-V69G; g208t-V70L; t447g-H149Q; g748t-G250C; t1031c-L344S; c1111t-R371W; g1162a-G388R y c1228t-L410F) se establece anteriormente en el listado de secuencia. Además, se han identificado diversos cSNPs en el precursor de humano. Cada cSNP, el cual también se establece anteriormente en el listado de secuencia, se resume a continuación en el cuadro 2.

CUADRO 2 Codificación de polimorfismos por nucleótidos particulares en el precursor de humano De conformidad con la presente invención se pueden emplear técnicas convencionales de biología molecular, microbiología, y técnicas de ADN recombinante dentro de la capacidad de la técnica. Dichas técnicas se explican completamente en la literatura. Véase, por ejemplo, Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloninq: A Laboratorv Manual, segunda edición (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (en la presente invención "Sambrook, et al., 1989"); DNA Cloninq: A Practical Approach, volúmenes I y II (D. N. Glover ed. 1985); Oliqonucleotide Svnthesis (M. J. Gait ed. 1984); Nucleic Acid Hvbridization (B. D. Hames & S. J.Higgins eds. (1985)); Transcription And Translation (B. D. Hames & S. J. Higgins, eds. (1984)); Animal Cell Culture (R. I. Freshney, ed. (1986)); Immobilized Cells And Enzvmes (IRL Press, (1986)); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloninq (1984); F. M. Ausubel, et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Bioloqy, John Wiley & Sons, Inc. (1994). Para los propósitos de la presente invención, el término "RF-Amida" o "péptido RF-Amida" o "polipéptido RF-Amida" incluye cualquier péptido de la invención (por ejemplo, véase el cuadro 1 ) o cualquier análogo del mismo el cual está en cualquier forma. Por ejemplo, el término incluye péptidos con un carboxi-terminal amidado y péptidos con un carboxi-terminal no modificado. El término "SP9155" o "receptor SP9155" incluye el receptor de humano (por ejemplo, SEQ ID NOs: 1 y 2) y el receptor de ratón (por ejemplo, SEQ ID NOs: 19 y 20). El término "sujeto" o "paciente" se refiere a cualquier organismo, preferiblemente un animal, más preferiblemente un mamífero (por ejemplo, ratón, rata, conejo, vaca, perro, gato, vaca, chimpancé, gorila) y más preferiblemente un humano. La presente invención incluye versiones recombinantes de los péptidos RF-amida de la invención. El término "recombinante" puede describir dos o más ácidos nucleicos o proteínas las cuales no son contiguas de manera natural y los cuales están fusionados entre sí. El término también se puede referir a un ácido nucleico o proteína la cual ha sido alterada (por ejemplo, modificados o mutados post-traduccional mente) mediante intervención humana. Por ejemplo, un codón de tipo silvestre se puede reemplazar con un codón redundante que codifica el mismo residuo de aminoácido o una sustitución conservativa, mientras que al mismo tiempo se introduce o se remueve una secuencia de ácido nucleico del sitio de reconocimiento. De manera similar, los segmentos de ácido nucleico que codifican las funciones deseadas se pueden fusionar para generar una entidad genética particular que codifica una combinación deseada de funciones que no se encuentran juntas en la naturaleza. A pesar de que los sitios de reconocimiento para las enzimas de restricción frecuentemente son el blanco de dichas manipulaciones artificiales, otros blancos sitios específicos, por ejemplo, promotores, sitios de replicación del ADN, secuencias de regulación, secuencias control, y otras características útiles se pueden incorporar mediante diseño. También se pueden incorporar las secuencias que codifican marcas de epítopes para la detección o purificación, como se describen a continuación. Una "secuencia polinucleótida", "secuencia de ácido nucleico" o "secuencia nucleotídica" es una serie de dos o más bases nucleotídicas (también denominados "nucleótidos") en un ácido nucleico, tal como ADN o ARN. La presente invención incluye fragmentos de ácido nucleico de cualesquiera de los polinucleótidos establecidos anteriormente en el cuadro 1 (por ejemplo, SEQ ID NO: 3 ó 12). Un "fragmento" de ácido nucleico incluye al menos aproximadamente 12, 15, 18 ó 21 (por ejemplo, 22, 23 ó 24), generalmente al menos aproximadamente 25 (por ejemplo, 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 32, 33 ó 34), preferiblemente al menos aproximadamente 35 (por ejemplo, 36, 37, 38, 39, 40, 41 , 42, 43 ó 44), más preferiblemente al menos aproximadamente 45 (por ejemplo, 46, 47, 48, 49, 50, 51 , 52, 53 ó 54), y más preferiblemente al menos aproximadamente 55 o más nucleótidos contiguos (por ejemplo, 56, 57, 58, 59, 60, 100, 200, 300, 400, 500, 1000 ó 1200) a partir de, por ejemplo, cualesquiera de SEQ ID NOs: 3 y 12. Los fragmentos cortos de ácidos nucleicos (por ejemplo, entre aproximadamente 10 nucleótidos y aproximadamente 100 nucleótidos) también se pueden referir como "oligonucleótidos". Los oligonucleótidos se pueden utilizar como iniciadores para la amplificación mediante PCR. La "amplificación" de ADN como se utiliza en la presente invención puede denotar el uso de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para incrementar la concentración de una secuencia particular de ADN dentro de una mezcla de secuencias de ADN. Para una descripción de la PCR véase Saiki, et al., (1988) Science 239: 487. Los oligonucleótidos y los fragmentos de ácido nucleico se pueden marcar, por ejemplo, mediante incorporación de 32P-nucleótidos, 3H-nucleótidos, 4C-nucleótidos, 35S-nucleótidos o nucleótidos a los cuales una marca, tal como biotina, se ha conjugado covalentemente. En una modalidad, se puede utilizar un oligonucleótido marcado como una sonda para detectar la presencia de un ácido nucleico. En otra modalidad, los oligonucleótidos (uno o ambos de los cuales pueden estar marcados) pueden ser utilizados como iniciadores de PCR, ya sea para la clonación de un gen de longitud total o de un fragmento del gen, o para detectar la presencia de ácidos nucleicos. Generalmente, los oligonucleótidos se preparan de manera sintética, preferiblemente en un sintetizador de ácido nucleico.

Una "secuencia de proteína", "secuencia peptídica" o "secuencia polipeptídica" o "secuencia de aminoácidos" se puede referir a una serie de dos o más aminoácidos en una proteína, péptido o polipéptido. La "proteína", "péptido" o "polipéptido" incluye una hilera contigua de aminoácidos. Los péptidos preferidos de la invención incluyen aquellos establecidos en el cuadro 1 así como variantes (por ejemplo, variantes terminalmente carboxi-amidadas) y fragmento de las mismas. Dichos fragmentos preferiblemente comprenden al menos aproximadamente 4, 5, 6 ó 7 (por ejemplo, 8, 9, 10 u 11), preferiblemente al menos aproximadamente 12 (por ejemplo,13, 14, 15, 16, 17, 18 ó 19), más preferiblemente al menos aproximadamente 20 (por ejemplo, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 ó 29), y más preferiblemente al menos aproximadamente 30 (por ejemplo, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 124 ó 136) o más residuos contiguos de aminoácidos a partir de cualesquiera de SEQ ID NOs: 4 y 13. Como se discute a continuación, dichos péptidos pueden ser útiles como antígenos para generar moléculas de anticuerpo las cuales reconocen a los péptidos precursores del péptido RF-Amida (por ejemplo, SEQ ID NOs: 4 y 13) o cualesquiera fragmentos de las mismas. Los polipéptidos de la invención se pueden producir mediante la escisión proteolítica de un péptido intacto, mediante síntesis química o mediante la aplicación de tecnología de ADN recombi'nante y no se limitan a polipéptidos delineados por los sitios de escisión proteolítica. Los polipéptidos, ya sea solos o entrecruzados o conjugados a una molécula vehículo para volverlos más inmunogénicos, son útiles como antígenos para inducir la producción de anticuerpos y fragmentos de los mismos. Los anticuerpos se pueden utilizar, por ejemplo, en inmunoensayos para purificación por inmunogenicidad, etc. El término "ácido nucleico aislado" o "polipéptido aislado" se pueden referir a un ácido nucleico, tal como a una molécula de ARN o de ADN o a un polímero mezclado, o a un polipéptido, respectivamente, el cual está separado parcialmente o. completamente a partir de otros componentes que se encuentran normalmente en células o en sistemas de expresión de ADN recombinante. Estos componentes incluyen, pero no se limitan a, membranas celulares, paredes celulares, ribosomas, polimerasas, componentes del suero, y secuencias genómicas flanqueantes. El término incluye así una secuencia de ácido nucleico que ha sido removida a partir de su ambiente en el que se presenta naturalmente, y puede incluir aislados de ADN recombinante o de ADN clonado y análogos químicamente sintetizados o análogos biológicamente sintetizados por sistemas heterólogos. Un ácido nucleico aislado o polipéptido será, preferiblemente, una composición de moléculas esencialmente homogénea que puede contener cierta heterogeneidad. El término "substancialmente puro" se puede referir a un péptido RF-amida, ácido nucleico u otro material que está libre de otras proteínas contaminantes, ácidos nucleicos, y otros elementos biológicos derivados a partir de un organismo que es la fuente original o un sistema de expresión de ADN recombinante. La pureza también se puede ensayar mediante métodos estándares y típicamente excederá al menos aproximadamente 50%, preferiblemente al menos aproximadamente 75%, más preferiblemente al menos aproximadamente 90%, y más preferiblemente al menos aproximadamente 95% (por ejemplo, aproximadamente 100%) de pureza. La evaluación de la pureza se puede realizar en una base de masa o molar. La invención comprende adicionalmente proteínas y ácidos nucleicos que tienen, respectivamente, secuencias de aminoácidos o de nucleótidos las cuales contienen la identidad de secuencia o una identidad de secuencia similar a las proteínas y ácidos nucleicos establecidos en el cuadro 1. La "identidad" de secuencia se refiere a las coincidencias exactas entre los nucleótidos o aminoácidos de dos secuencias que se comparan. La "similitud" u "homología" de secuencia se refiere tanto a las coincidencias exactas entre los aminoácidos de dos polipéptidos los cuales van a ser comparados en adición a las coincidencias entre los aminoácidos no idénticos, bioquímicamente relacionados. Los aminoácidos bioquímicamente relacionados comparten propiedades similares y pueden ser intercambiables. Los aminoácidos con propiedades similares que pueden ser intercambiables se conocen bien en la técnica. Por ejemplo, los aminoácidos polares/hidrófilos que pueden ser intercambiables incluyen a la asparagina, glutamina, serina, cisteína, treonina, lisina, arginina, histidina, ácido aspártico y ácido glutámico; los aminoácidos no polares/hidrófobos que pueden ser intercambiables incluyen a la glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, tirosina, fenilalaninae, triptofano y metionina; los aminoácidos ácidos los cuales pueden ser intercambiables incluyen al ácido aspártico y al ácido glutámico y los aminoácidos básicos los cuales pueden ser intercambiables incluyen a la histidina, lisina y arginina. La "identidad" y "similitud" de secuencia se puede calcular fácilmente mediante métodos conocidos, incluyendo pero no limitados a aquellos descritos en (Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Proiects. Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analvsis of Sequence Data, Parte I, Griffin, A. M., y Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analvsis in Molecular Biology. von Heinje, G., Academic Press, 1987; v Sequence Analvsis Primer. Gribskov, M. y Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991 ; y Carillo, H., et al. (1988), SIAM J. Applied Math., 48: 1073. Los métodos preferidos para determinar la identidad se diseñan para producir la mayor coincidencia entre las secuencias evaluadas. Los métodos para determinar la identidad y similitud están codificados en programas de cómputo disponibles al público. Los métodos de programas de cómputo preferidos para determinar la identidad y similitud entre dos secuencias incluyen, pero no se limitan a, el paquete del programa GCG (Devereux, J., et al., (1984) Nucleic Acids Research 12 (1): 387), BestFit, BLASTP, BLASTN, y FASTA (Altschul, S. F., et al., (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410. El programa BLASTX está disponible al público a partir de NCBI y otras fuentes (BLAST Manual. Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894; Altschul, S.t et al„ (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410. El algoritmo de Smith Waterman bien conocido también se puede utilizar para determinar la identidad. Los parámetros preferidos para la comparación de secuencias polipeptídicas incluyen los siguientes: 1) Algoritmo: Needleman, et al., (1970), J. Mol. Biol.48: 443-453 Matrix de comparación: BLOSSUM62 a partir de Hentikoff, et al., (1992) Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 89: 10915-10919 Sanción por omisión: 12 Sanción por longitud de espacio: 4 Un programa útil con estos parámetros está disponible al público como el programa "gap" a partir del Genetics Computer Group, localizado en Madison, Wl. Los parámetros anteriormente mencionados son los parámetros por omisión de las comparaciones peptídicas (junto con ausencia de sanción para los espacios terminales). Los parámetros preferidos para la comparación de polinucleótidos, utilizando el programa "espacio", incluyen los siguientes: 1) Algoritmo: Needleman, et al., (1970) J. Mol. Biol.48: 443-453 Matrix de comparación: coincidencias = +10, no coincidencias = 0 Sanción por espacio: 50 Sanción por longitud de espacio: 3 La presente invención incluye ácidos nucleicos (por ejemplo, SEQ ID NOs: 3 y 12) los cuales codifican los polipéptidos descritos en el cuadro 1 (por ejemplo, SEQ ID NOs: 4-11 y 13-18), fragmentos de los mismos (discutidos anteriormente) así como ácidos nucleicos los cuales hibrídan a los mismos. Preferiblemente, los ácidos nucleicos hibrídan bajo condiciones de severidad baja, más preferiblemente bajo condiciones de severidad moderada y más preferiblemente bajo condiciones de severidad alta. Una molécula de ácidos nucleicos es "hibridable" a otra molécula de ácido nucleico, tal como un ADNc, ADN genómico, o ARN, cuando una forma en cadena sencilla de la molécula de ácido nucleico se puede fijar a la otra molécula de ácido nucleico bajo las condiciones apropiadas de temperatura y de fuerza iónica de la solución (véase Sambrook, et al., anteriormente mencionado). Las condiciones de temperatura y de fuerza iónica determinan la "severidad" de la hibridación. Las condiciones de hibridación típicas, de baja severidad pueden ser a 55°C, SSC 5X, SDS al 0.1%, leche al 0.25%, y sin formamida; o formamida al 30%, SSC 5X, SDS al 0.5%. Las condiciones de hibridación típicas, de severidad moderada son similares a las condiciones de severidad baja excepto que la hibridación se lleva a cabo en formamida al 40%, con SSC 5X o 6X. Las condiciones de hibridación de alta severidad son similares a las condiciones de baja severidad excepto que las condiciones de hibridación se pueden llevar a cabo en formamida al 50%, SSC 5X o 6X y, opcionalmente, a una mayor temperatura (por ejemplo, 57°C, 59°C, 60°C, 62°C, 63°C, 65°C o 68°C). Típicamente, SSC es NaCI 0.15 M y citrato-Na 0.015 M. La hibridación requiere que los dos ácidos nucleicos contengan secuencias complementarias, sin embargo, dependiendo de la severidad de la hibridación, son posibles las no coincidencias entre las bases. La severidad apropiada para hibridar ácidos nucleicos depende de la longitud de los ácidos nucleicos y del grado de complementación, variables bien conocidas en la técnica. A mayor grado de similitud u homología entre dos secuencias nucleotídicas, mayor la severidad bajo la cual los ácidos nucleicos pueden hibridar. Típicamente, las condiciones de hibridación selectivas se presentan cuando existe al menos aproximadamente 55% de identidad sobre una hilera de al menos aproximadamente 30 nucleótidos, preferiblemente de al menos aproximadamente 65% sobre al menos aproximadamente 25 nucleótidos, más preferiblemente de al menos aproximadamente 75% a aproximadamente 95%, o más, sobre aproximadamente 20 nucleótidos o más. Para los híbridos de más de 100 nucleótidos en longitud, se han derivado las ecuaciones para el cálculo de la temperatura de fusión (véase Sambrook, et al., anteriormente mencionado, 9.50-9.51). Para la hibridación con ácidos nucleicos más cortos, por ejemplo, oligonucleótidos, la posición de las no coincidencias se vuelve más importante, y la longitud del oligonucleótido determina su especificidad (véase Sambrook, et al., anteriormente mencionado, 11.7-11.8). • Una indicación adicional de que dos ácidos nucleicos que codifican dos polipéptidos son sustancialmente idénticos es que el polipéptido codificado por el primer ácido nucleico es reactivo de manera inmunológicamente cruzada con el polipéptido codificado por el segundo ácido nucleico. Típicamente, un polipéptido se observa como sustancialmente idéntico a un segundo polipéptido, por ejemplo, en donde los dos polipéptidos difieren, principalmente, por sustituciones conservativas. También se incluyen en la presente invención los ácidos nucleicos que comprenden secuencias nucleotídicas y polipéptidos que comprenden secuencias de aminoácidos las cuales son al menos aproximadamente 70% idénticas, preferiblemente al menos aproximadamente 80% idénticas, más preferiblemente al menos aproximadamente 90% idénticas y más preferiblemente al menos aproximadamente 95% idénticas (por ejemplo, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%) a las secuencias nucleotídicas y de aminoácidos de referencia del cuadro 1. Los polipéptidos que comprenden secuencias de aminoácidos las cuales son al menos aproximadamente 70% similares o idénticas, preferiblemente al menos aproximadamente 80% similares o idénticas, más preferiblemente al menos aproximadamente 90% similares o idénticas y más preferiblemente al menos aproximadamente 95% similares o idénticas (por ejemplo, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%,100%) a las secuencias de aminoácidos de referencia del cuadro 1 (por ejemplo, SEQ ID NOs: 4-11 y 13-18) también se incluyen en la presente invención. Además, la presente invención incluye ácidos nucleicos los cuales codifican polipéptidos que comprenden secuencias de aminoácidos que son al menos aproximadamente 70% similares o idénticas, preferiblemente al menos aproximadamente 80% similares o idénticas, más preferiblemente al menos aproximadamente 90% similares o idénticas y más preferiblemente al menos aproximadamente 95% idénticas o similares (por ejemplo, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%) a aquellas establecidas en el cuadro 1 (por ejemplo, SEQ ID NOs: 4-11 y 13-18). Algunas de las variantes físicas tienen homología sustancial de secuencia de aminoácidos con las secuencias de aminoácidos de los péptídos RF-amida de la invención. En esta invención, la homología de secuencia de aminoácidos, o la identidad de secuencia se puede determinar mediante la optimización de las coincidencias de los residuos y, si es necesario, mediante la introducción de espacios como se requiera. Típicamente se pretende que las secuencias homologas de aminoácidos incluyan variaciones alélicas naturales, variaciones polimórficas e interespecie en cada secuencia respectiva. Típicamente, las proteínas o péptidos homólogos tendrán de aproximadamente 25-100% de homología (si se pueden introducir espacios) a aproximadamente 50-100% de homología (si se incluyen sustituciones conservativas), con la secuencia de aminoácidos de los péptidos RF-amida. Las homologías observadas típicamente serán de al menos aproximadamente 35%, preferiblemente de al menos aproximadamente 50%, más preferiblemente de al menos aproximadamente 75%, y más preferiblemente de al menos aproximadamente 80% o más. Véase Needleham, (1970) et al., J. Mol. Biol.48: 443-453; Sankoff, et al., en Time Warps. String Edits, and Macromolecules: The Theory and Practice of Sequence Comparison. 1983, Addison-Wesley, Reading, MA; y los paquetes de software a partir de IntelliGenetics, Mountain View, CA, y el Genetics Computer Group de la University of Wisconsin, Madison, Wl.

Los ácidos nucleicos que codifican los péptidos RF-amida o fragmentos de los mismos se pueden preparar mediante métodos estándares. Por ejemplo, el ADN se puede sintetizar químicamente utilizando, por ejemplo, el método en soporte sólido de fosforamidita de Matteucci, et al., (1981) (J. Am. Chem. Soc. 103: 3185), el método de Yoo, et al., (1989) (J. Biol. Chem. 764: 17078), u otros métodos bien conocidos. Esto se puede realizar mediante la asociación secuencial de series de cassettes de oligonucleótidos que comprenden pares de oligonucleótidos sintéticos, como se describe a continuación. Naturalmente, debido a la degeneración del código genético, muchas secuencias nucleotídicas diferentes pueden codificar los péptidos RF-amida de la invención. Los codones se pueden seleccionar para expresión óptima en sistemas procariontes o eucariontes. Dichas variantes degeneradas también se abarcan, por supuesto, por esta invención. Además, los ácidos nucleicos que codifican los péptidos RF-amida de la invención se pueden modificar fácilmente mediante sustituciones nucleotídicas, deleciones nucleotídicas, inserciones nucleotídicas, e inversiones de extensiones nucleotídicas. Dichas modificaciones pueden producir secuencias novedosas de ADN que codifican antígenos que tienen actividad inmunogénica o antigénica en común con los péptidos de tipo silvestre. Estas secuencias modificadas se pueden utilizar para producir los péptidos de tipo silvestre o péptidos mutantes, o para mejorar la expresión en un sistema de ADN recombinante.

Los ácidos nucleicos de la invención se pueden asociar operativamente a segmentos de ADN que controlan la transcripción (por ejemplo, promotores; como se discute a continuación), traducción (por ejemplo, secuencias Kozak (Kozak (1991) J. Biol. Chem. 255: 19867-19870 o Kozak (1991) J. Cell. Biol. 115: 887-903), y/o replicación de ADN (por ejemplo, orígenes de replicación tales como ori). Un ácido nucleico está "bajo el control de", "funcionalmente asociado con", "operativamente asociado a" u "operativamente asociado con" las secuencias control de la transcripción y/o traducción cuando las secuencias dirigen la transcripción mediada por la ARN polimerasa de la secuencia codificante hacia el ARN, preferiblemente hacia el ARNm, el cual puede ser entonces un ARN procesado (si éste contiene intrones) y, opcionalmente, se traduce hacia una proteína codificada por la secuencia codificante. Los términos "expresa" y "expresión" pueden significar que permite o que ocasiona que se manifieste la información en un gen, secuencia de ARN o de ADN; por ejemplo, produciendo una proteína mediante la activación de las funciones celulares implicadas en la transcripción y en la traducción de un gen correspondiente. Alternativamente, un gen se puede expresar in vitro; el ADN que contiene el gen se puede transcribir mediante una ARN polimerasa recombinante y, opcionalmente, se traduce, por ejemplo, con un lisado de reticulocito de conejo (Promega Corporation; Madison, Wl). Una secuencia de ADN se expresa en o mediante una célula, o in vitro, para formar un "producto de expresión" tal como un ARN (por ejemplo, ARNm) o una proteína. También se puede decir que el producto de expresión mismo está "expresado". Los vectores dentro de los cuales los ácidos nucleicos de la invención se pueden insertar incluyen plásmidos microbianos, virus, bacteriófago, fragmentos de ADN que se pueden integrar, y otros vehículos que pueden facilitar la introducción de los ácidos nucleicos dentro del genoma del hospedero. Los plásmidos son la forma de vector más comúnmente utilizada pero todas las otras formas de vectores que sirven para una función similar y las cuales son, o se vuelven, conocidas en la técnica son adecuadas para uso en la presente invención. Véase, por ejemplo, Pouwels, et al., Cloning Vectors: A Laboratorv Manual. 1985 y suplementos, Elsevier, N. Y., y Rodríguez et al. (eds. ), Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, 1988, Buttersworth, Boston, MA. La inserción del ADN que codifica los péptidos RF-amida o que codifica el receptor SP9 55 o un fragmento funcional del mismo dentro de un vector se logra fácilmente cuando los extremos tanto del ADN como del vector comprenden sitios de restricción compatibles. Si esto no se puede realizar, puede ser necesario modificar los extremos del ADN y/o del vector mediante la digestión de las proyecciones traseras de ADN de cadena sencilla generadas mediante la escisión de endonucleasas de restricción para producir extremos romos, o para lograr el mismo resultado mediante el llenado en los extremos de una sola cadena con una ADN polimerasa apropiada (por ejemplo, Klenow). Alternativamente, se pueden producir los sitios deseados, por ejemplo, mediante la ligación de secuencias nucleotídicas (enlazadores) en los extremos. Dichos enlazadores pueden comprender secuencias de oligonucleótidos específicos que definen los sitios de restricción deseados. Los sitios de restricción también se pueden generar mediante el uso de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Véase, por ejemplo, Saiki, et al., Science 239: 487 (1988). El vector escindido y los fragmentos de ADN también se pueden modificar si se requiere mediante modificación del extremo homopolimérico. Los vectores de expresión recombinante utilizados en esta invención son típicamente construcciones de ADN o ARN auto-replicantes que comprenden los ácidos nucleicos que codifican los péptidos RF-amida o que codifican el receptor SP9155 o un fragmento funcional del mismo y usualmente están operativamente asociados a los elementos de control genético adecuados que son capaces de regular la expresión de los ácidos nucleicos en células hospederas compatibles. Los elementos de control genético pueden incluir un sistema promotor procarionte o un sistema de control de la expresión con un promotor eucarionte, y típicamente incluyen un promotor transcripcional, un operador opcional para controlar el inicio de la transcripción, mejoradores transcripcionales para elevar el nivel de expresión del ARNm, una secuencia que codifica un sitio adecuado para unión al ribosoma, y secuencias que terminan la transcripción y la traducción. Los promotores que se pueden utilizar para controlar la expresión génica incluyen, pero no se limitan a, el sistema promotor de triptofano (trp) (Goeddel, et al., (1980) Nucleic Acids Res. 8: 4057), el sistema promotor lambda PL (Shimatake, et al., (1981) Nature 292: 128), el promotor de citomegalovirus (CMV) (Patentes de E.U.A. Nos. 5,385,839 y 5,168,062), la región del promotor temprano de SV40 (Benoist, et al., (1981) Nature 290: 304-310), el promotor contenido en el repetido terminal largo 3' del virus del sarcoma de Rous (Yamamoto, et al., Cell (1980) 22: 787-797), el promotor de la timidina cinasa del herpes (Wagner, et al., (1981) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 78: 1441-1445), las secuencias reguladoras del gen de la metalotioneína (Brinster, et al., (1982) Nature 296: 39-42), el promotor de la ß-lactamasa (Villa-Komaroff, et al., (1978) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 75: 3727-3731), o el promotor tac (DeBoer, et al., (1983) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 80: 21-25); véase también "Useful proteins from recombinant bacteria" en Scientific American (1980) 242: 74-94; los elementos promotores a partir de levaduras o de otros hongos tales como el promotor Gal4, el promotor de la ADC (alcohol deshidrogenasa), el promotor de la PGK (fosfoglicerol cinasa) o el promotor de la fosfatasa alcalina que también pueden estar operativamente asociados a los ácidos nucleicos de la invención. Los vectores de expresión también pueden contener un origen de la replicación que permite que el vector se replique independientemente de la célula hospedera. El término "célula hospedera" puede significar cualquier célula de cualquier organismo que se selecciona, modifica, transfecta, transforma, crece, o se utiliza o se manipula de cualquier forma, para la producción de una sustancia por la célula, por ejemplo la expresión o replicación, por la célula, de un gen, una molécula de ADN o de ARN, un vector, una proteína o una enzima. Las células hospederas preferidas incluyen células bacterianas tales como E. coli (por ejemplo, BL21 (DE3), DH5 o HB101 ) y células eucariontes (por ejemplo, células HEK293 o células CHO). El término "transformación" se puede referir a la introducción de un ácido nucleico (por ejemplo, SEQ ID NO: 3 ó 12, un fragmento del mismo, o un ácido nucleico el cual codifica cualesquiera de SEQ ID NOs: 4-11 y 13-18 o cualquier fragmento de los mismos) dentro de una célula. El gen o secuencia introducida se puede denominar una "clona". Una célula hospedera que recibe el ADN o ARN introducido ha sido "transformada" y es un "transformante" o es una "clona". El ADN o ARN introducido a una célula hospedera puede originarse a partir de cualquier fuente, incluyendo células del mismo género o especie que la célula hospedera, o células de un género o especie diferente. La expresión de los ácidos nucleicos que codifican los péptidos RF-amida de esta invención se puede llevar a cabo mediante métodos convencionales en cualesquiera células procariontes o eucariontes. Aunque las células hospederas de E. coli se emplean más frecuentemente en sistemas procariontes, se conocen en la técnica muchas otras bacterias, tales como diversas cepas de Pseudomonas y de Bacillus, y también se pueden utilizar. Las células hospederas adecuadas para la expresión de ácidos nucleicos que codifican los péptidos RF-amida o el receptor SP9155 o un fragmento funcional de los mismos incluyen procariontes y eucariontes superiores. Los procariontes incluyen tanto organismos gram-negativos como organismos gram-positivos, por ejemplo, E. coli y B. subtilis. Los eucariontes superiores incluyen líneas de células en cultivo de tejidos establecidas a partir de células animales, tanto de origen no mamífero, por ejemplo, células de insecto, y células de aves, como de origen de mamífero, por ejemplo, humano, primates, y roedores. Los sistemas de vectores para hospederos procariontes incluyen una amplia variedad de vectores para muchas especies diferentes. Un vector representativo para amplificar el ADN es pBR322 o muchos de sus derivados (por ejemplo, pUC 18 ó 19). Los vectores que se pueden utilizar para expresar los péptidos RF-amida incluyen, pero no se limitan a, aquellos que contienen el promotor lac (pUC-series); el promotor trp (pBR322-trp); el promotor Ipp (las series pIN); los promotores lambda-pP o pR (pOTS); o los promotores híbridos tales como ptac (pDR540). Véase Brosius, et al.,"Expression Vectors Employing Lambda-, trp-, lac-, and Ipp-derived Promoters", en Rodríguez y Denhardt (eds.) Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses. 1988, Buttersworth, Boston, pp. 205-236. Los péptidos de la invención se pueden expresar a niveles elevados en un sistema de expresión de E. coliVT7 como se describe en las Patentes de E.U.A. Nos. 4,952,496, 5,693,489 y 5,869,320 y en Davanloo, P., et al., (1984) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 81: 2035-2039; Studier, F. W., et al., (1986) J. Mol. Biol. 189: 113-130; Rosenberg, A. H., et al., (1987) Gene 56: 125-135; y Dunn, J. J„ et al., (1988) Gene 68: 259. Las células de cultivo de tejidos de eucarion.es superiores también se pueden utilizar para la producción recombinante de los péptidos RF-amida de la invención. Aunque se pueden utilizar cualquier línea de células de cultivo de tejidos de eucariontes superiores, incluyendo los sistemas de expresión de baculovirus de insectos, se prefieren las células de mamífero. La transformación o transfección y propagación de dichas células se ha vuelto un procedimiento de rutina. Los ejemplos de líneas celulares útiles incluyen a las células de riñon embrionario de humano (HEK293), células HeLa, líneas celulares de ovario de hámster chino (CHO), líneas celulares de riñon de cría de rata (BRK), líneas celulares de insecto, líneas celulares de ave, líneas celulares de mono (COS). Los vectores de expresión para dichas líneas celulares usualmente incluyen un origen de la replicación, un promotor, un sitio para inicio de la traducción, sitios para procesamiento de ARN, un sitio de poliadenilación, y/o un sitio de terminación de la transcripción. Estos vectores también pueden contener usualmente un gen para selección o gen para amplificación. Los vectores de expresión adecuados pueden ser plásmidos, virus, o retrovirus que portan promotores derivados, por ejemplo, a partir de dichas fuentes como adenovirus, SV40, parvovirus, virus de vaccinia, o citomegalovirus. Los ejemplos representativos de vectores de expresión adecuados incluyen pCR®3.1 , pCDNAl , pCD (Okayama, et al., (1985) Mol. Cell Biol. 5: 1136), pMCIneo Poly-A (Thomas, et al., (1987) Cell 51 : 503), pREP8, pSVSPORT y derivados de los mismos, y vectores de baculovirus tales como pAC373 o pAC610. La presente invención también incluye fusiones las cuales incluyen los polipéptidos y polinucleótidos de la presente invención y una segunda porción polipéptida o de polinucleótido, la cual se puede referir como una "marca". Las fusiones de la presente invención pueden comprender cualesquiera de los polinucleótidos o polipéptidos establecidos anteriormente en el cuadro 1 o cualquier subsecuencia o fragmento de los mismos. Los polipéptidos fusionados de la invención se pueden construir convenientemente, por ejemplo, mediante la inserción de un polinucleótido de la invención o fragmento del mismo dentro de un vector de expresión como se describió anteriormente. Las fusiones de la invención pueden incluir marcas las cuales facilitan la purificación o la detección. Dichas marcas incluyen marcas de la glutationa-S-transferasa (GST), marcas de hexahistidina (His6), marcas de la proteína de unión a la maltosa (MBP), marcas de la hemaglutinina (HA), marcas de la proteína de unión a la celulosa (CBP) y marcas myc. Las etiquetas o marcas detectables tales como 32P, 35S, 4C, 3H, 99mTc> 111 | n > 68Qaj 18^ 125, 131 ^ 113p.,? > ?¾.. 67^ S j^ 123| > 111 | n y 8Qa también se pueden utilizar para marcar los polipéptidos de la invención. Los métodos para construir y utilizar dichas fusiones son muy convencionales y se conocen bien en la técnica. Las modificaciones (por ejemplo, modificaciones post-traduccionales) que se presenta en un polipéptido frecuentemente serán una función de cómo se realiza. Para los polipéptidos elaborados mediante la expresión de un gen clonado en un hospedero, por ejemplo, la naturaleza y grado de las modificaciones, serán determinadas en gran parte por la capacidad de modificación post-traduccional de las células hospederas y las señales de modificación presentes en la secuencia de aminoácidos del polipéptido. Por ejemplo, como se conoce bien, la glucosilación no se presenta frecuentemente en hospederos bacterianos tales como E. coli. Por consiguiente, cuando se desea la glucosilación, se puede expresar un polipéptido en un hospedero para glucosilación, generalmente una célula eucarionte. Las células de insecto frecuentemente llevan a cabo glucosilaciones post-traduccionales las cuales son similares a aquellas en las células de mamífero. Por esta razón, se han desarrollado los sistemas de expresión en células de insecto para expresar, de manera eficiente, proteínas de mamífero que tienen patrones nativos de glucosilación. Alternativamente, las enzimas para desglucosilación se pueden utilizar para remover los carbohidratos unidos durante la producción en sistemas de expresión eucariontes. Otras modificaciones también pueden incluir la adición de amidas o ésteres alifáticos al carboxilo-terminal del polipéptido. La presente invención también incluye análogos de los péptidos RF-amida los cuales contienen ciertas modificaciones, tales como la incorporación de residuos no naturales de aminoácidos, o residuos fosforilados de aminoácidos tales como residuos de fosfotirosina, fosfoserina o fosfotreonina. Otras modificaciones potenciales incluyen la sulfonación, biotinilación, o la adición de otras porciones, particularmente aquellas que tienen formas moleculares similares a los grupos fosfato. Los péptidos de la invención también se pueden formar en ciclo. Específicamente, los residuos amino y carboxi-terminales en un péptido o en dos residuos internos de un péptido de la invención se pueden fusionar para crear un péptido en forma de ciclo. Preferiblemente, la formación en ciclo se lleva a cabo de tal manera que el carboxi-terminal del péptido está libre. Los péptidos también se pueden formar en ciclo de tal manera que el amino-terminal está libre. Los métodos para formar en ciclo a los péptidos son convencionales y se conocen muy bien en la técnica; por ejemplo véase Gurrath, et al., (1992) Eur. J. Biochem 210: 911- 921. A los péptidos RF-amida de la invención se les puede anexar un polímero el cual incrementa la vida media del péptido en el cuerpo de un sujeto. Los polímeros preferidos incluyen polietilenglicol (PEG) (por ejemplo, PEG con un peso molecular de 2 kDa, 5 kDa, 10 kDa, 12 kDa, 20 kDa, 30 kDa o 40 kDa), dextrán y monometoxipolietilen glicol (mPEG). Se apreciará que el mismo tipo de modificación puede estar presente en los mismos grados o en grados variables en diversos sitios en un polipéptido dado. También, un polipéptido dado puede contener muchos tipos de modificaciones. Los análogos de los péptidos RF-amida de la invención se pueden preparar mediante síntesis química o mediante el uso de mutagénesis sitio dirigida (GiHman, et al., (1979) Gene 8:81; Roberts, et al., (1987) Nature, 328: 731 o Innis (Ed.), 1990, PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, New York, NY o el método de la reacción en cadena de la polimerasa PCR; Saiki, et al., (1988) Science 239: 487, como se ejemplifica por Daugherty, et al., (1991) (Nucleic Acids Res. 19: 2471 ) para modificar los ácidos nucleicos que codifican a los péptidos. Se previo la adición de marcas de epítope para la purificación o detección de productos recombinantes. Incluso otros análogos están presentes mediante el uso de agentes conocidos en la técnica por su utilidad en entrecruzamiento de proteínas a través de grupos laterales reactivos. Los sitios de derivatización preferidos con los agentes para entrecruzamiento son los grupos amino carboxi libres, porciones de carbohidrato y residuos de cisteína. El término "polipéptido", "péptido" y "proteína" abarca todas esas modificaciones, particularmente aquellas que están presentes en polipéptidos sintetizados mediante la expresión de un polinucleótido en una célula hospedera.

Purificación de proteínas Típicamente, los péptidos de la invención se pueden producir mediante la expresión de un ácido nucleico el cual codifica el polipéptido en una célula hospedera la cual se crece en un cultivo (por ejemplo, cultivo líquido tal como caldo de Luria). Por ejemplo, el ácido nucleico puede ser parte de un vector (por ejemplo, un plásmido) el cual está presente en la célula hospedera. Después de la expresión, los polipéptidos de la invención se pueden aislar a partir de las células cultivadas. Los péptidos de esta invención se pueden purificar mediante métodos estándares, incluyendo, pero no limitados a, precipitación con sal o con alcohol, cromatografía por afinidad (por ejemplo, utilizada en conjunción con un péptido marcado para purificación como se discutió anteriormente), electroforesis preparativa en disco de gel, foco isoeléctrico, cromatografía líquida de alta presión (CLAP), CLAR de fase reversa, filtración en gel, cromatografía de intercambio de cationes y de aniones y de partición, distribución a contracorriente. Dichos métodos de purificación se conocen bien en la técnica y se describen, por ejemplo, en "Guide to Protein Purification", Methods in Enzvmology, Vol. 182, M. Deutscher, Ed., 1990, Academic Press, New York, NY. Los pasos de purificación se pueden seguir mediante la realización de ensayos para la actividad de unión al receptor como se describe a continuación. Particularmente en donde un péptido RF-amida ha sido aislado a partir una fuente celular o tisular, es preferible incluir uno o más inhibidores de enzimas proteolíticas en el sistema de ensayo, tal como fluoruro de fenilmetansulfonilo (PMSF), Pefabloc SC, pepstatina, leupeptina, quimostatina y EDTA.

Moléculas de anticuerpo Los fragmentos antigénicos (por ejemplo, inmunogénicos) de los péptidos RF-amida de la invención, los cuales se pueden unir o no al SP9155 o a un fragmento funcional del mismo, están dentro del alcance de la presente invención. Los péptidos antigénicos pueden ser útiles para preparar moléculas de anticuerpo las cuales reconocen al precursor del péptido RF-amida o a cualquier fragmento del mismo. Aunque no siempre es necesario, cuando los péptidos RF-amida se utilizan como antígenos para inducir la producción de anticuerpos en un hospedero inmunológicamente competente, los fragmentos antigénicos más pequeños se vuelven preferiblemente primero más inmunogénicos mediante entrecruzamiento o concatenación, o mediante el acoplamiento a una molécula vehículo inmunogénica (por ejemplo, una macromolécula que tiene la propiedad de inducir independientemente una respuesta inmunológica en un animal hospedero, tal como toxina de difteria o tétanos). Se puede requerir el entrecruzamiento o la conjugación a una molécula vehículo debido a que los fragmentos polipeptídicos pequeños algunas veces actúan como haptenos (moléculas que son capaces de unirse específicamente a un anticuerpo pero que son incapaces de inducir producción del anticuerpo, por ejemplo, no son ¡nmunogénicas). La conjugación de dichos fragmentos a una molécula vehículo inmunogénica las hace más ¡nmunogénicas a través de lo que se conoce comúnmente como el "efecto vehículo". Las moléculas vehículo incluyen, por ejemplo, proteínas y compuestos poliméricos naturales o sintéticos tales como polipéptidos, polisacáridos, lipopolisacáridos, etc. Se prefieren especialmente a las moléculas vehículo de la proteínas, incluyendo, pero no limitadas a, hemocianina de lapa cerradura y proteínas del suero de mamíferos tales como la gammaglobulina de humano o de bovino, albúmina de suero de humano, bovino o conejo, o derivados metilados u otros derivados de dichas proteínas. Otros vehículos de proteínas serán evidentes a aquellos expertos en la técnica. Preferiblemente, el vehículo de la proteína será extraño al animal hospedero en el cual se van a inducir anticuerpos en contra de los fragmentos. El acoplamiento covalente a la molécula vehículo se puede lograr utilizando los métodos bien conocidos en la técnica; la descripción exacta del cual será impuesta por la naturaleza de la molécula vehículo utilizada. Cuando la molécula vehículo inmunogénica es una proteína, los fragmentos de la invención se pueden acoplar, por ejemplo, utilizando carbodümidas solubles en agua tales como diciclohexilcarbodiimida o glutaraldehído. Los agentes para acoplamiento, tales como éstos, también se pueden utilizar para entrecruzar los fragmentos entre sí sin el uso de una molécula vehículo separada. Dicho entrecruzamiento dentro de los agregados también puede incrementar la inmunogenicidad. La inmunogenicidad también se pueden incrementar mediante el uso de adyuvantes conocidos, solos o en combinación con agentes para acoplamiento o para agregación. Los adyuvantes para la vacunación de animales incluyen, pero no se limitan a, adyuvante 65 (que contiene aceite de cacahuate, monooleato de manida y monoestearato de aluminio); adyuvante completo o incompleto de Freund; geles minerales tales como hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio y alumbre; agentes tensioactivos tales como hexadecilamina, octadecilamina, lisolecitina, bromuro de dimetildioctadecilamonio, N,N-dioctadecil-N',N'-bis(2-hidroximetil)propandiamina, metoxihexadecilglicerol y polioles plurónicos; polianiones tales como pirano, sulfato de dextrano, poli IC, ácido poliacrílico y carbopol; péptidos tales como dipéptido de muramilo, dimetilglicina y tuftsina; y emulsiones oleosas. Los polipéptidos también se pueden administrar después de la incorporación dentro de liposomas o de otros microve ículos. La información que se refiere a los adyuvantes y a diversos aspectos de los inmunoensayos se describe, por ejemplo, en la serie por P. Tijssen, Practice and Theorv of Enzvme Immunoassavs. 3a edición, 1987, Elsevier, New York. Otras referencias útiles que abarcan métodos para la preparación de antisuero policlonal incluyen Microbioloqy. 1969, Hoeber Medical División, Harper y Row; Landsteiner, Specificity of Seroloqical Reactions. 1962, Dover Publications, New York, y Williams, et al., Methods in Immunology and Immunochemistrv, Vol. 1, 1967, Academic Press, New York. Las "moléculas de anticuerpos" del péptido anti-RF-Amida de la invención incluyen, pero no se limitan en ningún sentido a, anticuerpos del péptido anti-RF-Amida (por ejemplo, anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos biespecíficos y anticuerpos anti-idiotípicos) y fragmentos, preferiblemente fragmentos para unión al antígeno o fragmentos funcionales, de los mismos, tales como los fragmentos del anticuerpo Fab, fragmentos del anticuerpo F(ab)2, fragmentos del anticuerpos Fv (por ejemplo, VH O Vl), fragmentos del anticuerpo Fv de cadena sencilla y fragmentos del anticuerpo dsFv. Además, las moléculas de anticuerpo de la invención pueden ser anticuerpos completamente de humano, anticuerpos de ratón, anticuerpos de conejo, anticuerpos de pollo, anticuerpos quiméricos de humano/ratón o anticuerpos humanizados. Las moléculas del anticuerpo del péptido anti-RF-amida de la invención preferiblemente reconocen a los péptidos RF-amida de humano o de ratón de la invención; no obstante, la presente invención incluye moléculas de anticuerpo las cuales reconocen a los péptidos RF-amida a partir de especies diferentes, preferiblemente mamíferos (por ejemplo, rata, conejo, oveja o perro). La presente invención también incluye complejos que comprenden los péptidos RF-amidas de la invención y una o más moléculas de anticuerpo. Dichos complejos se pueden realizar mediante el simple contacto de la molécula de anticuerpo con su péptido cognado. Se pueden utilizar diversos métodos para elaborar las moléculas de anticuerpo de la invención. En modalidades preferidas, los anticuerpos de la invención se producen mediante métodos que son similares a aquellos descritos en las Patentes de E.U.A. Nos. 5,625,126; 5,877,397; 6,255,458; 6,023,010 y 5,874,299. Las células de hibridoma las cuales producen anticuerpos monoclonales, anti-péptido RF-amida completamente de humano se pueden producir entonces mediante métodos que se conoce comúnmente en la técnica. Estos métodos incluyen, pero no se limitan a, la técnica de hibridoma originalmente desarrollada por Kohler, et al., (1975) (Nature 256: 495-497), así como la técnica de trioma (Hering, et al., (1988) Biomed. Biochim. Acta. 47: 211-216 y Hagiwara, et al., (1993) Hum. Antibod. Hybridomas 4: 15), la técnica de hibridoma de célula B de humano (Kozbor, et al., (1983) Immunology Today 4: 72 y Cote, et al., (1983) Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A 80: 2026-2030), y la técnica de hibridoma-EBV (Colé, et al., en Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy. Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96,1985). De nuevo, el ELISA se puede utilizar para determinar si las células de hibridoma están expresando anticuerpos anti-péptido RF-amida. Las moléculas de anticuerpo anti-péptido RF-amida de la presente invención también se pueden producir de manera recombinante (por ejemplo, en un sistema de expresión en E. coli/T7 como se discutió anteriormente). En esta modalidad, los ácidos nucleicos que codifican las moléculas de anticuerpo de la invención (por ejemplo, VH o V|_) se pueden insertar dentro de un plásmido basado en pet y se expresan en el sistema E. coli/T7. Existen diversos métodos mediante los cuales se producen anticuerpos recombinantes los cuales se conocen en la técnica. Un ejemplo de un método para la producción recombinante de anticuerpos se describe en la Patente de E.U.A. No. 4,816,567. El término "anticuerpo monoclonal" incluye un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos substancialmente homogéneos, por ejemplo, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por mutaciones que posiblemente ocurren de manera natural que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, siendo dirigidos en contra de un sitio antigénico particular. Los anticuerpos monoclonales son ventajosos puesto que se pueden sintetizar por un cultivo de hibridoma, esencialmente no contaminado con otras inmunoglobulinas. El modificador "monoclonal" indica la característica del anticuerpo a estar entre una población de anticuerpos substancialmente homogénea, y no se construye para que requiera la producción del anticuerpo mediante cualquier método particular. Como se mencionó anteriormente, los anticuerpos monoclonales a ser utilizados de conformidad con la presente invención se pueden realizar mediante el método de hibridoma como se describe por Kohler, et al., (1975) Nature 256: 495. El término "anticuerpo policlonal" incluye un anticuerpo el cual se produce entre o en la presencia de uno o más anticuerpos diferentes, no idénticos. En general, los anticuerpos policlonales se producen a partir de un linfocito B en la presencia de muchos otros linfocitos B los cuales producen anticuerpos no idénticos. Usualmente, los anticuerpos policlonales se obtienen directamente a partir de un animal inmunizado. Un "anticuerpo biespecífico" comprende dos regiones diferentes para unión al antígeno las cuales se unen a antígenos distintos. Los anticuerpos biespecíficos, así como los métodos de elaboración y de uso de los anticuerpos, son convencionales y muy bien conocidos en la técnica. Los anticuerpos anti-idiotípicos o anti-idiotipos son anticuerpos dirigidos en contra de la región para combinación del antígeno o región variable (denominada el idiotipo) de otra molécula de anticuerpo. Como se describe por Jeme et al. (Jerne, N. K., (1974) Ann. Immunol. (París) 125c: 373 y Jeme, N. K., et al., (1982) EMBO 1: 234), la inmunización con una molécula de anticuerpo que expresa un paratopo (sitio para combinación del antígeno) a un antígeno dado (por ejemplo, un péptido RF-amida) producirá un grupo de anti-anticuerpos, algunos de los cuales comparten, con el antígeno, una estructura complementaria al paratopo. La inmunización con una subpoblación de los anticuerpos anti-idiotípicos producirá, a su vez, una subpoblación de anticuerpos o subpoblaciones de células inmunes que son reactivas al antígeno inicial. El término "anticuerpo completamente de humano" se refiere a un anticuerpo el cual comprende solamente secuencias de inmunoglobulina de humano. De manera similar, "anticuerpo de ratón" se refiere a un anticuerpo el cual comprende solamente secuencias de inmunoglobulina de ratón y "anticuerpo de pollo" se refiere a un anticuerpo el cual comprende solamente secuencias de inmunoglobulina de pollo. "Anticuerpo quimérico de humano/ratón" se refiere a un anticuerpo que comprende una región variable de ratón (VH y VL) fusionada a una región constante de humano. Los anticuerpos del péptido anti-RF-amida "humanizados" también están dentro del alcance de la presente invención. Las formas humanizadas de anticuerpos no humanos (por ejemplo, de murino o de pollo) son inmunoglobulinas quiméricas, las cuales contienen secuencias mínimas derivadas a partir de inmunoglobulina no de humano. En general, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas de humano (anticuerpo recipiente) en las cuales los residuos a partir de una región determinante de complementariedad del recipiente están reemplazados por residuos a partir de una región determinante de complementariedad de una especie humana (anticuerpo donante), tales como ratón, pollo, rata o conejo, que tiene una especificidad, afinidad y capacidad deseada. En ciertos casos, los residuos de la estructura de Fv de la inmunoglobulina de humano también son reemplazados por residuos correspondientes que no son de humano. Los fragmentos de anticuerpos "Fv de cadena sencilla" o de "sFv" incluyen los dominios VH y/o VL de un anticuerpo, en donde estos dominios están presentes en una cadena polipeptídica particular. Generalmente, el polipéptido sFv comprende adicionalmente un enlazador polipeptídico entre los dominios VH y VL lo cual permite que el sFv forme la estructura deseada para unión al antígeno. Las técnicas descritas para la producción de anticuerpos de cadena sencilla (Patentes de E.U.A. Nos. 5,476,786; 5,132,405 y 4,946,778) se pueden adaptar para producir anticuerpos de cadena sencilla específicos para el péptido anti-RF-Am¡da. Para una revisión de sFv véase Pluckthun en The Pharmacoloqy of onoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y Moore eds. Springer-Verlag, N. Y., pp. 269-315 (1994). Los "fragmentos Fv estabilizados mediante enlaces disulfuro" y "dsFv" incluyen moléculas que tienen una cadena pesada variable (VH) y/o una cadena ligera variable (VL) las cuales están unidas mediante un enlace disulfuro. Los fragmentos de anticuerpo dentro del alcance de la presente invención también incluyen fragmentos F(ab)2 los cuales se pueden producir mediante escisión enzimática de una IgG mediante, por ejemplo, pepsina. Los fragmentos Fab se pueden producir mediante, por ejemplo, reducción de F(ab)2 con ditiotreitol o mercaptoetilamina. Un fragmento Fab es una cadena VL-CL añadida a una cadena VH-CHI mediante un enlace disulfuro. Un fragmento F(ab)2 es dos fragmentos Fab los cuales, a su vez, están añadidos mediante dos enlaces disulfuro. La porción Fab de una molécula F(ab)2 incluye una porción de la región Fe entre la cual se localizan los enlaces disulfuro. Un fragmento Fv es una región VL o VH. Dependiendo de las secuencias de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas, las inmunoglobulinas se pueden asignar a diferentes clases. Existen al menos cinco clases principales de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias de estas se pueden dividir adicionalmente en subclases (isotipos), por ejemplo, lgG-1 , lgG-2, lgG-3 e lgG-4; lgA-1 e lgA-2. Las moléculas de anticuerpo del péptido anti-RF-amida de la invención también se pueden conjugar a una porción química. La porción química puede ser, entre otros, un polímero, un radionúclido o un factor citotóxico. Preferiblemente, la porción química es un polímero el cual incrementa la vida media de la molécula de anticuerpo en el cuerpo de un sujeto. Los polímeros adecuados incluyen, pero no se limitan en ninguna forma a, polietilenglicol (PEG) (por ejemplo, PEG con un peso molecular de 2 kDa, 5 kDa, 10 kDa,12 kDa, 20 kDa, 30 kDa o 40 kDa), dextran y monometoxipolietilenglicol (mPEG). Los métodos para la producción de anticuerpos anti-IL8 polietilenglucosilados los cuales se describen en la Patente de E.U.A. No. 6,133,426, que se incorpora en la presente invención como referencia, se pueden aplicar a la producción de anticuerpos del péptido anti-RF-Amida polietilenglucosilado de la invención. Lee, et al., (1999) (Bioconj. Chem. 10: 973- 981) describe anticuerpos de cadena sencilla conjugados a PEG. Wen, et al., (2001) (Bioconj. Chem. 12: 545-553) describe anticuerpos conjugados con PEG el cual está unido a un quelante radiometal (ácido dietilenetriaminpentaacético (DTPA)). Las moléculas de anticuerpo de la invención también se pueden conjugar con marcas radioisotópicas tales como 99Tc, 90Y, 11ln, 32P, 1 C, 125l, H 131l, 1C, 150, 13N, 8F, 35S, 5 Cr, 57To, ^Ra, 60Co, 59Fe, 57Se, 152Eu, 67CU, 217Ci, 211At, 212Pb, 47Sc, 109Pd, 234Tn, y 0K, y marcas no radioisotópicas tales como 157Gd, 55Mn, 52Tr, 56Fe. Los anticuerpos de la invención también se pueden conjugar con marcas fluorescentes ó quimioluminiscentes, incluyendo fluoróforos tales como quelantes de tierras raras, fluoresceina y sus derivados, rodamina y sus derivados, isoti'ocianato, ficoeritrína, ficocianina, aloficocianina, o-ftalade ído, fluorescamina, 52Eu, dansilo, umbeliferona, luciferina, marca luminai, marca isoluminal, una marca de éster de acridinio aromático, una marca de imidazol, una marca de sal de acridinio, una marca de éster de oxalato, una marca de acuorina, 2,3-dihidroftalazinedionas, biotina/avidina, marcas de rotación y radicales libres estables. Las moléculas de anticuerpo también se pueden conjugar a un factor citotóxíco tal como toxina de difteria, cadena A de la exotoxina de Pseudomonas aeruginosa, cadena A de la ricina, cadena A de la abrina, cadena A de la modecina, alfa-sarcina, proteínas y compuestos de Aleurites fordii (por ejemplo, ácidos grasos), proteínas de diantina, proteínas de la Phytoiacca americana PAPI, PAPII, y PAP-S, inhibidor de la momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de la saponaria officinalis, mitogelina, restrictocina, fenomicina, y enomicina. Se puede emplear cualquier método conocido en la técnica para la conjugación de moléculas de anticuerpo de la invención a las diversas porciones, incluyendo aquellos métodos descritos por Hunter, et al., (1962) Nature 144: 945; David, et al., (1974) Biochemistry 13: 1014; Pain, et al., (1981) J. Immunol. Meth. 40: 219; y Nygren, J., (1982) Histochem. and Cytochem. 30: 407. Los métodos para la conjugación de anticuerpos son convencionales y muy bien conocidos en la técnica.

Composiciones farmacéuticas Los péptidos RF-amida y moléculas de anticuerpo de la invención se pueden administrar, preferiblemente para propósitos terapéuticos, a un sujeto, preferiblemente en una composición farmacéutica. Preferiblemente, una composición farmacéutica incluye un vehículo farmacéuticamente aceptable. Los péptidos RF-Amida y moléculas de anticuerpo se pueden utilizar terapéuticamente (por ejemplo, en una composición farmacéutica) para estimular o bloquear la actividad del receptor SP9155 y, por lo tanto, para tratar cualquier condición médica ocasionada o mediada por el receptor. El bloqueo de la unión de los péptidos RF-amida de la invención al receptor SP9155 puede bloquear el efecto que dichos péptidos tienen sobre la actividad del receptor. Como se discutió anteriormente, el receptor SP9155 ha sido relacionado con trastornos metabólicos tales como la obesidad y a mecanismos tales como el dolor y la analgesia. Los vehículos farmacéuticamente aceptables son convencionales y muy bien conocidos en la técnica. Los ejemplos incluyen vehículos acuosos y no acuosos, estabilizantes, antioxidantes, solventes, medio para dispersión, revestimientos, agentes antimicrobianos, reguladores de pH, proteínas del suero, agentes isotónicos y agentes para retraso de la absorción, y los similares que sean fisiológicamente compatibles. Preferiblemente, el vehículo es adecuado para la inyección dentro del cuerpo del sujeto. Generalmente, las composiciones útiles para la administración parenteral de dichos fármacos se conocen bien; por ejemplo, Reminqton's Pharmaceutical Science, 17a Ed. (Mack Publishing Company, Easton, PA, 1990). Los ejemplos de vehículos acuosos y no acuosos adecuados, los cuales pueden ser empleados en las composiciones farmacéuticas de la invención incluyen agua, etanol, polioles (tales como glicerol, propilenglicol, polietilenglicol, y los similares), y mezclas adecuadas de los mismos, aceites vegetales, tales como aceite de oliva, y ésteres orgánicos inyectables, tales como oleato de etilo. La fluidez adecuada se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de materiales para revestimiento, tales como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de las dispersiones, y mediante el uso de agentes tensioactivos. Las composiciones farmacéuticas de la invención se pueden administrar en conjunción con una segunda composición o sustancia farmacéutica. En modalidades preferidas, la segunda composición es un fármaco anti-obesidad o un analgésico. Cuando se utiliza terapia de combinación, ambas composiciones se pueden formular dentro de una composición particular para administración simultánea o se pueden formular separadamente dentro de dos o más composiciones (por ejemplo, un equipo). Los fármacos anti-obesidad pueden incluir sibutramina, fentermina u orlistant. Los analgésicos pueden incluir aspirina, acetominofen, codeína, morfina, aponorfina, normorfine, etorfina, buprenorfina, hidrocodona, racemorfan, levorfanol, butorfand, metadona, demerol, ¡buprofen u oxicodona.

Las composiciones farmacéuticas de la invención también pueden incluir otros tipos de sustancias, incluyendo moléculas orgánicas pequeñas y análogos inhibidores del ligando, los cuales se pueden identificar utilizando los ensayos descritos en la presente invención. Las formulaciones se pueden presentar convenientemente en forma de dosis unitaria y se pueden preparar mediante cualesquiera métodos bien conocidos en la técnica de farmacia. Véase, por ejemplo, Gilman et al. (eds. ) (1990), The Pharmacoloqical Bases of Therapeutics, 8a Ed., Pergamon Press; y Remlnqton's Pharmaceutical Science, anteriormente mencionado, Easton, Penn.; Avis et al. (eds.) (1993) Pharmaceutical Dosaqe Forms: Parenteral Medications Dekker, New York; Lieberman et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosaqe Forms: Tablets Dekker, New York; y Lieberman et al. (eds.) (1990), Pharmaceutical Dosaqe Forms: Disperse Systems Dekker, New York. El régimen de dosis implicado en una aplicación terapéutica se puede determinar por un médico, considerando diversos factores los cuales pueden modificar la acción de la sustancia terapéutica, por ejemplo, la condición, peso corporal, sexo y dieta del paciente, la severidad de cualquier infección, tiempo de administración, y otros factores clínicos. Frecuentemente, las dosis para tratamiento se titulan hacia arriba a partir de un nivel bajo para optimizar la seguridad y eficiencia. Las dosis se pueden ajustar para justificar los tamaños moleculares más pequeños y posiblemente vidas medias disminuidas (tiempos de eliminación) después de la administración. Una "cantidad efectiva" de una composición de la invención puede ser una cantidad que mejorará uno o más de los parámetros bien conocidos que caracterizan las condiciones médicas ocasionadas o mediadas por el receptor SP9155 o un fragmento funcional del mismo. Los protocolos típicos para la administración terapéutica de dichas sustancias se conocen bien en la técnica. Las composiciones farmacéuticas de la invención se pueden administrar, por ejemplo, mediante rutas parenterales (por ejemplo, inyección intravenosa, inyección intramuscular, inyección subcutánea, inyección intratumoral o mediante infusión) o mediante una ruta no parenteral (por ejemplo, administración oral, administración pulmonar o administración tópica). Las composiciones se pueden administrar con dispositivos médicos conocidos en la técnica. Por ejemplo, en una modalidad preferida, una composición farmacéutica de la invención se puede administrar mediante la inyección con una aguja hipodérmica. Las composiciones farmacéutica de la invención también se pueden administrar con un dispositivo para inyección hipodérmica sin aguja; tales como los dispositivos descritos en las Patentes de E.U.A. Nos. 5,399,163; 5,383,851 ; 5,312,335; 5,064,413; 4,941 ,880; 4,790,824 o 4,596,556. Los ejemplos de implantes bien conocidos y de módulos útiles en la presente invención incluyen: Patente de E.U.A. No. 4,487, 603, la cual describe una bomba para micro-infusión que se puede implantar para dispensar el medicamento a una velocidad controlada; Patente de E.U.A. No. 4,447,233, la cual describe una bomba para infusión de medicamento para la administración del medicamento a una velocidad de infusión precisa; Patente de E.U.A. No. 4,447,224, la cual describe un aparato para infusión con flujo variable que se puede implantar para la administración continua del fármaco; Patente de E.U.A. No. 4,439,196, la cual describe un sistema de administración osmótica del fármaco que tiene compartimientos multi-cámara.

Moléculas anti-sentido La presente invención también abarca oligonucleótidos antisentido capaces de hibridar específicamente con ácidos nucleicos (por ejemplo, ADN genómico o ARNm) que codifican un péptido RF-Amida de la invención, preferiblemente que tienen una secuencia de aminoácidos definida por cualesquiera de SEQ ID NOs: 4-11 ó 13-18 o una subsecuencia de las mismas de manera que se previene la expresión del ácido nucleico. Esta invención provee adicionalmente composiciones farmacéuticas que comprenden (a) una cantidad de un oligonucleótido efectiva para modular la actividad del receptor SP9155 mediante el paso a través de una membrana celular y la unión específicamente con el ARNm que codifica un péptido RF-Amida de la invención en la célula de manera que se previene su traducción y (b) o un vehículo farmacéuticamente aceptable capaz de pasar a través de una membrana celular. En una modalidad, el oligonucleótido está acoplado a una sustancia que inactiva el ARNm (por ejemplo, una ribozima).

EJEMPLOS Los siguientes ejemplo se pretenden solamente para la ejemplificación de la presente invención y no deben considerarse limitantes del alcance de la invención en ningún sentido.

Abreviaturas GenScan: un algoritmo para la predicción del gen (Burge, et al., (1997) J. Mol. Biol. 268 (1): 78-94).

Bases de datos de transcritos virtuales de humano (VTS): Procesamiento por GenScan, genes o exones se pronosticaron para el ADN genómico de humano los cuales están disponibles en las bases de datos públicas. VTS es una colección de todos los genes o exones pronosticados de humano. Se generaron tanto una versión del ADN como de proteína del VTS.

EJEMPLO 1 Identificación de la proteína precursora del péptido RF-Amida de humano Los péptidos RF-amida son miembros de una familia de neuropéptidos bien conocidos y se derivan a partir de un propéptido con un motivo carboxi-terminal "RFG(K/R)". En general, "G(K/R)" es una proteinasa para digestión y una señal de amidación. La digestión proteolítica y la amidación son pasos que se presentan cuando el propéptido se procesa hacia un péptido maduro con un carboxi-terminal de RF-amida. Puesto que la mayoría de los precursores del péptido RF-amida contienen más de un motivo RFG(k/R), la base de datos de la proteína VTS fue investigada para péptidos que contienen uno o más motivos RFGR. Los inventores identificaron VTS 164407 la cual se encontró que contiene un exón con dos motivos RFG(k/ ). El análisis adicional reveló que este exón contiene un codón de inicio en el codón de inicio y de paro en la parte terminal. El análisis del exón con PSORT (un software gratis para predicción de la localización subcelular de proteína; Nakai, et al., (1999) Trends Biochem. Sci. 24(1): 34-36), pronosticó que este exón tiene un péptido líder y no tiene dominio trans-membranal, lo cual sugirió que el exón codifica una proteína secretada. Este exón se puede referir como el "precursor del péptido RF-Amida". Puesto que, en general, los precursores del péptido RF-amida también se secretan, el ADNc que codifica al gen se aisló. Se identificó una diferencia de un nucleótido entre el exón genómico y la clona de ADNc. Esta diferencia pudo representar un polimorfismo. La secuencia nucleotídica y la secuencia de aminoácidos deducida correspondiente se establecen en SEQ ID NOs: 3 y 4, respectivamente.

EJEMPLO 2 Identificación del homólogo de ratón del gen precursor del péptido RF- Amida de humano El homólogo del ratón del gen precursor del péptido RF-Amida de humano se identificó mediante búsqueda BLAST en una base de datos pública una marca de secuencia expresada (EST) utilizando el gen precursor del péptido RF-Amida de humano como una clave de búsqueda. En esta búsqueda, la EST BF167714 de ratón se identificó como homologa al precursor del péptido RF-Amida de humano. Además, una base de datos pública de ADN genómico de ratón se investigó utilizando el gen del precursor del péptido RF-Amida de humano como una clave de búsqueda. De nuevo, se identificó un homólogo de ratón en la segunda búsqueda lo cual se determinó, mediante alineamiento de secuencias, como idéntico al homólogo de ratón el cual se identificó en la primera búsqueda. El gen precursor del péptido RF-Amida de ratón de longitud total se dedujo a partir de las clonas que se identificaron.

Basándose en la secuencia de ADN deducida del precursor del péptido RF-Amida de ratón, se clonó el ADNc del precursor del péptido RF-Amida de ratón. La secuencia nucieotídica y la secuencia de aminoácidos deducida, correspondientes se establecen en SEQ ID NOs: 12 y 13, respectivamente.

EJEMPLO 3 Posibles derivados peptídicos funcionales a partir de los genes precursores del péptido RF-Amida tanto a partir de humano como de ratón Los inventores dedujeron lo siguiente, posiblemente, los péptidos RF-amida funcionales se basan en la suposición de que el RFG(k/R) podría estar en el carboxi-terminal. Los péptidos derivados a partir del precursor del péptido RF- Amida de humano son como sigue: P51 de humano: EHAGCRFRF-amida (SEQ ID NO: 5) P242 de humano: GLQTSGREHAGCRFRF-amida (SEQ ID NO: 6) P552 de humano: ASQPQALLVIARGLQTSGREHAGCRFRF-amida (SEQ ID NO: 7) P52 de humano: GGFSFRF-amida (SEQ ID NO: 8) P513 de humano: KGGFSFRF-amida (SEQ ID NO: 9) P517 de humano: KKGGFSFRF-amida (SEQ ID NO: 10) P518 de humano :TSGPLGNLAEELNGYSRKKGGFSFRF-amida (SEQ ID NO: 11) Los péptidos derivados a partir del precursor del péptido RF-Amida de ratón son como sigue: P51 de ratón: EHTGFRL-amida (SEQ ID NO: 14) P52 de ratón: GGFSFRF-amida (SEQ ID NO: 15) P513 de ratón: KGGFSFRF-amida (SEQ ID NO: 16) P517 de ratón: RKGGFSFRF-amida (SEQ ID NO: 17) P518 de ratón: ASGPLGTLAEELSSYSRRKGGFSFRF-amida (SEQ ID NO: 18) EJEMPLO 4 Ensayos a. Medición de la concentración intercelular de Ca2+ En el siguiente ejemplo, los ensayos en lector de placas para representación fluorométrica (FLIPR) se utilizaron para determinar que los P518, P517, P52, P513 y P51 de humano son ligandos para el receptor SP9155 de humano. Como se discute a continuación, el ensayo se puede adaptar para determinar si una muestra es un agonista o un antagonista al receptor.

Las células HEK293, crecidas en DMEM que contenían FCS al 10% hasta 80-90% de confluencia, se transfectaron ya sea con un vector de expresión que portaba el ADNc del receptor SP9155 o con un vector de expresión que carecía del ADN del receptor SP9155 utilizando el agente de transfección SuperFect. Al siguiente día, las células fueron tripsinizadas de los platos de cultivo y se lavaron con PBS que carecía de Ca2+/Mg2+. Posteriormente las células fueron sembradas a una densidad de 35,000 células por 100 µ? de medio dentro de placas de 96 pozos que fueron pre-revestidas con poli-D-lisina (Becton Dickinson). Al tercer día después de la transfección, el medio se removió a partir de las células y se añadieron 100 µ? de solución salina balanceada de Hank (que carecía de rojo fenol) que contenía 4 M de Fluo-3, AM (Molecular Probes), Hepes 20 mM, pH 7.4, BSA al 0.1% (p/v) y probenecida 250 mM y subsecuentemente se incubó a 37°C, con C02 al 5% por 1 hora. Luego las células se lavaron tres veces con 150 µ? de regulador de pH para lavado que contenía BSS de HANK, Hepes 40 mM, pH 7.4 y probenecida 250 mM. Un ciento de µ? del regulador de pH para lavado se añadió después del lavado final y se midió el flujo de Ca2+ después de la adición de 40 µ? de regulador de pH para lavado que contenía cada uno de los péptidos respectivos. El instrumento FLIPR (Molecular Device) se utilizó en la medición del flujo de Ca +. Los datos que se generaron en estos ensayos se muestran a continuación en el cuadro 3: CUADRO 3 Potencia del péptido Cada péptido evaluado estaba carboxi-terminalmente amidado. 2 Los valores representan las medias ± desviación estándar; n=5.

El ensayo FLIPR también se utilizó para seleccionar las muestras para actividad agonista o antagonista. En estos ensayos, las células prueba se pueden poner simultáneamente en contacto con un ligando peptídico (o con cualquier otro ligando del receptor SP9155) y la muestra. Un experimento control negativo puede incluir poner en contacto a las células prueba con el ligando y con un blanco (por ejemplo, agua o cualquier otra sustancia la cual se sabe que no es un agonista o antagonista). Un experimento control positivo puede incluir poner en contacto a las células con el ligando y una sustancia la cual se sabe que agoniza o que antagoniza la unión del receptor/ligando SP9155. Una muestra se puede Identificar como que contiene un antagonista después de determinar su capacidad para disminuir el grado de movilización de Ca2+ ocasionada por la unión del ligando/receptor (por ejemplo, para disminuir la señal FLIPR) en comparación con el mismo experimento llevado a cabo sin la muestra. Contrariamente, una muestra se puede identificar como que contiene un agonista después de determinar su capacidad para incrementar el grado de movilización de Ca2+ ocasionada por la unión del ligando/receptor (por ejemplo, para incrementar la señal FLIPR) en comparación con el mismo experimento llevado a cabo sin la muestra. b. Ensayo de unión al radioliqando En este ejemplo, se utilizan los ensayos de unión al radioligando para determinar que el P518 de humano es un ligando para el receptor SP9155 de humano. Como se discute a continuación, el ensayo se puede adaptar para determinar si una muestra es un agonista o un antagonista. Los ensayos para unión al radioligando se llevan a cabo para evaluar la capacidad del receptor SP9155, cuando se expresa en células cultivadas, para unirse al P518 marcado con 3H. El ORF de SP9155 se clona en el vector de expresión pCR3.1 (pCR3.1-SP9155). Las células COS-7 se transfectan con pCR3.1-SP9155 o con pCR3.1 solo (transfección sin secuencia clave). Dos días después de la transfección, el medio de crecimiento normal DMEM/FCS al 10% se reemplaza por otro Opti-MEM o DME -Opti-MEM/FCS al 5%. Las células se dejan crecer un día más y luego las membranas se preparan para uso en el ensayo de unión. El P518 no marcado a 1 µ? se utiliza para determinar la unión no especifica. Después de un total de tres días a partir de la transfección, las membranas se preparan a partir de las células transfectadas y se observa la unión específica a 3H-P518.

Para la unión por saturación, 150 µ? del regulador de pH para ensayo de unión (Hepes 30 mM, pH 7.4, CaCI2 10 mM, MgCI2 10 mM, BSA al 0.05% libre de ácidos grasos (p/v), mantenido frío sobre hielo) que contenía 24 µg de membranas se mezclan con 50 µ? de regulador de pH para ensayo de unión que contenía 2% (v/v) de DMSO frío P518 (1 µ?). 3H-P518/etanol se añade a los ensayos a concentraciones en incremento. Las reacciones se incuban por 1 hora a 4°C mientras que se agitan lentamente. Los filtros Multiscreen FB (Millipore) pre-empapados con 50 µ? de regulador de pH para ensayo de unión por 1 hora a temperatura ambiente, se utilizan para filtrar los ensayos de unión y los filtros se lavan dos veces con 100 µ? de Tris-CI 50 mM, pH 7.5 (enfriado con hielo). 50 microlitros del fluido para centelleo se añaden a los filtros y se cuentan para detectar los radioligandos unidos. Para los ensayos de competencia por el radioligando, se mezclaron 160 µ? del regulador de pH para ensayo de unión que contenía membranas apropiadas con 20 µ? de regulador de pH para ensayo de unión que contenía DMSO al 6% (v/v) y diversas concentraciones de los compuestos candidatos para competencia. Un volumen final de 20 µ? del regulador de pH para ensayo de unión que contenía 6% (v/v) de DMSO y 1 µ? de 3H-P518/etanol (NEN, 50 nM) se añadió para iniciar la reacción de unión. La concentración final del radioligando fue de 0.25 nM. Las condiciones de incubación son las mismas que las utilizadas para los ensayos de saturación descritos anteriormente. Una muestra se puede identificar como que contiene un agonista o antagonista después de determinar su capacidad para disminuir la unión del ligando al receptor en comparación con el mismo experimento llevado a cabo sin la muestra. Un experimento control negativo puede incluir poner en contacto a las membranas con el ligando y con un blanco (por ejemplo, agua o cualquier otra sustancia la cual se sabe que no es un agonista o antagonista). Un experimento control positivo puede incluir poner en contacto a las células prueba con el ligando y con una sustancia la cual se sabe que agoniza o antagoniza la unión del receptor/ligando SP9155. La presente invención no debe limitarse en su alcance por las modalidades específicas descritas en la presente invención. De hecho, diversas modificaciones de la invención además de aquellas descritas en la presente invención serán evidentes a aquellos expertos en la técnica a partir de la descripción precedente y de las figuras anexas. Se pretende que dichas modificaciones estén dentro del alcance de las reivindicaciones anexas. Las patentes, solicitudes de patente, publicaciones, descripciones de producto, y protocolos están citados a lo largo de esta solicitud, las descripciones de las cuales se incorporan en la presente invención como referencia en su totalidad para todos los propósitos.

LISTADO DE SECUENCIA <110> Schering Corporation <120> LIGANDOS DEL RECEPTOR ACOPLADO A LA PROTEINA G Y METODOS <130> CN01530-WI <140> PCT/US03/11159 <141> 2003-04-10 <150> 60/372,640 <151> 2002-04-12 <160> 20 <170> Patente en versión 3.1 <210> 1 <211> 1296 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> 1..1296 <223> <220> <221> VARIANTE <222> 154 <223> r <220> <221> VARIANTE <222> 181 <223> k <220> <221> VARIANTE <222> 206 <223> k <220> <221> VARIANTE <222> 208 <223> k <220> <221> VARIANTE <222> 447 <223> k <220> <221> VARIANTE <222> 748 <223> k <220> <221> VARIANTE <222> 1031 <223> y <220> <221> VARIANTE <222> 1111 <223> Y <220> <221> VARIANTE <222> 1162 <223> r <220> <221> VARIANTE <222> 1228 <223> y <400> 1 atg cag gcg ctt aac att acc ceg gag cag ttc tet cgg ctg ctg cgg 48 Met Gln Ala Leu Asn lie Thr Pro Glu Gln Phe Ser Arg Leu Leu Arg 1 5 10 15 gac cae aac ctg acg cgg gag cag ttc ate gct ctg tac cgg ctg cga 96 Asp His Asn Leu Thr Arg Glu Gln Phe lie Ala Leu Tyr Arg Leu Arg 20 25 30 ceg etc gtc tac acc cea gag ctg ceg gga cgc gee aag ctg gee etc 144 Pro Leu Val Tyr Thr Pro Glu Leu Pro Gly Arg Ala Lys Leu Ala Leu 35 40 45 gtg etc acc ggc gtg etc ate ttc gee ctg gcg etc ttt ggc aat gct 192 Val Leu Thr Gly Val Leu lie Phe Ala Leu Ala Leu Phe Gly Asn Ala 50 55 60 ctg gtg ttc tac gtg gtg acc cgc age aag gee atg cgc acc gtc acc 240 Leu Val Phe Tyr Val Val Thr Arg Ser Lys Ala Met Arg Thr Val Thr 65 70 75 80 aac ate ttt ate tgc tec ttg gcg etc agt gac ctg etc ate acc ttc 288 Asn lie Phe lie Cys Ser Leu Ala Leu Ser Asp Leu Leu lie Thr Phe 85 90 95 ttc tgc att ccc gtc acc atg ctc cag aac att tcc gac aac tgg ctg 336 Phe Cys lie Pro Val Thr Met Leu Gln Asn lie Ser Asp Asn Trp Leu 100 IOS 110 999 99t 9ct ttc att fc9c a 9 at9 9fc9 cca tfct 9tc ca9 tct acc 9ct 384 Gly Gly Ala Phe lie Cys Lys Met Val Pro Phe Val Gln Ser Thr Ala 115 120 125 gtt gtg aca gaa ate ctc act atg acc tgc att gct gtg gaa agg cae 432 Val Val Thr Glu lie Leu Thr Met Thr Cys lie Ala Val Glu Arg His 130 135 140 cag gga ctt gtg cat ect ttt aaa atg aag tgg caá tac acc aac cga 480 Gln Gly Leu Val His Pro Phe Lys Met Lys Trp Gln Tyr Thr Asn Arg 145 150 155 160 agg gct ttc aca atg cta ggt gtg gtc tgg ctg gtg gca gtc ate gta 528 Arg Ala Phe Thr Met Leu Gly Val Val Trp Leu Val Ala Val lie Val 165 170 175 gga tea ccc atg tgg cae gtg caá caá ctt gag ate aaa tat gac ttc 576 Gly Ser Pro Met Trp His Val Gln Gln Leu Glu lie Lys Tyr Asp Phe 180 185 190 cta tat gaa aag gaa cae ate tgc tgc tta gaa gag tgg acc age ect 624 Leu Tyr Glu Lys Glu His lie Cys Cys Leu Glu Glu Trp Thr Ser Pro 195 200 205 gtg cae cag aag ate tac acc acc ttc ate ctt gtc ate ctc ttc ctc 672 Val His Gln Lys lie Tyr Thr Thr Phe lie Leu Val lie Leu Phe Leu 210 215 220 ctg ect ctt atg gtg atg ctt att ctg tac agt aaa att ggt tat gaa 720 Leu Pro Leu Met Val Met Leu lie Leu Tyr Ser Lys lie Gly Tyr Glu 225 230 235 240 ctt tgg ata aag aaa aga gtt ggg gat ggt tea gtg ctt cga act att 768 Leu Trp lie Lys Lys Arg Val Gly Asp Gly Ser Val Leu Arg Thr lie 245 250 255 cat gga aaa gaa atg tcc aaa ata gee agg aag aag aaa cga gct gtc 816 His Gly Lys Glu Met Ser Lys lie Ala Arg Lys Lys Lys Arg Ala Val 260 265 270 att atg atg gtg aca gtg gtg gct ctc ttt gct gtg tgc tgg gca cca 864 lie Met Met Val Thr Val Val Ala Leu Phe Ala Val Cys Trp Ala Pro 275 280 285 ttc cat gtt gtc cat atg atg att gaa tac agt aat ttt gaa aag gaa 912 Phe His Val Val His Met Met lie Glu Tyr Ser Asn Phe Glu Lys Glu 290 295 300 tat gat gat gtc acá ate aag atg att ttt gct ate gtg caá att att 960 Tyr Asp Asp Val Thr lie Lys Met lie Phe Ala lie Val Gln lie lie 305 310 315 320 gga ttt tcc aac tcc ate tgt aat ecc att gte tat gca ttt atg aat 1008 Gly Phe Ser Asn Ser lie Cys Asn Pro lie Val Tyr Ala Phe Met Asn 325 330 335 gaa aac ttc aaa aaa aat gtt ttg tet gca gtt tgt tat tgc ata gta 1056 Glu Asn Phe Lys Lys Asn Val Leu Ser Ala Val Cys Tyr Cys lie Val 340 345 350 aat aaa acc ttc tet cea gca caá agg cat gga aat tea gga att acá 1104 Asn Lys Thr Phe Ser Pro Ala Gln Arg His Gly Asn Ser Gly lie Thr 355 360 365 atg atg cgg aag aaa gca aag ttt tcc etc aga gag aat cea gtg gag 1152 Met Met Arg Lys Lys Ala Lys Phe Ser Leu Arg Glu Asn Pro Val Glu 370 375 380 gaa acc aaa gga gaa gca ttc agt gat ggc aac att gaa gtc aaa ttg 1200 Glu Thr Lys Gly Glu Ala Phe Ser Asp Gly Asn lie Glu Val Lys Leu 385 390 395 400 tgt gaa cag acá gag gag aag aaa aag etc aaa cga cat ctt gct etc 1248 Cys Glu Gln Thr Glu Glu Lys Lys Lys Leu Lys Arg His Leu Ala Leu 405 410 415 ttt agg tet gaa ctg gct gag aat tet ect tta gac agt ggg cat taa 1296 Phe Arg Ser Glu Leu Ala Glu Asn Ser Pro Leu Asp Ser Gly His 420 425 430 <210> 2 <211> 431 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> CA ACTERISTICA_MISC <222> 52 <223> Ser o Gly <220> <221> CARACTERISTICA_MISC <222> 410 <223> Phe o Leu <220> <221> CARACTERISTICA_MISC <222> 388 <223> Arg o Gly <220> <221> CARACTERISTICA_MISC <222> 371 <223> Trp o Arg <220> <221> CARACTERISTICA_MISC <222> 344 <223> Ser o Leu <220> <221> CARACTERISTICA_MISC <222> 250 <223> Cys o Gly <220> <221> CARACTERISTICA_MISC <222> 149 <223> Gln O Lys <220> <221> CARACTERISTICA_MISC <222> 70 <223> Leu o Val <220> <221> CARACTERISTICA_M1SC <222> 69 <223> Gly o Val 220> 221> CARACTERISTICA_MISC 222> 61 223> Val o Phe 400> 2 Met Gln Ala Leu Asn lie Thr Pro Glu Gln Phe Ser Arg Leu Leu Arg 1 5 10 15 Asp His Asn Leu Thr Arg Glu Gln Phe lie Ala Leu Tyr Arg Leu Arg 20 25 30 Pro Leu Val Tyr Thr Pro Glu Leu Pro Gly Arg Ala Lys Leu Ala Leu 35 40 45 Val Leu Thr Xaa Val Leu lie Phe Ala Leu Ala Leu Xaa Gly Asn Ala 50 55 60 Leu Val Phe Tyr Xaa Xaa Thr Arg Ser Lys Ala Met Arg Thr Val Thr 65 70 75 80 Asn lie Phe lie Cys Ser Leu Ala Leu Ser Asp Leu Leu lie Thr Phe 85 90 95 Phe Cys lie Pro Val Thr Met Leu Gln Asn lie Ser Asp Asn Trp Leu 100 105 110 Gly Gly Ala Phe lie Cys Lys Met Val Pro Phe Val Gln Ser Thr Ala 115 120 125 Val Val Thr Glu lie Leu Thr Met Thr Cys lie Ala Val Glu Arg His 130 135 140 Gln Gly Leu Val Xaa Pro Phe Lys Met Lys Trp Gln Tyr Thr Asn Arg 145 150 155 160 Arg Ala Phe Thr Met Leu Gly Val Val Trp Leu Val Ala Val lie Val 165 170 175 Gly Ser Pro Met Trp His Val Gln Gln Leu Glu lie Lys Tyr Asp Phe 180 185 190 Leu Tyr Glu Lys Glu His lie Cys Cys Leu Glu Glu Trp Thr Ser Pro 195 200 205 Val His Gln Lys lie Tyr Thr Thr Phe lie Leu Val lie Leu Phe Leu 210 215 220 Leu Pro Leu Met Val Met Leu lie Leu Tyr Ser Lys lie Gly Tyr Glu 225 230 235 240 Leu Trp lie Lys Lys Arg Val Gly Asp Xaa Ser Val Leu Arg Thr lie 245 250 255 His Gly Lys Glu Met Ser Lys lie Ala Arg Lys Lys Lys Arg Ala Val 260 265 270 lie Met Met Val Thr Val Val Ala Leu Phe Ala Val Cys Trp Ala Pro 275 280 285 Phe His Val Val His Met Met lie Glu Tyr Ser Asn Phe Glu Lys Glu 290 295 300 Tyr Asp Asp Val Thr lie Lys Met lie Phe Ala lie Val Gln lie lie 305 310 315 320 Gly Phe Ser Asn Ser lie Cys Asn Pro lie Val Tyr Ala Phe Met Asn 325 330 335 Glu Asn Phe Lys Lys Asn Val Xaa Ser Ala Val Cys Tyr Cys lie Val 340 345 350 Asn Lys Thr Phe Ser Pro Ala Gln Arg His Gly Asn Ser Gly lie Thr 355 360 365 Met Met Xaa Lys Lys Ala Lys Phe Ser Leu Arg Glu Asn Pro Val Glu 370 375 380 Glu Thr Lys Xaa Glu Ala Phe Ser Asp Gly Asn lie Glu Val Lys Leu 385 390 395 400 Cys Glu Gln Thr Glu Glu Lys Lys Lys Xaa Lys Arg His Leu Ala Leu 405 410 415 Phe Arg Ser Glu Leu Ala Glu Asn Ser Pro Leu Asp Ser Gly His 420 425 430 <211> 411 <212> ADN <213> Homo sap <220> <221> CDS <222> 1..411 <223> <220> <221> VARIANTE <222> 76 <223> s <220> <221> VARIANTE <222> 103 <223> r <220> <221> VARIANTE <222> 139 <223> y <220> <2 1> VARIANTE <222> 203 <223> w <220> <221> VARIANTE <222> 239 <223> r <400> 3 atg gta agg cct tac ccc ctg ate tac ttc ctc ttc ctg ccg ctg ggc 48 Met Val Arg Pro Tyr Pro Leu lie Tyr Phe Leu Phe Leu Pro Leu Gly 1 5 10 15 gcc tgc ttc cct cta ctg gac aga aga gag ccc acá gac gcc atg ggt 96 Ala Cys Phe Pro Leu Leu Asp Arg Arg Glu Pro Thr Asp Ala Met Gly 20 25 30 ggc ctc gga gct gga gaa cgc tgg gcc gac ctg gcc atg ggg ccc cga 144 Gly Leu Gly Ala Gly Glu Arg Trp Ala Asp Leu Ala Met Gly Pro Arg 35 40 45 ccc 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<220> <221> CARACTERISTICA_ ISC <222> 35 <223> Arg o Gly <220> <221> CARACTERISTICA_MISC <222> 26 <223> Gln o Glu <400> 4 Met Val Arg Pro Tyr Pro Leu lie Tyr Phe Leu Phe Leu Pro Leu Gly 1 5 10 15 Ala Cys Phe Pro Leu Leu Asp Arg Arg Xaa Pro Thr Asp Ala Met Gly 20 25 30 Gly Leu Xaa Ala Gly Glu Arg Trp Ala Asp Leu Ala Met Gly Xaa Arg 35 40 45 Pro His Ser Val Trp Gly Ser Ser Arg Trp Leu Arg Ala Ser Gln Pro 50 55 60 Gln Ala Leu Xaa Val lie Ala Arg Gly Leu Gln Thr Ser Gly Arg Xaa 65 70 75 80 His Ala Gly Cys Arg Phe Arg Phe Gly Arg Gln Asp Glu Gly Ser Glu 85 90 95 Ala Thr Gly Phe Leu Pro Ala Ala Gly Glu Lys Thr Ser Gly Pro Leu 100 105 110 Gly Asn Leu Ala Glu Glu Leu Asn Gly Tyr Ser Arg Lys Lys Gly Gly 115 120 125 Phe Ser Phe Arg Phe Gly Arg Arg 130 135 <210> 5 <211> 9 <212> PRT < 13> Homo sapiens <400> 5 Glu His Ala Gly Cys Arg Phe Arg Phe 1 5 <210> 6 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Gly Leu Gln Thr Ser Gly Arg Glu His Ala Gly Cys Arg Phe Arg Phe 1 5 10 15 <210> 7 <211> 28 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Ala Ser Gln Pro Gln Ala Leu Leu Val lie Ala Arg Gly Leu Gln Thr 1 5 10 15 Ser Gly Arg Glu His Ala Gly Cys Arg Phe Arg Phe 20 25 <210> 8 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Gly Gly Phe Ser Phe Arg 1 5 <210> 9 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Lys Gly Gly Phe Ser Phe Arg Phe 1 5 <210> 10 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens < 00> 10 Lys Lys Gly Gly Phe Ser Phe Arg Phe 1 5 <210> 11 <211> 26 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Thr Ser Gly Pro Leu Gly Asn Leu Ala Glu Glu Leu Asn Gly Tyr Ser 1 5 10 15 Arg Lys Lys Gly Gly Phe Ser Phe Arg Phe 20 25 <210> 12 <211> 375 <212> ADN <213> Desconocida <220> <223> ratón <220> <221> CDS <222> 1..375 <223> <400> 12 atg agg ggc ttc cgg cct ttg ctt tcc cta ctt etc cct ctg agt gcc 48 Met Arg Gly Phe Arg Pro Leu Leu Ser Leu Leu Leu Pro Leu Ser Ala 1 5 10 15 tgc ttt ccc ctg ctg gac aga agg gga ccc acá gac ate ggt gac ate 96 Cys Phe Pro Leu Leu Asp Arg Arg Gly Pro Thr Asp lie Gly Asp lie 20 25 30 gga gcc agg atg aac tgg gcc cag ctg gct gag gga cat ccc ccc aac 144 Gly Ala Arg Met Asn Trp Ala Gln Leu Ala Glu Gly His Pro Pro Asn 35 40 45 tcg gtt caá aat cea cag cea cag gcc ctg ctt gtg gtg gcc agg gag 192 Ser Val Gln Asn Pro Gln Pro Gln Ala Leu Leu Val Val Ala Arg Glu 50 55 60 cag cag gcc tcc cae agg gag cae acc ggc ttc cgt cta ggg agg caá 240 Gln Gln Ala Ser His Arg Glu His Thr Gly Phe Arg Leu Gly Arg Gln 65 70 75 80 gac ggt age agt gag gcc gca ggg ttc ctg ccc gcc gac tcg gag aag 288 Asp Gly Ser Ser Glu Ala Ala Gly Phe Leu Pro Ala Asp Ser Glu Lys 85 90 95 gcc age ggc cct ctg ggg act ctg gca gag gag ctg age age tac age 336 Ala Ser Gly Pro Leu Gly Thr Leu Ala Glu Glu Leu Ser Ser Tyr Ser .100 105 110 cgg agg aag gga ggc ttc age ttc cgc ttt gga cgg tga 375 Arg Arg Lys Gly Gly Phe Ser Phe Arg Phe Gly Arg 115 120 <210> 13 <211> 124 <212> PRT <213> Desconocida <220> <223> ratón <400> 13 et Arg Gly Phe Arg Pro Leu Leu Ser Leu Leu Leu Pro Leu Ser Ala 1 5 10 15 Cys Phe Pro Leu Leu Asp Arg Arg Gly Pro Thr Asp lie Gly Asp 20 25 30 Gly Ala Arg Met Asn Trp Ala Gln Leu Ala Glu Gly His Pro Pro Asn 35 40 45 Ser Val Gln Asn Pro Gln Pro Gln Ala Leu Leu Val Val Ala Arg Glu 50 55 60 Gln Gln Ala Ser His Arg Glu His Thr Gly Phe Arg Leu Gly Arg Gln 65 70 75 80 Asp Gly Ser Ser Glu Ala Ala Gly Phe Leu Pro Ala Asp Ser Glu Lys 85 90 95 Ala Ser Gly Pro Leu Gly Thr Leu Ala Glu Glu Leu Ser Ser Tyr Ser 100 105 110 Arg Arg Lys Gly Gly Phe Ser Phe Arg Phe Gly Arg <210> 14 <211> 7 <212> PRT <213> Desconocida <220> <223> ratón <400> 14 Glu His Thr Gly Phe Arg Leu 1 5 <210> 15 <211> 7 <212> PRT <213> Desconocida <220> <223> ratón <400> 15 Gly Gly Phe Ser Phe Arg Phe 1 5 <210> 16 <211> 8 <212> PRT <213> Desconocida <220> <223> ratón <400> 16 Lys Gly Gly Phe Ser Phe Arg Phe 1 5 <210> 17 <211> 9 <212> PRT <213> Desconocida <220> <223> ratón <400> 17 Arg Lys Gly Gly Phe Ser Phe Arg Phe 1 5 <210> 18 <211> 26 <212> PRT <213> Desconocida <220> <223> ratón <400> 18 Ala Ser Gly Pro Leu Gly Thr Leu Ala Glu Glu Leu Ser Ser Tyr Ser 1 5 10 15 Arg Arg Lys Gly Gly Phe Ser Phe Arg Phe 20 25 <210> 19 <211> 1302 <212> ADN <213> Desconocida <220> <223> ratón <220> <221> CDS <222> (1) .. (1302) <223> <400> 19 atg cag gcg ctc aac ate acc gcg gag cag ttt tcc cgg ctg ctg agc 48 et Gln Ala Leu Asn lie Thr Ala Glu Gln Phe Ser Arg Leu Leu Ser 1 5 10 15 gca cae aac ctg act cgg gaa cag ttc att cat cgc tat ggg ctg cga 96 Ala His Asn Leu Thr Arg Glu Gln Phe lie His Arg Tyr Gly Leu Arg 20 25 30 ceg ctg gtc tac acc ceg gag ctg ccc gcg cgc gct aaa ctg gcc ttt 144 Pro Leu Val Tyr Thr Pro Glu Leu Pro Ala Arg Ala Lys Leu Ala Phe 35 40 45 gcg ctg gct gga gca ctc att ttt gcc ctg gcg ctc ttt ggc aac tet 192 Ala Leu Ala Gly Ala Leu lie Phe Ala Leu Ala Leu Phe Gly Asn Ser 50 55 60 ctg gtc atc tat gtg gtg acc cgc age aag gcc atg cae acc gtc acc 240 Leu Val lie Tyr Val Val Thr Arg Ser Lys Ala Met His Thr Val Thr 65 70 75 80 aac atc ttc atc tgc tet ctg gca ctc agt gat ctg ctc att gcc ttc 288 Asn lie Phe lie Cys Ser Leu Ala Leu Ser Asp Leu Leu lie Ala Phe 85 90 95 ttc tgc atc ccc gtc acg atg ctc cag aac atc tcc gac aag tgg ctg 336 Phe Cys lie Pro Val Thr Met Leu Gln Asn lie Ser Asp Lys Trp Leu 100 105 110 ggt ggt gcc ttc atc tgc aag atg gtg ccc ttc gtc cag tcc act gct 384 Gly Gly Ala Phe lie Cys Lys Met Val Pro Phe Val Gln Ser Thr Ala 115 120 125 gtt gtg acg gaa atc ctc acc atg act tgc atc gct gtt gag agg cae Val Val Thr Glu lie Leu Thr Met Thr Cys lie Ala Val Glu Arg His 130 135 140 caá gga ctc atc cat ect ttt aaa atg aag tgg cag tac act acc cga 480 Gln Gly Leu lie His Pro Phe Lys Met Lys Trp Gln Tyr Thr Thr Arg 145 150 155 160 agg gct ttc acá ate ttg ggt gtg gtc tgg ttg gca gcc ate atc gta 528 Arg Ala Phe Thr lie Leu Gly Val Val Trp Leu Ala Ala lie lie Val 165 170 175 gga tea ecc atg tgg cae gta caá cgc etc gag att aag tat gac ttc 57S Gly Ser Pro Met Trp His Val Gln Arg Leu Glu lie Lys Tyr Asp Phe 180 185 190 etc tat gag aaa gaa cat gtc tgc tgt ttg gaa gag tgg gcc age ecc 624 Leu Tyr Glu Lys Glu His Val Cys Cys Leu Glu Glu Trp Ala Ser Pro 195 200 205 atg cae cag aga atc tac acc acc ttc atc etc gtc atc etc ttc etc 672 Met His Gln Arg lie Tyr Thr Thr Phe lie Leu Val lie Leu Phe Leu 210 215 220 ctg ceg ctt gtg gtg atg ctt gtc etc tac age aag att ggc tat gaa 720 Leu Pro Leu Val Val Met Leu Val Leu Tyr Ser Lys lie Gly Tyr Glu 225 230 : 235 240 ctg tgg atc aag aag aga gtt gga gac agt tea gca ctt cag act atc 768 Leu Trp lie Lys Lys Arg Val Gly Asp Ser Ser Ala Leu Gln Thr lie 245 250 255 cae ggg aaa gaa atg tec aaa ata gcc agg aag aag aag cgg gct gtc 816 His Gly Lys Glu Met Ser Lys lie Ala Arg Lys Lys Lys Arg Ala Val 260 265 270 gtt atg atg gtg acá gtg gtg gct etc ttc gct gcg tgc tgg gca ect 864 Val Met Met Val Thr Val Val Ala Leu Phe Ala Ala Cys Trp Ala Pro 275 280 285 ttc cat gtt gtt cae atg atg gtt gag tac agt aac ttt gaa aaa gag 912 Phe His Val Val His Met Met Val Glu Tyr Ser Asn Phe Glu Lys Glu 290 295 300 tat gat gat gtc acá atc aag atg gtt ttt gct gtt gca caá acá att 960 Tyr Asp Asp Val Thr lie Lys Met Val Phe Ala Val Ala Gln Thr lie 305 310 315 320 ggc ttt ttc aac tec atc tgt aat ecc ttt gtg tat gca ttt atg aat 1008 Gly Phe Phe Asn Ser lie Cys Asn Pro Phe Val Tyr Ala Phe Met Asn 325 330 335 gaa aac ttc aaa aag aat ttt ttg tet gcg gtt tgt tat tgc ata gta 1056 Glu Asn Phe Lys Lys Asn Phe Leu Ser Ala Val Cys Tyr Cys lie Val 340 345 350 aaa gaa acc ttc tec cea gga cag aag ect gga aat tet ggg att tea 1104 Lys Glu Thr Phe Ser Pro Gly Gln Lys Pro Gly Asn Ser Gly lie Ser 355 360 365 atg atg caa aag aga gca aag tta tea cga tea cag cgt cca gtg gcg 1152 Met Met Gln Lys Arg Ala Lys Leu Ser Arg Ser Gln Arg Pro Val Ala 370 375 380 gaa gcc aaa gga gac tta ttc age gat gcc aac gtt gat gtc aaa ttg 1200 Glu Ala Lys Gly Asp Leu Phe Ser Asp Ala Asn Val Asp Val Lys Leu 385 390 395 400 tgt gag cag cca ggg gag aaa agg caa etc aag cga cag ctt gcc ttc 1248 Cys Glu Gln Pro Gly Glu Lys Arg Gln Leu Lys Arg Gln Leu Ala Phe 405 410 415 ttt agt tct gaa ctt tct gaa aac tct act ttc ggc agt gga cat gaa 1296 Phe Ser Ser Glu Leu Ser Glu Asn Ser Thr Phe Gly Ser Gly His Glu 420 425 430 ctg taa 1302 Leu <210> 20 <211> 433 <212> PRT <213> Desconocida <220> <223> ratón <400> 20 Met Gln Ala Leu Asn lie Thr Ala Glu Gln Phe Ser Arg Leu Leu Ser 1 5 10 15 Ala His Asn Leu Thr Arg Glu Gln Phe lie His Arg Tyr Gly Leu Arg 20 25 30 Pro Leu Val Tyr Thr Pro Glu Leu Pro Ala Arg Ala Lys Leu Ala Phe 35 40 45 Ala Leu Ala Gly Ala Leu lie Phe Ala Leu Ala Leu Phe Gly As: 50 55 60 Leu Val lie Tyr Val Val Thr Arg Ser Lys Ala Met His Thr Val Thr 65 70 75 80 Asn lie Phe lie Cys Ser Leu Ala Leu Ser Asp Leu Leu lie Ala Phe 85 90 95 Phe Cys lie Pro Val Thr Met Leu Gln Asn lie Ser Asp Lys Trp Leu 100 105 110 Gly Gly Ala Phe lie Cys Lys Met Val Pro Phe Val Gln Ser Thr Ala 115 120 125 Val Val Thr Glu lie Leu Thr Met Thr Cys lie Ala Val Glu Arg His 130 135 140 Gln Gly Leu lie His Pro Phe Lys Met Lys Trp Gln Tyr Thr Thr Arg 145 150 155 160 Arg Ala Phe Thr lle Leu Gly Val Val Trp Leu Ala Ala lie lie Val 165 170 175 Gly Ser Pro Met Trp His Val Gln Arg Leu Glu lie Lys Tyr Asp Phe 180 185 190 Leu Tyr Glu Lys Glu His Val Cys Cys Leu Glu Glu Trp Ala Ser Pro 195 200 205 Met His Gln Arg lle Tyr Thr Thr Phe lie Leu Val lie Leu Phe Leu 210 215 220 Leu Pro Leu Val Val Met Leu Val Leu Tyr Ser Lys lie Gly Tyr Glu 225 230 235 240 Leu Trp lie Lys Lys Arg Val Gly Asp Ser Ser Ala Leu Gln Thr lie 245 250 255 His Gly Lys Glu Met Ser Lys lie Ala Arg Lys Lys Lys Arg Ala Val 260 265 270 Val Met Met Val Thr Val Val Ala Leu Phe Ala Ala Cys Trp Ala Pro 275 280 285 Phe His Val Val His Met Met Val Glu Tyr Ser Asn Phe Glu Lys Glu 290 295 300 Tyr Asp Asp Val Thr lie Lys Met Val Phe Ala Val Ala Gln Thr lie 305 310 315 320 Gly Phe Phe Asn Ser lie Cys Asn Pro Phe Val Tyr Ala Phe Met Asn 325 330 335 Glu Asn Phe Lys Lys Asn Phe Leu Ser Ala Val Cys Tyr Cys lie Val 340 345 350 Lys Glu Thr Phe Ser Pro Gly Gln Lys Pro Gly Asn Ser Gly lie Ser 355 360 365 Met Met Gln Lys Arg Ala Lys Leu Ser Arg Ser Gln Arg Pro Val Ala 370 375 380 Glu Ala Lys Gly Asp Leu Phe Ser Asp Ala Asn Val Asp Val Lys Leu 385 390 395 400 Cys Glu Gln Pro Gly Glu Lys Arg Gln Leu Lys Arg Gln Leu Ala Phe 405 410 415 Phe Ser Ser Glu Leu Ser Glu Asn Ser Thr Phe Gly Ser Gly His Glu 420 425 430 Leu

Claims (25)

NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES

1.- Un método para identificar un agonista o antagonista de un receptor SP9155, que comprende: (a) poner en contacto el receptor SP9155 o un fragmento funcional del mismo, en la presencia de una cantidad conocida del ligando del receptor SP9155 marcado, con una muestra a ser evaluada para la presencia de dicho agonista o antagonista; y (b) medir la cantidad del ligando específicamente unido al receptor; por medio de la cual la muestra se identifica como que contiene un antagonista o un agonista mediante la medición sustancialmente reducida de la unión del ligando marcado al receptor, en comparación con la que se podría medir en la ausencia de la muestra.

2.- El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque el ligando marcado es un polipéptido carboxi-terminalmente amidado que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir de SEQ ID NOs: 4-11 y 13-18.

3. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el receptor comprende la secuencia de aminoácidos de SEQID NO: 2 o de SEQ ID NO: 20.

4. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la fuente del receptor comprende una membrana aislada a partir de una célula de mamífero que comprende a dicho receptor.

5.- Un método para identificar un agonista o antagonista de un receptor SP9155 que comprende: (a) poner en contacto una célula que expresa el receptor SP9155 o un fragmento funcional del mismo, en la presencia de una cantidad conocida del ligando del receptor SP9155, con una muestra a ser evaluada para la presencia de dicho agonista o antagonista; y (b) medir la movilización de calcio por la célula; por medio de la cual la muestra se identifica como que contiene un antagonista mediante la medición de la movilización sustancialmente reducida del calcio en comparación con la que se podría medir en la ausencia de la muestra y por medio de la cual la muestra se identifica como que contiene un agonista mediante la medición de la movilización sustancialmente incrementada del calcio en comparación con la que se podría medir en la ausencia de la muestra.

6.- El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque el ligando es un polipéptido carboxi-terminalmente amidado que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir de SEQ ID NOs: 4-11 y 13-18.

7. - El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque el receptor comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o de SEQ ID NO: 20.

8. - El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque la movilización de calcio se mide mediante el contacto del calcio con un indicador de calcio y luego midiendo la fluorescencia de dicho indicador.

9. - El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado además porque el indicador de calcio es pentaacetoximetilo éster del ácido 1-[2-Amino-5-(2,7-dicloro-6-hidroxi-3-oxi-9-xantenil)fenoxi]-2-(2'-amino-5'-metilfenoxi)etan-N,N,N',N'-tetraacético.

10. - Un método para elaborar un polipéptido que comprende cultivar una célula hospedera que comprende un vector recombinante, dicho vector comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido antigénico que comprende 7 o más aminoácidos contiguos a partir de SEQ ID NO: 4 o a partir de SEQ ID NO: 13 bajo condiciones en la cual se expresa el ácido nucleico.

11. - El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque el polipéptido se aisla a partir del cultivo.

12. - Un método para formar un complejo entre un péptido antigénico que comprende 7 o más residuos contiguos de una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir de SEQ ID NOs: 4 y 13 y una molécula de anticuerpo la cual se une específicamente a dicho péptido que comprende poner en contacto dicho péptido con dicha molécula de anticuerpo.

13. - El uso de un anticuerpo o fragmento para unión al antígeno del mismo el cual se une específicamente a un polipéptido que comprende 7 o más aminoácidos contiguos a partir de SEQ ID NO: 4 o a partir de SEQ ID NO: 13 y un vehículo farmacéuticamente aceptable, para preparar una composición farmacéutica para tratar o prevenir una condición médica en un sujeto mediada por el receptor SP9155.

14. - El uso como se reclama en la reivindicación 13, en donde la condición médica se selecciona a partir de dolor y obesidad.

15. - Un polipéptido antigénico aislado que comprende 7 o más residuos contiguos de una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir de SEQ ID NOs: 4 y 13.

16. - Un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir de SEQ ID NOs: 4-11 y 13-18

17. - El polipéptido antigénico aislado de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado además porque está carboxi-terminalmente amidado.

18. - Un anticuerpo o fragmento funcional del mismo el cual se une específicamente a un polipéptido de la reivindicación 15.

19. - Un ácido nucleico aislado el cual codifica un polipéptido de la reivindicación 15.

20. - El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado además porque codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácido seleccionada partir de SEQ ID NOs: 4-11 y 13- 8.

21. - El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado además porque comprendo una secuencia nucleotídica seleccionada a partir de SEQ ID NOs: 3 y 12.

22. - Un vector recombinante que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 19.

23. - Una célula hospedera que comprende el vector de la reivindicación 22.

24. - Una composición farmacéutica que comprende el polipéptido de conformidad con la reivindicación 15 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

25. - Una composición farmacéutica que comprende la molécula de anticuerpo de la reivindicación 18 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.