KR100571299B1 - 펜토피라노실 뉴클레오시드 및 이의 제조방법 - Google Patents

펜토피라노실 뉴클레오시드 및 이의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 화학식 I 또는 화학식 II의 펜토피라노실뉴클레오시드, 이의 제조방법, 및 치료제, 진단제 및/또는 전자 성분의 제조를 위한 이의 용도에 관한 것이다.
화학식 I
Figure 112003034478968-pct00036
화학식 II
Figure 112003034478968-pct00037
펜토피라노실뉴클레오시드, 펜토피라노실핵산, 리보피라노실뉴클레오시드, 치료제, 진단제, 전자 성분

Description

펜토피라노실 뉴클레오시드 및 이의 제조방법{Pentopyranosyl nucleoside, and production of the same}
본 발명은 하기 화학식 I 또는 화학식 II의 펜토피라노실뉴클레오시드, 이의 제조방법, 및 치료제, 진단제 및/또는 전자 성분의 제조를 위한 이의 용도에 관한 것이다.
Figure 112000005480674-pct00001
Figure 112000005480674-pct00002
피라노실핵산(p-NA)은 일반적으로 천연 RNA에 대한 이성체인 구조적 형태이며, 여기서, 펜토스 단위는 피라노스 형태로 존재하고, C-2'과 C-4' 위치 사이의 포스포디에스테르 그룹에 의해 반복적으로 결합된다(도 1). "핵염기(nucleobase)"는 본원에서 표준 핵염기 A, T, U, C, G 뿐만 아니라, 이소구아닌/이소시토신 및 2,6-디아미노퓨린/크산틴 쌍 및 본 발명의 의미내에서, 또한 다른 퓨린 및 피리미딘을 의미하는 것으로 이해한다. p-NA, 즉 리보스로부터 유도된 p-RNA는 에쉔모서(Eschenmoser) 등[참조: Pitsch, S. et al., Helv. Chim. Acta 1993, 76, 2161; Pitsch, S. et al., Helv. Chim. Acta 1995, 78, 1621; Angew. Chem. 1996, 108, 1619-1623]에 의해 최초로 기재되었다. 이는 오로지 소위 왓슨-크릭 짝형성된(Watson-Crick-paired), 즉 퓨린-피리미딘- 및 퓨린-퓨린-짝형성된, 반평행의, 가역적으로 "용융하는", 안정한 준선형 이중구조(duplex)를 형성한다. 반대 센스의 키랄성 호모키랄 p-RNA 스트랜드 또한 조절 가능하게 짝을 이루고, 형성된 이중구조에서 정확히 비나선형이다. 초분자 단위의 구성에 유용한 이러한 특수성은 리보피라노스 포스페이트 골격의 비교적 낮은 가요성, 및 스트랜드 축에 대한 염기 평면의 큰 경사 및 이로부터 발생하는 생성된 이중구조의 연쇄내 염기 스택킹 경향과 관련되고, 최종적으로는 골격의 구성에 2',4'-시스-이치환 리보피라노스 환을 참여시킬 수 있다. 이러한 현저히 우수한 짝형성 특성은 p-NA 짝형성 시스템이 초분자 단위의 구성에 사용하기 위한 DNA 및 RNA와 비교하여 바람직한 시스템이 되도록 한다. 이는 천연 핵산에 직교하는 짝형성 시스템을 형성하며, 즉 이는 천연 DNA 및 RNA와 짝을 형성하지 않으며, 이는 특히, 진단 분야에서 중요하다.
에쉔모서 등(1993, 상기 문헌 참조)은 도 2에 제시되고 하기에 기술되는 바와 같이, 최초로 p-RNA를 제조하였다.
이러한 맥락에서, 적합한 보호 핵염기는 비스(트리메틸실릴)아세트아미드 및 루이스산(예: 트리메틸실릴 트리플루오로메탄설포네이트)의 작용에 의해 테트라벤조일리보피라노스의 아노머(anomer) 혼합물과 반응시킨다[참조: 문헌(H. Vorbruggen, K. Krolikiewicz, B. Bennua, Chem. Ber. 1981, 114, 1234)과 유사함]. 염기(퓨린의 경우, THF/메탄올/물 중의 NaOH; 피리미딘의 경우 MeOH 중의 포화 암모니아)의 작용하에, 아실 보호 그룹이 당으로부터 제거되고, 생성물이 산성 촉매 작용하에 3',4'-위치에서 p-아니스알데히드 디메틸 아세탈로 보호한다. 디아스테레오머 혼합물이 2'-위치에서 아실화하고, 3',4'-메톡시벤질리덴 보호된 2'-벤조에이트는 산성 처리에 의해, 예를 들면, 메탄올 중의 트리플루오로아세트산으로 탈아세탈화시키고, 디메톡시트리틸 클로라이드와 반응시킨다. 벤조에이트의 2'→3' 이동은 p-니트로페놀/4-(디메틸아미노)피리딘/트리에틸아민/피리딘/n-프로판올로 처리하여 개시한다. 거의 모든 반응은 칼럼 크로마토그래피로 후처리한다. 그 다음에, 이 방법으로 합성되는 주요 단위인, 리보피라노스의 4'-DMT-3'-벤조일-1'-핵염기 유도체는 부분적으로 포스피틸화시키고, 결합제(linker)를 통하여 고체 상에 결합시킨다.
다음의 자동화 올리고뉴클레오티드 합성에 있어서, 4'-위치의 담체 결합된 성분은 반복적으로 산성적으로 탈보호시키고, 포스포르아미다이트는 커플링제, 예 를 들면, 테트라졸 유도체의 작용하에 커플링시키며, 여전히 유리된 4'-산소원자는 아세틸화시키고, 인원자는 산화시켜 올리고머 생성물을 수득한다. 이어서, 잔류 보호 그룹을 제거하고, 생성물을 HPLC에 의해 정제하여 탈염시킨다.
그러나, 에쉔모서 등의 기술된 방법(1993, 상기 문헌 참조)은 다음의 단점을 나타낸다:
1. 핵염기와의 뉴클레오시드화 반응에 대해 비아노머적으로 순수한 테트라벤조일펜토피라노스를 사용하면[참조: H.G. Fletcher, J. Am. Chem. Soc. 1955, 77, 5337] 후속의 작업 단계에서 엄격한 크로마토그래피 커트가 필요하므로 최종 생성물의 수율을 감소시킨다.
2. 1'-위치에 핵염기를 갖는 리보피라노스로부터 출발하여 보호된 3'-벤조에이트까지 5개의 반응 단계로, 합성은 매우 오래 걸리고, 공업적 규모로 수행하는 것은 거의 불가능하다. 많은 시간 소모 이외에도, 수득된 단량체 단위의 수율은 낮다: 퓨린 단위 아데닌의 경우 29%, 피리미딘 단위 우라실의 경우 24%.
3. 올리고뉴클레오티드의 합성에 있어서, 5-(4-니트로페닐)-1H-테트라졸을 자동화 p-RNA 합성에서 커플링제로서 사용한다. 아세토니트릴 중의 테트라졸 용액 중의 이 시약의 농도는 이 경우에 너무 높아서, 5-(4-니트로페닐)-1H-테트라졸은 합성기의 얇은 관에서 규칙적으로 결정화되고, 따라서 합성은 조기에 종결된다. 더욱이, 올리고머가 5-(4-니트로페닐)-1H-테트라졸로 오염되는 것이 관찰되었다.
4. p-RNA 올리고뉴클레오티드의 기술된 후처리, 특히 하이드라진 용액으로 염기 불안정한 보호 그룹을 제거하는 것은 올리고머 중의 높은 티미딘 분획이 존재 하는 경우에 항상 가능한 것은 아니다.
따라서, 본 발명의 목적은 유용한 신규 펜토피라노실뉴클레오시드와, 공지된 방법보다 대규모로 펜토피라노실뉴클레오시드를 제조할 수 있도록 하고 상기 기술된 단점이 제거될 수 있는 이의 제조방법을 제공하는 것이다.
따라서, 본 발명의 하나의 목적은 하기 화학식 I 또는 화학식 II의 펜토피라노실뉴클레오시드이다.
화학식 I
Figure 112000005480674-pct00003
화학식 II
Figure 112000005480674-pct00004
위의 화학식 I 및 II에서,
R1은 H, OH, Hal(여기서, Hal은 Br 또는 Cl이다), 또는
Figure 112005053617663-pct00005
및 -O-P[N(i-Pr)2]-(OCH2CH2CN)으로부터 선택된 라디칼(여기서, i-Pr은 이소프로필이다)이고,
R2, R3 및 R4는 서로 독립적으로 동일하거나 상이하고, 각각의 경우, H, Hal(여기서, Hal은 Br 또는 Cl이다), NR5R6, OR7, SR8[여기서, R5, R6, R7 및 R8은 서로 독립적으로 동일하거나 상이하고, 각각의 경우, H, CnH2n+1, CnH2n-1(여기서, n은 아래에서 정의하는 바와 같다) 또는 -C(O)R9(여기서, R9는 임의로 치환된 직쇄 또는 측쇄 알킬 또는 아릴 라디칼, 바람직하게는 페닐 라디칼이다)이다], =O, CnH2n+1(여기서, n은 1 내지 12, 바람직하게는 1 내지 8, 특히 1 내지 4의 정수이다), β-제거 가능한 그룹, 바람직하게는 화학식 -OCH2CH2R18의 그룹(여기서, R18은 시아노 또는 p-니트로페닐 라디칼이거나, 플루오레닐메틸옥시카보닐(Fmoc) 라디칼이다), 또는 화학식(CnH2n)NR10R11의 그룹(여기서, R10R11은 H, CnH2n+1 또는 하기 화학식 III의 라디칼을 통하여 결합된 R10R11이다)이고,
X, Y 및 Z는 서로 독립적으로 동일하거나 상이하고, 각각의 경우, =N-, =C(R16)- 또는 -N(R17)-(여기서, R16 및 R17은 서로 독립적으로 동일하거나 상이하고, 각각의 경우, H 또는 위에서 정의한 바와 같은 CnH2n+1 또는 (CnH2n)NR10R11이다)이고,
Sc1 및 Sc2는 서로 독립적으로 동일하거나 상이하고, 각각의 경우, H, 또는 아실, 트리틸 및 알릴옥시카보닐 그룹으로부터 선택된 보호 그룹, 바람직하게는 벤조일 또는 4,4'-디메톡시트리틸(DMT) 그룹이고,
R1'는 H, OH, Hal(여기서, Hal은 Br 또는 Cl이다), 또는
Figure 112005053617663-pct00006
및 -O-P[N(i-Pr)2]-(OCH2CH2CN)으로부터 선택된 라디칼(여기서, i-Pr은 이소프로필이다)이고,
R2', R3' 및 R4'는 서로 독립적으로 동일하거나 상이하고, 각각의 경우, H, Hal(여기서, Hal은 Br 또는 Cl이다), =O, CnH2n+1, CnH2n-1, β-제거 가능한 그룹, 바람직하게는 화학식 -OCH2CH2R18의 그룹(여기서, R18은 시아노 또는 p-니트로페닐 라디칼이거나, 플루오레닐메틸옥시카보닐(Fmoc) 라디칼이다), 또는 화학식 (CnH2n)NR10'R11'의 그룹(여기서, R10' 및 R11'는 서로 독립적으로 R10 또는 R11에 대해 위에서 정의한 바와 같다)이고,
X'는, 각각의 경우, =N-, =C(R16')- 또는 -N(R17')-(여기서, R16' 및 R17'는 서로 독립적으로 R16 또는 R17에 대해 위에서 정의한 바와 같다)이며,
Sc1' 및 Sc2'는 4'-DMT-3'-벤조일리보피라노실-N-벤조일아데노신, N6,N6-디벤조일-9-(2'-O-벤조일-β-D-리보피라노실)아데노신, 리보피라노실-N-벤조일아데노신, 4'-DMT-3'-벤조일리보피라노실우라실 및 리보피라노실우라실을 제외한 SC1 및 SC2에 대해 위에서 정의한 바와 같다.
Figure 112000005480674-pct00007
위의 화학식 III에서,
R12, R13, R14 및 R15는 서로 독립적으로 동일하거나 상이하고, 각각의 경우, H, OR7(여기서, R7은 위에서 정의한 바와 같다), CnH2n+1 또는 CnH2n-1(여기서, n은 위에서 정의한 바와 같다)이다.
본 발명에 따르는 펜토피라노실뉴클레오시드는 일반적으로 리보-, 아라비노-, 리크소- 및/또는 크실로피라노실뉴클레오시드, 바람직하게는 리보피라노실뉴클레오시드이며, 여기서 펜토피라노실 잔기는 D 배위 뿐만 아니라, L 배위일 수 있다.
통상, 본 발명에 따르는 펜토피라노실뉴클레오시드는 펜토피라노실퓨린, - 2,6-디아미노퓨린, -6-퓨린에티올, -피리딘, -피리미딘, -아데노신, -구아노신, -이소구아노신, -6-티오구아노신, -크산틴, -하이포크산틴, -티미딘, -시토신, -이소시토신, -인돌, -트립타민, -N-프탈로일트립타민, -우라실, -카페인, -테오브롬, -테오필린, -벤조트리아졸 또는 -아크리딘, 특히 펜토피라노실퓨린, -피리미딘, -아데노신, -구아노신, -티미딘, -시토신, -트립타민, -N-프탈로트립타민 또는 -우라실이다.
본 발명에 따르는 화합물은 또한 결합제로서, 즉 생체 분자, 예를 들면, 이들의 천연 핵산 또는 개질된 핵산(예: DNA, RNA 뿐만 아니라, p-NA, 바람직하게는 pRNA)에 공유결합될 수 있는 작용성 그룹을 갖는 화합물로서 사용될 수 있는 펜토피라노실뉴클레오시드를 포함한다. 이는 p-NA에 대해 아직까지 어떠한 결합제도 공지되지 않았기 때문에 놀라운 것이다.
예를 들면, 이들은 R2, R3, R4, R2' R3' 및/또는 R4'이 2-프탈이미도에틸 또는 알릴옥시 라디칼인 펜토피라노실뉴클레오시드를 포함한다. 본 발명에 따르는 바람직한 결합제는, 예를 들면, 우라실의 5-위치가 바람직하게는 개질된 우라실계 결합제(예: N-프탈로일아미노에틸우라실) 뿐만 아니라, 인돌계 결합제, 바람직하게는 트립타민 유도체(예: N-프탈로일트립타민)이다.
놀랍게도, 본 발명에 의해 보다 용이하게 취급할 수 있는 펜토피라노실-N,N-디아실뉴클레오시드, 바람직하게는 퓨린, 특히 아데노신, 구아노신 또는 6-티오구아노신이 또한 이용가능하게 되었으며, 이의 핵염기는 간단한 방법으로 완전히 탈보호시킬 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 R2, R3, R4, R2', R3' 및/또는 R4'이 화학식 -N[C(O)R9]2의 라디칼, 특히 N6,N6-디벤조일-9-(β-D-리보피라노실)아데노신인 본 발명에 따르는 펜토피라노실뉴클레오시드를 포함한다.
더욱이, 놀랍게도 본 발명은 보호 그룹, 바람직하게는 염기 또는 금속 촉매 작용에 의해 제거될 수 있는 보호 그룹, 특히 아실 그룹, 특히 바람직하게는 벤조일 그룹을 오로지 펜토피라노시드 잔기의 3'-산소원자에만 갖는 펜토피라노실뉴클레오시드를 이용 가능하게 한다. 이들 화합물은, 예를 들면, 추가의 보호 그룹, 바람직하게는 산- 또는 염기 불안정한 보호 그룹, 특히 트리틸 그룹, 특히 바람직하게는 디메톡시트리틸 그룹을 펜토피라노시드 잔기의 4'-산소원자로 수율을 감소시키는 부가의 단계, 예를 들면, 부가의 정제 단계 없이 직접 도입시키기 위한 출발 물질로서 사용된다.
더욱이, 본 발명은 보호 그룹, 바람직하게는 산- 또는 염기 불안정한 보호 그룹, 특히 트리틸 그룹, 특히 바람직하게는 디메톡시트리틸 그룹을 오로지 펜토피라노시드 잔기의 4'-산소원자에만 갖는 펜토피라노실뉴클레오시드를 이용 가능하게 한다. 이들 화합물은, 예를 들면, 추가의 보호 그룹, 바람직하게는 염기 또는 금속 촉매 작용에 의해 제거될 수 있는 보호 그룹, 특히 아실 그룹, 특히 바람직하게는 벤조일 그룹을, 예를 들면, 펜토피라노시드 잔기의 2'-산소원자로 수율을 감소시키는 부가의 단계, 예를 들면, 부가의 정제 단계 없이 직접 도입시키기 위한 출발 물질로서도 작용한다.
일반적으로, 본 발명에 따르는 펜토피라노시드뉴클레오시드는 이른바 원-포트(one-pot) 반응으로 반응시킬 수 있으며, 이는 수율을 증가시키므로 특히 유용하다.
하기의 화합물은 본 발명에 따르는 펜토피라노실뉴클레오시드의 바람직한 예이다.
(A) [2',4'-디-O-벤조일)-β-리보피라노실]뉴클레오시드, 특히 [2',4'-디-O-벤조일-β-리보피라노실]-아데닌, -구아닌, -시토신, -티미딘, -우라실, -크산틴 또는 -하이포크산틴 및 N-벤조일-2',4'-디-O-벤조일리보피라노실뉴클레오시드, 특히 -아데닌, -구아닌 또는 -시토신 및 N-이소부티로일-2',4'-디-O-벤조일리보피라노실뉴클레오시드, 특히 -아데닌, -구아닌 또는 -시토신 및 O6-(2-시아노에틸)-N2-이소부티로일-2',4'-디-O-벤조일리보피라노실뉴클레오시드, 특히 -구아닌 및 O6-(2-(4-니트로페닐)에틸)-N2-이소부티로일-2',4'-디-O-벤조일리보피라노실뉴클레오시드, 특히 -구아닌.
(B) β-리보피라노실뉴클레오시드, 특히 β-리보피라노실아데닌, -구아닌, -시토신, -티미딘 또는 -우라실, -크산틴 또는 하이포크산틴 및 N-벤조일-, N-이소부티로일-, O6-(2-시아노에틸)- 또는 O6-(2-(4-니트로페닐)에틸)-N2-이소부티로일-β-리보피라노실뉴클레오시드.
(C) 4'-DMT-펜토피라노실뉴클레오시드, 바람직하게는 4'-DMT-리보피라노실뉴 클레오시드, 특히 4'-DMT-리보피라노실아데닌, -구아닌, -시토신, -티미딘, -우라실, -크산틴 또는 -하이포크산틴 및 N-벤조일-4'-DMT-리보피라노실뉴클레오시드, 특히 N-벤조일-4'-DMT-리보피라노실아데닌, -구아닌 또는 -시토신, 및 N-이소부티로일-4'-DMT-리보피라노실뉴클레오시드, 특히 N-이소부티로일-4'-DMT-리보피라노실아데닌, -구아닌 또는 -시토신 및 O6-(2-시아노에틸)-N2-이소부티로일-4'-DMT-리보피라노실뉴클레오시드, 특히 O6-(2-시아노에틸)-N2-이소부티로일-4'-DMT-리보피라노실구아닌, 및 O6-(2-(-4-니트로페닐)에틸)-N2-이소부티로일-4'-DMT-리보피라노실뉴클레오시드, 특히 O6-(2-(-4-니트로페닐)에틸)-N2-이소부티로일-4'-DMT-리보피라노실구아닌.
(D) β-리보피라노실-N,N'-디벤조일아데노신 또는 β-리보피라노실-N,N'-디벤조일구아노신.
올리고뉴클레오티드 합성에 적합한 전구체는, 예를 들면, 4'-DMT-펜토피라노실뉴클레오시드-2'-포스피타미드/-H-포스포네이트, 바람직하게는 4'-DMT-리보피라노실뉴클레오시드-2'-포스피타미드/-H-포스포네이트, 특히 4'-DMT-리보피라노실아데닌-, -구아닌-, -시토신-, -티미딘-, -크산틴- 또는 하이포크산틴- 또는 -우라실-2'-포스피타미드/-H-포스포네이트 및 N-벤조일-4'-DMT-리보피라노실아데닌-, -구아닌- 또는 -시토신-2'-포스피타미드/-H-포스포네이트 및 N-이소부티로일-4'- DMT-리보피라노실아데닌-, -구아닌-, 또는 -시토신-2'-포스피타미드/-H-포스포네이트, O6-(2-시아노에틸)-4'-DMT-리보피라노실구아닌-, -크산틴-, -하이포크산틴-2'-포스피타미드/-H-포스포네이트 또는 O6-(2-(4-니트로페닐)에틸)-N2-이소부티로일-4'-DMT-리보피라노실구아닌, 및 고형 담체에 대한 커플링을 위해서는, 예를 들면, 4'-DMT-펜토피라노실뉴클레오시드-2'-석시네이트, 바람직하게는 4'-DMT-리보피라노실뉴클레오시드-2'-석시네이트, 특히 4'-DMT-리보피라노실아데닌-, -구아닌-, -시토신-, -티미딘-, -크산틴-, -하이포크산틴- 또는 -우라실-2'-석시네이트 및 N-벤조일-4'-DMT-리보피라노실아데닌-, -구아닌- 또는 -시토신-2'-석시네이트 및 N-이소부티로일-4'-DMT-리보피라노실아데닌-, -구아닌- 또는 -시토신-2'-석시네이트, O-(2-시아노에틸)-4'-DMT-리보피라노실구아닌-, -크산틴- 또는 -하이포크산틴-2'-석시네이트 및 O6-(2-(4-니트로페닐)에틸)-N2-이소부티로일-4'-DMT-리보피라노실구아닌-2'-석시네이트이다.
본 발명의 추가의 목적은 보호되지 않은 펜토피라노시드로부터 출발하여,
(a) 제1 단계에서 펜토피라노시드의 2'-, 3'- 또는 4'-위치를 우선 보호하고, 바람직하게는
(b) 제2 단계에서 다른 2'-, 3'- 또는 4'-위치를 보호하는, 본 발명에 따르는 화학식 I 또는 화학식 II의 펜토피라노실뉴클레오시드의 제조방법이다.
본 발명에 따르는 방법은 인용 문헌에 기술된 핵염기로 제한되지는 않지만, 놀랍게도 다량의 천연 및 합성 핵염기를 사용하여 성공적으로 수행할 수 있다. 더욱이, 특히 놀랍게도 본 발명에 따르는 방법은 문헌에 공지된 방법에 비하여 높은 수율로, 평균 60%의 시간을 절감하여 수행할 수 있으며, 이는 특히 공업적 용도에 유용하다. 또한, 본 발명에 따르는 방법을 사용하면 문헌에 기술된 공정에 필요한 정제 단계, 예를 들면, 크로마토그래피 중간 정제가 필요치 않고, 반응은 어떤 경우에는 이른바 원-포트 반응으로서 수행할 수 있으며, 이는 공간/시간 수율을 현저히 증가시킨다.
특별한 양태에 있어서, 2'-보호된 위치의 경우 2'-위치로부터 3'-위치로의 보호 그룹의 재배열이 발생하고, 이는 일반적으로 염기의 존재하에, 특히 N-에틸디이소프로필아민 및/또는 트리에틸아민의 존재하에 수행한다. 본 발명에 따라, 이 반응은 원-포트 반응으로서 동일한 반응 용기에서 특히 유리하게 수행할 수 있다.
다른 바람직한 양태에 있어서, 피라노실뉴클레오시드는 산 불안정하고 염기 불안정하거나, 금속 촉매 작용에 의해 제거될 수 있는 보호 그룹 Sc1, Sc2, Sc1' 또는 Sc2'에 의해 보호되며, 보호 그룹 Sc1 및 Sc1'는 바람직하게는 보호 그룹 Sc2 및 Sc2'과 상이하다.
일반적으로, 언급되는 보호 그룹은 아실 그룹, 바람직하게는 아세틸, 벤조일, 니트로벤조일 및/또는 메톡시벤조일 그룹, 트리틸 그룹, 바람직하게는 4,4'-디메톡시트리틸(DMT) 그룹 또는 β-제거 가능한 그룹, 바람직하게는 화학식 -OCH2CH2R18의 그룹[여기서, R18은 시아노 또는 p-니트로페닐 라디칼이거나, 플루오레닐메틸옥시카보닐(Fmoc) 그룹이다]이다.
2'- 또는 3'-위치가 염기 불안정하거나 금속 촉매 작용에 의해 제거될 수 있는 보호 그룹, 바람직하게는 아실 그룹에 의해, 특히 아세틸, 벤조일, 니트로벤조일 및/또는 메톡시벤조일 그룹에 의해 보호되고/되거나, 4'-위치가 산- 또는 염기 불안정한 보호 그룹에 의해, 바람직하게는 트리틸 및/또는 Fmoc 그룹에 의해, 특히 DMT 그룹에 의해 보호되는 경우가 특히 바람직하다.
문헌에 공지된 방법과는 달리, 본 발명에 따르는 방법은 결과적으로 아세탈 보호 그룹(예: 아세탈 또는 케탈)없이 수행되며, 이로 인하여 추가의 크로마토그래피 중간 정제를 피할 수 있고, 결과적으로 반응을 놀랍게도 높은 공간/시간 수율로 원-포트 반응으로서 수행하도록 할 수 있다.
언급된 보호 그룹은 바람직하게는 저온에서 도입되며, 이 방법에 의해 이들은 놀랍게도 선택적으로 도입될 수 있다.
따라서, 예를 들면, 벤조일 그룹의 도입은 저온에서 피리딘 또는 피리딘/메틸렌 클로라이드 혼합물 중의 벤조일 클로라이드와의 반응에 의해 발생한다. DMT 그룹은, 예를 들면, 염기[예: N-에틸디이소프로필아민(휘니그(Hunig)의 염기)] 및, 예를 들면, 피리딘, 메틸렌 클로라이드 또는 피리딘/메틸렌 클로라이드 혼합물의 존재하에 실온에서 DMTCl과 반응시켜 도입시킬 수 있다.
임의로 수행되는 아실화 및/또는 2'-위치에서 3'-위치로의 재배열 후에, 반응 생성물을 크로마토그래피로 정제하는 경우도 또한 유용하다. 트리틸화 후의 정제는 본 발명에 따르는 방법에 따라 필요치않고, 이는 특히 유용하다.
경우에 따라, 최종 생성물은 추가로 결정화에 의해 추가 정제할 수 있다.
본 발명의 다른 목적은,
(a) 보호된 핵염기를 보호 리보피라노스와 반응시키고,
(b) 단계(a)로부터의 생성물의 리보피라노실 잔기로부터 보호 그룹을 제거하며,
(c) 단계(b)의 생성물을 보다 상세히 상기 기술된 방법에 따라 반응시키는, 리보피라노실뉴클레오시드의 제조방법이다.
이와 관련하여, 추가의 시간- 및 물질-소모적인 크로마토그래피 단계를 피하기 위하여, 아노머적으로 순수한 보호 펜토피라노스, 예를 들면, 테트라벤조일펜토피라노스, 바람직하게는 β-테트라벤조일리보피라노스를 사용하기만 하는 것이 유리하다[참조: R. Jeanloz, J. Am. Chem. Soc. 1948, 70, 4052].
추가의 양태에서, R4'이 (CnH2n)NR10'R11'이고 R10'R11'이 이미 나타낸 의미를 갖는 화학식 III의 라디칼에 의해서 결합되는 화학식 II에 따르는 결합제는 다음 공정으로 유리하게 제조한다:
(a) R4'이 (CnH2n)OSc3 또는 (CnH2n)Hal(여기서 n은 위에서 정의한 바와 같고, Sc3은 보호 그룹, 바람직하게는 메실레이트 그룹이고, Hal은 염소 또는 브롬이다)인 화학식 II의 화합물을 아지드와, 바람직하게는 DMF 중에서 반응시킨 다음,
(b) (a)로부터의 반응 생성물을 바람직하게는 트리페닐포스핀을 사용하여, 예를 들면, 피리딘 중에서 환원시키고, 이어서
(c) (b)로부터의 반응 생성물을 적합한 프탈이미드, 예를 들면 N-에톡시카보닐프탈이미드와 반응시키고,
(d) (c)로부터의 반응 생성물을 적합한 보호 피라노스, 예를 들면, 리보스 테트라벤조에이트와 반응시키고, 최종적으로
(e) 보호 그룹을, 예를 들면, 메틸레이트를 사용하여 제거한 다음,
(f) 추가의 단계를 위에서 이미 기술된 바와 같이 수행한다.
또한, 결합제로서의 인돌 유도체는 형광력의 이점을 갖고 있으며, 따라서 매우 소량의 물질의 검출에 관여될 수 있는 나노기술 용도에 특히 바람직하다. 따라서 인돌-1-리보시드는 이미 문헌[참조: N.N. Suvorov et al., Biol. Aktivn. Soedin., Akad. Nauk SSSR 1965, 60 and Tetrahedron 1967, 23, 4653]에 기재되어 있다. 그러나, 3-치환된 유도체를 제조하기 위한 유사한 방법은 없다. 일반적으로, 이들은 동물의 비보호된 당 성분과 인돌을 형성한 다음, 산화에 의해 인돌-1-리보시드로 전환시키는 공정을 통하여 제조한다. 예를 들면, 3-치환된 유도체가 통상적으로 빌스마이어(Vielsmeier) 반응에 의해 제조되는, 인돌-1-글루코시드 및 -1-아라비노시드가 기재되어 있다[참조: Y.V. Dobriynin et al., Khim.-Farm Zh. 1978, 12, 33]. 그러나, 아미노에틸 단위를 인돌의 3-위치로 도입시키는 이 방법은 공업용으로는 너무 복잡하다.
따라서, 다른 바람직한 양태로, X 및 Y가 서로 독립적으로 동일하거나 상이하고, 각각의 경우, =C(R16)(여기서, R16은 H 또는 CnH2n이다)이고 Z가 =C(R16)-(여기서, R16은 (CnH2n)NR10R11이다)인, 화학식 I에 따르는 결합제가 다음 공정에 의해 유리하게 제조된다:
(a) 적합한 인돌, 예를 들면, N-프탈로일트립타민을 피라노스, 예를 들면, D-리보스와 반응시켜 뉴클레오시드 트리올을 수득한 다음,
(b) (a)로부터의 생성물의 피라노실 잔기의 하이드록실 그룹을 바람직하게는 아실 그룹으로, 예를 들어, 아세트산 무수물로 보호시킨 다음,
(c) (b)로부터의 생성물을, 예를 들면, 2,3-디클로로-5,6-디시아노파라퀴논으로 산화시키고,
(d) (c)로부터의 생성물의 피라노스 잔기의 하이드록실 보호 그룹을, 예를 들면, 메틸레이트로 제거한 다음, 최종적으로,
(e) 상기에서 이미 기술된 바와 같은 추가의 단계를 수행한다.
그러나, 이 공정은 리보피라노스의 경우에 사용할 수 있을 뿐만 아니라, 리보푸라노스 및 2'-데옥시리보푸라노스 또는 2'-데옥시리보피라노스의 경우에도 사용할 수 있어, 특히 유리하다. 사용된 당의 뉴클레오시드화 파트너는 바람직하게는 트립타민, 특히 트립타민의 N-아실 유도체, 특히 N-프탈로일트립타민이다.
추가의 양태에서, 4'-보호된, 바람직하게는 3',4'-보호된 펜토피라노실뉴클레오시드를 추가 단계에서 포스피틸화시키거나 고체상에 결합시킨다.
포스피틸화는, 예를 들면, 염기(예: N-에틸디이소프로필아민)의 존재하에서 모노알릴 N-디이소프로필클로로포스포르아미다이트에 의해 또는 사염화인 및 이미다졸 또는 테트라졸에 의해 수행하고, 이어서 염기를 부가하여 가수분해시킨다. 첫번째 경우, 생성물은 포스포르아미다이트이고, 두번째 경우에는 H-포스포네이트이다. 본 발명에 따르는 보호된 펜토피라노실뉴클레오시드를 고체상, 예를 들면, "장쇄 알킬아미노-조절된 기공 유리"(CPG, Sigma Chemie, Munich)에 결합시키는 것은, 예를 들면, 에쉔모서 등의 문헌(1993)에 기재한 바와 같이 수행할 수 있다.
수득한 화합물은, 예를 들면, 펜토피라노실핵산의 제조용으로 제공된다.
따라서, 본 발명의 추가의 목적은 다음과 같은 단계들을 갖는, 펜토피라노실핵산의 제조방법이다:
(a) 제1 단계에서 보호 펜토피라노실뉴클레오시드를 상기에서 이미 기술된 바와 같은 고체상에 결합시키고,
(b) 제2 단계에서 단계(a)에 따르는 고체상에 결합된 3'-, 4'-보호 펜토피라노실뉴클레오시드를 포스피틸화 3'-, 4'-보호 펜토피라노실뉴클레오시드에 의해 연장시킨 다음, 예를 들면, 요오드 수용액으로 산화시키고,
(c) 동일하거나 상이한 포스피틸화 3'-, 4'-보호 펜토피라노실뉴클레오시드를 사용하여 목적하는 펜토피라노실핵산이 존재할 때까지, 단계(b)를 반복한다.
피리디늄 하이드로클로라이드, 특히 벤즈이미다졸륨 트리플레이트와 같은 산성 활성화제는 포스포르아미다이트가 바람직하게는 아세토니트릴 중에서 재결정화시킨 후 및 아세토니트릴 중에 용해시킨 후 사용되는 경우에 커플링제로서 적합하며, 커플링제로서 5-(4-니트로페닐)-1H-테트라졸과는 대조적으로 커플링제 라인의 차단 및 생성물의 오염이 발생하지 않는다.
아릴설포닐 클로라이드, 디페닐클로로포스페이트, 피발로일 클로라이드 또는 아다만토일 클로라이드는 H-포스포네이트가 사용되는 경우에 커플링제로서 특히 적합하다.
또한, 염화나트륨과 같은 염을 올리고뉴클레오티드, 특히 p-NA, 바람직하게는 p-RNA의 보호 그룹-제거 가하이드라진 분해에 첨가함으로써, 피리미딘 염기, 특히 우라실 및 티민을, 올리고뉴클레오티드를 파괴시키는 개환 반응으로부터 보호하는 것이 유리하다. 알릴옥시 그룹은, 예를 들면, 가하이드라진 분해 전에, 팔라듐 [Pd(O)] 착체에 의해 제거하는 것이 바람직할 수 있다.
추가의 특정 양태로, 천연 펜토푸라노실뉴클레오시드, 예를 들면, 아데노신, 구아노신, 시티딘, 티미딘 및/또는 우라실을 또한 단계(a) 및/또는 단계(b)에 포함시킬 수 있는데, 이는, 예를 들면, 혼합된 p-NA-DNA 또는 p-NA-RNA로 유도된다.
또 다른 특정 양태로, 추가 단계에서 화학식 IV의 알릴옥시 결합제를 혼입시킬 수 있다.
Sc4NH(CnH2n)CH(OPSc5Sc6)CnH2nSc7
위의 화학식 IV에서,
Sc4 및 Sc7은 서로 독립적으로 동일하거나 상이하고, 각각의 경우, 특히, Fmoc 및/또는 DMT로부터 선택된 보호 그룹이고,
Sc5 및 Sc6은 서로 독립적으로 동일하거나 상이하고, 각각의 경우, 알릴옥시 및/또는 디이소프로필아미노 그룹이며,
n은 위에서 정의한 바와 같다.
특히 바람직한 알릴옥시 결합제는 (2-(S)-N-Fmoc-O1-DMT-O2-알릴옥시디이소프로필아미노포스피닐-6-아미노-1,2-헥산디올)이다.
예를 들면, 리신으로부터 출발하여, 수개의 반응 단계에서 활성화가능한 인 화합물 및 DMT와 같은 산-불안정한 보호 그룹을 둘다 포함하는 아미노-말단 결합제를 합성할 수 있으며, 따라서 자동화 올리고뉴클레오티드 합성에 용이하게 사용할 수 있다[참조: 예를 들면, P.S. Nelson et al., Nucleic Acid Res. 1989, 17, 7179; L.J. Arnold et al., 국제 공개특허공보 제WO 89/02439호]. 상기 목적은 인 원자상의 다른 통상의 시아노에틸 그룹 대신, 알릴옥시 그룹이 도입되어, 노요리 올리고뉴클레오티드법[참조: R. Noyori, J. Am. Chem. Soc. 1990, 112, 1691-6]에서 유리하게 이용될 수 있는, 리신계 결합제에 의해 본 발명에서 연장된다.
그러므로, 본 발명의 추가의 목적은 또한 본 발명에 따르는 하나 이상의 펜토피라노실뉴클레오시드 및 경우에 따라, 하나 이상의 알릴옥시 결합제를 함유하는 펜토피라노실핵산이다.
p-NA 및 특히 p-RNA는 서로 안정한 이중구조를 형성하며, 일반적으로 천연 DNA 및 RNA와 짝을 형성하지 않는다. 이러한 특성은 p-NA를 바람직한 짝형성 시스템이 되도록 한다.
이러한 짝형성 시스템은 비-공유결합성 상호작용의 초분자 시스템으로, 이는 선택성, 안정성 및 가역성으로 구별되며, 이의 특성은 열역학적으로, 즉 온도, pH 및 농도에 의해 바람직하게 영향받는다. 이러한 짝형성 시스템은 또한, 예를 들면, "분자 접착제"로서의 이들의 선택적인 특성 때문에 사용하여 상이한 금속 덩어리와 함께 잠재적으로 신규한 특성을 갖는 덩어리 부수물을 제공할 수 있다[참조: R.L. Letsinger et al., Nature 1996, 382, 607-9; P.G. Schultz et al., Nature 1996, 382,, 609-11]. 결과적으로, p-NA는 또한 나노기술 분야, 예를 들면, 신규한 물질, 진단제 및 치료제와, 마이크로일렉트로닉, 광자 또는 광전자 성분의 제조, 및 분자종을 함께 조절되게 결합시켜 예를 들면, 단백질 회합체의 (조합적) 합성을 위한 초분자 단위를 제공하는데 적합한데[참조: A. Lombardi, J.W. Bryson, W.F. DeGrado, Biomolekuls (Pept. Sci.) 1997, 40, 495-504], 이는 pNA가 강력하고 열역학적으로 조절가능한 짝형성 시스템을 형성하기 때문이다. 따라서, 추가의 적용은 특히 단백질 또는 DNA/RNA 부분과 같은, 작용성, 바람직하게는 생물학적 단위에, 천연 핵산을 방해하지않는 p-NA 코드를 제공할 수 있는 가능성으로 인하여 진단 및 약제 발견 분야에서 발생한다[참조: WO 제93/20242호].
따라서, 본 발명의 또 다른 목적은 약제, 예를 들면, 치료제, 진단제 및/또는 전자 성분을 제조하기 위한 본 발명에 따르는 화학식 I 또는 화학식 II의 펜토피라노실뉴클레오시드 또는 본 발명에 따르는 펜토피라노실핵산의 용도에 관한 것이다.
생체 분자, 예를 들면, DNA 또는 RNA는 두 개의 생체 분자가 서로 수소 브릿지의 형성에 의해 핵염기의 상보적 서열의 결과로서 결합할 수 있는 부분을 함유하는 경우 또 다른 생체 분자, 예를 들면, DNA 또는 RNA와 비공유결합시키는데 사용될 수 있다. 이러한 유형의 생체 분자는, 예를 들면, 시그널 증폭용 분석 시스템에서 사용되며, 여기서 서열이 분석될 DNA 분자는 한편으로는 고체 지지체상에 비-공유결합성 DNA 결합제에 의해 고정화되어야 하고, 다른 한편으로는 시그널-증폭 측쇄 DNA 분자(bDNA)에 결합되어야 한다[참조: S. Urdea, Biol/Technol. 1994, 12, 926 또는 미국 특허 제5,624,802호]. 최종적으로 기술된 시스템의 주요 단점은 현재까지 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의한 핵산 진단용 공정에 대한 이들의 감도에 의존한다는 것이다[참조: K. Mullis, Methods Enzymol. 1987, 155, 335]. 이는 특히, 분석할 DNA 분자에 대한 고체 지지체의 비-공유결합성 결합 뿐만아니라 분석할 DNA 분자의 비-공유결합성 결합이, 항상 명확하게 발생하는 것은 아니며, 그 결과 "서열 인식" 및 "비-공유 결합" 기능의 혼합이 발생된다는 사실에 기인한다. DNA 또는 RNA 짝형성 공정에 방해가 되지 않는 직교 짝형성 시스템으로서 p-NA를 사용함으로써 상기 문제점이 유리하게 해결되며, 그 결과 기술된 분석 공정의 감도가 현저히 증가될 수 있다.
따라서, 본 발명의 추가의 목적은 본 발명에 따르는 화학식 I 또는 화학식 II의 펜토피라노실뉴클레오시드 또는 본 발명에 따르는 펜토피라노실핵산 및 생체 분자를 포함하는 접합체를 제조하기 위한 본 발명에 따르는 화학식 I 또는 화학식 II의 펜토피라노실뉴클레오시드, 또는 본 발명에 따르는 펜토피라노실핵산의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 의미내에서 접합체는 p-NA 및 다른 생체 분자, 바람직하게는 펩티드, 단백질 또는 핵산, 예를 들면, 이들의 항체 또는 작용성 잔기 또는 천연 DNA 및/또는 RNA의 공유결합된 혼성체이다. 항체의 작용성 잔기는, 예를 들면, Fv 단편[참조: Skerra & Pluckthun (1988) Science 240, 1038], 단일쇄 Fv 단편[참조: scFv; Bird et al., (1988), Science 242, 423; Huston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85, 5879] 또는 Fab 단편[참조: Better et al., (1988) Science 240, 1041]이다.
본 발명의 의미내에서 생체 분자는 천연 발생 물질 또는 이로부터 유도되는 물질을 의미하는 것으로 이해한다.
바람직한 양태에서, 이들은 이 경우 p-RNA/DNA 또는 p-RNA/RNA 접합체이다.
접합체는 "서열 인식" 및 "비-공유 결합" 기능이, 본 발명에 따르는 접합체가 서로 직교인 2개의 짝형성 시스템을 함유하기 때문에, 1개의 분자에서 실현되어야 할 경우 바람직하게 사용된다.
순차적 방법 및 집중적 방법 둘다 접합체의 제조에 적합하다.
순차적 방법에서는, 예를 들면, p-RNA 올리고머의 자동 합성을 동일한 합성기에서 직접 수행한 후 - 시약 및 커플링 프로토콜을 재조정한 후- 예를 들면, DNA 올리고뉴클레오티드를 추가로 합성한다. 이 방법은 역순으로도 수행할 수 있다.
집중적 방법에서는, 예를 들면, 아미노-말단 결합제를 갖는 p-RNA 올리고머, 예를 들면, 티올 결합제를 갖는 DNA 올리고머를 개별적인 공정으로 합성한다. 이후, p-RNA 올리고머의 요오도아세틸화 및 문헌[참조: T. Zhu et al., Bioconjug. Chem. 1994, 5, 312]으로부터 공지된 프로토콜에 따르는 2개의 단위의 커플링 단계를 수행하는 것이 바람직하다.
집중적 공정이, 이들의 가요성면에서 특히 바람직한 것으로 증명되었다.
본 발명의 의미내에서 용어 접합체는, 또한 이른바 배열체(array)를 의미하는 것으로 이해된다. 배열체는 특히 분석 및 진단에 있어서, 분석물의 동시 결정에서 중요한 역할을 하는 고정화된 인식종의 배열이다. 예로서, 펩티드 배열체[참조: Fodor et al., Nature 1993, 364, 555] 및 핵산 배열체[참조: Southern et al., Genomics 1992, 13, 1008; Heller, 미국 특허 제5,632,957호]가 있다. 이들 배열체의 고도의 가요성은 인식종을 코드화 올리고뉴클레오티드에 결합시키고, 연합된, 상보적인 스트랜드를 고형 담체상의 특정 위치에 결합시킴으로써 성취될 수 있다. 코드화 인식종을 "안티-코드화" 고체 담체에 적용하고 하이브리드화 조건을 조절함으로써, 인식종이 목적하는 위치에 비-공유결합된다. 그 결과, 다양한 유형의 인식종, 예를 들면, DNA 부분, 항체가 하이브리드화 조건을 사용함으로써 고형 담체상에 동시에 배열될 수 있다(도 3 참조). 그러나, 이에 대한 필요 조건으로서, 가능한 한 짧은 코드화 부분을 유지하기 위해서- 극히 강하고 선택적이며 천연 핵산을 방해하지 않는 코돈 및 안티코돈이 필수적이다. p-NA, 바람직하게는 p-RNA가 이에 특히 유리하게 적합하다.
본 발명의 의미내에서 용어 "담체"는 고체 또는 젤라틴 형태로 존재하는 물질, 특히 칩 물질을 의미하는 것으로 이해한다. 적합한 담체 물질의 예로는 세라믹, 금속, 특히 귀금속, 유리, 플라스틱, 결정상 물질 또는 박막의 담체, 특히 상기 언급한 물질 또는 박막의 담체, 특히 상기 언급한 물질 또는, 셀룰로스와 같은 (생체)분자 필라멘트, 구조적 단백질이 있다.
따라서, 본 발명은, 또한, 특히 항체 또는 항체의 작용성 잔기에서 인식종, 바람직하게는 천연 DNA 또는 RNA 스트랜드 또는 단백질을 코드화하기 위한 본 발명에 따르는 펜토피라노실핵산, 바람직하게는 리보피라보실핵산의 용도에 관한 것이다. 이어서, 이들은 도 3에 따라, 고형 담체 상에서 적합한 코돈을 사용하여 하이브리드화시킬 수 있다. 따라서, 신규하고 진단적으로 유용한 배열체는 단지 항상 신규한 인식종의 조합을 사용하는 하이브리드화 조건을 조절함으로써만 배열체의 형태의 코돈이 갖춰진 고체 담체상의 목적하는 위치에 항상 생성될 수 있다. 이어서, 분석물, 예를 들면, 생물학적 샘플(예: 혈청 등)을 적용시키는 경우에, 검출할 종은 특정 패턴으로 배열체에 결합된 다음, 간접적으로(예: 인식종의 형광 표지에 의해) 또는 직접적으로(예: 코돈의 결합점에서 임피던스 측정에 의해) 기록된다. 그 다음에, 하이브리드화는 적합한 조건(온도, 염, 용매, 전기 영동법)에 의해 제거함으로써 코돈을 갖는 담체만이 다시 잔류하도록 한다. 이어서, 이를 다시 다른 인식종에 가중하고, 예를 들면, 또 다른 샘플의 측정을 위한 동일한 분석물에 사용한다. 배열체 포맷에서 인식종의 항상 신규한 배열 및 짝형성 시스템으로서 p-NA의 사용이 다른 시스템에 비하여 특히 유용하다[참조: WO 제96/13522호](하기의 16 참조).
따라서, 본 발명의 추가의 목적은, 또한 상기에서 이미 상세하게 설명된 바와 같이, 상기 기술된 펜토피라노실뉴클레오시드 또는 본 발명에 따르는 접합체를 포함하는 진단제에 관한 것이다.
다음 도면 및 실시예는 본 발명을 제한하지 않고, 더욱 상세하게 설명하려는 것이다.
도 1은 천연 발생 형태(좌측) 및 p-NA 형태(우측)의 RNA 구조 부분을 나타낸다.
도 2는 에쉔모서 등(1993)에 따르는 p-리보-(A,U)-올리고뉴클레오티드의 합성을 도식적으로 나타낸다.
도 3은 고형 담체상에 고정화된 인식 구조물(배열체)의 배열을 도식적으로 나타낸다.
실시예 1
1-{3'-O-벤조일-4'-O-[(4,4'-디메톡시트리페닐)메틸]-β-D-리보피라노실}티민의 합성
우선 4'-치환, 이어서 2'-치환, 이어서 이동 반응:
Figure 112000005480674-pct00008
1-(β-D-리보피라노실)티민(A) 51.6g(200mmol)을 아르곤 대기하에 무수 피리딘 620㎖에 용해시키고, N-에틸디이소프로필아민 71.4㎖(2.1당량) 및 분자체(4 Å) 100g을 가하여, 혼합물을 KPG 교반기를 사용하여 15분 동안 교반하였다. 디메톡시트리틸 클로라이드(DMTCl) 92g(272mmol; 1.36당량)을 클로로포름 280㎖(고체 NaHCO3로부터 새로 증류함)에 용해시키고, 당해 용액을 -6 내지 -5℃에서 30분 동안 트리올 용액에 적가하였다. 동일한 온도에서 1시간 동안 교반한 다음, 실온(RT)에서 밤새 교반하고, 다시 냉각시킨 다음, 클로로포름 70㎖ 중의 DMTCl 25g(74mmol; 0.37당량)을 추가로 가하였다. 혼합물을 RT가 되도록 하고, 4시간 동안 교반하였다.
소량의 샘플을 취하여, 수성 후처리한 다음, 크로마토그래피하여 1-{4'-O-4,4'-디메톡시트리페닐)메틸]-β-D-리보피라노실}티민의 분석 데이터를 수득하였다:
1H-NMR (300 MHz, CDCl3): 1.70 (bs, 2H, OH); 1.84 (d, 3H, Me); 2.90 (bs, 1 H, OH); 3.18, 3.30 (2m, 2H, H(5')), 3.62 (bs, 1H, H(3')); 3.70-3.82 (m, 8H, 2 OMe, H(4'), H(2')); 5.75 (d, J = 9.5 Hz, 1H, H(1')), 6.85 (m, 4H, Harom); 6.96 (m, 1H, Harom), 7.20 (m, 9H, Harom, H(6)), 8.70 (bs, 1H, H(3)).
반응 혼합물을 4-디메틸아미노피리딘(DMAP) 2.46g(20.5mmol; 0.1당량)으로 처리하고, -6℃로 되도록 냉각시킨 다음, 피리딘 30㎖ 중의 벤조일 클로라이드(BzCl) 27.9㎖(0.24mol; 1.2당량)를 -6 내지 -1℃에서 15분 동안 적가하고, 혼합물을 10분 동안 교반하였다. 반응을 완결시키기 위하여, 각각의 경우, BzCl 2.8㎖(24mmol; 0.12당량)를 25분 간격으로 냉각시키면서 추가로 가하고, 혼합물을 최종적으로 20분 동안 교반하였다.
무수 피리딘 460㎖, n-프로판올 841㎖(11.2mol; 56당량), p-니트로페놀 44g(0.136mol; 1.58당량), DMAP 21.7g(0.18mol; 0.9당량) 및 N-에틸디이소프로필아민 136㎖(0.8mol; 4당량)를 RT에서 가하고, 혼합물을 61 내지 63℃에서 48시간 동안 교반하였다. 이어서, 혼합물을 RT에서 60시간 동안 방치시켰다. 반응 혼합물을 다시 61 내지 63℃로 24시간 동안 가열하고, RT로 냉각시킨 다음, 회전식 증발기(Rotavapor)에서 농축시켰다. 잔사를 에틸 아세테이트 2ℓ에 용해시키고, 분자체를 여과하여 유기상을 매 회 물 1ℓ로 3회 추출한 다음, 10% 농도의 시트르산 1.2ℓ와 함께 교반하여 1회 추출하고, 유기상을 다시 분리시켜 물 1ℓ와 최종적으로 포화 NaHCO3 용액 1ℓ로 1회 추출하였다. 유기상을 황산나트륨으로 건조시키고, 여과하여 농축시켰다(잔사 220g).
잔사는 정제를 위하여 헵탄/에틸 아세테이트(1:1 내지 0.1)의 단계 구배를 사용하여 실리카 겔 60(20 x 10㎝)에서 먼저 여과한 다음, 실리카 겔 60(30 x 10㎝; 디클로로메탄/에틸 아세테이트의 단계 구배, 1:0 내지 1:1)에서 크로마토그래피하였다.
다음이 수득되었다:
비극성 분획 40g
1-{3'-O-벤조일-4'-O-[(4,4'-디메톡시트리페닐)메틸]-β-D-리보피라노실}티민(B) 52.9g
불순물(B) 34.5g
극성 분획 3.4g
불순물 분획을 다시 크로마토그래피(SG 60, 45 x 10㎝; 디클로로메탄/에틸 아세테이트, 3:1)하고, 추가로 화합물(B) 11.3g을 수득하였다.
총 수율: 화합물(B) 64.2g(97mmol), 즉 수율 48%.
1H-NMR이 상응한다.
실시예 2
N4-벤조일-1-{3'-O-벤조일-4'-O-[(4,4'-디메톡시트리페닐)메틸]-β-D-리보피라노실}시토신의 합성
우선 2'-치환, 이어서 4'-치환, 이어서 이동 반응:
Figure 112000005480674-pct00009
모든 배치(batch)는 N2 대기하에 수행하였다.
N4-벤조일-1-(2'-O-벤조일-β-D-리보피라노실}시토신(2):
N4-벤조일-1-(β-D-리보피라노실)시토신(1) 54.0g(0.155mol)을 124℃로 가온하면서 디메틸포름아미드(DMF) 830㎖ 및 피리딘 1.5ℓ(두 용매를 분자체 3Å에서 건조시켜 저장함)에 용해시켰다. 피리딘 210㎖에 용해시킨 BzCl 23.0g(0.163mol; 1.05당량)을 3.5시간 동안 -58 내지 -63℃에서 적가하였다. 배치를 냉각 욕에서 밤새 교반하였다. n-프로판올 90.3g(1.5mol; 10당량)을 교반하고, 배치를 고진공하에 40℃에서 농축시켰다. 피리딘 잔사는 톨루엔 150㎖를 2회 가하고, 다시 농축시켜 제거하였다. 잔사 124.3g을 CH2Cl2 500㎖에 용해시키고, 매 회 반농축된 NaHCO3 용액 300㎖와 함께 교반하여 2회 추출하며, 침전된 고체를 여과하여 건조시켰다: 잔사 60.7g. CH2Cl2 상을 농축시켰다: 25.0g. 구배(AcOEt/이소헥산 4:1, 이어서 순수한 AcOEt, 이어서 AcOEt/MeOH 19:1 내지 2:1)에 의해 실리카 겔 60(40 x 10㎝)에서 개별적인 크로마토그래피로 수득한다(TLC(실리카 겔, AcOEt)).
2',4'-디벤조에이트(24%) Rf 0.5 16.8g
화합물(1) (23%) Rf 0.0 12.4g
화합물(2) (51%) Rf 0.14 35.4g
N4-벤조일-1-{3'-O-벤조일-4'-O-[(4,4'-디메톡시트리페닐)메틸]-β-D-리보피라노실}시토신(3):
화합물(2) 35.4g(78mmol)을 CH2Cl2 390㎖와 피리딘 180㎖(모두 무수 상태임)에 용해시키고, DMAP 0.94(7.8mmol; 0.1당량), N-에틸디이소프로필아민 34.6㎖(203mmol; 2.6당량) 및 DMTCl 33.1g(98mmol; 1.25당량)을 가하고, 혼합물을 RT에서 2시간 동안 교반하였다.
TLC(실리카 겔, AcOEt): Rf 0.6.
CH2Cl2를 30℃에서 스트립핑시키고, 잔사를 피리딘 640㎖, DMAP 9.37(78mmol; 1.0당량), Et3N 32.5㎖(234mmol; 3.0당량), p-니트로페놀 21.7g(156mmol; 2.0당량) 및 n-프로판올 93.8g(1.56mol; 20당량)으로 처리한 다음, 65℃에서 42시간 동안 교반하였다. 배치를 고진공하에 50℃에서 농축시키고, 매 회 톨루엔 250㎖로 2회 처리하여 농축시켰다. 잔사를 CH2Cl2 1ℓ에 용해시키고, 매 회 NaHCO3 희석 용액 500㎖와 함께 교반하여 3회 추출하고, 유기상은 Na2SO4를 사용하여 건조시킨 다음, 농축시켰다: 잔사 92.5g. 구배(메틸 3급 부틸 에테르/이소헥산 2:1 내지 4:1, 이어서 메틸 3급 부틸 에테르/AcOEt 1:4, 이어서 AcOEt/MeOH 1:1 내지 1:3)를 사용하여 실리카 겔 60(50 x 10㎝)에서 크로마토그래피하여 생성물 함유 분획 44.7g을 수득하고, 이를 CH2Cl2/메틸 3급 부틸 에테르(1:5) 540㎖로부터 재결정화하였다. 결정화물을 다시 CH2Cl2/메틸 3급 부틸 에테르(1:1) 300㎖로부터 다시 재결정화하였다.
화합물(3): TLC(실리카 겔, CHCl3/i-PrOH 49:1); Rf 0.14.
다음이 수득되었다: N4-벤조일-1-{3'-O-벤조일-4'-O-[(4,4'-디메톡시트리페닐)메틸]-β-D-리보피라노실}시토신(3) 30.0g, 즉 화합물(2)를 기준으로 하여 수율 51%. 1H-NMR이 상응한다.
실시예 3
N6-벤조일-9-{3'-O-벤조일-4'-O-[(4,4'-디메톡시트리페닐)메틸]-β-D-리보피라노실}아데닌의 합성
우선 2' 치환, 이어서 4'-치환, 이어서 이동 반응:
Figure 112000005480674-pct00010
9-(β-D-리보피라노실)아데닌(2):
N6-벤조일-9-(2',3',4'-트리-O-벤조일-β-D-리보피라노실)아데닌(1) 68.37g(100mmol)을 NH3 포화된 MeOH 300㎖ 중에서 RT에서 밤새 교반하고, 결정화물을 여과한다: 화합물(2) 23.5g(88%).
TLC(실리카 겔, AcOEt/MeOH 2:1): Rf 0.23
1H-NMR (300 MHz, DMSO): 3.56-3.78 (m, 3H, H(4'), H(5')); 4.04 (m, 1H, H(3')); 4.23 (ddd, J = 2.5, 8, 9.5　Hz, H(2')), 4.89 (d, J = 6 Hz, 1H, OH), 5.07 (d, J　= 7 Hz, 1H, OH), 5.12 (d, J = 4 Hz, 1H, OH), 5.63 (d, J = 9.5 Hz, 1H, H(1')), 7.22 (s, 2H, NH2), 8.14 (s, 1H, H(2)), 8.29 (s, 1H, H(8)).
13C-NMR (75 MHz, DMSO): 65.0 (t, C(5')); 66.6 (s, C(4')), 68.1 (s, C(3')), 71.1 (s, C(2')), 79.6 (s, C(1')); 118.6 (C(5)); 139.5 (s, C(8)), 149.9 (s, C(4)), 152.5 (s, C(2)), 155.8 (s, C(6)).
N6,N6-디벤조일-9-(β-D-리보피라노실)아데닌(3):
화합물(2) 16.8g(62.9mmol)을 N2 대기하에 무수 피리딘 500㎖에 현탁시키고, -4 내지 -10℃로 냉각시켰다. 트리메틸클로로실란 40㎖(199mmol; 5당량)를 20분 동안 적가하고, 혼합물을 냉각하에 2.5시간 동안 교반하였다.
피리딘 73㎖에 용해시킨 벤조일 클로라이드 36.5㎖(199mmol; 5당량)를 25분 동안 -10 내지 -15℃에서 가하고, 냉각하에 10분 동안 교반한 다음, RT에서 2시간 동안 교반하였다[TLC 검사(실리카 겔, AcOEt/헵탄 1:1): Rf 0.5]. 혼합물을 다시 -10℃로 냉각시키고, H2O(최대 온도 +8℃) 136㎖를 가하고, 혼합물을 RT에서 밤새 교반하였다. 전환이 완결된 후에, 용매를 스트립핑시키고, 잔사를 매 회 톨루엔 200㎖에 2회 용해시켜, 다시 증발시켰다. 혼합물을 Et2O 및 H2O 각각 500㎖로 처리하고, 2시간 동안 기계적으로 교반하여, 두 상에 약간만 가용성인 생성물을 여과하고, Et2O 및 H2O로 세척하여, 고진공하에 P2O5로 건조시켰다: 화합물(3) 23.8g(80%).
TLC(실리카 겔, AcOEt/MeOH 9:1): Rf 0.35.
1H-NMR (300 MHz, DMSO): 3.60-3.80 (m, 3H, H(4'), H(5')); 4.06 (bs, 1H, H(3')); 4.30 (ddd, J = 2.5, 8, 9.5 Hz, H(2')), 4.93 (d, J = 6 Hz, 1H, OH), 5.20 (d, J　= 4 Hz, 1H, OH), 5.25 (d, J = 4 Hz, 1H, OH), 5.77 (d, J = 9.5 Hz, 1H, H(1')), 7.47 (m, 4H, Harom), 7.60 (m, 2H, Harom), 7.78 (m, 4H, Harom), 8.70 (s, 1H, H-C(2)), 8.79 (s, 1H, H(8)).
13C-NMR (75 MHz, DMSO): 66.2 (t, C(5')); 66.5 (s, C(4')), 68.0 (s, C(3')), 71.0 (s, C(2')), 80.4 (s, C(1')); 112.42 (C(5)); 126.9 (s, C(5')), 126.9, 128.9, 133.3, 133.4 (arom. C), 146.0 (s, C(8)), 150.7 (s, C(4)), 151.8 (s, C(2)), 153.3 (s, C(6)), 172.0 (s, C=O)).
N6,N6-디벤조일-9-(2'-O-벤조일-β-D-리보피라노실}아데닌(4):
화합물(3) 26.4g(55.5mmol)을 N2 대기하에 무수 CH2Cl2 550㎖ 및 피리딘 55㎖(각각의 경우, 분자체에 저장함)에 용해시키고, DMAP 0.73g(5.55mmol; 0.1당량)으로 처리하여, -87 내지 -90℃로 냉각시켰다. 피리딘 14㎖ 중의 BzCl 8.58g(61mmol; 1.1당량)을 1시간 동안 적가하고, 혼합물을 -78℃에서 60시간 동안 방치시켰다(주말). 배치를 농축시키고, 매 회 톨루엔 100㎖로 2회 처리하여 증발시켜 피리딘을 제거하였다. 구배(AcOEt/헵탄, 1:1 내지 9:1)를 사용하여 실리카 겔 60(20 x 10㎝)에서 크로마토그래피로 화합물(4)을 23.2g 수득하였다.
화합물(4): TLC(실리카 겔, AcOEt); Rf 0.34.
N6-벤조일-9-{3'-O-벤조일-4'-O-[(4,4'-디메톡시트리페닐)메틸]-β-D-리보피라노실}아데닌(5):
화합물(4) 23.2g(40mmol)을 무수 CH2Cl2 160㎖에 용해시키고, 이어서 DMTCl 14.9g(56mmol; 1.1당량) 및 N-에틸디이소프로필아민 17.7㎖(104mmol; 2.6당량)로 처리하였다. RT에서 2시간 동안 교반한 후에, DMTCl 4.0g(11.8mmol; 0.3당량)을 추가로 가하고, 혼합물을 추가로 40분 동안 교반하였다. 배치를 350 내지 520mbar 및 35℃에서 회전식 증발기에서 농축시켰다.
TLC(실리카 겔, AcOEt/헵탄 1:1): Rf 0.18.
잔사를 무수 피리딘 260㎖에 용해시키고, 이어서 n-프로판올 51㎖(679mmol; 17당량), Et3N 16.6㎖(120mmol; 3당량), p-니트로페놀 11.1g(80mmol; 2당량) 및 DMAP 5.3g(44mmol; 1.1당량)으로 처리한 다음, 60 내지 63℃에서 23시간 동안 교반하였다. 이어서, 배치를 RT에서 21시간 동안 유지하였다. 반응 혼합물을 회전식 증발기에서 농축시켰다. 잔사를 매 회 톨루엔 200㎖로 2회 처리하여 농축시키고, CH2Cl2에 용해시켜, 물로 3회 추출하였다.
구배(AcOEt/헵탄 1:2 내지 1:0, 이어서 AcOEt/MeOH 1:0 내지 9:1)를 사용하여 실리카 겔 60(30 x 10㎝)에서 크로마토그래피로 화합물(5)을 13g 수득하였다.
화합물(5): TLC(실리카 겔, AcOEt/헵탄 4:1); Rf 0.2.
다음이 수득되었다: N6-벤조일-9-{3'-O-벤조일-4'-O-[(4,4'-디메톡시트리페닐)메틸]-β-D-리보피라노실}아데닌(5) 13g, 즉 화합물(3)을 기준으로 하여 수율 30%. 1H-NMR이 상응한다. 문헌에 공지된 방법에 비하여 시간 절감: 50%.
실시예 4
9-[3'-O-벤조일-4'-O-((4,4'-디메톡시트리페닐)메틸)-β-D-리보피라노실]-2-O-알릴-2-N-이소부티로일구아닌의 합성
우선 3' 치환, 이어서 4'-치환 반응:
Figure 112000005480674-pct00011

9-[3'-O-벤조일-β-D-리보피라노실]-2-O-알릴-2-N-이소부티로일구아닌(B)
G 트리올(A)(393㎎, 1.0mmol)를 무수 디클로로메탄 4㎖에 용해시켰다. 용액을 트리메틸 오르토벤조에이트(0.52㎖, 3.0mmol) 및 캄포르설폰산(58㎎, 0.25mmol)으로 처리하고, 실온에서 15시간 동안 교반하였다. 이어서, 혼합물을 0℃로 냉각시키고, 0℃로 예비냉각시킨 아세토니트릴, 물 및 트리플루오로아세트산(50:5:1)의 혼합물 2㎖로 처리하였다. 혼합물을 10분 동안 교반하고, 용매를 진공하에 제거하였다. 잔사를 디클로로메탄/메탄올(100:3)을 사용하여 실리카 겔(2.3 x 21㎝)에서 섬광 크로마토그래피로 정제하였다. 4-O-벤조일 화합물 25㎎(5%), 혼합 분획 139㎎(28%) 및 목적하는 3-O-벤조일 화합물(B) 205㎎(41%)을 수득하였다.
1H-NMR (300 MHz, CDCl3): 1.12, 1.14 (2d, J = 7.0 Hz, 2 x 3 H, NHCOCHMe 2), 2.78 (hep, J = 7 Hz, 1 H, NHCOCHMe2), 3.85 (dd, J = 6.0, 11.0 Hz, 1 H, H-5'eq), 3.94 (app. T, J = 11.0 Hz, 1 H, H=5'ax), 4.12 (ddd, J = 2.5, 6.0, 11.0 Hz, 1 H, H-4'), 4.52 (dd, J = 3.5, 9.5 hz, 1 H, H-2'), 5.00 (dt, J = 1.5, 6.0 Hz, 2 H, All), 5.19 (dq, J = 1.5, 10.0 Hz, 1 H, All), 5.39 (dq, 1.5, 16.5 Hz, 1 H, All), 5.85 (bt, J = 3.0 Hz, 1 H, H-3'), 5.97 (d, J = 9.5 Hz, 1 H, H-1'), 6.07 (ddd, J = 6.0, 10.0, 16.5 Hz, 1 H, All), 7.40-7.58 (m, 3 H, Bz), 8.10-8.16 (m, 2 H, Bz), 8.28 (s, 1 H, H-8).
9-[3'-O-벤조일-4'-O-((4,4'-디메틸옥시트리페닐)메틸)-β-D-리보피라노실]-2-O-알릴-2-N-이소부티로일구아닌(C)
디올(B)(101㎎, 0.2mmol)를 무수 디클로로메탄 3.2㎖에 현탁시켰다. 현탁액을 N-에틸디이소프로필아민 171㎕(1.0mmol), 피리딘 320㎕(3.96mmol) 및 DMTCl 102㎎(0.3mmol)으로 처리하고, 실온에서 교반하였다. 24시간 후에, DMTCl 102㎎(0.3mmol)을 추가로 가하고, 혼합물을 다시 24시간 동안 교반하였다. 그 다음, 디클로로메탄 30㎖로 희석시켰다. 용액을 10% 농도의 시트르산 수용액 20㎖ 및 포화 중탄산나트륨 용액 10㎖로 세척하고, MgSO4로 건조시켜, 진공하에 농축시켰다. 잔사를 디클로로메탄/메탄올(100:1)을 사용하여 실리카 겔(2.3 x 20㎝)에서 섬광 크로마토그래피로 정제하였다. 공지된 목적 생성물(C) 39㎎(24%)이 수득되었다.
실시예 5
p-RNA 결합제 시스템의 합성
이하, 아미노 종결기를 갖고 있으며, 이후 작용성 단위의 결합에 사용될 수 있는 결합제를 제공할 수 있는 3가지 방법이 기술되어 있다:
5.1 우라실계 결합제
우라실의 5-위치의 개질을 기본으로 함.
공지된 방법(J.D. Fissekis, A. Myles, G.B. Brown, J. Org. Chem. 1964, 29, 2670)에 따라서 대규모로 하이드록시에틸우라실(28)을 제조할 수 있다. g-부티로락톤(25)을 메틸 포르메이트로 포르밀화시키고, 나트륨 염(26)을 반응시켜 우레아 유도체(27)을 수득하고, 이를 폐환시켜 하이드록시에틸우라실(28)을 수득한다(반응식 4).
Figure 112005053617663-pct00049
Figure 112000005480674-pct00013
하이드록시에틸우라실(28)을 메탄설포닐 클로라이드로 피리딘 중에서 메실화시켜 화합물(29)을 수득하였다[참조: J.D. Fissekis, F. Sweet, J. Org. Chem. 1973, 38, 264].
다음 단계는 새롭게 발명된 것이다: DMF 중의 나트륨 아지드를 사용하여, 화합물(29)을 반응시켜 아지드(30)를 수득하고, 이를 피리딘 중의 트리페닐포스핀으로 환원시켜 아미노에틸우라실(31)을 수득하였다. 화합물(31) 중의 아미노 작용기를 최종적으로 N-에톡시카보닐프탈이미드로 보호하였다(반응식 5). N-프탈로일아미노에틸우라실(32)로 리보스 테트라벤조에이트(33)를 뉴클레오시드화시켜 양호한 수율로 리보스 트리벤조에이트(34)를 수득하였다. 피라노스 환의 아노머 중심은 J=9.5 ㎐의 H-C(1') 및 H-C(2') 사이의 커플링 상수로부터 명백히 알 수 있는 바와 같이, β 배위이다. 이어서, MeOH 중의 NaOMe를 사용하여 벤조에이트 보호 그룹을 제거하여 결합제 트리올(35)을 수득하였다. 화합물(35)을 DMAP의 존재하에서 피리딘/디클로로메탄(1:10) 중에서 -78℃에서 벤조일 클로라이드와 반응시켰다. 이 공정에서, 목적하는 2'-벤조에이트(36)(64%) 외에, 2',4'-디벤조일화 생성물(22%)을 수득하며, 이를 수집하여 화합물(34)을 화합물(35)로 가메탄올 분해시키는 것과 유사하게 트리올(35)로 전환시켰다. 2'-벤조에이트(36)를 디클로로메탄 중의 휘니그 염기의 존재하에서 디메톡시트리틸 클로라이드를 사용하여 4'-위치에서 90% 초과의 수율로 트리틸화시켰다. 4'-DMT-2'-벤조에이트(37)를 4'-DMT-3'-벤조에이트(38)로 DMAP, p-니트로페놀 및 휘니그 염기의 존재하에 n-프로판올/피리딘(5:2) 중에서 재배열시켰다. 크로마토그래피한 후, 화합물(38)을 수득하였다. 4'-DMT-3'-벤조에이트(38)를 최종적으로 휘니그 염기의 존재하에서 ClP(OAll)N(iPr)2와 반응시켜 포스포르아미다이트(39)를 수득하였다(반응식 6). 이는 합성 프로토콜을 변경시키지 않고 자동화 올리고뉴클레오티드 합성용으로 사용할 수 있다.
Figure 112005053617663-pct00050
공정:
우라실 결합제 단위의 합성
5-(2-아지도에틸)우라실(30)
Figure 112000005480674-pct00015

1. 공정
화합물(29) 26.0g(0.11mol)을 내부 온도계 및 환류 콘덴서가 장착되어 있는 500㎖ 삼구 플라스크 중의 DMF 250㎖에 용해시키고, 화합물을 나트륨 아지드 10.8g(0.166mol)로 처리하였다. 현탁액을 그 후에 60℃에서 4시간 동안 교반하였다(TLC 검사, CHCl3:MeOH 9:1). DMF를 증류 제거하고, 잔사를 물 150㎖와 함께 교반하였다. 고체를 여과하고, 물 약 50㎖로 세척한 다음 오산화인으로 밤새 진공하에 데시케이터에서 건조시켰다. 화합물(30) 14.2g(71%)을 융점 230 내지 235℃(분해)의 무색 고체의 형태로 수득하였다.
2. 분석 데이터
5-(2-아지도에틸)우라실(30):
융점 230-235℃, 분해됨.
TLC: CHCl3/MeOH 9:1, Rf 0.48
UV (MeOH): λmax 263.0 (7910).
IR (KBr): 3209s, 3038s, 2139s, 1741s, 1671s, 1452m, 1245m, 1210m
1H-NMR (300 MHz, d6-DMSO): 2.46 (t, 2H, J(CH2CH2N, CH2CH2N) = 7.0, CH2CH2N); 3.40 (t, 2H, J(CH2CH2N, CH2CH2N) = 7.0 CH2CH2N); 7.36 (s, H-C(6)); 11.00 (br. s, 2H, H-N(1), H-N(3)).
MS (ESI+): 180.0 [M+H].
5-(2-아미노에틸)우라실(31)
Figure 112005053617663-pct00016

1. 공정
화합물(30) 14.2g(78.0mmol)을 내부 온도계 및 환류 콘덴서가 장착되어 있는 250㎖ 삼구 플라스크 중의 피리딘 175㎖에 현탁시키고 혼합물을 트리페닐포스핀2) 61.4g(234mmol)으로 처리하였다. 이를 60℃에서 5시간 동안 가열하고 실온에서 밤새 교반하였다(TLC 검사, CHCl3/MeOH 5:1). 25% 농도의 암모니아 용액 40㎖를 상기 현탁액에 가한 다음, 이를 정화시켰다. 용매를 진공하에 회전식 증발기에서 제거하였다. 잔사를 실온에서 30분 동안 CH2Cl2/MeOH 1:1 200㎖ 중에서 교반하고, 침전물을 여과하여 CH2Cl2로 세척하였다. 진공하에 데시케이터 중에서 오산화인으로 건조시킨 후, 융점 214 내지 220℃의 화합물(31) 10.0g(85%)을 수득하였다.
2. 분석 데이터
5-(2-아미노에틸)우라실(31):
융점 214-220℃, 기체 발생, 예비소결.
TLC: CHCl3/MeOH/HOAc/H2O 85:20:10:2, Rf 0.07
UV (MeOH): λmax 263.0 (6400).
IR (KBr): 3430m, 3109s, 1628s, 1474m, 1394s, 1270s, 1176w, 1103m, 1021m, 966m, 908m, 838m.
1H-NMR (300 MHz, d6-DMSO): 2.21 (t, 2H, J(CH2CH2N, CH2CH2N) = 6.8, CH2CH2N); 2.59 (t, 2H, J(CH2CH2N, CH2CH2N) = 6.8 CH2CH2N); 5.90 (v. br. s, 4H, H-N(1), H-N(3), NH2); 7.19 (s, H-C(6)).
MS (ESI-): 153.9 [M-H].
5-(2-프탈이미도에틸)우라실(32)
Figure 112000005480674-pct00017
1. 공정
화합물(31) 9.6g(61.8mmol)을 250㎖ 환저 플라스크 중의 물 100㎖에 현탁시키고 Na2CO3 6.64g(62.6mmol)으로 처리하였다. 실온에서 15분 동안 교반한 후, N-에톡시카보닐프탈이미드 14.3g(65mmol)을 나누어 가하고, 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반하였다(TLC 검사, CHCl3/MeOH 5:1). 이제 점성의 백색 현탁액을 조심스럽게1), 농축 염산을 사용하여 pH가 4로 되도록 조절하고, 백색 침전물을 여과하였다. 물로 세척한 후, 고체를 진공하에 데시케이터 중의 오산화인으로 건조시켰다. 이로부터 융점 324 내지 327℃의 화합물(32) 16.0g(91%)을 수득하였다.
2. 분석 데이터
5-(2-프탈이미도에틸)우라실(32):
융점 324-327℃, 분해됨.
TLC: CHCl3/MeOH 5:1, Rf 0.51
UV (MeOH): λmax 263.0 (5825); λ 298.0 (sh., 1380).
IR (KBr): 3446m, 3216m, 1772m, 1721s, 1707s, 1670s, 1390m.
1H-NMR (300 MHz, d6-DMSO): 2.49 (t, 2H, J(CH2CH2N, CH2CH2N) = 6.0, CH2CH2N); 3.71 (t, 2H, J(CH2CH2N, CH2CH2N) = 6.0 CH2CH2N); 7.24 (s, H-C(6)); 7.84 (mc, 4H, NPht); 10.76 (br, s, H-N(1), H-N(3)).
MS (ESI-): 284.0 [M-H].
1-(2,3,4-트리-O-벤조일-β-D-리보피라노실)-5-(2-프탈이미도에틸)우라실(34)
Figure 112000005480674-pct00018

1. 공정
화합물(32) 7.00g(24mmol) 및 화합물(33) 13.6g(24mmol)을 아르곤 주입구(lead-in), 내부 온도계 및 격벽이 장착되어 있는 250㎖ 삼구 플라스크 중의 아세토니트릴 120㎖에 현탁시켰다. 먼저, BSA 12.2㎖(50mmol), 및 30분 동안 교반한 후, 추가로 BSA 7㎖(28mmol)를 주사기를 사용하여 가하였다. 40℃로 단시간 동안 가열한 후, 반응 혼합물을 정화시켰다. TMSOTf 13㎖(72mmol)을 실온에서 주사기를 사용하여 가하였다. 1시간 후에는 생성물 형성이 아직 관찰되지 않는다(TLC 검사, AcOEt/n-헵탄 1:1). 추가로 TMSOTf 13㎖(72mmol)을 가하였다. 계속해서, 반응 혼합물을 50℃로 가열하였다. 50℃에서 2.5시간 동안 교반한 후(TLC 검사), 혼합물을 RT로 냉각시키고, AcOEt 250㎖와 NaHCO3 포화 용액 190㎖의 빙냉 혼합물 속에 넣고 10분 동안 교반하여 집중적으로 추출하였다. 다시 NaHCO3 용액 100㎖로 세척하고 수상을 다시 AcOEt 100㎖로 추출하였다. 희석된 유기상을 MgSO4를 사용하여 건조시키고 용매를 진공하에 회전 증발기중에서 제거하였다. 오일 펌프 진공하에서 건조시킨 후, 20.9g의 조 생성물을 수득하였다. 실리카 겔에서 크로마토그래피(h=25㎝, φ = 5㎝, AcOEt/n-헵탄 1:1)하여 TLC-균일한 발포체성 생성물을 수득하고, 이를 Et2O를 사용하여 분해시켰다. 여과하고, 오일 펌프 진공하에 건조시켜 화합물(34) 15g(86%)을 수득하였다.
2. 분석 데이터
1-(2,3,4-트리-O-벤조일-β-D-리보피라노실)-5-(2-프탈이미도에틸)우라실(34):
융점 124℃(소결)
TLC: AcOEt/n-헵탄 1:1, Rf 0.09.
UV (MeOH): λmax 263.0 (11085): λ 299.0 (sh., 1530)
IR (KBr): 3238w, 3067w, 1772m, 1710s, 1452m, 1395m, 1266s, 1110s, 1070m, 1026m.
1H-NMR (300 MHz, CDCl3): 2.79 (mc, 2H, CH2CH2N); 3.96 (mc, 2H, CH2CH2N); 4.06 (dd, J(Heq-C(5'), Hax-C(5')) = 11.0, J(Heq-C(5'), H-C(4')) = 6.0, Heq-C(5')); 4.12 (t, J(Hax-C(5'), Heq-C(5')) = J(Hax-C(5'), H-C(4')) = 11.0, Hax-C(5')); 5.39 (dd, J(H-C(2'), H-C(1')) = 9.5, J(H-C(2'), H-C(3')) = 2.9 H-C(2')); 5.46 (ddd, J(H-C(4'), Hax-C(5')) = 11.0, J(H-C(4'), Heq-C(5')) = 6.0, J(H-C(4'), H-C(3')) = 2.9, H-C(4')); 6.26 (ψt, J
Figure 112005053617663-pct00019
2.6, H-C(3')); 6.36 (d, J(H-C(1'), H-C(2')) = 9.5, H-C(1')); 7.24-7.40, 7.44-7.56, 7.61-7.66, 7.72-7.80, 7.84-7.90, 8.06-8.13 (6m, 16H, 3 Ph, H-C(6)); 7.70, 7.82 (2 mc, 4H, NPht); 8.37 (s, H-N(3)).
13C-NMR (75 MHz, CDCl3): 21.19 (CH2CH2N); 36.33 (CH2CH2N); 64.07 (C(5')); 66.81, 68.22 (C(4'), C(2')); 69.29 (C(3')); 78.59 (C(1')); 112.42 (C(5)); 123.31, 132.05, 133.89 (6C, Pht); 128.33, 128.47, 128.47, 128.83, 128,86, 129.31, 129.83, 129.83, 129.94, 133.55, 133.62, 133.69 (18C, 3 Ph); 135.87 (C(6)); 150.39, 162.78 (C(4)); 164.64, 165.01, 165.41 (3C, O2CPh); 168.43 (2C, CO-Pht).
MS (ESI+): 730.2 [M+H].
분석:
C40H31N3O11(729.70)에 대한 계산치: C 65.84, H 4.28, N 5.76;
실측치: C 65.63, H 4.46, N 5.53.
5-(2-프탈이미도에틸)-1-(β-D-리보피라노실)우라실(35)
Figure 112000005480674-pct00020

1. 공정
화합물(34) 15g(20mmol)을 1ℓ 환저 플라스크 중의 MeOH 500㎖에 용해시키고, NaOMe 324㎎(6mmol)으로 처리하고, 실온에서 물을 배제시키면서 밤새 교반하였다(TLC 검사, AcOEt/n-헵탄 1:1). 암버라이트(Amberlite) IR-120을 상기 생성된 현탁액에 pH가 < 7이 될 때까지 가하였다. 고체를 가열하에서 용해시키고, 이온 교환기로부터 뜨거운 상태로 여과하여 MeOH로 세척하였다. 용매를 제거한 후, 잔사를 매 회 물 150㎖를 사용하여 2회 공증발시켰다. 이로부터 조 생성물 9g을 수득하고, 이를 환류하에서 MeOH 90㎖ 중에서 10분 동안 가열하였다. 실온으로 냉각시킨 후, 혼합물을 Et2O 60㎖로 처리하고 4℃에서 밤새 보관하였다. 여과하고, Et2O로 세척한 다음 오일 펌프 진공하에서 건조시켜 화합물(35)을 7.8g(93%) 수득하였다.
2. 분석 데이터
5-(2-프탈이미도에틸)-1-(β-D-리보피라노실)우라실(35):
융점 137℃(소결)
TLC: CHCl3/MeOH 5:1, Rf 0.21.
UV (MeOH): λmax 263.0 (8575): λ 299.0 (sh., 1545).
IR (KBr): 3458s, 1772w, 1706s, 1400m, 1364m, 1304m, 1045m.
1H-NMR (300 MHz, d6-DMSO + 2 Tr. D2O: 2.55 (mc, 2H, CH2CH2N); 3.28-3.61 (m, 4H, H-C(2'), H-C(4'), Heq-C(5'), Hax-C(5')); 3.73 (mc, 2H, CH2CH2N); 3.93 (m, H-C(3')); 5.50 (d, J(H-C(1'), H-C(2')) = 9.3, H-C(1')); 7.41 (s, H-C(6)); 7.84 (s, 4H, NPht).
13C-NMR (75 MHz, d6-DMSO): 25.63 (CH2CH2N); 36.62 (CH2CH2N); 64.95 (C(5')); 66.29 (C(4')); 67.37 (C(2')); 71.12 (C(3')); 79.34 (C(1')); 110.39 (C(5)); 122.85, 131.54, 134.08 (6C, Pht); 137.92 (C(6)); 150.84 (C(2)); 163.18 (C(4)); 167.74 (2C, CO-Pht).
MS (ESI-): 416.1 [M-H].
1-(2'-O-벤조일-β-D-리보피라노실)-5-(2-프탈이미도에틸)우라실
5-(2-프탈이미도에틸)-1-(β-D-리보피라노실)우라실 10.6g(0.025mmol)을 가열시키고 아르곤-플러쉬시킨 1ℓ 사구 플라스크 중의 피리딘 20㎖에 용해시키고 디클로로메탄 200㎖와 혼합하였다. 혼합물을 -70℃로 냉각시키고, 피리딘 5㎖와 디클로로메탄 20㎖ 중의 벤조일 클로라이드 3.82㎖(0.033mmol)을 냉각시키면서 천천히 적가하고 혼합물을 -70℃에서 35분 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 냉각시킨 염화암모늄 용액 600㎖에 붓고, 수성상을 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기상을 물로 세척하고, 건조시킨 다음, 진공하에 농축 건조시켰다. 실리카 겔에서 크로마토그래피(에틸 아세테이트/헵탄 1:1)하여 1-(2'-O-벤조일-β-D-리보피라노실)-5-(2-프탈이미도에틸)우라실 7.9g(60%)을 수득하였다.
TLC: Rf 0.24(에틸 아세테이트/헵탄 4:1)
1H-NMR (300 Mhz, d6-DMSO): 2.67 (mc, 2H, CH2CH2N); 3.66-3.98 (m, 5H, H-C(4')), Heq-C(5'), Hax-C(5'), CH2CH2N); 4.51 (t, 1H, H-C(3')); 4.98 (dd, 1H, H-C(2')); 6.12 (d, 1H, H-C(1')); 7.19 (s, 1H, H-C(6)); 7.29-7.92 (m, 9H, OBz, NPht).
1-(2-O-벤조일-4-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-β-D-리보피라노실)-5-(2-프탈이미도에틸)우라실
1-(2-O-벤조일-β-D-리보피라노실-5-(2-프탈이미도에틸)우라실 5.6g(10.73mmol)을 디클로로메탄 60㎖에 용해시키고, 4,4'-디메톡시트리틸 클로라이드 4.72g(13.95mmol) 및 N-에틸디이소프로필아민 2.4㎖(13.95mmol)로 처리하고 RT에서 20분 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 디클로로메탄 100㎖로 희석시키고, 탄산수소나트륨 용액과 20% 시트르산 용액으로 세척하여, 건조시키고 진공하에서 농축 건조시켰다. 실리카 겔에서 크로마토그래피(에틸 아세테이트/헵탄 1:1 + 2% 트리에틸아민)하여 1-(2-O-벤조일-4-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-β-D-리보피라노실)-5-(2-프탈이미도에틸)우라실 7.7g(87%)을 수득하였다.
TLC:Rf 0.53 (에틸 아세테이트/헵탄 1:1 + 2% 트리에틸아민).
1H-NMR (300 MHz, CDCl3): 2.64 (mc, 2H, CH2CH2N); 3.12 (mc, 1H, H-C(4')); 3.59-3.63 및 3.72-3.92 (m, 5H, H-C(3'), Heq-C((5')), Hax-C(5')), CH2CH2N); 3.81 및 3.82 (s, 6H, CH3O); 4.70 (dd, 1H, H-C(2')); 6.09 (d, 1H, H-C(1')), 7.05 (s, 1H, H-C(6)); 6.84-7.90 (m, 22H, ODmt, OBz, NPht).
1-(3-O-벤조일-4-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-β-D-리보피라노실)-5-(2-프탈이미도에틸)우라실
1-(2-O-벤조일-4-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-β-D-리보피라노실)-5-(2-프탈이미도에틸)우라실 3g(3.63mmol), 4-니트로페놀 1g(7.26mmol), 4-(디메틸아미노)피리딘 0.44g(3.63mmol) 및 N-에틸디이소프로필아민 3.75㎖(21.78mmol)를 이소프로판올 5.6㎖와 피리딘 25㎖에 용해시키고, 65℃로 가열하여 65℃에서 3일 동안 교반하였다. 상기 용액을 진공하에서 농축 건조시키고, 잔사를 디클로로메탄 150㎖에 용해시켰다. 20% 시트르산 용액과 탄산수소나트륨 용액으로 세척한 후, 용액을 황산마그네슘으로 건조시켰다. 실리카 겔에서 크로마토그래피(에틸 아세테이트/디클로로메탄/이소헥산 2:1:1)하여 1-(3-O-벤조일-4-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-β-D-리보피라노실)-5-(2-프탈이미도에틸)우라실 2.27g(76%)을 수득하였다.
TLC:Rf 0.27 (에틸 아세테이트/이소헥산 2:1 + 1% 트리에틸아민).
1H-NMR (300 MHz, CDCl3): 2.39 (mc, 2H, CH2CH2N); 2.53 (mc, 1H, Heq-C(5')); 3.30 (dd, 1H, H-C(2')); 3.55 (mc, 1H, Hax-C(5')); 3.69 (mc, 2H, CH2CH2N); 3.78 및 3.79 (s, 6H, CH3O); 3.79-3.87 (m, 1H, H-C(4')); 5.74 (d, 1H, H-C(1')); 5.77 (mc, 1H, H-C(3')); 6.92 (s, 1H, H-C(6)); 6.74-8.20 (m, 22H, ODmt, OBz, NPht).
1-{2'-O-[(알릴옥시)(디이소프로필아미노)포스피노]-3'-O-벤조일-4'-O-[(4,4'-디메톡시트리페닐)메틸]-β-D-리보피라노실}-5-(2-프탈이미도에틸)우라실
1-(3-O-벤조일-4-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-β-D-리보피라노실)-5-(2-프탈이미도에틸)우라실 88㎎(0.11mmol)을 디클로로메탄 5㎖에 용해시키고, N-에틸디이소프로필아민 75㎕(0.44mmol) 및 알릴옥시클로로(디이소프로필아미노)포스핀 70㎕(0.3mmol)로 처리하여 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 추가로 알릴옥시클로로(디이소프로필아미노)포스핀 35㎕(0.15mmol)을 가하여 반응을 완결한 후, 이를 실온에서 추가로 1시간 동안 교반하고, 반응 혼합물을 진공하에서 농축시켰다. 실리카 겔에서 크로마토그래피(에틸 아세테이트/헵탄: 구배 1:2 내지 1:1 내지 2:1, 각각의 경우, 2% 트리에틸아민)하여 1-{2'-O-[(알릴옥시)(디이소프로필아미노)포스피노]-3'-O-벤조일-4'-O-[(4,4'-디메톡시트리페닐)메틸]-β-D-리보피라노실}-5-(2-프탈이미도에틸)우라실 85㎎(76%)을 수득하였다.
TLC: Rf 0.36 (에틸 아세테이트/헵탄 2:1).
1H-NMR (CDCl3, 300 MHz,): 선택된 특징적 위치: 2.28, 2.52 (2 dd, J = 5.0, 11.0 Hz, 2 H, 2 H - 5'), 3.79, 3.78 (app. 2 s, 12 H, OMe), 6.14 (1 bs, 1 H, H-3')
31P-NMR (CDCl3): 149.8, 150.6
5.2 인돌계 결합제
N-프탈로일트립타민을 문헌[참조: Kuehne et al., J. Org. Chem. 43, 13, 1978, 2733-2755]에 기재된 바와 같이 프탈산 무수물 및 트립타민으로부터 수득한다. 이를 보란-THF로 환원시켜 인돌린을 수득한다[참조: A. Giannis, et al., Angew. Chem. 1989, 101, 220].
3-치환된 인돌린을 먼저 리보스와 반응시켜 뉴클레오시드 트리올을 수득한 다음, 아세트산 무수물과 반응시켜 트리아세테이트를 수득한다. 혼합물을 2,3-디클로로-5,6-디시아노파라퀴논으로 산화시키고, 아세테이트를 나트륨 메톡사이드로 분해시키고, 2'-위치에서 선택적으로 벤조일화시키며, 4'-위치에서 선택적으로 DM-트리틸화시킨 다음, 이동 반응을 수행하여 3'-벤조에이트를 수득한다. 포스포르아미다이트를 통상의 방법으로 형성시킨다. 이는 합성 프로토콜을 변경시키지 않고 자동화 올리고뉴클레오티드 합성에 사용할 수 있다.
공정
3-(N-프탈로일-2-아미노에틸)인돌린
Figure 112000005480674-pct00021
프탈로일트립타민(A) 51.4g(177mmol)을 질소 대기하에서 1M 보란-THF 용액(2당량) 354㎖에 용해시키고 0℃로 냉각시켰다. 0℃에서 트리플루오로아세트산 354㎖를 천천히 적가하고(주의: 가스 방출) 혼합물을 30분 동안 교반하였다(TLC 검사: EtOAc). 물 17.3㎖를 가하고, 혼합물을 10분 동안 교반한 다음, 진공하에 농축시켰다. 잔사를 10% 농도의 NaOH 용액/디클로로메탄에 용해시키고, 유기상을 분리하여, NaSO4로 건조시켜, 여과하고 진공하에서 농축시켰다. 잔사[50.9g]를 뜨거운 에탄올(3ℓ)로부터 재결정화하였다. 융점 161 내지 162℃의 화합물(B) 41.4g을 수득하였다. 모액을 진공하에서 농축시키고, 잔사를 에탄올로부터 다시 재결정화하였다. 추가로 융점 158 내지 159℃의 화합물(B) 3.2g을 수득하였다.
총 수율: 화합물(B) 44.6g(153mmol), 즉 86%.
1H-NMR (CDCl3, 300 MHz): 1.85-2.00, 2.14-2.28 (2 m, 2 × 1 H, CH 2CH2NPhth), 2.70 (bs, 1 H, NH), 3.24-3.38, 3.66-3.86 (2 m, 5 H, CH2CH 2NPhth, H-2a, H-2b, H-3), 6.62 (d, J = 8.0 Hz, 1 H, H-7), 6.66-6.72 (m, 1 H, H-5), 6.99 (app t, J = 7.5 Hz, 1 H, H-6), 7.14 (d, J = 8.0 Hz, 1 H, H-4), 7.64-7.74, 7.78-7.86 (2 m, 2 × 2 H, Phth).
13C-NMR (CDCl3, 75 MHz): 32.70, 36.10 (2 t, C-2, CH2CH2NPhth), 39.62 (d, C-3), 53.04 (t, CH2NPhth), 109.65 (d, C-7), 118.74 (d, C-5), 123.25 (d, Phth), 123.92, 127.72 (2 d, C-4, C-6), 131.81 (s, C-3a), 132.14 (s, Phth), 133.99 (d, Phth), 151.26 (s, C-7a), 168.38 (s, C=O).
계산치: C: 73.96, H: 5.52, N: 9.58;
실측치: C: 73.89, H: 5.57, N: 9.55.
MS (ES+): 293 (MH+, 100%)
3-(N-프탈로일-2-아미노에틸)-1-(2',3',4'-트리-O-아세틸-β-D-리보피라노실)인돌
Figure 112000005480674-pct00022
화합물(A) 45.2g(155mmol)과 D-리보스 23.2g(155mmol; 1.0당량)을 무수 에탄올 750㎖에 현탁시키고 환류 온도로 4시간 동안 질소 대기하에서 가열하였다(TLC 검사: CH2Cl2/MeOH 10:1). RT로 냉각시킨 후, 혼합물을 진공하에서 농축시켰다. 잔사를 피리딘 300㎖에 용해시키고 아세트산 무수물 155㎖로 빙냉시키면서 처리하였다. 15분 후, 빙욕을 제거하고, 혼합물을 RT에서 18시간 동안 교반하였다(TLC 검사: EtOAc/이소헥산 1:1). 이 용액을 진공하에서 농축시키고 매 회 톨루엔 300㎖와 함께 3회 공-증발시켰다. 수득한 오일을 디클로로메탄 900㎖에 용해시키고 2,3-디클로로-5,6-디시아노파라퀴논 38.8g(171mmol; 1.1당량)으로 처리하였다. 15분 후, 빙욕을 제거하고, 혼합물을 RT에서 1.5시간 동안 교반하였다(TLC 검사; EtOAc/이소헥산 1:1). 침착된 침전물을 흡인 여과하고, 디클로로메탄으로 세척하여 폐기시켰다. 여액을 NaHCO3 포화 용액 600㎖로 세척하였다. 이 과정에서 침착된 침전물을 다시 흡인 여과하고 디클로로메탄으로 세척하여 폐기시켰다. 합한 유기 추출액을 NaSO4로 건조시키고 진공하에서 농축시켰다. 잔사(90.9g)를 실리카 겔에서 섬광 크로마토그라피(10 x 25㎝; EtOAc/이소헥산 2:3)로 정제하였다.
다음을 수득하였다: 순수한 화합물(B) 21.5g 및 혼합된 분획 46.83g, 섬광 크로마토그라피하여 순수한 화합물(B) 20.4g을 추가로 수득하였다.
총 수율: 화합물(B) 41.9g(76mmol), 즉 49%.
1H-NMR (CDCl3, 300 MHz): 1.64, 1.98, 2.19 (3 s, 3 ×3 H, Ac), 3.06 (t, J = 8.0 Hz, 2 H, CH 2CH2NPhth), 3.81-4.00 (m, 4 H, H-5'ax, H-5'eq, CH 2NPhth), 5.13 (ddd, J = 2.5, 6.0, 10.5 Hz, 1 H, H-4'), 5.36(dd, J = 3.5, 9.5 Hz, 1 H, H-2'), 5.71(d, J = 9.5 Hz, 1 H, H-1'), 5.74(app t, J = 3.0 Hz, 1 H, H-3'), 7.02(s, 1 H, H-2), 7.04-7.10, 7.13-7.19 (2 m, 2 ×1 H, H-5, H-6), 7.33 (d, J = 8.0 Hz, 1 H, H-7), 7.58-7.66, 7.72-7.80(2 m, 5 H, Phth, H-4).
13C-NMR (CDCl3, 75 MHz): 20.23, 20.65, 20.87 (3 q, Ac), 24.41, 38.28 (2 t, CH2CH2), 63.53 (t, C-5'), 66.24, 68.00, 68.64 (3 d, C-2', C-3', C-4'), 80.33 (d, C-1'), 109.79 (d, C-7), 113.95 (s, C-3), 119.33, 120.39, 122.04, 122.47 (4 d, C-4, C-5, C-6, C-7), 123.18 (d, Phth), 128.70, 132.17 (2 s, C-3a, Phth), 133.87 (d, Phth), 136.78 (s, C-7a), 168.243, 168.77, 169.44, 169.87 (4 s, C=O).
계산치: C: 63.50, H: 5.15, N: 5.11;
실측치: C: 63.48, H: 5.16, N: 5.05.
MS (ES+): 566 (M+NH4 +, 82%), 549 (MH+, 74%), 114 (100%).
3-(N-프탈로일-2-아미노에틸)-1-β-D-리보피라노실인돌
Figure 112000005480674-pct00023
화합물(A) 44.1g(80mmol)을 질소 대기하에서 무수 메탄올 400㎖에 용해시켰다. 혼합물을 30% 농도의 나트륨 메톡사이드 용액 4.0㎖로 빙냉시키면서 처리한 다음, RT에서 18시간 동안 교반하였다. 침착된 침전물을 흡인 여과하고 냉 에탄올로 세척하였다. 여액을 진공하에서 농축시켰다. 잔사를 디클로로메탄에 용해시켰다. 이 용액을 NaHCO3 포화 용액으로 세척하고, NaSO4로 건조시켜 진공하에서 농축시켰다. 수득한 잔사를 뜨거운 에탄올로부터 상기 반응 용액으로부터 침착된 침전물과 함께 재결정화시켰다. 융점 196 내지 198℃의 화합물(B)을 22.6g 수득하였다. 모액을 진공하에서 농축시키고, 잔사를 다시 에탄올로부터 재결정화하였다. 추가로 융점 188 내지 194℃의 화합물(B) 9.2g을 수득하였다.
총 수율: 화합물(B) 25.8g(즉, 76%).
1H=NMR (MeOD, 300 MHz): 3.09 (app. t, J = 7.0 Hz, 2 H, CH 2CH2NPhth), 3.64-3.98 (m, 5 H, H-4' H-5'ax, H-5'eq, CH 2NPhth), 4.05 (dd, J = 3.5, 9.5 Hz, 1 H, H-2'), 4.22 (app t, J = 3.0 Hz, 1 H, H-3'), 5.65 (d, J = 9.5 Hz, 1 H, H-1'), 6.95-7.05, 7.09-7.16 (2 m, 2 ×1 H, H-5, H-6), 7.25 (s, 1 H, H-2), 7.44 (d, J = 8.0 Hz, 1 H, H-7), 7.60 (d, J = 8.0 Hz, 1 H, H-4), 7.74-7.84 (m, 4 H, Phth).
13C-NMR (d6-DMSO, 75 MHz): 23.87, 37.79 (2 t, CH2 CH2NPhth), 64.82 (t, C-5'), 66.74 (d, C-4'), 68.41 (d, C-2'), 71.42 (d, C-3'), 81.37 (d, C-1'), 110.42 (d, C-7), 111.05 (s, C-3), 118.17, 119.21, 121.36, 122.92, 123.80 (5 d, C-2, C-4, C-5, C-6, NPhth), 127.86, 131.59 (2 s, C-3a, Phth), 134.27 (d, Phth), 136.62 (s, C-7a), 167.72 (s, C=O).
MS(ES-): 457 (M+OH-+H2O, 49%), 439 (M+OH-, 100%), 421 (M-H +, 28%)
1-(2'-O-벤조일-β-D-리보피라노실)-3-(N-프탈로일-2-아미노에틸)인돌
Figure 112000005480674-pct00024
화합물(A) 10.6g(25mmol)을 질소 대기하에서 무수 디클로로메탄 250㎖에 용해시켰다. 혼합물을 DMAP 305㎎(2.5mmol) 및 피리딘 20㎖로 처리하였다. 이를 모두 용액이 될 때까지 가열한 다음, -78℃로 냉각시켰다. 디클로로메탄 8㎖ 중에 용해된 벤조일 클로라이드 3.35㎖(28.8mmol)를 15분에 걸쳐 적가하였다. 추가로 30분후 TLC 검사(EtOAc/헥산 3:1)하면 반응이 완료된 것으로 나타난다. 45분 후, 냉 용액을 NH4Cl 포화 용액 200㎖에 접힌 필터를 통하여 직접 가하고 필터 잔사를 디클로로메탄으로 세척하였다. 유기상을 물로 1회 세척하고, MgSO4로 건조시키고 농축시켰다. 잔사를 톨루엔으로 2회 공-증발시키고 EtOAc/헥산 3:1을 사용한 10 x 20㎝ 실리카 겔에서 섬광 크로마토그래피로 정제하여 화합물(B) 8.1g(64%)을 수득하였다.
1H-NMR (CDCl3, 300 MHz): 2.45, 2.70 (2 bs, 2 ×1 H, OH), 3.04 (t, J = 8.0 Hz, 2 H, CH 2CH2NPhth), 3.80-4.20 (m, 5 H, H-4', H-5'ax, H-5'eq, CH 2NPhth), 4.63 (bs, 1 H, H-3'), 5.46 (dd, J = 3.5, 9.5 Hz, 1 H, H-2'), 6.03 (d, J = 9.5 Hz, 1 H, H-1'), 7.08-7.31 (m, 5 H, H-2, H-5, H-6, Bz-m-H), 7.41-7.48 (m, 1 H, H-Bz-p-H), 7.50 (d, J = 8.0 Hz, 1 H, H-7), 7.64-7.79 (m, 7 H, Phth, H-4, Bz-o-H).
13C-NMR (d6-DMSO, 75 MHz): 24.40, 38.22 (2 t, CH2 CH2NPhth), 65.95 (t, C-5'), 66.65 (d, C-4'), 69.55 (d, C-3'), 71.87 (d, C-2'), 79.57 (d, C-1'), 109.96 (d, C-7), 113.70 (s, C-3), 119.21, 120.21, 122.11, 122.41, 123.14, (5 d, C-2, C-4, C-5, C-6, NPhth), 128.28 (d, Bz), 128.58, 128.59, (2 s, C-3a, Bz), 129.62 (d, Phth), 132.05 (s, Phth), 133.81 (Bz), 136.97 (s, C-7a), 165.12, 168.29 (2 s, C=O).
MS(ES-): 525 (M-H+, 12%), 421 (M-PhCO+, 23%), 107 (100%).
1-{3'-O-벤조일-4'-O-[(4,4'-디메톡시트리페닐)메틸-β-D-리보피라노실}-3-(N-프탈로일-2-아미노에틸)인돌
Figure 112000005480674-pct00025
화합물(A) 8.9g(16.9mmol)을 무수 디클로로메탄 135㎖에 질소 대기하에서 현탁시켰다. 혼합물을 DMAP 206㎎(1.68mmol), N-에틸디이소프로필아민 5.8㎖(33.7mmol) 및 피리딘 약 12㎖로 처리하였다(용액으로 될 때까지). 분자체 4Å 34g으로 처리하고, 30분 동안 교반하였다. 0℃로 냉각시킨 후, DMTCl 11.4g(33.7mmol)로 처리하고, 냉각 욕을 제거한 다음 75분 동안 교반하였다. 추가로 1.94g(0.34당량), 및 추가로 40분 후, 1.14g(0.2당량), 및 추가로 65분 후, 1.14g의 DMTCl(0.2당량)을 가하였다. 4.25시간 후, 반응이 완결된다. 이어서 혼합물을 n-프로판올 25.3㎖(20당량)으로 처리하고, 추가로 30분 동안 교반한 다음, 주의하면서 농축시켰다(발포체 형성). 잔사를 피리딘 100㎖에 용해시켰다. 이를 DMAP 1.85g(15.1mmol; 0.9당량), N-에틸디이소프로필아민 13.05㎖(101mmol; 6.0당량), n-프로판올 71㎖(940mmol; 56당량) 및 p-니트로페놀 3.74g(26.9mmol; 1.6당량)으로 처리하였다. 이 혼합물을 질소하에서 96시간 동안 75 내지 80℃에서 교반하였다. 실온으로 냉각시킨 후, 혼합물을 셀라이트(Celite)를 통하여 여과하고 농축시켰다. 잔사를 9 x 17㎝ 실리카 겔에서 톨루엔/디에틸 에테르/트리에틸아민 90:10:1을 사용하여 섬광 크로마토그래피로 정제하였다. 생성물 함유 분획(9.25g)을 먼저 EtOAc로부터 재결정화한 다음, 톨루엔/메탄올로부터 침전시켰다. 화합물(B) 5.86g(42%)을 수득하였다.
1H-NMR (CDCl3, 300 MHz): 2.64 (bs, 1 H, OH), 2.68 (dd, J = 5.0, 11.5 Hz, 1 H, H-5'eq), 2.94 (dd, J = 7.5, 16.0 Hz, 1 H, CH 2CH2NPhth), 3.03 (dd, J = 8.0, 16.0 Hz, 1 H, CH 2CH2NPhth), 3.67-3.74 (m, 1 H, H-5'ax), 3.69, 3.70 (2 s, 2 ×3 H, OMe), 3.85 (t, J = 7.5 Hz, 2H, CH2CH 2NPhth), 3.94 (ddd, J = 3.0, 5.0, 10.5 Hz, 1 H, H-4'), 4.03 (dd, J = 3.5, 9.0 Hz, 1 H, H-2'), 5.51 (d, J = 9.0 Hz, 1 H, H-1'), 5.86 (bs, 1 H, H-3'), 6.68-7.66 (m, 25 H), 8.19-8.30 (m, 2 H).
13C-NMR (CDCl3, 75 MHz): 24.16, 38.80 (2 t, CH2 CH2NPhth), 55.25, 55.26 (2 q, Ome), 65.58 (t, C-5'), 68.29, 69.19, 73.83 (3 d, C-2', C-3', C-4'), 83.03 (d, C-1'), 87.31 (CAr3)110.03 (d, C-7), 113.37, 113.47 (2 d), 113.53 (s, C-3), 118.95, 120.20, 122.28, 122.31, 123.10, 127.07, 128.02, 128.08, 128.68 (9 d), 128.74 (s), 130.02, 130.19, 130.22 (3 d), 130.37, 131.95 (2 s), 133.40, 133.83 (2 d), 135.98, 136.14, 136.56, 145.12, 158.82, 166.76, 168.52 (7 s, C-7a, 2 COMe, 2 C=O).
1-{2'-O-(알릴옥시)(디이소프로필아미노)포스피노)-3'-O-벤조일-4'O-[(4,4'-디메톡시트리페닐)메틸]-β-D-리보피라노실}-3-(N-프탈로일-2-아미노에틸)인돌(디아스테레오머 2개)
Figure 112000005480674-pct00026
알코올(A) 1658㎎(2.0mmol)을 아르곤 대기하에서 무수 디클로로메탄 10㎖에 용해시켰다. 당해 용액을 N-에틸디이소프로필아민 1.03㎖(6.0mmol) 및 모노알릴 n-디이소프로필클로로포스포르아미다이트 0.63㎖(2.8mmol)로 처리하고, 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 이어서, 과량의 포스포릴화 시약을 이소프로판올 61㎕(0.8mmol)를 가하여 파괴시켰다. 10분 후, 혼합물을 진공하에서 농축시키고 잔사를 3.3 x 21㎝ 실리카 겔에서 헥산/EtOAc/NEt3(75:25:1)을 사용한 섬광 크로마토그래피로 정제하였다. 생성물 함유 분획을 농축시키고, CCl4에 용해시켜 다시 농축시켰다. 거의 무색인 발포체 2.04g(정량적)을 수득하고, 이는 올리고머화용으로 직접 사용될 수 있으며 수주간 -20℃에서 보관할 수 있다.
실리카 겔에서의 TLC(EtOAc/헥산/NEt3 33:66:1): 0.41
1H-NMR (CDCl3, 300 MHz): 선택된 특징적 위치: 2.42, 2.53, (2 dd, J = 5.0, 11.0 Hz, 2 H, 2 H-5'eq), 3.76, 3.77, 3.78, 3.79 (4 s, 4 ×3 H, OMe), 5.70, 5.73 (2 d, J = 9.0 Hz, 2 H, 2 H-1'), 6.16, 6.29 (2 bs, 2 H, 2 H-3').
31P-NMR (CDCl3): 150.6, 151.0
5.3 리신계 결합제
합성을 반응식 7에 나타내며, 하기에 상세하게 설명한다.
Figure 112000005480674-pct00027
6-아미노-2(S)-하이드록시헥산산(1)을 L-리신으로부터 문헌에 공지된 방법으로 디아조화 및 후속의 가수분해에 의해 제조하였다(K. -I. Aketa, Chem. Pharm Bull. 1976, 24, 621).
2-(S)-N-Fmoc-6-아미노-1,2-헥산디올(2)
LiBH4 3.4g(156mmol, 4당량)을 아르곤하에서 무수 THF 100㎖에 용해시킨다(발열성!). 약 30℃로 냉각시킨후, TMSCl 39.6㎖(312mmol, 8당량)를 천천히 적가하면(가스 방출), 침전물이 형성된다. 6-아미노-2(S)-하이드록시헥산산(1) 5.74g(39mmol)을 아르곤 역류하에서 나누어 가하고 혼합물을 TLC(실리카 겔; i-PrOH/농축 NH4OH/물 7:2:1, 닌하이드린으로 착색)가 더이상 출발 물질을 나타내지 않을 때까지(약 3시간) 65℃로 가열한다. 혼합물을 빙냉시키면서 메탄올 120㎖로 주의하며 처리한다(강력한 가스 방출). 용매를 진공하에서 농축시키고, 잔사를 매 회 메탄올 200㎖와 함께 3회 공증발시킨 다음 무수 DMF 100㎖에 용해시킨다. 에틸디이소프로필아민 16㎖(93.6mmol, 2.4당량)를 첨가한 후, 혼합물을 0℃로 냉각시키고 FmocCl 12.1g(46.8mmol, 1.2당량)으로 나누어 처리한다. 15분 후, 냉각 욕을 제거하고 혼합물을 출발 물질이 소모될 때까지(약 3시간; TLC 검사: 실리카 겔; CHCl3/MeOH/HOAc/물 60:30:3:5) 실온에서 교반한다. 반응 용액을 포화 NaHCO3 용액 600㎖에 가한다. 침전물을 여과하고, 물 200㎖로 세척하여 50℃에서 고진공하에 중량이 일정해 질 때까지(약 6시간) 건조시킨다. 무색 고체를 13.9g 수득하고, 이를 에틸 아세테이트(40㎖)/n-헥산(35㎖)으로부터 재결정화한다. 수율: 9.05g(65%).
1H-NMR (300 MHz, CDCl3): 7.68, 7.51 (2 d, J = 8.0 Hz, 각각의 경우, 2 H, Ar-H), 7.32 (t, J = 8.0 Hz, 2 H, Ar-H), 7.23 (dt, J = 1.6, 8.0 Hz, 2 H, Ar-H), 4.92 (bs, 1 H. NH), 4.32 (d, J = 7.0 Hz, 2 H, OCOCH2), 4.13 (bt, J = 7.0 Hz, OCOCH2CH), 3.64-3.58 (m, 1 H, H-1, H-1', H-2, H-6, H-6'), 3.54 (dd, J = 3.2, 11.0 Hz, 1 H, H-1, H-1', H-2, H-6, H-6'), 3.35 (dd, J = 7.4, 11.0 Hz, 1 H, H-1, H-1', H-2, H-6, H-6'), 3.16-3.06 (m, 2 H, H-1, H-1', H-2, H-6, H-6'), 3.0-2.0 (bs, 2 H, OH), 1.52-1.18 (m, 6 H, H-3, H-3', H-4, H-4', H-5, H-5').
2-(S)-N-Fmoc-O1-DMT-6-아미노-1,2-헥산디올(3)을 WO 제89/02439호에 따라 DM-트리틸화시켰다.
2-(S)-N-Fmoc-O1-DMT-O2-알릴옥시디이소프로필아미노포스피닐-6-아미노-1,2-헥산디올(4)
에틸디이소프로필아민 0.51㎖(3.0mmol, 3당량) 및 클로로-N,N-디이소프로필아미노알릴옥시포스핀 0.33㎖(1.5mmol, 1.5당량)을 아르곤하에서 무수 디클로로메탄 10㎖ 중의 상기 알코올(3) 670㎎(1.02mmol)의 용액에 가한다 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하고, 용매를 진공하에서 스트리핑시킨 다음, 수득한 잔사를 3.2 x 16㎝ 실리카 겔(EtOAc/이소헥산/NEt3 20:80:1)에서 섬광 크로마토그래피로 정제한다. 약간 황색을 띤 오일 839㎎(97%)을 수득한다.
TLC: 실리카 겔; EtOAc/이소헥산/NEt3 50:50:1; UV; Rf=0.77.
1H=NMR (300 MHz, CDCl3): 7.70-6.68 (m, 21 H, Ar-H), 4.92-4.62 (m, 1 H. NH), 4.31 (d, J = 7.0 Hz, 2 H, OCOCH2), 4.13 (t, J = 7.0 Hz, 1 H, OCOCH2CH), 3.98-3.40 (m, 5 H), 3.77 (2 s, 각각의 경우, 3 H, OMe), 3.16-2.86 (m, 4 H), 2.58 (t, J = 7.0 Hz, 1 H, CHCN), 2.38 (t, 1 H, CHCN), 1.80-1.20 (m, 6 H), 1.20, 1.18, 1.17, 1.16, 1.15, 1.13, 1.08, 1.06 (8 s, 12 H, NMe).
31P-NMR (300 MHz, CDCl3): 149.5, 149.0 (2 s)
실시예 6
커플링제로서 벤즈이미다졸륨 트리플레이트를 사용한 서열 4'-인돌 결합제-A8-2'의 p-RNA 올리고의 합성
인돌 결합제 포스포르아미다이트 108㎎ 및 A 포스포르아미다이트 244㎎을 합성기 바이알 속으로 중량 측정하여 데시케이터 중에서 KOH 상으로 CPG 지지체 28.1㎎이 패킹되어있으며, A 단위가 가중되어 있는 컬럼과 함께 고진공하에 둔다. 포스포르아미다이트를 아세토니트릴 1㎖(인돌 결합제) 또는 2.5㎖(A 포스포르아미다이트)에 용해시키고, 몇 비드의 분자체를 가한 다음, 데시케이터 중에서 KOH 상으로 밀폐시켜 방치시킨다.
요오드 200㎎을 아세토니트릴 50㎖ 중에서 격렬하게 교반하면서 용해시킨다. 모두 용해된 후(육안으로 조절), 물 23㎖ 및 sym-콜리딘 4.6㎖를 가하고 용액을 일단 철저히 혼합한다. 탈트리틸화의 경우, 디클로로메탄 중의 6% 농도의 디클로로아세트산 용액을 사용한다. 캡핑제(아세트산 무수물 + 염기)를 구입하여 올리고뉴클레오티드 합성에 대해 통상적인 바와 같이 사용한다.
벤즈이미다졸륨 트리플레이트를 뜨거운 아세토니트릴로부터 재결정화하고 건조시킨다. 거의 무색의 결정을 사용하여, 무수 아세토니트릴 중의 0.1M 용액을 커플링제로서 제조한다. 합성 동안, 상기 용액은 항상 투명한 상태로 잔류하고, 합성기 튜브를 차단하는 일은 발생하지 않는다.
에펜도르프 에코신(Ecosyn) 300+ (DMT-one) 중의 개질된 DNA 커플링 사이클:
탈트리틸화 7분
커플링 1시간
캡핑 1.5분
산화 1분
테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐 20㎎을 디클로로메탄 1.5㎖에 용해시키고, 디에틸암모늄 탄산수소염 20㎎, 트리페닐포스핀 20㎎ 및 올리고뉴클레오티드를 포함하는 유리 지지체를 가하고, 단단히 밀봉하여(파라필름) 바이알을 RT에서 5시간 동안 교반한다. 유리 지지체를 분석용 흡인 필터를 사용하여 흡인 여과하고, 디클로로메탄, 아세톤 및 물로 세척한다.
지지체를 0.1M 나트륨 디에틸디티오카보네이트 수용액을 사용하여 현탁시키고 RT에서 45분 동안 방치시킨다. 흡인 여과하고, 물, 아세톤, 에탄올 및 디클로로메탄으로 세척한다. 지지체를 24% 농도의 하이드라진 수화물 용액 1.5㎖에 현탁시키고, 24 내지 36시간 동안 4℃에서 진탕시킨 다음 0.1M 트리에틸암모늄 탄산수소염 완충액(TEAB 완충액)으로 7㎖로 희석시킨다. 하이드라진이 없어질 때까지 워터스(Waters) Sep-Pak 카트리지를 사용하여 세척한다. 80% 농도의 포름산 용액 5㎖로 처리하고, 30분 후 농축 건조시킨다. 잔사를 물 10㎖에 용해시키고, 디클로로메탄으로 추출한 다음, 수성상을 농축시키고, HPL 크로마토그래피한다(tR = 33분, 0.1M 트리에틸암모늄 아세테이트 완충액 중의 아세토니트릴 구배). 통상적으로 탈염시켜(워터스 Sep-Pak 카트리지) 올리고뉴클레오티드를 수득한다.
수율: 17.6 OD
ESI 질량 분광계에 의해 입증된 물질 확인:
M(계산치)=3082 D, (M+2H)2+ (실측치)=1541.9 D
실시예 7
접합체의 제조
1. 순차적 공정
서열 A8, 즉 옥타머의 p-RNA 올리고머를, 먼저 에펜도르프 에코신 D 300+상에서 실시예 2에 기재된 바와 같이 제조하며, 다음 시약을 교환한다: 6% 농도의 디클로로아세트산을 2% 농도의 트리클로로아세트산 대신, 콜리딘 중의 요오드를 피리딘 중의 요오드 대신, 벤즈이미다졸륨 트리플레이트 용액을 테트라졸 용액 대신. 합성 프로그램 변경 후, 서열 GATTC의 DNA 올리고머를 공지된 방법[참조: M.J. Gait, Oligonucleotide Synthesis, IRL Press, Oxford, UK 1984]에 따라 추가로 합성한다. 탈알릴화, 가하이드라진 분해, HPL 크로마토그래피 및 탈염을 상기 p-RNA 올리고머에 대해 설명한 바와 같이 수행하고(상기 참조), 목적하는 접합체를 수득한다.
2. 집중적 공정
삭제
실시예 2에 기술된 바와 같이, 서열 4'-인돌 결합제-A8-2'을 갖는 p-RNA 올리고머를 제조하고, 정제하여, 요오도아세틸화시킨다. 서열 GATTC-티올 결합제의 DNA 올리고머를 공지된 방법[참조: M.J. Gait, Oligonucleotide Synthesis, IRL Press, Oxford, UK 1984]에 따라 합성하고 정제한다[참조: 문헌(Glen Research: No. 20-2933)으로부터의 3'-티올 결합제]. 2개의 단편을 완충액 중에서 정치시켜 접합체가 생성되며[참조: T.Zhu et al., Bioconjug. Chem. 1994, 5, 312], 이는 최종적으로 HPLC로 정제한다.
실시예 8
아미노 개질된 p-RNA에 대한 비오틴 라디칼의 접합
먼저, 실시예 6에 기술된 공정과 유사하게, 유로겐텍(Eurogentec) (2-(2-(4-모노메톡시트리틸)아미노에톡시)에틸 2-시아노에틸 (N,N-디이소프로필)포스포르아미다이트)의 5'-아미노 개질제에 의해 4'-말단에 아미노 그룹이 제공된, 서열 TAGGCAAT의 p-RNA 올리고머를 합성하여 후처리하였다. 올리고뉴클레오티드(17.4 OD, 0.175μmol)를 염기성 완충액 0.5㎖에 용해시키고, 비오틴-N-하이드록시석신이미드 에스테르 1.14㎎(2.5μmol)을 DMF(무수) 114㎕에 용해시켜, 용액을 RT에서 1시간 동안 방치시켰다. 생성된 접합체는 예비 HPLC로 정제하고, 순수한 생성물은 세팍(Sepak)을 사용하여 탈염시켰다.
수율: 8.6 OD(49%)
M(계산치) = 3080 D, M(fef) = 3080.4 D
실시예 9
시아닌 또는 비오틴 표지된 p-RNA 온라인의 제조
다양한 A, T, G, C 및 Ind(Ind = 핵염기로서 아미노에틸 인돌) 포스포르아미다이트를 먼저 공지된 방법에 따라 제조하였다. 시아닌(Cy3-CE) 및 비오틴 포스포르아미다이트를 글렌 리서치(Glen Research)로부터 입수하였다.
완전 자동화된 고체상 합성을, 각각의 경우, 15μmol을 사용하여 수행하였다. 1회 합성 사이클은 다음 단계로 이루어져 있다:
(a) 탈트리틸화: CH2Cl2(79㎖) 중에서 6% DCA(디클로로아세트산)로 5분;
(b) CH2Cl2(20㎖), 아세토니트릴(20㎖)로 세척한 다음 아르곤으로 플러시;
(c) 커플링: 수지를 활성화제(CH2Cl2 중의 0.5M 피리딘.HCl(0.2㎖))로 세척한 다음, 이어서 1/1 비의 활성화제(0.76㎖) 및 상응 포스포르아미다이트(0.76㎖: 8당량; 아세토니트릴 중의 0.1M)로 30분 처리;
(d) 캡핑: 퍼셉티브(Perseptive)로부터 50% Cap A(10.5㎖) 및 50% Cap B(10.5㎖) (Cap A: THF, 루티딘, 아세트산 무수물; Cap B: 1-메틸이미다졸, THF, 피리딘)를 사용하여 2분;
(e) 산화: 요오드 용액(아세토니트릴 100㎖, H2O 46㎖ 및 sym-콜리딘 9.2㎖ 중의 요오드 400㎎) 120㎖로 1분 동안 처리; 및
(f) 아세토니트릴(22㎖)로 세척.
후속되는 올리고뉴클레오티드의 HPLC 정제를 용이하게 하기 위하여, 최종 DMT(디메톡시트리틸) 또는 MMT(모노메톡시트리틸) 보호 그룹은 비오틴 또는 시아닌 단량체로부터 제거하지 않는다. 개질된 포스포르아미다이트와의 최종 커플링 검출은 합성후 UV(503 ㎚)에서의 트리틸 양이온 흡광에 의해 수지 1%로 수행한다.
올리고뉴클레오티드의 후처리:
알릴 에테르 보호 그룹을 RT에서 5시간 후 CH2Cl2(15㎖) 중의 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐(272㎎), 트리페닐포스핀(272㎎) 및 디에틸암모늄 탄산수소염의 용액으로 제거하였다. 이어서, 유리 지지체를 CH2Cl2(30㎖), 아세톤(30㎖) 및 물(30㎖)로 세척하였다. 팔라듐 착체 잔사를 제거하기 위하여, 수지를 0.1M 나트륨 디에틸디티오카바메이트 하이드레이트 수용액으로 세정하였다. 상기 언급한 세척 공정을 1회 이상 역순으로 수행하였다. 이어서, 수지를 고진공하에 10분 동안 건조시켰다. 탈벤조일화와 동시에 유리 지지체로부터의 제거 단계는 24% 하이드라진 수화물 용액(6㎖) 중 4℃에서 수행하였다. RP18상에서의 HPLC 검사 후(18 내지 25시간), 올리고뉴클레오티드 "트리틸 ON"을 활성화된(아세토니트릴, 20㎖) 워터스 Spe-Pak 카트리지를 사용하여 하이드라진으로부터 유리시켰다. 상기 하이드라진을 TEAB 0.1M(30㎖)로 세척하였다. 이어서, 올리고뉴클레오티드를 아세토니트릴/TEAB 0.1M(10㎖)로 용출시켰다. (단편 서열의 분리를 위하여) 혼합물을 HPLC를 이용하여 정제하고, DMT 탈보호(80% 농도의 수성 포름산 30㎖)를 수행하였다. 최종 탈염(Sep-Pak 카트리지 사용, TEAB 완충액 0.1M/아세토니트릴: 1/1)하여 순수한 시아닌- 또는 비오틴-표지된 올리고머를 수득하였다.
당해 올리고 용액의 분취량(aliquot)은 ESI-MS를 수행하는 데 사용되었다.
4' Cy-AIndTTCCTA 2': 계산치 M = 3026, 실측치(M+H)+ = 3027
4' 비오틴-TAGGAAIndT 2': 계산치 M = 3014, 실측치 (M+H)2+ m/e 1508 및 (M+H)+ m/e 3015.
올리고는 저장을 위해 동결 건조시켰다.
실시예 10
N-(요오도아세틸옥시)석신이미드를 사용한 p-RNA의 요오도아세틸화
p-RNA 서열: 4' AGGCAIndT 2' Mw = 2266.56g/mol(Ind = 인돌-CH2-CH2-NH2-결합제)
p-RNA 1당량을 0.1M 탄산수소나트륨 용액(pH 8.4)에 용해시키고(350nmol당 1㎖) DMSO 중의 N-(요오도아세틸옥시)석신이미드 용액으로 처리하였다(㎎당 40㎕). 이 배치를 알루미늄 필름으로 가리고, 실온에서 30 내지 90분 동안 정치시켰다.
상기 반응의 진행은 분석용 HPLC를 사용하여 모니터하였다. 표준 조건은 다음과 같다:
완충액 A: 수중 0.1M 트리에틸암모늄 아세테이트 완충액
완충액 B: 1:4 비율의 물:아세토니트릴 중의 0.1M 트리에틸암모늄 아세테이트 완충액
구배: 40분 동안 10% B로부터 출발하여 50% B 까지
컬럼 재료: 머크 다름슈타트 게엠베하(Merck Darmstadt GmbH)로부터의 10μM 리크로스피어(LiChrosphere)
Figure 112000005480674-pct00028
100 RP-18; 250 x 4㎜
출발물질의 체류 시간: 18.4 분
이 경우 생성물의 체류 시간: 23.1분
반응 완료 후, 배치를 물을 사용하여 4배 용적으로 희석시켰다. 워터스 Sep-Pak 카트리지 RP-18(15 OD 2g 패킹)을 아세토니트릴 2 x 10㎖ 및 물 2 x 10㎖로 활성화시키고, 올리고를 가하여 침지시켜 반응 용기를 물 2 x 10㎖로 세척하고, 물 3 x 10㎖로 재세척하여 염 및 시약을 제거하고, 먼저 50:1 물:아세토니트릴 5 x 1㎖, 이어서 1:1 물:아세토니트릴로 용출시켰다. 생성물은 1:1 분획으로 매우 양호한 순도로 용출된다. 분획을 냉한 암실에서 농축시키고, 합하여, 다시 농축시켰다.
수율은 260㎚에서 UV 흡광 분광계를 이용하여 측정하였다.
질량 분석법:
서열: 4' AGGCAInd(CH2CH2NHCOCH2-I)T 2'
계산된 질량: 2434.50g/mol
실측된 질량 MH2 2+: 1217.9g/mol = 2433g/mol
실시예 11
p-RNA의 서열 CYSKVG의 펩티드로의 접합:
요오도아세틸화 p-RNA(Mw = 2434.50g/mol)를 완충액 시스템(114nmol당 1000㎕)에 용해시킨 다음, 완충액 중의 펩티드 용액(CYSKVG 펩티드 2mol; Mw = 655.773g/mol; 완충액 20㎕중 228nmol).
완충액 시스템: 리델-데 하엔(Riedel-de Haen)으로부터의 보락스(Borax)/HCl 완충액, pH 8.0을 1:1의 비율로 EDTA 이나트륨염의 10 mM 용액과 혼합하고, HCl을 사용하여 pH 6.3으로 조절하였다. 이 방법으로 5mM Na2EDTA를 함유하는 용액을 수득하였다.
상기 배치를 전환이 완결될 때까지 암실에서 실온에 방치시켰다. 상기 반응을 HPLC 분석에 의하여 모니터하였다.
표준 조건은 다음과 같다:
완충액 A: 수중 0.1M 트리에틸암모늄 아세테이트 완충액
완충액 B: 물:아세토니트릴 1:4중의 0.1M 트리에틸암모늄 아세테이트 완충액
구배: 40분 동안 10% B로부터 출발하여 50% B 까지
컬럼 재료: 머크 다름슈타트 게엠베하로부터의 10μM 리크로스피어
Figure 112005053617663-pct00029
100 RP-18; 250 x 4
출발물질의 체류 시간: 17.6분
생성물의 체류 시간: 15.5분
반응 완료 후, RP-HPLC를 사용하여 배치를 직접 정제하였다(표준 조건 상기 참조).
분획을 냉한 상태의 암실에서 농축시키고, 합하여 다시 농축시켰다. 잔사를 물에 용해시키고 탈염시켰다. 워터스 Sep-Pak 카트리지 RP-18(15 OD 2g 패킹)을 아세토니트릴 2 x 10㎖ 및 물 2 x 10㎖로 활성화시키고, 올리고를 가하여 침지시켜 반응 용기를 물 2 x 10㎖로 세척하고, 물 3 x 10㎖로 재세척하여 염을 제거한 다음, 1:1 비율의 물:아세토니트릴로 용출시켰다. 생성물 분획을 농축시켜, 합하고, 다시 농축시켰다.
수율은 260㎚에서 UV 흡광 분광계를 이용하여 측정하였다. 이들은 이론치의 70 내지 95%에 달한다.
질량 분석법:
서열: 4' AGGCAInd(CH2CH2NHCOCH2-CYSKVG)T 2'
계산된 질량: 2962.36g/mol
실측된 질량 MH2 2+: 1482.0g/mol = 2962g/mol.
실시예 12
p-RNA의 펩티드 라이브러리로의 접합
요오도아세틸화 p-RNA(Mw = 2434.50g/mol)를 완충액 시스템 중에 용해시킨 다음(832nmol당 1300㎕), 완충액(8mol; 평균 분자 질량 Mm = 677.82g/mol; 4.5㎎ = 완충액 200㎕ 중의 6.66μmol) 중의 펩티드 라이브러리 용액(CKR-XX-OH); X = Arg, Asn, Glu, His, Leu, Lys, Phe, Ser, Trp, Tyr)으로 처리하였다.
완충액 시스템: 리델-데 하엔으로부터의 보락스/HCl 완충액, pH 8.0을 1:1의 비로 수중 EDTA 이나트륨염의 10mM 용액과 혼합하여 HCl을 사용하여 pH 6.6으로 조절하였다. 5mM Na2EDTA를 함유하는 용액을 상기 방법으로 수득하였다.
배치를 전환이 완결될 때까지 암실에서 실온에 방치시켰다. 상기 반응은 HPLC 분석을 이용하여 모니터하였다. 이 경우, 출발 물질은 70시간 후 사라진다.
분석용 HPLC의 표준 조건은 다음과 같다:
완충액 A: 수중 0.1M 트리에틸암모늄 아세테이트 완충액
완충액 B: 물:아세토니트릴 1:4중의 0.1M 트리에틸암모늄 아세테이트 완충액
구배: 40분 동안 10% B로부터 출발하여 50% B까지
컬럼 재료: 머크 다름슈타트 게엠베하로부터의 10μM 리크로스피어
Figure 112000005480674-pct00030
100 RP-18; 250 x 4
출발물질의 체류 시간: 18.8 분
생성물의 체류 시간: 13.9 내지 36.2분으로부터 수 개의 피크
반응 완료 후, 물을 사용하여 배치를 4배로 희석시켰다. 워터스 Sep-Pak 카트리지 RP-18(15 OD 2g 패킹)을 아세토니트릴 3 x 10㎖ 및 물 3 x 10㎖로 활성화시키고, 올리고를 가하여 침지시켜, 반응 용기를 물 2 x 10㎖로 다시 세척하고, 카트리지를 물 3 x 10㎖로 재세척하여 염 및 과량의 펩티드를 제거한 다음, 생성물이 UV 분광계에 의해 더 이상 용출되지 않을 때까지 물:아세토니트릴을 1:1의 비율로 용출시켰다. 분획을 냉암실에서 농축시켜 합하고, 재농축시켰다.

Claims (31)

  1. 펜토피라노실뉴클레오시드 또는 펜토피라노실핵산과, 펩티드, 단백질 및 핵산으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 생체 분자를 포함하는 접합체.
  2. 제1항에 있어서, 하기 화학식 I 또는 화학식 II의 펜토피라노실뉴클레오시드를 포함하는 접합체.
    화학식 I
    화학식 II
    Figure 112005053617663-pct00045
    위의 화학식 I 및 II에서,
    R1은 H, OH, Hal, 또는
    Figure 112005053617663-pct00046
    및 -O-P[N(i-Pr)2]-(OCH2CH2CN)으로부터 선택된 라디칼, 또는 OSc3이고, 여기서, Hal은 Br 또는 Cl이고, i-Pr은 이소프로필이고, Sc3은 보호 그룹이고,
    R2, R3 및 R4는 서로 독립적으로 동일하거나 상이하고, 각각의 경우, H, Hal, NR5R6, OR7, SR8, =O, CnH2n+1, β-제거 가능한 그룹 또는 (CnH2n)NR10R11이고, 여기서, Hal은 Br 또는 Cl이고, R5, R6, R7 및 R8은 서로 독립적으로 동일하거나 상이하고, 각각의 경우, H, CnH2n+1, CnH2n-1 또는 -C(O)R9이고, n은 1 내지 12의 정수이고, R9는 치환되거나 치환되지 않은 직쇄 또는 측쇄 C1-6 알킬 라디칼 또는 페닐 라디칼이고, R10R11은 H, CnH2n+1 또는 화학식 III의 라디칼을 통하여 결합된 R10R11이고,
    X, Y 및 Z는 서로 독립적으로 동일하거나 상이하고, 각각의 경우, =N-, =C(R16)- 또는 -N(R17)-이고, 여기서, R16 및 R17은 서로 독립적으로 동일하거나 상이하고, 각각의 경우, H 또는 위에서 정의한 바와 같은 CnH2n+1 또는 (CnH2n)NR10R11이고,
    Sc1 및 Sc2는 서로 독립적으로 동일하거나 상이하고, 각각의 경우, H, 또는 아실, 트리틸 및 알릴옥시카보닐 그룹으로부터 선택된 보호 그룹이고,
    R1'는 H, OH, Hal, 또는
    Figure 112005053617663-pct00047
    및 -O-P[N(i-Pr)2]-(OCH2CH2CN)으로부터 선택된 라디칼, 또는 OSc3이고, 여기서, Hal은 Br 또는 Cl이고, i-Pr은 이소프로필이고, Sc3은 보호 그룹이고,
    R2', R3' 및 R4'는 서로 독립적으로 동일하거나 상이하고, 각각의 경우, H, Hal, =O, CnH2n+1 , -CnH2n-1, β-제거 가능한 그룹 또는 (CnH2n)NR10'R11'의 그룹이고, 여기서, Hal은 Br 또는 Cl이고, R10'및 R11'는 서로 독립적으로 R10 또는 R11에 대해 위에서 정의한 바와 같고,
    X'는 =N-, =C(R16')- 또는 -N(R17')-이고, 여기서, R16' 및 R17'는 서로 독립적으로 R16 또는 R17에 대해 위에서 정의한 바와 같고,
    Sc1' 및 Sc2'는 Sc1 및 Sc2에 대해 위에서 정의한 바와 같다.
    화학식 III
    Figure 112005053617663-pct00048
    위의 화학식 III에서,
    R12, R13, R14 및 R15는 서로 독립적으로 동일하거나 상이하고, 각각의 경우, H, OR7, CnH2n+1 또는 CnH2n-1이고, 여기서, R7 및 n은 위에서 정의한 바와 같다.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 하나 이상의 펜토피라노실뉴클레오시드와 하나 이상의 화학식 IV의 알릴옥시 결합제를 포함하는 접합체.
    화학식 IV
    Sc4NH(CnH2n)CH(OPSc5Sc6)CnH2nSc7
    위의 화학식 IV에서,
    Sc4 및 Sc7은 서로 독립적으로 동일하거나 상이하고, 각각의 경우, 플루오레닐메틸옥시카보닐(Fmoc) 및/또는 4,4'-디메톡시트리틸(DMT)로부터 선택된 보호 그룹이고,
    Sc5 및 Sc6은 서로 독립적으로 동일하거나 상이하고, 각각의 경우, 알릴옥시(-O-CH2-CH=CH2) 또는 디이소프로필아미노 그룹이며,
    n은 1 내지 12의 정수이다.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 펜토피라노실뉴클레오시드가 리보-, 아라비노-, 리크소- 및/또는 크실로피라노실뉴클레오시드인 접합체.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 펜토피라노실뉴클레오시드의 펜토피라노실 잔기가 D 또는 L 배위인 접합체.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 사용된 펜토피라노실뉴클레오시드가 펜토피라노실 퓨린, -2,6-디아미노퓨린, -6-퓨린티올, -피리딘, -피리미딘, -아데노신, -구아노신, -이소구아노신, -6-티오구아노신, -크산틴, -하이포크산틴, -티미딘, -시토신, -이소시토신, -인돌, -트립타민, -N-프탈로일트립타민, -우라실, -카페인, -테오브롬, -테오필린, -벤조트리아졸 또는 -아크리딘인 접합체.
  7. 제2항에 있어서, R2, R3, R4, R2', R3' 및/또는 R4'가 2-프탈이미도에틸 또는 알릴옥시(-O-CH2-CH=CH2) 라디칼인 접합체.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서, 펜토피라노실뉴클레오시드가 [2',4'-디-O-벤조일-β-리보피라노실]뉴클레오시드, N-벤조일-2',4'-디-O-벤조일리보피라노실뉴클레오시드, N-이소부티로일-2',4'-디-O-벤조일리보피라노실뉴클레오시드, O6-(2-시아노에틸)-N2-이소부티로일-2',4'-디-O-벤조일리보피라노실뉴클레오시드, O6-(2-(4'-니트로페닐)에틸)-N2-이소부티로일-2',4'-디-O-벤조일리보피라노실뉴클레오시드, β-리보피라노실뉴클레오시드, N-벤조일-β-리보피라노실뉴클레오시드, N-이소부티로일-β-리보피라노실뉴클레오시드, O6-(2-시아노에틸)-β-리보피라노실뉴클레오시드, O6-(2-(4-니트로페닐)에틸)-N2-이소부티로일-β-리보피라노실뉴클레오시드, 4'-DMT-펜토피라노실뉴클레오시드, N-벤조일-4'-DMT-리보피라노실뉴클레오시드, N-이소부티로일-4'-DMT-리보피라노실뉴클레오시드, O6-(2-시아노에틸)-N2-이소부티로일-4'-DMT-리보피라노실뉴클레오시드, O6-(2-(-4-니트로페닐)에틸)-N2-이소부티로일-4'-DMT-리보피라노실뉴클레오시드, β-리보피라노실-N,N'-디벤조일아데노신 또는 β-리보피라노실-N,N'-디벤조일구아노신인 접합체.
  9. 삭제
  10. 제1항에 있어서, 생체 분자가 항체 또는 이의 작용성 잔기이거나, 이의 천연 DNA 및/또는 RNA인 접합체.
  11. 펜토피라노실뉴클레오시드 또는 펜토피라노실핵산을, 펩티드, 단백질 및 핵산으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 생체 분자와 혼합함을 포함하는, 제1항에 따르는 접합체의 제조방법.
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 삭제
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Families Citing this family (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19741715A1 (de) * 1997-09-22 1999-03-25 Hoechst Ag Pentopyranosyl-Nucleosid, seine Herstellung und Verwendung
DE19741738A1 (de) * 1997-09-22 1999-03-25 Hoechst Ag Linker-Nucleosid, seine Herstellung und Verwendung
DE19741739B4 (de) * 1997-09-22 2006-04-27 Nanogen Recognomics Gmbh Supramolekulares Paarungssystem, dessen Herstellung und Verwendung
DE19815901A1 (de) * 1998-04-08 1999-10-14 Aventis Res & Tech Gmbh & Co Verfahren zur Herstellung von Pentopyranosyl-Nucleosiden
DE19837387A1 (de) 1998-08-18 2000-02-24 Aventis Res & Tech Gmbh & Co 3'-Desoxypentopyranosyl-Nucleinsäure, ihre Herstellung und Verwendung
US20010049111A1 (en) * 1999-08-13 2001-12-06 Norbert Windhab Methods, procedures, and formats for using microelectronic array devices to perform multiplex immunoassay analyses
DE10010118A1 (de) * 2000-03-03 2001-09-20 Henkel Kgaa Beschichtungssystem auf der Basis von Pyranosyl-Nukleinsäuren
DE10111681A1 (de) * 2001-03-09 2002-10-02 Nanogen Recognomics Gmbh Verbessertes Verfahren zur Herstellung von Pentopyranosyl-Nucleosiden
US6893822B2 (en) 2001-07-19 2005-05-17 Nanogen Recognomics Gmbh Enzymatic modification of a nucleic acid-synthetic binding unit conjugate
AU2003219576A1 (en) * 2003-04-03 2004-10-25 Korea Advanced Institute Of Science And Technology Conjugate for gene transfer comprising oligonucleotide and hydrophilic polymer, polyelectrolyte complex micelles formed from the conjugate, and methods for preparation thereof
CA2463719A1 (en) * 2003-04-05 2004-10-05 F. Hoffmann-La Roche Ag Nucleotide analogs with six membered rings
US20070286863A1 (en) * 2006-05-17 2007-12-13 Christopher Sinal CMKLR regulation of adipogenesis and adipocyte metabolic function
JP5126706B2 (ja) * 2007-02-16 2013-01-23 独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構 ２以上の水酸基を有する化合物のライブラリー合成方法
ES2616051T3 (es) 2008-12-02 2017-06-09 Wave Life Sciences Japan, Inc. Método para la síntesis de ácidos nucleicos modificados en el átomo de fósforo
AU2010270714B2 (en) 2009-07-06 2015-08-13 Wave Life Sciences Ltd. Novel nucleic acid prodrugs and methods use thereof
EP2593892A1 (en) * 2010-07-16 2013-05-22 Elitech Holding B.V. Orthogonal nucleic acid affinity pairs
US10428019B2 (en) 2010-09-24 2019-10-01 Wave Life Sciences Ltd. Chiral auxiliaries
EP2734208B1 (en) 2011-07-19 2017-03-01 Wave Life Sciences Ltd. Methods for the synthesis of functionalized nucleic acids
MX2015000577A (es) 2012-07-13 2015-08-14 Wave Life Sciences Pte Ltd Control quiral.
JP6246121B2 (ja) 2012-07-13 2017-12-13 株式会社新日本科学 キラル核酸アジュバント
CN107011400B (zh) 2012-07-13 2021-05-25 波涛生命科学有限公司 不对称辅助基团
WO2014175974A2 (en) 2013-03-13 2014-10-30 Elitech Holding B.V. Artificial nucleic acids
US10144933B2 (en) 2014-01-15 2018-12-04 Shin Nippon Biomedical Laboratories, Ltd. Chiral nucleic acid adjuvant having immunity induction activity, and immunity induction activator
US10322173B2 (en) 2014-01-15 2019-06-18 Shin Nippon Biomedical Laboratories, Ltd. Chiral nucleic acid adjuvant having anti-allergic activity, and anti-allergic agent
US10149905B2 (en) 2014-01-15 2018-12-11 Shin Nippon Biomedical Laboratories, Ltd. Chiral nucleic acid adjuvant having antitumor effect and antitumor agent
KR102423317B1 (ko) 2014-01-16 2022-07-22 웨이브 라이프 사이언시스 리미티드 키랄 디자인
US10472620B2 (en) 2014-07-01 2019-11-12 General Electric Company Method, substrate and device for separating nucleic acids
US10870845B2 (en) 2014-07-01 2020-12-22 Global Life Sciences Solutions Operations UK Ltd Methods for capturing nucleic acids
US9593368B2 (en) 2014-07-01 2017-03-14 General Electric Company Methods for amplifying nucleic acids on substrates
CN107556355B (zh) * 2016-06-30 2021-10-22 上海兆维科技发展有限公司 一种核苷双亚磷酰胺及其制备方法

Family Cites Families (114)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2644817A (en) * 1949-10-28 1953-07-07 Merck & Co Inc 1-glycosido-5, 6 dimethyl benzimidazoles and process therefor
GB690119A (en) * 1950-07-13 1953-04-15 British Drug Houses Ltd Improvements in or relating to the manufacture of heterocyclic compounds
US2719843A (en) * 1951-10-24 1955-10-04 Davoll John Method of synthesizing nucleosides and analogous compounds and compounds prepared thereby
GB866815A (en) * 1957-06-14 1961-05-03 Pfizer & Co C Piperazine salts
US2993039A (en) * 1959-11-06 1961-07-18 Upjohn Co Preparing nu-glycosides of aldose and ketose sugars
US3658788A (en) * 1969-06-06 1972-04-25 Salk Inst For Biological Studi Aminooxazolines and products thereof and processes for synthesizing same
US3752804A (en) 1969-06-14 1973-08-14 Takeda Chemical Industries Ltd 2-allyloxyinosine-5'-phosphate and physiologically acceptable salts thereof
JPS5036087A (ko) 1973-07-13 1975-04-04
JPS5821005B2 (ja) * 1974-08-26 1983-04-26 株式会社クボタ 球状黒鉛鋳鉄製造における黒鉛球状化剤
US3995190A (en) 1974-09-19 1976-11-30 Butler, Binion, Rice, Cook & Knapp Mobile ion film memory
US4283773A (en) 1977-08-30 1981-08-11 Xerox Corporation Programmable master controller communicating with plural controllers
US4225410A (en) 1978-12-04 1980-09-30 Technicon Instruments Corporation Integrated array of electrochemical sensors
JPS55153796A (en) * 1979-05-21 1980-11-29 Meiji Seika Kaisha Ltd 5-fluorouracil nucleoside and its preparation
US4352795A (en) 1981-01-29 1982-10-05 Warner-Lambert Company 7-β-D-Arabinofuranosyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidine compounds and methods for their production
JPS57146796A (en) * 1981-03-09 1982-09-10 Haruo Ogura Glycoside derivative
FI63596C (fi) 1981-10-16 1983-07-11 Orion Yhtymae Oy Mikrobdiagnostiskt foerfarande som grundar sig pao skiktshybridisering av nukleinsyror och vid foerfarandet anvaenda kombinationer av reagenser
US4476301A (en) * 1982-04-29 1984-10-09 Centre National De La Recherche Scientifique Oligonucleotides, a process for preparing the same and their application as mediators of the action of interferon
CA1223831A (en) * 1982-06-23 1987-07-07 Dean Engelhardt Modified nucleotides, methods of preparing and utilizing and compositions containing the same
US4580895A (en) 1983-10-28 1986-04-08 Dynatech Laboratories, Incorporated Sample-scanning photometer
EP0143623A3 (en) 1983-11-25 1987-09-23 Mars Incorporated Automatic test equipment
US4661451A (en) 1984-02-06 1987-04-28 Ortho Diagnostic Systems, Inc. Methods for immobilizing and translocating biological cells
FI71768C (fi) 1984-02-17 1987-02-09 Orion Yhtymae Oy Foerbaettrade nykleinsyrareagenser och foerfarande foer deras framstaellning.
DE3434039A1 (de) 1984-09-17 1986-03-27 Behringwerke Ag, 3550 Marburg Glycopeptide, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung
US4828979A (en) 1984-11-08 1989-05-09 Life Technologies, Inc. Nucleotide analogs for nucleic acid labeling and detection
US4584075A (en) 1984-11-26 1986-04-22 Ionics Incorporated Process and apparatus for electrically desorbing components selectively sorbed on an electrolytically conducting barrier
GB8432118D0 (en) 1984-12-19 1985-01-30 Malcolm A D B Sandwich hybridisation technique
US4594135A (en) 1985-02-20 1986-06-10 Ionics Incorporated Process and apparatus for electrically desorbing components selectively sorbed on granules
US5096807A (en) 1985-03-06 1992-03-17 Murex Corporation Imaging immunoassay detection system with background compensation and its use
JPH0337770Y2 (ko) 1985-03-30 1991-08-09
DE3513168A1 (de) * 1985-04-12 1986-10-16 Thomas 8000 München Dandekar Biosensor bestehend aus einem halbleiter auf silizium oder kohlenstoffbasis (elektronischer teil) und nukleinbasen (od. anderen biol. monomeren)
US4751177A (en) 1985-06-13 1988-06-14 Amgen Methods and kits for performing nucleic acid hybridization assays
US4816418A (en) 1985-07-22 1989-03-28 Sequoia-Turner Corporation Method and apparatus for performing automated, multi-sequential immunoassays
EP0213825A3 (en) 1985-08-22 1989-04-26 Molecular Devices Corporation Multiple chemically modulated capacitance
US4822566A (en) 1985-11-19 1989-04-18 The Johns Hopkins University Optimized capacitive sensor for chemical analysis and measurement
EP0228075B1 (en) 1986-01-03 1991-04-03 Molecular Diagnostics, Inc. Eucaryotic genomic dna dot-blot hybridization method
US5242797A (en) 1986-03-21 1993-09-07 Myron J. Block Nucleic acid assay method
US5125748A (en) 1986-03-26 1992-06-30 Beckman Instruments, Inc. Optical detection module for use in an automated laboratory work station
FR2604438B1 (fr) * 1986-09-26 1988-12-23 Centre Nat Rech Scient Nouveaux conjugues de couplage entre des sequences d'arn ou d'adn et une proteine, leur procede de preparation et leur application biologique
US4918056A (en) * 1986-10-14 1990-04-17 Health Research, Inc. (Roswell Park Division) 2-substituted arabinopyranosyl nucleosides and nucleotides
ATE111083T1 (de) 1986-10-22 1994-09-15 Abbott Lab Chemilumineszierende acridinium- und phenantridiniumsalze.
US4859538A (en) * 1986-11-20 1989-08-22 Ribi Hans O Novel lipid-protein compositions and articles and methods for their preparation
US4885211A (en) * 1987-02-11 1989-12-05 Eastman Kodak Company Electroluminescent device with improved cathode
US5202231A (en) 1987-04-01 1993-04-13 Drmanac Radoje T Method of sequencing of genomes by hybridization of oligonucleotide probes
YU57087A (en) 1987-04-01 1990-08-31 Centar Za Genticko Inzenjerstv Process for obtaining genome by hebridization and oligonucleotidic tests
US5114674A (en) 1987-05-01 1992-05-19 Biotronic Systems Corporation Added array of molecular chains for interfering with electrical fields
US4787963A (en) 1987-05-04 1988-11-29 Syntro Corporation Method and means for annealing complementary nucleic acid molecules at an accelerated rate
US5074977A (en) 1987-05-05 1991-12-24 The Washington Technology Center Digital biosensors and method of using same
EP0382736B1 (en) 1987-07-27 1994-11-02 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Receptor membranes
JP2603480B2 (ja) * 1987-08-05 1997-04-23 住友製薬株式会社 安定化されたアンスラサイクリン系製剤
CA1339303C (en) * 1987-09-21 1997-08-19 Lyle John Arnold Jr. Non-nucleotide linking reagents for nucleotide probes
US5359100A (en) 1987-10-15 1994-10-25 Chiron Corporation Bifunctional blocked phosphoramidites useful in making nucleic acid mutimers
GB8810400D0 (en) 1988-05-03 1988-06-08 Southern E Analysing polynucleotide sequences
US4908112A (en) 1988-06-16 1990-03-13 E. I. Du Pont De Nemours & Co. Silicon semiconductor wafer for analyzing micronic biological samples
US5188963A (en) 1989-11-17 1993-02-23 Gene Tec Corporation Device for processing biological specimens for analysis of nucleic acids
US5075077A (en) 1988-08-02 1991-12-24 Abbott Laboratories Test card for performing assays
WO1990001564A1 (en) 1988-08-09 1990-02-22 Microprobe Corporation Methods for multiple target analyses through nucleic acid hybridization
DE68926118T2 (de) 1988-08-18 1996-08-22 Au Membrane & Biotech Res Inst Verbesserungen an der empfindlichkeit und der selektivität von ionenkanalmembranbiosensoren
US5096669A (en) 1988-09-15 1992-03-17 I-Stat Corporation Disposable sensing device for real time fluid analysis
US5849482A (en) * 1988-09-28 1998-12-15 Epoch Pharmaceuticals, Inc. Crosslinking oligonucleotides
US5200051A (en) 1988-11-14 1993-04-06 I-Stat Corporation Wholly microfabricated biosensors and process for the manufacture and use thereof
US5063081A (en) 1988-11-14 1991-11-05 I-Stat Corporation Method of manufacturing a plurality of uniform microfabricated sensing devices having an immobilized ligand receptor
US5391723A (en) 1989-05-31 1995-02-21 Neorx Corporation Oligonucleotide conjugates
US5219726A (en) 1989-06-02 1993-06-15 The Salk Institute For Biological Studies Physical mapping of complex genomes
US5143854A (en) 1989-06-07 1992-09-01 Affymax Technologies N.V. Large scale photolithographic solid phase synthesis of polypeptides and receptor binding screening thereof
DE3924454A1 (de) * 1989-07-24 1991-02-07 Cornelis P Prof Dr Hollenberg Die anwendung von dna und dna-technologie fuer die konstruktion von netzwerken zur verwendung in der chip-konstruktion und chip-produktion (dna chips)
US5681941A (en) * 1990-01-11 1997-10-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Substituted purines and oligonucleotide cross-linking
US5126022A (en) 1990-02-28 1992-06-30 Soane Tecnologies, Inc. Method and device for moving molecules by the application of a plurality of electrical fields
US5750015A (en) 1990-02-28 1998-05-12 Soane Biosciences Method and device for moving molecules by the application of a plurality of electrical fields
WO1991015758A1 (en) 1990-04-11 1991-10-17 Ludwig Institute For Cancer Research Methods and apparatus allowing sequential chemical reactions
US5166063A (en) 1990-06-29 1992-11-24 Eli Lilly And Company Immobolization of biomolecules by enhanced electrophoretic precipitation
US5527670A (en) 1990-09-12 1996-06-18 Scientific Generics Limited Electrochemical denaturation of double-stranded nucleic acid
GB2247889A (en) 1990-09-12 1992-03-18 Scient Generics Ltd DNA denaturation by an electric potential
AU8517391A (en) 1990-09-12 1992-03-30 Scientific Generics Limited Electrochemical denaturation of double-stranded nucleic acid
US5227265A (en) 1990-11-30 1993-07-13 Eastman Kodak Company Migration imaging system
US5679757A (en) 1990-12-12 1997-10-21 The Regents Of The University Of California Highly organic solvent soluble, water insoluble electroluminescent polyphenylene vinylenes having pendant steroid groups and products and uses thereof
WO1992019960A1 (en) 1991-05-09 1992-11-12 Nanophore, Inc. Methods for the electrophoretic separation of nucleic acids and other linear macromolecules in gel media with restrictive pore diameters
US6048690A (en) 1991-11-07 2000-04-11 Nanogen, Inc. Methods for electronic fluorescent perturbation for analysis and electronic perturbation catalysis for synthesis
US5632957A (en) 1993-11-01 1997-05-27 Nanogen Molecular biological diagnostic systems including electrodes
US5605662A (en) 1993-11-01 1997-02-25 Nanogen, Inc. Active programmable electronic devices for molecular biological analysis and diagnostics
US5849486A (en) 1993-11-01 1998-12-15 Nanogen, Inc. Methods for hybridization analysis utilizing electrically controlled hybridization
US6017696A (en) 1993-11-01 2000-01-25 Nanogen, Inc. Methods for electronic stringency control for molecular biological analysis and diagnostics
US5846708A (en) 1991-11-19 1998-12-08 Massachusetts Institiute Of Technology Optical and electrical methods and apparatus for molecule detection
US5349203A (en) * 1991-12-09 1994-09-20 Mitsubishi Denki Kabushiki Kaisha Organic electric-field switching device
JPH05236997A (ja) 1992-02-28 1993-09-17 Hitachi Ltd ポリヌクレオチド捕捉用チップ
US5573905A (en) 1992-03-30 1996-11-12 The Scripps Research Institute Encoded combinatorial chemical libraries
GB9207086D0 (en) * 1992-03-31 1992-05-13 Sharp Kk Improvements relating to information technology
US5304487A (en) 1992-05-01 1994-04-19 Trustees Of The University Of Pennsylvania Fluid handling in mesoscale analytical devices
CA2140428C (en) * 1992-07-23 2003-07-08 Daniel Peter Claude Mcgee Novel 2'-o-alkyl nucleosides and phosphoramidites processes for the preparation and uses thereof
US5312527A (en) 1992-10-06 1994-05-17 Concordia University Voltammetric sequence-selective sensor for target polynucleotide sequences
US5433819A (en) 1993-05-26 1995-07-18 Pressac, Inc. Method of making circuit boards
CA2170264A1 (en) 1993-09-10 1995-03-16 Michael W. Konrad Optical detection of position of oligonucleotides on large dna molecules
US5965452A (en) 1996-07-09 1999-10-12 Nanogen, Inc. Multiplexed active biologic array
US5445525A (en) 1994-05-12 1995-08-29 Intel Corporation Interconnection scheme for integrated circuit card with auxiliary contacts
WO1997027317A1 (en) * 1996-01-23 1997-07-31 Affymetrix, Inc. Nucleic acid analysis techniques
MX9702927A (es) * 1994-10-24 1998-04-30 Genencor Int L-piranosilnucleosidos.
US5718915A (en) * 1994-10-31 1998-02-17 Burstein Laboratories, Inc. Antiviral liposome having coupled target-binding moiety and hydrolytic enzyme
US5585069A (en) 1994-11-10 1996-12-17 David Sarnoff Research Center, Inc. Partitioned microelectronic and fluidic device array for clinical diagnostics and chemical synthesis
US5464517A (en) 1995-01-30 1995-11-07 Bio-Rad Laboratories Electrophoresis in low conductivity buffers
US5602262A (en) * 1995-02-03 1997-02-11 Eli Lilly And Company Process for the preparation of 2-deoxy-2,2-difluoro-β-D-ribo-pentopyranose
US5559222A (en) * 1995-02-03 1996-09-24 Eli Lilly And Company Preparation of 1-(2'-deoxy-2',2'-difluoro-D-ribo-pentofuranosyl)-cytosine from 2-deoxy-2,2-difluoro-β-D-ribo-pentopyranose
ATE206131T1 (de) 1995-03-13 2001-10-15 Aventis Pharma Gmbh Phosphonomonoesternnukleinsäuren, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung
AU5958196A (en) * 1995-06-01 1996-12-24 Hybridon, Inc. Novel base protecting groups for oligonucleotide synthesis
EP0851866B1 (en) * 1995-06-23 2001-08-29 Oxford GlycoSciences (UK) Limited Therapeutic compounds
WO1997005156A1 (en) 1995-07-27 1997-02-13 Carsten Behrens A new achiral linker reagent for the incorporation of multiple amino groups into oligonucleotides
US5912340A (en) 1995-10-04 1999-06-15 Epoch Pharmaceuticals, Inc. Selective binding complementary oligonucleotides
WO1997014709A1 (en) * 1995-10-13 1997-04-24 F. Hoffmann-La Roche Ag Antisense oligomers
GB9602028D0 (en) 1996-02-01 1996-04-03 Amersham Int Plc Nucleoside analogues
US5660701A (en) 1996-02-29 1997-08-26 Bio-Rad Laboratories, Inc. Protein separations by capillary electrophoresis using amino acid-containing buffers
DE19651560A1 (de) * 1996-12-11 1998-06-18 Hoechst Ag Neue funktionelle supramolekulare Nanosysteme
JPH10306907A (ja) * 1997-05-06 1998-11-17 Kobe Steel Ltd 流動層熱分解方法及び熱分解炉並びに被燃焼物処理装置
EE9900564A (et) * 1997-06-10 2000-06-15 Glaxo Group Limited Bensimidasooli derivaadid
DE19741738A1 (de) * 1997-09-22 1999-03-25 Hoechst Ag Linker-Nucleosid, seine Herstellung und Verwendung
DE19741715A1 (de) * 1997-09-22 1999-03-25 Hoechst Ag Pentopyranosyl-Nucleosid, seine Herstellung und Verwendung
AU6751800A (en) * 1999-08-13 2001-03-13 Aventis Research And Technologies Gmbh Microelectronic molecular descriptor array devices, methods, procedures, and formats for combinatorial selection of intermolecular ligand binding structures and for drug screening

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