JP5210154B2

JP5210154B2 - Ｃ−グリコシド誘導体とｌ−プロリンとの共結晶

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Publication number: JP5210154B2
Application number: JP2008508716A
Authority: JP
Inventors: 雅一今村; 慶太中西; 良太白木; 健一恩田; 大輔流石; 真道湯田
Original assignee: Kotobuki Seiyaku Co Ltd; Astellas Pharma Inc
Current assignee: Kotobuki Seiyaku Co Ltd; Astellas Pharma Inc
Priority date: 2006-04-05
Filing date: 2007-04-04
Publication date: 2013-06-12
Anticipated expiration: 2027-04-04
Also published as: NO20084659L; CA2649022A1; AU2007232763B2; WO2007114475A1; KR20120025001A; CN101443328B; CA2649022C; TW200811152A; AU2007232763A1; KR20090015912A; TWI370818B; JPWO2007114475A1; BRPI0710581A2; CN101443328A; IL194512A0; EP2009010A4; KR101243039B1; RU2008143362A; ZA200809201B; EP2009010A1

Description

本発明は、（１Ｓ）−１，５−アンヒドロ−１−［３−（１−ベンゾチエン−２−イルメチル）−４−フルオロフェニル］−Ｄ−グルシトール（以下、「Ｃ−グリコシド誘導体Ａ」又は単に「公知化合物Ａ」ということがある）と、Ｌ−プロリンとの共結晶に関する。更に詳しくは、医薬の製造に用いられる原薬の結晶として、一定の品質を有し、保存安定性に優れたＣ−グリコシド誘導体ＡとＬ−プロリンとの共結晶、及びこれを有効成分として含有する、特に糖尿病治療剤として有用な医薬組成物に関する。

本発明者等は、下記化学構造式で示される、（１Ｓ）−１，５−アンヒドロ−１−［３−（１−ベンゾチエン−２−イルメチル）−４−フルオロフェニル］−Ｄ−グルシトール（公知化合物Ａ）が、Ｎａ^＋−グルコース共輸送体阻害剤として、例えば、インスリン依存性糖尿病（１型糖尿病）、インスリン非依存性糖尿病（２型糖尿病）等の糖尿病の他、インスリン抵抗性疾患及び肥満の治療、並びにこれらの予防に有用な化合物であることを報告している（特許文献１：実施例１３８参照）。

国際公開第２００４／０８０９９０号パンフレット

特許文献１において開示された公知化合物Ａの結晶は包接水和物を形成し、温湿度環境により無水物から非化学量論的な水和物へと可逆的に変化する性質を示すものであることが分かった。このため、公知化合物Ａは、医薬品に供する原薬として一定の品質を保つことが困難であることが判明した。

そこで本発明者等は、公知化合物Ａについて、包接水和物を形成しない結晶を得るための結晶化条件を種々検討した。具体的には、メタノール、エタノール、２−プロパノール、ジメチルホルムアミド、テトラヒドロフラン、アセトン、メチルエチルケトン、酢酸エチル、酢酸、ピリジン、１，４−ジオキサン、アセトニトリル、アニソール、水、トルエン、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ジｎ−ブチルエーテル、ｎ−ヘキサン、シクロヘキサン、ｎ−ヘプタン、クロロホルム、及び四塩化炭素の単一溶媒、並びにこれらの二種以上を組み合せた混合溶媒を使用し、公知化合物Ａを加熱溶解後、徐々に冷却する結晶化条件を検討した。

上記検討の結果、ほとんどの結晶化条件で包接水和物を形成する結晶が得られた。また、一部の結晶化条件では、結晶化溶媒の一部又は全部が溶媒和した結晶が確認されるのみであった。安全性に問題のある溶媒が多量に混入した溶媒和物結晶は、医薬品に供する原薬としては適さない。従って、公知化合物Ａのフリー体を医薬の製造における原薬として用いることは、実際上不可能であるという問題があった。

また、公知化合物Ａは、通常のｐＨでは非イオン性化合物として存在する。従って、製薬学的に許容される塩を形成することによっては、上記問題を回避することができなかった。

本発明は、上述の問題を解決するためになされたものであり、一定の品質を有するとともに保存安定性に優れた、医薬品に供する原薬の結晶として好適な公知化合物Ａの共結晶を提供することを目的とする。

上述の目的を達成するため、本発明者等は、公知化合物Ａとアミノ酸との共結晶の形成について鋭意研究した。その結果、公知化合物Ａと、グリシン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−リジン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−システイン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−アルギニン、Ｄ−セリン、Ｄ−トレオニン、Ｄ−メチオニン、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−アラニン、Ｄ−バリン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−イソロイシン、又はＤ−プロリンとでは、共結晶を得ることはできなかった。

これに対して、公知化合物ＡとＬ−プロリンが、１：１のモル比で一定の品質を有する単一の共結晶を再現性よく形成することが判明した。また、この共結晶が、保存安定性に優れているとともに、医薬品の製造に用いられる原薬の結晶として安定的に供給可能であることを見出し、本発明を完成させた。

即ち、上記目的を達成するため、本発明によれば、以下のＣ−グリコシド誘導体ＡとＬ−プロリンの共結晶（以下、「本発明共結晶」ということがある）、及びこれを有効成分として含有する、特に糖尿病治療剤として有用な医薬組成物が提供される。

［１］（１Ｓ）−１，５−アンヒドロ−１−［３−（１−ベンゾチエン−２−イルメチル）−４−フルオロフェニル］−Ｄ−グルシトールと、Ｌ−プロリンとの共結晶。

［２］（１Ｓ）−１，５−アンヒドロ−１−［３−（１−ベンゾチエン−２−イルメチル）−４−フルオロフェニル］−Ｄ−グルシトールと、Ｌ−プロリンとのモル比が、１：１である前記［１］に記載の共結晶。

［３］示差走査熱量計分析（ＤＳＣ分析）で２０１〜２１３℃に吸熱ピークを有する、前記［１］に記載の共結晶。

［４］粉末Ｘ線回折で２θ（°）４．１４、８．９８、１２．４、１６．５、１７．５、１８．７、２０．５、及び２１．５にピークを有する、前記［１］に記載の共結晶。

［５］示差走査熱量計分析（ＤＳＣ分析）で２０１〜２１３℃に吸熱ピークを有するとともに、粉末Ｘ線回折で２θ（°）４．１４、８．９８、１２．４、１６．５、１７．５、１８．７、２０．５、及び２１．５にピークを有する、前記［１］に記載の共結晶。

［６］前記［１］〜［５］のいずれかに記載の共結晶を有効成分として含有する医薬組成物。

［７］前記［１］〜［５］のいずれかに記載の共結晶を用いて製造した医薬組成物。

［８］製薬学的に許容される担体を更に含有する前記［６］又は［７］に記載の医薬組成物。

［９］糖尿病治療剤である前記［６］〜［８］のいずれか一項に記載の医薬組成物。

［１０］糖尿病治療剤の製造のための前記［１］〜［５］のいずれかに記載の共結晶の使用。

［１１］前記［１］〜［５］のいずれかに記載の共結晶の治療有効量を患者に投与することを含む糖尿病の治療方法。

本発明によって、医薬品に供する原薬の結晶として、一定の品質を有し、保存安定性に優れた公知化合物ＡとＬ−プロリンとの共結晶、及びこれを有効成分として含有する、特に糖尿病治療剤として有用な医薬組成物が提供される。

（１Ｓ）−１，５−アンヒドロ−１−［３−（１−ベンゾチエン−２−イルメチル）−４−フルオロフェニル］−Ｄ−グルシトール（公知化合物Ａ）の示差走査熱量計分析図（ＤＳＣ分析図）である。（１Ｓ）−１，５−アンヒドロ−１−［３−（１−ベンゾチエン−２−イルメチル）−４−フルオロフェニル］−Ｄ−グルシトール（公知化合物Ａ）の粉末Ｘ線回析図である。Ｌ−プロリンの示差走査熱量計分析図（ＤＳＣ分析図）である。Ｌ−プロリンの粉末Ｘ線回析図である。（１Ｓ）−１，５−アンヒドロ−１−［３−（１−ベンゾチエン−２−イルメチル）−４−フルオロフェニル］−Ｄ−グルシトールとＬ−プロリンの共結晶（本発明共結晶）の示差走査熱量計分析図（ＤＳＣ分析図）である。（１Ｓ）−１，５−アンヒドロ−１−［３−（１−ベンゾチエン−２−イルメチル）−４−フルオロフェニル］−Ｄ−グルシトールとＬ−プロリンの共結晶（本発明共結晶）の粉末Ｘ線回析図である。湿度可変条件下で測定した、（１Ｓ）−１，５−アンヒドロ−１−［３−（１−ベンゾチエン−２−イルメチル）−４−フルオロフェニル］−Ｄ−グルシトール（公知化合物Ａ）の粉末Ｘ線回析図である。各種湿度条件下で７日間保存した、（１Ｓ）−１，５−アンヒドロ−１−［３−（１−ベンゾチエン−２−イルメチル）−４−フルオロフェニル］−Ｄ−グルシトールとＬ−プロリンの共結晶（本発明共結晶）を、保存する前のものと比較した粉末Ｘ線回析図である。（１Ｓ）−１，５−アンヒドロ−１−［３−（１−ベンゾチエン−２−イルメチル）−４−フルオロフェニル］−Ｄ−グルシトール（公知化合物Ａ）の吸脱着等温線である。（１Ｓ）−１，５−アンヒドロ−１−［３−（１−ベンゾチエン−２−イルメチル）−４−フルオロフェニル］−Ｄ−グルシトールとＬ−プロリンの共結晶（本発明共結晶）の吸脱着等温線である。

以下、本発明を実施するための最良の形態を具体的に説明する。本発明のＣ−グリコシド誘導体Ａ（（１Ｓ）−１，５−アンヒドロ−１−［３−（１−ベンゾチエン−２−イルメチル）−４−フルオロフェニル］−Ｄ−グルシトール）とＬ−プロリンとの共結晶（本発明共結晶）は、以下に示す化学構造を有している。

本発明共結晶においては、上述のように、包接水和物を形成する結晶とは異なり、一定の品質を有する単一の共結晶が再現性よく得られ、医薬の製造に用いられる原薬の結晶として安定的に供給することが可能で、保存安定性に優れている。包接水和物を形成する公知化合物Ａと本発明共結晶の結晶形の相違は、特に、示差走査熱量計分析（ＤＳＣ分析）及び粉末Ｘ線回析の結果から明確である。

即ち、本発明共結晶は、示差走査熱量計分析（ＤＳＣ分析）で２０１〜２１３℃に吸熱ピークを有し、及び／又は粉末Ｘ線回折で２θ（°）４．１４、８．９８、１２．４、１６．５、１７．５、１８．７、２０．５、及び２１．５付近にピークを有するものである。

公知化合物Ａは、表１に示される粉末Ｘ線回折スペクトルにおける回折角（２θ（°））及び相対強度によって特徴付けられる。これに対して、本発明共結晶は、表２に示される粉末Ｘ線回折スペクトルにおける回折角（２θ（°））及び相対強度によって特徴付けられる。なお、粉末Ｘ線回折はデータの性質上、結晶の同一性認定においては結晶格子間隔や全体的なパターンが重要であり、相対強度は結晶成長の方向、粒子の大きさ、測定条件によって多少は変わり得るものであるから、厳密に解されるべきではない。

包接水和物を形成する結晶（公知化合物Ａ）は、非化学量論的な水和物を有することにより、結晶の面間隔にずれが生じ、回折角がシフトする現象が認められる。

「粉末Ｘ線回折」及び「示差走査熱量計分析（ＤＳＣ分析）」はそれぞれ以下の条件で測定した。

（粉末Ｘ線回折）
（１）標準測定：「ＭＡＣＳｃｉｅｎｃｅＭＸＰ１８ＴＡＨＦ２２」を用い、管球：Ｃｕ、管電流：２００ｍＡ、管電圧：４０ｋＶ、サンプリング幅：０．０２０°、走査速度：３°／ｍｉｎ、波長：１．５４０５６Å、測定回折角範囲（２θ）：３〜４０°の条件で測定した。

（２）調湿測定：「多機能湿度温度変換器（ＶＡＩＳＡＬＡＭＨＰ２３５）付ＭＡＣＳｃｉｅｎｃｅＭＸＰ１８ＴＡＨＦ２２」を用い、管球：Ｃｕ、管電流：３５０ｍＡ、管電圧：５０ｋＶ、サンプリング幅：０．０２０°、走査速度：３°／ｍｉｎ、波長：１．５４０５６Å、測定回折角範囲（２θ）：５〜４０°の条件で測定した。

（示差走査熱量計分析（ＤＳＣ分析））
「ＴＡＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔＴＡ５０００」を用い、室温〜３００℃（１０℃／ｍｉｎ）、Ｎ_２（５０ｍｌ／ｍｉｎ）、アルミニウム製サンプルパンの条件で測定した。

（製造法）
本発明共結晶は、下記式に示すように、特許文献１の実施例１３８に記載されたＣ−グリコシド誘導体Ａのフリー体と、Ｌ−プロリンを使用して製造することができる。即ち、（１Ｓ）−１，５−アンヒドロ−１−［３−（１−ベンゾチエン−２−イルメチル）−４−フルオロフェニル］−Ｄ−グルシトール（公知化合物Ａ）とＬ−プロリンを、約１：１のモル比で、適当な溶媒中で加熱攪拌し、反応液を攪拌しながら徐々に冷却後、析出した固体をろ取する。適当な溶媒で洗浄することで得られた固体を乾燥した後、適当な溶媒を用いて再結晶操作を行い、析出した結晶をろ取する。適当な溶媒で洗浄後、乾燥することで、（１Ｓ）−１，５−アンヒドロ−１−［３−（１−ベンゾチエン−２−イルメチル）−４−フルオロフェニル］−Ｄ−グルシトールとＬ−プロリンの共結晶（本発明共結晶）を得ることができる。

溶媒の具体例としては、メタノール、エタノール、２−プロパノール、ｎ−プロパノール等のアルコール類、水、及びこれらの混合溶媒が挙げられる。加熱攪拌時の温度は、通常、約４０〜１５０℃、好ましくは約６０〜１００℃である。加熱攪拌する時間は、通常、約１５分〜２時間、好ましくは約２０分〜１時間である。冷却攪拌時の温度は、通常、約−２０〜２０℃、好ましくは約０〜１０℃である。冷却攪拌する時間は、通常、約３０分〜３時間、好ましくは約１〜２時間である。乾燥は、通常、減圧加熱条件で行われる。乾燥するときの温度は、通常、約３０〜１００℃、好ましくは約４０〜６０℃である。

上述のようにして得ることができる本発明共結晶は、Ｃ−グリコシド誘導体ＡとＬ−プロリンとを、約１：１のモル比で用いて得られたものである。このため、本発明共結晶は、通常、Ｃ−グリコシド誘導体ＡとＬ−プロリンとのモル比が、１：１の共結晶であると考えられる。

本発明の医薬組成物は、上述の本発明結晶を有効成分として含有するものである。また、本発明の医薬組成物は、上述の本発明結晶を用いて製造されるものである。本発明の医薬組成物は、上述の本発明結晶以外の成分として、さらに製薬学的に許容される担体を含有していてもよく、特に、糖尿病治療剤として有用なものである。

本発明共結晶を有効成分として含有する医薬組成物は、通常用いられている製剤用の担体や賦形剤、その他の添加剤を用いて、錠剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤、丸剤、液剤、注射剤、坐剤、軟膏、貼付剤等に調製され、経口的又は非経口的に投与される。

本発明共結晶のヒトに対する臨床投与量（治療有効量）は、適用される患者の症状、体重、年齢や性別等を考慮して適宜決定されるが、通常、成人１日当たり経口で０．１〜５００ｍｇ、非経口で０．０１〜１００ｍｇであり、これを１回或いは数回に分けて投与する。投与量は種々の条件で変動するので、上記投与量範囲より少ない量で十分な場合もある。

本発明共結晶の経口投与のための固体組成物としては、錠剤、散剤、顆粒剤等が用いられる。このような固体組成物においては、一つ又はそれ以上の活性物質が、少なくとも一つの不活性な希釈剤、例えば乳糖、マンニトール、ブドウ糖、ヒドロキシプロピルセルロース、微結晶セルロース、デンプン、ポリビニルピロリドン、メタケイ酸アルミン酸マグネシウムと混合される。組成物は、常法に従って、不活性な希釈剤以外の添加剤、例えばステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤や繊維素グリコール酸カルシウムのような崩壊剤、ラクトースのような安定化剤、グルタミン酸又はアスパラギン酸のような可溶化剤又は溶解補助剤を含有していてもよい。錠剤又は丸剤は必要によりショ糖、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート等の糖衣又は胃溶性若しくは腸溶性物質のフィルムで被膜してもよい。

経口投与のための液体組成物は、薬剤的に許容される乳濁剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤、エリキシル剤等を含み、一般的に用いられる不活性な希釈剤、例えば精製水、エチルアルコールを含む。この組成物は不活性な希釈剤以外に可溶化剤、溶解補助剤、湿潤剤、懸濁剤のような補助剤、甘味剤、風味剤、芳香剤、防腐剤を含有していてもよい。

非経口投与のための注射剤としては、無菌の水性又は非水性の溶液剤、懸濁剤、乳濁剤を包含する。水性の溶液剤、懸濁剤の希釈剤としては、例えば注射剤用蒸留水及び生理食塩水が含まれる。非水溶性の溶液剤、懸濁剤の希釈剤としては、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油；エチルアルコールのようなアルコール類；ポリソルベート８０（商品名）等がある。

このような組成物は、更に等張化剤、防腐剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定化剤（例えば、ラクトース）、可溶化剤又は溶解補助剤のような添加剤を含んでもよい。これらは例えばバクテリア保留フィルターを通す濾過、殺菌剤の配合又は照射によって無菌化される。これらはまた無菌の固体組成物を製造し、使用前に無菌水又は無菌の注射用溶媒に溶解して使用することもできる。

以下、本発明を実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって何ら限定されるものではない。

（参考例１）
アルゴン気流下、−７８℃に冷却した（１Ｓ）−１，５−アンヒドロ−１−［３−（１−ベンゾチエン−２−イルメチル）−４−フルオロフェニル］−２，３，４，６−テトラ−Ｏ−ベンジル−Ｄ−グルシトール（２．５ｇ）のジクロロメタン（５０ｍＬ）溶液に、ペンタメチルベンゼン（４．８５ｇ）、三塩化ホウ素の１．０Ｍｎ−ヘプタン溶液（１６．３ｍＬ）を加え同温度で２時間攪拌した。反応終了後、メタノール（１００ｍＬ）を加えて過剰の試薬を分解し、溶媒を減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム−メタノール）にて精製し、得られた残渣をエタノールと水の混合溶媒に懸濁し加熱還流することで溶解させた後に徐々に室温まで冷却することで再結晶を行った。得られた結晶をろ取し、加熱条件下減圧乾燥して、（１Ｓ）−１，５−アンヒドロ−１−［３−（１−ベンゾチエン−２−イルメチル）−４−フルオロフェニル］−Ｄ−グルシトール（公知化合物Ａ）（１．１ｇ）を白色結晶として得た。得られた公知化合物Ａの示差走査熱量計分析図（ＤＳＣ分析図）を図１に、粉末Ｘ線回析図を図２に示す。

（参考例２）
Ｌ−プロリンの示差走査熱量計分析図（ＤＳＣ分析図）を図３に、粉末Ｘ線回析図を図４に示す。

（実施例１）
（１Ｓ）−１，５−アンヒドロ−１−［３−（１−ベンゾチエン−２−イルメチル）−４−フルオロフェニル］−Ｄ−グルシトール（公知化合物Ａ）（２．０ｇ）のエタノール（２５ｍＬ）懸濁液にＬ−プロリン（５７０ｍｇ）を加え、１００℃で３０分間攪拌した。反応液を徐々に室温まで冷却後、析出した固体をろ取し、エタノールで洗浄した。得られた固体を加熱条件下減圧乾燥した後、エタノールと水の混合溶媒に懸濁し加熱還流することで溶解させた後に徐々に冷却し、氷冷下で１時間攪拌した。析出した結晶をろ取し、エタノールで洗浄後、加熱条件下減圧乾燥して、（１Ｓ）−１，５−アンヒドロ−１−［３−（１−ベンゾチエン−２−イルメチル）−４−フルオロフェニル］−Ｄ−グルシトールとＬ−プロリンの共結晶（本発明共結晶）（１．７ｇ）を得た。得られた本発明共結晶の示差走査熱量計分析図（ＤＳＣ分析図）を図５に、粉末Ｘ線回析図を図６に示す。

図１〜６の示差走査熱量計分析図（ＤＳＣ分析図）及び粉末Ｘ線回析図のプロファイルに示すように、上記実施例１によれば、公知化合物ＡとＬ−プロリンとの単なる混合物ではなく、公知化合物ＡとＬ−プロリンとの共結晶が得られたと判断される。

本発明の（１Ｓ）−１，５−アンヒドロ−１−［３−（１−ベンゾチエン−２−イルメチル）−４−フルオロフェニル］−Ｄ−グルシトールとＬ−プロリンの共結晶（本発明共結晶）は、保存安定性に優れるとともに、Ｎａ^＋−グルコース共輸送体阻害作用及び血糖降下作用を有するため、医薬、特に、Ｎａ^＋−グルコース共輸送体阻害剤として、例えば、インスリン依存性糖尿病（１型糖尿病）、インスリン非依存性糖尿病（２型糖尿病）等の糖尿病の他、インスリン抵抗性疾患及び肥満の治療、並びにこれらの予防に有用である。

本発明共結晶の優れた保存安定性、並びに顕著なＮａ^＋−グルコース共輸送体阻害作用及び血糖降下作用は、以下に示す［保存安定性試験］、［吸湿性試験］、及び［薬理試験］（試験例１及び試験例２）により確認された。

［保存安定性試験］
温度：２５℃、測定範囲：相対湿度２〜８８％の条件で連続的に粉末Ｘ線回折を測定した。その結果、公知化合物Ａは、相対湿度の変化に伴う回折角のずれが確認された（図７参照）。また、フリー体の多くの結晶化条件から得られた結晶は、室温、低湿度から非化学量論的な包接水和物を可逆的に形成する物理的に不安定な結晶であった。

これに対して、本発明共結晶は、室温（２５℃）、６３．５％ＲＨ〜８４％ＲＨで７日間まで放置しても、物理的な変化が認められなかった（図８参照）。更に、４０℃／７５％ＲＨ／開放、６０℃／なりゆき湿度、８０℃／なりゆき湿度条件下でも、少なくとも２箇月間、物理的に安定であった。

［吸湿性試験］
「ＶＴＩＳＧＡ−１００」を用い、温度：２５℃、測定範囲：相対湿度５〜９５％、測定間隔：相対湿度５％の条件で重量変化を測定した。その結果、公知化合物Ａは、低湿度から物理的な変化を伴う非化学量論的な吸湿性を示した。特に、相対湿度２５〜３５％から急激な重量の増加を示した（図９参照）。また、粒子径や晶癖によって吸湿曲線が多少異なるものの、２５℃、相対湿度５〜９５％で３．２％の水分を脱吸着するものが確認されている。

これに対して、本発明共結晶は、相対湿度５〜９５％の全範囲において、水分保持量は０．７％以下であり、吸湿性を示さなかった（図１０参照）。また、物理的にも安定であった。

［薬理試験］
（試験例１）：［ヒトＮａ^＋−グルコース共輸送体（ヒトＳＧＬＴ２）活性阻害作用確認試験］
１）ヒトＳＧＬＴ２発現ベクターの作製
まず、Superscript II（Gibco社製）とランダムヘキサマーを用いて、ヒト腎臓由来の全ＲＮＡ（Clontech社製）から１本鎖ｃＤＮＡを逆転写した。次に、これを鋳型とし、Pyrobest ＤＮＡポリメラーゼ（Takara社製）を用いたＰＣＲ反応により、ヒトＳＧＬＴ２（Wells R.G. et al., Am. J. Physiol., 1992, 263(3)F459）をコードするＤＮＡ断片を増幅した（このＤＮＡ断片の５’側にHind IIIサイトが、３’側にEcoRIサイトが導入されるようなプライマーを用いた）。

増幅された断片をTopo TA Cloningキット（Invitrogen社製）を用いてpCR2.1-Topoベクターにクローニングし、大腸菌ＪＭ１０９株のコンピテントセルに導入して、アンピシリン耐性を示すクローンをアンピシリン（１００ｍｇ／Ｌ）を含むＬＢ培地中で増殖した。増殖した大腸菌からHanahanの方法（Maniatisら、Molecular Cloningを参照）によりプラスミドを精製し、このプラスミドをHindIII、EcoRI消化して得られるヒトＳＧＬＴ２をコードするＤＮＡ断片を、発現ベクターpcDNA3.1（Invitrogen社製）の同サイトにＴ４ＤＮＡリガーゼ（Roche Diagnostics社製）を用いてライゲーションし、クローニングした。ライゲーションしたクローンを、上記と同様に大腸菌ＪＭ１０９株のコンピテントセルに導入し、アンピシリンを含むＬＢ培地中で増殖させ、Hanahanの方法によりヒトＳＧＬＴ２発現ベクターを取得した。

２）ヒトＳＧＬＴ２安定発現細胞の作製
ヒトＳＧＬＴ２発現ベクターをLipofectamine2000（Gibco社製）を用いてＣＨＯ−Ｋ１細胞に導入した。遺伝子導入後、細胞をペニシリン（５０ＩＵ／ｍＬ。大日本製薬社製）、ストレプトマイシン（５０μｇ／ｍＬ。大日本製薬社製）、Geneticin（４０μｇ／ｍＬ。Gibco社製）と１０％ウシ胎児血清を含むＨａｍ’ｓＦ１２培地（日水製薬社製）中で、３７℃、５％ＣＯ_２存在下で２週間ほど培養し、Geneticin耐性のクローンを得た。これらのクローンの中からヒトＳＧＬＴ２を安定発現する細胞を、定常レベルに対するナトリウム存在下の糖取り込みの比活性を指標に選択し、取得した（糖取り込みの測定方法の詳細は次項以降参照）。

３）メチル−α−Ｄ−グルコピラノシド取り込み阻害活性の測定
ヒトＳＧＬＴ２安定発現ＣＨＯ細胞の培地を除去し、１ウェルあたり前処置用緩衝液（塩化コリン１４０ｍＭ、塩化カリウム２ｍＭ、塩化カルシウム１ｍＭ、塩化マグネシウム１ｍＭ、２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸１０ｍＭ、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン５ｍＭを含む緩衝液ｐＨ７．４）を１００μＬ加え、３７℃で２０分間静置した。

本発明共結晶を含む取り込み用緩衝液（塩化ナトリウム１４０ｍＭ、塩化カリウム２ｍＭ、塩化カルシウム１ｍＭ、塩化マグネシウム１ｍＭ、メチル−α−Ｄ−グルコピラノシド５０μＭ、２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸１０ｍＭ、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン５ｍＭを含む緩衝液ｐＨ７．４）１０００μＬに１１μＬのメチル−α−Ｄ−（Ｕ−１４Ｃ）グルコピラノシド（AmershamPharmacia Biotech社製）を加え混合し、取り込み用緩衝液とした。対照群に本発明共結晶を含まない取り込み用緩衝液を調製した。また、本発明共結晶及びナトリウム非存在下の基礎取り込み測定用に塩化ナトリウムに替えて１４０ｍＭの塩化コリンを含む基礎取り込み用緩衝液を同様に調製した。

前処置用緩衝液を除去し、取り込み用緩衝液を１ウェルあたり２５μＬずつ加え３７℃で２時間静置した。取り込み用緩衝液を除去し、洗浄用緩衝液（塩化コリン１４０ｍＭ、塩化カリウム２ｍＭ、塩化カルシウム１ｍＭ、塩化マグネシウム１ｍＭ、メチル−α−Ｄ−グルコピラノシド１０ｍＭ、２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸１０ｍＭ、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン５ｍＭを含む緩衝液ｐＨ７．４）を１ウェルあたり２００μＬずつ加え、すぐに除去した。この洗浄操作を更に１回行い、０．５％ラウリル硫酸ナトリウムを１ウェルあたり２５μＬずつ加え、細胞を可溶化した。ここに７５μＬのマイクロシンチ４０（Packard社製）を加えマイクロシンチレーションカウンタートップカウント（Packard社製）にて放射活性を計測した。対照群の取り込み量から基礎取り込み量を差し引いた値を１００％とし、取り込み量の５０％阻害する濃度（ＩＣ_５０値）を濃度−阻害曲線から最小二乗法により算出した。その結果、本発明共結晶のＩＣ_５０値は、５．８ｎＭであった。

（試験例２）：［血糖降下作用確認試験］
実験動物として非絶食のKK-A^yマウス（日本クレア、雄性）を用いた。本発明共結晶を０．５％メチルセルロース水溶液に懸濁させ、１ｍｇ／１０ｍＬの濃度とした。マウスの体重を測定し、本発明共結晶の懸濁液を１０ｍＬ／ｋｇの用量で強制経口投与し、対照群には０．５％メチルセルロース水溶液のみを投与した。１群当たりの匹数は６匹とした。採血は、薬物投与直前及び薬物投与後１、２、４及び８時間において尾静脈から行い、血糖値を、グルコースCIIテストワコー（和光純薬）を用いて測定した。血糖降下作用強度は、本発明共結晶投与群の０から８時間での経時的血糖値より、ｔｒａｐｅｚｏｉｄａｌ法を用いて血糖値−時間曲線下面積（ＡＵＣ）を算出し、対照群のそれに対する降下の割合（％）で評価した。その結果、本発明共結晶は強い血糖降下作用を示した。

試験例１及び試験例２の結果、本発明共結晶は顕著なＮａ^＋−グルコース共輸送体活性阻害作用を示し、かつ強い血糖降下作用を示したことから、既存の糖尿病治療剤と同等又はそれ以上の有効性を有する糖尿病治療剤となり得ることが期待される。

Claims

（１Ｓ）−１，５−アンヒドロ−１−［３−（１−ベンゾチエン−２−イルメチル）−４−フルオロフェニル］−Ｄ−グルシトールと、Ｌ−プロリンとの共結晶。
（１Ｓ）−１，５−アンヒドロ−１−［３−（１−ベンゾチエン−２−イルメチル）−４−フルオロフェニル］−Ｄ−グルシトールと、Ｌ−プロリンとのモル比が、１：１である請求項１に記載の共結晶。
示差走査熱量計分析（ＤＳＣ分析）で２０１〜２１３℃に吸熱ピークを有する、請求項１に記載の共結晶。
粉末Ｘ線回折で２θ（°）４．１４、８．９８、１２．４、１６．５、１７．５、１８．７、２０．５、及び２１．５にピークを有する、請求項１に記載の共結晶。
示差走査熱量計分析（ＤＳＣ分析）で２０１〜２１３℃に吸熱ピークを有するとともに、粉末Ｘ線回折で２θ（°）４．１４、８．９８、１２．４、１６．５、１７．５、１８．７、２０．５、及び２１．５にピークを有する、請求項１に記載の共結晶。
請求項１〜５のいずれか一項に記載の共結晶を有効成分として含有する医薬組成物。
請求項１〜５のいずれか一項に記載の共結晶を用いて製造した医薬組成物。
製薬学的に許容される担体を更に含有する請求項６又は７に記載の医薬組成物。
糖尿病治療剤である請求項６〜８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
糖尿病治療剤の製造のための請求項１〜５のいずれか一項に記載の共結晶の使用。