CN104698183A - 一种肝癌肿瘤标志物、其抗体及应用 - Google Patents

一种肝癌肿瘤标志物、其抗体及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种肝癌肿瘤标志物、其抗体及应用。所示肝癌肿瘤标志物为含Fucα1，2结构的糖抗原，所述Fucα1，2结构即α1→2岩藻糖苷键，来源于鞘糖脂或N-糖苷键型糖蛋白。所示Fucα1，2结构的糖抗原在肝癌组织中有特异性高表达现象，因此可以作为肝癌诊断的肿瘤标记物。本发明以含Fucα1，2结构的糖抗原为免疫原制备得到了其多克隆抗体和单克隆抗体，用于肝癌的诊断，有助于快速、准确地发现肝癌。

Description

一种肝癌肿瘤标志物、其抗体及应用
技术领域
本发明涉及肿瘤标志物技术领域，尤其涉及一种肝癌肿瘤标志物、其抗体及应用。
背景技术
肝癌是常见的恶性肿瘤之一，分为原发性肝癌和转移性肝癌，其中原发性肝癌最为常见且恶化程度较高。世界每年都约有60万人新患肝癌，在众多恶性肿瘤中排第五位。其中，肝癌在我国病人数占全球肝癌发病人数的55%，这已经严重威胁了我国人民的健康和生命安全，其危险性不容小觑。因此，急需发现一种有效而又具有特异性的肿瘤标志物以帮助肝癌的早期诊断或者后期治疗。
由于肝癌化疗放疗的不敏感型，使肝癌的治疗仍然缺乏有效的治疗。因此，寻找一种切实可行性的治疗靶点或新方法成为治疗肝癌的当务之急。研究发现，糖扼合物（Glpcokonjugaten）是细胞膜甚至是蛋白上存在的一类非常重要的生物小分子，他们对于信号传导以及维持正常的生理机能都起着非常关键的作用。而在肿瘤中，这些分子的结构往往发生异常，成为糖抗原。这些糖抗原会表达在异常的肿瘤细胞表面或者是异常的糖蛋白表面，并且与肿瘤的发生和发展存在密切的关系。异常肿瘤的糖抗原目前发现的有T、Tn、β1，6分支的N-glycan抗原，以及如Lewis a，Lewis b等鞘糖脂。
本领域还需要寻找更多的肝癌肿瘤标志物，及制备相应的抗体，以用于肝癌的快速、准确的诊断。
发明内容
本发明人通过研究发现含Fucα1，2结构的糖抗原在肝癌组织中有特异性高表达现象，而在癌旁的正常组织中没有这种高表达现象，本发明基于此发现完成。
本发明提供一种肝癌肿瘤标志物、其抗体及应用，所提供的肝癌肿瘤标志物能够明确表征肝癌的发生，所提供的其抗体能够用于制备诊断肝癌的试剂盒。
本发明包括以下内容：
在第一方面，本发明提供一种肝癌肿瘤标志物，其为含Fucα1，2结构的糖抗原，所述Fucα1，2结构即α1→2岩藻糖苷键。
本发明中，含Fucα1，2结构的糖抗原在下文中有时称为含Fucα1，2结构的糖链，其含义是相同的，在本发明中可以替换。
作为本发明的优选，所述含Fucα1，2结构的糖抗原来源于鞘糖脂，即所述含Fucα1，2结构的糖抗原是鞘糖脂的一部分。
作为本发明的优选，所述含Fucα1，2结构的糖抗原来源于N-糖苷键型糖蛋白，即所述含Fucα1，2结构的糖抗原是N-糖苷键型糖蛋白的一部分。
在第二方面，本发明提供一种多克隆抗体，是通过含Fucα1，2结构的糖抗原免疫动物产生的。
作为本发明的优选，所述动物为小鼠。
在第三方面，本发明提供一种单克隆抗体，是含Fucα1，2结构的糖抗原免疫小鼠得到的脾细胞与小鼠淋巴瘤细胞融合得到的杂交瘤细胞产生的。
作为本发明的优选，所述小鼠淋巴瘤细胞为P2-X63-Ag8.653。
在第四方面，本发明提供一种肝癌诊断试剂盒，包括第二方面所述的多克隆抗体或者第三方面所述的单克隆抗体。
在第五方面，本发明提供第二方面所述的多克隆抗体或者第三方面所述的单克隆抗体在制备肝癌诊断试剂盒中的应用。
在第六方面，本发明提供第二方面所述的多克隆抗体或者第三方面所述的单克隆抗体在组织免疫染色中的应用。
本发明的有益效果为：本发明通过研究发现含Fucα1，2结构的糖抗原在肝癌组织中有特异性高表达现象，而在癌旁的正常组织中没有这种高表达现象，基于此判断含Fucα1，2结构的糖抗原可以作为肝癌诊断的肿瘤标记物。本发明以含Fucα1，2结构的糖抗原为免疫原制备得到了其多克隆抗体和单克隆抗体，用于肝癌的诊断，有助于快速、准确地发现肝癌。
附图说明
图1为含Fucα1，2结构的糖链的二级质谱图，以C24和C16的Fucα1，2结构的糖链为例，其中C24和C16指神经酰胺部分的脂肪酸链的长度。
图2为含Fucα1，2结构的糖链的三级质谱图，以C26和C16的Fucα1，2结构的糖链为例，其中C26和C16指神经酰胺部分的脂肪酸链的长度。
图3为含Fucα1，2结构的糖链的四级质谱图，以C26和C16的Fucα1，2结构的糖链为例，其中C26和C16指神经酰胺部分的脂肪酸链的长度。
图4为肝癌组织和癌旁组织中含Fucα1，2结构的糖链含量对比结果，其中**表示p<0.001。
图5为含Fucα1，2结构的糖抗原与其单克隆抗体的免疫染色结果，其中箭头指示的位置表示糖抗原与其单克隆抗体有结合，结果显示肝癌组织中有较多的糖抗原与其单克隆抗体的结合，而癌旁组织中未见这种结合。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，以下实施例仅为本发明的优选实施例，以便于更好地理解本发明，因而不应视为限定本发明的范围。对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂厂商购买得到的。
实施例1
从组织蛋白或者血清蛋白分离含有Fucα1，2结构的糖链，具体步骤如下：使用PNGase F酶试剂盒（New England，英国），按照厂商提供的试剂盒说明书，提取蛋白N糖链，并对蛋白N糖链进行多级质谱分析，其过程如下：
（1）取500微克组织蛋白或者血清蛋白置于离心管中，加入5微升10×变性剂、45微升超纯水，混匀，再煮沸10min，然后离心。
（2）冷却至室温，加入5微升10×G7缓冲液、5微升10%NP-40缓冲液，加入1微升PNGase F酶，于37℃下过夜。
（3）然后干燥样品，过SEP-C18柱，样品进一步经过真空干燥以后，冰浴下加入300微升新鲜配制的还原溶液——NaBH4溶液（10mg/mL in0.01MNaOH），室温下静置过夜。
（4）冰浴下，加入几滴乙酸终止反应，然后升温至室温，并加入3mL乙醇干燥样品。
（5）为了去除样品中的硼酸盐，分别、依次向上述干燥的样品中加入3mL下列试剂：a、1%乙酸：甲醇，b、甲苯，c、1%乙酸：甲醇，d、甲苯，e、1%乙酸：甲醇，重复进行加入试剂-干燥的步骤，最终得到的干燥样品即为从血清抗体中切割下来的糖链。
（6）用1mL水溶解切割下来的糖链。
（7）准备PGC预装柱（需要亲和层析装置），分别、依次向预装柱中加入下列试剂3mL：a）1M NaOH；b）HPLC水；c）80%ACN水溶液（内含0.1%TFA）；d）25%ACN水溶液（内含0.05%TFA）；e）25%ACN水溶液；f）水，进行洗柱；再用6-8mL水平衡柱子。
（8）向步骤（7）所得柱子上样步骤（6）所得样品，加入8-10mL水洗脱柱子，以去除杂质和盐分；然后加入3mL的25%CAN溶液洗脱下中性的糖链（如果洗脱的糖是酸性的，需要加3m25%ACN水溶液（内含0.1%TFA）；真空干燥样品，加入甲醇溶解样品，进行多级质谱分析，所得质谱图如图1所示。
（9）将上述质谱分析中相对丰度较大的峰所对应的糖链，进行多级质谱结构鉴定，以确定所对应糖链的具体结构，如图2和图3所示。
对于含Fucα1，2结构的鞘糖脂，分离方法如下：取肝癌组织样本或者血清样本研磨破碎，加溶剂氯仿：甲醇（1：1，v/v）并超声震荡一小时后离心取上清液，反复四次，再加入异丙醇：己烷：一级水（55:25:20，v/v/v）超声震荡一小时后离心取上清，反复四次，离心干燥器干燥。先将SephadexA25凝胶液装柱，后用氯仿：甲醇：水（30:60:8，v/v/v）溶液平衡，之后将上一步中干燥的脂质样品加入层析柱，用氯仿：甲醇：水（30:60:8，v/v/v）洗脱获得中性糖脂并收集获得中性糖脂，后离心干燥器干燥。先用氯仿：甲醇（98：2，v/v）溶液平衡60号的硅胶柱层析，将上步中干燥的中性脂质上样，后用100mL氯仿：甲醇：水（10：10：2.5，v/v/v）洗脱并收集获得中性鞘糖脂，氮气干燥。用0.1mL的甲醇：氯仿（1:1，v/v）溶解上步中干燥的中性鞘糖脂，然后经过质谱分析。
通过质谱的相对定量，并采用采用SPSS软件和GraphPad Prism5软件进行Student-Newman-Keulsa,b检验分析证明，含Fucα1，2结构的糖链在肝癌中高表达且具有统计学意义（图4）。
实施例2
专一性识别含有Fucα1，2结构糖链的抗体的制作过程。购买已知结构中含有Fucα1，2结构的鞘糖脂Globo-H（Takara，日本），取50μg鞘糖脂Globo-H联合0.5mL弗氏完全佐剂注射小鼠，2周后用50μg鞘糖脂联合0.5mL弗氏不完全佐剂再次免疫小鼠，4周后400μg鞘糖脂经腹腔免疫小鼠。眼眶后眦静脉取血，-20℃冻存血清。4天后处死小鼠取脾脏用于细胞融合。三次鞘糖脂免疫小鼠后，在其血清诱导的抗鞘糖脂的抗体采用常规ELISA方法检测：以15μg/mL鞘糖脂溶解于包被液中（0.1M NaCO3、PH9.6、0.1%BSA）4℃包被96孔酶标板中，以5%牛奶-PBS封闭；依次加1：100稀释血清，HRP标记的羊抗鼠IgG、OPD、显色终止，测OD490nm。取未免疫的同一品系的BALB/c小鼠摘眼球放血，置于EP管中，其血清做阴性对照，脱颈椎处死小鼠，在超净工作台内剪开小鼠腹腔，吸取少许无血清1640培养基注入小鼠腹腔，反复吹打4-5次，吸出腹腔内细胞悬液，其主要含巨噬细胞，1500rpm离心5分钟，弃去上清加入HAT培养基，制成饲养细胞悬液置于CO2培养箱中培养，留做细胞融合使用。小鼠P2-X63-Ag8.653（简称653）淋巴瘤细胞的准备：融合前两周用8-氮鸟嘌呤（8-AG）对653细胞作选择培养。融合当天收集的处于对数生长期，活率大于95%的653细胞，用无血清培养基RPMI-1640洗涤细胞一次，取3×107的653细胞备用。小鼠脾细胞制备：选择血清抗体效价最高小鼠，脱颈椎处死，超净工作台无菌取脾，研磨并制成单细胞悬液，用无血清1640培养基悬浮，收集2×108细胞备用。细胞融合：使用常规方法融合细胞，将653细胞和小鼠脾细胞以1:5～1:10的比例融合，无血清1640洗涤2-3次，离心弃去上清，轻轻弹击离心管底部，是细胞沉淀疏松，将37℃预热的1mL50%PEG于1分钟内缓缓滴加入细胞沉淀中，边加边缓缓均匀摇动离心管，沿管壁滴加液滴，静置融合90秒钟，之后在2分钟内加上1mL无血清1640培养基，1分钟内加上1mL无血清1640培养基，再在30秒内加无血清培养基16401mL，再缓缓加入无血清培养基164030-40mL，低速离心6分钟，弃上清，20%的小牛血清HAT培养液轻轻重悬沉淀细胞，再滴加入铺有饲养细胞的96孔培养版中，每孔100μL。放于37℃，5%CO2培养箱培养。待融合之后，将融合的细胞在HAT培养基中培养14天，人后换用HAT培养基培养，等两周后逐步换成20%胎牛血清的RPMI1640培养基。等杂交瘤细胞铺满培养版孔底1/4的部分时，去培养上清液，ELISA方法检测阳性克隆。连续检测OD值逐渐升高或维持同一水平，并且其值大于阴性对照2倍或判定为阳性。保留好阳性孔，并及时克隆化。克隆的前一天按前面所述方法制备1×105/ml小鼠腹腔巨噬细胞，每孔加100μL。选择阳性孔的细胞技术并以有限稀释法克隆：取500个活细胞悬浮于10mL培养液中（50/mL），按每孔100μL接种于96孔中，放在37℃，5%CO2培养箱中培养，于第五天补加一次培养液，之后每三天换液一次。待克隆长大后铺满培养孔底1/3-1/4再次抗体检测，连续进行克隆化直至所检测的克隆阳性率达100%，选择阳性反应最强的克隆株扩大培养并冻存。将阳性单克隆杂交瘤细胞一次转入24孔，6孔培养板，于1640完全培养基中扩大培养，待细胞铺满培养孔底部时，收集后10分钟1500rpm离心，弃掉上清，含10%DMSO的完全培养液的冻存液稀释，分装入1mL的冻存管，4℃放置30分钟之后于-20℃放置2小时，-70℃放置1个小时，最后转移至液氮中冻存。一代、二代、三代的细胞克隆均以此法冻存于液氮中。
采用体内杂交瘤培养法在小鼠腹水中收集高效价高纯度的抗Fucα1，2结构糖链的单克隆抗体。取6-8周龄的雌性BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注入降植烷0.5mL，一周后腹腔注射杂交瘤细胞1×107个/只，之后8-10天开始收集腹水，ELISA法检测阳性率。离心取腹水上清并加入等体积的饱和(NH4)2SO4溶液混匀并置于40℃水浴4-6小时，离心弃上清。0.01mol/L PBS(PH=7.4)溶解沉淀物，透析去除(NH4)2SO4，遵照Pharmacia公司的Protein G亲和层析法进行单克隆抗体纯化。
抗Fucα1，2结构糖链的抗体可以用与制备肝癌诊断试剂盒以及用于各种组织免疫染色中。以免疫组化为例，取肝癌患者肿瘤组织制成石蜡切片，先与60℃恒温箱中烘烤60分钟，再于二甲苯中浸泡10分钟，更换一次二甲苯再浸泡10分钟，之后分别依次于无水乙醇、95%乙醇、80%乙醇、70%乙醇中浸泡5分钟，PBS洗2-3次（5分钟/次）后进行抗原修复，再PBS洗2-3次（5分钟/次），滴加正常血清封闭液置于室温20分钟，去除多余液体，而后加抗Fucα1，2结构糖链的单克隆抗体50μL，静置37℃1小时，PBS洗5分钟/次共3次，再滴加含有0.05%的tween-20的羊抗鼠二抗50μL，于37℃放置1小时，PBS洗5分钟/次共3次，滴加SP于30℃放置20分钟之后用PBS洗5分钟/次共4次，再用DAB显色5-10分钟后用PBS冲洗10分钟，苏木精复染2分钟，盐酸酒精分化，最后自来水冲洗15分钟后脱水、透明、封片、并镜检，如图5所示。其中箭头指示的地方表示糖抗原与其单克隆抗体有结合，结果显示肝癌组织中有较多的糖抗原与其单克隆抗体的结合，而癌旁组织中未见这种结合，证明含Fucα1，2结构的糖抗原在肝癌组织呈特异性高表达。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细特征以及详细方法，但本发明并不局限于上述详细特征以及详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细特征以及详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明选用组分的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种肝癌肿瘤标志物，其为含Fucα1，2结构的糖抗原，所述Fucα1，2结构即α1→2岩藻糖苷键。
2.根据权利要求1所述的肝癌肿瘤标志物，其特征在于，所述含Fucα1，2结构的糖抗原来源于鞘糖脂。
3.根据权利要求1所述的肝癌肿瘤标志物，其特征在于，所述含Fucα1，2结构的糖抗原来源于N-糖苷键型糖蛋白。
4.一种多克隆抗体，是通过含Fucα1，2结构的糖抗原免疫动物产生的。
5.根据权利要求4所述的多克隆抗体，其特征在于，所述动物为小鼠。
6.一种单克隆抗体，是含Fucα1，2结构的糖抗原免疫小鼠得到的脾细胞与小鼠淋巴瘤细胞融合得到的杂交瘤细胞产生的。
7.根据权利要求6所述的单克隆抗体，其特征在于，所述小鼠淋巴瘤细胞为P2-X63-Ag8.653。
8.一种肝癌诊断试剂盒，包括如权利要求4或5所述的多克隆抗体或者如权利要求6或7所述的单克隆抗体。
9.如权利要求4或5所述的多克隆抗体或者如权利要求6或7所述的单克隆抗体在制备肝癌诊断试剂盒中的应用。
10.如权利要求4或5所述的多克隆抗体或者如权利要求6或7所述的单克隆抗体在组织免疫染色中的应用。
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