WO2020071968A1 - Способ ранней диагностики почечно-клеточной карциномы - Google Patents

Способ ранней диагностики почечно-клеточной карциномы

Info

Publication number
WO2020071968A1
WO2020071968A1 PCT/RU2019/050167 RU2019050167W WO2020071968A1 WO 2020071968 A1 WO2020071968 A1 WO 2020071968A1 RU 2019050167 W RU2019050167 W RU 2019050167W WO 2020071968 A1 WO2020071968 A1 WO 2020071968A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
arrestin
antibodies
patient
pac
cell carcinoma
Prior art date
Application number
PCT/RU2019/050167
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Андрей Александрович ЗАМЯТНИН
Александр Владиславович БАЖИН
Алексей Викторович БАЛДИН
Андрей Зиновьевич ВИНАРОВ
Марина Олеговна ГОЛОВАСТОВА
Алена Николаевна ГРИШИНА
Евгений Юрьевич ЗЕРНИЙ
Дмитрий Олегович КОРОЛЕВ
Людмила Владимировна САВВАТЕЕВА
Павел Павлович ФИЛИППОВ
Original Assignee
федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации (Сеченовский университет)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации (Сеченовский университет) filed Critical федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации (Сеченовский университет)
Priority to EA202100134A priority Critical patent/EA202100134A1/ru
Publication of WO2020071968A1 publication Critical patent/WO2020071968A1/ru

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/483—Physical analysis of biological material
    • G01N33/487—Physical analysis of biological material of liquid biological material
    • G01N33/49—Blood
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor

Definitions

  • the invention relates to the field of medicine, namely oncology and clinical biochemistry.
  • the invention can be used for early diagnosis of renal cell carcinoma by the presence of antibodies to visual arrestin 1 in the blood serum of patients using immunological detection methods.
  • Renal cell carcinoma is the second most common malignant pathology among cancer-related cancer diseases (RL Siegel, KD Miller, A. Jemal, Cancer Statistics, 2017, CA: a cancer journal for clinicians, 67 (2017) 7-30 DOI: 10.3322 / saas. 21387). It is characterized as aggressive and invasive cancer with a high frequency of metastasis. In addition, PAC does not have specific symptoms, which is why it is usually diagnosed by chance at a late stage during medical check-ups or other routine studies for another pathology. About 40% of patients diagnosed with local PAC eventually develop metastases (AJ Wein, LR Kavoussi, MF Campbell, Campbell-Walsh urology / editor-in-chief, Alan J.
  • biomarkers in biological fluids or in the tumor itself can be quite informative. Despite this, the heterogeneity of the tumor and the complexity of the biopsy procedure at an early stage of the disease are limiting factors. On the other hand, taking blood to detect biomarkers is a less invasive procedure. However, serological biomarkers are degraded by circulating proteases and nucleases, which, thus, reduces the diagnostic value of the data obtained in such tests (T.C. Ngo, CG Wood, JA Kagat, Biomarkers of renal cell carcinoma, Urologic oncology, 32 ( 2014) 243-251 DOI: l0.l0l6 / j.urolonc.20l3.07.0ll).
  • biomarker Another type of biomarker that can be used in the early diagnosis of PACs is antibodies to proteins aberrantly expressed in the tumor.
  • OAAs tumor-associated antigens
  • nucleic acids antibodies are much more stable in the blood (M.A. Murphy, JJ O'Leary, DJ Cahill, Assessment of the humoral immune response to cancer, Journal of proteomics, 75 ( 2012) 4573-4579 DOI: 10.l0l6 / j.jprot.20l2.01.021).
  • the humoral immune response amplifies over time and lasts.
  • the cause of the antitumor humoral immune response is the aberrant expression of OAA.
  • melanoma cells can express PCA such as rhodopsin, transducin, cGMP phosphodiesterase 6, rhodopsin kinase, reverin and arrestin 1 (AV Bazhin, D. Whitney, N. Willner, C. De Smet, A. Heinzelmann, NK
  • the composition of all arrestin proteins included in the so-called arrestin clan includes the arrestin domain, which is a unique ancestor of all arrestees.
  • the clan consists of two families: the family of arrestees and the so-called family of Ur826-related proteins, which are also called a-arrestins, or arrestin-domain-containing proteins (ARRDCs; proteins containing the arrestin domain) to denote the corresponding proteins in mammals (CE Alvarez , On the origins of arrestin and rhodopsin, BMC evolutionary biology, 8
  • the family of arrestin consists of 4 proteins, which in turn are divided into 2 groups: visual arrestin, which include arrestin 1 (S-antigen, SAG, S-arrestin, stick arrestin, visual arrestin) and arrestin 4 (X-arrestin , ARR3, cone arrestin), and b-arrestin, which include arrestin 2 (b-arrestin or b-arrestin !, !, ARRB1) and arrestin 3 f-arrestin-2, ARRB2) (EV Gurevich, VV Gurevich, Arrestins : ubiquitous regulators of cellular signaling pathways, Genome biology, 7 (2006) 236 DOI: l0.H86 / gb-2006-7-9-236).
  • visual arrestin which include arrestin 1 (S-antigen, SAG, S-arrestin, stick arrestin, visual arrestin) and arrestin 4 (X-arrestin , ARR3, cone arrestin
  • b-arrestin which include arrestin 2 (b-arrestin or b-
  • Ur826-related proteins or A-arrestin in mammals consists of 6 proteins: ARRDC1, ARRDC2, ARRDC3 / TLIMP, ARRDC4, ARRDC5 and TXNIP / TBP-2 (L. Rice, C. Lice, Alpha arrestins - new players in Notch and GPCR signaling pathways in mammals , Journal of cell science, 127 (2014) 1359-1367 DOI: 10. l242 / jcs.142539). The full classification of the arresting clan for mammals is given in table. 1.
  • arrestin 1 and arrestin 4 have a strictly specific localization in the human body - cells of the retina and pineal gland.
  • the visual group arrests are “foreign” antigens for our body, and, accordingly, are immunogenic.
  • the immunogenic activity of arrestin 1 has been shown in experimental models of autoimmune diseases of the retina.
  • the expression of arrestin 1 was detected in melanoma cells in patients with MAP, which allows the attribution of arrestin 1 to PC A.
  • the technical problem solved by the present invention is the development of a minimally invasive method for early diagnosis of PAC.
  • the technical result of the claimed invention is the ability to determine the presence of antibodies to arrestin 1 in the blood serum of patients with suspected pathology by immunological detection methods.
  • the problem is solved by the method of determining the presence in the blood serum of patients of antibodies to arrestin 1, capable of aberrantly expressed in tumor cells of the kidneys of patients with PAC, using immunological (immunometric) methods. These methods include immunoblotting, enzyme immunoassay, immunofluorescence analysis, etc.
  • FIG. Figure 1 shows the immunoblot of serum samples from patients with PAC.
  • Control samples recombinant visual arrestin 1 (1 ⁇ g per lane) stained with goat monoclonal antibodies to visual arrestin 1 (lane 1), or using patient serum (dilution 1: 20) with urolithiasis (lane 2); typical blots of recombinant visual arrestin 1 (1 ⁇ g per lane) stained with patient sera (titer 1:20) with PAC with lanes 3-5) antibodies to visual arrestin 1.
  • Two independent experiments were performed for each serum sample.
  • the presence of antibodies to arrestin 1 in blood serum was determined using Western blotting. If the test result is positive, the patient from the risk group for PAC or with a preliminary diagnosis of a kidney tumor is diagnosed with PAC. According to the results of the studies, a high frequency of the presence of antibodies to arrestin 1 in the blood serum of patients with PAC was shown. Among the 33 patients tested with AUC, 25 showed antibodies to arrestin 1, which corresponds to 75.7%. In the table. 3 presents the data of the study.
  • the inventive method for the early diagnosis of PAC can be carried out as follows. A patient is taken on an empty stomach for venous blood in the morning. Then, after folding, the whole blood is centrifuged, serum is taken, which is then used for analysis. It is possible to freeze serum samples at -80 ° C for storage and further use. To detect anti-arrestin antibodies in the obtained serum samples, SDS-PAGE electrophoresis of arrestin 1 (2 ⁇ g per lane) was performed in a 14% gel.
  • Arrestin 1 is then transferred from the gel to membrane filters on polyvinylidene difluoride (PVDF) or nitrocellulose membrane in Towbin buffer with SDS (25 mM Tris, 192 mM glycine, 20% ethanol, 0.05% SDS), pH 8.3.
  • SDS 25 mM Tris, 192 mM glycine, 20% ethanol, 0.05% SDS
  • Non-specific membrane sites are blocked with a 10% solution of non-skimmed milk powder in washing buffer (PBS, 0.1% Tween-20), pH 7.4, for 1.5 hours, followed by washing with the same buffer, without milk (washing 3 times for 10 minutes; same sequence for all of the following membrane washing procedures).
  • washing buffer PBS, 0.1% Tween-20
  • pH 7.4 washing buffer
  • the membrane is incubated with serum obtained earlier from patients in a titer of 1: 20 for 1 h, followed by washing.
  • the membrane is then incubated with secondary antibodies, which are a conjugate of goat anti-human IgG antibodies with peroxidase diluted 1: 1000 in washing buffer, followed by washing the membrane from unbound antibodies.
  • Immunoreactive bands on the membrane are visualized using the Enhanced Chemiluminescence Detection System (BioRad, USA). Further, according to the results of the detection of immunoreactive bands, the conclusion is made about the presence or absence of antibodies to arrestin 1 in the patient's serum: a sample is classified as positive if the immunoreactive strip formed on the membrane with arrestin 1 transferred to it after incubation with a test serum sample corresponds to the molecular weight of arrestin 1. Accordingly, in the absence of a band corresponding to the molecular weight of arrestin 1, a serum sample is classified as negative, conclude that there is no anti ate to arrestin 1 in patient serum.
  • An enzyme-linked immunosorbent assay can be used to detect antibodies against arrestin 1 in serum samples.
  • recombinant arrestin 1 VV Gurevich, JL Benovic, Arrestin: mutagenesis, expression, purification, and functional characterization, Methods in enzymology, 315 (2000) 422-437
  • specific hyperimmune polyclonal rabbit serum can be used as trapping antibodies
  • specific monoclonal goat antibodies against arrestin 1 can serve as a positive control
  • a patient’s urolithiasis serum can be a negative control.
  • the following can be used as buffer solutions: 0.05 M carbonate-bicarbonate buffer (pH 9, 5 -9, 6) for dilution of antigen (1.59 g of NaC03, 2.93 g of NaHC03 per 1000 cm3 of water - store at 4-8 ° C no more than a week).
  • Tris-buffer solution (pH 7.4-7.6) (8.7 g 0.15 M NaCl, 1.2 g 0.01 M Tris HC1 per 1000 cm3 of water - store at 4-8 ° ⁇ no more than a week).
  • Wash buffer solution of TBR with Tween-20 (TBR-T) - 1000 cm3 of TBR, 1 cm3 of Tween-20 (0.1% solution).
  • Blocking buffer solution (pH 7, 4-7, 6) containing 10 cm3 TBR, 1 g of milk powder (10% solution). Buffer for dilutions of samples and conjugate containing 100 cm3 of TBR-T, 1 g of milk powder (1% solution).
  • ABTS solution (2,2-azino-di- (3-ethylbenzoamino-sulfonate).
  • the color-stopping solution is a 1% SDS solution (sodium dodecyl sulfate).
  • Example 1 To sensitize the tablet, specific rabbit blood serum (capture antibodies) was used in working dilution (1: 4000) on carbonate-bicarbonate buffer. 100 ⁇ l was added to each well. The plate was incubated at a temperature of 4-8 ° C for 18-20 hours. Without washing the plate, a blocking Tris buffer solution with 10% milk powder was introduced, incubated for 1 hour at a temperature of (37 ⁇ 0.5) ° C. After washing the wells of TBR-T, the antigen was introduced - recombinant arrestin 1 at a dilution of 1: 1000 at 100 ⁇ l per well.
  • Dilutions were prepared on TBR-T with the addition of 1% milk powder and incubated for 1 h at a temperature of (37 ⁇ 0.5) ° ⁇ . After washing the plate, specific monoclonal goat anti-arrestin 1 antibodies in dilutions from 1: 2 to 1: 256 were added to a series of wells with positive control. Serum of a patient with urolithiasis in dilutions from 1: 2 to 1: 256 was added to a series of wells with negative control. Then, in each remaining row of wells, test samples of patient blood serum were introduced — one sample per row of wells — in dilutions from 1: 2 to 1: 256.
  • Dilutions were prepared on TBR-T with the addition of 1% milk powder and 100 were added ⁇ l per well, incubated for 1 h at a temperature of (37 ⁇ 0.5) ° ⁇ . After washing the plate, an anti-species conjugate was applied - against goat IgG for positive control, against human IgG in the remaining wells - in a working dilution of 1: 500, 100 ⁇ l. The plate was incubated for 1 h at a temperature of (37 ⁇ 0.5) ° C. Well washing was carried out 3-5 times after each incubation. The introduction of the substrate. The ABTS solution was added 100 ⁇ l to all wells of the plate. The plate was incubated at room temperature for 10-15 minutes until the controls were completely stained.
  • the reaction was stopped by adding 1% SDS solution of 100 ⁇ l to each well.
  • the result was taken into account by recording the optical density (OD) at a wavelength of 405 nm.
  • OD optical density
  • the results of ELISA determined the presence or absence of antibodies to arrestin-1 and the titer of antibodies, if any, in the patient’s blood serum samples. For this, the obtained OD values in the wells of each row corresponding to dilutions from 1: 2 to 1: 256 serum of one patient were compared with the OD values obtained from the corresponding wells in the rows of negative and positive controls.
  • Antibody titer was determined as the last obtained OD value in the patient serum dilution series equal to or greater than twice the average OD value of the negative control in the well of the corresponding dilution. In the case of determining the OD value in each well of a series of dilutions of the serum of one patient is less than twice the average OD value of the corresponding well of the negative control, it was concluded that there are no antibodies to arrestin-1 in the blood serum of the corresponding patient. Thus, when obtaining OD values corresponding to the presence of antibodies in the sample, a conclusion was drawn about the presence of antibodies in the patient's blood serum, as well as about the titer of antibodies.
  • Example 2 The result of the test for the presence of autoantibodies against arrestin 1 using Western blotting is shown in FIG. 1, which is an illustration of a PVDF membrane with recombinant visual arrestin 1 transferred to it and treated with various samples.
  • the number 1 denotes a membrane with a positive control, in which the membrane with recombinant arrestin 1 was incubated with commercial monoclonal antibodies to arrestin 1 (Santa Cruz Biotechnology, USA).
  • the number 2 indicates a typical result with a negative control - a membrane with recombinant arrestin 1, incubated with serum from one of the patients with diagnosed urolithiasis, without signs of cancer.
  • Numbers 3-5 indicate typical positive experimental results corresponding to the presence of autoantibodies to arrestin 1 in serum — a membrane with recombinant arrestin 1, incubated with the sera of patients with diagnosed PAC.
  • Numeral 4 indicates a negative experimental result corresponding to the absence of autoantibodies to arrestin 1 in serum — a membrane with recombinant arrestin 1 incubated with serum from one of the patients with diagnosed PAC.
  • the number of tested serum samples from patients with a diagnosed PAC and the frequency of occurrence of the presence of anti-arrestin 1 autoantibodies in blood serum in patients with each type of PAC are shown in Table. 3.
  • Example 3 Patient K., 53 years old. He was examined at the Clinic of Urology at Sechenov University with a preliminary diagnosis of a kidney tumor. After surgery, histological and cytological analysis of postoperative material from the patient was performed: a tumor of the kidney, paranephritic adipose tissue and lymph nodes. The patient was diagnosed with clear cell PAC (T3, NO, MO). After surgery, the patient received a venous blood sampling. After folding, the blood was centrifuged, the serum was taken and frozen for further analysis, in particular, for the presence of auto-antibodies to arrestin 1 in the Western blot. In FIG.
  • Example 4 Patient Peninsula, 58 years old. He was examined at the Clinic of Urology at Sechenov University with a preliminary diagnosis of a kidney tumor. After surgery, histological and cytological analysis of postoperative material from the patient was performed: a tumor of the kidney, paranephritic adipose tissue and lymph nodes. The patient was diagnosed with papillary PAC (TK, NO, MO). After surgery, the patient received a venous blood sampling. After clotting, the blood was centrifuged, the serum was taken and frozen for further analysis, in particular, for the presence of auto-antibodies to arrestin 1 in Western blot. In FIG.
  • Example 5 Patient P-in, 68 years. He was examined at the Clinic of Urology at Sechenov University with a preliminary diagnosis of a kidney tumor. After surgery, histological and cytological analysis of postoperative material from the patient was performed: a tumor of the kidney, paranephritic adipose tissue and lymph nodes. The patient was diagnosed with a chromophobic PAC (Tlb, NO, MO). After surgery, the patient received a venous blood sampling. After folding, the blood was centrifuged, the serum was taken and frozen for further analysis, in particular, for the presence of auto-antibodies to arrestin 1 in the Western blot. In FIG.
  • the advantage of the claimed technical solution is precisely the use of antibodies to OAA, and not OAA itself, in particular visual arrestin 1.
  • the early diagnosis of PAC by antibodies becomes possible due to the fact that the humoral immune response to OAA develops shortly after the start of their aberrant expression, increases over time and long lasting.
  • antibodies are much more stable in the blood, unlike others used as biomarkers, proteins and nucleic acids, which undergo rapid degradation by proteases and nucleases present in the blood serum.
  • OAA Even after aberrant expression of OAA has ceased (for example, due to tumor eradication during surgery), antibodies to OAA continue to circulate for some additional time.
  • Another advantage of using antibodies to OAA as biomarkers in PAC is that even a low level of OAA expression at an early stage of tumor progression is sufficient for a strong humoral response to develop. While the same low level of OAA expression and early stage biopsy become a problem when using OAA as biomarkers per se. Thus, early detection of the presence of antibodies to OAA with visual arrestin 1 in the patient’s blood can be a warning signal for the doctor to prescribe more thorough examinations of the patient’s kidneys and achieve an early positive outcome.

Abstract

Изобретение относится к области медицины, а именно онкологии и клинической биохимии, и касается способа ранней диагностики почечно-клеточной карциномы. Сущность способа заключается в определении наличия антител к белку аррестину 1 в сыворотке крови пациентов из группы риска или после предварительного диагноза опухоль почки с помощью иммунологических методов детекции (например, иммуно-ферментного, вестерн-блот анализа). При выявлении наличия антител к аррестину 1 в сыворотке крови у пациента может быть предварительно диагностирована почечно-клеточная карцинома. Предлагаемый способ малоинвазивен, т.к. требуется только забор крови у пациента. Данный способ может быть использован для ранней диагностики почечно-клеточной карциномы, что значительно повысит вероятность положительного исхода для пациента при обнаружении данной патологии.

Description

СПОСОБ РАННЕЙ ДИАГНОСТИКИ ПОЧЕЧНО-КЛЕТОЧНОЙ
КАРЦИНОМЫ
Область техники
Изобретение относится к области медицины, а именно онкологии и клинической биохимии. Изобретение может быть использовано для ранней диагностики почечно-клеточной карциномы по наличию антител к зрительному аррестину 1 в сыворотке крови пациентов с применением иммунологических методов детекции.
Уровень техники
Почечно-клеточная карцинома (ПКК) - вторая наиболее встречаемая злокачественная патология среди уронефрологических онкологических заболеваний (R.L. Siegel, K.D. Miller, A. Jemal, Cancer Statistics, 2017, CA: a cancer journal for clinicians, 67 (2017) 7-30 DOI: 10.3322/саас.21387). Она характеризуется как агрессивный и инвазивный рак с высокой частотой метастазирования. Вдобавок, у ПКК нет специфических симптомов, поэтому она обычно диагностируется случайно на поздней стадии во время диспансеризации или других рутинных исследований по поводу другой патологии. У порядка 40% пациентов с диагностированной локальной ПКК в итоге развиваются метастазы (A.J. Wein, L.R. Kavoussi, M.F. Campbell, Campbell-Walsh urology / editor-in-chief, Alan J. Wein; [editors, Louis R. Kavoussi ... et ah], lOth ed., Elsevier Saunders, Philadelphia, PA, 2012). Смертность при ПКК довольно высокая: пятилетняя выживаемость при I стадии ПКК 80-95%, примерно 80% при II стадии ПКК, 60 % при III стадии ПКК и менее 10% при IV стадии (Е. Jonasch, J. Gao, W.K. Rathmell, Renal cell carcinoma, Bmj, 349 (2014) g4797 DOI: l0.H36/bmj.g4797). Более того, опухолевая инвазия на I-II стадиях ПКК ассоциируется с неблагоприятным прогнозом - пятилетняя выживаемость у таких пациентов менее 60%. Что касается метастатической ПКК, прогноз практически всегда фатальный - десятилетняя выживаемость менее 5% (A.J. Wein, L.R. Kavoussi, M.F. Campbell, Campbell-Walsh urology / editor-in-chief, Alan J. Wein; [editors, Louis R. Kavoussi ... et ah], lOth ed., Elsevier Saunders, Philadelphia, PA, 2012). В случае ПКК, местное хирургическое лечение является золотым стандартом. Установленная практика при данной патологии - циторедуктивная нефректомия с последующей системной медикаментозной терапией. Как и при других видах онкологических заболеваний, ранняя диагностика и своевременное начало лечения ПКК приводит к благоприятным исходам заболевания. Тем не менее, в настоящее время не существует методов специфической ранней диагностики ПКК. Обнаружение биомаркеров в биологических жидкостях или в самой опухоли может быть достаточно информативным. Несмотря на это, гетерогенность опухоли и сложность процедуры биопсии на ранней стадии заболевания являются ограничивающими факторами. С другой стороны, взятие крови для обнаружения биомаркеров является менее инвазивной процедурой. Однако серологические биомаркеры подвергаются деградации циркулирующими в крови протеазами и нуклеазами, что, таким образом, уменьшает диагностическую ценность данных, получаемых в таких тестах (Т.С. Ngo, C.G. Wood, J.A. Кагат, Biomarkers of renal cell carcinoma, Urologic oncology, 32 (2014) 243-251 DOI: l0.l0l6/j.urolonc.20l3.07.0l l).
В настоящее время наиболее часто диагностические мероприятия по поводу ПКК начинают проводить после случайного обнаружения объемного образования в почке рутинными методами УЗИ, КТ, МРТ. Проведенная впоследствии процедура биопсии позволяет поставить диагноз ПКК. Также для диагностики ПКК используются такие биомаркеры как vimentin, СК-7, СК-20, CD 20, MUC1, AMACR и др. (J.R. Srigley, В. Delahunt, J.N. Eble, L. Egevad, J.I. Epstein, D. Grignon, О. Hes, H. Modi, R. Montironi, S.K. Tickoo, M. Zhou, P. Argani, I.R.T. Panel, The International Society of Urological Pathology (IS UP) Vancouver Classification of Renal Neoplasia, The American journal of surgical pathology, 37 (2013) 1469-1489 DOI: l0.l097/PAS.0b0l3e3l8299f2dl). Тем не менее, все перечисленные биомаркеры являются диагностическими, т.е. используются для уточнения подтипа уже установленного диагноза почечно-клеточная карцинома. Более того, перечисленные биомаркеры не детектируются поодиночке, но исследуются в панели, т.н. профили экспрессии. Таким образом, в настоящее время не существует биомаркера, подходящего для ранней (скрининговой) диагностики ПКК.
Наиболее близким к предлагаемому в настоящей заявке способу является детекция белков Tu М2-РК, VEGF, TATI, СА9 (М.О. Golovastova, D.O. Korolev, L.V. Tsoy, V.A. Varshavsky, W.H. Xu, A.Z. Vinarov, E.Y. Zernii, P.P. Philippov, A.A. Zamyatnin, Jr., Biomarkers of Renal Tumors: the Current State and Clinical Perspectives, Current urology reports, 18 (2017) 3 DOI: 10. l007/sl 1934-017-0655-1). Тем не менее, по описанным выше причинам белковые биомаркеры обладают рядом недостатков в сравнении с антителами, что в итоге приводит к низкой чувствительности предлагаемых тестов.
Иным типом биомаркеров, которые могут быть применены при ранней диагностике ПКК, являются антитела к аберрантно экспрессируемым в опухоли белкам. Существует несколько преимуществ использования антител в качестве биомаркеров перед другими их типами. В отличие от опухоле-ассоциированных антигенов (ОАА) и нуклеиновых кислот, антитела намного более стабильны в крови (М.А. Murphy, J.J. O'Leary, D.J. Cahill, Assessment of the humoral immune response to cancer, Journal of proteomics, 75 (2012) 4573-4579 DOI: 10. l0l6/j.jprot.20l2.01.021). Более того, гуморальный иммунный ответ усиливается со временем и продолжителен. Причиной возникновения противоопухолевого гуморального иммунного ответа является аберрантная экспрессия ОАА. Однако в случае с ПКК редко наблюдается экспрессия хорошо изученных сегодня раково-зародышевых антигенов, таких как RAGE-l, MAGE-A4, SAGE, NY-ESO-l (M.J. Scanlan, А. О. Gure, A. A. Jungbluth, L.J. Old, Y.T. Chen, Cancer/testis antigens: an expanding family of targets for cancer immunotherapy, Immunological reviews, 188 (2002) 22-32; N. Soga, Y. Hori, K. Yamakado, H. Ikeda, N. Imai, S. Kageyama, K. Nakase, A. Yuta, N. Hayashi, H. Shiku, Y. Sugimura, Limited expression of cancer-testis antigens in renal cell carcinoma patients, Molecular and clinical oncology, 1 (2013) 326-330 DOI: 10.3892/тсо.2012.40). Тем не менее, существуют другие белки, экспрессирующиеся в норме в иммунопривилегированных тканях, таких как центральная нервная система и сетчатка глаза, которые могут так же аберрантно экспрессироваться в опухолевых клетках вследствие злокачественной трансформации. Такие белки классифицируются в две группы в зависимости от их происхождения: онконевральные и раково-сетчаточные антигены (РСА).
Несколько РСА были классифицированы как ОАА (A.V. Bazhin, D. Schadendorf, N. Willner, C. De Smet, A. Heinzelmann, N.K. Tikhomirova, V. Umansky, P.P. Philippov, S.B. Eichmuller, Photoreceptor proteins as cancer-retina antigens, International journal of cancer, 120 (2007) 1268-1276 DOI: l0.l002/ijc.22458). Многие из них экспрессируются в нейронах сетчатки глаза, где они участвуют в зрительной трансдукции. Возможность продукции антител к сетчаточным белкам у пациентов с паранеопластическим синдромом, таким как меланома-ассоциированная ретинопатия (MAP), показывает возможность аберрантной экспрессии сетчаточных белков в соответствующей опухоли (А.Н. Milam, J.C. Saari, S.G. Jacobson, W.P. Lubinski, L.G. Feun, K.R. Alexander, Autoantibodies against retinal bipolar cells in cutaneous melanoma- associated retinopathy, Investigative ophthalmology & visual science, 34 (1993) 91-100; M.J. Potter, C.E. Thirkill, O.M. Dam, A.S. Lee, A.H. Milam, Clinical and immunocytochemical findings in a case of melanoma-associated retinopathy, Ophthalmology, 106 (1999) 2121-2125 DOI: l0.l0l6/S0l6l-6420(99)90493-l). Было показано, что клетки меланомы могут экспрессировать такие РСА как родопсин, трансдуцин, cGMP-фосфодиэстеразу 6, родопсин киназу, рековерин и аррестин 1 (A.V. Bazhin, D. Schadendorf, N. Willner, C. De Smet, A. Heinzelmann, N.K.
Tikhomirova, V. Umansky, P.P. Philippov, S.B. Eichmuller, Photoreceptor proteins as cancer-retina antigens, International journal of cancer, 120 (2007) 1268-1276 DOI: l0.l002/ijc.22458). Таким образом, по аналогии с меланома-ассоциированной ретинопатией, экспрессия РСА в клетках опухоли при ПКК может запустить продукцию антител к РСА. Это может быть использовано для ранней диагностики ПКК. При этом в уровне техники отсутствуют сведения, раскрывающие возможность использования аутоантител против зрительного аррестина - аррестина 1, как одного из РСА, в качестве биомаркера для ранней диагностики ПКК. Известно, что в состав всех белков-аррестинов, включенных в так называемый аррестиновый клан, входит аррестиновый домен, который является уникальным предком всех аррестинов. Клан состоит из двух семейств: семейство аррестинов и так называемое семейство Ур826-родственных белков, которые так же называются а- аррестины, или arrestin-domain-containing proteins (ARRDCs; белки, содержащие аррестиновый домен) для обозначения соответствующих белков у млекопитающих (C.E. Alvarez, On the origins of arrestin and rhodopsin, BMC evolutionary biology, 8
(2008) 222 DOI: 10.1186/1471-2148-8-222). Семейство аррестинов состоит из 4 белков, которые в свою очередь подразделяются еще на 2 группы: зрительные аррестины, которые включают в себя аррестин 1 (S-antigen, SAG, S-arrestin, аррестин палочек, зрительный аррестин) и аррестин 4 (X-arrestin, ARR3, аррестин колбочек), и b-аррестины, которые включают в себя аррестин 2 (b-аррестин или b-аррестин-!, ARRB1) и аррестин 3 ф-аррестин-2, ARRB2) (E.V. Gurevich, V.V. Gurevich, Arrestins: ubiquitous regulators of cellular signaling pathways, Genome biology, 7 (2006) 236 DOI: l0.H86/gb-2006-7-9-236). В свою очередь, семейство Ур826-родственных белков или a-аррестинов у млекопитающих состоит их 6 белков: ARRDC1, ARRDC2, ARRDC3/TLIMP, ARRDC4, ARRDC5 и TXNIP/TBP-2 (L. Риса, С. Вши, Alpha- arrestins - new players in Notch and GPCR signaling pathways in mammals, Journal of cell science, 127 (2014) 1359-1367 DOI: 10. l242/jcs.142539). Полная классификация арестинового клана для млекопитающих приведена в табл. 1.
Таблица 1. Семейства аррестинов млекопитающих.
Figure imgf000007_0001
Несмотря на то, что открытый первым аррестин 1 был обнаружен в клетках сетчатки глаза, впоследствии выяснилось, что белки аррестинового семейства встречаются повсеместно. Любая животная клетка экспрессирует как минимум один тип аррестина (E.V. Gurevich, V.V. Gurevich, Arrestins: ubiquitous regulators of cellular signaling pathways, Genome biology, 7 (2006) 236 DOI: l0.H86/gb-2006-7-9-236). Однако существует два исключения - это зрительные аррестины. Хотя те или иные b- и a-аррестины постоянно присутствуют в протеоме всех живых клеток, аррестин 1 и аррестин 4 имеют строго специфическую локализацию в организме человека - клетки сетчатки глаза и шишковидной железы. Таким образом, из-за наличия гематоэнцефалического и гематоретинального барьера, аррестины зрительной группы являются «чужеродными» антигенами для нашего организма, и, соответственно, иммуногенны. Действительно, была показана иммуногенная активность аррестина 1 в экспериментальных моделях аутоиммунных заболеваний сетчатки глаза. Более того, как указано ранее, экспрессия аррестина 1 была обнаружена в клетках меланомы у пациентов с МАР, что позволяет отнести аррестин 1 к PC А.
Авторами настоящего изобретения было выявлено, что помимо повсеместно встречаемых аррестинов, в опухолях почки с высокой частотой встречается экспрессия зрительного аррестина 1. Учитывая его иммуногенность, были также проведены исследования по проверке способности обнаруженного вне иммуно- привилигерованной ткани аррестина 1 индуцировать продукцию антител. В результате проведенных исследований показано, что экспрессирующийся при ПКК аррестин 1 способен активировать выработку анти-аррестин 1 антител с частотой примерно 75%. Следует отметить, что аррестины b- и а- подгрупп, несмотря на повсеместный характер экспрессии в клетках организма, не могут быть использованы в качестве диагностических биомаркеров вследствие их невозможности вызвать иммунный ответ, в том числе выработку антител. Таким образом, предложено использовать феномен развития гуморальной реакции в ответ на аберрантную экспрессию аррестина 1 при ранней диагностике ПКК.
Раскрытие изобретения
Технической проблемой, решаемой настоящим изобретением, является разработка малоинвазивного способа ранней диагностики ПКК.
Техническим результатом заявляемого изобретения является возможность определения наличия антител к аррестину 1 в сыворотке крови пациентов с предполагаемой патологией иммунологическими методами детекции.
Поставленная задача решается способом определения наличия в сыворотке крови пациентов антител к аррестину 1, способному аберрантно экспрессироваться в клетках опухоли почки пациентов с ПКК, с помощью иммунологических (иммунометрических) методов. К таким методам могут быть отнесены иммуноблотинг, иммуноферментный анализ, иммунофлюоресцентный анализ и т.п.
Краткое описание чертежей
На фиг. 1 приведен иммуноблот образцов сывороток от пациентов с ПКК. Контрольные образцы: рекомбинантный зрительный аррестин 1 (1 мкг на дорожку) окрашенный с помощью козьих моноклональных антител к зрительному аррестину 1 (дорожка 1), или с помощью сыворотки пациента (разведение 1 :20) с уролитиазом (дорожка 2); типичные блоты рекомбинантного зрительного аррестина 1 (1 мкг на дорожку), окрашенные с помощью сывороток пациентов (титр 1:20) с ПКК с наличием дорожки 3-5) антител к зрительному аррестину 1. Два независимых эксперимента были выполнены для каждого образца сыворотки.
Осуществление изобретения
В рамках проведенных в Институте молекулярной медицины ФГАОУ ВО
Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский Университет) исследований было показано, что РСА аррестин 1 довольно часто может аберрантно экспрессироваться в клетках опухоли почки пациентов с ПКК. Для определения наличия экспрессии аррестина 1 проводилась иммуногистохимия образцов опухоли почки пациентов с диагностированной ПКК. В результате, в 17 образцах из 29, что соответствует 58.6%, была обнаружена аберрантная экспрессия аррестина 1 при ПКК. В табл. 2 представлены данные проведенного исследования.
Таблица 2. Экспрессия аррестина 1 при ПКК.
Figure imgf000009_0001
Настоящее изобретение поясняется конкретным примером выполнения, который наглядно демонстрируют возможность достижения требуемого технического результата, но при этом не ограничивает заявленный объем притязаний.
Наличие антител к аррестину 1 в сыворотке крови определялось с помощью метода Вестерн-блоттинг. При положительном результате теста у пациента из группы риска по ПКК или с предварительным диагнозом опухоль почки ставился диагноз ПКК. По итогам проведенных исследований была показана высокая частота наличия антител к аррестину 1 в сыворотке крови пациентов с ПКК. Среди протестированных 33 пациентов с ППК, у 25 были обнаружены антитела к аррестину 1, что соответствует 75.7%. В табл. 3 представлены данные проведенного исследования.
Таблица 3. Наличие антител к аррестину 1 при ПКК.
Figure imgf000009_0002
Заявляемый способ ранней диагностики ПКК может быть осуществлен следующим образом. У пациента производят забор венозной крови натощак с утра. Далее, после сворачивания цельную кровь центрифугируют, отбирают сыворотку, которую в дальнейшем используют для анализа. Возможно замораживание образцов сыворотки при -80°С для хранения и дальнейшего использования. Для детекции анти-аррестиновых антител в полученных образцах сыворотки производят SDS- PAGE электрофорез аррестина 1 (2 мкг на дорожку) в 14% геле. Далее аррестин 1 переносят из геля на мембранные фильтры на поливинилидендифториде (PVDF) или нитроцеллюлозную мембрану в Towbin буфере с SDS (25 мМ Tris, 192 мМ глицин, 20% этанол, 0.05% SDS), pH 8.3. Неспецифические сайты мембраны блокируют с помощью 10% раствора нежирного сухого молока в отмывочном буфере (PBS, 0.1% Tween-20), pH 7.4, в течение 1.5 ч с последующей отмывкой тем же буфером, без молока (отмывка 3 раза по 10 мин; та же последовательность для всех следующих процедур отмывки мембраны). Далее мембрану инкубируют с полученной ранее от пациентов сывороткой в титре 1 :20 в течение 1 ч с последующей отмывкой. Далее мембрану инкубируют со вторичными антителами, которые представляют собой конъюгат козьих anti-human IgG антител с пероксидазой в разведении 1 : 1000 в отмывочном буфере, с последующей отмывкой мембраны от несвязавшихся антител. Иммунореактивные полосы на мембране визуализируют с помощью Enhanced Chemiluminescence Detection System (BioRad, USA). Далее, по результатам детекции иммунореактивных полос делают вывод о наличии или отсутствии антител к аррестину 1 в сыворотке пациента: образец классифицируют как положительный, если иммунореактивная полоса, формирующаяся на мембране с перенесенным на нее аррестином 1 после инкубации с тестируемым образцом сыворотки, соответствует молекулярной массе аррестина 1. Соответственно, в случае отсутствия полосы соответствующей молекулярной массе аррестина 1 образец сыворотки классифицируют как отрицательный, делают вывод об отсутствии антител к аррестину 1 в сыворотке пациента.
Для детекции антител против аррестина 1 в образцах сыворотки можно использовать иммуно-ферментный анализ. В предполагаемой тест-системе в качестве антигена используют рекомбинантный аррестин 1 (V.V. Gurevich, J.L. Benovic, Arrestin: mutagenesis, expression, purification, and functional characterization, Methods in enzymology, 315 (2000) 422-437), при этом другие компоненты могут варьироваться. Например, в качестве улавливающих антител может быть использована специфическая гипериммунная поликлональная сыворотка кролика, положительным контролем могут служить специфические моноклональные козьи антитела против аррестина 1, отрицательным контролем - сыворотка пациента с уролитиазом. В качестве антивидовых конъюгатов могут быть использованы иммуноглобулины против IgG козы, конъюгированные с пероксидазой хрена (конъюгат 1) и иммуноглобулины против IgG человека, конъюгированные с пероксидазой хрена (конъюгат 2). В качестве буферных растворов могут быть использованы: 0,05М карбонат-бикарбонатный буфер (pH 9, 5 -9, 6) для разведения антигена (1,59 г NaC03, 2,93 г NaHC03 на 1000 см3 воды - хранить при 4-8°С не более недели). Трис-буферный раствор (ТБР) (pH 7,4-7, 6) (8,7 г 0,15 М NaCl, 1,2 г 0,01 М трис НС1 на 1000 см3 воды - хранить при 4-8°С не более недели). Промывочный буферный раствор ТБР с тв ином-20 (ТБР-Т) - 1000 см3 ТБР, 1 см3 Твин-20 (0,1%-ный раствор). Блокирующий буферный раствор (pH 7, 4-7, 6), содержащий 10 см3 ТБР, 1 г сухого молока (10%-ный раствор). Буфер для разведений проб и конъюгата, содержащий 100 см3 ТБР-Т, 1 г сухого молока (1%- ный раствор). Раствор АБТС (2,2-азино-ди-(3-этилбензоаминосульфонат). Раствор, останавливающий окраску - 1%-ный раствор ДСН (додецилсульфат натрия).
Пример 1 Для сенсибилизации планшета использовали специфическую сыворотку крови кролика (улавливающие антитела) в рабочем разведении (1 :4000) на карбонатно-бикарбонатном буфере. В каждую лунку вносили по 100 мкл. Планшет инкубировали при температуре 4-8°С в течение 18-20 ч. Не отмывая планшета вносили блокирующий трис-буферный раствор с 10% сухим молоком, инкубировали 1 ч при температуре (37±0,5)°С. После отмывки лунок ТБР-Т, вносили антиген - рекомбинантный аррестин 1 в разведении 1 : 1000 по 100 мкл на лунку. Разведения готовили на ТБР-Т с добавлением 1% сухого молока и инкубировали 1 ч при температуре (37±0,5)°С. После промывки планшета в ряд лунок с положительным контролем вносили специфические моноклональные козьи антитела против аррестина 1 в разведениях от 1:2 до 1:256. В ряд лунок с отрицательным контролем вносили сыворотку пациента с уролитиазом в разведениях от 1 :2 до 1 :256. Далее в каждый оставшийся ряд лунок вносили испытуемые образцы сывороток крови пациентов - один образец на один ряд лунок - в разведениях от 1 :2 до 1 :256. Разведения готовили на ТБР-Т с добавлением 1% сухого молока и вносили по 100 мкл на лунку, инкубировали 1 ч при температуре (37±0,5)°С. После промывания планшета наносили антивидовой конъюгат - против IgG козы для положительного контроля, против IgG человека в остальные лунки - в рабочем разведении 1 :500 по 100 мкл. Планшет инкубировали 1 ч при температуре (37±0,5)°С. Промывку лунок проводили 3-5 раз после каждого инкубирования. Внесение субстрата. Раствор АБТС вносили по 100 мкл во все лунки планшета. Планшет инкубировали при комнатной температуре в течение 10-15 мин до полного окрашивания контролей. Остановку реакции проводили путем внесения 1%-ного раствора ДСН по 100 мкл в каждую лунку. Результат учитывали, регистрируя оптическую плотность (ОП) при длине волны 405 нм. По полученным результатам ИФА определяли наличие или отсутствие антител к аррестину-1 и титр антител при их наличии в образцах сыворотки крови пациента. Для этого, полученные значения ОП в лунках каждого ряда, соответствующего разведениям от 1 :2 до 1 :256 сыворотки одного пациента, сравнивались со значениями ОП, полученными из соответствующих лунок в рядах отрицательного и положительного контроля. Титр антител определяли как последнее полученное значение ОП в ряду разведения сыворотки пациента, равное или большее удвоенному среднему значению ОП отрицательного контроля в лунке соответствующего разведения. В случае определения значения ОП в каждой лунке ряда разведений сыворотки одного пациента меньше удвоенного среднего значения ОП соответствующей лунки отрицательного контроля, делался вывод об отсутствии антител к аррестину-1 в сыворотке крови соответствующего пациента. Таким образом, при получении значений ОП, соответствующих наличию антител в пробе, делался вывод о наличии антител в сыворотке крови пациента, а также о титре антител.
Пример 2. Результат теста на наличие аутоантител против аррестина 1 с помощью методики Вестерн-блоттинг представлен на фиг. 1, представляющую собой иллюстрацию PVDF мембраны с перенесенным на нее рекомбинантным зрительным аррестином 1 и обработанную различными образцами. Цифрой 1 обозначена мембрана с положительным контролем, в качестве которого мембрану с рекомбинантным аррестином 1 инкубировали с коммерческими моноклональными антителами к аррестину 1 (Santa Cruz Biotechnology, USA). Цифрой 2 обозначен типичный результат с отрицательным контролем - мембрана с рекомбинантным аррестином 1, проинкубированная с сывороткой от одного из пациентов с диагностированным уролитиазом, без признаков онкологической патологии. Цифрами 3-5 обозначены типичные положительные опытные результаты, соответствующие наличию аутоантител к аррестину 1 в сыворотке - мембрана с рекомбинантным аррестином 1, проинкубированная с сыворотками пациентов с диагностированной ПКК. Цифрой 4 обозначен отрицательный опытный результат, соответствующий отсутствию аутоантител к аррестину 1 в сыворотке - мембрана с рекомбинантным аррестином 1, проинкубированная с сывороткой от одного из пациентов с диагностированной ПКК. Количество протестированных образцов сывороток от пациентов с установленным диагнозом ПКК и частота встречаемости наличия аутоантител против аррестина 1 в сыворотке крови у пациентов с каждым типом ПКК отражены в табл. 3.
Пример 3. Пациент К-в, 53 лет. Проходил обследование в клинике Урологии Сеченовского Университета с предварительным диагнозом опухоль почки. После оперативного вмешательства был проведен гистологический и цитологический анализ послеоперационного материала от пациента: опухоли почки, паранефритической жировой ткани и лимфоузлов. Пациенту был поставлен диагноз светлоклеточной ПКК (ТЗЬ, NO, МО). После операции у пациента был произведен забор венозной крови. После сворачивания кровь центрифугировалась, сыворотка отбиралась и замораживалась для дальнейшего анализа, в частности, на наличие аутоантител к аррестину 1 в Вестерн-блоте. На фиг. 1 (дорожка 3) представлен положительный результат иммунодетекции антител против аррестина 1 в сыворотке крови, собранной у пациента К-ва, в результате чего был сделан вывод о наличии антител против аррестина 1 в крови пациента и наличию ПКК, что согласуется с поставленным ранее диагнозом.
Пример 4. Пациент П-в, 58 лет. Проходил обследование в клинике Урологии Сеченовского Университета с предварительным диагнозом опухоль почки. После оперативного вмешательства был проведен гистологический и цитологический анализ послеоперационного материала от пациента: опухоли почки, паранефритической жировой ткани и лимфоузлов. Пациенту был поставлен диагноз папиллярной ПКК (ТЗа, NO, МО). После операции у пациента был произведен забор венозной крови. После сворачивания кровь центрифугировалась, сыворотка отбиралась и замораживалась для дальнейшего анализа, в частности, на наличие аутоантител к аррестину 1 в Вестерн-блоте. На фиг. 1 (дорожка 4) представлен положительный результат иммунодетекции антител против аррестина 1 в сыворотке крови, собранной у пациента И-ва, в результате чего был сделан вывод о наличии антител против аррестина 1 в крови пациента и наличию ПКК, что согласуется с поставленным ранее диагнозом.
Пример 5. Пациент П-в, 68 лет. Проходил обследование в клинике Урологии Сеченовского Университета с предварительным диагнозом опухоль почки. После оперативного вмешательства был проведен гистологический и цитологический анализ послеоперационного материала от пациента: опухоли почки, паранефритической жировой ткани и лимфоузлов. Пациенту был поставлен диагноз хромофобной ПКК (Tlb, NO, МО). После операции у пациента был произведен забор венозной крови. После сворачивания кровь центрифугировалась, сыворотка отбиралась и замораживалась для дальнейшего анализа, в частности, на наличие аутоантител к аррестину 1 в Вестерн-блоте. На фиг. 1 (дорожка 5) представлен положительный результат иммунодетекции антител против аррестина 1 в сыворотке крови, собранной у пациента П-ва, в результате чего был сделан вывод о наличии антител против аррестина 1 в крови пациента и наличию ПКК, что согласуется с поставленным ранее диагнозом.
Преимуществом заявленного технического решения является именно использование антител к ОАА, а не сам ОАА, в частности зрительный аррестин 1. Ранняя диагностика ПКК с помощью антител становится возможной благодаря тому, что гуморальный иммунный ответ на ОАА развивается вскоре после начала их аберрантной экспрессии, усиливается со временем и продолжителен. Более того, антитела намного более стабильны в крови, в отличие от других, используемых в качестве биомаркеров, белков и нуклеиновых кислот, которые подвергаются быстрой деградации присутствующими в сыворотке крови протеазами и нуклеазами. Даже после прекращения аберрантной экспрессии ОАА (например, вследствие эрадикации опухоли при оперативном вмешательстве) антитела к ОАА продолжают циркулировать некоторое дополнительное время. Другим преимуществом использования антител к ОАА в качестве биомаркеров при ПКК является то, что даже низкий уровень экспрессии ОАА на ранней стадии опухолевой прогрессии достаточен для того, чтобы развился сильный гуморальный ответ. Тогда как этот же низкий уровень экспрессии ОАА и биопсия на ранней стадии заболевания становятся проблемой при использовании ОАА в качестве биомаркеров как таковых. Таким образом, раннее обнаружение наличия антител к ОАА зрительному аррестину 1 в крови пациента может являться предупреждающим сигналом для врача, чтобы назначить более тщательные обследования почек пациента и добиться скорейшего положительного исхода.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ диагностики почечно-клеточной карциномы путем определения наличия в сыворотке крови антител к зрительному аррестину - аррестину 1.
2. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что антитела определяют иммунологическими методами детекции, в качестве которых используют иммуно-ферментный и вестерн-блот анализ.
3. Применение антител к аррестину 1 в качестве биомаркера для диагностики почечно-клеточной карциномы.
PCT/RU2019/050167 2018-10-03 2019-10-03 Способ ранней диагностики почечно-клеточной карциномы WO2020071968A1 (ru)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EA202100134A EA202100134A1 (ru) 2018-10-03 2019-10-03 Способ ранней диагностики почечно-клеточной карциномы

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2018134788A RU2707884C1 (ru) 2018-10-03 2018-10-03 Способ ранней диагностики почечно-клеточной карциномы по наличию антител к зрительному аррестину
RU2018134788 2018-10-03

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2020071968A1 true WO2020071968A1 (ru) 2020-04-09

Family

ID=68836326

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2019/050167 WO2020071968A1 (ru) 2018-10-03 2019-10-03 Способ ранней диагностики почечно-клеточной карциномы

Country Status (3)

Country Link
EA (1) EA202100134A1 (ru)
RU (1) RU2707884C1 (ru)
WO (1) WO2020071968A1 (ru)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2217761C2 (ru) * 1998-07-01 2003-11-27 Фон Кнебель Дёберитц Магнус Способ ранней диагностики карцином
US20060029985A1 (en) * 2004-08-03 2006-02-09 Hypatia Ltd. Diagnostic compositions containing an antibody to a beta-arrestin, methods utilizing the same and kits containing the same
RU2612021C1 (ru) * 2016-01-12 2017-03-01 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Саратовский национальный исследовательский государственный университет имени Н.Г. Чернышевского" Способ прогнозирования риска развития аденокарциномы желудка при хронических процессах язвообразования органа

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2217761C2 (ru) * 1998-07-01 2003-11-27 Фон Кнебель Дёберитц Магнус Способ ранней диагностики карцином
US20060029985A1 (en) * 2004-08-03 2006-02-09 Hypatia Ltd. Diagnostic compositions containing an antibody to a beta-arrestin, methods utilizing the same and kits containing the same
RU2612021C1 (ru) * 2016-01-12 2017-03-01 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Саратовский национальный исследовательский государственный университет имени Н.Г. Чернышевского" Способ прогнозирования риска развития аденокарциномы желудка при хронических процессах язвообразования органа

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CAO Y.-J. ET AL.: "Overexpression of beta-arrestin2 induces G1 -phase cell cycle arrest and suppresses tumorigenicity in renal cell carcinoma", EUR REV MED PHARMACOL SCI., vol. 21, no. 8, April 2017 (2017-04-01), pages 1729 - 1737, XP055700325 *
GOLOVASTOVA MARINA O. ET AL.: "Biomarkers of Renal Tumors: the Current State and Clinical Perspectives", CURR UROL REP., vol. 18, no. 1, 21 January 2017 (2017-01-21), pages 1 - 11, XP036142517 *

Also Published As

Publication number Publication date
RU2707884C1 (ru) 2019-12-02
EA202100134A1 (ru) 2021-10-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Zayakin et al. Tumor‐associated autoantibody signature for the early detection of gastric cancer
CN101632020B (zh) 改进的免疫测定方法
CN102749447B (zh) 改进的免疫测定方法
Chen et al. Blood autoantibodies against tumor-associated antigens as biomarkers in early detection of colorectal cancer
Chapman et al. Autoantibodies in breast cancer: their use as an aid to early diagnosis
ES2748397T3 (es) Uso de HE4 y otros marcadores bioquímicos para la evaluación de cánceres de ovario
US20060275845A1 (en) Annexin proteins and autoantibodies as serum markers for cancer
Yi et al. Autoantibody to tumor antigen, alpha 2-HS glycoprotein: a novel biomarker of breast cancer screening and diagnosis
Minamida et al. 14-3-3 protein beta/alpha as a urinary biomarker for renal cell carcinoma: proteomic analysis of cyst fluid
JP2017133831A (ja) 大腸がんの転移検出方法
JP2005525103A (ja) 結腸癌および結腸癌の肝臓転移に関わる核マトリックスタンパク質の変化とその使用
CN109975549B (zh) 肿瘤来源IgG在胰腺癌诊断或预后中的用途
CN112345755A (zh) 乳腺癌的生物标志物及其应用
Nagashio et al. Detection of tumor-specific autoantibodies in sera of patients with lung cancer
JP5670422B2 (ja) 胃癌検出用マーカー及び胃癌検出方法
US10656154B2 (en) Methods for detecting an amount of complement factor B protein and carbohydrate antigen 19-9 protein, and methods for diagnosing and treating pancreatic cancer using the same
RU2662555C2 (ru) Улучшенные способы иммуноанализа
RU2707884C1 (ru) Способ ранней диагностики почечно-клеточной карциномы по наличию антител к зрительному аррестину
JPWO2011108626A1 (ja) 胃癌検出用マーカー及び胃癌検出方法
EA043142B1 (ru) Способ ранней диагностики почечно-клеточной карциномы
JP5358808B2 (ja) 腫瘍マーカー、腫瘍診断キット、腫瘍マーカーの測定方法および腫瘍診断方法
CN103257227A (zh) 改进的免疫测定方法
RU2741245C1 (ru) Способ ранней диагностики почечно-клеточной карциномы по наличию белка зрительного аррестина в сыворотке крови
KR101636821B1 (ko) Aimp2-dx2 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 폐암 진단용 조성물
JP6168625B2 (ja) 上皮性卵巣癌鑑別マーカー

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 19868379

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 19868379

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1