JP5216139B2 - GloboHおよびその断片に対する抗体のレベルに基づく癌の診断方法 - Google Patents
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Description
本願は、2008年6月16日に提出の、米国仮特許出願第61/061,974号に対する優先権を主張するものであり、この仮出願は参考で全体を引用する。
6糖のエピトープを含む、Globo Hは、正常な上皮細胞や腺組織に加えて、様々な癌で発現する。Huang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:15-20 (2006), Wang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 33:11661-11666 (2008)、およびChang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 33:11667-11672 (2008)を参照。乳癌患者の血清が高レベルの抗Globo H抗体を含むことが報告された。しかし、これらの抗体単独のレベルは乳癌の信頼性できる目安ではない。
本発明は、Globo H、その断片であるBb2、Bb3、またはBb4に対する抗体のレベルの、Globo Hの他の断片である、Gb5に対する抗体のレベルに対する割合が、癌をもたないヒトに比べて乳癌患者で有意により高いという予想できない発見に基づくものである。
図面について、まず説明する。
我々は、抗−Globo H/抗−Gb5、抗−Bb2/抗−Gb5、抗−Bb3/抗−Gb5、または抗−Bb4/抗−Gb5抗体のレベルの割合が、癌を持たない個体に対するより乳癌患者で有意により高いことを発見した。ゆえに、これらの割合のいずれかは、癌の診断において信頼できる目安として機能する。
図1に示されるオリゴ糖Globo H、Gb5、Gb4、Gb3、Gb2、Bb4、Bb3、Bb2を、Hung et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103-15-20 (2006)に記載されるワン−ポットプログラマブルプロトコル(one-pot programmable protocol)に従って調製した。これらのオリゴ糖を、Hung et al. and Blixt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:17033-17038 (2004)に記載される標準的なマイクロアレイロボット印刷技術(microarray robotic printing technology)によって、Nexterion H slide (SCHOTT North America)から購入した、NHS−被覆スライドガラス上に共有結合させた。より詳しくは、各オリゴ糖のストック溶液(80μM)のアリコートを、各オリゴ糖について2列で、16−列フォーマット(16-row format)でスライドガラス上に置いた。
・Mbr1、マウスIgM 抗−Globo Hモノクローナル抗体、
・Vk9、マウスIgG 抗−Globo Hモノクローナル抗体、および
・A488、抗−マウス/ヒトGb5モノクローナル抗体。
乳癌患者および健常個体からの血漿サンプルを、0.05% Tween 20/3% BSA/PBSバッファー(pH 7.4)で1:20に希釈し、1時間、振盪しながら、加湿チャンバーで上記実施例1に記載されたグリカンアレイと共にインキュベートした。0.05% Tween 20/PBSバッファー(pH 7.4)、PBSバッファー(pH 7.4)、および水で、それぞれ、3回ずつ洗浄した後、スライドガラスを、1時間、振盪しながら、加湿チャンバーでCy3−結合ヤギ抗−ヒトIgMまたはIgG抗体と共にインキュベートした。次に、このスライドガラスを、0.05% Tween 20/PBSバッファー(pH 7.4)で3回、PBSバッファー(pH7.4)で3回、およびH2Oで3回洗浄した。乾燥した後、スライドガラスを、マイクロアレイ蛍光チップリーダー(microarray fluorescence chip reader)(ArrayWorx microarray reader)を用いて、595nm(Cy3−結合二次抗体について)でスキャンした。
ワクチン
マウス(6週齢のメスBALB/cマウス、BioLASCO, Taiwan)に、Globo H−KLHワクチン(Optimer Pharmaceuticals, Inc., San Diego, Ca.)を、3週間、週1回、皮下に免疫処置した。コントロールマウスには、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を注射した。血清サンプルを、最後に免疫処置してから10日目に処置マウスから集めた。これらのサンプルを、30、120、240、480、960、及び1920倍に順次希釈し、抗−Globo H抗体の力価を、上記実施例1に記載されたグリカンアレイスライド(1スポット当たり、3.5×10−14モルのオリゴ糖)を用いてまたは公知のELISA(1ウェル当たり、1.28×10−10モルのGlobo Hを被覆)によって、希釈した血清サンプルで試験した。
本明細書中に開示されるすべての特徴は、いずれの組み合わせで組み合わされてもよい。本明細書中に開示される各特徴は、同じ、等価のまたは同様の目的を果たす別の特徴で置換されてもよい。ゆえに、特記されない限り、開示される各特徴は、包括的な一連の等価のまたは同様の特徴の一例にすぎない。
Claims (14)
- 乳癌を有する疑いのある被検者からの抗体を含むサンプルを用意し、
前記サンプルをGb5ならびにGlobo H、Bb2、Bb3、およびBb4の1以上とインキュベートして、前記サンプル中の抗体をGb5ならびにGlobo H、Bb2、Bb3、およびBb4の1以上に結合させ、
Gb5に結合した抗体の量ならびにGlobo Hに結合した、Bb2に結合した、Bb3に結合した、またはBb4に結合した抗体の量の双方を測定し、さらに
すべての結合した抗体の量に基づいて、前記被検者が乳癌を有しているか否かを決定することを有し、
乳癌を有していない被検者に比して、Gb5に結合した抗体の量に対するGlobo Hに結合した、Bb2に結合した、Bb3に結合した、またはBb4に結合した抗体の量の割合がより高いと、前記被検者は乳癌を有していることを示す、乳癌の検査方法。 - 前記インキュベートする段階は、前記サンプルをGb5およびGlobo Hと混合することによって、前記サンプルをGb5およびBb3と混合することによって、前記サンプルをGb5およびBb2と混合することによって、または前記サンプルをGb5、Globo H、Bb2、Bb3、およびBb4と混合することによって、行われる、請求項1に記載の方法。
- 前記サンプルが血清サンプルである、請求項1または2に記載の方法。
- Gb5ならびにGlobo H、Bb2、Bb3、およびBb4の1以上は、支持デバイスに固定化される、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- Gb5ならびにGlobo H、Bb2、Bb3、およびBb4の1以上は、支持デバイスに固定化される、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記インキュベートする段階は、前記サンプルをGb5およびGlobo Hと混合することによって行われる、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記Gb5およびGlobo Hは、支持デバイスに固定化される、請求項6に記載の方法。
- 前記インキュベートする段階は、前記サンプルをGb5およびBb2と混合することによって行われる、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記Gb5およびBb2は、支持デバイスに固定化される、請求項8に記載の方法。
- 前記インキュベートする段階は、前記サンプルをGb5およびBb3と混合することによって行われる、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記Gb5およびBb3は、支持デバイスに固定化される、請求項10に記載の方法。
- 前記インキュベートする段階は、前記サンプルをGb5、Globo H、Bb2、Bb3、およびBb4と混合することによって行われる、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記Gb5、Globo H、Bb2、Bb3、およびBb4は、支持デバイスに固定化される、請求項12に記載の方法。
- 前記サンプルが血清サンプルである、請求項1〜13のいずれか1項に記載の方法。
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