JP2001517675A - ペントピラノシルヌクレオシドの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は下記の式（Ｉ）又は式（ＩＩ）のペントピラノシルヌクレオシド、該ペントピラノシルヌクレオシドの製造、及び治療剤、診断剤及び／又は電子構成要素を製造するためのその利用に関する。式（Ｉ） 【化１】 式（ＩＩ） 【化２】

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】技術分野 本発明は、下記式（Ｉ）又は式（ＩＩ）のペントピラノシルヌクレオシド、そ
の製造及び治療的、診断的及び／又は電子的構成要素の生産のための利用に関す
る。

【０００２】

【化８】

【０００３】

【化９】

【０００４】 背景技術 ピラノシル核酸（ｐ−ＮＡｓ）は一般に、ペントース単位がピラノース型であ
り、Ｃ−２′位とＣ−４′位との間でホスホジエステルにより繰り返して結合さ
れている天然ＲＮＡに対し、異性である型構造のものである（図１）。「核酸塩
基（ｎｕｃｌｅｏｂａｓｅ）」はここでは標準核酸塩基Ａ、Ｔ、Ｕ、Ｃ、Ｇ、Ｅ
を意味するものとして解されるが、またイソグアニン／イソシトシン及び２，６
−ジアミノプリン／キサンチン対も、そして本発明の意味ではまた他のプリン及
びピリミジンも「核酸塩基」に包含される。ｐ−ＮＡｓ、すなわちリボースから
誘導されたｐ−ＲＮＡｓは最初にＥｓｃｈｅｎｍｏｓｅｒらにより報告された（
参照、Ｐｉｔｓｃｈ，Ｓら．Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ１９９３，７６，２
１６１； Ｐｉｔｓｃｈ，Ｓら．Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ１９９５，７８ ，１６２１；Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．１９９６，１０８，１６１９−１６２３）
。それらはもっぱら、いわゆるワトソン−クリック対合の（Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒ
ｉｃｋ−ｐａｉｒｅｄ）、すなわちプリン−ピリミジン−及びプリン−プリン−
対の、逆平行の、可逆的に融解する（ｍｅｌｔｉｎｇ）、擬リニアー状の（ｑｕ
ａｓｉ−ｌｉｎｅａｒ）、そして安定な二重鎖（ｄｕｐｌｅｘｅｓ）を形成する
。対掌性（ｃｈｉｒａｌｉｔｙ）の反対の意味のホモキラルｐ−ＲＮＡ鎖は同じ
く対合するのを制御でき、形成された二重鎖は厳密には非螺旋状である。この特
異性は、超分子の構築のために価値があり、これはリボピラノースホスフェート
基幹の比較的低いフレキシビリティー、基面（ｂａｓｅ ｐｌａｎｅ）の鎖軸に 対する強度の傾き、及びこれから生じる、インターカテナリーベース（ｉｎｔｅ
ｒｃａｔｅｎａｒｙ ｂａｓｅ）が生成二重鎖に積み重なる傾向と関係づけられ 、結局、基幹の構築に２′，４′−シス−ジ置換リボピラノース環の関与に帰せ
られる。これらの特に良好な対合特性は超分子単位の構築に用いて、ｐ−ＮＡｓ
対系をＤＮＡ及びＲＮＡと比べて好ましくさせる。それらは天然の核酸に直交す
る対系を形成する、すなわち特に診断分野で重要である、天然形態で産生するＤ
ＮＡｓ及びＲＮＡｓとは対合しない。

【０００５】 Ｅｓｃｈｅｎｍｏｓｅｒら（１９９３以前）は、図２に示し、以下に説明する
ように最初にｐ−ＲＮＡを製造した。

【０００６】 このような状況において、適当な保護核酸塩基がビス（トリメチルシリル）ア
セタミドの作用で、そしてルイス酸、例えばトリメチルシリルトリフルオロメタ
ンスルホネートの作用でテトラベンゾイルリボピラノースのアノマー混合物と反
応させられた（Ｈ．Ｖｏｒｂｒｕｇｇｅｎ，Ｋ．Ｋｒｏｌｉｋｉｅｗｉｃｚ，Ｂ
．Ｂｅｎｎｕａ，Ｃｈｅｍ．Ｂｅｒ．１９８１，１１４，１２３４に類似）。塩
基（プリンの場合にはＴＨＦ／メタノール／水中のＮａＯＨ；ピリミジンの場合
にはＭｅＯＨ中の飽和アンモニア）の作用下に、アシル保護された基を糖から除
去し、生成物を酸性接触下にp−アニスアルデヒドジメチルアセタールで３′， ４′−位で保護した。ジアステレオマー混合物を２′−位でアシル化し、３′，
４′−メトキシベンジリデン−保護された２′−ベンゾエートを酸性処理、例え
ばメタノール中のトリフルオロ酢酸で脱アセタール化し、ジメトキシトリチルク
ロリドと反応させた。ベンゾエートの２′⇒３′転移はp−ニトロフェノール／ ４−（ジメチルアミノ）ピリジン／トリエチルアミン／ピリジン／ｎ−プロパノ
ールで処理することにより開始された。ほとんどすべての反応はカラムクロマト
グラフィーにより仕上げられた。次いで、この方法で合成されたキー単位、リボ
ピラノースの４′−ＤＭＴ−３′−ベンゾイル−１′−核酸塩基誘導体を部分的
にホスフィチル化し、リンカーを介して固相に結合させた。

【０００７】 次いで自動オリゴヌクレオチド合成で、４′−位で担体に結合された成分を、
繰り返し酸性状態で脱保護し、ホスホルアミダイトをカップリング試薬、例えば
テトラゾール誘導体の作用で結合させ、まだ遊離の４′−酸素原子をアセチル化
し、リン原子をオリゴマー生成物を得るために酸化した。次いで、残留保護基を
除去し、生成物を精製し、ＨＰＬＣで脱塩した。

【０００８】 しかし、Ｅｓｃｈｅｎｍｏｓｅｒらの報告した方法（１９９３以前）は次の不
利を示す： １．核酸塩基でのヌクレオシド化反応のための非アノマーとして純粋なテトラベ
ンゾペントピラノース（Ｈ．Ｇ．Ｆｌｅｔｃｈｅｒ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏ
ｃ．１９５５，７７，５３３７）の使用は、次の工程での過酷なクロマトグラフ
ィーの必要のために最終生成物の収率を減少させる。 ２．１′−位に核酸塩基を有するリボピラノースから出発して、保護された３′
−ベンゾエートまでの５つの反応段階で合成が非常に遅延し、工業的規模での実
施はほとんど不可能である。時間的浪費が大きい上に、得られるモノマー単位の
収率がプリン単位アデニンの場合で２９％、ピリミジン単位ウラシルの場合で２
４％と低い。 ３．オリゴヌクレオチドの合成では、自動p−RNA合成で５−（４−ニトロフェニ
ル）−１Ｈ−テトラゾールがカップリング試薬として用いられる。アセトニトリ
ル中のテトラゾールの溶液でのこの試剤の濃度は、この場合に５−（４−ニトロ
フェニル）−１Ｈ−テトラゾール合成器の細管中で一様に晶出し、かくして合成
が早期に終わるほどに高い。さらに、オリゴマーが５−（４−ニトロフェニル）
−１Ｈ−テトラゾールで汚染されることが観察された。 ４．報告されたｐ−ＲＮＡのオリゴヌクレオチドの仕上げ、特に塩基に不安定な
保護基のヒドラジン溶液での除去は、オリゴマー中に高チミジン画分があると必
ずしも可能ではない。発明の開示 それ故に、本発明の目的は、既知及び新規のペントピラノシルヌクレオシドの
製造を既知の方法より大規模に行うのを可能にし、上述の不利を回避するペント
ピラノシルヌクレオシドの新規な製造法を用いうるようにすることである。それ
故に、本発明の課題は、未保護ペントピラノシドから出発して、（ａ）第１の工
程で、ペントピラノシドの２′，３′又は４′−位を先ず保護し、（ｂ）第２の
工程で、残りの２′，３′又は４′−位の他の位置を保護することを特徴とする
ペントピラノシルヌクレオシドの製造方法である。好ましい態様では、次の式（
Ｉ）及び（ＩＩ）のものについてである。 式（Ｉ）

【０００９】

【化１０】

【００１０】 ｛ここで、Ｒ¹はＨ、ＯＨ、Ｈａｌ（ここでＨａｌはＢｒ又はＣｌである）、又 は式

【００１１】

【化１１】

【００１２】 、又は式

【００１３】

【化１２】

【００１４】 又は−Ｏ−Ｐ［Ｎ（ｉ−Ｐｒ）₂］−（ＯＣＨ₂ＣＨ₂ＣＮ）（ここでｉ−Ｐｒは イソプロピルである）から選ばれた基であり、Ｒ²，Ｒ³及びＲ⁴はそれぞれ、互 いに独立して、同一であるか又は異なって、Ｈ、Ｈａｌ（ここでＨａｌはＢｒ又
はＣｌである）、ＮＲ⁵Ｒ⁶、ＯＲ⁷、ＳＲ⁸、＝Ｏ、Ｃ_nＨ_2n+1（ここでｎは１− １２、好ましくは１−８、特に１−４の整数である）、β−脱離性基（β−ｅｌ
ｉｍｉｎａｂｌｅ ｇｒｏｕｐ）、好ましくは式−ＯＣＨ₂ＣＨ₂Ｒ¹⁸（ここでＲ ¹⁸ はシアノ基、ｐ−ニトロフェニル基、フルオレニルメチルオキシカルボニル（
Ｆｍｏｃ）基である）、又は（Ｃ_nＨ_2n）ＮＲ¹⁰Ｒ¹¹［ここでＲ¹⁰Ｒ¹¹はＨ、Ｃ_n Ｈ_2n+1であるか又は式

【００１５】

【化１３】

【００１６】 〔ここで、Ｒ¹²，Ｒ¹³，Ｒ¹⁴，Ｒ¹⁵はそれぞれ、互いに独立して、同一であるか
又は異なって、Ｈ、ＯＲ⁷（ここでＲ⁷は上記の意味をもつ）、又はＣ_nＨ_2n+1又 はＣ_nＨ_2n-1（ここでｎは上記の意味をもつ）である〕の基を介して結合されて いる］であって、かつＲ⁵，Ｒ⁶，Ｒ⁷，Ｒ⁸はそれぞれ、互いに独立して、同一で
あるか又は異なって、Ｈ、Ｃ_nＨ_2n+1又はＣ_nＨ_2n-1（ここでｎは上記の意味をも
つ）、又は−Ｃ（Ｏ）Ｒ⁹（ここでＲ⁹は直鎖状又は分枝状の、場合により置換さ
れたアルキル又はアリール基、好ましくはフェニル基である）であり、Ｘ，Ｙ，
Ｚはそれぞれ、互いに独立して、同一であるか又は異なって、＝Ｎ−、＝Ｃ（Ｒ ¹⁶ ）−又は−Ｎ（Ｒ¹⁷）−（ここでＲ¹⁶及びＲ¹⁷はそれぞれ、互いに独立して、
同一であるか又は異なって、Ｈ、又は上記の意味をもつＣ_nＨ_2n+1又は（Ｃ_nＨ_2n ）ＮＲ₁₀Ｒ₁₁である）であり、そしてＳ_c1及びＳ_c2はそれぞれ、互いに独立して
、同一であるか又は異なって、Ｈ、又はアシル、トリチル又はアリルオキシカル
ボニル基、好ましくはベンゾイル又は４，４′−ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）
基から選ばれた保護基である｝ 式（ＩＩ）

【００１７】

【化１４】

【００１８】 ［ここで、Ｒ¹′はＨ、ＯＨ、Ｈａｌ（ここでＨａｌはＢｒ又はＣｌである）、 又は式

【００１９】

【化１５】

【００２０】 、又は式

【００２１】

【化１６】

【００２２】 又は−Ｏ−Ｐ［Ｎ（ｉ−Ｐｒ）₂］−（ＯＣＨ₂ＣＨ₂ＣＮ）（ここでｉ−Ｐｒは イソプロピルである）から選ばれた基であり、Ｒ²′，Ｒ³′及びＲ⁴′はそれぞ れ、互いに独立して、同一であるか又は異なって、Ｈ、Ｈａｌ（ここでＨａｌは
Ｂｒ又はＣｌである）、＝Ｏ、Ｃ_nＨ_2n+1、Ｃ_nＨ_2n-1、β−脱離性基、好ましく
は式−ＯＣＨ₂ＣＨ₂Ｒ¹⁸（ここでＲ¹⁸はシアノ基、ｐ−ニトロフェニル基、フル
オレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基である）、又は（Ｃ_nＨ_2n）Ｎ Ｒ¹⁰′Ｒ¹¹′（ここでＲ¹⁰′，Ｒ¹¹′は互いに独立して、上記のＲ¹⁰又はＲ¹¹の
意味をもつ）であり、Ｘ′は＝Ｎ−、＝Ｃ（Ｒ¹⁶′）−又は−Ｎ（Ｒ¹⁷′）−（
ここでＲ¹⁶′及びＲ¹⁷′は互いに独立して上記のＲ¹⁶又はＲ¹⁷の意味をもつ）で
あり、そしてＳ_c1′及びＳ_c2′は上記のＳ_c1及びＳ_c2の意味をもつ］ 本発明によるペントピラノシルヌクレオシドは一般にペントピラノシル部がＤ
配置（Ｄ ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）である（しかし、Ｌ配置の場合もある
）、リボ−、アラビノ−、リキソ−及び／又はキシロピラノシルヌクレオシド、
好ましくはリボピラノシルヌクレオシドである。

【００２３】 通例、本発明によるペントピラノシルヌクレオシドは、ペントピラノシルプリ
ン、−２，６−ジアミノプリン、−６−プリンチオール、−ピリジン、−ピリミ
ジン、−アデノシン、−グアノシン、−イソグアノシン、−６−チオグアノシン
、−キサンチン、−ヒポキサンチン、−チミジン、−シトシン、−イソシトシン
、−インドール、−トリプタミン、−Ｎ−フタロイルトリプタミン、−ウラシル
、−カフェイン、−テオブロミン、−テオフィリン、−ベンゾトリアゾール又は
−アクリジン、特にペントピラノシルプリン、−ピリミジン、−アデノシン、−
グアノシン、−チミジン、−シトシン、−トリプタミン、−Ｎ−フタロイルトリ
プタミン又は−ウラシルである。

【００２４】 この化合物はまた、リンカーとして、すなわち生体分子、例えばＤＮＡ、ＲＮ
Ａのみならずｐ−ＮＡｓ、好ましくはｐＲＮＡｓなどの、天然型で産生する核酸
又は修飾された核酸のような生体分子に共有結合しうる官能基をもつ化合物とし
て用いられるペントピラノシルヌクレオシドを包含する。これはリンカーがｐ−
ＮＡｓ用にはまだ知られていないので驚くべきことである。

【００２５】 例えば、これらは、Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁴、Ｒ²′、Ｒ³′及び／又はＲ⁴′が２−フタ
ルイミドエチル又はアリルオキシ基であるペントピラノシルヌクレオシドを包含
する。本発明による好適なリンカーは例えば好ましくはウラシルの５−位が修飾
されているウラシルベースリンカー（ｕｒａｃｉｌ−ｂａｓｅｄ ｌｉｎｋｅｒ ｓ）、例えばＮ−フタロイルアミノエチルウラシルであり、またインドールベー
スリンカー、好ましくは例えばＮ−フタロイルトリプタミンのようなトリプタミ
ン誘導体である。

【００２６】 驚くべきことに、本発明によれば、より取り扱いやすいペントピラノシル−Ｎ
，Ｎ−ジアシルヌクレオシド、好ましくはプリン、特にアデノシン、グアノシン
又は６−チオグアノシンもまた利用しうるようになり、その核酸塩基を簡単な方
法で完全に脱保護しうる。それ故に本発明はまた、Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁴、Ｒ²′、Ｒ³ ′及び／又はＲ⁴′が式−Ｎ［Ｃ（Ｏ）Ｒ⁹］₂の基、特にＮ⁶，Ｎ⁶−ジベンゾイ ル−９−（β−Ｄ−リボピラノシルアデノシンであるペントピラノシルヌクレオ
シドを包含する。

【００２７】 さらに驚くべきことには、本発明は、ペントピラノシド部位の３′−酸素原子
上を除いて、保護基、好ましくは塩基又は金属接触により除去しうる保護基、特
にアシル基、特に好ましくはベンゾイル基をもつ、ペントピラノシルヌクレオシ
ドを利用しうるようになる。これらの化合物は、例えば追加の精製工程のような
収率を低下させる追加の工程なしに、ペントピラノシド部位の４′−酸素原子に
さらなる保護基、好ましくは酸又は塩基に不安定な保護基、特にトリチル基、特
に好ましくはジメトキシトリチル基を直接導入するための出発物質として役立つ
。

【００２８】 さらに、本発明は、ペントピラノシド部位の４′−酸素原子上を除いて、保護
基、好ましくは酸又は塩基に不安定な保護基、特にトリチル基、特に好ましくは
ジメトキシトリチル基をもつ、ペントピラノシルヌクレオシドを利用しうるよう
になる。これらの化合物もまた、例えば追加の精製工程のような収率を低下させ
る追加の工程なしに、例えばペントピラノシド部位の２′−酸素原子などに、さ
らなる保護基、好ましくは塩基又は金属接触により除去しうる保護基、特にアシ
ル基、特に好ましくはベンゾイル基を直接導入するための出発物質として役立つ
。

【００２９】 一般に、本発明によるペントピラノシルヌクレオシドは、収率を高め、それ故
に特に有利であるいわゆるワンポット（ｏｎｅ−ｐｏｔ）反応で反応させうる。
次の化合物がペントピラノシルヌクレオシドの好適例である。 Ａ）［２′，４′−ジ−Ｏ−ベンゾイル）−β−リボピラノシル］ヌクレオシド
、特に［２′，４′−ジ−Ｏ−ベンゾイル）−β−リボピラノシル］−アデニン
、−グアニン、−シトシン、−チミジン、−ウラシル、−キサンチン又は−ヒポ
キサンチン、及びＮ−ベンゾイル−２′，４′−ジ−Ｏ−ベンゾイルリボピラノ
シルヌクレオシド、特に−アデニン、−グアニン又は−シトシン、及びＮ−イソ
ブチロイル−２′，４′−ジ−Ｏ−ベンゾイルリボピラノシルヌクレオシド、特
に−アデニン、−グアニン又は−シトシン、及びＯ⁶−（２−シアノエチル）− Ｎ２−イソブチロイル−２′，４′−ジ−Ｏ−ベンゾイルリボピラノシルヌクレ
オシド、特に−グアニン及びＯ６−（２−（４−ニトロフェニル）エチル）−Ｎ
２−イソブチロイル−２′，４′−ジ−Ｏ−ベンゾイルリボピラノシルヌクレオ
シド、特に−グアニン。 Ｂ）β−リボピラノシルヌクレオシド、β−リボピラノシルアデニン、−グアニ
ン、−シトシン、−チミジン、−ウラシル、−キサンチン又は−ヒポキサンチン
、及びＮ−ベンゾイル−、Ｎ−イソブチロイル、 Ｏ⁶−（２−シアノエチル）−
又はＯ⁶−（２−（４−ニトロフェニル）エチル）−Ｎ²−イソブチロイル−β−
リボピラノシルヌクレオシド。 Ｃ）４′−ＤＭＴ−ペントピラノシルヌクレオシド、好ましくは４′−ＤＭＴ−
リボピラノシルヌクレオシド、特に４′−ＤＭＴ−リボピラノシルアデニン、−
グアニン、−シトシン、−チミジン、−ウラシル、−キサンチン又は−ヒポキサ
ンチン、及びＮ−ベンゾイル−４′− ＤＭＴ−リボピラノシルヌクレオシド、 特にＮ−ベンゾイル−４′− ＤＭＴ−リボピラノシルアデニン、−グアニン又 は−シトシン、及びＮ−イソブチロイル−４′− ＤＭＴ−リボピラノシルヌク レオシド、特にＮ−イソブチロイル−４′− ＤＭＴ−リボピラノシルアデニン 、−グアニン又は−シトシン、及びＯ⁶−（２−シアノエチル）− Ｎ²−イソブ チロイル−４′− ＤＭＴ−リボピラノシルヌクレオシド、特にＯ⁶−（２−シア
ノエチル）− Ｎ²−イソブチロイル−４′− ＤＭＴ−リボピラノシルグアニン 、及びＯ⁶−（２−（４−ニトロフェニル）エチル）−Ｎ²−イソブチロイル−４
′− ＤＭＴ−リボピラノシルヌクレオシド、特にＯ⁶−（２−（４−ニトロフェ
ニル）エチル）−Ｎ²−イソブチロイル−４′− ＤＭＴ−リボピラノシルグアニ
ン。 Ｄ）β−リボピラノシル−Ｎ，Ｎ′−ジベンゾイルアデノシン又はβ−リボピラ
ノシル−Ｎ，Ｎ′−ジベンゾイルグアノシン。

【００３０】 オリゴヌクレオチド合成の好適な前駆体は、例えば４′− ＤＭＴ−ペントピ ラノシルヌクレオシド−２′−ホスフィタミド／−Ｈ−ホスホネート、好ましく
は４′− ＤＭＴ−リボピラノシルヌクレオシド−２′−ホスフィタミド／−Ｈ −ホスホネート、特に４′− ＤＭＴ−リボピラノシルアデニン−、−グアニン −、−シトシン−、−チミジン−、−キサンチン−、−ヒポキサンチン−又は−
ウラシル−２′−ホスフィタミド／−Ｈ−ホスホネート、及びＮ−ベンゾイル−
４′− ＤＭＴ−リボピラノシルアデニン−、−グアニン−又は−シトシン−２ ′−ホスフィタミド／−Ｈ−ホスホネート、及びＮ−イソブチロイル−４′− ＤＭＴ−リボピラノシルアデニン−、−グアニン−又は−シトシン−２′−ホス
フィタミド／−Ｈ−ホスホネート、及びＯ⁶−（２−シアノエチル）−４′− Ｄ
ＭＴ−リボピラノシルグアニン−、−キサンチン−又は−ヒポキサンチン−２′
−ホスフィタミド／−Ｈ−ホスホネート、又は Ｏ⁶−（２−（４−ニトロフェニ
ル）エチル）−Ｎ²−イソブチロイル−４′− ＤＭＴ−リボピラノシル−グアニ
ンであり、そして固体担体ヘのカップリング用には、例えば４′− ＤＭＴ−ペ ントピラノシルヌクレオシド−２′−スクシネート、好ましくは４′− ＤＭＴ −リボピラノシルヌクレオシド−２′−スクシネート、特に４′− ＤＭＴ−リ ボピラノシルアデニン−、−グアニン−、−シトシン−、−チミジン−、−キサ
ンチン−、−ヒポキサンチン−又は−ウラシル−２′−スクシネート、及びＮ−
ベンゾイル−４′− ＤＭＴ−リボピラノシルアデニン−、−グアニン−又は− シトシン−２′−スクシネート、及びＮ−イソブチロイル−４′− ＤＭＴ−リ ボピラノシルアデニン−、−グアニン−又は−シトシン−２′−スクシネート、
及びＯ−（２−シアノエチル）−４′− ＤＭＴ−リボピラノシルグアニン−２ ′−スクシネート、及びＯ⁶−（２−（４−ニトロフェニル）エチル）−Ｎ²−イ
ソブチロイル−４′− ＤＭＴ−リボピラノシルグアニン−２′−スクシネート である。

【００３１】 本発明による方法は、引用文献に記載された核酸塩基に制限されず、驚くべき
ことに多数の天然及び合成の核酸塩基を用いて成功裡に行われる。さらに、特に
驚くべきことには本発明による方法は文献から知られた方法に比べて高収率で平
均６０％の時間節約を伴って行われ、特に工業的適用に有利である。その上に、
本発明による方法を用いると、文献に記載された方法に必要な精製工程、例えば
クロマトグラフィーによる中間精製処理を要さず、反応が著しく空時収率を高め
るいわゆるワンポット反応として行われる場合もある。

【００３２】 特別な態様として、２′−保護位の場合に、２′−位から３′−位への保護基
の転移が一般的には塩基の存在下に行われ、特にＮ−エチルジイソプロピルアミ
ン及び／又はトリエチルアミンの存在下に行われる。本発明に従い、この反応は
特に有利にはワンポット反応として同じ反応容器で行われる。

【００３３】 さらに好ましい態様では、ピラノシルヌクレオシドは、酸に不安定であるか、
塩基に不安定であるか、又は金属接触で除去されうる保護基Ｓ_c1、Ｓ_c2、 Ｓ_c1 ′又はＳ_c2′によって保護され、保護基Ｓ_c1及び Ｓ_c1′は保護基Ｓ_c2及びＳ_c2 ′とは異なっているのが好ましい。一般に、上記保護基はアシル基、好ましくは
アセチル、ベンゾイル、ニトロベンゾイル及び／又はメトキシベンゾイル基、ト
リチル基、好ましくは４，４′−ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）基又はβ−除去
しうる基、好ましくは式ＯＣＨ₂ＣＨ₂Ｒ¹⁸（ここで、Ｒ¹⁸はシアノ基、ｐ−ニト
ロフェニル基又はフルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基である）
の基である。

【００３４】 特に好ましくは、２′−又は３′−位が、塩基に不安定であるか、又は金属接
触で除去されうる保護基、好ましくはアシル基、特にアセチル、ベンゾイル、ニ
トロベンゾイル及び／又はメトキシベンゾイル基で保護され、及び／又は４′−
位が、酸又は塩基に不安定である保護基、好ましくはトリチル基及び／又はＦｍ
ｏｃ基、特にＤＭＴ基で保護されている。

【００３５】 文献から知られた方法と異なって、本発明による方法は、従って、アセタール
又はケタールのようなアセタール保護基なしに処置し、追加のクロマトグラフィ
ーによる中間精製処理を回避し、従って反応を驚異的に高い空時収率でワンポッ
ト反応として行わせるものである。

【００３６】 上記保護基は、好ましくは低温で導入され、それはこの手段で驚くほど選択的
に導入しうるからである。こうして、例えば、ベンゾイル基の導入は低温でピリ
ジン又はピリジン／メチレンクロリド中でベンゾイルクロリドと反応させること
により行われる。ＤＭＴ基は例えば、塩基例えばＮ−エチルジイソプロピルアミ
ン（Ｈｕｎｉｇの塩基）及び例えばピリジン、メチレンクロリド又はピリジン／
メチレンクロリド混合物の存在下にＤＭＴＣｌと反応させることにより導入され
る。

【００３７】 また、アシル化後及び／又は任意に行われる２′−又は３′−位の転移後に、
反応生成物をクロマトグラフィーで精製するのもまた有利である。トリチル化後
の精製は本発明方法によれば必要ではなく、それが特に有利なことである。

【００３８】 最終生成物は、必要ならば、さらに晶出により精製される。 本発明の別の課題は、（ａ）保護された核酸塩基を保護されたリボピラノース
と反応させ、（ｂ）工程（ａ）からの生成物のリボピラノシル部位から保護基を
除去し、そして（ｃ）工程（ｂ）からの生成物をより詳細に上記した方法に従い
反応させる、リボピラノシルヌクレオシドの製造法である。

【００３９】 これに関連して、さらなる時間−及び物質−消費性のクロマトグラフィー工程
を回避するために、アノマー性からして純粋な（ａｎｏｍｅｒｉｃａｌｌｙ ｐ
ｕｒｅ）保護されたペントピラノース、例えばテトラベンゾイルペントピラノー
ス、好ましくはβ−テトラベンゾイルリボピラノースを用いるのが唯一有利であ
る（Ｒ．Ｊｅａｎｌｏｚ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９４８，７０，４０
５２）。

【００４０】 さらなる態様では、Ｒ⁴′が（Ｃ_nＨ_2n）ＮＲ¹⁰′Ｒ¹¹′であって、 Ｒ¹⁰′Ｒ^{1 1} ′が既に示した意味をもつ式（ＩＩＩ）の基で結合されている式（ＩＩ）によ るリンカーは、有利には次の工程： （ａ）Ｒ⁴′が（Ｃ_nＨ_2n）ＯＳ_c3又は（Ｃ_nＨ_2n）Ｈａｌ（ここで、ｎは上記の 意味をもち、Ｓ_c3は保護基、好ましくはメシレート（ｍｅｓｙｌａｔｅ）基であ
り、Ｈａｌは塩素又は臭素である）である式（ＩＩ）の化合物を、好ましくはＤ
ＭＦ中でアジドと反応させ、次いで、 （ｂ）（ａ）からの反応生成物を好ましくは例えばピリジン中でトリフェニルホ
スフィンと反応させ、次いで、 （ｃ）（ｂ）からの反応生成物を適当なフタルイミド、例えばＮ−エトキシカル
ボニルフタルイミドと反応させ、そして、 （ｄ）（ｃ）からの反応生成物を適当な保護されたピラノース、例えばリボース
テトラベンゾエートと反応させ、そして最後に、 （ｅ）保護基を、例えばメチレート（ｍｅｔｈｙｌａｔｅ）で除去し、そして、 （ｆ）さらなる工程を既に上記したように実施することにより製造される。

【００４１】 さらに、リンカーとしてのインドール誘導体は蛍光発生能の利点を有し、それ
故に特にごく少量の物質の検出を問題とするナノ技術への応用に好適である。例
えば、インドール−１−リボシド（ｉｎｄｏｌｅ−１−ｒｉｂｏｓｉｄｅ）は既
に「Ｎ．Ｎ．ＳＵｖｏｒｏｖら，Ｂｉｏｌ．Ａｋｔｉｖｎ．Ｓｏｅｄｉｎ．，Ａ
ｋａｄ．Ｎａｕｋ ＳＳＳＲ １９６５，６０」及び「テトラヘドロン １９６７ ，２３，４６５３」に報告されている。しかし、３−置換誘導体を製造する類似
の方法はない。一般に、これらの製造は、未保護糖成分のアミナール（ａｍｉｎ
ａｌ）及びインドリンの生成を経て行われ、次いでこれを酸化によりインドール
−１−リボシドへ転化する。例えば、インドール−１−グルコシド及び−１−ア
ラビノシドが報告され（Ｙ．Ｖ．Ｄｏｂｒｉｙｎｉｎら，Ｋｈｉｍ．−Ｆａｒｍ
Ｚｈ．１９７８，１２，３３）、その３−置換誘導体は通常フィールスマイヤ ー反応により製造された。しかし、インドールの３−位へのアミノエチル単位の
導入のためのこのルートは、工業的応用にはあまりにも複雑である。

【００４２】 さらに好適な態様では、式（Ｉ）［式中のＸ及びＹはそれぞれ、互いに独立し
て、同一であるか又は異なって、＝Ｃ（Ｒ¹⁶）（ここでＲ¹⁶はＨ又はＣ_nＨ_2nで ある）、Ｚは＝Ｃ（Ｒ¹⁶）−（ここでＲ¹⁶は（Ｃ_nＨ_2n）ＮＲ¹⁰Ｒ¹¹である）で ある］によるリンカーは、それ故に有利には次の工程： （ａ）適当なインドリン、例えばＮ−フタロイルトリプタミンをピラノース、例
えばＤ−リボースと反応させてヌクレオシドトリオールを生成させ、次いで、 （ｂ）（ａ）からの生成物のピラノシル部位のヒドロキシル基を好ましくはアシ
ル基、例えば無水酢酸で保護し、次いで、 （ｃ）（ｂ）からの生成物を、例えば２，３−ジクロロ−５，６−ジシアノパラ
キノンで酸化し、そして、 （ｄ）（ｃ）からの生成物のピラノシル部位のヒドロキシル保護基を、例えばメ
チレートで除去し、そして最後に、 （ｅ）さらなる工程を既に上記したように行う工程により製造される。

【００４３】 しかし、この方法はリボピラノースの場合に用いられるばかりではなく、リボ
フラノース及び２′−デオキシリボフラノース又は２′−デオキシリボピラノー
スの場合にも用いられ、これは特に有利である。用いられた糖のヌクレオシド化
パートナー（ｎｕｃｌｅｏｓｉｄａｔｉｏｎ ｐａｒｔｎｅｒ）は好ましくはト リプタミン、特にトリプタミンのＮ−アシル誘導体、とりわけＮ−フタロイルト
リプタミンである。

【００４４】 さらなる態様では、４′−保護、好ましくは３′，４′−保護ペントピラノシ
ルヌクレオシドはさらなる工程でホスフィチル化され、あるいは固相に結合され
る。

【００４５】 ホスフィチル化（ｐｈｏｓｐｈｉｔｙｌａｔｉｏｎ）は、例えば、Ｎ−エチル
ジイソプロピルアミンのような塩基の存在下にモノアリル Ｎ−ジイソプロピル クロロホスホルアミダイトにより、あるいは三塩化リン及びイミダゾール又はテ
トラゾールでの処理及び引き続いての塩基の添加での加水分解により行われる。
生成物は、第１の場合にはホスホルアミダイトであり、第２の場合にはＨ−ホス
ホネートである。本発明による保護されたペントピラノシルヌクレオシドの固相
、例えば「長鎖アルキルアミノ制御の多孔質ガラス」（ＣＰＧ，Ｓｉｇｍａ Ｃ ｈｅｍｉｅ，Ｍｕｎｉｃｈ）への結合は、例えばＥｓｃｈｅｎｍｏｓｅｒら（１
９９３）に記載されているように行われる。

【００４６】 得られた化合物は、例えばペントピラノシル核酸の製造のために役立つ。 それ故に、本発明のさらなる課題は、次の工程： （ａ）第1工程で、保護されたペントピラノシルヌクレオシドを既に上記したよ うに固相に結合させ、そして、 （ｂ）第2工程で、工程（ａ）により固相に結合された３′−，４′−保護ペン トピラノシルヌクレオシドを、ホスフィチル化３′−，４′−保護ペントピラノ
シルヌクレオシドにより伸長させ、次いで、例えば水性ヨウ素溶液で酸化し、そ
して、 （ｃ）所望のペントピラノシル核酸が発現するまで、工程（ｂ）を同一又は異な
るホスフィチル化３′−，４′−保護ペントピラノシルヌクレオシドを用いて繰
り返す工程によってペントピラノシル核酸を製造する方法である。

【００４７】 ピリジニウム塩酸塩、特にベンズイミダゾリウム トリフレートなどの酸性活
性化剤は、カップリング試薬としての５−（４−ニトロフェニル）−１Ｈ−テト
ラゾールに対比し、カップリング試薬ライン（ｌｉｎｅｓ）の阻害や生成物の汚
染を全く起こさないので、ホスホルアミダイトを好ましくはアセトニトリル中で
再結晶化及びアセトニトリルに溶解後に用いるときにカップリング試薬として好
適である。

【００４８】 Ｈ−ホスホネートを用いるときには、カップリング試薬として、アリールスル
ホニルクロリド、ジフェニルクロロホスホネート、ピバロイルクロリド又はアダ
マントイルクロリドが特に好適である。

【００４９】 さらに、オリゴヌクレオチド特にｐ−ＮＡｓ、好ましくはｐ−ＲＮＡｓの保護
基除去のヒドラジン分解に対し、ピリミジン塩基特にウラシル及びチミンを、オ
リゴヌクレオチドを破壊する開環から保護するには、塩化ナトリウムのような塩
の添加によるのが有利である。アリルオキシ基は好ましくは、例えばヒドラジン
分解の前に、パラジウム［Ｐｄ（０）］錯体で除去される。

【００５０】 さらに特別の態様では、天然型であるペントフラノシルヌクレオシド、例えば
アデノシン、グアノシン、シチジン、チミジン及び／又はウラシルもまた、工程
（ａ）及び／又は工程（ｂ）に併合され、それは、例えば混合ｐ−ＮＡ−ＤＮＡ
又はｐ−ＮＡ−ＲＮＡへ導かれる。

【００５１】 別の特別の態様では、さらなる工程で、式： Ｓ_c4ＮＨ（Ｃ_nＨ_2n）ＣＨ（ＯＰＳ_c5Ｓ_c6）Ｃ_nＨ_2nＳ_c7 （ＩＶ） （式中、Ｓ_c4及びＳ_c7はそれぞれ、互いに独立して、同一であるか又は異なって
、特にＦｍｏｃ及び／又はＤＭＴから選ばれた保護基であり、Ｓ_c5及びＳ_c6はそ
れぞれ、互いに独立して、同一であるか又は異なって、アリルオキシ及び／又は
ジイソプロピルアミノ基であり、ｎは既に上記した意味を有する）のアリルオキ
シリンカーが併合される。

【００５２】 特に好適なアリルオキシリンカーは［２−（Ｓ）−Ｎ−Ｆｍｏｃ−Ｏ¹−ＤＭ Ｔ−Ｏ²−アリルオキシジイソプロピルアミノホスフィニル−６−アミノ−１， ２−ヘキサンジオール］である。

【００５３】 このようにして、例えばリジンから出発して、数反応工程で、アミノ−末端リ
ンカーが合成され、それは活性化しうるリン化合物とともに酸に不安定な保護基
を担持し、それ故に自動オリゴヌクレオチド合成に容易に用いられる（参照、例
えばＰ．Ｓ．Ｎｅｌｓｏｎら，Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１９８９，１
７，７１７９；Ｌ．Ｊ．Ａｒｎｏｌｄら，ＷＯ８９０２４３９）。本発明の範囲
はリジンベースリンカーで拡張され、それではリン原子上での常用のシアノエチ
ル基に代えて、アリルオキシ基が導入され、それはそれ故にＮｏｙｏｒｉオリゴ
ヌクレオチド法（ Ｒ．Ｎｏｙｏｒｉ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９０ ，１１２，１６９１−６ ）で有利に用いられる。

【００５４】 ｐ−ＮＡｓ、特にｐ−ＲＮＡｓは互いに安定な二重鎖を形成し、一般に天然型
であるＤＮＡｓ及びＲＮＡｓとは対合しない。この性質はｐ−ＮＡｓを好適な対
系（ｐａｉｒｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍｓ）にする。

【００５５】 このような対系（ｐａｉｒｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍｓ）は非共有（ｎｏｎ−ｃｏ
ｖａｌｅｎｔ）相互作用の超分子系であり、それは選択性、安定性及び可逆性に
より特徴づけられ、その性質は好ましくは動力学的に、例えば温度、ｐＨ及び濃
度により影響される。このような対系はまた、例えば異なる金属クラスター（ｃ
ｌｕｓｔｅｒ）を一緒にして潜在的に新規な性質を有するクラスター会合（ａｓ
ｓｏｃｉａｔｅｓ）を形成させるための「分子接着剤」としての選択的な性質を
考慮して用いられる［参照、例えばＲ．Ｌ．Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら，Ｎａｔｕｒ
ｅ，１９９６，３８２，６０７−９；Ｐ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚら， Ｎａｔｕｒ ｅ，１９９６，３８２，６０９−１１ ］。従って、 ｐ−ＮＡｓはまた、強力に
かつ熱力学的に制御しうる対系を形成するので、ナノ技術分野、例えば新規物質
、診断剤、治療剤及びまたマイクロエレクトロニクス、光学又はオプトエレクト
ロニクスの構成要素（ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ）の製造に用いて、また分子種（ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｐｅｃｉｅｓ）を集めるのを制御してタンパク組立（ａｓ ｓｒｍｂｌｉｅｓ）の（組合せ）合成用などの超分子単位を形成させるのに用い
て好適である［参照、例えば、Ａ．Ｌｏｍｂａｒｄｉ，Ｊ．Ｗ．Ｂｒｙｓｏｎ，
Ｗ．Ｆ．ＤｅＧｒａｄｏ，Ｂｉｏｍｏｌｅｋｕｌｓ（Ｐｅｐｔ．Ｓｃｉ．）１９
９７，４０，４９５−５０４］。それ故に、更なる応用は特に、天然核酸をそこ
なわないｐ−ＮＡコードをもつタンパクやＤＮＡ／ＲＮＡ切片（ｓｅｃｔｉｏｎ
ｓ）などの、機能的好ましくは生物学的単位を提供しうるために、診断及び医薬
分野において生じる（参照、例えばＷＯ９３／２０２４２）。

【００５６】 生体分子、例えばＤＮＡ又はＲＮＡは、それと他の生体分子、例えばＤＮＡ又
はＲＮＡ の双方が核酸塩基の相補的配列の結果として水素架橋の形成によって 互いに結合しうる部分を含有している場合に、他の生体分子との非共有結合のた
めに用いられる。このタイプの生体分子は、例えば信号増幅ののための分析シス
テムにおいて用いられ、それでは配列が分析されるＤＮＡ分子が一方では非共有
ＤＮＡリンカーのような手段で固体担体に固定され、他方では信号増幅しうる分
岐鎖ＤＮＡ分子（ｂＤＮＡ）に結合されている（参照、例えばＳ．Ｕｒｄｅａ，
Ｂｉｏｌ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．１９９４，１２，９２６又は米国特許第５６２４８
０２号）。最後に記載したシステムの本質的欠点はこれまでのところポリメラー
ゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による核酸分析法に対する感度に関してである（Ｋ．Ｍｕ
ｌｌｉｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９８７，１５５，３３５）。こ れは、中でも、分析されるＤＮＡ分子の非共有結合と同様に分析される、ＤＮＡ
分子への固体担体の非共有結合が、特には必ずしも起こらないという事実に帰せ
られ、この結果として、配列認識と非共有結合の機能の混同（ｍｉｘｉｎｇ）が
生じる。ＤＮＡ又はＲＮＡ対合法（ｐａｉｒｉｎｇ ｐｒｏｃｅｓｓ）に介入し ない直交対系（ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｐａｉｒｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ）としての
ｐ−ＮＡｓの使用は、この問題を有利に解決し、その結果として上記分析法の感
度を顕著に増大しうる。

【００５７】 それ故に、本発明方法により得られるペントピラノシルヌクレオシド又はペン
トピラノシル核酸は、例えば生体分子との結合状態のような複合体の形態で、治
療的、診断的及び／又は電子的構成要素のような医薬の製造に好適である。

【００５８】 本発明の意味での複合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）とはｐ−ＮＡｓと他の生体
分子、好ましくはペプチド、タンパク又は核酸の共有結合ハイブリッド、例えば
抗体又はその機能部、天然型で産するＤＮＡ及び／又はＲＮＡである。抗体の機
能部は、例えばＦｖ断片（Ｓｋｅｒｒａ＆Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ（１９８８）Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ２４０，１０３８）、単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ；Ｂｉｒｄら，（１９
８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４２，４２３；Ｈｕｓｔｏｎら、（１９８８）Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．米国８５，５８７９）又はＦａｂ断片（Ｂｅｔ
ｔｅｒら、（１９８８） Ｓｃｉｅｎｃｅ２４０，１０４１）である。

【００５９】 本発明の意味での生体分子とは、天然産生物質又はそれから誘導された物質で
ある。

【００６０】 好適な態様では、それらはｐ−ＲＮＡ／ＤＮＡ又はｐ−ＲＮＡ／ＲＮＡ複合体
である。

【００６１】 本発明による複合体は互いに直交する（ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ）２つの対系を
含有するので、配列認識及び非共有結合の機能が分子で実現されねばならないと
きに好ましくは用いられる。

【００６２】 逐次法及び集中法（ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ ａｎｄ ｃｏｎｖｅｒｇｅｎｔ
ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ）ともに複合体の製造に好適である。

【００６３】 逐次法では、例えばｐ−ＲＮＡオリゴマーの自動合成を同じ合成器で、試剤や
カップリングプロトコルの再調整後に直接行った後、さらにＤＮＡオリゴヌクレ
オチドが合成される。この方法はまた逆の順序でも行われる。

【００６４】 集中法では、例えばアミノ末端リンカーを有するｐ−ＲＮＡオリゴマー及び、
例えばチオールリンカーを有するＤＮＡオリゴマーが別の操作で合成される。次
いで、好ましくは、文献から知られたプロトコルに従い、ｐ−ＲＮＡオリゴマー
のヨードアセチル化及び２つの単位のカップリングが行われる（Ｔ．Ｚｈｕら，
Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．ｃｈｅｍ．１９９４，５，３１２）。

【００６５】 集中法は特にそのフレキシビリティーのために好ましい。 本発明の意味での用語の複合体はまた、いわゆるアレイ（ａｒｒａｙｓ）を意
味するものとして理解される。アレイは特に分析及び診断において分析物の同時
決定に重要な役割を果たす、固定された認識種（ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｓｐ ｅｃｉｅｓ）の配列である。例としてペプチドアレイ（Ｆｏｄｏｒら，Ｎａｔｕ
ｒｅ１９９３，３６４，５５５）や核酸アレイ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎら ，Ｇｅｎ ｏｍｉｃｓ１９９２，１３，１００８；Ｈｅｌｌｅｒ，米国特許第５６３２９５
７号）がある。これらのアレイの高いフレキシビリティーは、認識種をコードし
うるオリゴヌクレオチドに、そして結合された相補鎖（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａ
ｒｙ ｓｔｒａｎｄｓ）を固体担体上のある箇所に結合させることによって達成 されうる。コード認識種をアンチコード（ａｎｔｉ−ｃｏｄｅｄ）固体担体に適
用し、ハイブリッド形成条件を調整することにより、認識種は所望の位置に非共
有結合される。結果として、種々のタイプの認識種、例えばＤＮＡ切片（ｓｅｃ
ｔｉｏｎｓ）、抗体がハイブリッド形成条件を利用して固体担体上に同時に配列
されうる（図３参照）。しかし、このためにまず必要なものとして、コード切片
をできるだけ短くし、天然核酸ｐ−ＮＡｓ、好ましくはｐ−ＲＮＡｓをそこなわ
ないために極めて強力で選択的であるコドン及びアンチコドンがあり、これらは
このために特に有利に好適である。

【００６６】 本発明の意味での用語の担体は、固体又はゼラチン状形態である物質、特にチ
ップ状物質を意味するものとして理解される。好適な担体材料は、例えばセラミ
ック、金属特に貴金属、ガラス、プラスチック、結晶性物質又は、上記材料の中
でも特に担体の薄層であり、また、セルロースや構造タンパクのような（生体）
分子フィラメントである。

【００６７】 それ故に、本発明はまた、認識種、好ましくは天然ＤＮＡ又はＲＮＡ鎖又はタ
ンパク、特に抗体又は抗体の機能部位をコードするためのペントピラノシル核酸
、好ましくはリボピラノシル核酸の利用に関する。これらは次いで図４による固
体担体上で適当なコドンでハイブリッド形成される。このようにして、新規で診
断的に有用なアレイを、常に新規な認識種の組合せを用いハイブリッド形成条件
を調整することによってのみアレイ形態でコドンを具備させた固体担体の所望位
置に常に組み込める。次いで、分析物、例えば血漿などの生物学的試料が適用さ
れると、検出される種はあるパターンでアレイに結合され、次いで間接的に（例
えば認識種の蛍光標識により）又は直接的に（例えばコドンの結合点でのインピ
ーダンス測定により）記録される。次いで、ハイブリッド形成はコドンを有する 担体のみが再び残るように適当な条件（温度、塩、溶媒、電気泳動法）で解除さ
れる。これは次いで再び他の認識種で装荷され、例えば他の試料の決定用の同じ
分析物に対して用いられる。アレイフォーマットでの認識種の常に新規な配列及
び対系としてのｐ−ＮＡｓの使用は他のシステム、例えばＷＯ９６／１３５２２
と比べ特に有利である。

【００６８】 それ故に、本発明のさらなる課題は、特に上記のペントピラノシルヌクレオシ
ドからなる診断薬又は既により詳細に上記した本発明による複合体に関する。以
下の実施例及び図面は本発明をより詳細にそれを制限することなく述べることを
意図したものである。実施例 実施例１ １−｛３′−Ｏ−ベンゾイル−４′−Ｏ−［（４，４′−ジメトキシトリフェニ
ル）メチル］−β−Ｄ−リボピラノシル｝チミンの合成 最初の４′−置換、次いでの２′−置換、次いでの転移（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）
反応：

【００６９】

【化１７】

【００７０】 １−（β−Ｄ−リボピラノシル｝チミンＡ５１．６ｇ（２００ミリモル）をア
ルゴン雰囲気下に無水ピリジン６２０ｍｌに溶解し、Ｎ−エチルジイソプロピル
アミン７１．4ｍｌ（２．１当量（ｅｑ．））及びモレキュラーシーブ（４Å） １００ｇを加え、混合物をＫＰＧ攪拌器を用い１５分間攪拌した。ジメトキシト
リチルクロリド（ＤＭＴＣｌ）９２ｇ（２７２ミリモル；１．３６当量）をクロ
ロホルム（固体ＮａＨＣＯ３から新たに蒸留されたもの）２８０ｍｌに溶解し、
この溶液をトリオール溶液に−6ないし−5℃で30分かけて滴下した。これをこの
温度で1時間、次いで室温で一夜攪拌し、再度冷却し、さらにクロロホルム７０ ｍｌ中のＤＭＴＣｌ２５ｇ（７４ミリモル；０．３７当量）を加えた。混合物を
室温にならしめ4時間攪拌した。１−｛４′−Ｏ−［（４，４′−ジメトキシト リフェニル）メチル］−β−Ｄ−リボピラノシル｝チミンの分析データを得るた
めに、少量の試料をとり、水性仕上げ処理（ｗｏｒｋ−ｕｐ）にかけ、クロマト
グラフィーに付した。

【００７１】

【化１８】

【００７２】 反応混合物を４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）２．４６ｇ（２０．５
ミリモル；０．１当量）で処理し、−６℃に冷却し、ピリジン３０ｍｌ中のベン
ゾイルクロリド（ＢｚＣｌ）２７．９ｍｌ（０．２４モル；１．２当量）を−6 ℃から−１℃の間で１５分かけて滴下し、混合物を１０分間攪拌した。反応を完
結させるために、さらにＢｚＣｌ２．８ｍｌ（２４ミリモル；０．１２当量）を
冷却しながら２５分間隔で各場合に加え混合物を最後に２０分間攪拌した。 次いで無水ピリジン４６０ｍｌ、ｎ−プロパノール８４１ｍｌ（１１．２モル；
５６当量）、ｐ−ニトロフェノール４４ｇ（０．３１６モル；１．５８当量）、
ＤＭＡＰ２１．７ｇ（０．１８モル；０．９当量）及びＮ−エチルジイソプロピ
ルアミン１３６ｍｌ（０．８モル；４当量）を室温で加え、混合物を６１−６３
℃で４８時間攪拌した。

【００７３】 次いで混合物を室温で６０時間放置した。 反応混合物を再度６１−６３℃に ２４時間加熱し、室温に冷却し、ロタベイパー（Ｒｏｔａｖａｐｏｒ）で濃縮し
た。残渣を酢酸エチル２リットルにとり、モレキュラーシーブをろ別し、有機相
を3回各回水１リットルで抽出し、１０％濃度のクエン酸１．２リットルと攪拌 して１回抽出し、有機相を再度分別し、水１リットルで一回抽出し、飽和ＮａＨ
ＣＯ溶液１リットルで最後に抽出した。有機相を硫酸ナトリウムを用い乾燥し、
ろ過し、濃縮した（残渣２２０ｇ）。

【００７４】 残渣を先ず予備精製のためヘプタン／酢酸エチル（１：１−０．１）のステッ
プグラジエント（ｓｔｅｐ ｇｒａｄｉｅｎｔ）を用いてシリカゲル６０（２０ ×１０ｃｍ）でろ過し、次いでシリカゲル６０でのクロマトグラフィー（３０×
１０ｃｍ；ジクロロメタン／酢酸エチル（１：０−１：１）のステップグラジエ
ント）に付した。 以下のものが得られた。 非極性画分４０ｇ １−｛３′−Ｏ−ベンゾイル−４′−Ｏ−［（４，４′−ジメトキシトリフェニ
ル）メチル］−β−Ｄ−リボピラノシル｝チミンＢ５２．９ｇ 不純な化合物Ｂ３４．５ｇ 極性画分３．４ｇ 不純画分を再度クロマトグラフィーに付し（ＳＧ６０，４５×１０ｃｍ；ジク
ロロメタン／酢酸エチル，３：１）、さらに化合物Ｂ１１．３ｇを得た。全収量
：化合物Ｂ６４．２ｇ（９７ミリモル）、すなわち収率４８％。１Ｈ−ＮＭＲは
一致する。実施例２ Ｎ４−ベンゾイル−１−｛３′−Ｏ−ベンゾイル−４′−Ｏ−［（４，４′−ジ
メトキシトリフェニル）メチル］−β−Ｄ−リボピラノシル｝シトシンの合成 最初の２′−置換、次いでの４′−置換、次いでの転移反応：

【００７５】

【化１９】

【００７６】 全バッチを窒素雰囲気下に行った。 Ｎ⁴−ベンゾイル−１−（２′−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｄ−リボピラノシル）シ トシン２： ５４．０ｇ（０．１５５モル）のＮ４−ベンゾイル−１−（β−Ｄ−リボピラ
ノシル）シトシン１をジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）８３０ｍｌ及びピリジン
１．５リットル（両溶媒は乾燥してモレキュラーシーブ３Åで保存）に１２４℃
に加温しながら溶解した。ピリジン２１０ｍｌに溶解したＢｚＣｌ２３．０ｇ（
０．１６３モル；１．０５当量）を−５８℃ないし−６３℃で３．５時間かけて
滴下した。このバッチを冷却浴中で一夜攪拌し、ｎ−プロパノール９０．３ｇ（
１．５モル；１０当量）を攪拌しながら混入しバッチを高真空で４０℃で濃縮し
た。ピリジン残渣をトルエン１５０ｍｌを２回加えることにより除去し、再度濃
縮した。残渣１２４．３ｇをＣＨ２Ｃｌ２５００ｍｌに溶解し、各回半濃縮Ｎａ
ＨＣＯ３溶液３００ｍｌと攪拌することにより２回抽出し、沈でんした固体をろ
別し乾燥した。残渣は６０．７ｇであった。 ＣＨ２Ｃｌ２相を濃縮した：２５ ．０ｇ。グラジエント（ｇｒａｄｉｅｎｔｓ）（ＡｃＯＥｔ／イソヘキサン，４
：１、次いで無水ＡｃＯＥｔ、次いでＡｃＯＥｔ／ＭｅＯＨ，１９：１−２：１
）を用いたシリカゲル６０（４０×１０ｃｍ）での分離クロマトグラフィーによ
り、次のものを得た（ＴＬＣ（シリカゲル，ＡｃＯＥｔ））： ２′、４′ジベンゾエート１６．８ｇ（２４％）Ｒｆ０．５ １２．４ｇの化合物１（２３％）Ｒｆ０．０ ３５．４ｇの化合物２（５１％）Ｒｆ０．１４ Ｎ⁴−ベンゾイル−１−｛３′−Ｏ−ベンゾイル−４′−Ｏ−［（４，４′−ジ メトキシトリフェニル）メチル］−β−Ｄ−リボピラノシル｝シトシン３ ３５．４ｇ（７８ミリモル）の化合物２をＣＨ２Ｃｌ２３９０ｍｌ及びピリジ
ン１８０ｍｌ（両者無水）、ＤＭＡＰ０．９４ｇ（７．８ミリモル；０．１当量
）、Ｎ−エチルジイプロピルアミン３４．６ｍｌ（２０３ミリモル；２．６当量
）及びＤＭＴＣｌ３３．１ｇ（９８ミリモル；１．２５当量）を加え、混合物を
室温で２時間攪拌した。 ＴＬＣ（シリカゲル，ＡｃＯＥｔ）：Ｒｆ０．６ ＣＨ₂Ｃｌ₂を３０℃でストリッピング（留去）し、残渣をピリジン６４０ｍｌ、
ＤＭＡＰ９．３７ｇ（７８ミリモル；１．０当量）、Ｅｔ₃Ｎ３２．５ｍｌ（２ ３４ミリモル；３．０当量）、ｐ−ニトロフェノール２１．７ｇ（１５６ミリモ
ル；２．０当量）及びｎ−プロパノール９３．８ｇ（１．５６ミリモル；２０当
量）で処理し、６５℃で４２時間攪拌した。このバッチを高真空で５０℃で濃縮
し、各回トルエン２５０ｍｌで２回処理し、濃縮した。残渣をＣＨ₂Ｃｌ₂１リッ
トルにとり、各回希釈ＮａＨＣＯ₃溶液５００ｍｌと攪拌することにより３回抽 出し、有機相をＮａ₂ＳＯ₄を用いて乾燥し濃縮した：残渣９２．５ｇ。グラジエ
ント（メチルｔ−ブチルエーテル／イソヘキサン２：１−４：１、次いでメチル
ｔ−ブチルエーテル／ＡｃＯＥｔ，１：４、次いでＡｃＯＥｔ／ＭｅＯＨ，１：
１−１：３）を用いたシリカゲル６０（５０×１０ｃｍ）でのクロマトグラフィ
ーにより、生成物含有画分を得た。該画分をＣＨ₂Ｃｌ₂／メチルｔ−ブチルエー
テル（１：５）５４０ｍｌから再結晶した。晶析物を再度ＣＨ２Ｃｌ２／メチル
ｔ−ブチルエーテル（１：１）３００ｍｌから再結晶した。 ３：ＴＬＣ（シリカゲル，ＣＨＣｌ₃／ｉ−ＰｒＯＨ４９：１）：Ｒｆ０．１４ 次のものを得た： Ｎ４−ベンゾイル−１−｛３′−Ｏ−ベンゾイル−４′−Ｏ −［（４，４′−ジメトキシトリフェニル）メチル］−β−Ｄ−リボピラノシル
｝シトシン３３０ｇすなわち化合物２に基づく収率５１％。¹Ｈ−ＮＭＲは一致 する。実施例３ Ｎ⁶−ベンゾイル−９−｛３′−Ｏ−ベンゾイル−４′−Ｏ−［（４，４′−ジ メトキシトリフェニル）メチル］−β−Ｄ−リボピラノシル｝アデニンの合成 最初の２′−置換、次いでの４′−置換、次いでの転移反応

【００７７】

【化２０】

【００７８】 ９−（β−Ｄ−リボピラノシル｝アデニン２： ６８．３７ｇ（１００ミリモル）のＮ⁶−ベンゾイル−９−（２′，３′，４ ′−トリ−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｄ−リボピラノシル）アデニン１をＮＨ₃−飽 和ＭｅＯＨ３００ｍｌ中で室温で一夜攪拌し、晶析物をろ別した：２３．５ｇ（
８８％）の化合物２。 ＴＬＣ（シリカゲル，ＡｃＯＥｔ／ＭｅＯＨ２：１）：Ｒｆ０．２３

【００７９】

【化２１】

【００８０】 Ｎ⁶，Ｎ⁶−ジベンゾイル−９−（β−Ｄ−リボピラノシル）アデニン３： １６．８ｇ（６２．９ミリモル）の化合物２を窒素雰囲気下に無水ピリジン５
００ｍｌに懸濁させ−４℃ないし−１０℃に冷却した。トリメチルクロロシラン
４０ｍｌ（１９９ミリモル；５当量）を２０分かけて滴下し、混合物を冷却しな
がら２．５時間攪拌した。ピリジン７３ｍｌに溶解したベンゾイルクロリド３６
．５ｍｌ（１９９ミリモル；５当量）を２５分かけて−１０ないし−１５℃で加
え、冷却しながら１０分間、そして室温で２時間攪拌した。（ＴＬＣチェック（
シリカゲル，ＡｃＯＥｔ／ヘプタン１：１）：Ｒｆ０．５）。混合物を再度−１
０℃に冷却し、水（温度最大＋８℃）１３６ｍｌを混入させ、混合物を室温で一
夜攪拌した。転化が完了した後、溶媒を留去し残渣を各回トルエン２００ｍｌに
２回とり再度蒸発させた。混合物を各５００ｍｌのエーテル及び水で処理し、２
時間機械的に攪拌し、両相にごくわずか溶解する生成物をろ別し、エーテル及び
水で洗浄し、高真空でＰ₂Ｏ₅で乾燥した：２３．８ｇ（８０％）の化合物３。 ＴＬＣ（シリカゲル，ＡｃＯＥｔ／ＭｅＯＨ９：１）：Ｒｆ０．３５

【００８１】

【化２２】

【００８２】 Ｎ⁶，Ｎ⁶−ジベンゾイル−９−（２′−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｄ−リボピラノシ
ル｝アデニン４： ２６．４ｇ（５５．５ミリモル）の化合物３を窒素雰囲気下に無水ＣＨ₂Ｃｌ₂ ５５０ｍｌ及びピリジン５５ｍｌ（各場合ともモレキュラーシーブに貯蔵）に溶
解し、ＤＭＡＰ０．７３ｇ（５．５５ミリモル；０．１当量）で処理し、−８７
ないし−９０℃に冷却した。ピリジン１４ｍｌ中のＢｚＣｌ８．５８ｇ（６１ミ
リモル；１．１当量）を１時間かけて滴下し、混合物を６０時間（週末）にわた
り−７８℃で放置した。バッチを濃縮し、各回トルエン１００ｍｌで２回処理し
、ピリジンを除去するために蒸発させた。グラジエント（ＡｃＯＥｔ／ヘプタン
，１：１−９：１）を用いたシリカゲル６０（２０×１０ｃｍ）でのクロマトグ
ラフィーにより、２３．２ｇの化合物４を得た。 化合物４：ＴＬＣ（シリカゲル，ＡｃＯＥｔ）：Ｒｆ０．３４ Ｎ⁶−ベンゾイル−９−｛３′−Ｏ−ベンゾイル−４′−Ｏ−［（４，４′−ジ メトキシトリフェニル）メチル］−β−Ｄ−リボピラノシル｝アデニン５ ２３．２ｇ（４０ミリモル）の化合物４を無水ＣＨ２Ｃｌ２１６０ｍｌに溶解
し、次いでＤＭＴＣｌ１４．９ｇ（５６ミリモル；１．１当量）及びＮ−エチル
ジイソプロピルアミン１７．７ｍｌ（１０４ミリモル；２．６当量）で処理した
。室温で２時間攪拌した後、さらにＤＭＴＣｌ４．０ｇ（１１．８ミリモル；０
．３当量）を加え、混合物をさらに４０分間攪拌した。バッチを３５０−５２０
ミリバール及び３５℃でロタベイパー（Ｒｏｔａｖａｐｏｒ）中で濃縮した。 ＴＬＣ（シリカゲル，ＡｃＯＥｔ／ヘプタン１：１）：Ｒｆ０．１８ 残渣を無水ピリジン２６０ｍｌに溶解し、次いでｎ−プロパノール５１ｍｌ（
６７９ミリモル；１７当量）、Ｅｔ₃Ｎ１６．６ｍｌ（１２０ミリモル；３当量 ）、ｐ−ニトロフェノール１１．１ｇ（８０ミリモル；２当量）、ＤＭＡＰ５．
３ｇ（４４ミリモル；１．１当量）で処理し、６０−６３℃で２３時間攪拌した
。次いで、バッチを２１時間室温のままとした。反応混合物をロタベイパーで濃
縮した。残渣を各回トルエン２００ｍｌで２回処理し、濃縮し、ＣＨ２Ｃｌ２に
溶解し、水で３回抽出した。グラジエント（ＡｃＯＥｔ／ヘプタン，１：２−１
：０；次いでＡｃＯＥｔ／ＭｅＯＨ１：０−９：１）を用いたシリカゲル６０（
３０×１０ｃｍ）でのクロマトグラフィーにより、１３ｇの化合物５を得た。 化合物５：ＴＬＣ（シリカゲル，ＡｃＯＥｔ／ヘプタン４：１）：Ｒｆ０．２ 次のものを得た：１３ｇのＮ⁶−ベンゾイル−９−｛３′−Ｏ−ベンゾイル−４ ′−Ｏ−［（４，４′−ジメトキシトリフェニル）メチル］−β−Ｄ−リボピラ
ノシル｝アデニン５ すなわち化合物３に基づく収率３０％。¹Ｈ−ＮＭＲは一致する。文献から知ら れた方法と比べた時間節約：５０％実施例４ ９−［３′−Ｏ −ベンゾイル−４′−Ｏ−［（４，４′−ジメトキシトリフェ ニル）メチル］−β−Ｄ−リボピラノシル｝−２−Ｏ−アリル−２−Ｎ−イソブ
チロイルグアニンの合成 最初の３′−置換、次いでの４′−置換：

【００８３】

【化２３】

【００８４】 ９−［３′−Ｏ −ベンゾイル−β−Ｄ−リボピラノシル｝−２−Ｏ−アリル− ２−Ｎ−イソブチロイルグアニンＢ ＧトリオールＡ３９３ｍｇ（１．０ミリモル）を乾燥ジクロロメタン４ｍｌに
溶解した。溶液をトリメチルオルトベンゾエート０．５２ｍｌ（３．０ミリモル
）及びカンファースルホン酸５８ｍｇ（０．２５ミリモル）で処理し、室温で１
５時間攪拌した。次いで、混合物を０℃に冷却し、０℃に予備冷却された、アセ
トニトリル、水及びトリフルオロ酢酸の混合物（５０：５：１）２ｍｌで処理し
た。混合物を１０分間攪拌し溶媒を真空留去した。残渣を、ジクロロメタン／メ
タノール（１００：３）を用いてシリカゲル（２．３×２１ｃｍ）でのフラッシ
ュクロマトグラフィーで精製し、４−Ｏ −ベンゾイル化合物２５ｍｇ（５％） 、混合画分１３９ｍｇ（２８％）及び所望の３−Ｏ −ベンゾイル化合物Ｂ２０ ５ｍｇ（４１％）を得た。

【００８５】

【化２４】

【００８６】 ９−｛３′−Ｏ −ベンゾイル−４′−Ｏ−［（４，４′−ジメトキシトリフェ ニル）メチル］−β−Ｄ−リボピラノシル｝−２−Ｏ−アリル−２−Ｎ−イソブ
チロイルグアニンＣ ジオールＢ１０１ｍｇ（０．２ミリモル）を乾燥ジクロロメタン３．２ｍｌに
懸濁させた。懸濁液をＮ−エチルジイソプロピルアミン１７１μｌ（１．０ミリ
モル）、ピリジン３２０μｌ（３．９６ミリモル）及びＤＭＴＣｌ１０２ｍｇ（
０．３ミリモル）で処理し、室温で攪拌した。２４時間後、さらにＤＭＴＣｌ１
０２ｍｇ（０．３ミリモル）を加え、混合物を再度２４時間攪拌した。次いで、
それをジクロロメタン３０ｍｌで希釈した。溶液を１０％濃度クエン酸水溶液２
０ｍｌ及び飽和重炭酸ナトリウム溶液１０ｍｌで洗浄し、ＭｇＳＯ₄で乾燥し、 真空濃縮した。残渣を、ジクロロメタン／メタノール（１００：１）を用いてシ
リカゲル（２．３×２０ｃｍ）でのフラッシュクロマトグラフィーで精製し、既
知の所望生成物Ｃ３９ｍｇ（２４％）を得た。実施例５ ｐ−ＲＮＡリンカー系（ｌｉｎｋｅｒ ｓｙｓｔｅｍｓ）の合成 官能単位の結合のために用いられるアミノ末端を有するリンカー（ｌｉｎｋｅ
ｒ）の用意を可能にする３つの方法を下記に示す。 ５．１ウラシルベースリンカー ウラシルの５位の変性に基づいての方法 ヒドロキシエチルウラシル２８は既知の方法（Ｊ．Ｄ．Ｆｉｓｓｅｋｉｓ，Ａ
．Ｍｙｌｅｓ，Ｇ．Ｂ．Ｂｒｏｗｎ，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９６４，２９，
２６７０）に従って大規模に製造することができる。γ−ブチロラクトン２５を
ギ酸メチルでホルミル化し、ナトリウム塩２６を反応させて尿素誘導体２７を生
成させ、これを環化させてヒドロキシエチルウラシル２８を得た（スキーム４）
。

【００８７】

【化２５】

【００８８】 スキーム４：ヒドロキシエチルウラシル２８の合成

【００８９】

【化２６】

【００９０】 スキーム５：Ｎ−フタロイルアミノエチルウラシル３２の合成 ヒドロキシエチルウラシル２８をピリジン中のメタンスルホニルクロリドでメ
シル化し、化合物２９を得た（Ｊ．Ｄ．Ｆｉｓｓｅｋｉｓ，Ｆ．Ｓｗｅｅｔ，Ｊ
．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９７３，３８，２６４）。

【００９１】 次の段階は新規に発明されたものである：化合物２９をＤＭＦ中でアジ化ナト
リウムを用い反応させて、アジド３０を生成させ、これをピリジン中でトリフェ
ニルホスフィンで還元してアミノエチルウラシル３１を得た。化合物３１におけ
るアミノ基を最終的にＮ−エトキシカルボニルフタルイミドで保護した。リボー
ステトラベンゾエート３３をＮ−フタロイルアミノエチルウラシル３２でヌクレ
オシド化して好収率でリボーストリベンゾエート３４を得た。ピラノース環のア
ノマー中心は、Ｊ＝９．５ＨｚのＨ−Ｃ（１′）とＨ−Ｃ（２′）との間のカッ
プリング（結合）定数から明らかにみられるように、β配位を有する。次いで、
ベンゾエート保護基をＭｅＯＨ中でＮａＯＭｅで除去してリンカートリオール３
５を得た。化合物３５をＤＭＡＰの存在下にピリジン／ジクロロメタン１：１０
中で−７８℃でベンゾイルクロリドと反応させた。この方法で所望の２′−ベン
ゾエート３６（６４％）に加え、２′，４′−ジベンゾイル化生成物（２２％）
を得た。これを集め、化合物３４の化合物３５へのメタノーリシスに類似して再
度トリオール３５へ転化した。２′−ベンゾエート３６を、ジクロロメタン中で
ヒューニッヒ塩基（Ｈｕｎｉｇ′ｓ ｂａｓｅ）の存在下にジメトキシトリチル クロリドを用いて９０％を超える収率で４′位でトリチル化した。４′−ＤＭＴ
−２′−ベンゾエート３７の４′−ＤＭＴ−３′−ベンゾエート３８への転移を
、ｎ−プロパノール／ピリジン５：２中で、ＤＭＡＰ、ｐ−ニトロフェノール及
びヒューニッヒ塩基の存在下に行った。クロマトグラフィー後、化合物３８を得
た。４′−ＤＭＴ−３′−ベンゾエート３８を最終的にヒューニッヒ塩基の存在
下にＣｌＰ（ＯＡｌｌ）Ｎ（ｉＰｒ）２と反応させてホスホルアミダイト３９を
得た（スキーム６）。これは合成プロトコル（ｐｒｏｔｏｃｏｌ）を変更するこ
となく自動オリゴヌクレオチド合成に用いられる。

【００９２】

【化２７】

【００９３】 スキーム６：リンカーホスホルアミダイト３９の合成操作： ウラシルリンカー単位の合成 ５−（２−アジドエチル）ウラシル（３０）

【００９４】

【化２８】

【００９５】 １．操作 ２６．０ｇ（０．１１モル）の化合物２９を内部温度計及び還流冷却器を備え
た三ツ口フラスコ５００ｍｌ中でＤＭＦ２５０ｍｌに溶解し、混合物をアジ化ナ
トリウム１０．８ｇ（０．１６６モル）で処理した。次いで、懸濁液を６０℃で
４時間攪拌した（ＴＬＣチェック，ＣＨＣｌ₃：ＭｅＯＨ（９：１））。ＤＭＦ を留去し、残渣を水１５０ｍｌと攪拌した。固体をろ別し、水約５０ｍｌで洗浄
し、五酸化リンでデシケーター中で一夜真空で乾燥した。１４．２ｇ（７１％）
の化合物３０をｍ．ｐ．２３０−２３５℃（分解）の無色固体の状態で得た。

【００９６】 ２．分析データ ５−（２−アジドエチル）ウラシル（３０）

【００９７】

【化２９】

【００９８】 ５−（２−アミノエチル）ウラシル（３１）

【００９９】

【化３０】

【０１００】 １．操作 １４．２ｇ（７８．０ミリモル）の化合物３０を内部温度計及び還流冷却器を
備えた三ツ口フラスコ２５０ｍｌ中でピリジン１７５ｍｌに懸濁させ、混合物を
トリフェニルホスフィン６１．４ｇ（２３４ミリモル）で処理した。これを６０
℃で５時間加熱し、室温で一夜攪拌した（ＴＬＣチェック，ＣＨＣｌ₃／ＭｅＯ Ｈ（５：１））。懸濁液に２５％濃度アンモニア溶液４０ｍｌを加え、次いで清
澄化した。溶媒を回転蒸発器（ロータリーエバポレータ）中で真空で除去した。
残渣をＣＨ₂Ｃｌ₂／ＭｅＯＨ（１：１）２００ｍｌ中で室温で３０分間攪拌し、
晶析物をろ別し、ＣＨ₂Ｃｌ₂で洗浄し、五酸化リンでデシケーター中で真空で乾
燥したのち、ｍ．ｐ．２１４−２２０℃の１０．０ｇ（８５％）の化合物３１を
得た。

【０１０１】 ２．分析データ ５−（２−アミノエチル）ウラシル（３１） Ｍ．ｐ．：２１４−２２０℃（ガス発生を伴う、予備シンターリング）

【０１０２】

【化３１】

【０１０３】 ５−（２−フタルイミドエチル）ウラシル（３２）

【０１０４】

【化３２】

【０１０５】 １．操作 ９．６ｇ（６１．８ミリモル）の化合物３１を丸底フラスコ２５０ｍｌ中で水
１００ｍｌに懸濁させ、Ｎａ２ＣＯ３６．６４ｇ（６２．６ミリモル）で処理し
た。室温で１５分間攪拌した後、Ｎ−エトキシカルボニルフタルイミド１４．３
ｇ（６５ミリモル）を分けて加え、混合物を室温で３時間攪拌した（ＴＬＣチェ
ック，ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ（５：１））。粘性の白色懸濁液を濃塩酸を用い注
意深くｐＨ４に調整し、白色沈殿物をろ別した。水で洗浄後、固体を五酸化リン
でデシケーター中で真空で乾燥してｍ．ｐ．３２４−３２７℃の１６．０ｇ（９
１％）の化合物３２を得た。

【０１０６】 ２．分析データ ５−（２−フタルイミドエチル）ウラシル（３２）： Ｍ．ｐ．：３２４−３２７℃（分解）

【０１０７】

【化３３】

【０１０８】 １−（２，３，４−トリ−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｄ−リボピラノシル）−５−（
２−フタルイミドエチル）ウラシル（３４）

【０１０９】

【化３４】

【０１１０】 １．操作 ７．００ｇ（２４ミリモル）の化合物３２をアルゴン導入部、内部温度計及び
隔膜（ｓｅｐｔｕｍ）を備えた三ツ口フラスコ２５０ｍｌ中でアセトニトリル１
２０ｍｌに懸濁させた。先ず、ＢＳＡ１２．２ｍｌ（５０ミリモル）を、次いで
３０分間攪拌後、さらにＢＳＡ７ｍｌ（２８ミリモル）を注入器で加えた。短時
間４０℃に加熱後、反応混合物を清澄化した。ＴＭＳＯＴｆ１３ｍｌ（７２ミリ
モル）を室温で注入器で加えた。１時間後、生成物の生成は観察されなかった（
ＴＬＣチェック，ＡｃＯＥｔ／ｎ−ヘプタン（１：１））。そこで、さらにＴＭ
ＳＯＴｆ１３ｍｌ（７２ミリモル）を加えた。次いで、反応混合物を５０℃に加
熱した。５０℃で２．５時間攪拌後（ＴＬＣチェック）、混合物を室温に冷却し
、ＡｃＯＥｔ２５０ｍｌ及び飽和ＮａＨＣＯ₃溶液１９０ｍｌの氷冷混合物に注 ぎ、１０分間攪拌することにより強力に抽出した。ＮａＨＣＯ３溶液１００ｍｌ
で再度洗浄し、水性相をＡｃＯＥｔ１００ｍｌで再度抽出した。希釈有機相をＭ
ｇＳＯ₄を用いて乾燥し、溶媒を回転蒸発器（ロータリーエバポレータ）中で真 空で除去した。オイルポンプ真空中で乾燥後、粗生成物２０．９ｇを得た。シリ
カゲル（ｈ＝２５ｃｍ，ψ＝５ｃｍ，ＡｃＯＥｔ／ｎ−ヘプタン（１：１））で
のクロマトグラフィーにより、 ＴＬＣ均一な発泡性生成物を得た。これをエー テルを用いて温浸した。ろ過、オイルポンプ真空中で乾燥して１５ｇ（８６％）
の化合物３４を得た。

【０１１１】 ２．分析データ １−（２，３，４−トリ−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｄ−リボピラノシル）−５−（
２−フタルイミドエチル）ウラシル（３４）：

【０１１２】

【化３５】

【０１１３】 ５−（２−フタルイミドエチル）−１−（β−Ｄ−リボピラノシル）ウラシル（
３５）

【０１１４】

【化３６】

【０１１５】 １．操作 １５ｇ（２０ミリモル）の化合物３４を丸底フラスコ１リットル中でＭｅＯＨ
５００ｍｌに溶解し、ＮａＯＭｅ３２４ｍｇ（６ミリモル）で処理し、水を排除
しながら室温で一夜攪拌した（ＴＬＣチェック，ＡｃＯＥｔ／ｎ−ヘプタン１：
１）。生成懸濁液にアンバーライトＩＲ−１２０をｐＨ７未満となるまで加えた
。固体を加熱下に溶解し、イオン交換体から熱時ろ別し、ＭｅＯＨで洗浄した。
溶媒除去後、残渣を各回水１５０ｍｌを用いて２回共蒸発させて粗生成物９ｇを
得た。これをＭｅＯＨ９０ｍｌ中で１０分間還流下に加熱した。室温に冷却後、
混合物をＥｔ２Ｏ６０ｍｌで処理し、４℃で一夜貯蔵した。これをろ過、Ｅｔ２
Ｏで洗浄、及びオイルポンプで真空乾燥して７．８ｇ（９３％）の化合物３５を
得た。

【０１１６】 ２．分析データ ５−（２−フタルイミドエチル）−１−（β−Ｄ−リボピラノシル）ウラシル（
３５）： Ｍ．ｐ．：１３７℃（シンターリング）

【０１１７】

【化３７】

【０１１８】 １−（２′−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｄ−リボピラノシル）−５−（２−フタルイ
ミドエチル）ウラシル ５−（２−フタルイミドエチル）−１−（β−Ｄ−リボピラノシル）ウラシル
１０．６ｇ（２５ミリモル）をアルゴン流下の加熱四つ口フラスコ１リットル中
でピリジン２０ｍｌに溶解し、ジクロロメタン２００ｍｌと混合した。混合物を
−７０℃に冷却し、ピリジン５ｍｌ及びジクロロメタン２０ｍｌ中のベンゾイル
クロリド３．８２ｍｌ（３３ミリモル）を冷却しながら徐々に滴下し、混合物を
−７０℃で３５分間攪拌した。反応混合物を冷却した塩化アンモニウム溶液６０
０ｍｌに注ぎ、水性相を酢酸エチルで抽出した。化合させた有機相を水洗、乾燥
し、真空で濃縮乾燥した。シリカゲルでのクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘ
プタン１：１）により１−（２′−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｄ−リボピラノシル）
−５−（２−フタルイミドエチル）ウラシル７．９ｇ（６０％）を得た。 ＴＬＣ：Ｒｆ０．２４（酢酸エチル／ヘプタン４：１）

【０１１９】

【化３８】

【０１２０】 １−（２−Ｏ−ベンゾイル−４−Ｏ−（４，４′−ジメトキシトリチル）−β−
Ｄ−リボピラノシル）−５−（２−フタルイミドエチル）ウラシル １−（２−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｄ−リボピラノシル）−５−（２−フタルイ
ミドエチル）ウラシル５．６ｇ（１０．７３ミリモル）をジクロロメタン６０ｍ
ｌに溶解し、４，４′−ジメトキシトリチルクロリド４．７２ｇ（１３．９５ミ
リモル）及びＮ−エチルジイソプロピルアミン２．４ｍｌ（１３．９５ミリモル
）で処理し、室温で２０分間攪拌した。反応混合物を ジクロロメタン１００ｍ ｌで希釈し、炭酸水素ナトリウム溶液及び２０％クエン酸溶液で洗浄し、乾燥し
、真空で濃縮乾燥した。シリカゲルでのクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘプ
タン（１：１）＋２％トリエチルアミン）により１−（２−Ｏ−ベンゾイル−４
−Ｏ−（４，４′−ジメトキシトリチル）−β−Ｄ−リボピラノシル）−５−（
２−フタルイミドエチル）ウラシル７．７ｇ（８７％）を得た。 ＴＬＣ：Ｒｆ０．５３（酢酸エチル／ヘプタン（１：１）＋２％トリエチルアミ
ン）

【０１２１】

【化３９】

【０１２２】 １−（３−Ｏ−ベンゾイル−４−Ｏ−（４，４′−ジメトキシトリチル）−β−
Ｄ−リボピラノシル）−５−（２−フタルイミドエチル）ウラシル １−（２−Ｏ−ベンゾイル−４−Ｏ−（４，４′−ジメトキシトリチル）−β
−Ｄ−リボピラノシル）−５−（２−フタルイミドエチル）ウラシル３ｇ（３．
６３ミリモル）、４−ニトロフェノール１ｇ（７．２６ミリモル）、４−（ジメ
チルアミノ）ピリジン０．４４ｇ（３．６３ミリモル）及びＮ−エチルジイソプ
ロピルアミン３．７５ ｍｌ（２１．７８ミリモル）をイソプロパノール５．６ ｍｌ及びピリジン２５ｍｌに溶解し、６５℃に加熱し、６５℃で３日間攪拌した
。溶液を真空で濃縮乾燥し、残渣をジクロロメタン１５０ｍｌに溶解した。２０
％クエン酸溶液及び炭酸水素ナトリウム溶液で洗浄した後、溶液を硫酸マグネシ
ウムで乾燥した。シリカゲルでのクロマトグラフィー（酢酸エチル／ジクロロメ
タン／イソヘキサン２：１：１）により１−（３−Ｏ−ベンゾイル−４−Ｏ−（
４，４′−ジメトキシトリチル）−β−Ｄ−リボピラノシル）−５−（２−フタ
ルイミドエチル）ウラシル２．２７ｇ（７６％）を得た。 ＴＬＣ：Ｒｆ０．２７（酢酸エチル／イソヘキサン（２：１）＋１％トリエチル
アミン）

【０１２３】

【化４０】

【０１２４】 １−｛２′−Ｏ−［（アリルオキシ）（ジイソプロピルアミノ）ホスフィノ］−
３′−Ｏ−ベンゾイル−４′−Ｏ−［（４，４′−ジメトキシトリフェニル）メ
チル］−β−Ｄ−リボピラノシル｝−５−（２−フタルイミドエチル）ウラシル １−（３−Ｏ−ベンゾイル−４−Ｏ−（４，４′−ジメトキシトリチル）−β
−Ｄ−リボピラノシル）−５−（２−フタルイミドエチル）ウラシル８８ｍｇ（
０．１１ミリモル）をジクロロメタン５ｍｌに溶解し、Ｎ−エチルジイソプロピ
ルアミン７５μｌ（０．４４ミリモル）及びアリルオキシクロロ（ジイソプロピ
ルアミノ）ホスフィン７０μｌ（０．３ミリモル）で処理し、室温で３時間攪拌
した。反応を完結させるためにさらにアリルオキシクロロ（ジイソプロピルアミ
ノ）ホスフィン３５μｌ（０．１５ミリモル）を加えた後、さらに室温で１時間
攪拌し、反応混合物を真空で濃縮した。シリカゲルでのクロマトグラフィー（酢
酸エチル／ヘプタン：グラジエント１：２−１：１−２：１、各場合２％トリエ
チルアミンを用いた）により１−｛２′−Ｏ−［（アリルオキシ）（ジイソプロ
ピルアミノ）ホスフィノ］−３′−Ｏ−ベンゾイル−４′−Ｏ−［（４，４′−
ジメトキシトリフェニル）メチル］−β−Ｄ−リボピラノシル｝−５−（２−フ
タルイミドエチル）ウラシル８５ｇ（７６％）を得た。 ＴＬＣ：Ｒｆ０．３６（酢酸エチル／ヘプタン２：１）

【０１２５】

【化４１】

【０１２６】 ５．２インドールベースリンカー 文献記載のように（Ｋｕｅｈｎｅら ，Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ． ４３，１３
，１９７８，２７３３−２７３５）、無水フタル酸とトリプタミンからＮ−フタ
ロイルトリプタミンを得た。これを（Ａ． Ｇｉａｎｎｉｓら，Ａｎｇｅｗ．Ｃ ｈｅｍ．１９８９，１０１，２２０ に類似して）ボラン−ＴＨＦで還元してイ ンドリンを得た。

【０１２７】 ３−置換インドリンを先ずリボースと反応させ、ヌクレオシドトリオールを得
て、次いで無水酢酸と反応させてトリアセテートを得た。混合物を２，３−ジク
ロロ−５，６−ジシアノパラキノンで酸化し、アセテートをナトリウムメトキシ
ドで開裂し、選択的に２′位にベンゾイル化し、選択的に４′位にＤＭ−トリチ
ル化し、転移反応を行わせて３′−ベンゾエートを得た。ホスホルアミダイトの
生成は常法で行われた。これは合成プロトコルの変更なしに自動オリゴヌクレオ
チド合成に用いられる。操作 ３−（Ｎ−フタロイル−２−アミノエチル）インドリン

【０１２８】

【化４２】

【０１２９】 フタロイルトリプタミンＡ５１．４ｇ（１７７ミリモル）を窒素雰囲気下に１
Ｍボラン−ＴＨＦ溶液（２当量）３５４ｍｌに溶解し、０℃に冷却した。トリフ
ルオロ酢酸３５４ｍｌを（ガスの発生に注意して）０℃で徐々に滴下し、混合物
を３０分間攪拌した（ＴＬＣチェック：ＥｔＯＡｃ）。次いで水１７．３ｍｌを
加え、混合物を１０分間攪拌し真空で濃縮した。残渣を１０％濃度ＮａＯＨ溶液
／ジクロロメタンに溶解し、有機相を分別し、Ｎａ₂ＳＯ₄で乾燥し、ろ過、真空
で濃縮した。残渣（５０．９ｇ）を加熱エタノール（３リットル）から再結晶し
て化合物Ｂ４１．４ｇを得た。ｍ．ｐ．１６１−１６２℃。母液を真空で濃縮し
、残渣を再度エタノールから再結晶してさらに化合物Ｂ３．２ｇを得た。ｍ．ｐ
．１５８−１５９℃。全収率：４４．６ｇ（１５３ミリモル）の化合物Ｂすなわ
ち８６％。

【０１３０】

【化４３】

【０１３１】 ３−（Ｎ−フタロイル−２−アミノエチル）−１−（２′，３′，４′−トリ−
Ｏ−アセチル−β−Ｄ−リボピラノシル）インドール

【０１３２】

【化４４】

【０１３３】 化合物Ａ４５．２ｇ（１５５ミリモル）及びＤ−リボース２３．２ｇ（１５５
ミリモル；１．０当量）を乾燥エタノール７５０ｍｌに懸濁させ、窒素雰囲気下
に４時間加熱還流した（ＴＬＣチェック：ＣＨ₂Ｃｌ₂／ＭｅＯＨ１０：１）。室
温に冷却後、混合物を真空で濃縮した。残渣をピリジン３００ｍｌに溶解し、氷
冷しながら無水酢酸１５５ｍｌで処理した。１５分後、氷浴を除去し、混合物を
室温で１８時間攪拌した（ＴＬＣチェック：ＥｔＯＡｃ／イソヘキサン１：１）
。この溶液を真空で濃縮し、各回トルエン３００ｍｌで３回共蒸発した。得られ
た油分をジクロロメタン９００ｍｌに溶解し、氷冷しながら２，３−ジクロロ−
５，６−ジシアノパラキノン３８．８ｇ（１７１ミリモル；１．１当量）で処理
した。１５分後、氷浴を除去し、混合物を室温で１．５時間攪拌した（ＴＬＣチ
ェック：ＥｔＯＡｃ／イソヘキサン１：１）。沈殿を吸引ろ別し、ジクロロメタ
ンで洗浄し、捨てた。ろ液を飽和ＮａＨＣＯ₃溶液６００ｍｌで洗浄した。この 過程で析出した沈殿を再度吸引ろ別し、ジクロロメタンで洗浄し、捨てた。併せ
た有機抽出物をＮａ₂ＳＯ₄で乾燥し、真空で濃縮した。残渣（９０．９ｇ）をシ
リカゲル６０でのクロマトグラフィー（１０×２５ｃｍ；ＥｔＯＡｃ／イソヘキ
サン２：３）により精製した。次のものを得た：純粋な化合物Ｂ２１．５ｇ、混
合画分は４６．８３ｇでこの新たなクロマトグラフィー処理後にさらに純粋な化
合物Ｂ２０．４ｇを得た。全収率：４１．９ｇ（７６ミリモル）の化合物Ｂすな
わち４９％。

【０１３４】

【化４５】

【０１３５】 ３−（Ｎ−フタロイル−２−アミノエチル）−１−β−Ｄ−リボピラノシル−イ
ンドール

【０１３６】

【化４６】

【０１３７】 化合物Ａ４４．１ｇ（８０ミリモル）を窒素雰囲気下に無水メタノール４００
ｍｌに溶解した。混合物を氷冷しながら３０％濃度ナトリウムメトキシド溶液４
．０mlで処理し、次いで室温で１８時間攪拌した。沈殿を吸引ろ別し、冷エタノ
ールで洗浄した。ろ液を真空で濃縮した。残渣をジクロロメタンにとり、この溶
液を飽和ＮａＨＣＯ₃溶液で洗浄し、Ｎａ₂ＳＯ₄で乾燥し、真空で濃縮した。得 られた残渣を反応溶液から析出した沈殿と共に加熱エタノールから再結晶させて
化合物Ｂ２２．６gを得た。融点１９６−１９８℃。母液を真空で濃縮し、残渣 を再度エタノールから再結晶してさらに化合物Ｂ９．２ｇを得た。ｍ．ｐ．１８
８−１９４℃。全収率：２５．８ｇの化合物Ｂ，すなわち７６％。

【０１３８】

【化４７】

【０１３９】 １−（２′−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｄ−リボピラノシル）−３−（Ｎ−フタロイ
ル−２−アミノエチル）インドール

【０１４０】

【化４８】

【０１４１】 化合物Ａ１０．６ｇ（２５ミリモル）を窒素雰囲気下に乾燥ジクロロメタン２
５０ｍｌにとり、混合物をＤＭＡＰ３０５ｍｇ（２．５ミリモル）及びピリジン
２０ｍｌで処理した。これを全てが溶液になるまで加熱し、次いで−７８℃で冷
却した。ジクロロメタン８ｍｌに溶解したベンゾイルクロリド３．３５ｍｌ（２
８．８ミリモル）を１５分間かけて滴下した。さらに３０分後ＴＬＣチェック（
ＥｔＯＡｃ／ヘキサン３：１）は完全な反応を示した。４５分後、この冷溶液を
折り畳みフィルターを通して飽和ＮＨ４Ｃｌ溶液２００ｍｌに直接加え、ろ過残
渣をジクロロメタンで洗浄した。有機相を１回水洗し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、濃
縮した。残渣をトルエンで２回共蒸発させ、ＥｔＯＡｃ／ヘキサン３：１を用い
た１０×２０ｃｍシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィーにより精製して
化合物Ｂ８．１ｇ（６４％）を得た。

【０１４２】

【化４９】

【０１４３】 １−｛３′−Ｏ−ベンゾイル−４′−Ｏ−［（４，４′−ジメトキシトリフェニ
ル）メチル−β−Ｄ−リボピラノシル｝−３−（Ｎ−フタロイル−２−アミノエ
チル）インドール

【０１４４】

【化５０】

【０１４５】 化合物Ａ８．９ｇ（１６．９ミリモル）を窒素雰囲気下に乾燥ジクロロメタン
１３５ｍｌに懸濁させた。混合物を（完全に溶液になるまで）ＤＭＡＰ２０６ｍ
ｇ（１．６８ミリモル）、Ｎ−エチルジイソプロピルアミン５．８ｍｌ（３３．
７ミリモル）及びピリジン約１２ｍｌで処理した。これを３４ｇのモレキュラー
シーブ４Åで処理し、３０分間攪拌した。０℃に冷却後、ＤＭＴＣｌ１１．４ｇ
（３３．７ミリモル）で処理し、冷却浴を除去後、７５分間攪拌した。次いで、
さらにＤＭＴＣｌを１．９４ｇ（０．３４当量）、さらに４０分後１．１４ｇ（
０．２当量）、及びさらに６５分後１．１４ｇ（０．２当量）加えた。４．２５
時間後反応は完了した。次いで混合物をｎ−プロパノール２５．３ｍｌ（２０当
量）で処理し、さらに３０分間攪拌し、次いで注意深く（泡発生）濃縮した。残
渣をピリジン１００ ｍｌに溶解し、ＤＭＡＰ１．８５ｇ（１５．１ミリモル； ０．９当量）、 Ｎ−エチルジイソプロピルアミン１３．０５ｍｌ（１０１ミリ モル；６．０当量）、ｎ−プロパノール７１ ｍｌ（９４０ミリモル；５６当量 ）及びｐ−ニトロフェノール３．７４ｇ（２６．９ミリモル；１．６当量）で処
理した。この混合物を窒素下に７５−８０℃で９６時間攪拌した。室温に冷却後
、混合物をセライトを通してろ過し、濃縮した。残渣を、トルエン／ジエチルエ
ーテル／トリエチルアミン９０：１０：１を用いてシリカゲル（９×１７ｃｍ）
でのフラッシュクロマトグラフィーで精製した。生成物含有画分（９．２５ｇ）
を先ずＥｔＯＡｃから再結晶させ、次いでトルエン／メタノールから再沈殿させ
て化合物Ｂ５．８６ｇ（４２％）を得た。

【０１４６】

【化５１】

【０１４７】 １−｛２′−Ｏ−（アリルオキシ）（ジイソプロピルアミノ）ホスフィノ−３′
−Ｏ−ベンゾイル−４′−Ｏ−［（４，４′−ジメトキシトリフェニル）メチル
］−β−Ｄ−リボピラノシル｝−３−（Ｎ−フタロイル−２−アミノエチル）イ
ンドール （２ジアステレオマー）

【０１４８】

【化５２】

【０１４９】 アルコールＡ１６５８ｍｇ（２．０ミリモル）をアルゴン雰囲気下に乾燥ジク
ロロメタン１０ｍｌに溶解した。溶液をＮ−エチルジイソプロピルアミン１．０
３ｍｌ（６．０ミリモル）及びモノアリルｎ−ジイソプロピルクロロホスホルア
ミダイト０．６３ｍｌ（２．８ミリモル）で処理し、室温で１時間攪拌した。次
いで過剰のホスホリル化試剤をイソプロパノール６１μｌ（０．８ミリモル）を
加えて分解した。１０分後、混合物を真空で濃縮し、残渣を、ヘキサン／ＥｔＯ
Ａｃ／ＮＥｔ３（７５：２５：１）を用いてシリカゲル（３．３×２１ｃｍ）で
のフラッシュクロマトグラフィーで精製した。生成物含有画分を濃縮し、ＣＣｌ
４にとり、再度濃縮してほとんど無色の泡（ｆｏａｍ）２．０４ｇ（定量的）を
得た。これはオリゴマー化に直接用いられ、数週間−２０℃に保持される。 シリカゲルでのＴＬＣ（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン／ＮＥｔ３３３：６６：１）：０
．４１

【０１５０】

【化５３】

【０１５１】 ５．３リジンベースリンカー 合成はスキーム７に描写され、以下に詳述される。

【０１５２】

【化５４】

【０１５３】 スキーム７：リジンリンカーの合成 ６−アミノ−２（Ｓ）−ヒドロキシヘキサン酸（１）を、 Ｌ−リジンから文 献（Ｋ．−Ｉ．Ａｋｅｔａ，Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．１９７６，２４
，６２１）から知られた方法でジアゾ化及び次いでの加水分解により得た。 ２−（Ｓ）−Ｎ−Ｆｍｏｃ−６−アミノ−１，２−ヘキサンジオール（２） ＬｉＢＨ４３．４ｇ（１５６ミリモル，４当量）をアルゴン下に無水ＴＨＦ（
発熱性）１００ｍｌに溶解した。約３０℃に冷却後、ＴＭＳＣｌ３９．６ｍｌ（
３１２ミリモル，８当量）を徐々に滴下し（ガス発生）、沈殿を生成させた。６
−アミノ−２（Ｓ）−ヒドロキシヘキサン酸 （１）５．７４ｇ（３９ミリモル ）をアルゴン向流で分けて加え、混合物をＴＬＣ（シリカゲル；ｉ−ＰｒＯＨ／
濃ＮＨ４ＯＨ／水７：２：１；ニンヒドリンで着色）がもはや出発物質を何ら示
さなくなるまで（約３時間）６５℃に加熱した。混合物を氷冷しながらメタノー
ル１２０ｍｌで注意深く処理した（激しいガス発生）。溶媒を真空で濃縮し、残
渣を各回メタノール２００ｍｌで３回共蒸発させ、次いで無水ＤＭＦ１００ｍに
溶解した。エチルジイソプロピルアミン１６ｍｌ（９３．６ミリモル，２．４当
量）を加えた後、混合物を０℃に冷却し、ＦｍｏｃＣｌ１２．１ｇ（４６．８ミ
リモル，１．２当量）で分けて処理した。１５分後、冷浴を除去し、混合物を出
発物質が消費されるまで（約３時間；ＴＬＣチェック：シリカゲル；ＣＨＣｌ３
／ＭｅＯＨ／ＨＯＡｃ／水６０：３０：３：５）室温で攪拌した。反応溶液を飽
和ＮａＨＣＯ３溶液６００ｍｌに加えた。沈殿をろ別し、水２００ｍｌで洗浄し
、重量が一定になるまで（約６時間）高真空で５０℃で乾燥して、無色固体１３
．９ｇを得た。これを酢酸エチル（４０ｍｌ）／ｎ−ヘキサン（３５ｍｌ）から
再結晶した。収率：９．０５ｇ（６５％）

【０１５４】

【化５５】

【０１５５】 ２−（Ｓ）−Ｎ−Ｆｍｏｃ−Ｏ１−ＤＭＴ−６−アミノ−１，２−ヘキサンジオ
ール（３）をＷＯ８９／０２４３９に従いＤＭ−トリチル化した。 ２−（Ｓ）−Ｎ−Ｆｍｏｃ−Ｏ１−ＤＭＴ−Ｏ２−アリルオキシジイソプロピル
アミノ−ホスフィニル−６−アミノ−１，２−ヘキサンジオール（４） エチルジイソプロピルアミン０．５１ｍｌ（３．０ミリモル、３当量）及びク
ロロ−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノアリルオキシホスフィン０．３３ｍｌ（１
．５ミリモル，１．５当量）を無水ジクロロメタン１０ｍｌ中のアルコール（３
）６７０ｍｇ（１．０２ミリモル）の溶液にアルゴン下に加えた。混合物を室温
で２時間攪拌し、溶媒を真空で留去し、得られた残渣を、３．２×１６ｃｍシリ
カゲルでのフラッシュクロマトグラフィー（ ＥｔＯＡｃ／イソヘキサン／ＮＥ ｔ３２０：８０：１）で精製して僅かに黄色の油分８３９ｍｇ（９７％）を得た
。 ＴＬＣ：シリカゲル；ＥｔＯＡｃ／イソヘキサン／ＮＥｔ３５０：５０：１；Ｕ
Ｖ； Ｒｆ０．７７。

【０１５６】

【化５６】

【０１５７】実施例６ カップリング試薬としてベンズイミダゾリウムトリフレートを用いる配列（ｓｅ
ｑｕｅｎｃｅ）４′−インドールリンカー−Ａ８−２′のｐ−ＲＮＡオリゴの合
成。

【０１５８】 インドールリンカーホスホルアミダイト１０８ｍｇ及びＡホスホルアミダイト
２４４ｍｇを合成びん（ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ ｖｉａｌ）に秤量し、Ａユニ
ットを載置させたＣＰＧ担体２８．１ｍｇを充填したカラムとともにＫＯＨ上で
デシケータ中に高真空で３時間放置した。ホスホルアミダイトを１ｍｌ（インド
ールリンカー）又は２．５ｍｌ（Ａホスホルアミダイト）のアセトニトリル中に
溶解し、数粒のモレキュラーシーブを加え、ＫＯＨ上でデシケータ中に密閉放置
した。

【０１５９】 ヨウ素２００ｍｇをアセトニトリル５０ｍｌに激しく攪拌しながら溶解した。
全てが溶解した後（目視制御）、水２３ｍｌ及びｓｙｍ−コリジン４．６ｍｌを
加え、溶液を一度完全に混合させた。脱トリチル化のため、ジクロロメタン中の
ジクロロ酢酸の６％濃度溶液を用いた。キャッピング試薬（無水酢酸＋塩基）を
購入し、オリゴヌクレオチド合成に常法に従い用いた。

【０１６０】 ベンズイミダゾリウムトリフレートを加熱アセトニトリルから再結晶させ乾燥
した。ほとんど無色の結晶を用い、無水アセトニトリル中の０．１Ｍ溶液をカッ
プリング試薬として調製した。合成中、この溶液を常に清浄なままにし、合成器
の管の閉塞を起こさせなかった。Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｅｃｏｓｙｎ３００＋（ ＤＭＴ−ｏｎｅ）での修飾された（ｍｏｄｉｆｉｅｄ）ＤＮＡカップリングサイ
クル：脱トリチル化７分、カップリング１時間、キャッピング１．５分、酸化１
分。

【０１６１】 テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム２０ｍｇをジクロロメタン
１．５ｍｌに溶解し、ジエチルアンモニウム重炭酸塩２０ｍｇ、トリフェニルホ
スフィン２０ｍｇ及びオリゴヌクレオチドを担持するガラス担体を加え、きつく
シールし（Ｐａｒａｆｉｌｍ）、びん（ｖｉａｌ）を室温で５時間攪拌した。次
いで、ガラス担体を分析用吸引フィルターで吸引ろ別し、ジクロロメタン、アセ
トン及び水で洗浄した。

【０１６２】 担体を０．１モルのナトリウムジエチルジチオカルバメート水溶液を用いて懸
濁させ、室温で４５分間放置した。これを吸引ろ別し、水、アセトン、エタノー
ル及びジクロロメタンで洗浄した。担体を２４％濃度ヒドラジン水和物溶液１．
５ｍｌに懸濁させ、４℃で２４−３６時間振とうし、０．１モルのトリエチルア
ンモニウム重炭酸塩緩衝液（ＴＥＡＢバッファー）で ７ｍｌに希釈した。これ をＷａｔｅｒｓ Ｓｅｐ−Ｐａｋカートリッジでヒドラジンがなくなるまで洗浄 した。これを８０％濃度ギ酸溶液５ｍｌで処理し、３０分後濃縮乾燥した。残渣
を水１０ｍｌにとり、ジクロロメタンで抽出し、水性相を濃縮し、次いでＨＰＬ
クロマトグラフィー（ｔＲ＝３３分，０．１Ｍトリエチルアンモニウム酢酸塩バ
ッファー中のアセトニトリルのグラジエント）に付した。常法の脱塩により（Ｗ
ａｔｅｒｓ Ｓｅｐ−Ｐａｋカートリッジ）によりオリゴヌクレオチドを得た。 収率：１７．６ＯＤ。物質の同一性を，ＥＳＩマススペクトロスコピー：Ｍ（Ｃ
ａｌｃ．）＝３０８２Ｄ，（Ｍ＋２Ｈ）２＋（ｆｏｕｎｄ）＝１５４１．９Ｄに
より証した。実施例７ 複合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）の製造 １．逐次法（ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ ｐｒｏｃｅｓｓ） 先ず、配列（ｓｅｑｕｅｎｃｅ）Ａ８のｐ−ＲＮＡオリゴマーすなわちオクタ
マー（ｏｃｔａｍｅｒ）を実施例２に記載したようにＥｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｅｃ ｏｓｙｎ Ｄ３００＋上で調製し、次いで、試剤を次のとおりそれぞれ変更する ：すなわち濃度２％のトリクロロ酢酸に代えて濃度６％のジクロロ酢酸を、ピリ
ジン中のヨウ素に代えてコリジン中のヨウ素を、テトラゾール溶液に代えてベン
ズイミダゾリウムトリフレート溶液をそれぞれ用いる。合成プログラムを変えた
後、さらに配列ＧＡＴＴＣのＤＮＡオリゴマーを既知の方法に従い合成する（Ｍ
．Ｊ．Ｇａｉｔ，オリゴヌクレオチド合成，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ ，ＵＫ１９８４）。脱アリル化、ヒドラジン分解、ＨＰＬクロマトグラフィー及
び脱塩をｐ−ＲＮＡオリゴマー用に記載されているように（上記参照）行い、所
望の複合体を得る。 ２．集中法（ｃｏｎｖｅｒｇｅｎｔ ｐｒｏｃｅｓｓ） 実施例２に記載されているように、配列４′−インドールリンカー−Ａ８−２′
をもつｐ−ＲＮＡオリゴマーを調製し、精製し、ヨウドアセチル化する。配列Ｇ
ＡＴＴＣ−チオールリンカーのＤＮＡオリゴマーを既知の方法に従い合成し（Ｍ
．Ｊ．Ｇａｉｔ，オリゴヌクレオチド合成，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ ，英国１９８４）、精製する（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ：Ｎｏ．２０−２９ ３３からの３′−チオールリンカー）。二つの断片を緩衝液中に放置すると（Ｔ
．Ｚｈｕ．ら，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．１９９４，５，３１２）複合体
を生じ、これを最後にＨＰＬＣで精製する。実施例８ ビオチン基のアミノ変性ｐ−ＲＮＡへの複合 先ず、実施例６に記載された方法に類似して、Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ ［２− （２−（４−（モノメトキシトリチル）アミノエトキシ）エチル２−シアノエチ
ル （Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）ホスホルアミダイト）］の５′−アミノ変性剤 ５の手段で４′−末端にアミノ基を具備させた、配列ＴＡＧＧＣＡＡＴのｐ−Ｒ
ＮＡオリゴマーを合成した。オリゴヌクレオチド（１７．０４ＯＤ，０．１７５
μｍｏｌ）を塩基性バッファー０．５ｍｌにとり、ビオチン−Ｎ−ヒドロキシス
クシンイミドエステル１．１４ｍｇ（２．５μｍｏｌ）を無水ＤＭＦ１１４μｌ
に溶解し、溶液を室温で１時間放置した。生成した複合体を予備（ｐｒｅｐａｒ
ａｔｉｖｅ）ＨＰＬＣで精製し、純粋な生成物をＳｅｐａｋを用いて脱塩した。 収率：８．６ＯＤ（４９％）。Ｍ（ｃａｌｃ．）＝３０８０Ｄ，Ｍ（ｆｅｆ）＝
３０８０．４Ｄ。実施例９ シアニン又はビオチン−標識ｐ−ＲＮＡオンライン（ｏｎｌｉｎｅ）製造 先ず、種々のＡ，Ｔ，Ｇ，Ｃ及びＩｎｄ（Ｉｎｄ＝核酸塩基としてのアミノエ
チルインドール）ホスホルアミダイトを既知の方法により製造した。シアニン（
Ｃｙ３−ＣＥ）及びビオチンホスホルアミダイトをＧｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ から得た。

【０１６３】 完全自動固相合成を各場合１５μｍｏｌを用いて行った。１合成サイクルは次
の工程からなる。 （ａ）脱トリチル化： ＣＨ₂Ｃｌ₂（７９ｍｌ）中６％ＤＣＡ（ジクロロ酢酸） で５分； （ｂ） ＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍｌ）、アセトニトリル（２０ｍｌ）で洗浄及び次 いでのアルゴンでのフラッシング（ｆｌｕｓｈｉｎｇ）； （ｃ）カップリング：活性化剤での樹脂の洗浄（ ＣＨ２Ｃｌ２０．２ｍｌ中の ０．５ＭピリジンＨＣｌ）；活性化剤（０．７６ml）及び相当するホスホルアミ
ダイト（０．７６ml：８当量；アセトニトリル中０．１Ｍ）の比１：１での３０
分処理； （ｄ）キャッピング：Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅからの５０％ＣａｐＡ（１０．５ｍ
ｌ）及び５０％ＣａｐＢ（１０．５ｍｌ）（ＣａｐＡ：ＴＨＦ、ルチジン、無水
酢酸；ＣａｐＢ：１−メチルイミダゾール、ＴＨＦ、ピリジン）で２分 （ｅ）酸化：ヨウ素溶液（アセトニトリル１００ｍｌ、水４６ｍｌ及びｓｙｍ−
コリジン９．２ｍｌ中のヨウ素４００ｍｇ）１２０ｍｌで１分； （ｆ）アセトニトリル（２２ｍｌ）で洗浄。

【０１６４】 引き続いてのオリゴヌクレオチドのＨＰＬＣ精製を容易にするために、最後の
ＤＭＴ（ジメトキシトリチル）又はＭＭＴ（モノメトキシトリチル）保護基をビ
オチン又はシアニンモノマーからは除去しなかった。最後のカップリングの変性
ホスホルアミダイトでの検出は合成後にＵＶ（５０３ｎｍ）でのトリチルカチオ
ン吸収の手段で樹脂の１％で実施される。 オリゴヌクレオチドの作製（ｗｏｒｋ−ｕｐ）： アリルエーテル保護基を、ＣＨ₂Ｃｌ₂（１５ｍｌ）中のテトラキス（トリフェ
ニルホスフィン）パラジウム（２７２ｍｇ）、トリフェニルホスフィン（２７２
ｍｇ）及びジエチルアンモニウム重炭酸塩の溶液で室温で５時間処理して除去し
た。次いで、ガラス担体をＣＨ₂Ｃｌ₂（３０ｍｌ）、アセトン（３０ｍｌ）及び
水（３０ｍｌ）で洗浄した。パラジウム錯体残渣を除去するために、樹脂を０．
１Ｍナトリウムジエチルジチオカルバメート水和物水溶液でリンスした。上述の
洗浄操作を反対の順でもう一度行った。次いで、樹脂を高真空で１０分乾燥した
。同時に脱ベンゾイル化を伴うガラス担体からの除去工程を２４％ヒドラジン水
和物溶液（６ｍｌ）中４℃で行った。ＲＰ１８上でのＨＰＬＣチェッキング（１
８−２５時間）後、オリゴヌクレオチド「Ｔｒｉｔｙｌ ＯＮ」を、活性化され た（アセトニトリル、２０ｍｌ）Ｗａｔｅｒｓ Ｓｅｐ−Ｐａｋ Ｃａｒｔｒｉｄ
ｇｅでヒドラジンから取り除いた。ヒドラジンをＴＥＡＢ０．１Ｍ（３０ｍｌ）
で洗浄した。次いで、オリゴヌクレオチドをアセトニトリル／ＴＥＡＢ０．１Ｍ
（１０ｍｌ）で溶出した。次いで、混合物をＨＰＬＣ（断片配列の分離用）で精
製し、ＤＭＴ脱保護（８０％濃度水性ギ酸３０ｍｌ）を行った。最後に脱塩して
（ＴＥＡＢバッファー０．１Ｍ／アセトニトリル：１／１を用いたＳｅｐ−Ｐａ
ｋ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅで）、純粋なシアニン−又はビオチン−標識オリゴマー を得た。このオリゴ溶液の一部（アリコート）をＥＳＩ−ＭＳを行うために用い
た。４′Ｃｙ−ＡＩｎｄＴＴＣＣＴＡ２′：Ｍ＝３０２６、（Ｍ＋Ｈ）⁺＝３０ ２７。４′ビオチン−ＴＡＧＧＡＡＩｎｄＴ２′：Ｍ＝３０１４、（Ｍ＋Ｈ）²⁺ ｍ／ｅ１５０８及び（Ｍ＋Ｈ）⁺ｍ／ｅ ３０１５。 オリゴ体（Ｏｌｉｇｏｓ）を貯蔵のため凍結乾燥した。実施例１０ ｐ−ＲＮＡのＮ−（ヨードアセチルオキシ）−スクシンイミドでのヨードアセチ
ル化 ｐ−ＲＮＡ配列：４′ＡＧＧＣＡＩｎｄＴ２′Ｍｗ＝２２６６．５６ｇ／モル（
Ｉｎｄ＝インドール−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＮＨ₂−リンカー ｐ−ＲＮＡ１当量を０．１モル重炭酸ナトリウム溶液（ｐＨ８．４）に溶解し
（３５０ｎｍｏｌ当たり１ｍｌ）、ＤＭＳＯ中のＮ−（ヨードアセチルオキシ）
スクシンイミド溶液で処理した（ｍｇ当たり４０μｌ）。バッチをＡｌフィルム
で暗くし（ｂｌａｃｋｅｄ ｏｕｔ）、室温で３０−９０分放置した。

【０１６５】 反応の進行を分析用ＨＰＬＣで監視した。標準条件は次のとおりである。 バッファーＡ；水での０．１モルのトリエチルアンモニウム酢酸塩バッファー バッファーＢ；水：アセトニトリル（１：４）での０．１モルのトリエチルアン
モニウム酢酸塩バッファー グラジエント：１０％Ｂから出発して４０分で５０％Ｂへ カラム材：Ｍｅｒｃｋ Ｄａｒｍｓｔａｄｔ ＧｍｂＨ製の、１０μＭのＬｉＣｈ
ｒｏｓｐｈｅｒｅ（登録商標）１００ＲＰ−１８；２５０×４ｍｍ 出発物質の保持時間：１８．４分 この場合の生成物の保持時間：２３．１分 反応が完了した後、バッチを水で４倍容に希釈した。Ｗａｔｅｒｓ Ｓｅｐ− Ｐａｋ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ ＲＰ−１８（１５ ＯＤ ２ｇのパッキングから）を
２×１０ｍｌのアセトニトリル及び２×１０ｍｌの水で活性化し、オリゴを適用
し、埋入させ（ｓｉｎｋ ｉｎ）、塩及び試剤を除去するために反応容器を２× １０ｍｌの水で洗浄し、３×１０ｍｌの水で再洗浄し、先ず５×１ｍｌの水：ア
セトニトリル（５０：１）、次いで水：アセトニトリル（１：１）で溶出した。
生成物を非常に良い純度で１：１画分で溶出した。画分は冷却して暗所で濃縮し
、併せ、再度濃縮した。収率をＵＶ吸収分光計で２６０ｎｍで決定した。質量分
析： 配列：４′ＡＧＧＣＡＩｎｄ（ＣＨ₂ＣＨ₂ＮＨＣＯＣＨ₂−Ｉ）Ｔ２′ 算出（ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ）質量：２４３４．５０ｇ／モル 質量ＭＨ₂ ²⁺：２４３３ｇ／モル実施例１１ ｐ−ＲＮＡの配列ＣＹＳＫＶＧのペプチドへの複合 ヨードアセチル化ｐ−ＲＮＡ（Ｍ_w＝２４３４．５０ｇ／モル）をバッファー 系に溶解し（１１４ｎｍｏｌ当たり１０００μｌ）、次いでバッファーでのペプ
チド溶液（２モルのＣＹＳＫＶＧペプチド； Ｍ_w＝６５５．７７３ｇ／モル；バ
ッファー２０μｌ中の２２８ｎｍｏｌ）で処理した。 バッファー系：Ｒｉｅｄｅｌ−ｄｅ Ｈａｅｎ製のＢｏｒａｘ／ＨＣｌバッファ ー（ｐＨ８．０）を、１０ミリモルのＥＤＴＡジナトリウム塩の水溶液と１：１
比で混合し、ＨＣｌを用いｐＨ６．３に調整した。このようにして５ｍＭのＮａ ₂ ＥＤＴＡを含む溶液を得た。

【０１６６】 バッチを転化が完了するまで室温で暗所に放置した。反応をＨＰＬＣ分析で監
視した。標準条件は次のとおりである。 バッファーＡ；水での０．１モルのトリエチルアンモニウム酢酸塩バッファー バッファーＢ；水：アセトニトリル（１：４）での０．１モルのトリエチルアン
モニウム酢酸塩バッファー グラジエント：１０％Ｂから出発して４０分で５０％Ｂへ カラム材：Ｍｅｒｃｋ Ｄａｒｍｓｔａｄｔ ＧｍｂＨ製の、１０μＭのＬｉＣｈ
ｒｏｓｐｈｅｒｅ（登録商標）１００ＲＰ−１８；２５０×４ｍｍ 出発物質の保持時間：１７．６分 生成物の保持時間：１５．５分 反応が完了した後、バッチをＲＰ−ＨＰＬＣで直接精製した。（標準条件は上
記参照）。

【０１６７】 画分は冷却して暗所で濃縮し、併せ、再度濃縮した。残渣を水にとり、脱塩し
た。Ｗａｔｅｒｓ Ｓｅｐ−Ｐａｋ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ ＲＰ−１８（１５ ＯＤ
２ｇのパッキングから）を２×１０ｍｌのアセトニトリル及び２×１０ｍｌの 水で活性化し、オリゴを適用し、埋入させ、塩を除去するために反応容器を２×
１０ｍｌの水で洗浄し、３×１０ｍｌの水で再洗浄し、水：アセトニトリル（１
：１）で溶出した。生成物画分は濃縮し、併せ、再度濃縮した。収率をＵＶ吸収
分光計で２６０ｎｍで決定した。それは理論値の７０−９５％に達した。 質量分析： 配列：４′ＡＧＧＣＡＩｎｄ（ＣＨ₂ＣＨ₂ＮＨＣＯＣＨ₂−ＣＹＳＫＶＧ）Ｔ２ ′ 算出（ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ）質量：２９６２．３６ｇ／モル 質量ＭＨ₂ ²⁺：２９６２ｇ／モル実施例１２ ｐ−ＲＮＡのペプチドライブラリへの複合 ヨードアセチル化ｐ−ＲＮＡ（Ｍｗ＝２４３４．５０ｇ／モル）をバッファー系
に溶解し（８３２ｎｍｏｌ当たり１３００μｌ）、次いでペプチドライブラリ（
ＣＫＲ−ＸＸ−ＯＨ；Ｘ＝Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、
Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ）溶液でバッファー［８モル；平均分子質量Ｍ
ｍ＝６７７．８２ｇ／モル；バッファー２００μｍｏｌ中の４．５ｍｇ（６．６
６μｍｏｌ）］中で処理した。 バッファー系：Ｒｉｅｄｅｌ−ｄｅ Ｈａｅｎ製のＢｏｒａｘ／ＨＣｌバッファ ー（ｐＨ８．０）を、１０ミリモルのＥＤＴＡジナトリウム塩の水溶液と１：１
比で混合し、ＨＣｌを用いｐＨ６．６に調整した。このようにして５ｍＭのＮａ
２ＥＤＴＡを含む溶液を得た。バッチを転化が完了するまで室温で暗所に放置し
た。反応をＨＰＬＣ分析で監視した。この場合、出発物質は７０時間後に消失し
た。分析用ＨＰＬＣの標準条件は次のとおりである。 バッファーＡ；水での０．１モルのトリエチルアンモニウム酢酸塩バッファー バッファーＢ；水：アセトニトリル（１：４）での０．１モルのトリエチルアン
モニウム酢酸塩バッファー グラジエント：１０％Ｂから出発して４０分で５０％Ｂへ カラム材：Ｍｅｒｃｋ Ｄａｒｍｓｔａｄｔ ＧｍｂＨ製の、１０μＭのＬｉＣｈ
ｒｏｓｐｈｅｒｅ（登録商標）１００ＲＰ−１８；２５０×４ｍｍ 出発物質の保持時間：１８．８分 生成物の保持時間：１３．９−３６．２分から数個のピーク 反応が完了した後、バッチを水を用い４倍容に希釈した。Ｗａｔｅｒｓ Ｓｅ ｐ−Ｐａｋ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ ＲＰ−１８（１５ ＯＤ ２ｇのパッキングから
）を３×１０ｍｌのアセトニトリル及び３×１０ｍｌの水で活性化し、オリゴを
適用し、埋入させ、反応容器を２×１０ｍｌの水で再洗浄し、塩及び過剰のペプ
チドを除去するためにカートリッジを３×１０ｍｌの水で再洗浄し、生成物がも
はやＵＶ分光計で溶出されなくなるまで水：アセトニトリル（１：１）で溶出し
た。画分は冷却して暗所で濃縮し、併せ、再度濃縮した。

【図面の簡単な説明】

【図１】 天然に産生する形態（左）及びｐ−ＮＡ（右）の形態のＲＮＡの構造の断面を
示す。

【図２】 Ｅｓｃｈｅｎｍｏｓｅｒら（１９９３）によるｐ−リボ（Ａ，Ｕ）オリゴヌク
レオチドの合成を図式的に示す。

【図３】 固体担体上の固定化認識構造（アレイ）の配列を図式的に示す。

【手続補正書】

【提出日】平成１２年１２月１５日（２０００．１２．１５）

【手続補正１】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】全図

【補正方法】変更

【補正内容】

【図１】

【図２】

【図３】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ブラントシュテッター，ティルマン ドイツ連邦共和国デー−80339 ミュンヘ ン，ヴェステントシュトラーセ 154 (72)発明者 ブルディンスキー，ゲルハルト ドイツ連邦共和国デー−56355 ナステッ テン，ヨハネスヴェーク ２ Ｆターム(参考） 4C057 AA17 AA19 CC03 DD01 MM05 【要約の続き】 【化２】

Claims (25)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】未保護ペントピラノシドから出発して、（ａ）第１の工程で、ペン
   トピラノシドの２′，３′又は４′−位を先ず保護し、（ｂ）第２の工程で、残
   りの２′，３′又は４′−位を保護することを特徴とするペントピラノシルヌク
   レオシドの製造方法。
2. 【請求項２】下記の式（Ｉ）又は式（ＩＩ）のペントピラノシルヌクレオシドを
   製造することを特徴とする請求項１記載の方法。 式（Ｉ） 【化１】 ｛ここで、Ｒ¹はＨ、ＯＨ、Ｈａｌ（ここでＨａｌはＢｒ又はＣｌである）、又 は式 【化２】 、又は式 【化３】 又は−Ｏ−Ｐ［Ｎ（ｉ−Ｐｒ）₂］−（ＯＣＨ₂ＣＨ₂ＣＮ）（ここでｉ−Ｐｒは イソプロピルである）から選ばれた基であり、Ｒ²，Ｒ³及びＲ⁴はそれぞれ、互 いに独立して、同一であるか又は異なって、Ｈ、Ｈａｌ（ここでＨａｌはＢｒ又
   はＣｌである）、ＮＲ⁵Ｒ⁶、ＯＲ⁷、ＳＲ⁸、＝Ｏ、Ｃ_nＨ_2n+1（ここでｎは１− １２、好ましくは１−８、特に１−４の整数である）、β−脱離性基、好ましく
   は式−ＯＣＨ₂ＣＨ₂Ｒ¹⁸（ここでＲ¹⁸はシアノ基、ｐ−ニトロフェニル基、又は
   フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基である）、式 【化４】 〔ここで、Ｒ¹²，Ｒ¹³，Ｒ¹⁴及びＲ¹⁵はそれぞれ、互いに独立して、同一である
   か又は異なって、Ｈ、ＯＲ⁷（ここでＲ⁷は上記の意味をもつ）、又はＣ_nＨ_2n+1 又はＣ_nＨ_2n-1（ここでｎは上記の意味をもつ）である〕の基であって、かつＲ⁵ ，Ｒ⁶，Ｒ⁷及びＲ⁸はそれぞれ、互いに独立して、同一であるか又は異なって、 Ｈ、Ｃ_nＨ_2n+1又はＣ_nＨ_2n-1（ここでｎは上記の意味をもつ）、又は−Ｃ（Ｏ）
   Ｒ⁹（ここでＲ⁹は直鎖状又は分枝状の、場合により置換されたアルキル又はアリ
   ール基、好ましくはフェニル基である）であり、Ｘ，Ｙ及びＺはそれぞれ、互い
   に独立して、同一であるか又は異なって、＝Ｎ−、＝Ｃ（Ｒ¹⁶）−又は−Ｎ（Ｒ ¹⁷ ）−（ここでＲ¹⁶及びＲ¹⁷はそれぞれ、互いに独立して、同一であるか又は異
   なって、Ｈ、又は上記の意味をもつＣ_nＨ_2n+1又は（Ｃ_nＨ_2n）ＮＲ¹⁰Ｒ¹¹である
   ）であり、そしてＳ_c1及びＳ_c2はそれぞれ、互いに独立して、同一であるか又は
   異なって、Ｈ、又はアシル、トリチル又はアリルオキシカルボニル基、好ましく
   はベンゾイル若しくは４，４′−ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）基から選ばれた
   保護基である｝ 式（ＩＩ） 【化５】 ［ここで、Ｒ¹′はＨ、ＯＨ、Ｈａｌ（ここでＨａｌはＢｒ又はＣｌである）、 又は式 【化６】 、又は式 【化７】 又は−Ｏ−Ｐ［Ｎ（ｉ−Ｐｒ）₂］−（ＯＣＨ₂ＣＨ₂ＣＮ）（ここでｉ−Ｐｒは イソプロピルである）から選ばれた基であり、Ｒ²′，Ｒ³′及びＲ⁴′はそれぞ れ、互いに独立して、同一であるか又は異なって、Ｈ、Ｈａｌ（ここでＨａｌは
   Ｂｒ又はＣｌである）、＝Ｏ、Ｃ_nＨ２_n+1、Ｃ_nＨ_2n-1、β−脱離性基、好まし くは式−ＯＣＨ₂ＣＨ₂Ｒ¹⁸（ここでＲ¹⁸はシアノ基、ｐ−ニトロフェニル基、フ
   ルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基である）、又は（Ｃ_nＨ_2n） ＮＲ¹⁰′Ｒ¹¹′（ここでＲ¹⁰′，Ｒ¹¹′は互いに独立して、上記のＲ¹⁰又はＲ¹¹ の意味をもつ）の基であり、Ｘ′、Ｙ′及びＺ′はそれぞれ、互いに独立して、
   同一であるか又は異なって、＝Ｎ−、＝Ｃ（Ｒ¹⁶′）−又は−Ｎ（Ｒ¹⁷′）−（
   ここでＲ¹⁶′及びＲ¹⁷′は互いに独立して上記のＲ¹⁶又はＲ¹⁷の意味をもつ）で
   あり、そしてＳ_c1′及びＳ_c2′は上記のＳ_c1及びＳ_c2の意味をもつ］
3. 【請求項３】ペントピラノシルヌクレオシドがリボ−、アラビノ−、リキソ−及
   び／又はキシロピラノシルヌクレオシド、好ましくはリボピラノシルヌクレオシ
   ドであることを特徴とする請求項１又は２記載の方法。
4. 【請求項４】ペントピラノシル部がＤ又はＬ配置であることを特徴とする請求項
   １ないし３のいずれかに記載の方法。
5. 【請求項５】用いられるペントピラノシルヌクレオシドがペントピラノシルプリ
   ン、−２，６−ジアミノプリン、−６−プリンチオール、−ピリジン、−ピリミ
   ジン、−アデノシン、−グアノシン、−イソグアノシン、−６−チオグアノシン
   、−キサンチン、−ヒポキサンチン、−チミジン、−シトシン、−イソシトシン
   、−インドール、−トリプタミン、−Ｎ−フタロイルトリプタミン、−ウラシル
   、−カフェイン、−テオブロミン、−テオフィリン、−ベンゾトリアゾール又は
   −アクリジンであることを特徴とする請求項１ないし４のいずれかに記載の方法
   。
6. 【請求項６】Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁴、Ｒ²′、Ｒ³′及び／又はＲ⁴′が２−フタルイミド
   エチル又はアリルオキシ基又は式−Ｎ［Ｃ（Ｏ）Ｒ⁹］₂の基であることを特徴と
   する請求項１ないし５のいずれかに記載の方法。
7. 【請求項７】ペントピラノシルヌクレオシドが［（２′，４′−ジ−Ｏ−ベンゾ
   イル）−β−リボピラノシル］ヌクレオシド、特に［（２′，４′−ジ−Ｏ−ベ
   ンゾイル）−β−リボピラノシル］−アデニン、−グアニン、−シトシン、−チ
   ミジン、−ウラシル、−キサンチン又は−ヒポキサンチン、Ｎ−ベンゾイル−２
   ′，４′−ジ−Ｏ−ベンゾイルリボピラノシルヌクレオシド、特に−アデニン、
   −グアニン又は−シトシン、Ｎ−イソブチロイル−２′，４′−ジ−Ｏ−ベンゾ
   イルリボピラノシルヌクレオシド、特に−アデニン、−グアニン又は−シトシン
   、Ｏ⁶−（２−シアノエチル）−Ｎ²−イソブチロイル−２′，４′−ジ−Ｏ−ベ
   ンゾイルリボピラノシルヌクレオシド、特に−グアニン、Ｏ⁶−（２−（４−ニ トロフェニル）エチル）−Ｎ²−イソブチロイル−２′，４′−ジ−Ｏ−ベンゾ イルリボピラノシルヌクレオシド、特に−グアニン、β−リボピラノシルヌクレ
   オシド、特にβ−リボピラノシルアデニン、−グアニン、−シトシン、−チミジ
   ン若しくは−ウラシル、−キサンチン若しくは−ヒポキサンチン、Ｎ−ベンゾイ
   ル−、Ｎ−イソブチロイル−、 Ｏ⁶−（２−シアノエチル）−若しくはＯ⁶−（ ２−（４−ニトロフェニル）エチル）−Ｎ²−イソブチロイル−β−リボピラノ シルヌクレオシド、４′−ＤＭＴ−ペントピラノシルヌクレオシド、好ましくは
   ４′−ＤＭＴ−リボピラノシルヌクレオシド、特に４′−ＤＭＴ−リボピラノシ
   ルアデニン、−グアニン、−シトシン、−チミジン、−ウラシル、−キサンチン
   若しくは−ヒポキサンチン、Ｎ−ベンゾイル−４′− ＤＭＴ−リボピラノシル ヌクレオシド、特にＮ−ベンゾイル−４′− ＤＭＴ−リボピラノシルアデニン 、−グアニン又は−シトシン、Ｎ−イソブチロイル−４′− ＤＭＴ−リボピラ ノシルヌクレオシド、特にＮ−イソブチロイル−４′− ＤＭＴ−リボピラノシ ルアデニン、−グアニン又は−シトシン、Ｏ⁶−（２−シアノエチル）− Ｎ²− イソブチロイル−４′− ＤＭＴ−リボピラノシルヌクレオシド、特にＯ⁶−（２
   −シアノエチル）− Ｎ²−イソブチロイル−４′− ＤＭＴ−リボピラノシルグ アニン、Ｏ⁶−（２−（４−ニトロフェニル）エチル）−Ｎ²−イソブチロイル−
   ４′− ＤＭＴ−リボピラノシルヌクレオシド、特にＯ⁶−（２−（４−ニトロフ
   ェニル）エチル）−Ｎ²−イソブチロイル−４′− ＤＭＴ−リボピラノシルグア
   ニン又はβ−リボピラノシル−Ｎ，Ｎ′−ジベンゾイルアデノシン又はβ−リボ
   ピラノシル−Ｎ，Ｎ′−ジベンゾイルグアノシンであることを特徴とする請求項
   １ないし５のいずれかに記載の方法。
8. 【請求項８】２′−保護位の場合に、保護基の転位が２′−位から３′−位へ行
   われることを特徴とする請求項１ないし７のいずれかに記載の方法。
9. 【請求項９】転位が塩基の存在下に、特にＮ−エチルジイソプロピルアミン及び
   ／又はトリエチルアミンの存在下に行われることを特徴とする請求項８記載の方
   法。
10. 【請求項１０】ピラノシルヌクレオシドが、酸に不安定であるか、塩基に不安定
    であるか、又は金属接触で除去されうる保護基Ｓ_c1、Ｓ_c2、 Ｓ_c1′又はＳ_c2′ によって保護されていることを特徴とする請求項１ないし９のいずれかに記載の
    方法。
11. 【請求項１１】 Ｓ_c1及びＳ_c1′がＳ_c2及びＳ_c2′と異なることを特徴とする請 求項１ないし１０のいずれかに記載の方法。
12. 【請求項１２】保護基Ｓ_c1、Ｓ_c2、 Ｓ_c1′又はＳ_c2′がアシル基、好ましくは アセチル、ベンゾイル、ニトロベンゾイル及び／又はメトキシベンゾイル基、ト
    リチル基、好ましくは４，４′−ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）基又はβ−脱離
    性基、好ましくは式ＯＣＨ₂ＣＨ₂Ｒ¹⁸（ここで、Ｒ¹⁸はシアノ基、ｐ−ニトロフ
    ェニル基又はフルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基である）の基
    から選択されることを特徴とする請求項１ないし１１のいずれかに記載の方法。
13. 【請求項１３】２′−又は３′−位が、塩基に不安定であるか、又は金属接触で
    除去されうる保護基、好ましくはアシル基、特にアセチル、ベンゾイル、ニトロ
    ベンゾイル及び／又はメトキシベンゾイル基で保護されていることを特徴とする
    請求項１ないし１２のいずれかに記載の方法。
14. 【請求項１４】４′−位が、酸又は塩基に不安定である保護基、好ましくはトリ
    チル基及び／又はＦｍｏｃ基、特にＤＭＴ基で保護されていることを特徴とする
    請求項１ないし１３のいずれかに記載の方法。
15. 【請求項１５】（ａ）保護された核酸塩基を保護されたペントピラノースと反応
    させ、（ｂ）工程（ａ）からの生成物のペントピラノシル部位から保護基を除去
    し、（ｃ）工程（ｂ）からの生成物を請求項１−１４のいずれかによる方法に従
    い反応させることを特徴とするペントピラノシルヌクレオシドの製造方法。
16. 【請求項１６】保護されたペントピラノースがアノマーとして純粋であることを
    特徴とする請求項１５記載の方法。
17. 【請求項１７】（ａ）式（ＩＩ）［ここで、Ｒ⁴′は（Ｃ_nＨ_2n）ＯＳ_c3又は（Ｃ _n Ｈ_2n）Ｈａｌ（ここで、ｎは上記の意味をもち、Ｓ_c3は保護基、好ましくはメ シレート基であり、Ｈａｌは塩素又は臭素である）である］の化合物をアジドと
    反応させ、 （ｂ）（ａ）からの反応生成物を還元し、 （ｃ）（ｂ）からの反応生成物を適当なフタルイミドと反応させ、 （ｄ）（ｃ）からの反応生成物を適当な保護されたピラノースと反応させ、そし
    て、 （ｅ）保護基を除去し、そして、 （ｆ）請求項７ないし１６のいずれかに記載の工程を実施することを特徴とする
    、式（ＩＩ）［ここで、 Ｒ⁴′は（Ｃ_nＨ_2n）ＮＲ¹⁰′Ｒ¹¹′であり、 Ｒ¹⁰′Ｒ ¹¹ ′は式（ＩＩＩ）の基を介して請求項１に定義した意味に結合されている］に
    よるリンカーの製造のための請求項１５記載の方法。
18. 【請求項１８】（ａ）適当なインドリンをピラノースと反応させてヌクレオシド
    トリオールを生成させ、 （ｂ）（ａ）からの生成物のピラノシル部位のヒドロキシル基を好ましくはアシ
    ル基で保護し、 （ｃ）（ｂ）からの生成物を酸化し、 （ｄ）（ｃ）からの生成物のピラノシル部位のヒドロキシル保護基を除去するこ
    とを特徴とする、式（Ｉ）［ここでＸ及びＹはそれぞれ、互いに独立して、同一
    であるか又は異なって、＝Ｃ（Ｒ¹⁶）（ここでＲ¹⁶はＨ又はＣ_nＨ_2nである）で あり、Ｚは＝Ｃ（Ｒ¹⁶）−（ここでＲ¹⁶は請求項１に定義した意味をもつ（Ｃ_n Ｈ_2n）ＮＲ¹⁰Ｒ¹¹である）である］によるリンカーの製造のための請求項１５記
    載の方法。 （ｆ）請求項７ないし１６のいずれかに記載の工程を実施することを特徴とする
19. 【請求項１９】４′−保護ペントピラノシルヌクレオシドをさらなる工程でホス
    フィチル化し、あるいは固相に結合させることを特徴とする請求項１ないし１８
    のいずれかに記載の方法。
20. 【請求項２０】（ａ）第１工程で、請求項１ないし１９のいずれかに記載の方法
    により製造された、保護されたペントピラノシルヌクレオシドを固相に結合させ
    、そして、 （ｂ）第２工程で工程（ａ）により固相に結合された３′−，４′−保護ペント
    ピラノシルヌクレオシドをホスフィチル化３′−，４′−保護ペントピラノシル
    ヌクレオシドにより伸長させ、そして、 （ｃ）工程（ｂ）を繰り返すことを特徴とするペントピラノシル核酸の製造方法
    。
21. 【請求項２１】工程（ａ）及び／又は工程（ｂ）でペントフラノシルヌクレオシ
    ドもまた併合されることを特徴とする請求項１９記載の方法。
22. 【請求項２２】工程（ｂ）による伸長のために用いられるカップリング試薬が、
    ホスホルアミダイトを用いる場合にはピリジニウム塩酸塩、好ましくはニトロフ
    ェニルテトラゾール、特にベンズイミダゾリウムトリフレートなどの酸性活性化
    剤であり、Ｈ−ホスホネートを用いる場合には、アリールスルホニルクロリド、
    ジフェニルクロロホスホネート、ピバロイルクロリド又はアダマントイルクロリ
    ドであることを特徴とする請求項２０又は２１記載の方法。
23. 【請求項２３】さらなる工程（ｄ）において、保護基及び形成されたオリゴマー
    を固相から除去することを特徴とする、請求項２０ないし２２のいずれかに記載
    の方法。
24. 【請求項２４】ヒドラジン分解での除去が好ましくは塩の存在下に行われること
    を特徴とする請求項２３記載の方法。
25. 【請求項２５】さらなる工程で、式：Ｓ_c4ＮＨ（Ｃ_nＨ_2n）ＣＨ（ＯＰＳ_c5Ｓ_c6 ）Ｃ_nＨ_2nＳ_c7（式中、Ｓ_c4及びＳ_c7はそれぞれ、互いに独立して、同一である か又は異なって、特にＦｍｏｃ及び／又はＤＭＴから選ばれた保護基であり、Ｓ _c5 及びＳ_c6はそれぞれ、互いに独立して、同一であるか又は異なって、アリルオ
    キシ及び／又はジイソプロピルアミノ基であり、 ｎは請求項１に規定されたと おりのものである）のアリルオキシリンカーが併合されることを特徴とする請求
    項２０ないし２４のいずれかに記載の方法。