MX2010013931A - Diagnosis de cancer basada en niveles de anticuerpos contra globo h y sus fragmentos. - Google Patents

Abstract

Un método de diagnóstico de cáncer que usa un arreglo de glucano que contiene Gb5 y Globo H, Bb2, Bb3 y/o Bb4.

Description

DIAGNOSIS DE CÁNCER BASADA EN NIVELES DE ANTICUERPOS CONTRA GLOBO H Y SUS FRAGMENTOS ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Globo H, que contiene un epitope de hexasacárido, se expresa en varios cánceres, asi como en células epiteliales normales y tejidos glandulares. Ver Huang y colaboradores, Proc. Nati. ñcad. Sci. USA 103:15-20 (2006), ang y colaboradores, Proc. Nati. ñcad. Sci. USA 33:11661-11666 (2008), y Chang y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 5 33:11667-11672 (2008). Se ha reportado que los sueros de pacientes de cáncer de seno contienen niveles altos de anticuerpos anti-Globo H. Sin embargo, el nivel de estos anticuerpos solo no es una indicación confiable del cáncer de seno .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención está basada en un descubrimiento inesperado de que la relación del nivel de anticuerpos contra Globo H, su fragmento Bb2, Bb3, o Bb4 , al nivel de anticuerpos contra Gb5, otro fragmento de Globo H, es significativamente más alta en pacientes de cáncer de seno que en humanos libres de cáncer.

Por consiguiente, esta invención ofrece un método de diagnóstico de cáncer, que incluye (i) proporcionar una muestra (por ejemplo, una muestra de suero) que contiene anticuerpos de un sujeto (por ejemplo, un humano) quien se sospecha de tener un cáncer (por ejemplo, cáncer de seno, melanoraa, neuroblastoma, cáncer de piel, cáncer de hígado, cáncer de próstata, cáncer de ovario, cáncer de colon, cáncer de estomago, cáncer de pulmón y cáncer de páncreas), (ii) incubar la muestra con Gb5 y uno o más de Globo H, Bb2, Bb3, y Bb4 para permite el enlace de estas moléculas a anticuerpos en la muestra, (iii) medir tanto la cantidad de anticuerpos enlazados a Gb5 como la cantidad de anticuerpos enlazados a Globo H, enlazados a Bb2, enlazados a Bb3 o enlazados a Bb4, y (iv) determinar si el sujeto tiene cáncer basado en la relación de la cantidad de anticuerpos enlazados a Globo H, enlazados a Bb2, enlazados a Bb3 o enlazados a Bb4 a la cantidad de anticuerpos enlazados a Gb5. Una relación más alta indica que el sujeto tiene el cáncer. Globo H, Gb5, Bb2, Bb3 y Bb4 pueden ser inmovilizados sobre un dispositivo soportador para formar un arreglo de glucano. En un ejemplo, el arreglo contiene Gb5 y uno de Globo H, Bb2, Bb3 y Bb . En otro ejemplo, este contiene todas de estas moléculas.

También dentro del alcance de esta invención está el uso de Gb5 y uno o más de Globo H, Bb2, Bb3 y Bb : para la diagnosis de cáncer y para la manufactura de un dispositivo médico utilizado en la diagnosis de cáncer.

Los detalles de uno o más ejemplos de la invención se exponen en la descripción enseguida. Otras características o ventajas de la presente invención serán evidentes a partir de los siguientes dibujos y la descripción detallada de varios ejemplos y también de las reivindicaciones adjuntas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Los dibujos son primero descritos.

La Fig. 1 es un diagrama que representa las estructuras del epitope de hexasacárido en Globo H (GH) y fragmentos de este epitope. Panel A: la estructura del epitope de hexasacárido. Panel B: las estructuras de los epitopes de hexasacárido y sus siete fragmentos.

La Fig. 2 es un diagrama que muestra el uso del arreglo de glucano, que imita la superficie de la célula de cáncer, para detectar anticuerpos anti-glucano .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Los inventores han descubierto que la relación de nivel de anticuerpos anti-Globo H/anti-Gb5, anti-Bb2/anti-Gb5,. anti-Bb3/anti-Gb5 o anti-Bb4 /anti-Gb5 es significativamente más alta en pacientes de cáncer de seno que en individuos libres de cáncer. Asi, cualquiera de estas relaciones sirve como una indicación confiable en la diagnosis de cáncer.

Por consiguiente, se describe en la presente un método para diagnosticar cáncer al detectar las cantidades de anticuerpos contra Gb5 y uno o más de Globo H, Bb2, Bb3, Bb4 en un sujeto que se sospecha de tener cáncer, por ejemplo, un humano quien es genéticamente susceptible al cáncer, y determinar si el sujeto tiene cáncer basado en cualquiera de las relaciones de nivel mencionadas en lo anterior. Los anticuerpos mencionados en lo anterior pueden ser IgG, IgM, IgE, IgA o IgD, o una mezcla de los mismos.

Globo H es un glucano que contiene el epitope de hexasacárido mostrado en la Fig. 1, Panel A, y opcionalmente , una porción no de azúcar. Su fragmento (por ejemplo, Gb5, Bb2, Bb3 y Bb4) es un glucano que contiene un fragmento del epitope de hexasacárido y si es aplicable, la porción no de azúcar. Siete fragmentos del epitope de hexasacárido se muestran en la Fig. 1, Panel B. Estos oligosacáridos se pueden preparar mediante métodos rutinarios. Ver, por ejemplo Huang y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sel USA 103:15-20 (2006) . De preferencia, se conjugan con un enlazador no de azúcar tal como una alquilamina, por ejemplo, (CH2)sNH2, o una alquilazida, por ejemplo, (CH2)5N3, que puede ser enlazado covalentemente a un dispositivo de soporte (por ejemplo, un sustrato polimérico) hecho de varios materiales, tal como vidrio, plástico, nylon, metal o silicio. Cada uno de Globo H, Gb5, Bb2, Bb3 y Bb4 se puede manchar en una dirección definida sobre el dispositivo de soporte para formar un arreglo de glucano. Este arreglo, que imita la superficie de una célula de cáncer que expresa los epitopes de oligosacárido contenidos en Globo H, Gb5, Bb2, Bb3 y Bb4 (ver la Fig. 2), se puede utilizar para detectar los niveles de anticuerpo que enlazan a los epitopes de oligosacárido .

Para realizar el método de esta invención, el arreglo de glucano descrito en la presente se incuba con una muestra que contiene anticuerpo de un sujeto que se sospecha de tener un cáncer. Ejemplos de la muestra incluyen, pero no están limitados a, suero, saliva y fluidos de ganglio linfático. El arreglo se lava para remover los anticuerpos no enlazados y luego se incuba con un anticuerpo secundario marcado que específicamente . enlaza a los anticuerpos de interés, que pueden ser IgG, IgA, IgD, IgE · o IgM humanos. El arreglo de glucano se lava nuevamente para remover las moléculas de anticuerpo secundario no enlazadas y las intensidades de la señal liberadas de las moléculas de anticuerpo secundario enlazadas corresponden a los niveles de los anticuerpos objetivo. Cuando una relación de nivel más alta de anti-Globo H/anti-Gb5, anti-Bb2/anti-Gb5, anti-Bb3/anti-Gb5 o anti-Bb4 /anti-Gb5 se observa en un sujeto, el sujeto se diagnostica que tiene cáncer o en riesgo de desarrollar el cáncer.

Sin elaboración adicional, se cree que un experto en la técnica, basado en la descripción anterior, puede utilizar la presente invención a su grado más completo. Las siguientes modalidades específicas, por lo tanto, sé van a considerar como meramente ilustrativas, y no limitativas del resto de la descripción de cualquier manera que sea, Todas las publicaciones citadas en la presente se incorporan por referencia .

Ejemplo 1: Enlace de Anticuerpos Vk9, Mbrl y A488 a Un Arreglo de Glucano Los oligosacáridos Globo H, Gb5, Gb4 , Gb3, Gb2, Bb4, Bb3, Bb2 mostrados en la Fig. 1 se prepararon de acuerdo con un protocolo programable de un recipiente descrito en Hung y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci USA 103-15-20 (2006) . Estos oligosacáridos se unieron covalentemente sobre una platina de vidrio recubierta con NHS, que se adquirió de platina Nexterion H (SCHOTT North America), mediante la tecnología de impresión robótica de arreglo estándar descrita en Hung y colaboradores y Blixt y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 101: 17033-17038 (2004). Más específicamente, un alícuota de una solución de extracto (80 µ ) de cada oligosacárido se colocó sobre la platina de vidrio en un formato de 16 hileras, dos hileras para cada oligosacárido.

Los siguientes tres anticuerpos se utilizaron en este estudio: • Mbrl, un anticuerpo monoclonal anti-Glqbo H de IgM de ratón, • VK-9, un anticuerpo monoclonal anti-Globo H de IgG de ratón y A488, un anticuerpo monoclonal anti-ratón/Gb5 humano .

Cada uno de los anticuerpos se incubó con la platina de vidrio, (a la cual se unen los oligosacáridos ) descritos en lo anterior en Tween 20 al 0.05%/solución reguladora de PBS (pH 7.4) en una cámara de humidificación con agitación durante lh. La platina luego se lavó, a su vez, tres veces con Tween 20 al 0.05%/solución reguladora de PBS (pH 7.4), tres veces son solución reguladora de PBS (pH 7.4) y tres veces con agua. Enseguida, la platina se incubó con IgM anti-ratón de cabra conjugado con Cy3 (para Brl) o IgG (para VK-9 y A488) de anticuerpo de la misma cámara con agitación durante lh. La platina se lavó nuevamente tres veces con Tween 20 al 0-05%/solución reguladora de PBS (pH 7.4), tres veces con solución reguladora de PBS (pH 7.4) y tres veces con H20 y se secó. Finalmente, la platina se exploró en 595nm (para anticuerpo secundario conjugado con Cy3) y 488 nm (para anticuerpo anti-antigeno SSEA-3 A488) utilizando un lector de chip de fluorescencia de microarreglo (lector de microarreglo ArrayWorx) .

Todos los tres anticuerpos se enlazan al arreglo de glucano descrito en lo anterior. VK9 específicamente se enlaza a Globo H y Bb4; Mbrl específicamente se enlaza a Globo H Y BB4 y también se enlaza a Bb3 en una afinidad inferior; y A488 específicamente se enlaza a Gb5. estos resultados indican que el arreglo de glucano es capaz de capturar anticuerpos que enlazan a Globo H y/o sus fragmentos .

Ejemplo 2: Uso de Un Arreglo de Glucano para Detectar Anticuerpos Contra Globo H y sus Fragmentos en Pacientes de Cáncer de Seno Las muestras de plasma de pacientes de cáncer de seno e individuos sanos se diluyeron 1:20 con T een 20 al 0.05%/BSA al 3%/solución reguladora de PBS (pH 7.4) y se incubaron con la platina de arreglo de glucano descrita en el Ejemplo 1 anterior en una cámara de humidificación con agitación durante lh. Después de que es lavada con tween 20 al 0.05%/solución reguladora de PBS (pH 7.4), solución reguladora de PBS (pH 7.4) y agua, cada uno por tres veces, la platina se incubó con anticuerpo IgM o IgG anti-humano de cabra conjugado con Cy3 en la cámara de humidificación con agitación durante lh. La platina luego se lavó tres veces con Tween 20 al 0.05%/solución reguladora de PBS (pH 7.4), tres veces con solución reguladora de PBS (pH7.4) y tres veces con H20. Después de ser secada, la platina se exploró en 595nm (para anticuerpo secundario conjugado con Cy3) , con un lector de chip de fluorescencia de microarreglo (lector de microarreglo ArrayWorx) .

Como se muestra en las Tablas 1 y 2 enseguida, las relaciones de nivel de IgG enlazado a Globo H enlazado a IgG/Gb5 (GH/Gb5 IgG) e IgM enlazado a Globo H enlazado a IgM/Gb5 (GH/Gb5 IgM) fueron mucho más altas en las muestras de plasma de los pacientes de cáncer de seno que las muestras de plasma de los individuos, sanos. Como también se muestra en las dos tablas, la relación es de Bb2/Gb5 IgG, Bb4/Gb5 IgM, Bb3/Gb5 IgM y Bb2/Gb5 IgM de los pacientes de cáncer fueron significativamente más altas que aquellas de los individuos sanos. Estos datos indican que las relaciones listadas en lo anterior son marcadores confiables para diagnosticar cáncer. Tabla 1. Relaciones de nivel de IgG del Globo H y sus fragmentos Bb2 , Bb3 y Bb4 a Gb5 en pacientes de cáncer de seno (n = 58) e individuos sanos (n = 47) ***: p < 0.001, extremadamente significante; **: p = 0.001-0.01, muy significante Tabla 2. Relaciones de nivel de IgM del Globo H y sus fragmentos Bb2 , Bb3 y Bb4 a Gb5 en pacientes de cáncer de seno (n = 58) e individuos sanos (n = 47) % GH/Gb5 Bb4/Gb5 Bb3/Gb5 Bb2/Gb5 de Sano Cáncer Sano Cáncer Sano Cáncer Sano Cáncer relación de IgM Media 27.82 53.98 15.73 22.74 15.36 40.51 16.19 30.36 SD 23.42 35.41 21.60 23.98 23.30 59.76 18.83 35.44 P p < 0.0001 p < 0.1259* p < 0.0043** p < 0.0105* * * * ***: p < 0.001, extremadamente significante; **: p = 0.001-0.01, muy significante *: p = 0.01-0.05, significante Ejemplo 3: Uso del Arreglo de Glucano para Inspeccionar la Respuestas Inmunes Inducidas para la Vacuna de Globo H Ratones (ratones BALB/c hembras de 6 semanas de edad, BioLASCO, Taiwan) se inmunizaron subcutáneamente con la vacuna Globo H-KLH (Optimer Pharmaceuticals, Inc., San Diego, Ca . ) una vez cada semana por tres semanas. Los ratones de control se inyectaron son solución salina reguladora de fosfato (PBS) . Muestras de suero se recolectaron de los ratones tratados 10 días después de la última inmunización. Estas muestras se sometieron a dilución en serie en 30, 120, 240, 480, 960 y 1920 veces y los títulos de anticuerpos anti-Globo H se examinaron en las muestras de suero diluidas utilizando la platina de arreglo de glucano descrita en el Ejemplo 1 anterior (3.5 x 10"14 mol de oligosacáridos por mancha) o por ELISA convencional (recubierto con 1.28 x 10~10 mol de Globo H por cavidad) .

La vacuna Globo H-KLH indujo la secreción de anticuerpos anti-Globo H en los ratones inmunizados. Ver la Tabla 3 enseguida. También se ha encontrado que el ensayo de arreglo de glucano descrito en lo anterior es mucho más sensible como es comparado con ELISA convencional.

Tabla 3. Respuesta Inmune Inducida por la Vacuna de Globo H Determinada por el Análisis de Arreglo de Glucano y ELISA * Calculado como sigue: (intensidad de señal post-inmune - intensidad de señal pre-inmune) /intensidad de señal antecedente OTRAS MODALIDADES Todas las características divulgadas en esta especificación se pueden combinar en cualquier combinación. Cada característica divulgada en esta especificación se puede reemplazar por una característica alternativa que sirve para el mismo, equivalente o similar propósito. Así, a menos que se establezca expresamente de otra mansera, cada característica divulgada es solamente un ejemplo de una serie genérica de características equivalentes o similares.

A partir de la descripción anterior, un experto en la técnica puede averiguar fácilmente las características esenciales de la presente invención, y sin apartarse del espíritu y alcance de la misma, puede hacer varios cambios y modificaciones de la invención para adaptarla a varias utilizaciones y condiciones. Así, otras modalidades también están dentro de las reivindicaciones

Claims (19)

REIVINDICACIONES

1. Un método de diagnóstico de cáncer, caracterizado porque comprende proporcionar una muestra que contiene anticuerpos de un sujeto que se sospecha de tener cáncer, incubar la muestra con Gb5 y uno o más de Globo H, Bb2, Bb3 y Bb4 para permitir el enlace de anticuerpos en la muestra al Gb5 y el uno o más de Globo H, Bb2, Bb3 y Bb , medir tanto la cantidad de anticuerpos enlazados a Gb5 como la cantidad de anticuerpos enlazados a Globo H, enlazados a Bb2f enlazados a Bb3 o enlazados a Bb4, y determinar si el sujeto tiene el cáncer basado en las cantidades de todos los anticuerpos enlazados, en donde una relación más alta de la cantidad de anticuerpos enlazados a Globo H, enlazados a Bb2 , enlazados a Bb3 o enlazados a Bb4 a la cantidad de anticuerpos enlazados a Gb5, como es comparada con aquella de un sujeto libre de cáncer, indica que el sujeto tiene el cáncer.

2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la etapa de incubación se realiza al mezclar la muestra con Gb5 y Globo H.

3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la etapa de incubación se realiza al mezclar la muestra con Gb5 y Bb3.

4. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la etapa de incubación se realiza al mezclar la muestra con Gb5 y Bb2.

5. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la etapa de incubación se realiza al mezclar la muestra con Gb5, Globo H, Bb2, Bb3 y Bb .

6. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la muestra es una muestra de suero.

7. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el Gb5 y el uno o más de Globo H, Bb2, Bb3 y Bb4 se inmovilizan sobre un dispositivo de soporte .

8. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el cáncer se selecciona del grupo que consiste de cáncer de seno, melanoma, neuroblastoma, cáncer de piel, cáncer de hígado, cáncer de próstata, cáncer de ovario, cáncer de colon, cáncer de estómago y cáncer de páncreas .

9. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el cáncer es cáncer de seno.

10. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el Gb5 y el uno o más de Globo H, Bb2, Bb3 y Bb4 se inmovilizan sobre un dispositivo de soporte.

11. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la etapa de incubación se realiza al mezclar la muestra con Gb5 y Globo H.

12. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el Gb5 y el Globo H se inmovilizan sobre un dispositivo de soporte.

13. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la etapa de incubación se realiza al mezclar la muestra con Gb5 y Bb2.

14. El método de gonformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el Gb5 y el Bb2 se inmovilizan sobre un dispositivo de soporte.

15. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la etapa de incubación se realiza al mezclar la muestra con Gb5 y Bb3.

16. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el Gb5 y el Bb3 se inmovilizan sobre un dispositivo de soporte.

17. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la etapa de incubación se realiza al mezclar la muestra con Gb5, Globo H, Bb2, Bb3 y Bb4.

18. El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el Gb5, Globo H, Bb2, Bb3 y Bb4 se inmovilizan sobre un dispositivo de soporte.

19. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la muestra es una muestra de suero.