JP4601817B2 - ペントピラノシルヌクレオシドの製造方法 - Google Patents
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Description
技術分野
本発明は、下記式(I)又は式(II)のペントピラノシルヌクレオシド、その製造及び治療的、診断的及び/又は電子的構成要素の生産のための利用に関する。
【0002】
【化8】
【0003】
【化9】
【0004】
背景技術
ピラノシル核酸(p−NAs)は一般に、ペントース単位がピラノース型であり、C−2′位とC−4′位との間でホスホジエステルにより繰り返して結合されている天然RNAに対し、異性である型構造のものである(図1)。「核酸塩基(nucleobase)」はここでは標準核酸塩基A、T、U、C、G、Eを意味するものとして解されるが、またイソグアニン/イソシトシン及び2,6−ジアミノプリン/キサンチン対も、そして本発明の意味ではまた他のプリン及びピリミジンも「核酸塩基」に包含される。p−NAs、すなわちリボースから誘導されたp−RNAsは最初にEschenmoserらにより報告された(参照、Pitsch,Sら.Helv.Chim.Acta1993,76,2161; Pitsch,Sら.Helv.Chim.Acta1995,78,1621;Angew.Chem.1996,108,1619−1623)。それらはもっぱら、いわゆるワトソン−クリック対合の(Watson−Crick−paired)、すなわちプリン−ピリミジン−及びプリン−プリン−対の、逆平行の、可逆的に融解する(melting)、擬リニアー状の(quasi−linear)、そして安定な二重鎖(duplexes)を形成する。対掌性(chirality)の反対の意味のホモキラルp−RNA鎖は同じく対合するのを制御でき、形成された二重鎖は厳密には非螺旋状である。この特異性は、超分子の構築のために価値があり、これはリボピラノースホスフェート基幹の比較的低いフレキシビリティー、基面(base plane)の鎖軸に対する強度の傾き、及びこれから生じる、インターカテナリーベース(intercatenary base)が生成二重鎖に積み重なる傾向と関係づけられ、結局、基幹の構築に2′,4′−シス−ジ置換リボピラノース環の関与に帰せられる。これらの特に良好な対合特性は超分子単位の構築に用いて、p−NAs対系をDNA及びRNAと比べて好ましくさせる。それらは天然の核酸に直交する対系を形成する、すなわち特に診断分野で重要である、天然形態で産生するDNAs及びRNAsとは対合しない。
【0005】
Eschenmoserら(1993以前)は、図2に示し、以下に説明するように最初にp−RNAを製造した。
【0006】
このような状況において、適当な保護核酸塩基がビス(トリメチルシリル)アセタミドの作用で、そしてルイス酸、例えばトリメチルシリルトリフルオロメタンスルホネートの作用でテトラベンゾイルリボピラノースのアノマー混合物と反応させられた(H.Vorbruggen,K.Krolikiewicz,B.Bennua,Chem.Ber.1981,114,1234に類似)。塩基(プリンの場合にはTHF/メタノール/水中のNaOH;ピリミジンの場合にはMeOH中の飽和アンモニア)の作用下に、アシル保護された基を糖から除去し、生成物を酸性接触下にp−アニスアルデヒドジメチルアセタールで3′,4′−位で保護した。ジアステレオマー混合物を2′−位でアシル化し、3′,4′−メトキシベンジリデン−保護された2′−ベンゾエートを酸性処理、例えばメタノール中のトリフルオロ酢酸で脱アセタール化し、ジメトキシトリチルクロリドと反応させた。ベンゾエートの2′⇒3′転移はp−ニトロフェノール/4−(ジメチルアミノ)ピリジン/トリエチルアミン/ピリジン/n−プロパノールで処理することにより開始された。ほとんどすべての反応はカラムクロマトグラフィーにより仕上げられた。次いで、この方法で合成されたキー単位、リボピラノースの4′−DMT−3′−ベンゾイル−1′−核酸塩基誘導体を部分的にホスフィチル化し、リンカーを介して固相に結合させた。
【0007】
次いで自動オリゴヌクレオチド合成で、4′−位で担体に結合された成分を、繰り返し酸性状態で脱保護し、ホスホルアミダイトをカップリング試薬、例えばテトラゾール誘導体の作用で結合させ、まだ遊離の4′−酸素原子をアセチル化し、リン原子をオリゴマー生成物を得るために酸化した。次いで、残留保護基を除去し、生成物を精製し、HPLCで脱塩した。
【0008】
しかし、Eschenmoserらの報告した方法(1993以前)は次の不利を示す:
1.核酸塩基でのヌクレオシド化反応のための非アノマーとして純粋なテトラベンゾペントピラノース(H.G.Fletcher,J.Am.Chem.Soc.1955,77,5337)の使用は、次の工程での過酷なクロマトグラフィーの必要のために最終生成物の収率を減少させる。
2.1′−位に核酸塩基を有するリボピラノースから出発して、保護された3′−ベンゾエートまでの5つの反応段階で合成が非常に遅延し、工業的規模での実施はほとんど不可能である。時間的浪費が大きい上に、得られるモノマー単位の収率がプリン単位アデニンの場合で29%、ピリミジン単位ウラシルの場合で24%と低い。
3.オリゴヌクレオチドの合成では、自動p−RNA合成で5−(4−ニトロフェニル)−1H−テトラゾールがカップリング試薬として用いられる。アセトニトリル中のテトラゾールの溶液でのこの試剤の濃度は、この場合に5−(4−ニトロフェニル)−1H−テトラゾール合成器の細管中で一様に晶出し、かくして合成が早期に終わるほどに高い。さらに、オリゴマーが5−(4−ニトロフェニル)−1H−テトラゾールで汚染されることが観察された。
4.報告されたp−RNAのオリゴヌクレオチドの仕上げ、特に塩基に不安定な保護基のヒドラジン溶液での除去は、オリゴマー中に高チミジン画分があると必ずしも可能ではない。
発明の開示
それ故に、本発明の目的は、既知及び新規のペントピラノシルヌクレオシドの製造を既知の方法より大規模に行うのを可能にし、上述の不利を回避するペントピラノシルヌクレオシドの新規な製造法を用いうるようにすることである。それ故に、本発明の課題は、未保護ペントピラノシドから出発して、(a)第1の工程で、ペントピラノシドの2′,3′又は4′−位を先ず保護し、(b)第2の工程で、残りの2′,3′又は4′−位の他の位置を保護することを特徴とするペントピラノシルヌクレオシドの製造方法である。好ましい態様では、次の式(I)及び(II)のものについてである。
式(I)
【0009】
【化10】
【0010】
{ここで、R1はH、OH、Hal(ここでHalはBr又はClである)、又は式
【0011】
【化11】
【0012】
、又は式
【0013】
【化12】
【0014】
又は−O−P[N(i−Pr)2]−(OCH2CH2CN)(ここでi−Prはイソプロピルである)から選ばれた基であり、R2,R3及びR4はそれぞれ、互いに独立して、同一であるか又は異なって、H、Hal(ここでHalはBr又はClである)、NR5R6、OR7、SR8、=O、CnH2n+1(ここでnは1−12、好ましくは1−8、特に1−4の整数である)、β−脱離性基(β−eliminable group)、好ましくは式−OCH2CH2R18(ここでR18はシアノ基、p−ニトロフェニル基、フルオレニルメチルオキシカルボニル(Fmoc)基である)、又は(CnH2n)NR10R11[ここでR10R11はH、CnH2n+1であるか又は式
【0015】
【化13】
【0016】
〔ここで、R12,R13,R14,R15はそれぞれ、互いに独立して、同一であるか又は異なって、H、OR7(ここでR7は上記の意味をもつ)、又はCnH2n+1又はCnH2n-1(ここでnは上記の意味をもつ)である〕の基を介して結合されている]であって、かつR5,R6,R7,R8はそれぞれ、互いに独立して、同一であるか又は異なって、H、CnH2n+1又はCnH2n-1(ここでnは上記の意味をもつ)、又は−C(O)R9(ここでR9は直鎖状又は分枝状の、場合により置換されたアルキル又はアリール基、好ましくはフェニル基である)であり、X,Y,Zはそれぞれ、互いに独立して、同一であるか又は異なって、=N−、=C(R16)−又は−N(R17)−(ここでR16及びR17はそれぞれ、互いに独立して、同一であるか又は異なって、H、又は上記の意味をもつCnH2n+1又は(CnH2n)NR10R11である)であり、そしてSc1及びSc2はそれぞれ、互いに独立して、同一であるか又は異なって、H、又はアシル、トリチル又はアリルオキシカルボニル基、好ましくはベンゾイル又は4,4′−ジメトキシトリチル(DMT)基から選ばれた保護基である}
式(II)
【0017】
【化14】
【0018】
[ここで、R1′はH、OH、Hal(ここでHalはBr又はClである)、又は式
【0019】
【化15】
【0020】
、又は式
【0021】
【化16】
【0022】
又は−O−P[N(i−Pr)2]−(OCH2CH2CN)(ここでi−Prはイソプロピルである)から選ばれた基であり、R2′,R3′及びR4′はそれぞれ、互いに独立して、同一であるか又は異なって、H、Hal(ここでHalはBr又はClである)、=O、CnH2n+1、CnH2n-1、β−脱離性基、好ましくは式−OCH2CH2R18(ここでR18はシアノ基、p−ニトロフェニル基、フルオレニルメチルオキシカルボニル(Fmoc)基である)、又は(CnH2n)NR10′R11′(ここでR10′,R11′は互いに独立して、上記のR10又はR11の意味をもつ)であり、X′は=N−、=C(R16′)−又は−N(R17′)−(ここでR16′及びR17′は互いに独立して上記のR16又はR17の意味をもつ)であり、そしてSc1′及びSc2′は上記のSc1及びSc2の意味をもつ]
本発明によるペントピラノシルヌクレオシドは一般にペントピラノシル部がD配置(D configuration)である(しかし、L配置の場合もある)、リボ−、アラビノ−、リキソ−及び/又はキシロピラノシルヌクレオシド、好ましくはリボピラノシルヌクレオシドである。
【0023】
通例、本発明によるペントピラノシルヌクレオシドは、ペントピラノシルプリン、−2,6−ジアミノプリン、−6−プリンチオール、−ピリジン、−ピリミジン、−アデノシン、−グアノシン、−イソグアノシン、−6−チオグアノシン、−キサンチン、−ヒポキサンチン、−チミジン、−シトシン、−イソシトシン、−インドール、−トリプタミン、−N−フタロイルトリプタミン、−ウラシル、−カフェイン、−テオブロミン、−テオフィリン、−ベンゾトリアゾール又は−アクリジン、特にペントピラノシルプリン、−ピリミジン、−アデノシン、−グアノシン、−チミジン、−シトシン、−トリプタミン、−N−フタロイルトリプタミン又は−ウラシルである。
【0024】
この化合物はまた、リンカーとして、すなわち生体分子、例えばDNA、RNAのみならずp−NAs、好ましくはpRNAsなどの、天然型で産生する核酸又は修飾された核酸のような生体分子に共有結合しうる官能基をもつ化合物として用いられるペントピラノシルヌクレオシドを包含する。これはリンカーがp−NAs用にはまだ知られていないので驚くべきことである。
【0025】
例えば、これらは、R2、R3、R4、R2′、R3′及び/又はR4′が2−フタルイミドエチル又はアリルオキシ基であるペントピラノシルヌクレオシドを包含する。本発明による好適なリンカーは例えば好ましくはウラシルの5−位が修飾されているウラシルベースリンカー(uracil−based linkers)、例えばN−フタロイルアミノエチルウラシルであり、またインドールベースリンカー、好ましくは例えばN−フタロイルトリプタミンのようなトリプタミン誘導体である。
【0026】
驚くべきことに、本発明によれば、より取り扱いやすいペントピラノシル−N,N−ジアシルヌクレオシド、好ましくはプリン、特にアデノシン、グアノシン又は6−チオグアノシンもまた利用しうるようになり、その核酸塩基を簡単な方法で完全に脱保護しうる。それ故に本発明はまた、R2、R3、R4、R2′、R3′及び/又はR4′が式−N[C(O)R9]2の基、特にN6,N6−ジベンゾイル−9−(β−D−リボピラノシルアデノシンであるペントピラノシルヌクレオシドを包含する。
【0027】
さらに驚くべきことには、本発明は、ペントピラノシド部位の3′−酸素原子上を除いて、保護基、好ましくは塩基又は金属接触により除去しうる保護基、特にアシル基、特に好ましくはベンゾイル基をもつ、ペントピラノシルヌクレオシドを利用しうるようになる。これらの化合物は、例えば追加の精製工程のような収率を低下させる追加の工程なしに、ペントピラノシド部位の4′−酸素原子にさらなる保護基、好ましくは酸又は塩基に不安定な保護基、特にトリチル基、特に好ましくはジメトキシトリチル基を直接導入するための出発物質として役立つ。
【0028】
さらに、本発明は、ペントピラノシド部位の4′−酸素原子上を除いて、保護基、好ましくは酸又は塩基に不安定な保護基、特にトリチル基、特に好ましくはジメトキシトリチル基をもつ、ペントピラノシルヌクレオシドを利用しうるようになる。これらの化合物もまた、例えば追加の精製工程のような収率を低下させる追加の工程なしに、例えばペントピラノシド部位の2′−酸素原子などに、さらなる保護基、好ましくは塩基又は金属接触により除去しうる保護基、特にアシル基、特に好ましくはベンゾイル基を直接導入するための出発物質として役立つ。
【0029】
一般に、本発明によるペントピラノシルヌクレオシドは、収率を高め、それ故に特に有利であるいわゆるワンポット(one−pot)反応で反応させうる。次の化合物がペントピラノシルヌクレオシドの好適例である。
A)[2′,4′−ジ−O−ベンゾイル)−β−リボピラノシル]ヌクレオシド、特に[2′,4′−ジ−O−ベンゾイル)−β−リボピラノシル]−アデニン、−グアニン、−シトシン、−チミジン、−ウラシル、−キサンチン又は−ヒポキサンチン、及びN−ベンゾイル−2′,4′−ジ−O−ベンゾイルリボピラノシルヌクレオシド、特に−アデニン、−グアニン又は−シトシン、及びN−イソブチロイル−2′,4′−ジ−O−ベンゾイルリボピラノシルヌクレオシド、特に−アデニン、−グアニン又は−シトシン、及びO6−(2−シアノエチル)−N2−イソブチロイル−2′,4′−ジ−O−ベンゾイルリボピラノシルヌクレオシド、特に−グアニン及びO6−(2−(4−ニトロフェニル)エチル)−N2−イソブチロイル−2′,4′−ジ−O−ベンゾイルリボピラノシルヌクレオシド、特に−グアニン。
B)β−リボピラノシルヌクレオシド、β−リボピラノシルアデニン、−グアニン、−シトシン、−チミジン、−ウラシル、−キサンチン又は−ヒポキサンチン、及びN−ベンゾイル−、N−イソブチロイル、 O6−(2−シアノエチル)−又はO6−(2−(4−ニトロフェニル)エチル)−N2−イソブチロイル−β−リボピラノシルヌクレオシド。
C)4′−DMT−ペントピラノシルヌクレオシド、好ましくは4′−DMT−リボピラノシルヌクレオシド、特に4′−DMT−リボピラノシルアデニン、−グアニン、−シトシン、−チミジン、−ウラシル、−キサンチン又は−ヒポキサンチン、及びN−ベンゾイル−4′− DMT−リボピラノシルヌクレオシド、特にN−ベンゾイル−4′− DMT−リボピラノシルアデニン、−グアニン又は−シトシン、及びN−イソブチロイル−4′− DMT−リボピラノシルヌクレオシド、特にN−イソブチロイル−4′− DMT−リボピラノシルアデニン、−グアニン又は−シトシン、及びO6−(2−シアノエチル)− N2−イソブチロイル−4′− DMT−リボピラノシルヌクレオシド、特にO6−(2−シアノエチル)− N2−イソブチロイル−4′− DMT−リボピラノシルグアニン、及びO6−(2−(4−ニトロフェニル)エチル)−N2−イソブチロイル−4′− DMT−リボピラノシルヌクレオシド、特にO6−(2−(4−ニトロフェニル)エチル)−N2−イソブチロイル−4′− DMT−リボピラノシルグアニン。
D)β−リボピラノシル−N,N′−ジベンゾイルアデノシン又はβ−リボピラノシル−N,N′−ジベンゾイルグアノシン。
【0030】
オリゴヌクレオチド合成の好適な前駆体は、例えば4′− DMT−ペントピラノシルヌクレオシド−2′−ホスフィタミド/−H−ホスホネート、好ましくは4′− DMT−リボピラノシルヌクレオシド−2′−ホスフィタミド/−H−ホスホネート、特に4′− DMT−リボピラノシルアデニン−、−グアニン−、−シトシン−、−チミジン−、−キサンチン−、−ヒポキサンチン−又は−ウラシル−2′−ホスフィタミド/−H−ホスホネート、及びN−ベンゾイル−4′− DMT−リボピラノシルアデニン−、−グアニン−又は−シトシン−2′−ホスフィタミド/−H−ホスホネート、及びN−イソブチロイル−4′− DMT−リボピラノシルアデニン−、−グアニン−又は−シトシン−2′−ホスフィタミド/−H−ホスホネート、及びO6−(2−シアノエチル)−4′− DMT−リボピラノシルグアニン−、−キサンチン−又は−ヒポキサンチン−2′−ホスフィタミド/−H−ホスホネート、又は O6−(2−(4−ニトロフェニル)エチル)−N2−イソブチロイル−4′− DMT−リボピラノシル−グアニンであり、そして固体担体ヘのカップリング用には、例えば4′− DMT−ペントピラノシルヌクレオシド−2′−スクシネート、好ましくは4′− DMT−リボピラノシルヌクレオシド−2′−スクシネート、特に4′− DMT−リボピラノシルアデニン−、−グアニン−、−シトシン−、−チミジン−、−キサンチン−、−ヒポキサンチン−又は−ウラシル−2′−スクシネート、及びN−ベンゾイル−4′− DMT−リボピラノシルアデニン−、−グアニン−又は−シトシン−2′−スクシネート、及びN−イソブチロイル−4′− DMT−リボピラノシルアデニン−、−グアニン−又は−シトシン−2′−スクシネート、及びO−(2−シアノエチル)−4′− DMT−リボピラノシルグアニン−2′−スクシネート、及びO6−(2−(4−ニトロフェニル)エチル)−N2−イソブチロイル−4′− DMT−リボピラノシルグアニン−2′−スクシネートである。
【0031】
本発明による方法は、引用文献に記載された核酸塩基に制限されず、驚くべきことに多数の天然及び合成の核酸塩基を用いて成功裡に行われる。さらに、特に驚くべきことには本発明による方法は文献から知られた方法に比べて高収率で平均60%の時間節約を伴って行われ、特に工業的適用に有利である。その上に、本発明による方法を用いると、文献に記載された方法に必要な精製工程、例えばクロマトグラフィーによる中間精製処理を要さず、反応が著しく空時収率を高めるいわゆるワンポット反応として行われる場合もある。
【0032】
特別な態様として、2′−保護位の場合に、2′−位から3′−位への保護基の転移が一般的には塩基の存在下に行われ、特にN−エチルジイソプロピルアミン及び/又はトリエチルアミンの存在下に行われる。本発明に従い、この反応は特に有利にはワンポット反応として同じ反応容器で行われる。
【0033】
さらに好ましい態様では、ピラノシルヌクレオシドは、酸に不安定であるか、塩基に不安定であるか、又は金属接触で除去されうる保護基Sc1、Sc2、 Sc1′又はSc2′によって保護され、保護基Sc1及び Sc1′は保護基Sc2及びSc2′とは異なっているのが好ましい。一般に、上記保護基はアシル基、好ましくはアセチル、ベンゾイル、ニトロベンゾイル及び/又はメトキシベンゾイル基、トリチル基、好ましくは4,4′−ジメトキシトリチル(DMT)基又はβ−除去しうる基、好ましくは式OCH2CH2R18(ここで、R18はシアノ基、p−ニトロフェニル基又はフルオレニルメチルオキシカルボニル(Fmoc)基である)の基である。
【0034】
特に好ましくは、2′−又は3′−位が、塩基に不安定であるか、又は金属接触で除去されうる保護基、好ましくはアシル基、特にアセチル、ベンゾイル、ニトロベンゾイル及び/又はメトキシベンゾイル基で保護され、及び/又は4′−位が、酸又は塩基に不安定である保護基、好ましくはトリチル基及び/又はFmoc基、特にDMT基で保護されている。
【0035】
文献から知られた方法と異なって、本発明による方法は、従って、アセタール又はケタールのようなアセタール保護基なしに処置し、追加のクロマトグラフィーによる中間精製処理を回避し、従って反応を驚異的に高い空時収率でワンポット反応として行わせるものである。
【0036】
上記保護基は、好ましくは低温で導入され、それはこの手段で驚くほど選択的に導入しうるからである。こうして、例えば、ベンゾイル基の導入は低温でピリジン又はピリジン/メチレンクロリド中でベンゾイルクロリドと反応させることにより行われる。DMT基は例えば、塩基例えばN−エチルジイソプロピルアミン(Hunigの塩基)及び例えばピリジン、メチレンクロリド又はピリジン/メチレンクロリド混合物の存在下にDMTClと反応させることにより導入される。
【0037】
また、アシル化後及び/又は任意に行われる2′−又は3′−位の転移後に、反応生成物をクロマトグラフィーで精製するのもまた有利である。トリチル化後の精製は本発明方法によれば必要ではなく、それが特に有利なことである。
【0038】
最終生成物は、必要ならば、さらに晶出により精製される。
本発明の別の課題は、(a)保護された核酸塩基を保護されたリボピラノースと反応させ、(b)工程(a)からの生成物のリボピラノシル部位から保護基を除去し、そして(c)工程(b)からの生成物をより詳細に上記した方法に従い反応させる、リボピラノシルヌクレオシドの製造法である。
【0039】
これに関連して、さらなる時間−及び物質−消費性のクロマトグラフィー工程を回避するために、アノマー性からして純粋な(anomerically pure)保護されたペントピラノース、例えばテトラベンゾイルペントピラノース、好ましくはβ−テトラベンゾイルリボピラノースを用いるのが唯一有利である(R.Jeanloz,J.Am.Chem.Soc.1948,70,4052)。
【0040】
さらなる態様では、R4′が(CnH2n)NR10′R11′であって、 R10′R11′が既に示した意味をもつ式(III)の基で結合されている式(II)によるリンカーは、有利には次の工程:
(a)R4′が(CnH2n)OSc3又は(CnH2n)Hal(ここで、nは上記の意味をもち、Sc3は保護基、好ましくはメシレート(mesylate)基であり、Halは塩素又は臭素である)である式(II)の化合物を、好ましくはDMF中でアジドと反応させ、次いで、
(b)(a)からの反応生成物を好ましくは例えばピリジン中でトリフェニルホスフィンと反応させ、次いで、
(c)(b)からの反応生成物を適当なフタルイミド、例えばN−エトキシカルボニルフタルイミドと反応させ、そして、
(d)(c)からの反応生成物を適当な保護されたピラノース、例えばリボーステトラベンゾエートと反応させ、そして最後に、
(e)保護基を、例えばメチレート(methylate)で除去し、そして、(f)さらなる工程を既に上記したように実施することにより製造される。
【0041】
さらに、リンカーとしてのインドール誘導体は蛍光発生能の利点を有し、それ故に特にごく少量の物質の検出を問題とするナノ技術への応用に好適である。例えば、インドール−1−リボシド(indole−1−riboside)は既に「N.N.SUvorovら,Biol.Aktivn.Soedin.,Akad.Nauk SSSR 1965,60」及び「テトラヘドロン 1967,23,4653」に報告されている。しかし、3−置換誘導体を製造する類似の方法はない。一般に、これらの製造は、未保護糖成分のアミナール(aminal)及びインドリンの生成を経て行われ、次いでこれを酸化によりインドール−1−リボシドへ転化する。例えば、インドール−1−グルコシド及び−1−アラビノシドが報告され(Y.V.Dobriyninら,Khim.−Farm Zh.1978,12,33)、その3−置換誘導体は通常フィールスマイヤー反応により製造された。しかし、インドールの3−位へのアミノエチル単位の導入のためのこのルートは、工業的応用にはあまりにも複雑である。
【0042】
さらに好適な態様では、式(I)[式中のX及びYはそれぞれ、互いに独立して、同一であるか又は異なって、=C(R16)(ここでR16はH又はCnH2nである)、Zは=C(R16)−(ここでR16は(CnH2n)NR10R11である)である]によるリンカーは、それ故に有利には次の工程:
(a)適当なインドリン、例えばN−フタロイルトリプタミンをピラノース、例えばD−リボースと反応させてヌクレオシドトリオールを生成させ、次いで、
(b)(a)からの生成物のピラノシル部位のヒドロキシル基を好ましくはアシル基、例えば無水酢酸で保護し、次いで、
(c)(b)からの生成物を、例えば2,3−ジクロロ−5,6−ジシアノパラキノンで酸化し、そして、
(d)(c)からの生成物のピラノシル部位のヒドロキシル保護基を、例えばメチレートで除去し、そして最後に、
(e)さらなる工程を既に上記したように行う工程により製造される。
【0043】
しかし、この方法はリボピラノースの場合に用いられるばかりではなく、リボフラノース及び2′−デオキシリボフラノース又は2′−デオキシリボピラノースの場合にも用いられ、これは特に有利である。用いられた糖のヌクレオシド化パートナー(nucleosidation partner)は好ましくはトリプタミン、特にトリプタミンのN−アシル誘導体、とりわけN−フタロイルトリプタミンである。
【0044】
さらなる態様では、4′−保護、好ましくは3′,4′−保護ペントピラノシルヌクレオシドはさらなる工程でホスフィチル化され、あるいは固相に結合される。
【0045】
ホスフィチル化(phosphitylation)は、例えば、N−エチルジイソプロピルアミンのような塩基の存在下にモノアリル N−ジイソプロピルクロロホスホルアミダイトにより、あるいは三塩化リン及びイミダゾール又はテトラゾールでの処理及び引き続いての塩基の添加での加水分解により行われる。生成物は、第1の場合にはホスホルアミダイトであり、第2の場合にはH−ホスホネートである。本発明による保護されたペントピラノシルヌクレオシドの固相、例えば「長鎖アルキルアミノ制御の多孔質ガラス」(CPG,Sigma Chemie,Munich)への結合は、例えばEschenmoserら(1993)に記載されているように行われる。
【0046】
得られた化合物は、例えばペントピラノシル核酸の製造のために役立つ。
それ故に、本発明のさらなる課題は、次の工程:
(a)第1工程で、保護されたペントピラノシルヌクレオシドを既に上記したように固相に結合させ、そして、
(b)第2工程で、工程(a)により固相に結合された3′−,4′−保護ペントピラノシルヌクレオシドを、ホスフィチル化3′−,4′−保護ペントピラノシルヌクレオシドにより伸長させ、次いで、例えば水性ヨウ素溶液で酸化し、そして、
(c)所望のペントピラノシル核酸が発現するまで、工程(b)を同一又は異なるホスフィチル化3′−,4′−保護ペントピラノシルヌクレオシドを用いて繰り返す工程によってペントピラノシル核酸を製造する方法である。
【0047】
ピリジニウム塩酸塩、特にベンズイミダゾリウム トリフレートなどの酸性活性化剤は、カップリング試薬としての5−(4−ニトロフェニル)−1H−テトラゾールに対比し、カップリング試薬ライン(lines)の阻害や生成物の汚染を全く起こさないので、ホスホルアミダイトを好ましくはアセトニトリル中で再結晶化及びアセトニトリルに溶解後に用いるときにカップリング試薬として好適である。
【0048】
H−ホスホネートを用いるときには、カップリング試薬として、アリールスルホニルクロリド、ジフェニルクロロホスホネート、ピバロイルクロリド又はアダマントイルクロリドが特に好適である。
【0049】
さらに、オリゴヌクレオチド特にp−NAs、好ましくはp−RNAsの保護基除去のヒドラジン分解に対し、ピリミジン塩基特にウラシル及びチミンを、オリゴヌクレオチドを破壊する開環から保護するには、塩化ナトリウムのような塩の添加によるのが有利である。アリルオキシ基は好ましくは、例えばヒドラジン分解の前に、パラジウム[Pd(0)]錯体で除去される。
【0050】
さらに特別の態様では、天然型であるペントフラノシルヌクレオシド、例えばアデノシン、グアノシン、シチジン、チミジン及び/又はウラシルもまた、工程(a)及び/又は工程(b)に併合され、それは、例えば混合p−NA−DNA又はp−NA−RNAへ導かれる。
【0051】
別の特別の態様では、さらなる工程で、式:
Sc4NH(CnH2n)CH(OPSc5Sc6)CnH2nSc7
(IV)
(式中、Sc4及びSc7はそれぞれ、互いに独立して、同一であるか又は異なって、特にFmoc及び/又はDMTから選ばれた保護基であり、Sc5及びSc6はそれぞれ、互いに独立して、同一であるか又は異なって、アリルオキシ及び/又はジイソプロピルアミノ基であり、nは既に上記した意味を有する)のアリルオキシリンカーが併合される。
【0052】
特に好適なアリルオキシリンカーは[2−(S)−N−Fmoc−O1−DMT−O2−アリルオキシジイソプロピルアミノホスフィニル−6−アミノ−1,2−ヘキサンジオール]である。
【0053】
このようにして、例えばリジンから出発して、数反応工程で、アミノ−末端リンカーが合成され、それは活性化しうるリン化合物とともに酸に不安定な保護基を担持し、それ故に自動オリゴヌクレオチド合成に容易に用いられる(参照、例えばP.S.Nelsonら,Nucleic acid Res.1989,17,7179;L.J.Arnoldら,WO8902439)。本発明の範囲はリジンベースリンカーで拡張され、それではリン原子上での常用のシアノエチル基に代えて、アリルオキシ基が導入され、それはそれ故にNoyoriオリゴヌクレオチド法( R.Noyori,J.Am.Chem.Soc.1990,112,1691−6 )で有利に用いられる。
【0054】
p−NAs、特にp−RNAsは互いに安定な二重鎖を形成し、一般に天然型であるDNAs及びRNAsとは対合しない。この性質はp−NAsを好適な対系(pairing systems)にする。
【0055】
このような対系(pairing systems)は非共有(non−covalent)相互作用の超分子系であり、それは選択性、安定性及び可逆性により特徴づけられ、その性質は好ましくは動力学的に、例えば温度、pH及び濃度により影響される。このような対系はまた、例えば異なる金属クラスター(cluster)を一緒にして潜在的に新規な性質を有するクラスター会合(associates)を形成させるための「分子接着剤」としての選択的な性質を考慮して用いられる[参照、例えばR.L.Letsingerら,Nature,1996,382,607−9;P.G.Schultzら, Nature,1996,382,609−11 ]。従って、 p−NAsはまた、強力にかつ熱力学的に制御しうる対系を形成するので、ナノ技術分野、例えば新規物質、診断剤、治療剤及びまたマイクロエレクトロニクス、光学又はオプトエレクトロニクスの構成要素(components)の製造に用いて、また分子種(molecular species)を集めるのを制御してタンパク組立(assrmblies)の(組合せ)合成用などの超分子単位を形成させるのに用いて好適である[参照、例えば、A.Lombardi,J.W.Bryson,W.F.DeGrado,Biomolekuls(Pept.Sci.)1997,40,495−504]。それ故に、更なる応用は特に、天然核酸をそこなわないp−NAコードをもつタンパクやDNA/RNA切片(sections)などの、機能的好ましくは生物学的単位を提供しうるために、診断及び医薬分野において生じる(参照、例えばWO93/20242)。
【0056】
生体分子、例えばDNA又はRNAは、それと他の生体分子、例えばDNA又はRNA の双方が核酸塩基の相補的配列の結果として水素架橋の形成によって互いに結合しうる部分を含有している場合に、他の生体分子との非共有結合のために用いられる。このタイプの生体分子は、例えば信号増幅ののための分析システムにおいて用いられ、それでは配列が分析されるDNA分子が一方では非共有DNAリンカーのような手段で固体担体に固定され、他方では信号増幅しうる分岐鎖DNA分子(bDNA)に結合されている(参照、例えばS.Urdea,Biol/Technol.1994,12,926又は米国特許第5624802号)。最後に記載したシステムの本質的欠点はこれまでのところポリメラーゼ連鎖反応(PCR)による核酸分析法に対する感度に関してである(K.Mullis,Methods Enzymol.1987,155,335)。これは、中でも、分析されるDNA分子の非共有結合と同様に分析される、DNA分子への固体担体の非共有結合が、特には必ずしも起こらないという事実に帰せられ、この結果として、配列認識と非共有結合の機能の混同(mixing)が生じる。DNA又はRNA対合法(pairing process)に介入しない直交対系(orthogonal pairing system)としてのp−NAsの使用は、この問題を有利に解決し、その結果として上記分析法の感度を顕著に増大しうる。
【0057】
それ故に、本発明方法により得られるペントピラノシルヌクレオシド又はペントピラノシル核酸は、例えば生体分子との結合状態のような複合体の形態で、治療的、診断的及び/又は電子的構成要素のような医薬の製造に好適である。
【0058】
本発明の意味での複合体(conjugates)とはp−NAsと他の生体分子、好ましくはペプチド、タンパク又は核酸の共有結合ハイブリッド、例えば抗体又はその機能部、天然型で産するDNA及び/又はRNAである。抗体の機能部は、例えばFv断片(Skerra&Pluckthun(1988)Science240,1038)、単鎖Fv断片(scFv;Birdら,(1988)Science242,423;Hustonら、(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.米国85,5879)又はFab断片(Betterら、(1988) Science240,1041)である。
【0059】
本発明の意味での生体分子とは、天然産生物質又はそれから誘導された物質である。
【0060】
好適な態様では、それらはp−RNA/DNA又はp−RNA/RNA複合体である。
【0061】
本発明による複合体は互いに直交する(orthogonal)2つの対系を含有するので、配列認識及び非共有結合の機能が分子で実現されねばならないときに好ましくは用いられる。
【0062】
逐次法及び集中法(sequential and convergent processes)ともに複合体の製造に好適である。
【0063】
逐次法では、例えばp−RNAオリゴマーの自動合成を同じ合成器で、試剤やカップリングプロトコルの再調整後に直接行った後、さらにDNAオリゴヌクレオチドが合成される。この方法はまた逆の順序でも行われる。
【0064】
集中法では、例えばアミノ末端リンカーを有するp−RNAオリゴマー及び、例えばチオールリンカーを有するDNAオリゴマーが別の操作で合成される。次いで、好ましくは、文献から知られたプロトコルに従い、p−RNAオリゴマーのヨードアセチル化及び2つの単位のカップリングが行われる(T.Zhuら,Bioconjug.chem.1994,5,312)。
【0065】
集中法は特にそのフレキシビリティーのために好ましい。
本発明の意味での用語の複合体はまた、いわゆるアレイ(arrays)を意味するものとして理解される。アレイは特に分析及び診断において分析物の同時決定に重要な役割を果たす、固定された認識種(recognition species)の配列である。例としてペプチドアレイ(Fodorら,Nature1993,364,555)や核酸アレイ(Southernら ,Genomics1992,13,1008;Heller,米国特許第5632957号)がある。これらのアレイの高いフレキシビリティーは、認識種をコードしうるオリゴヌクレオチドに、そして結合された相補鎖(complementary strands)を固体担体上のある箇所に結合させることによって達成されうる。コード認識種をアンチコード(anti−coded)固体担体に適用し、ハイブリッド形成条件を調整することにより、認識種は所望の位置に非共有結合される。結果として、種々のタイプの認識種、例えばDNA切片(sections)、抗体がハイブリッド形成条件を利用して固体担体上に同時に配列されうる(図3参照)。しかし、このためにまず必要なものとして、コード切片をできるだけ短くし、天然核酸p−NAs、好ましくはp−RNAsをそこなわないために極めて強力で選択的であるコドン及びアンチコドンがあり、これらはこのために特に有利に好適である。
【0066】
本発明の意味での用語の担体は、固体又はゼラチン状形態である物質、特にチップ状物質を意味するものとして理解される。好適な担体材料は、例えばセラミック、金属特に貴金属、ガラス、プラスチック、結晶性物質又は、上記材料の中でも特に担体の薄層であり、また、セルロースや構造タンパクのような(生体)分子フィラメントである。
【0067】
それ故に、本発明はまた、認識種、好ましくは天然DNA又はRNA鎖又はタンパク、特に抗体又は抗体の機能部位をコードするためのペントピラノシル核酸、好ましくはリボピラノシル核酸の利用に関する。これらは次いで図4による固体担体上で適当なコドンでハイブリッド形成される。このようにして、新規で診断的に有用なアレイを、常に新規な認識種の組合せを用いハイブリッド形成条件を調整することによってのみアレイ形態でコドンを具備させた固体担体の所望位置に常に組み込める。次いで、分析物、例えば血漿などの生物学的試料が適用されると、検出される種はあるパターンでアレイに結合され、次いで間接的に(例えば認識種の蛍光標識により)又は直接的に(例えばコドンの結合点でのインピーダンス測定により)記録される。次いで、ハイブリッド形成はコドンを有する担体のみが再び残るように適当な条件(温度、塩、溶媒、電気泳動法)で解除される。これは次いで再び他の認識種で装荷され、例えば他の試料の決定用の同じ分析物に対して用いられる。アレイフォーマットでの認識種の常に新規な配列及び対系としてのp−NAsの使用は他のシステム、例えばWO96/13522と比べ特に有利である。
【0068】
それ故に、本発明のさらなる課題は、特に上記のペントピラノシルヌクレオシドからなる診断薬又は既により詳細に上記した本発明による複合体に関する。以下の実施例及び図面は本発明をより詳細にそれを制限することなく述べることを意図したものである。
実施例
実施例1
1−{3′−O−ベンゾイル−4′−O−[(4,4′−ジメトキシトリフェニル)メチル]−β−D−リボピラノシル}チミンの合成
最初の4′−置換、次いでの2′−置換、次いでの転移(migration)反応:
【0069】
【化17】
【0070】
1−(β−D−リボピラノシル}チミンA51.6g(200ミリモル)をアルゴン雰囲気下に無水ピリジン620mlに溶解し、N−エチルジイソプロピルアミン71.4ml(2.1当量(eq.))及びモレキュラーシーブ(4Å)100gを加え、混合物をKPG攪拌器を用い15分間攪拌した。ジメトキシトリチルクロリド(DMTCl)92g(272ミリモル;1.36当量)をクロロホルム(固体NaHCO3から新たに蒸留されたもの)280mlに溶解し、この溶液をトリオール溶液に−6ないし−5℃で30分かけて滴下した。これをこの温度で1時間、次いで室温で一夜攪拌し、再度冷却し、さらにクロロホルム70ml中のDMTCl25g(74ミリモル;0.37当量)を加えた。混合物を室温にならしめ4時間攪拌した。1−{4′−O−[(4,4′−ジメトキシトリフェニル)メチル]−β−D−リボピラノシル}チミンの分析データを得るために、少量の試料をとり、水性仕上げ処理(work−up)にかけ、クロマトグラフィーに付した。
【0071】
【化18】
【0072】
反応混合物を4−ジメチルアミノピリジン(DMAP)2.46g(20.5ミリモル;0.1当量)で処理し、−6℃に冷却し、ピリジン30ml中のベンゾイルクロリド(BzCl)27.9ml(0.24モル;1.2当量)を−6℃から−1℃の間で15分かけて滴下し、混合物を10分間攪拌した。反応を完結させるために、さらにBzCl2.8ml(24ミリモル;0.12当量)を冷却しながら25分間隔で各場合に加え混合物を最後に20分間攪拌した。
次いで無水ピリジン460ml、n−プロパノール841ml(11.2モル;56当量)、p−ニトロフェノール44g(0.316モル;1.58当量)、DMAP21.7g(0.18モル;0.9当量)及びN−エチルジイソプロピルアミン136ml(0.8モル;4当量)を室温で加え、混合物を61−63℃で48時間攪拌した。
【0073】
次いで混合物を室温で60時間放置した。 反応混合物を再度61−63℃に24時間加熱し、室温に冷却し、ロタベイパー(Rotavapor)で濃縮した。残渣を酢酸エチル2リットルにとり、モレキュラーシーブをろ別し、有機相を3回各回水1リットルで抽出し、10%濃度のクエン酸1.2リットルと攪拌して1回抽出し、有機相を再度分別し、水1リットルで一回抽出し、飽和NaHCO溶液1リットルで最後に抽出した。有機相を硫酸ナトリウムを用い乾燥し、ろ過し、濃縮した(残渣220g)。
【0074】
残渣を先ず予備精製のためヘプタン/酢酸エチル(1:1−0.1)のステップグラジエント(step gradient)を用いてシリカゲル60(20×10cm)でろ過し、次いでシリカゲル60でのクロマトグラフィー(30×10cm;ジクロロメタン/酢酸エチル(1:0−1:1)のステップグラジエント)に付した。
以下のものが得られた。
非極性画分40g
1−{3′−O−ベンゾイル−4′−O−[(4,4′−ジメトキシトリフェニル)メチル]−β−D−リボピラノシル}チミンB52.9g
不純な化合物B34.5g
極性画分3.4g
不純画分を再度クロマトグラフィーに付し(SG60,45×10cm;ジクロロメタン/酢酸エチル,3:1)、さらに化合物B11.3gを得た。全収量:化合物B64.2g(97ミリモル)、すなわち収率48%。1H−NMRは一致する。
実施例2
N4−ベンゾイル−1−{3′−O−ベンゾイル−4′−O−[(4,4′−ジメトキシトリフェニル)メチル]−β−D−リボピラノシル}シトシンの合成
最初の2′−置換、次いでの4′−置換、次いでの転移反応:
【0075】
【化19】
【0076】
全バッチを窒素雰囲気下に行った。
N4−ベンゾイル−1−(2′−O−ベンゾイル−β−D−リボピラノシル)シトシン2:
54.0g(0.155モル)のN4−ベンゾイル−1−(β−D−リボピラノシル)シトシン1をジメチルホルムアミド(DMF)830ml及びピリジン1.5リットル(両溶媒は乾燥してモレキュラーシーブ3Åで保存)に124℃に加温しながら溶解した。ピリジン210mlに溶解したBzCl23.0g(0.163モル;1.05当量)を−58℃ないし−63℃で3.5時間かけて滴下した。このバッチを冷却浴中で一夜攪拌し、n−プロパノール90.3g(1.5モル;10当量)を攪拌しながら混入しバッチを高真空で40℃で濃縮した。ピリジン残渣をトルエン150mlを2回加えることにより除去し、再度濃縮した。残渣124.3gをCH2Cl2500mlに溶解し、各回半濃縮NaHCO3溶液300mlと攪拌することにより2回抽出し、沈でんした固体をろ別し乾燥した。残渣は60.7gであった。 CH2Cl2相を濃縮した:25.0g。グラジエント(gradients)(AcOEt/イソヘキサン,4:1、次いで無水AcOEt、次いでAcOEt/MeOH,19:1−2:1)を用いたシリカゲル60(40×10cm)での分離クロマトグラフィーにより、次のものを得た(TLC(シリカゲル,AcOEt)):
2′、4′ジベンゾエート16.8g(24%)Rf0.5
12.4gの化合物1(23%)Rf0.0
35.4gの化合物2(51%)Rf0.14
N4−ベンゾイル−1−{3′−O−ベンゾイル−4′−O−[(4,4′−ジメトキシトリフェニル)メチル]−β−D−リボピラノシル}シトシン3
35.4g(78ミリモル)の化合物2をCH2Cl2390ml及びピリジン180ml(両者無水)、DMAP0.94g(7.8ミリモル;0.1当量)、N−エチルジイプロピルアミン34.6ml(203ミリモル;2.6当量)及びDMTCl33.1g(98ミリモル;1.25当量)を加え、混合物を室温で2時間攪拌した。
TLC(シリカゲル,AcOEt):Rf0.6
CH2Cl2を30℃でストリッピング(留去)し、残渣をピリジン640ml、DMAP9.37g(78ミリモル;1.0当量)、Et3N32.5ml(234ミリモル;3.0当量)、p−ニトロフェノール21.7g(156ミリモル;2.0当量)及びn−プロパノール93.8g(1.56ミリモル;20当量)で処理し、65℃で42時間攪拌した。このバッチを高真空で50℃で濃縮し、各回トルエン250mlで2回処理し、濃縮した。残渣をCH2Cl21リットルにとり、各回希釈NaHCO3溶液500mlと攪拌することにより3回抽出し、有機相をNa2SO4を用いて乾燥し濃縮した:残渣92.5g。グラジエント(メチルt−ブチルエーテル/イソヘキサン2:1−4:1、次いでメチルt−ブチルエーテル/AcOEt,1:4、次いでAcOEt/MeOH,1:1−1:3)を用いたシリカゲル60(50×10cm)でのクロマトグラフィーにより、生成物含有画分を得た。該画分をCH2Cl2/メチルt−ブチルエーテル(1:5)540mlから再結晶した。晶析物を再度CH2Cl2/メチルt−ブチルエーテル(1:1)300mlから再結晶した。
3:TLC(シリカゲル,CHCl3/i−PrOH49:1):Rf0.14次のものを得た: N4−ベンゾイル−1−{3′−O−ベンゾイル−4′−O−[(4,4′−ジメトキシトリフェニル)メチル]−β−D−リボピラノシル}シトシン330gすなわち化合物2に基づく収率51%。1H−NMRは一致する。
実施例3
N6−ベンゾイル−9−{3′−O−ベンゾイル−4′−O−[(4,4′−ジメトキシトリフェニル)メチル]−β−D−リボピラノシル}アデニンの合成
最初の2′−置換、次いでの4′−置換、次いでの転移反応
【0077】
【化20】
【0078】
9−(β−D−リボピラノシル}アデニン2:
68.37g(100ミリモル)のN6−ベンゾイル−9−(2′,3′,4′−トリ−O−ベンゾイル−β−D−リボピラノシル)アデニン1をNH3−飽和MeOH300ml中で室温で一夜攪拌し、晶析物をろ別した:23.5g(88%)の化合物2。
TLC(シリカゲル,AcOEt/MeOH2:1):Rf0.23
【0079】
【化21】
【0080】
N6,N6−ジベンゾイル−9−(β−D−リボピラノシル)アデニン3:
16.8g(62.9ミリモル)の化合物2を窒素雰囲気下に無水ピリジン500mlに懸濁させ−4℃ないし−10℃に冷却した。トリメチルクロロシラン40ml(199ミリモル;5当量)を20分かけて滴下し、混合物を冷却しながら2.5時間攪拌した。ピリジン73mlに溶解したベンゾイルクロリド36.5ml(199ミリモル;5当量)を25分かけて−10ないし−15℃で加え、冷却しながら10分間、そして室温で2時間攪拌した。(TLCチェック(シリカゲル,AcOEt/ヘプタン1:1):Rf0.5)。混合物を再度−10℃に冷却し、水(温度最大+8℃)136mlを混入させ、混合物を室温で一夜攪拌した。転化が完了した後、溶媒を留去し残渣を各回トルエン200mlに2回とり再度蒸発させた。混合物を各500mlのエーテル及び水で処理し、2時間機械的に攪拌し、両相にごくわずか溶解する生成物をろ別し、エーテル及び水で洗浄し、高真空でP2O5で乾燥した:23.8g(80%)の化合物3。
TLC(シリカゲル,AcOEt/MeOH9:1):Rf0.35
【0081】
【化22】
【0082】
N6,N6−ジベンゾイル−9−(2′−O−ベンゾイル−β−D−リボピラノシル}アデニン4:
26.4g(55.5ミリモル)の化合物3を窒素雰囲気下に無水CH2Cl2550ml及びピリジン55ml(各場合ともモレキュラーシーブに貯蔵)に溶解し、DMAP0.73g(5.55ミリモル;0.1当量)で処理し、−87ないし−90℃に冷却した。ピリジン14ml中のBzCl8.58g(61ミリモル;1.1当量)を1時間かけて滴下し、混合物を60時間(週末)にわたり−78℃で放置した。バッチを濃縮し、各回トルエン100mlで2回処理し、ピリジンを除去するために蒸発させた。グラジエント(AcOEt/ヘプタン,1:1−9:1)を用いたシリカゲル60(20×10cm)でのクロマトグラフィーにより、23.2gの化合物4を得た。
化合物4:TLC(シリカゲル,AcOEt):Rf0.34
N6−ベンゾイル−9−{3′−O−ベンゾイル−4′−O−[(4,4′−ジメトキシトリフェニル)メチル]−β−D−リボピラノシル}アデニン5
23.2g(40ミリモル)の化合物4を無水CH2Cl2160mlに溶解し、次いでDMTCl14.9g(56ミリモル;1.1当量)及びN−エチルジイソプロピルアミン17.7ml(104ミリモル;2.6当量)で処理した。室温で2時間攪拌した後、さらにDMTCl4.0g(11.8ミリモル;0.3当量)を加え、混合物をさらに40分間攪拌した。バッチを350−520ミリバール及び35℃でロタベイパー(Rotavapor)中で濃縮した。
TLC(シリカゲル,AcOEt/ヘプタン1:1):Rf0.18
残渣を無水ピリジン260mlに溶解し、次いでn−プロパノール51ml(679ミリモル;17当量)、Et3N16.6ml(120ミリモル;3当量)、p−ニトロフェノール11.1g(80ミリモル;2当量)、DMAP5.3g(44ミリモル;1.1当量)で処理し、60−63℃で23時間攪拌した。次いで、バッチを21時間室温のままとした。反応混合物をロタベイパーで濃縮した。残渣を各回トルエン200mlで2回処理し、濃縮し、CH2Cl2に溶解し、水で3回抽出した。グラジエント(AcOEt/ヘプタン,1:2−1:0;次いでAcOEt/MeOH1:0−9:1)を用いたシリカゲル60(30×10cm)でのクロマトグラフィーにより、13gの化合物5を得た。
化合物5:TLC(シリカゲル,AcOEt/ヘプタン4:1):Rf0.2
次のものを得た:13gのN6−ベンゾイル−9−{3′−O−ベンゾイル−4′−O−[(4,4′−ジメトキシトリフェニル)メチル]−β−D−リボピラノシル}アデニン5
すなわち化合物3に基づく収率30%。1H−NMRは一致する。文献から知られた方法と比べた時間節約:50%
実施例4
9−[3′−O −ベンゾイル−4′−O−[(4,4′−ジメトキシトリフェニル)メチル]−β−D−リボピラノシル}−2−O−アリル−2−N−イソブチロイルグアニンの合成
最初の3′−置換、次いでの4′−置換:
【0083】
【化23】
【0084】
9−[3′−O −ベンゾイル−β−D−リボピラノシル}−2−O−アリル−2−N−イソブチロイルグアニンB
GトリオールA393mg(1.0ミリモル)を乾燥ジクロロメタン4mlに溶解した。溶液をトリメチルオルトベンゾエート0.52ml(3.0ミリモル)及びカンファースルホン酸58mg(0.25ミリモル)で処理し、室温で15時間攪拌した。次いで、混合物を0℃に冷却し、0℃に予備冷却された、アセトニトリル、水及びトリフルオロ酢酸の混合物(50:5:1)2mlで処理した。混合物を10分間攪拌し溶媒を真空留去した。残渣を、ジクロロメタン/メタノール(100:3)を用いてシリカゲル(2.3×21cm)でのフラッシュクロマトグラフィーで精製し、4−O −ベンゾイル化合物25mg(5%)、混合画分139mg(28%)及び所望の3−O −ベンゾイル化合物B205mg(41%)を得た。
【0085】
【化24】
【0086】
9−{3′−O −ベンゾイル−4′−O−[(4,4′−ジメトキシトリフェニル)メチル]−β−D−リボピラノシル}−2−O−アリル−2−N−イソブチロイルグアニンC
ジオールB101mg(0.2ミリモル)を乾燥ジクロロメタン3.2mlに懸濁させた。懸濁液をN−エチルジイソプロピルアミン171μl(1.0ミリモル)、ピリジン320μl(3.96ミリモル)及びDMTCl102mg(0.3ミリモル)で処理し、室温で攪拌した。24時間後、さらにDMTCl102mg(0.3ミリモル)を加え、混合物を再度24時間攪拌した。次いで、それをジクロロメタン30mlで希釈した。溶液を10%濃度クエン酸水溶液20ml及び飽和重炭酸ナトリウム溶液10mlで洗浄し、MgSO4で乾燥し、真空濃縮した。残渣を、ジクロロメタン/メタノール(100:1)を用いてシリカゲル(2.3×20cm)でのフラッシュクロマトグラフィーで精製し、既知の所望生成物C39mg(24%)を得た。
実施例5
p−RNAリンカー系(linker systems)の合成
官能単位の結合のために用いられるアミノ末端を有するリンカー(linker)の用意を可能にする3つの方法を下記に示す。
5.1ウラシルベースリンカー
ウラシルの5位の変性に基づいての方法
ヒドロキシエチルウラシル28は既知の方法(J.D.Fissekis,A.Myles,G.B.Brown,J.Org.Chem.1964,29,2670)に従って大規模に製造することができる。γ−ブチロラクトン25をギ酸メチルでホルミル化し、ナトリウム塩26を反応させて尿素誘導体27を生成させ、これを環化させてヒドロキシエチルウラシル28を得た(スキーム4)。
【0087】
【化25】
【0088】
スキーム4:ヒドロキシエチルウラシル28の合成
【0089】
【化26】
【0090】
スキーム5:N−フタロイルアミノエチルウラシル32の合成
ヒドロキシエチルウラシル28をピリジン中のメタンスルホニルクロリドでメシル化し、化合物29を得た(J.D.Fissekis,F.Sweet,J.Org.Chem.1973,38,264)。
【0091】
次の段階は新規に発明されたものである:化合物29をDMF中でアジ化ナトリウムを用い反応させて、アジド30を生成させ、これをピリジン中でトリフェニルホスフィンで還元してアミノエチルウラシル31を得た。化合物31におけるアミノ基を最終的にN−エトキシカルボニルフタルイミドで保護した。リボーステトラベンゾエート33をN−フタロイルアミノエチルウラシル32でヌクレオシド化して好収率でリボーストリベンゾエート34を得た。ピラノース環のアノマー中心は、J=9.5HzのH−C(1′)とH−C(2′)との間のカップリング(結合)定数から明らかにみられるように、β配位を有する。次いで、ベンゾエート保護基をMeOH中でNaOMeで除去してリンカートリオール35を得た。化合物35をDMAPの存在下にピリジン/ジクロロメタン1:10中で−78℃でベンゾイルクロリドと反応させた。この方法で所望の2′−ベンゾエート36(64%)に加え、2′,4′−ジベンゾイル化生成物(22%)を得た。これを集め、化合物34の化合物35へのメタノーリシスに類似して再度トリオール35へ転化した。2′−ベンゾエート36を、ジクロロメタン中でヒューニッヒ塩基(Hunig′s base)の存在下にジメトキシトリチルクロリドを用いて90%を超える収率で4′位でトリチル化した。4′−DMT−2′−ベンゾエート37の4′−DMT−3′−ベンゾエート38への転移を、n−プロパノール/ピリジン5:2中で、DMAP、p−ニトロフェノール及びヒューニッヒ塩基の存在下に行った。クロマトグラフィー後、化合物38を得た。4′−DMT−3′−ベンゾエート38を最終的にヒューニッヒ塩基の存在下にClP(OAll)N(iPr)2と反応させてホスホルアミダイト39を得た(スキーム6)。これは合成プロトコル(protocol)を変更することなく自動オリゴヌクレオチド合成に用いられる。
【0092】
【化27】
【0093】
スキーム6:リンカーホスホルアミダイト39の合成
操作:
ウラシルリンカー単位の合成
5−(2−アジドエチル)ウラシル(30)
【0094】
【化28】
【0095】
1.操作
26.0g(0.11モル)の化合物29を内部温度計及び還流冷却器を備えた三ツ口フラスコ500ml中でDMF250mlに溶解し、混合物をアジ化ナトリウム10.8g(0.166モル)で処理した。次いで、懸濁液を60℃で4時間攪拌した(TLCチェック,CHCl3:MeOH(9:1))。DMFを留去し、残渣を水150mlと攪拌した。固体をろ別し、水約50mlで洗浄し、五酸化リンでデシケーター中で一夜真空で乾燥した。14.2g(71%)の化合物30をm.p.230−235℃(分解)の無色固体の状態で得た。
【0096】
2.分析データ
5−(2−アジドエチル)ウラシル(30)
【0097】
【化29】
【0098】
5−(2−アミノエチル)ウラシル(31)
【0099】
【化30】
【0100】
1.操作
14.2g(78.0ミリモル)の化合物30を内部温度計及び還流冷却器を備えた三ツ口フラスコ250ml中でピリジン175mlに懸濁させ、混合物をトリフェニルホスフィン61.4g(234ミリモル)で処理した。これを60℃で5時間加熱し、室温で一夜攪拌した(TLCチェック,CHCl3/MeOH(5:1))。懸濁液に25%濃度アンモニア溶液40mlを加え、次いで清澄化した。溶媒を回転蒸発器(ロータリーエバポレータ)中で真空で除去した。残渣をCH2Cl2/MeOH(1:1)200ml中で室温で30分間攪拌し、晶析物をろ別し、CH2Cl2で洗浄し、五酸化リンでデシケーター中で真空で乾燥したのち、m.p.214−220℃の10.0g(85%)の化合物31を得た。
【0101】
2.分析データ
5−(2−アミノエチル)ウラシル(31)
M.p.:214−220℃(ガス発生を伴う、予備シンターリング)
【0102】
【化31】
【0103】
5−(2−フタルイミドエチル)ウラシル(32)
【0104】
【化32】
【0105】
1.操作
9.6g(61.8ミリモル)の化合物31を丸底フラスコ250ml中で水100mlに懸濁させ、Na2CO36.64g(62.6ミリモル)で処理した。室温で15分間攪拌した後、N−エトキシカルボニルフタルイミド14.3g(65ミリモル)を分けて加え、混合物を室温で3時間攪拌した(TLCチェック,CHCl3/MeOH(5:1))。粘性の白色懸濁液を濃塩酸を用い注意深くpH4に調整し、白色沈殿物をろ別した。水で洗浄後、固体を五酸化リンでデシケーター中で真空で乾燥してm.p.324−327℃の16.0g(91%)の化合物32を得た。
【0106】
2.分析データ
5−(2−フタルイミドエチル)ウラシル(32):
M.p.:324−327℃(分解)
【0107】
【化33】
【0108】
1−(2,3,4−トリ−O−ベンゾイル−β−D−リボピラノシル)−5−(2−フタルイミドエチル)ウラシル(34)
【0109】
【化34】
【0110】
1.操作
7.00g(24ミリモル)の化合物32をアルゴン導入部、内部温度計及び隔膜(septum)を備えた三ツ口フラスコ250ml中でアセトニトリル120mlに懸濁させた。先ず、BSA12.2ml(50ミリモル)を、次いで30分間攪拌後、さらにBSA7ml(28ミリモル)を注入器で加えた。短時間40℃に加熱後、反応混合物を清澄化した。TMSOTf13ml(72ミリモル)を室温で注入器で加えた。1時間後、生成物の生成は観察されなかった(TLCチェック,AcOEt/n−ヘプタン(1:1))。そこで、さらにTMSOTf13ml(72ミリモル)を加えた。次いで、反応混合物を50℃に加熱した。50℃で2.5時間攪拌後(TLCチェック)、混合物を室温に冷却し、AcOEt250ml及び飽和NaHCO3溶液190mlの氷冷混合物に注ぎ、10分間攪拌することにより強力に抽出した。NaHCO3溶液100mlで再度洗浄し、水性相をAcOEt100mlで再度抽出した。希釈有機相をMgSO4を用いて乾燥し、溶媒を回転蒸発器(ロータリーエバポレータ)中で真空で除去した。オイルポンプ真空中で乾燥後、粗生成物20.9gを得た。シリカゲル(h=25cm,ψ=5cm,AcOEt/n−ヘプタン(1:1))でのクロマトグラフィーにより、 TLC均一な発泡性生成物を得た。これをエーテルを用いて温浸した。ろ過、オイルポンプ真空中で乾燥して15g(86%)の化合物34を得た。
【0111】
2.分析データ
1−(2,3,4−トリ−O−ベンゾイル−β−D−リボピラノシル)−5−(2−フタルイミドエチル)ウラシル(34):
【0112】
【化35】
【0113】
5−(2−フタルイミドエチル)−1−(β−D−リボピラノシル)ウラシル(35)
【0114】
【化36】
【0115】
1.操作
15g(20ミリモル)の化合物34を丸底フラスコ1リットル中でMeOH500mlに溶解し、NaOMe324mg(6ミリモル)で処理し、水を排除しながら室温で一夜攪拌した(TLCチェック,AcOEt/n−ヘプタン1:1)。生成懸濁液にアンバーライトIR−120をpH7未満となるまで加えた。固体を加熱下に溶解し、イオン交換体から熱時ろ別し、MeOHで洗浄した。溶媒除去後、残渣を各回水150mlを用いて2回共蒸発させて粗生成物9gを得た。これをMeOH90ml中で10分間還流下に加熱した。室温に冷却後、混合物をEt2O60mlで処理し、4℃で一夜貯蔵した。これをろ過、Et2Oで洗浄、及びオイルポンプで真空乾燥して7.8g(93%)の化合物35を得た。
【0116】
2.分析データ
5−(2−フタルイミドエチル)−1−(β−D−リボピラノシル)ウラシル(35):
M.p.:137℃(シンターリング)
【0117】
【化37】
【0118】
1−(2′−O−ベンゾイル−β−D−リボピラノシル)−5−(2−フタルイミドエチル)ウラシル
5−(2−フタルイミドエチル)−1−(β−D−リボピラノシル)ウラシル10.6g(25ミリモル)をアルゴン流下の加熱四つ口フラスコ1リットル中でピリジン20mlに溶解し、ジクロロメタン200mlと混合した。混合物を−70℃に冷却し、ピリジン5ml及びジクロロメタン20ml中のベンゾイルクロリド3.82ml(33ミリモル)を冷却しながら徐々に滴下し、混合物を−70℃で35分間攪拌した。反応混合物を冷却した塩化アンモニウム溶液600mlに注ぎ、水性相を酢酸エチルで抽出した。化合させた有機相を水洗、乾燥し、真空で濃縮乾燥した。シリカゲルでのクロマトグラフィー(酢酸エチル/ヘプタン1:1)により1−(2′−O−ベンゾイル−β−D−リボピラノシル)−5−(2−フタルイミドエチル)ウラシル7.9g(60%)を得た。
TLC:Rf0.24(酢酸エチル/ヘプタン4:1)
【0119】
【化38】
【0120】
1−(2−O−ベンゾイル−4−O−(4,4′−ジメトキシトリチル)−β−D−リボピラノシル)−5−(2−フタルイミドエチル)ウラシル
1−(2−O−ベンゾイル−β−D−リボピラノシル)−5−(2−フタルイミドエチル)ウラシル5.6g(10.73ミリモル)をジクロロメタン60mlに溶解し、4,4′−ジメトキシトリチルクロリド4.72g(13.95ミリモル)及びN−エチルジイソプロピルアミン2.4ml(13.95ミリモル)で処理し、室温で20分間攪拌した。反応混合物を ジクロロメタン100mlで希釈し、炭酸水素ナトリウム溶液及び20%クエン酸溶液で洗浄し、乾燥し、真空で濃縮乾燥した。シリカゲルでのクロマトグラフィー(酢酸エチル/ヘプタン(1:1)+2%トリエチルアミン)により1−(2−O−ベンゾイル−4−O−(4,4′−ジメトキシトリチル)−β−D−リボピラノシル)−5−(2−フタルイミドエチル)ウラシル7.7g(87%)を得た。
TLC:Rf0.53(酢酸エチル/ヘプタン(1:1)+2%トリエチルアミン)
【0121】
【化39】
【0122】
1−(3−O−ベンゾイル−4−O−(4,4′−ジメトキシトリチル)−β−D−リボピラノシル)−5−(2−フタルイミドエチル)ウラシル
1−(2−O−ベンゾイル−4−O−(4,4′−ジメトキシトリチル)−β−D−リボピラノシル)−5−(2−フタルイミドエチル)ウラシル3g(3.63ミリモル)、4−ニトロフェノール1g(7.26ミリモル)、4−(ジメチルアミノ)ピリジン0.44g(3.63ミリモル)及びN−エチルジイソプロピルアミン3.75 ml(21.78ミリモル)をイソプロパノール5.6ml及びピリジン25mlに溶解し、65℃に加熱し、65℃で3日間攪拌した。溶液を真空で濃縮乾燥し、残渣をジクロロメタン150mlに溶解した。20%クエン酸溶液及び炭酸水素ナトリウム溶液で洗浄した後、溶液を硫酸マグネシウムで乾燥した。シリカゲルでのクロマトグラフィー(酢酸エチル/ジクロロメタン/イソヘキサン2:1:1)により1−(3−O−ベンゾイル−4−O−(4,4′−ジメトキシトリチル)−β−D−リボピラノシル)−5−(2−フタルイミドエチル)ウラシル2.27g(76%)を得た。
TLC:Rf0.27(酢酸エチル/イソヘキサン(2:1)+1%トリエチルアミン)
【0123】
【化40】
【0124】
1−{2′−O−[(アリルオキシ)(ジイソプロピルアミノ)ホスフィノ]−3′−O−ベンゾイル−4′−O−[(4,4′−ジメトキシトリフェニル)メチル]−β−D−リボピラノシル}−5−(2−フタルイミドエチル)ウラシル
1−(3−O−ベンゾイル−4−O−(4,4′−ジメトキシトリチル)−β−D−リボピラノシル)−5−(2−フタルイミドエチル)ウラシル88mg(0.11ミリモル)をジクロロメタン5mlに溶解し、N−エチルジイソプロピルアミン75μl(0.44ミリモル)及びアリルオキシクロロ(ジイソプロピルアミノ)ホスフィン70μl(0.3ミリモル)で処理し、室温で3時間攪拌した。反応を完結させるためにさらにアリルオキシクロロ(ジイソプロピルアミノ)ホスフィン35μl(0.15ミリモル)を加えた後、さらに室温で1時間攪拌し、反応混合物を真空で濃縮した。シリカゲルでのクロマトグラフィー(酢酸エチル/ヘプタン:グラジエント1:2−1:1−2:1、各場合2%トリエチルアミンを用いた)により1−{2′−O−[(アリルオキシ)(ジイソプロピルアミノ)ホスフィノ]−3′−O−ベンゾイル−4′−O−[(4,4′−ジメトキシトリフェニル)メチル]−β−D−リボピラノシル}−5−(2−フタルイミドエチル)ウラシル85g(76%)を得た。
TLC:Rf0.36(酢酸エチル/ヘプタン2:1)
【0125】
【化41】
【0126】
5.2インドールベースリンカー
文献記載のように(Kuehneら ,J. Org. Chem. 43,13,1978,2733−2735)、無水フタル酸とトリプタミンからN−フタロイルトリプタミンを得た。これを(A. Giannisら,Angew.Chem.1989,101,220 に類似して)ボラン−THFで還元してインドリンを得た。
【0127】
3−置換インドリンを先ずリボースと反応させ、ヌクレオシドトリオールを得て、次いで無水酢酸と反応させてトリアセテートを得た。混合物を2,3−ジクロロ−5,6−ジシアノパラキノンで酸化し、アセテートをナトリウムメトキシドで開裂し、選択的に2′位にベンゾイル化し、選択的に4′位にDM−トリチル化し、転移反応を行わせて3′−ベンゾエートを得た。ホスホルアミダイトの生成は常法で行われた。これは合成プロトコルの変更なしに自動オリゴヌクレオチド合成に用いられる。
操作
3−(N−フタロイル−2−アミノエチル)インドリン
【0128】
【化42】
【0129】
フタロイルトリプタミンA51.4g(177ミリモル)を窒素雰囲気下に1Mボラン−THF溶液(2当量)354mlに溶解し、0℃に冷却した。トリフルオロ酢酸354mlを(ガスの発生に注意して)0℃で徐々に滴下し、混合物を30分間攪拌した(TLCチェック:EtOAc)。次いで水17.3mlを加え、混合物を10分間攪拌し真空で濃縮した。残渣を10%濃度NaOH溶液/ジクロロメタンに溶解し、有機相を分別し、Na2SO4で乾燥し、ろ過、真空で濃縮した。残渣(50.9g)を加熱エタノール(3リットル)から再結晶して化合物B41.4gを得た。m.p.161−162℃。母液を真空で濃縮し、残渣を再度エタノールから再結晶してさらに化合物B3.2gを得た。m.p.158−159℃。全収率:44.6g(153ミリモル)の化合物Bすなわち86%。
【0130】
【化43】
【0131】
3−(N−フタロイル−2−アミノエチル)−1−(2′,3′,4′−トリ−O−アセチル−β−D−リボピラノシル)インドール
【0132】
【化44】
【0133】
化合物A45.2g(155ミリモル)及びD−リボース23.2g(155ミリモル;1.0当量)を乾燥エタノール750mlに懸濁させ、窒素雰囲気下に4時間加熱還流した(TLCチェック:CH2Cl2/MeOH10:1)。室温に冷却後、混合物を真空で濃縮した。残渣をピリジン300mlに溶解し、氷冷しながら無水酢酸155mlで処理した。15分後、氷浴を除去し、混合物を室温で18時間攪拌した(TLCチェック:EtOAc/イソヘキサン1:1)。この溶液を真空で濃縮し、各回トルエン300mlで3回共蒸発した。得られた油分をジクロロメタン900mlに溶解し、氷冷しながら2,3−ジクロロ−5,6−ジシアノパラキノン38.8g(171ミリモル;1.1当量)で処理した。15分後、氷浴を除去し、混合物を室温で1.5時間攪拌した(TLCチェック:EtOAc/イソヘキサン1:1)。沈殿を吸引ろ別し、ジクロロメタンで洗浄し、捨てた。ろ液を飽和NaHCO3溶液600mlで洗浄した。この過程で析出した沈殿を再度吸引ろ別し、ジクロロメタンで洗浄し、捨てた。併せた有機抽出物をNa2SO4で乾燥し、真空で濃縮した。残渣(90.9g)をシリカゲル60でのクロマトグラフィー(10×25cm;EtOAc/イソヘキサン2:3)により精製した。次のものを得た:純粋な化合物B21.5g、混合画分は46.83gでこの新たなクロマトグラフィー処理後にさらに純粋な化合物B20.4gを得た。全収率:41.9g(76ミリモル)の化合物Bすなわち49%。
【0134】
【化45】
【0135】
3−(N−フタロイル−2−アミノエチル)−1−β−D−リボピラノシル−インドール
【0136】
【化46】
【0137】
化合物A44.1g(80ミリモル)を窒素雰囲気下に無水メタノール400mlに溶解した。混合物を氷冷しながら30%濃度ナトリウムメトキシド溶液4.0mlで処理し、次いで室温で18時間攪拌した。沈殿を吸引ろ別し、冷エタノールで洗浄した。ろ液を真空で濃縮した。残渣をジクロロメタンにとり、この溶液を飽和NaHCO3溶液で洗浄し、Na2SO4で乾燥し、真空で濃縮した。得られた残渣を反応溶液から析出した沈殿と共に加熱エタノールから再結晶させて化合物B22.6gを得た。融点196−198℃。母液を真空で濃縮し、残渣を再度エタノールから再結晶してさらに化合物B9.2gを得た。m.p.188−194℃。全収率:25.8gの化合物B,すなわち76%。
【0138】
【化47】
【0139】
1−(2′−O−ベンゾイル−β−D−リボピラノシル)−3−(N−フタロイル−2−アミノエチル)インドール
【0140】
【化48】
【0141】
化合物A10.6g(25ミリモル)を窒素雰囲気下に乾燥ジクロロメタン250mlにとり、混合物をDMAP305mg(2.5ミリモル)及びピリジン20mlで処理した。これを全てが溶液になるまで加熱し、次いで−78℃で冷却した。ジクロロメタン8mlに溶解したベンゾイルクロリド3.35ml(28.8ミリモル)を15分間かけて滴下した。さらに30分後TLCチェック(EtOAc/ヘキサン3:1)は完全な反応を示した。45分後、この冷溶液を折り畳みフィルターを通して飽和NH4Cl溶液200mlに直接加え、ろ過残渣をジクロロメタンで洗浄した。有機相を1回水洗し、MgSO4で乾燥し、濃縮した。残渣をトルエンで2回共蒸発させ、EtOAc/ヘキサン3:1を用いた10×20cmシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィーにより精製して化合物B8.1g(64%)を得た。
【0142】
【化49】
【0143】
1−{3′−O−ベンゾイル−4′−O−[(4,4′−ジメトキシトリフェニル)メチル−β−D−リボピラノシル}−3−(N−フタロイル−2−アミノエチル)インドール
【0144】
【化50】
【0145】
化合物A8.9g(16.9ミリモル)を窒素雰囲気下に乾燥ジクロロメタン135mlに懸濁させた。混合物を(完全に溶液になるまで)DMAP206mg(1.68ミリモル)、N−エチルジイソプロピルアミン5.8ml(33.7ミリモル)及びピリジン約12mlで処理した。これを34gのモレキュラーシーブ4Åで処理し、30分間攪拌した。0℃に冷却後、DMTCl11.4g(33.7ミリモル)で処理し、冷却浴を除去後、75分間攪拌した。次いで、さらにDMTClを1.94g(0.34当量)、さらに40分後1.14g(0.2当量)、及びさらに65分後1.14g(0.2当量)加えた。4.25時間後反応は完了した。次いで混合物をn−プロパノール25.3ml(20当量)で処理し、さらに30分間攪拌し、次いで注意深く(泡発生)濃縮した。残渣をピリジン100 mlに溶解し、DMAP1.85g(15.1ミリモル;0.9当量)、 N−エチルジイソプロピルアミン13.05ml(101ミリモル;6.0当量)、n−プロパノール71 ml(940ミリモル;56当量)及びp−ニトロフェノール3.74g(26.9ミリモル;1.6当量)で処理した。この混合物を窒素下に75−80℃で96時間攪拌した。室温に冷却後、混合物をセライトを通してろ過し、濃縮した。残渣を、トルエン/ジエチルエーテル/トリエチルアミン90:10:1を用いてシリカゲル(9×17cm)でのフラッシュクロマトグラフィーで精製した。生成物含有画分(9.25g)を先ずEtOAcから再結晶させ、次いでトルエン/メタノールから再沈殿させて化合物B5.86g(42%)を得た。
【0146】
【化51】
【0147】
1−{2′−O−(アリルオキシ)(ジイソプロピルアミノ)ホスフィノ−3′−O−ベンゾイル−4′−O−[(4,4′−ジメトキシトリフェニル)メチル]−β−D−リボピラノシル}−3−(N−フタロイル−2−アミノエチル)インドール
(2ジアステレオマー)
【0148】
【化52】
【0149】
アルコールA1658mg(2.0ミリモル)をアルゴン雰囲気下に乾燥ジクロロメタン10mlに溶解した。溶液をN−エチルジイソプロピルアミン1.03ml(6.0ミリモル)及びモノアリルn−ジイソプロピルクロロホスホルアミダイト0.63ml(2.8ミリモル)で処理し、室温で1時間攪拌した。次いで過剰のホスホリル化試剤をイソプロパノール61μl(0.8ミリモル)を加えて分解した。10分後、混合物を真空で濃縮し、残渣を、ヘキサン/EtOAc/NEt3(75:25:1)を用いてシリカゲル(3.3×21cm)でのフラッシュクロマトグラフィーで精製した。生成物含有画分を濃縮し、CCl4にとり、再度濃縮してほとんど無色の泡(foam)2.04g(定量的)を得た。これはオリゴマー化に直接用いられ、数週間−20℃に保持される。
シリカゲルでのTLC(EtOAc/ヘキサン/NEt333:66:1):0.41
【0150】
【化53】
【0151】
5.3リジンベースリンカー
合成はスキーム7に描写され、以下に詳述される。
【0152】
【化54】
【0153】
スキーム7:リジンリンカーの合成
6−アミノ−2(S)−ヒドロキシヘキサン酸(1)を、 L−リジンから文献(K.−I.Aketa,Chem.Pharm.Bull.1976,24,621)から知られた方法でジアゾ化及び次いでの加水分解により得た。
2−(S)−N−Fmoc−6−アミノ−1,2−ヘキサンジオール(2)
LiBH43.4g(156ミリモル,4当量)をアルゴン下に無水THF(発熱性)100mlに溶解した。約30℃に冷却後、TMSCl39.6ml(312ミリモル,8当量)を徐々に滴下し(ガス発生)、沈殿を生成させた。6−アミノ−2(S)−ヒドロキシヘキサン酸 (1)5.74g(39ミリモル)をアルゴン向流で分けて加え、混合物をTLC(シリカゲル;i−PrOH/濃NH4OH/水7:2:1;ニンヒドリンで着色)がもはや出発物質を何ら示さなくなるまで(約3時間)65℃に加熱した。混合物を氷冷しながらメタノール120mlで注意深く処理した(激しいガス発生)。溶媒を真空で濃縮し、残渣を各回メタノール200mlで3回共蒸発させ、次いで無水DMF100mに溶解した。エチルジイソプロピルアミン16ml(93.6ミリモル,2.4当量)を加えた後、混合物を0℃に冷却し、FmocCl12.1g(46.8ミリモル,1.2当量)で分けて処理した。15分後、冷浴を除去し、混合物を出発物質が消費されるまで(約3時間;TLCチェック:シリカゲル;CHCl3/MeOH/HOAc/水60:30:3:5)室温で攪拌した。反応溶液を飽和NaHCO3溶液600mlに加えた。沈殿をろ別し、水200mlで洗浄し、重量が一定になるまで(約6時間)高真空で50℃で乾燥して、無色固体13.9gを得た。これを酢酸エチル(40ml)/n−ヘキサン(35ml)から再結晶した。収率:9.05g(65%)
【0154】
【化55】
【0155】
2−(S)−N−Fmoc−O1−DMT−6−アミノ−1,2−ヘキサンジオール(3)をWO89/02439に従いDM−トリチル化した。
2−(S)−N−Fmoc−O1−DMT−O2−アリルオキシジイソプロピルアミノ−ホスフィニル−6−アミノ−1,2−ヘキサンジオール(4)
エチルジイソプロピルアミン0.51ml(3.0ミリモル、3当量)及びクロロ−N,N−ジイソプロピルアミノアリルオキシホスフィン0.33ml(1.5ミリモル,1.5当量)を無水ジクロロメタン10ml中のアルコール(3)670mg(1.02ミリモル)の溶液にアルゴン下に加えた。混合物を室温で2時間攪拌し、溶媒を真空で留去し、得られた残渣を、3.2×16cmシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィー( EtOAc/イソヘキサン/NEt320:80:1)で精製して僅かに黄色の油分839mg(97%)を得た。
TLC:シリカゲル;EtOAc/イソヘキサン/NEt350:50:1;UV; Rf0.77。
【0156】
【化56】
【0157】
実施例6
カップリング試薬としてベンズイミダゾリウムトリフレートを用いる配列(sequence)4′−インドールリンカー−A8−2′のp−RNAオリゴの合成。
【0158】
インドールリンカーホスホルアミダイト108mg及びAホスホルアミダイト244mgを合成びん(synthesizer vial)に秤量し、Aユニットを載置させたCPG担体28.1mgを充填したカラムとともにKOH上でデシケータ中に高真空で3時間放置した。ホスホルアミダイトを1ml(インドールリンカー)又は2.5ml(Aホスホルアミダイト)のアセトニトリル中に溶解し、数粒のモレキュラーシーブを加え、KOH上でデシケータ中に密閉放置した。
【0159】
ヨウ素200mgをアセトニトリル50mlに激しく攪拌しながら溶解した。全てが溶解した後(目視制御)、水23ml及びsym−コリジン4.6mlを加え、溶液を一度完全に混合させた。脱トリチル化のため、ジクロロメタン中のジクロロ酢酸の6%濃度溶液を用いた。キャッピング試薬(無水酢酸+塩基)を購入し、オリゴヌクレオチド合成に常法に従い用いた。
【0160】
ベンズイミダゾリウムトリフレートを加熱アセトニトリルから再結晶させ乾燥した。ほとんど無色の結晶を用い、無水アセトニトリル中の0.1M溶液をカップリング試薬として調製した。合成中、この溶液を常に清浄なままにし、合成器の管の閉塞を起こさせなかった。Eppendorf Ecosyn300+(DMT−one)での修飾された(modified)DNAカップリングサイクル:脱トリチル化7分、カップリング1時間、キャッピング1.5分、酸化1分。
【0161】
テトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム20mgをジクロロメタン1.5mlに溶解し、ジエチルアンモニウム重炭酸塩20mg、トリフェニルホスフィン20mg及びオリゴヌクレオチドを担持するガラス担体を加え、きつくシールし(Parafilm)、びん(vial)を室温で5時間攪拌した。次いで、ガラス担体を分析用吸引フィルターで吸引ろ別し、ジクロロメタン、アセトン及び水で洗浄した。
【0162】
担体を0.1モルのナトリウムジエチルジチオカルバメート水溶液を用いて懸濁させ、室温で45分間放置した。これを吸引ろ別し、水、アセトン、エタノール及びジクロロメタンで洗浄した。担体を24%濃度ヒドラジン水和物溶液1.5mlに懸濁させ、4℃で24−36時間振とうし、0.1モルのトリエチルアンモニウム重炭酸塩緩衝液(TEABバッファー)で 7mlに希釈した。これをWaters Sep−Pakカートリッジでヒドラジンがなくなるまで洗浄した。これを80%濃度ギ酸溶液5mlで処理し、30分後濃縮乾燥した。残渣を水10mlにとり、ジクロロメタンで抽出し、水性相を濃縮し、次いでHPLクロマトグラフィー(tR=33分,0.1Mトリエチルアンモニウム酢酸塩バッファー中のアセトニトリルのグラジエント)に付した。常法の脱塩により(Waters Sep−Pakカートリッジ)によりオリゴヌクレオチドを得た。収率:17.6OD。物質の同一性を,ESIマススペクトロスコピー:M(Calc.)=3082D,(M+2H)2+(found)=1541.9Dにより証した。
実施例7
複合体(conjugates)の製造
1.逐次法(sequential process)
先ず、配列(sequence)A8のp−RNAオリゴマーすなわちオクタマー(octamer)を実施例2に記載したようにEppendorf Ecosyn D300+上で調製し、次いで、試剤を次のとおりそれぞれ変更する:すなわち濃度2%のトリクロロ酢酸に代えて濃度6%のジクロロ酢酸を、ピリジン中のヨウ素に代えてコリジン中のヨウ素を、テトラゾール溶液に代えてベンズイミダゾリウムトリフレート溶液をそれぞれ用いる。合成プログラムを変えた後、さらに配列GATTCのDNAオリゴマーを既知の方法に従い合成する(M.J.Gait,オリゴヌクレオチド合成,IRL Press,Oxford,UK1984)。脱アリル化、ヒドラジン分解、HPLクロマトグラフィー及び脱塩をp−RNAオリゴマー用に記載されているように(上記参照)行い、所望の複合体を得る。
2.集中法(convergent process)
実施例2に記載されているように、配列4′−インドールリンカー−A8−2′をもつp−RNAオリゴマーを調製し、精製し、ヨウドアセチル化する。配列GATTC−チオールリンカーのDNAオリゴマーを既知の方法に従い合成し(M.J.Gait,オリゴヌクレオチド合成,IRL Press,Oxford,英国1984)、精製する(Glen Research:No.20−2933からの3′−チオールリンカー)。二つの断片を緩衝液中に放置すると(T.Zhu.ら,Bioconjug.Chem.1994,5,312)複合体を生じ、これを最後にHPLCで精製する。
実施例8
ビオチン基のアミノ変性p−RNAへの複合
先ず、実施例6に記載された方法に類似して、Eurogentec [2−(2−(4−(モノメトキシトリチル)アミノエトキシ)エチル2−シアノエチル (N,N−ジイソプロピル)ホスホルアミダイト)]の5′−アミノ変性剤5の手段で4′−末端にアミノ基を具備させた、配列TAGGCAATのp−RNAオリゴマーを合成した。オリゴヌクレオチド(17.04OD,0.175μmol)を塩基性バッファー0.5mlにとり、ビオチン−N−ヒドロキシスクシンイミドエステル1.14mg(2.5μmol)を無水DMF114μlに溶解し、溶液を室温で1時間放置した。生成した複合体を予備(preparative)HPLCで精製し、純粋な生成物をSepakを用いて脱塩した。収率:8.6OD(49%)。M(calc.)=3080D,M(fef)=3080.4D。
実施例9
シアニン又はビオチン−標識p−RNAオンライン(online)製造
先ず、種々のA,T,G,C及びInd(Ind=核酸塩基としてのアミノエチルインドール)ホスホルアミダイトを既知の方法により製造した。シアニン(Cy3−CE)及びビオチンホスホルアミダイトをGlen Researchから得た。
【0163】
完全自動固相合成を各場合15μmolを用いて行った。1合成サイクルは次の工程からなる。
(a)脱トリチル化: CH2Cl2(79ml)中6%DCA(ジクロロ酢酸)で5分;
(b) CH2Cl2(20ml)、アセトニトリル(20ml)で洗浄及び次いでのアルゴンでのフラッシング(flushing);
(c)カップリング:活性化剤での樹脂の洗浄( CH2Cl20.2ml中の0.5MピリジンHCl);活性化剤(0.76ml)及び相当するホスホルアミダイト(0.76ml:8当量;アセトニトリル中0.1M)の比1:1での30分処理;
(d)キャッピング:Perseptiveからの50%CapA(10.5ml)及び50%CapB(10.5ml)(CapA:THF、ルチジン、無水酢酸;CapB:1−メチルイミダゾール、THF、ピリジン)で2分
(e)酸化:ヨウ素溶液(アセトニトリル100ml、水46ml及びsym−コリジン9.2ml中のヨウ素400mg)120mlで1分;
(f)アセトニトリル(22ml)で洗浄。
【0164】
引き続いてのオリゴヌクレオチドのHPLC精製を容易にするために、最後のDMT(ジメトキシトリチル)又はMMT(モノメトキシトリチル)保護基をビオチン又はシアニンモノマーからは除去しなかった。最後のカップリングの変性ホスホルアミダイトでの検出は合成後にUV(503nm)でのトリチルカチオン吸収の手段で樹脂の1%で実施される。
オリゴヌクレオチドの作製(work−up):
アリルエーテル保護基を、CH2Cl2(15ml)中のテトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(272mg)、トリフェニルホスフィン(272mg)及びジエチルアンモニウム重炭酸塩の溶液で室温で5時間処理して除去した。次いで、ガラス担体をCH2Cl2(30ml)、アセトン(30ml)及び水(30ml)で洗浄した。パラジウム錯体残渣を除去するために、樹脂を0.1Mナトリウムジエチルジチオカルバメート水和物水溶液でリンスした。上述の洗浄操作を反対の順でもう一度行った。次いで、樹脂を高真空で10分乾燥した。同時に脱ベンゾイル化を伴うガラス担体からの除去工程を24%ヒドラジン水和物溶液(6ml)中4℃で行った。RP18上でのHPLCチェッキング(18−25時間)後、オリゴヌクレオチド「Trityl ON」を、活性化された(アセトニトリル、20ml)Waters Sep−Pak Cartridgeでヒドラジンから取り除いた。ヒドラジンをTEAB0.1M(30ml)で洗浄した。次いで、オリゴヌクレオチドをアセトニトリル/TEAB0.1M(10ml)で溶出した。次いで、混合物をHPLC(断片配列の分離用)で精製し、DMT脱保護(80%濃度水性ギ酸30ml)を行った。最後に脱塩して(TEABバッファー0.1M/アセトニトリル:1/1を用いたSep−Pak Cartridgeで)、純粋なシアニン−又はビオチン−標識オリゴマーを得た。このオリゴ溶液の一部(アリコート)をESI−MSを行うために用いた。4′Cy−AIndTTCCTA2′:M=3026、(M+H)+=3027。4′ビオチン−TAGGAAIndT2′:M=3014、(M+H)2+m/e1508及び(M+H)+m/e 3015。
オリゴ体(Oligos)を貯蔵のため凍結乾燥した。
実施例10
p−RNAのN−(ヨードアセチルオキシ)−スクシンイミドでのヨードアセチル化
p−RNA配列:4′AGGCAIndT2′Mw=2266.56g/モル(Ind=インドール−CH2−CH2−NH2−リンカー
p−RNA1当量を0.1モル重炭酸ナトリウム溶液(pH8.4)に溶解し(350nmol当たり1ml)、DMSO中のN−(ヨードアセチルオキシ)スクシンイミド溶液で処理した(mg当たり40μl)。バッチをAlフィルムで暗くし(blacked out)、室温で30−90分放置した。
【0165】
反応の進行を分析用HPLCで監視した。標準条件は次のとおりである。
バッファーA;水での0.1モルのトリエチルアンモニウム酢酸塩バッファー
バッファーB;水:アセトニトリル(1:4)での0.1モルのトリエチルアンモニウム酢酸塩バッファー
グラジエント:10%Bから出発して40分で50%Bへ
カラム材:Merck Darmstadt GmbH製の、10μMのLiChrosphere(登録商標)100RP−18;250×4mm
出発物質の保持時間:18.4分
この場合の生成物の保持時間:23.1分
反応が完了した後、バッチを水で4倍容に希釈した。Waters Sep−Pak Cartridge RP−18(15 OD 2gのパッキングから)を2×10mlのアセトニトリル及び2×10mlの水で活性化し、オリゴを適用し、埋入させ(sink in)、塩及び試剤を除去するために反応容器を2×10mlの水で洗浄し、3×10mlの水で再洗浄し、先ず5×1mlの水:アセトニトリル(50:1)、次いで水:アセトニトリル(1:1)で溶出した。生成物を非常に良い純度で1:1画分で溶出した。画分は冷却して暗所で濃縮し、併せ、再度濃縮した。収率をUV吸収分光計で260nmで決定した。質量分析:
配列:4′AGGCAInd(CH2CH2NHCOCH2−I)T2′
算出(calculated)質量:2434.50g/モル
質量MH2 2+:2433g/モル
実施例11
p−RNAの配列CYSKVGのペプチドへの複合
ヨードアセチル化p−RNA(Mw=2434.50g/モル)をバッファー系に溶解し(114nmol当たり1000μl)、次いでバッファーでのペプチド溶液(2モルのCYSKVGペプチド; Mw=655.773g/モル;バッファー20μl中の228nmol)で処理した。
バッファー系:Riedel−de Haen製のBorax/HClバッファー(pH8.0)を、10ミリモルのEDTAジナトリウム塩の水溶液と1:1比で混合し、HClを用いpH6.3に調整した。このようにして5mMのNa2EDTAを含む溶液を得た。
【0166】
バッチを転化が完了するまで室温で暗所に放置した。反応をHPLC分析で監視した。標準条件は次のとおりである。
バッファーA;水での0.1モルのトリエチルアンモニウム酢酸塩バッファー
バッファーB;水:アセトニトリル(1:4)での0.1モルのトリエチルアンモニウム酢酸塩バッファー
グラジエント:10%Bから出発して40分で50%Bへ
カラム材:Merck Darmstadt GmbH製の、10μMのLiChrosphere(登録商標)100RP−18;250×4mm
出発物質の保持時間:17.6分
生成物の保持時間:15.5分
反応が完了した後、バッチをRP−HPLCで直接精製した。(標準条件は上記参照)。
【0167】
画分は冷却して暗所で濃縮し、併せ、再度濃縮した。残渣を水にとり、脱塩した。Waters Sep−Pak Cartridge RP−18(15 OD 2gのパッキングから)を2×10mlのアセトニトリル及び2×10mlの水で活性化し、オリゴを適用し、埋入させ、塩を除去するために反応容器を2×10mlの水で洗浄し、3×10mlの水で再洗浄し、水:アセトニトリル(1:1)で溶出した。生成物画分は濃縮し、併せ、再度濃縮した。収率をUV吸収分光計で260nmで決定した。それは理論値の70−95%に達した。
質量分析:
配列:4′AGGCAInd(CH2CH2NHCOCH2−CYSKVG)T2′
算出(calculated)質量:2962.36g/モル
質量MH2 2+:2962g/モル
実施例12
p−RNAのペプチドライブラリへの複合
ヨードアセチル化p−RNA(Mw=2434.50g/モル)をバッファー系に溶解し(832nmol当たり1300μl)、次いでペプチドライブラリ(CKR−XX−OH;X=Arg、Asn、Glu、His、Leu、Lys、Phe、Ser、Trp、Tyr)溶液でバッファー[8モル;平均分子質量Mm=677.82g/モル;バッファー200μmol中の4.5mg(6.66μmol)]中で処理した。
バッファー系:Riedel−de Haen製のBorax/HClバッファー(pH8.0)を、10ミリモルのEDTAジナトリウム塩の水溶液と1:1比で混合し、HClを用いpH6.6に調整した。このようにして5mMのNa2EDTAを含む溶液を得た。バッチを転化が完了するまで室温で暗所に放置した。反応をHPLC分析で監視した。この場合、出発物質は70時間後に消失した。分析用HPLCの標準条件は次のとおりである。
バッファーA;水での0.1モルのトリエチルアンモニウム酢酸塩バッファー
バッファーB;水:アセトニトリル(1:4)での0.1モルのトリエチルアンモニウム酢酸塩バッファー
グラジエント:10%Bから出発して40分で50%Bへ
カラム材:Merck Darmstadt GmbH製の、10μMのLiChrosphere(登録商標)100RP−18;250×4mm
出発物質の保持時間:18.8分
生成物の保持時間:13.9−36.2分から数個のピーク
反応が完了した後、バッチを水を用い4倍容に希釈した。Waters Sep−Pak Cartridge RP−18(15 OD 2gのパッキングから)を3×10mlのアセトニトリル及び3×10mlの水で活性化し、オリゴを適用し、埋入させ、反応容器を2×10mlの水で再洗浄し、塩及び過剰のペプチドを除去するためにカートリッジを3×10mlの水で再洗浄し、生成物がもはやUV分光計で溶出されなくなるまで水:アセトニトリル(1:1)で溶出した。画分は冷却して暗所で濃縮し、併せ、再度濃縮した。
【図面の簡単な説明】
【図1】 天然に産生する形態(左)及びp−NA(右)の形態のRNAの構造の断面を示す。
【図2】 Eschenmoserら(1993)によるp−リボ(A,U)オリゴヌクレオチドの合成を図式的に示す。
【図3】 固体担体上の固定化認識構造(アレイ)の配列を図式的に示す。
Claims (24)
- 下記の式(I)又は式(II)のペントピラノシルヌクレオシド:
式(I)
R1はH、OH、Hal(ここでHalはBr又はClである)、又は
R2、R3及びR4はそれぞれ互いに独立して同一であるか又は異なって、H、Hal(ここでHalはBr又はClである)、NR5R6、OR7、SR8、=O、CnH2n+1(ここでnは1〜12の整数である)、式−OCH2CH2R18のβ−脱離性基(ここでR18はシアノ基、p−ニトロフェニル基、又はフルオレニルメチルオキシカルボニル(Fmoc)基である)、又は(CnH2n)NR10R11(ここでR10R11はH、CnH2n+1である)、又は式
R5、R6、R7及びR8はそれぞれ互いに独立して同一であるか又は異なって、H、CnH2n+1又はCnH2n−1(ここでnは上記の意味をもつ)、又は−C(O)R9(ここでR9は直鎖状又は分枝状の、置換されていてもよいアルキル又はアリール基である)であり、
X、Y及びZはそれぞれ互いに独立して同一であるか又は異なって、=N−、=C(R16)−又は−N(R17)−(ここでR16及びR17はそれぞれ互いに独立して同一であるか又は異なって、H、又は上記の意味をもつCnH2n+1又は(CnH2n)NR10R11である)であり、そして
Sc1及びSc2はそれぞれ互いに独立して同一であるか又は異なって、アシル、トリチル又はアリルオキシカルボニル基から選ばれた保護基である};
式(II)
R1’はH、OH、Hal(ここでHalはBr又はClである)、又は
R2’、R3’及びR4’はそれぞれ互いに独立して同一であるか又は異なって、H、Hal(ここでHalはBr又はClである)、=O、CnH2n+1、CnH2n−1、式−OCH2CH2R18のβ−脱離性基(ここでR18はシアノ基、p−ニトロフェニル基、フルオレニルメチルオキシカルボニル(Fmoc)基である)、又は(CnH2n)NR10’R11’(ここでR10’、R11’はそれぞれ独立して上記のR10又はR11の意味をもつ)であり、
X’は、=N−、=C(R16’)−又は−N(R17’)−(ここでR16’及びR17’はそれぞれ独立して上記のR16又はR17の意味をもつ)であり、そして
Sc1’及びSc2’は上記のSc1及びSc2の意味をもつ}
を製造する方法であって、未保護ペントピラノシド部分を有するリボ−、アラビノ−、リキソー及び/又はキシロ−ピラノシルヌクレオシドから出発して、(a)第1の工程で、ペントピラノシドの2’、3’又は4’−位を先ず保護し、(b)第2の工程で、残りの2’、3’又は4’−位のうち1カ所を保護することを特徴とする、前記製造方法。 - ペントピラノシルヌクレオシドがリボピラノシルヌクレオシドであることを特徴とする、請求項1記載の方法。
- ペントピラノシルヌクレオシドのペントピラノシル部がD又はL配置であることを特徴とする、請求項1又は2のいずれか1項記載の方法。
- 用いられるペントピラノシルヌクレオシドが、ペントピラノシル−プリン、−2,6−ジアミノプリン、−6−プリンチオール、−ピリジン、−ピリミジン、−アデノシン、−グアノシン、−イソグアノシン、−6−チオグアノシン、−キサンチン、−ヒポキサンチン、−チミジン、−シトシン、−イソシトシン、−インドール、−トリプタミン、−N−フタロイルトリプタミン、−ウラシル、−カフェイン、−テオブロミン、−テオフィリン、−ベンゾトリアゾール又は−アクリジンであることを特徴とする、請求項1〜3のいずれか1項記載の方法。
- R2、R3、R4、R2’、R3’及び/又はR4’が2−フタルイミドエチル又はアリルオキシ基又は式−N[C(O)R9]2の基であることを特徴とする、請求項1〜4のいずれか1項記載の方法。
- ペントピラノシルヌクレオシドが、[(2’,4’−ジ−O−ベンゾイル)−β−リボピラノシル]ヌクレオシド、N−ベンゾイル−2’,4’−ジ−O−ベンゾイルリボピラノシルヌクレオシド、N−イソブチロイル−2’,4’−ジ−O−ベンゾイルリボピラノシルヌクレオシド、O6−(2−シアノエチル)−N2−イソブチロイル−2’,4’−ジ−O−ベンゾイルリボピラノシルヌクレオシド、O6−(2−(4−ニトロフェニル)エチル)−N2−イソブチロイル−2’,4’−ジ−O−ベンゾイルリボピラノシルヌクレオシド、β−リボピラノシルヌクレオシド、N−ベンゾイル−、N−イソブチロイル−、O6−(2−シアノエチル)−若しくはO6−(2−(4−ニトロフェニル)エチル)−N2−イソブチロイル−β−リボピラノシルヌクレオシド;4’−DMT−ペントピラノシルヌクレオシド、N−ベンゾイル−4’−DMT−リボピラノシルヌクレオシド、N−イソブチロイル−4’−DMT−リボピラノシルヌクレオシド、O6−(2−シアノエチル)−N2−イソブチロイル−4’−DMT−リボピラノシルヌクレオシド、O6−(2−(4−ニトロフェニル)エチル)−N2−イソブチロイル−4’−DMT−リボピラノシルヌクレオシド、又はβ−リボピラノシル−N,N’−ジベンゾイルアデノシン;又はβ−リボピラノシル−N,N’−ジベンゾイルグアノシンであることを特徴とする、請求項1〜4のいずれか1項記載の方法。
- 2’−保護位の場合に、保護基の転位が2’−位から3’−位へ行われることを特徴とする、請求項1〜6のいずれか1項記載の方法。
- 転位がN−エチルジイソプロピルアミン及び/又はトリエチルアミンの存在下に行われることを特徴とする、請求項7記載の方法。
- Sc1及びSc1’がSc2及びSc2’と異なることを特徴とする、請求項1〜8のいずれか1項記載の方法。
- 保護基Sc1、Sc2、Sc1’又はSc2’が、アシル基、ベンゾイル、ニトロベンゾイル及び/又はメトキシベンゾイル基、トリチル基から選択されることを特徴とする、請求項1〜9のいずれか1項記載の方法。
- 2’−又は3’−位が、塩基に不安定であるか、又は金属接触で除去されうる保護基、で保護されていることを特徴とする、請求項1〜10のいずれか1項記載の方法。
- 4’−位が、酸又は塩基に不安定である保護基で保護されていることを特徴とする、請求項1〜11のいずれか1項記載の方法。
- 反応が、結果として保護基が選択的に導入されるような低い温度で行われることを特徴とする、請求項1〜12のいずれか1項記載の方法。
- (a)保護された核酸塩基を保護されたペントピラノースと反応させ、(b)工程(a)からの生成物のペントピラノシル部位から保護基を除去し、(c)工程(b)からの生成物を請求項1〜13のいずれか1項記載の方法に従い反応させることを特徴とする、ペントピラノシルヌクレオシドの製造方法。
- 保護されたペントピラノースがアノマーとして純粋であることを特徴とする、請求項14記載の方法。
- (a)式(II)[ここで、R4’は(CnH2n)OSc3又は(CnH2n)Hal(ここで、nは上記の意味をもち、Sc3は保護基であり、Halは塩素又は臭素である)である]の化合物をアジドと反応させ、(b)(a)からの反応生成物を還元し、(c)(b)からの反応生成物を適当なフタルイミドと反応させ、(d)(c)の生成物のペントピラノシル部分の保護基を除去し、そして、(f)請求項1〜13のいずれか1項記載の工程を実施することを特徴とする、式(II)[ここで、R4’は(CnH2n)NR10’R11’であり、R10’R11’は式(III)の基を介して請求項1に定義した意味に結合されている]によるペントピラノシルヌクレオシドリンカーの製造のための請求項14記載の方法。
- (a)適当なインドリンをピラノースと反応させてヌクレオシドトリオールを生成させ、(b)(a)からの生成物のピラノシル部位のヒドロキシル基をアシル基で保護し、(c)(b)からの生成物を酸化し、(d)(c)からの生成物のピラノシル部位のヒドロキシル保護基を除去し、(e)請求項1〜13のいずれか1項記載の工程を実施することを特徴とする、式(I)[ここでX及びYはそれぞれ互いに独立して同一であるか又は異なって、=C(R16)(ここでR16はH又はCnH2nである)であり、Zは=C(R16)−(ここでR16は請求項1に定義した意味をもつ(CnH2n)NR10R11である)である]によるペントピラノシルヌクレオシドリンカーの製造のための請求項14記載の方法。
- 4’−保護ペントピラノシルヌクレオシドをさらなる工程でホスフィチル化し、あるいは固相に結合させることを特徴とする、請求項1〜17のいずれか1項記載の方法。
- (a)第1工程で、請求項1〜18のいずれか1項記載の方法により製造された、保護されたペントピラノシルヌクレオシドを固相に結合させ、(b)第2工程で工程(a)により固相に結合された3’−,4’−保護ペントピラノシルヌクレオシドを4’−位で脱保護し、ホスフィチル化3’−,4’−保護ペントピラノシルヌクレオシドにより伸長させ、そして、(c)工程(b)を繰り返すことを特徴とする、ペントピラノシル核酸の製造方法。
- 工程(a)及び/又は工程(b)でペントフラノシルヌクレオシドもまた併合されることを特徴とする、請求項19記載の方法。
- 工程(b)による伸長のために用いられるカップリング試薬が、ホスホルアミダイトを用いる場合にはピリジニウム塩酸塩の酸性活性化剤であり、H−ホスホネートを用いる場合には、アリールスルホニルクロリド、ジフェニルクロロホスホネート、ピバロイルクロリド又はアダマントイルクロリドであることを特徴とする、請求項19又は20記載の方法。
- さらなる工程(d)において、保護基及び形成されたオリゴマーを固相から除去することを特徴とする、請求項19〜21のいずれか1項記載の方法。
- ヒドラジン分解での除去が塩の存在下に行われることを特徴とする請求項22記載の方法。
- さらなる工程で、式:
Sc4NH(CnH2n)CH(OPSc5Sc6)CnH2nSc7 (IV)
(式中、Sc4及びSc7はそれぞれ互いに独立して同一であるか又は異なって、Fmoc及び/又はDMTから選ばれた保護基であり、Sc5及びSc6はそれぞれ互いに独立して同一であるか又は異なって、アリルオキシ及び/又はジイソプロピルアミノ基であり、nは請求項1に規定されたとおりのものである)のアリルオキシリンカーが併合されることを特徴とする、請求項19〜23のいずれか1項記載の方法。
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