JP2001517675A - ペントピラノシルヌクレオシドの製造方法 - Google Patents
ペントピラノシルヌクレオシドの製造方法Info
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Abstract
Description
の製造及び治療的、診断的及び/又は電子的構成要素の生産のための利用に関す
る。
り、C−2′位とC−4′位との間でホスホジエステルにより繰り返して結合さ
れている天然RNAに対し、異性である型構造のものである(図1)。「核酸塩
基(nucleobase)」はここでは標準核酸塩基A、T、U、C、G、E
を意味するものとして解されるが、またイソグアニン/イソシトシン及び2,6
−ジアミノプリン/キサンチン対も、そして本発明の意味ではまた他のプリン及
びピリミジンも「核酸塩基」に包含される。p−NAs、すなわちリボースから
誘導されたp−RNAsは最初にEschenmoserらにより報告された(
参照、Pitsch,Sら.Helv.Chim.Acta1993,76,2
161; Pitsch,Sら.Helv.Chim.Acta1995,78 ,1621;Angew.Chem.1996,108,1619−1623)
。それらはもっぱら、いわゆるワトソン−クリック対合の(Watson−Cr
ick−paired)、すなわちプリン−ピリミジン−及びプリン−プリン−
対の、逆平行の、可逆的に融解する(melting)、擬リニアー状の(qu
asi−linear)、そして安定な二重鎖(duplexes)を形成する
。対掌性(chirality)の反対の意味のホモキラルp−RNA鎖は同じ
く対合するのを制御でき、形成された二重鎖は厳密には非螺旋状である。この特
異性は、超分子の構築のために価値があり、これはリボピラノースホスフェート
基幹の比較的低いフレキシビリティー、基面(base plane)の鎖軸に 対する強度の傾き、及びこれから生じる、インターカテナリーベース(inte
rcatenary base)が生成二重鎖に積み重なる傾向と関係づけられ 、結局、基幹の構築に2′,4′−シス−ジ置換リボピラノース環の関与に帰せ
られる。これらの特に良好な対合特性は超分子単位の構築に用いて、p−NAs
対系をDNA及びRNAと比べて好ましくさせる。それらは天然の核酸に直交す
る対系を形成する、すなわち特に診断分野で重要である、天然形態で産生するD
NAs及びRNAsとは対合しない。
ように最初にp−RNAを製造した。
セタミドの作用で、そしてルイス酸、例えばトリメチルシリルトリフルオロメタ
ンスルホネートの作用でテトラベンゾイルリボピラノースのアノマー混合物と反
応させられた(H.Vorbruggen,K.Krolikiewicz,B
.Bennua,Chem.Ber.1981,114,1234に類似)。塩
基(プリンの場合にはTHF/メタノール/水中のNaOH;ピリミジンの場合
にはMeOH中の飽和アンモニア)の作用下に、アシル保護された基を糖から除
去し、生成物を酸性接触下にp−アニスアルデヒドジメチルアセタールで3′, 4′−位で保護した。ジアステレオマー混合物を2′−位でアシル化し、3′,
4′−メトキシベンジリデン−保護された2′−ベンゾエートを酸性処理、例え
ばメタノール中のトリフルオロ酢酸で脱アセタール化し、ジメトキシトリチルク
ロリドと反応させた。ベンゾエートの2′⇒3′転移はp−ニトロフェノール/ 4−(ジメチルアミノ)ピリジン/トリエチルアミン/ピリジン/n−プロパノ
ールで処理することにより開始された。ほとんどすべての反応はカラムクロマト
グラフィーにより仕上げられた。次いで、この方法で合成されたキー単位、リボ
ピラノースの4′−DMT−3′−ベンゾイル−1′−核酸塩基誘導体を部分的
にホスフィチル化し、リンカーを介して固相に結合させた。
繰り返し酸性状態で脱保護し、ホスホルアミダイトをカップリング試薬、例えば
テトラゾール誘導体の作用で結合させ、まだ遊離の4′−酸素原子をアセチル化
し、リン原子をオリゴマー生成物を得るために酸化した。次いで、残留保護基を
除去し、生成物を精製し、HPLCで脱塩した。
利を示す: 1.核酸塩基でのヌクレオシド化反応のための非アノマーとして純粋なテトラベ
ンゾペントピラノース(H.G.Fletcher,J.Am.Chem.So
c.1955,77,5337)の使用は、次の工程での過酷なクロマトグラフ
ィーの必要のために最終生成物の収率を減少させる。 2.1′−位に核酸塩基を有するリボピラノースから出発して、保護された3′
−ベンゾエートまでの5つの反応段階で合成が非常に遅延し、工業的規模での実
施はほとんど不可能である。時間的浪費が大きい上に、得られるモノマー単位の
収率がプリン単位アデニンの場合で29%、ピリミジン単位ウラシルの場合で2
4%と低い。 3.オリゴヌクレオチドの合成では、自動p−RNA合成で5−(4−ニトロフェニ
ル)−1H−テトラゾールがカップリング試薬として用いられる。アセトニトリ
ル中のテトラゾールの溶液でのこの試剤の濃度は、この場合に5−(4−ニトロ
フェニル)−1H−テトラゾール合成器の細管中で一様に晶出し、かくして合成
が早期に終わるほどに高い。さらに、オリゴマーが5−(4−ニトロフェニル)
−1H−テトラゾールで汚染されることが観察された。 4.報告されたp−RNAのオリゴヌクレオチドの仕上げ、特に塩基に不安定な
保護基のヒドラジン溶液での除去は、オリゴマー中に高チミジン画分があると必
ずしも可能ではない。発明の開示 それ故に、本発明の目的は、既知及び新規のペントピラノシルヌクレオシドの
製造を既知の方法より大規模に行うのを可能にし、上述の不利を回避するペント
ピラノシルヌクレオシドの新規な製造法を用いうるようにすることである。それ
故に、本発明の課題は、未保護ペントピラノシドから出発して、(a)第1の工
程で、ペントピラノシドの2′,3′又は4′−位を先ず保護し、(b)第2の
工程で、残りの2′,3′又は4′−位の他の位置を保護することを特徴とする
ペントピラノシルヌクレオシドの製造方法である。好ましい態様では、次の式(
I)及び(II)のものについてである。 式(I)
はClである)、NR5R6、OR7、SR8、=O、CnH2n+1(ここでnは1− 12、好ましくは1−8、特に1−4の整数である)、β−脱離性基(β−el
iminable group)、好ましくは式−OCH2CH2R18(ここでR 18 はシアノ基、p−ニトロフェニル基、フルオレニルメチルオキシカルボニル(
Fmoc)基である)、又は(CnH2n)NR10R11[ここでR10R11はH、Cn H2n+1であるか又は式
又は異なって、H、OR7(ここでR7は上記の意味をもつ)、又はCnH2n+1又 はCnH2n-1(ここでnは上記の意味をもつ)である〕の基を介して結合されて いる]であって、かつR5,R6,R7,R8はそれぞれ、互いに独立して、同一で
あるか又は異なって、H、CnH2n+1又はCnH2n-1(ここでnは上記の意味をも
つ)、又は−C(O)R9(ここでR9は直鎖状又は分枝状の、場合により置換さ
れたアルキル又はアリール基、好ましくはフェニル基である)であり、X,Y,
Zはそれぞれ、互いに独立して、同一であるか又は異なって、=N−、=C(R 16 )−又は−N(R17)−(ここでR16及びR17はそれぞれ、互いに独立して、
同一であるか又は異なって、H、又は上記の意味をもつCnH2n+1又は(CnH2n )NR10R11である)であり、そしてSc1及びSc2はそれぞれ、互いに独立して
、同一であるか又は異なって、H、又はアシル、トリチル又はアリルオキシカル
ボニル基、好ましくはベンゾイル又は4,4′−ジメトキシトリチル(DMT)
基から選ばれた保護基である} 式(II)
Br又はClである)、=O、CnH2n+1、CnH2n-1、β−脱離性基、好ましく
は式−OCH2CH2R18(ここでR18はシアノ基、p−ニトロフェニル基、フル
オレニルメチルオキシカルボニル(Fmoc)基である)、又は(CnH2n)N R10′R11′(ここでR10′,R11′は互いに独立して、上記のR10又はR11の
意味をもつ)であり、X′は=N−、=C(R16′)−又は−N(R17′)−(
ここでR16′及びR17′は互いに独立して上記のR16又はR17の意味をもつ)で
あり、そしてSc1′及びSc2′は上記のSc1及びSc2の意味をもつ] 本発明によるペントピラノシルヌクレオシドは一般にペントピラノシル部がD
配置(D configuration)である(しかし、L配置の場合もある
)、リボ−、アラビノ−、リキソ−及び/又はキシロピラノシルヌクレオシド、
好ましくはリボピラノシルヌクレオシドである。
ン、−2,6−ジアミノプリン、−6−プリンチオール、−ピリジン、−ピリミ
ジン、−アデノシン、−グアノシン、−イソグアノシン、−6−チオグアノシン
、−キサンチン、−ヒポキサンチン、−チミジン、−シトシン、−イソシトシン
、−インドール、−トリプタミン、−N−フタロイルトリプタミン、−ウラシル
、−カフェイン、−テオブロミン、−テオフィリン、−ベンゾトリアゾール又は
−アクリジン、特にペントピラノシルプリン、−ピリミジン、−アデノシン、−
グアノシン、−チミジン、−シトシン、−トリプタミン、−N−フタロイルトリ
プタミン又は−ウラシルである。
Aのみならずp−NAs、好ましくはpRNAsなどの、天然型で産生する核酸
又は修飾された核酸のような生体分子に共有結合しうる官能基をもつ化合物とし
て用いられるペントピラノシルヌクレオシドを包含する。これはリンカーがp−
NAs用にはまだ知られていないので驚くべきことである。
ルイミドエチル又はアリルオキシ基であるペントピラノシルヌクレオシドを包含
する。本発明による好適なリンカーは例えば好ましくはウラシルの5−位が修飾
されているウラシルベースリンカー(uracil−based linker s)、例えばN−フタロイルアミノエチルウラシルであり、またインドールベー
スリンカー、好ましくは例えばN−フタロイルトリプタミンのようなトリプタミ
ン誘導体である。
,N−ジアシルヌクレオシド、好ましくはプリン、特にアデノシン、グアノシン
又は6−チオグアノシンもまた利用しうるようになり、その核酸塩基を簡単な方
法で完全に脱保護しうる。それ故に本発明はまた、R2、R3、R4、R2′、R3 ′及び/又はR4′が式−N[C(O)R9]2の基、特にN6,N6−ジベンゾイ ル−9−(β−D−リボピラノシルアデノシンであるペントピラノシルヌクレオ
シドを包含する。
上を除いて、保護基、好ましくは塩基又は金属接触により除去しうる保護基、特
にアシル基、特に好ましくはベンゾイル基をもつ、ペントピラノシルヌクレオシ
ドを利用しうるようになる。これらの化合物は、例えば追加の精製工程のような
収率を低下させる追加の工程なしに、ペントピラノシド部位の4′−酸素原子に
さらなる保護基、好ましくは酸又は塩基に不安定な保護基、特にトリチル基、特
に好ましくはジメトキシトリチル基を直接導入するための出発物質として役立つ
。
基、好ましくは酸又は塩基に不安定な保護基、特にトリチル基、特に好ましくは
ジメトキシトリチル基をもつ、ペントピラノシルヌクレオシドを利用しうるよう
になる。これらの化合物もまた、例えば追加の精製工程のような収率を低下させ
る追加の工程なしに、例えばペントピラノシド部位の2′−酸素原子などに、さ
らなる保護基、好ましくは塩基又は金属接触により除去しうる保護基、特にアシ
ル基、特に好ましくはベンゾイル基を直接導入するための出発物質として役立つ
。
に特に有利であるいわゆるワンポット(one−pot)反応で反応させうる。
次の化合物がペントピラノシルヌクレオシドの好適例である。 A)[2′,4′−ジ−O−ベンゾイル)−β−リボピラノシル]ヌクレオシド
、特に[2′,4′−ジ−O−ベンゾイル)−β−リボピラノシル]−アデニン
、−グアニン、−シトシン、−チミジン、−ウラシル、−キサンチン又は−ヒポ
キサンチン、及びN−ベンゾイル−2′,4′−ジ−O−ベンゾイルリボピラノ
シルヌクレオシド、特に−アデニン、−グアニン又は−シトシン、及びN−イソ
ブチロイル−2′,4′−ジ−O−ベンゾイルリボピラノシルヌクレオシド、特
に−アデニン、−グアニン又は−シトシン、及びO6−(2−シアノエチル)− N2−イソブチロイル−2′,4′−ジ−O−ベンゾイルリボピラノシルヌクレ
オシド、特に−グアニン及びO6−(2−(4−ニトロフェニル)エチル)−N
2−イソブチロイル−2′,4′−ジ−O−ベンゾイルリボピラノシルヌクレオ
シド、特に−グアニン。 B)β−リボピラノシルヌクレオシド、β−リボピラノシルアデニン、−グアニ
ン、−シトシン、−チミジン、−ウラシル、−キサンチン又は−ヒポキサンチン
、及びN−ベンゾイル−、N−イソブチロイル、 O6−(2−シアノエチル)−
又はO6−(2−(4−ニトロフェニル)エチル)−N2−イソブチロイル−β−
リボピラノシルヌクレオシド。 C)4′−DMT−ペントピラノシルヌクレオシド、好ましくは4′−DMT−
リボピラノシルヌクレオシド、特に4′−DMT−リボピラノシルアデニン、−
グアニン、−シトシン、−チミジン、−ウラシル、−キサンチン又は−ヒポキサ
ンチン、及びN−ベンゾイル−4′− DMT−リボピラノシルヌクレオシド、 特にN−ベンゾイル−4′− DMT−リボピラノシルアデニン、−グアニン又 は−シトシン、及びN−イソブチロイル−4′− DMT−リボピラノシルヌク レオシド、特にN−イソブチロイル−4′− DMT−リボピラノシルアデニン 、−グアニン又は−シトシン、及びO6−(2−シアノエチル)− N2−イソブ チロイル−4′− DMT−リボピラノシルヌクレオシド、特にO6−(2−シア
ノエチル)− N2−イソブチロイル−4′− DMT−リボピラノシルグアニン 、及びO6−(2−(4−ニトロフェニル)エチル)−N2−イソブチロイル−4
′− DMT−リボピラノシルヌクレオシド、特にO6−(2−(4−ニトロフェ
ニル)エチル)−N2−イソブチロイル−4′− DMT−リボピラノシルグアニ
ン。 D)β−リボピラノシル−N,N′−ジベンゾイルアデノシン又はβ−リボピラ
ノシル−N,N′−ジベンゾイルグアノシン。
は4′− DMT−リボピラノシルヌクレオシド−2′−ホスフィタミド/−H −ホスホネート、特に4′− DMT−リボピラノシルアデニン−、−グアニン −、−シトシン−、−チミジン−、−キサンチン−、−ヒポキサンチン−又は−
ウラシル−2′−ホスフィタミド/−H−ホスホネート、及びN−ベンゾイル−
4′− DMT−リボピラノシルアデニン−、−グアニン−又は−シトシン−2 ′−ホスフィタミド/−H−ホスホネート、及びN−イソブチロイル−4′− DMT−リボピラノシルアデニン−、−グアニン−又は−シトシン−2′−ホス
フィタミド/−H−ホスホネート、及びO6−(2−シアノエチル)−4′− D
MT−リボピラノシルグアニン−、−キサンチン−又は−ヒポキサンチン−2′
−ホスフィタミド/−H−ホスホネート、又は O6−(2−(4−ニトロフェニ
ル)エチル)−N2−イソブチロイル−4′− DMT−リボピラノシル−グアニ
ンであり、そして固体担体ヘのカップリング用には、例えば4′− DMT−ペ ントピラノシルヌクレオシド−2′−スクシネート、好ましくは4′− DMT −リボピラノシルヌクレオシド−2′−スクシネート、特に4′− DMT−リ ボピラノシルアデニン−、−グアニン−、−シトシン−、−チミジン−、−キサ
ンチン−、−ヒポキサンチン−又は−ウラシル−2′−スクシネート、及びN−
ベンゾイル−4′− DMT−リボピラノシルアデニン−、−グアニン−又は− シトシン−2′−スクシネート、及びN−イソブチロイル−4′− DMT−リ ボピラノシルアデニン−、−グアニン−又は−シトシン−2′−スクシネート、
及びO−(2−シアノエチル)−4′− DMT−リボピラノシルグアニン−2 ′−スクシネート、及びO6−(2−(4−ニトロフェニル)エチル)−N2−イ
ソブチロイル−4′− DMT−リボピラノシルグアニン−2′−スクシネート である。
ことに多数の天然及び合成の核酸塩基を用いて成功裡に行われる。さらに、特に
驚くべきことには本発明による方法は文献から知られた方法に比べて高収率で平
均60%の時間節約を伴って行われ、特に工業的適用に有利である。その上に、
本発明による方法を用いると、文献に記載された方法に必要な精製工程、例えば
クロマトグラフィーによる中間精製処理を要さず、反応が著しく空時収率を高め
るいわゆるワンポット反応として行われる場合もある。
の転移が一般的には塩基の存在下に行われ、特にN−エチルジイソプロピルアミ
ン及び/又はトリエチルアミンの存在下に行われる。本発明に従い、この反応は
特に有利にはワンポット反応として同じ反応容器で行われる。
塩基に不安定であるか、又は金属接触で除去されうる保護基Sc1、Sc2、 Sc1 ′又はSc2′によって保護され、保護基Sc1及び Sc1′は保護基Sc2及びSc2 ′とは異なっているのが好ましい。一般に、上記保護基はアシル基、好ましくは
アセチル、ベンゾイル、ニトロベンゾイル及び/又はメトキシベンゾイル基、ト
リチル基、好ましくは4,4′−ジメトキシトリチル(DMT)基又はβ−除去
しうる基、好ましくは式OCH2CH2R18(ここで、R18はシアノ基、p−ニト
ロフェニル基又はフルオレニルメチルオキシカルボニル(Fmoc)基である)
の基である。
触で除去されうる保護基、好ましくはアシル基、特にアセチル、ベンゾイル、ニ
トロベンゾイル及び/又はメトキシベンゾイル基で保護され、及び/又は4′−
位が、酸又は塩基に不安定である保護基、好ましくはトリチル基及び/又はFm
oc基、特にDMT基で保護されている。
又はケタールのようなアセタール保護基なしに処置し、追加のクロマトグラフィ
ーによる中間精製処理を回避し、従って反応を驚異的に高い空時収率でワンポッ
ト反応として行わせるものである。
に導入しうるからである。こうして、例えば、ベンゾイル基の導入は低温でピリ
ジン又はピリジン/メチレンクロリド中でベンゾイルクロリドと反応させること
により行われる。DMT基は例えば、塩基例えばN−エチルジイソプロピルアミ
ン(Hunigの塩基)及び例えばピリジン、メチレンクロリド又はピリジン/
メチレンクロリド混合物の存在下にDMTClと反応させることにより導入され
る。
反応生成物をクロマトグラフィーで精製するのもまた有利である。トリチル化後
の精製は本発明方法によれば必要ではなく、それが特に有利なことである。
と反応させ、(b)工程(a)からの生成物のリボピラノシル部位から保護基を
除去し、そして(c)工程(b)からの生成物をより詳細に上記した方法に従い
反応させる、リボピラノシルヌクレオシドの製造法である。
を回避するために、アノマー性からして純粋な(anomerically p
ure)保護されたペントピラノース、例えばテトラベンゾイルペントピラノー
ス、好ましくはβ−テトラベンゾイルリボピラノースを用いるのが唯一有利であ
る(R.Jeanloz,J.Am.Chem.Soc.1948,70,40
52)。
り、Halは塩素又は臭素である)である式(II)の化合物を、好ましくはD
MF中でアジドと反応させ、次いで、 (b)(a)からの反応生成物を好ましくは例えばピリジン中でトリフェニルホ
スフィンと反応させ、次いで、 (c)(b)からの反応生成物を適当なフタルイミド、例えばN−エトキシカル
ボニルフタルイミドと反応させ、そして、 (d)(c)からの反応生成物を適当な保護されたピラノース、例えばリボース
テトラベンゾエートと反応させ、そして最後に、 (e)保護基を、例えばメチレート(methylate)で除去し、そして、 (f)さらなる工程を既に上記したように実施することにより製造される。
故に特にごく少量の物質の検出を問題とするナノ技術への応用に好適である。例
えば、インドール−1−リボシド(indole−1−riboside)は既
に「N.N.SUvorovら,Biol.Aktivn.Soedin.,A
kad.Nauk SSSR 1965,60」及び「テトラヘドロン 1967 ,23,4653」に報告されている。しかし、3−置換誘導体を製造する類似
の方法はない。一般に、これらの製造は、未保護糖成分のアミナール(amin
al)及びインドリンの生成を経て行われ、次いでこれを酸化によりインドール
−1−リボシドへ転化する。例えば、インドール−1−グルコシド及び−1−ア
ラビノシドが報告され(Y.V.Dobriyninら,Khim.−Farm
Zh.1978,12,33)、その3−置換誘導体は通常フィールスマイヤ ー反応により製造された。しかし、インドールの3−位へのアミノエチル単位の
導入のためのこのルートは、工業的応用にはあまりにも複雑である。
て、同一であるか又は異なって、=C(R16)(ここでR16はH又はCnH2nで ある)、Zは=C(R16)−(ここでR16は(CnH2n)NR10R11である)で ある]によるリンカーは、それ故に有利には次の工程: (a)適当なインドリン、例えばN−フタロイルトリプタミンをピラノース、例
えばD−リボースと反応させてヌクレオシドトリオールを生成させ、次いで、 (b)(a)からの生成物のピラノシル部位のヒドロキシル基を好ましくはアシ
ル基、例えば無水酢酸で保護し、次いで、 (c)(b)からの生成物を、例えば2,3−ジクロロ−5,6−ジシアノパラ
キノンで酸化し、そして、 (d)(c)からの生成物のピラノシル部位のヒドロキシル保護基を、例えばメ
チレートで除去し、そして最後に、 (e)さらなる工程を既に上記したように行う工程により製造される。
フラノース及び2′−デオキシリボフラノース又は2′−デオキシリボピラノー
スの場合にも用いられ、これは特に有利である。用いられた糖のヌクレオシド化
パートナー(nucleosidation partner)は好ましくはト リプタミン、特にトリプタミンのN−アシル誘導体、とりわけN−フタロイルト
リプタミンである。
ルヌクレオシドはさらなる工程でホスフィチル化され、あるいは固相に結合され
る。
ジイソプロピルアミンのような塩基の存在下にモノアリル N−ジイソプロピル クロロホスホルアミダイトにより、あるいは三塩化リン及びイミダゾール又はテ
トラゾールでの処理及び引き続いての塩基の添加での加水分解により行われる。
生成物は、第1の場合にはホスホルアミダイトであり、第2の場合にはH−ホス
ホネートである。本発明による保護されたペントピラノシルヌクレオシドの固相
、例えば「長鎖アルキルアミノ制御の多孔質ガラス」(CPG,Sigma C hemie,Munich)への結合は、例えばEschenmoserら(1
993)に記載されているように行われる。
シルヌクレオシドにより伸長させ、次いで、例えば水性ヨウ素溶液で酸化し、そ
して、 (c)所望のペントピラノシル核酸が発現するまで、工程(b)を同一又は異な
るホスフィチル化3′−,4′−保護ペントピラノシルヌクレオシドを用いて繰
り返す工程によってペントピラノシル核酸を製造する方法である。
性化剤は、カップリング試薬としての5−(4−ニトロフェニル)−1H−テト
ラゾールに対比し、カップリング試薬ライン(lines)の阻害や生成物の汚
染を全く起こさないので、ホスホルアミダイトを好ましくはアセトニトリル中で
再結晶化及びアセトニトリルに溶解後に用いるときにカップリング試薬として好
適である。
ホニルクロリド、ジフェニルクロロホスホネート、ピバロイルクロリド又はアダ
マントイルクロリドが特に好適である。
基除去のヒドラジン分解に対し、ピリミジン塩基特にウラシル及びチミンを、オ
リゴヌクレオチドを破壊する開環から保護するには、塩化ナトリウムのような塩
の添加によるのが有利である。アリルオキシ基は好ましくは、例えばヒドラジン
分解の前に、パラジウム[Pd(0)]錯体で除去される。
アデノシン、グアノシン、シチジン、チミジン及び/又はウラシルもまた、工程
(a)及び/又は工程(b)に併合され、それは、例えば混合p−NA−DNA
又はp−NA−RNAへ導かれる。
、特にFmoc及び/又はDMTから選ばれた保護基であり、Sc5及びSc6はそ
れぞれ、互いに独立して、同一であるか又は異なって、アリルオキシ及び/又は
ジイソプロピルアミノ基であり、nは既に上記した意味を有する)のアリルオキ
シリンカーが併合される。
ンカーが合成され、それは活性化しうるリン化合物とともに酸に不安定な保護基
を担持し、それ故に自動オリゴヌクレオチド合成に容易に用いられる(参照、例
えばP.S.Nelsonら,Nucleic acid Res.1989,1
7,7179;L.J.Arnoldら,WO8902439)。本発明の範囲
はリジンベースリンカーで拡張され、それではリン原子上での常用のシアノエチ
ル基に代えて、アリルオキシ基が導入され、それはそれ故にNoyoriオリゴ
ヌクレオチド法( R.Noyori,J.Am.Chem.Soc.1990 ,112,1691−6 )で有利に用いられる。
であるDNAs及びRNAsとは対合しない。この性質はp−NAsを好適な対
系(pairing systems)にする。
valent)相互作用の超分子系であり、それは選択性、安定性及び可逆性に
より特徴づけられ、その性質は好ましくは動力学的に、例えば温度、pH及び濃
度により影響される。このような対系はまた、例えば異なる金属クラスター(c
luster)を一緒にして潜在的に新規な性質を有するクラスター会合(as
sociates)を形成させるための「分子接着剤」としての選択的な性質を
考慮して用いられる[参照、例えばR.L.Letsingerら,Natur
e,1996,382,607−9;P.G.Schultzら, Natur e,1996,382,609−11 ]。従って、 p−NAsはまた、強力に
かつ熱力学的に制御しうる対系を形成するので、ナノ技術分野、例えば新規物質
、診断剤、治療剤及びまたマイクロエレクトロニクス、光学又はオプトエレクト
ロニクスの構成要素(components)の製造に用いて、また分子種(m
olecular species)を集めるのを制御してタンパク組立(as srmblies)の(組合せ)合成用などの超分子単位を形成させるのに用い
て好適である[参照、例えば、A.Lombardi,J.W.Bryson,
W.F.DeGrado,Biomolekuls(Pept.Sci.)19
97,40,495−504]。それ故に、更なる応用は特に、天然核酸をそこ
なわないp−NAコードをもつタンパクやDNA/RNA切片(section
s)などの、機能的好ましくは生物学的単位を提供しうるために、診断及び医薬
分野において生じる(参照、例えばWO93/20242)。
はRNA の双方が核酸塩基の相補的配列の結果として水素架橋の形成によって 互いに結合しうる部分を含有している場合に、他の生体分子との非共有結合のた
めに用いられる。このタイプの生体分子は、例えば信号増幅ののための分析シス
テムにおいて用いられ、それでは配列が分析されるDNA分子が一方では非共有
DNAリンカーのような手段で固体担体に固定され、他方では信号増幅しうる分
岐鎖DNA分子(bDNA)に結合されている(参照、例えばS.Urdea,
Biol/Technol.1994,12,926又は米国特許第56248
02号)。最後に記載したシステムの本質的欠点はこれまでのところポリメラー
ゼ連鎖反応(PCR)による核酸分析法に対する感度に関してである(K.Mu
llis,Methods Enzymol.1987,155,335)。こ れは、中でも、分析されるDNA分子の非共有結合と同様に分析される、DNA
分子への固体担体の非共有結合が、特には必ずしも起こらないという事実に帰せ
られ、この結果として、配列認識と非共有結合の機能の混同(mixing)が
生じる。DNA又はRNA対合法(pairing process)に介入し ない直交対系(orthogonal pairing system)としての
p−NAsの使用は、この問題を有利に解決し、その結果として上記分析法の感
度を顕著に増大しうる。
トピラノシル核酸は、例えば生体分子との結合状態のような複合体の形態で、治
療的、診断的及び/又は電子的構成要素のような医薬の製造に好適である。
分子、好ましくはペプチド、タンパク又は核酸の共有結合ハイブリッド、例えば
抗体又はその機能部、天然型で産するDNA及び/又はRNAである。抗体の機
能部は、例えばFv断片(Skerra&Pluckthun(1988)Sc
ience240,1038)、単鎖Fv断片(scFv;Birdら,(19
88)Science242,423;Hustonら、(1988)Proc
.Natl.Acad.Sci.米国85,5879)又はFab断片(Bet
terら、(1988) Science240,1041)である。
ある。
である。
含有するので、配列認識及び非共有結合の機能が分子で実現されねばならないと
きに好ましくは用いられる。
processes)ともに複合体の製造に好適である。
カップリングプロトコルの再調整後に直接行った後、さらにDNAオリゴヌクレ
オチドが合成される。この方法はまた逆の順序でも行われる。
例えばチオールリンカーを有するDNAオリゴマーが別の操作で合成される。次
いで、好ましくは、文献から知られたプロトコルに従い、p−RNAオリゴマー
のヨードアセチル化及び2つの単位のカップリングが行われる(T.Zhuら,
Bioconjug.chem.1994,5,312)。
味するものとして理解される。アレイは特に分析及び診断において分析物の同時
決定に重要な役割を果たす、固定された認識種(recognition sp ecies)の配列である。例としてペプチドアレイ(Fodorら,Natu
re1993,364,555)や核酸アレイ(Southernら ,Gen omics1992,13,1008;Heller,米国特許第563295
7号)がある。これらのアレイの高いフレキシビリティーは、認識種をコードし
うるオリゴヌクレオチドに、そして結合された相補鎖(complementa
ry strands)を固体担体上のある箇所に結合させることによって達成 されうる。コード認識種をアンチコード(anti−coded)固体担体に適
用し、ハイブリッド形成条件を調整することにより、認識種は所望の位置に非共
有結合される。結果として、種々のタイプの認識種、例えばDNA切片(sec
tions)、抗体がハイブリッド形成条件を利用して固体担体上に同時に配列
されうる(図3参照)。しかし、このためにまず必要なものとして、コード切片
をできるだけ短くし、天然核酸p−NAs、好ましくはp−RNAsをそこなわ
ないために極めて強力で選択的であるコドン及びアンチコドンがあり、これらは
このために特に有利に好適である。
ップ状物質を意味するものとして理解される。好適な担体材料は、例えばセラミ
ック、金属特に貴金属、ガラス、プラスチック、結晶性物質又は、上記材料の中
でも特に担体の薄層であり、また、セルロースや構造タンパクのような(生体)
分子フィラメントである。
ンパク、特に抗体又は抗体の機能部位をコードするためのペントピラノシル核酸
、好ましくはリボピラノシル核酸の利用に関する。これらは次いで図4による固
体担体上で適当なコドンでハイブリッド形成される。このようにして、新規で診
断的に有用なアレイを、常に新規な認識種の組合せを用いハイブリッド形成条件
を調整することによってのみアレイ形態でコドンを具備させた固体担体の所望位
置に常に組み込める。次いで、分析物、例えば血漿などの生物学的試料が適用さ
れると、検出される種はあるパターンでアレイに結合され、次いで間接的に(例
えば認識種の蛍光標識により)又は直接的に(例えばコドンの結合点でのインピ
ーダンス測定により)記録される。次いで、ハイブリッド形成はコドンを有する 担体のみが再び残るように適当な条件(温度、塩、溶媒、電気泳動法)で解除さ
れる。これは次いで再び他の認識種で装荷され、例えば他の試料の決定用の同じ
分析物に対して用いられる。アレイフォーマットでの認識種の常に新規な配列及
び対系としてのp−NAsの使用は他のシステム、例えばWO96/13522
と比べ特に有利である。
ドからなる診断薬又は既により詳細に上記した本発明による複合体に関する。以
下の実施例及び図面は本発明をより詳細にそれを制限することなく述べることを
意図したものである。実施例 実施例1 1−{3′−O−ベンゾイル−4′−O−[(4,4′−ジメトキシトリフェニ
ル)メチル]−β−D−リボピラノシル}チミンの合成 最初の4′−置換、次いでの2′−置換、次いでの転移(migration)
反応:
ルゴン雰囲気下に無水ピリジン620mlに溶解し、N−エチルジイソプロピル
アミン71.4ml(2.1当量(eq.))及びモレキュラーシーブ(4Å) 100gを加え、混合物をKPG攪拌器を用い15分間攪拌した。ジメトキシト
リチルクロリド(DMTCl)92g(272ミリモル;1.36当量)をクロ
ロホルム(固体NaHCO3から新たに蒸留されたもの)280mlに溶解し、
この溶液をトリオール溶液に−6ないし−5℃で30分かけて滴下した。これをこの
温度で1時間、次いで室温で一夜攪拌し、再度冷却し、さらにクロロホルム70 ml中のDMTCl25g(74ミリモル;0.37当量)を加えた。混合物を
室温にならしめ4時間攪拌した。1−{4′−O−[(4,4′−ジメトキシト リフェニル)メチル]−β−D−リボピラノシル}チミンの分析データを得るた
めに、少量の試料をとり、水性仕上げ処理(work−up)にかけ、クロマト
グラフィーに付した。
ミリモル;0.1当量)で処理し、−6℃に冷却し、ピリジン30ml中のベン
ゾイルクロリド(BzCl)27.9ml(0.24モル;1.2当量)を−6 ℃から−1℃の間で15分かけて滴下し、混合物を10分間攪拌した。反応を完
結させるために、さらにBzCl2.8ml(24ミリモル;0.12当量)を
冷却しながら25分間隔で各場合に加え混合物を最後に20分間攪拌した。 次いで無水ピリジン460ml、n−プロパノール841ml(11.2モル;
56当量)、p−ニトロフェノール44g(0.316モル;1.58当量)、
DMAP21.7g(0.18モル;0.9当量)及びN−エチルジイソプロピ
ルアミン136ml(0.8モル;4当量)を室温で加え、混合物を61−63
℃で48時間攪拌した。
た。残渣を酢酸エチル2リットルにとり、モレキュラーシーブをろ別し、有機相
を3回各回水1リットルで抽出し、10%濃度のクエン酸1.2リットルと攪拌 して1回抽出し、有機相を再度分別し、水1リットルで一回抽出し、飽和NaH
CO溶液1リットルで最後に抽出した。有機相を硫酸ナトリウムを用い乾燥し、
ろ過し、濃縮した(残渣220g)。
プグラジエント(step gradient)を用いてシリカゲル60(20 ×10cm)でろ過し、次いでシリカゲル60でのクロマトグラフィー(30×
10cm;ジクロロメタン/酢酸エチル(1:0−1:1)のステップグラジエ
ント)に付した。 以下のものが得られた。 非極性画分40g 1−{3′−O−ベンゾイル−4′−O−[(4,4′−ジメトキシトリフェニ
ル)メチル]−β−D−リボピラノシル}チミンB52.9g 不純な化合物B34.5g 極性画分3.4g 不純画分を再度クロマトグラフィーに付し(SG60,45×10cm;ジク
ロロメタン/酢酸エチル,3:1)、さらに化合物B11.3gを得た。全収量
:化合物B64.2g(97ミリモル)、すなわち収率48%。1H−NMRは
一致する。実施例2 N4−ベンゾイル−1−{3′−O−ベンゾイル−4′−O−[(4,4′−ジ
メトキシトリフェニル)メチル]−β−D−リボピラノシル}シトシンの合成 最初の2′−置換、次いでの4′−置換、次いでの転移反応:
ノシル)シトシン1をジメチルホルムアミド(DMF)830ml及びピリジン
1.5リットル(両溶媒は乾燥してモレキュラーシーブ3Åで保存)に124℃
に加温しながら溶解した。ピリジン210mlに溶解したBzCl23.0g(
0.163モル;1.05当量)を−58℃ないし−63℃で3.5時間かけて
滴下した。このバッチを冷却浴中で一夜攪拌し、n−プロパノール90.3g(
1.5モル;10当量)を攪拌しながら混入しバッチを高真空で40℃で濃縮し
た。ピリジン残渣をトルエン150mlを2回加えることにより除去し、再度濃
縮した。残渣124.3gをCH2Cl2500mlに溶解し、各回半濃縮Na
HCO3溶液300mlと攪拌することにより2回抽出し、沈でんした固体をろ
別し乾燥した。残渣は60.7gであった。 CH2Cl2相を濃縮した:25 .0g。グラジエント(gradients)(AcOEt/イソヘキサン,4
:1、次いで無水AcOEt、次いでAcOEt/MeOH,19:1−2:1
)を用いたシリカゲル60(40×10cm)での分離クロマトグラフィーによ
り、次のものを得た(TLC(シリカゲル,AcOEt)): 2′、4′ジベンゾエート16.8g(24%)Rf0.5 12.4gの化合物1(23%)Rf0.0 35.4gの化合物2(51%)Rf0.14 N4−ベンゾイル−1−{3′−O−ベンゾイル−4′−O−[(4,4′−ジ メトキシトリフェニル)メチル]−β−D−リボピラノシル}シトシン3 35.4g(78ミリモル)の化合物2をCH2Cl2390ml及びピリジ
ン180ml(両者無水)、DMAP0.94g(7.8ミリモル;0.1当量
)、N−エチルジイプロピルアミン34.6ml(203ミリモル;2.6当量
)及びDMTCl33.1g(98ミリモル;1.25当量)を加え、混合物を
室温で2時間攪拌した。 TLC(シリカゲル,AcOEt):Rf0.6 CH2Cl2を30℃でストリッピング(留去)し、残渣をピリジン640ml、
DMAP9.37g(78ミリモル;1.0当量)、Et3N32.5ml(2 34ミリモル;3.0当量)、p−ニトロフェノール21.7g(156ミリモ
ル;2.0当量)及びn−プロパノール93.8g(1.56ミリモル;20当
量)で処理し、65℃で42時間攪拌した。このバッチを高真空で50℃で濃縮
し、各回トルエン250mlで2回処理し、濃縮した。残渣をCH2Cl21リッ
トルにとり、各回希釈NaHCO3溶液500mlと攪拌することにより3回抽 出し、有機相をNa2SO4を用いて乾燥し濃縮した:残渣92.5g。グラジエ
ント(メチルt−ブチルエーテル/イソヘキサン2:1−4:1、次いでメチル
t−ブチルエーテル/AcOEt,1:4、次いでAcOEt/MeOH,1:
1−1:3)を用いたシリカゲル60(50×10cm)でのクロマトグラフィ
ーにより、生成物含有画分を得た。該画分をCH2Cl2/メチルt−ブチルエー
テル(1:5)540mlから再結晶した。晶析物を再度CH2Cl2/メチル
t−ブチルエーテル(1:1)300mlから再結晶した。 3:TLC(シリカゲル,CHCl3/i−PrOH49:1):Rf0.14 次のものを得た: N4−ベンゾイル−1−{3′−O−ベンゾイル−4′−O −[(4,4′−ジメトキシトリフェニル)メチル]−β−D−リボピラノシル
}シトシン330gすなわち化合物2に基づく収率51%。1H−NMRは一致 する。実施例3 N6−ベンゾイル−9−{3′−O−ベンゾイル−4′−O−[(4,4′−ジ メトキシトリフェニル)メチル]−β−D−リボピラノシル}アデニンの合成 最初の2′−置換、次いでの4′−置換、次いでの転移反応
88%)の化合物2。 TLC(シリカゲル,AcOEt/MeOH2:1):Rf0.23
00mlに懸濁させ−4℃ないし−10℃に冷却した。トリメチルクロロシラン
40ml(199ミリモル;5当量)を20分かけて滴下し、混合物を冷却しな
がら2.5時間攪拌した。ピリジン73mlに溶解したベンゾイルクロリド36
.5ml(199ミリモル;5当量)を25分かけて−10ないし−15℃で加
え、冷却しながら10分間、そして室温で2時間攪拌した。(TLCチェック(
シリカゲル,AcOEt/ヘプタン1:1):Rf0.5)。混合物を再度−1
0℃に冷却し、水(温度最大+8℃)136mlを混入させ、混合物を室温で一
夜攪拌した。転化が完了した後、溶媒を留去し残渣を各回トルエン200mlに
2回とり再度蒸発させた。混合物を各500mlのエーテル及び水で処理し、2
時間機械的に攪拌し、両相にごくわずか溶解する生成物をろ別し、エーテル及び
水で洗浄し、高真空でP2O5で乾燥した:23.8g(80%)の化合物3。 TLC(シリカゲル,AcOEt/MeOH9:1):Rf0.35
ル}アデニン4: 26.4g(55.5ミリモル)の化合物3を窒素雰囲気下に無水CH2Cl2 550ml及びピリジン55ml(各場合ともモレキュラーシーブに貯蔵)に溶
解し、DMAP0.73g(5.55ミリモル;0.1当量)で処理し、−87
ないし−90℃に冷却した。ピリジン14ml中のBzCl8.58g(61ミ
リモル;1.1当量)を1時間かけて滴下し、混合物を60時間(週末)にわた
り−78℃で放置した。バッチを濃縮し、各回トルエン100mlで2回処理し
、ピリジンを除去するために蒸発させた。グラジエント(AcOEt/ヘプタン
,1:1−9:1)を用いたシリカゲル60(20×10cm)でのクロマトグ
ラフィーにより、23.2gの化合物4を得た。 化合物4:TLC(シリカゲル,AcOEt):Rf0.34 N6−ベンゾイル−9−{3′−O−ベンゾイル−4′−O−[(4,4′−ジ メトキシトリフェニル)メチル]−β−D−リボピラノシル}アデニン5 23.2g(40ミリモル)の化合物4を無水CH2Cl2160mlに溶解
し、次いでDMTCl14.9g(56ミリモル;1.1当量)及びN−エチル
ジイソプロピルアミン17.7ml(104ミリモル;2.6当量)で処理した
。室温で2時間攪拌した後、さらにDMTCl4.0g(11.8ミリモル;0
.3当量)を加え、混合物をさらに40分間攪拌した。バッチを350−520
ミリバール及び35℃でロタベイパー(Rotavapor)中で濃縮した。 TLC(シリカゲル,AcOEt/ヘプタン1:1):Rf0.18 残渣を無水ピリジン260mlに溶解し、次いでn−プロパノール51ml(
679ミリモル;17当量)、Et3N16.6ml(120ミリモル;3当量 )、p−ニトロフェノール11.1g(80ミリモル;2当量)、DMAP5.
3g(44ミリモル;1.1当量)で処理し、60−63℃で23時間攪拌した
。次いで、バッチを21時間室温のままとした。反応混合物をロタベイパーで濃
縮した。残渣を各回トルエン200mlで2回処理し、濃縮し、CH2Cl2に
溶解し、水で3回抽出した。グラジエント(AcOEt/ヘプタン,1:2−1
:0;次いでAcOEt/MeOH1:0−9:1)を用いたシリカゲル60(
30×10cm)でのクロマトグラフィーにより、13gの化合物5を得た。 化合物5:TLC(シリカゲル,AcOEt/ヘプタン4:1):Rf0.2 次のものを得た:13gのN6−ベンゾイル−9−{3′−O−ベンゾイル−4 ′−O−[(4,4′−ジメトキシトリフェニル)メチル]−β−D−リボピラ
ノシル}アデニン5 すなわち化合物3に基づく収率30%。1H−NMRは一致する。文献から知ら れた方法と比べた時間節約:50%実施例4 9−[3′−O −ベンゾイル−4′−O−[(4,4′−ジメトキシトリフェ ニル)メチル]−β−D−リボピラノシル}−2−O−アリル−2−N−イソブ
チロイルグアニンの合成 最初の3′−置換、次いでの4′−置換:
溶解した。溶液をトリメチルオルトベンゾエート0.52ml(3.0ミリモル
)及びカンファースルホン酸58mg(0.25ミリモル)で処理し、室温で1
5時間攪拌した。次いで、混合物を0℃に冷却し、0℃に予備冷却された、アセ
トニトリル、水及びトリフルオロ酢酸の混合物(50:5:1)2mlで処理し
た。混合物を10分間攪拌し溶媒を真空留去した。残渣を、ジクロロメタン/メ
タノール(100:3)を用いてシリカゲル(2.3×21cm)でのフラッシ
ュクロマトグラフィーで精製し、4−O −ベンゾイル化合物25mg(5%) 、混合画分139mg(28%)及び所望の3−O −ベンゾイル化合物B20 5mg(41%)を得た。
チロイルグアニンC ジオールB101mg(0.2ミリモル)を乾燥ジクロロメタン3.2mlに
懸濁させた。懸濁液をN−エチルジイソプロピルアミン171μl(1.0ミリ
モル)、ピリジン320μl(3.96ミリモル)及びDMTCl102mg(
0.3ミリモル)で処理し、室温で攪拌した。24時間後、さらにDMTCl1
02mg(0.3ミリモル)を加え、混合物を再度24時間攪拌した。次いで、
それをジクロロメタン30mlで希釈した。溶液を10%濃度クエン酸水溶液2
0ml及び飽和重炭酸ナトリウム溶液10mlで洗浄し、MgSO4で乾燥し、 真空濃縮した。残渣を、ジクロロメタン/メタノール(100:1)を用いてシ
リカゲル(2.3×20cm)でのフラッシュクロマトグラフィーで精製し、既
知の所望生成物C39mg(24%)を得た。実施例5 p−RNAリンカー系(linker systems)の合成 官能単位の結合のために用いられるアミノ末端を有するリンカー(linke
r)の用意を可能にする3つの方法を下記に示す。 5.1ウラシルベースリンカー ウラシルの5位の変性に基づいての方法 ヒドロキシエチルウラシル28は既知の方法(J.D.Fissekis,A
.Myles,G.B.Brown,J.Org.Chem.1964,29,
2670)に従って大規模に製造することができる。γ−ブチロラクトン25を
ギ酸メチルでホルミル化し、ナトリウム塩26を反応させて尿素誘導体27を生
成させ、これを環化させてヒドロキシエチルウラシル28を得た(スキーム4)
。
シル化し、化合物29を得た(J.D.Fissekis,F.Sweet,J
.Org.Chem.1973,38,264)。
リウムを用い反応させて、アジド30を生成させ、これをピリジン中でトリフェ
ニルホスフィンで還元してアミノエチルウラシル31を得た。化合物31におけ
るアミノ基を最終的にN−エトキシカルボニルフタルイミドで保護した。リボー
ステトラベンゾエート33をN−フタロイルアミノエチルウラシル32でヌクレ
オシド化して好収率でリボーストリベンゾエート34を得た。ピラノース環のア
ノマー中心は、J=9.5HzのH−C(1′)とH−C(2′)との間のカッ
プリング(結合)定数から明らかにみられるように、β配位を有する。次いで、
ベンゾエート保護基をMeOH中でNaOMeで除去してリンカートリオール3
5を得た。化合物35をDMAPの存在下にピリジン/ジクロロメタン1:10
中で−78℃でベンゾイルクロリドと反応させた。この方法で所望の2′−ベン
ゾエート36(64%)に加え、2′,4′−ジベンゾイル化生成物(22%)
を得た。これを集め、化合物34の化合物35へのメタノーリシスに類似して再
度トリオール35へ転化した。2′−ベンゾエート36を、ジクロロメタン中で
ヒューニッヒ塩基(Hunig′s base)の存在下にジメトキシトリチル クロリドを用いて90%を超える収率で4′位でトリチル化した。4′−DMT
−2′−ベンゾエート37の4′−DMT−3′−ベンゾエート38への転移を
、n−プロパノール/ピリジン5:2中で、DMAP、p−ニトロフェノール及
びヒューニッヒ塩基の存在下に行った。クロマトグラフィー後、化合物38を得
た。4′−DMT−3′−ベンゾエート38を最終的にヒューニッヒ塩基の存在
下にClP(OAll)N(iPr)2と反応させてホスホルアミダイト39を
得た(スキーム6)。これは合成プロトコル(protocol)を変更するこ
となく自動オリゴヌクレオチド合成に用いられる。
た三ツ口フラスコ500ml中でDMF250mlに溶解し、混合物をアジ化ナ
トリウム10.8g(0.166モル)で処理した。次いで、懸濁液を60℃で
4時間攪拌した(TLCチェック,CHCl3:MeOH(9:1))。DMF を留去し、残渣を水150mlと攪拌した。固体をろ別し、水約50mlで洗浄
し、五酸化リンでデシケーター中で一夜真空で乾燥した。14.2g(71%)
の化合物30をm.p.230−235℃(分解)の無色固体の状態で得た。
備えた三ツ口フラスコ250ml中でピリジン175mlに懸濁させ、混合物を
トリフェニルホスフィン61.4g(234ミリモル)で処理した。これを60
℃で5時間加熱し、室温で一夜攪拌した(TLCチェック,CHCl3/MeO H(5:1))。懸濁液に25%濃度アンモニア溶液40mlを加え、次いで清
澄化した。溶媒を回転蒸発器(ロータリーエバポレータ)中で真空で除去した。
残渣をCH2Cl2/MeOH(1:1)200ml中で室温で30分間攪拌し、
晶析物をろ別し、CH2Cl2で洗浄し、五酸化リンでデシケーター中で真空で乾
燥したのち、m.p.214−220℃の10.0g(85%)の化合物31を
得た。
100mlに懸濁させ、Na2CO36.64g(62.6ミリモル)で処理し
た。室温で15分間攪拌した後、N−エトキシカルボニルフタルイミド14.3
g(65ミリモル)を分けて加え、混合物を室温で3時間攪拌した(TLCチェ
ック,CHCl3/MeOH(5:1))。粘性の白色懸濁液を濃塩酸を用い注
意深くpH4に調整し、白色沈殿物をろ別した。水で洗浄後、固体を五酸化リン
でデシケーター中で真空で乾燥してm.p.324−327℃の16.0g(9
1%)の化合物32を得た。
2−フタルイミドエチル)ウラシル(34)
隔膜(septum)を備えた三ツ口フラスコ250ml中でアセトニトリル1
20mlに懸濁させた。先ず、BSA12.2ml(50ミリモル)を、次いで
30分間攪拌後、さらにBSA7ml(28ミリモル)を注入器で加えた。短時
間40℃に加熱後、反応混合物を清澄化した。TMSOTf13ml(72ミリ
モル)を室温で注入器で加えた。1時間後、生成物の生成は観察されなかった(
TLCチェック,AcOEt/n−ヘプタン(1:1))。そこで、さらにTM
SOTf13ml(72ミリモル)を加えた。次いで、反応混合物を50℃に加
熱した。50℃で2.5時間攪拌後(TLCチェック)、混合物を室温に冷却し
、AcOEt250ml及び飽和NaHCO3溶液190mlの氷冷混合物に注 ぎ、10分間攪拌することにより強力に抽出した。NaHCO3溶液100ml
で再度洗浄し、水性相をAcOEt100mlで再度抽出した。希釈有機相をM
gSO4を用いて乾燥し、溶媒を回転蒸発器(ロータリーエバポレータ)中で真 空で除去した。オイルポンプ真空中で乾燥後、粗生成物20.9gを得た。シリ
カゲル(h=25cm,ψ=5cm,AcOEt/n−ヘプタン(1:1))で
のクロマトグラフィーにより、 TLC均一な発泡性生成物を得た。これをエー テルを用いて温浸した。ろ過、オイルポンプ真空中で乾燥して15g(86%)
の化合物34を得た。
2−フタルイミドエチル)ウラシル(34):
35)
500mlに溶解し、NaOMe324mg(6ミリモル)で処理し、水を排除
しながら室温で一夜攪拌した(TLCチェック,AcOEt/n−ヘプタン1:
1)。生成懸濁液にアンバーライトIR−120をpH7未満となるまで加えた
。固体を加熱下に溶解し、イオン交換体から熱時ろ別し、MeOHで洗浄した。
溶媒除去後、残渣を各回水150mlを用いて2回共蒸発させて粗生成物9gを
得た。これをMeOH90ml中で10分間還流下に加熱した。室温に冷却後、
混合物をEt2O60mlで処理し、4℃で一夜貯蔵した。これをろ過、Et2
Oで洗浄、及びオイルポンプで真空乾燥して7.8g(93%)の化合物35を
得た。
35): M.p.:137℃(シンターリング)
ミドエチル)ウラシル 5−(2−フタルイミドエチル)−1−(β−D−リボピラノシル)ウラシル
10.6g(25ミリモル)をアルゴン流下の加熱四つ口フラスコ1リットル中
でピリジン20mlに溶解し、ジクロロメタン200mlと混合した。混合物を
−70℃に冷却し、ピリジン5ml及びジクロロメタン20ml中のベンゾイル
クロリド3.82ml(33ミリモル)を冷却しながら徐々に滴下し、混合物を
−70℃で35分間攪拌した。反応混合物を冷却した塩化アンモニウム溶液60
0mlに注ぎ、水性相を酢酸エチルで抽出した。化合させた有機相を水洗、乾燥
し、真空で濃縮乾燥した。シリカゲルでのクロマトグラフィー(酢酸エチル/ヘ
プタン1:1)により1−(2′−O−ベンゾイル−β−D−リボピラノシル)
−5−(2−フタルイミドエチル)ウラシル7.9g(60%)を得た。 TLC:Rf0.24(酢酸エチル/ヘプタン4:1)
D−リボピラノシル)−5−(2−フタルイミドエチル)ウラシル 1−(2−O−ベンゾイル−β−D−リボピラノシル)−5−(2−フタルイ
ミドエチル)ウラシル5.6g(10.73ミリモル)をジクロロメタン60m
lに溶解し、4,4′−ジメトキシトリチルクロリド4.72g(13.95ミ
リモル)及びN−エチルジイソプロピルアミン2.4ml(13.95ミリモル
)で処理し、室温で20分間攪拌した。反応混合物を ジクロロメタン100m lで希釈し、炭酸水素ナトリウム溶液及び20%クエン酸溶液で洗浄し、乾燥し
、真空で濃縮乾燥した。シリカゲルでのクロマトグラフィー(酢酸エチル/ヘプ
タン(1:1)+2%トリエチルアミン)により1−(2−O−ベンゾイル−4
−O−(4,4′−ジメトキシトリチル)−β−D−リボピラノシル)−5−(
2−フタルイミドエチル)ウラシル7.7g(87%)を得た。 TLC:Rf0.53(酢酸エチル/ヘプタン(1:1)+2%トリエチルアミ
ン)
D−リボピラノシル)−5−(2−フタルイミドエチル)ウラシル 1−(2−O−ベンゾイル−4−O−(4,4′−ジメトキシトリチル)−β
−D−リボピラノシル)−5−(2−フタルイミドエチル)ウラシル3g(3.
63ミリモル)、4−ニトロフェノール1g(7.26ミリモル)、4−(ジメ
チルアミノ)ピリジン0.44g(3.63ミリモル)及びN−エチルジイソプ
ロピルアミン3.75 ml(21.78ミリモル)をイソプロパノール5.6 ml及びピリジン25mlに溶解し、65℃に加熱し、65℃で3日間攪拌した
。溶液を真空で濃縮乾燥し、残渣をジクロロメタン150mlに溶解した。20
%クエン酸溶液及び炭酸水素ナトリウム溶液で洗浄した後、溶液を硫酸マグネシ
ウムで乾燥した。シリカゲルでのクロマトグラフィー(酢酸エチル/ジクロロメ
タン/イソヘキサン2:1:1)により1−(3−O−ベンゾイル−4−O−(
4,4′−ジメトキシトリチル)−β−D−リボピラノシル)−5−(2−フタ
ルイミドエチル)ウラシル2.27g(76%)を得た。 TLC:Rf0.27(酢酸エチル/イソヘキサン(2:1)+1%トリエチル
アミン)
3′−O−ベンゾイル−4′−O−[(4,4′−ジメトキシトリフェニル)メ
チル]−β−D−リボピラノシル}−5−(2−フタルイミドエチル)ウラシル 1−(3−O−ベンゾイル−4−O−(4,4′−ジメトキシトリチル)−β
−D−リボピラノシル)−5−(2−フタルイミドエチル)ウラシル88mg(
0.11ミリモル)をジクロロメタン5mlに溶解し、N−エチルジイソプロピ
ルアミン75μl(0.44ミリモル)及びアリルオキシクロロ(ジイソプロピ
ルアミノ)ホスフィン70μl(0.3ミリモル)で処理し、室温で3時間攪拌
した。反応を完結させるためにさらにアリルオキシクロロ(ジイソプロピルアミ
ノ)ホスフィン35μl(0.15ミリモル)を加えた後、さらに室温で1時間
攪拌し、反応混合物を真空で濃縮した。シリカゲルでのクロマトグラフィー(酢
酸エチル/ヘプタン:グラジエント1:2−1:1−2:1、各場合2%トリエ
チルアミンを用いた)により1−{2′−O−[(アリルオキシ)(ジイソプロ
ピルアミノ)ホスフィノ]−3′−O−ベンゾイル−4′−O−[(4,4′−
ジメトキシトリフェニル)メチル]−β−D−リボピラノシル}−5−(2−フ
タルイミドエチル)ウラシル85g(76%)を得た。 TLC:Rf0.36(酢酸エチル/ヘプタン2:1)
,1978,2733−2735)、無水フタル酸とトリプタミンからN−フタ
ロイルトリプタミンを得た。これを(A. Giannisら,Angew.C hem.1989,101,220 に類似して)ボラン−THFで還元してイ ンドリンを得た。
て、次いで無水酢酸と反応させてトリアセテートを得た。混合物を2,3−ジク
ロロ−5,6−ジシアノパラキノンで酸化し、アセテートをナトリウムメトキシ
ドで開裂し、選択的に2′位にベンゾイル化し、選択的に4′位にDM−トリチ
ル化し、転移反応を行わせて3′−ベンゾエートを得た。ホスホルアミダイトの
生成は常法で行われた。これは合成プロトコルの変更なしに自動オリゴヌクレオ
チド合成に用いられる。操作 3−(N−フタロイル−2−アミノエチル)インドリン
Mボラン−THF溶液(2当量)354mlに溶解し、0℃に冷却した。トリフ
ルオロ酢酸354mlを(ガスの発生に注意して)0℃で徐々に滴下し、混合物
を30分間攪拌した(TLCチェック:EtOAc)。次いで水17.3mlを
加え、混合物を10分間攪拌し真空で濃縮した。残渣を10%濃度NaOH溶液
/ジクロロメタンに溶解し、有機相を分別し、Na2SO4で乾燥し、ろ過、真空
で濃縮した。残渣(50.9g)を加熱エタノール(3リットル)から再結晶し
て化合物B41.4gを得た。m.p.161−162℃。母液を真空で濃縮し
、残渣を再度エタノールから再結晶してさらに化合物B3.2gを得た。m.p
.158−159℃。全収率:44.6g(153ミリモル)の化合物Bすなわ
ち86%。
O−アセチル−β−D−リボピラノシル)インドール
ミリモル;1.0当量)を乾燥エタノール750mlに懸濁させ、窒素雰囲気下
に4時間加熱還流した(TLCチェック:CH2Cl2/MeOH10:1)。室
温に冷却後、混合物を真空で濃縮した。残渣をピリジン300mlに溶解し、氷
冷しながら無水酢酸155mlで処理した。15分後、氷浴を除去し、混合物を
室温で18時間攪拌した(TLCチェック:EtOAc/イソヘキサン1:1)
。この溶液を真空で濃縮し、各回トルエン300mlで3回共蒸発した。得られ
た油分をジクロロメタン900mlに溶解し、氷冷しながら2,3−ジクロロ−
5,6−ジシアノパラキノン38.8g(171ミリモル;1.1当量)で処理
した。15分後、氷浴を除去し、混合物を室温で1.5時間攪拌した(TLCチ
ェック:EtOAc/イソヘキサン1:1)。沈殿を吸引ろ別し、ジクロロメタ
ンで洗浄し、捨てた。ろ液を飽和NaHCO3溶液600mlで洗浄した。この 過程で析出した沈殿を再度吸引ろ別し、ジクロロメタンで洗浄し、捨てた。併せ
た有機抽出物をNa2SO4で乾燥し、真空で濃縮した。残渣(90.9g)をシ
リカゲル60でのクロマトグラフィー(10×25cm;EtOAc/イソヘキ
サン2:3)により精製した。次のものを得た:純粋な化合物B21.5g、混
合画分は46.83gでこの新たなクロマトグラフィー処理後にさらに純粋な化
合物B20.4gを得た。全収率:41.9g(76ミリモル)の化合物Bすな
わち49%。
ンドール
mlに溶解した。混合物を氷冷しながら30%濃度ナトリウムメトキシド溶液4
.0mlで処理し、次いで室温で18時間攪拌した。沈殿を吸引ろ別し、冷エタノ
ールで洗浄した。ろ液を真空で濃縮した。残渣をジクロロメタンにとり、この溶
液を飽和NaHCO3溶液で洗浄し、Na2SO4で乾燥し、真空で濃縮した。得 られた残渣を反応溶液から析出した沈殿と共に加熱エタノールから再結晶させて
化合物B22.6gを得た。融点196−198℃。母液を真空で濃縮し、残渣 を再度エタノールから再結晶してさらに化合物B9.2gを得た。m.p.18
8−194℃。全収率:25.8gの化合物B,すなわち76%。
ル−2−アミノエチル)インドール
50mlにとり、混合物をDMAP305mg(2.5ミリモル)及びピリジン
20mlで処理した。これを全てが溶液になるまで加熱し、次いで−78℃で冷
却した。ジクロロメタン8mlに溶解したベンゾイルクロリド3.35ml(2
8.8ミリモル)を15分間かけて滴下した。さらに30分後TLCチェック(
EtOAc/ヘキサン3:1)は完全な反応を示した。45分後、この冷溶液を
折り畳みフィルターを通して飽和NH4Cl溶液200mlに直接加え、ろ過残
渣をジクロロメタンで洗浄した。有機相を1回水洗し、MgSO4で乾燥し、濃
縮した。残渣をトルエンで2回共蒸発させ、EtOAc/ヘキサン3:1を用い
た10×20cmシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィーにより精製して
化合物B8.1g(64%)を得た。
ル)メチル−β−D−リボピラノシル}−3−(N−フタロイル−2−アミノエ
チル)インドール
135mlに懸濁させた。混合物を(完全に溶液になるまで)DMAP206m
g(1.68ミリモル)、N−エチルジイソプロピルアミン5.8ml(33.
7ミリモル)及びピリジン約12mlで処理した。これを34gのモレキュラー
シーブ4Åで処理し、30分間攪拌した。0℃に冷却後、DMTCl11.4g
(33.7ミリモル)で処理し、冷却浴を除去後、75分間攪拌した。次いで、
さらにDMTClを1.94g(0.34当量)、さらに40分後1.14g(
0.2当量)、及びさらに65分後1.14g(0.2当量)加えた。4.25
時間後反応は完了した。次いで混合物をn−プロパノール25.3ml(20当
量)で処理し、さらに30分間攪拌し、次いで注意深く(泡発生)濃縮した。残
渣をピリジン100 mlに溶解し、DMAP1.85g(15.1ミリモル; 0.9当量)、 N−エチルジイソプロピルアミン13.05ml(101ミリ モル;6.0当量)、n−プロパノール71 ml(940ミリモル;56当量 )及びp−ニトロフェノール3.74g(26.9ミリモル;1.6当量)で処
理した。この混合物を窒素下に75−80℃で96時間攪拌した。室温に冷却後
、混合物をセライトを通してろ過し、濃縮した。残渣を、トルエン/ジエチルエ
ーテル/トリエチルアミン90:10:1を用いてシリカゲル(9×17cm)
でのフラッシュクロマトグラフィーで精製した。生成物含有画分(9.25g)
を先ずEtOAcから再結晶させ、次いでトルエン/メタノールから再沈殿させ
て化合物B5.86g(42%)を得た。
−O−ベンゾイル−4′−O−[(4,4′−ジメトキシトリフェニル)メチル
]−β−D−リボピラノシル}−3−(N−フタロイル−2−アミノエチル)イ
ンドール (2ジアステレオマー)
ロロメタン10mlに溶解した。溶液をN−エチルジイソプロピルアミン1.0
3ml(6.0ミリモル)及びモノアリルn−ジイソプロピルクロロホスホルア
ミダイト0.63ml(2.8ミリモル)で処理し、室温で1時間攪拌した。次
いで過剰のホスホリル化試剤をイソプロパノール61μl(0.8ミリモル)を
加えて分解した。10分後、混合物を真空で濃縮し、残渣を、ヘキサン/EtO
Ac/NEt3(75:25:1)を用いてシリカゲル(3.3×21cm)で
のフラッシュクロマトグラフィーで精製した。生成物含有画分を濃縮し、CCl
4にとり、再度濃縮してほとんど無色の泡(foam)2.04g(定量的)を
得た。これはオリゴマー化に直接用いられ、数週間−20℃に保持される。 シリカゲルでのTLC(EtOAc/ヘキサン/NEt333:66:1):0
.41
,621)から知られた方法でジアゾ化及び次いでの加水分解により得た。 2−(S)−N−Fmoc−6−アミノ−1,2−ヘキサンジオール(2) LiBH43.4g(156ミリモル,4当量)をアルゴン下に無水THF(
発熱性)100mlに溶解した。約30℃に冷却後、TMSCl39.6ml(
312ミリモル,8当量)を徐々に滴下し(ガス発生)、沈殿を生成させた。6
−アミノ−2(S)−ヒドロキシヘキサン酸 (1)5.74g(39ミリモル )をアルゴン向流で分けて加え、混合物をTLC(シリカゲル;i−PrOH/
濃NH4OH/水7:2:1;ニンヒドリンで着色)がもはや出発物質を何ら示
さなくなるまで(約3時間)65℃に加熱した。混合物を氷冷しながらメタノー
ル120mlで注意深く処理した(激しいガス発生)。溶媒を真空で濃縮し、残
渣を各回メタノール200mlで3回共蒸発させ、次いで無水DMF100mに
溶解した。エチルジイソプロピルアミン16ml(93.6ミリモル,2.4当
量)を加えた後、混合物を0℃に冷却し、FmocCl12.1g(46.8ミ
リモル,1.2当量)で分けて処理した。15分後、冷浴を除去し、混合物を出
発物質が消費されるまで(約3時間;TLCチェック:シリカゲル;CHCl3
/MeOH/HOAc/水60:30:3:5)室温で攪拌した。反応溶液を飽
和NaHCO3溶液600mlに加えた。沈殿をろ別し、水200mlで洗浄し
、重量が一定になるまで(約6時間)高真空で50℃で乾燥して、無色固体13
.9gを得た。これを酢酸エチル(40ml)/n−ヘキサン(35ml)から
再結晶した。収率:9.05g(65%)
ール(3)をWO89/02439に従いDM−トリチル化した。 2−(S)−N−Fmoc−O1−DMT−O2−アリルオキシジイソプロピル
アミノ−ホスフィニル−6−アミノ−1,2−ヘキサンジオール(4) エチルジイソプロピルアミン0.51ml(3.0ミリモル、3当量)及びク
ロロ−N,N−ジイソプロピルアミノアリルオキシホスフィン0.33ml(1
.5ミリモル,1.5当量)を無水ジクロロメタン10ml中のアルコール(3
)670mg(1.02ミリモル)の溶液にアルゴン下に加えた。混合物を室温
で2時間攪拌し、溶媒を真空で留去し、得られた残渣を、3.2×16cmシリ
カゲルでのフラッシュクロマトグラフィー( EtOAc/イソヘキサン/NE t320:80:1)で精製して僅かに黄色の油分839mg(97%)を得た
。 TLC:シリカゲル;EtOAc/イソヘキサン/NEt350:50:1;U
V; Rf0.77。
quence)4′−インドールリンカー−A8−2′のp−RNAオリゴの合
成。
244mgを合成びん(synthesizer vial)に秤量し、Aユニ
ットを載置させたCPG担体28.1mgを充填したカラムとともにKOH上で
デシケータ中に高真空で3時間放置した。ホスホルアミダイトを1ml(インド
ールリンカー)又は2.5ml(Aホスホルアミダイト)のアセトニトリル中に
溶解し、数粒のモレキュラーシーブを加え、KOH上でデシケータ中に密閉放置
した。
全てが溶解した後(目視制御)、水23ml及びsym−コリジン4.6mlを
加え、溶液を一度完全に混合させた。脱トリチル化のため、ジクロロメタン中の
ジクロロ酢酸の6%濃度溶液を用いた。キャッピング試薬(無水酢酸+塩基)を
購入し、オリゴヌクレオチド合成に常法に従い用いた。
した。ほとんど無色の結晶を用い、無水アセトニトリル中の0.1M溶液をカッ
プリング試薬として調製した。合成中、この溶液を常に清浄なままにし、合成器
の管の閉塞を起こさせなかった。Eppendorf Ecosyn300+( DMT−one)での修飾された(modified)DNAカップリングサイ
クル:脱トリチル化7分、カップリング1時間、キャッピング1.5分、酸化1
分。
1.5mlに溶解し、ジエチルアンモニウム重炭酸塩20mg、トリフェニルホ
スフィン20mg及びオリゴヌクレオチドを担持するガラス担体を加え、きつく
シールし(Parafilm)、びん(vial)を室温で5時間攪拌した。次
いで、ガラス担体を分析用吸引フィルターで吸引ろ別し、ジクロロメタン、アセ
トン及び水で洗浄した。
濁させ、室温で45分間放置した。これを吸引ろ別し、水、アセトン、エタノー
ル及びジクロロメタンで洗浄した。担体を24%濃度ヒドラジン水和物溶液1.
5mlに懸濁させ、4℃で24−36時間振とうし、0.1モルのトリエチルア
ンモニウム重炭酸塩緩衝液(TEABバッファー)で 7mlに希釈した。これ をWaters Sep−Pakカートリッジでヒドラジンがなくなるまで洗浄 した。これを80%濃度ギ酸溶液5mlで処理し、30分後濃縮乾燥した。残渣
を水10mlにとり、ジクロロメタンで抽出し、水性相を濃縮し、次いでHPL
クロマトグラフィー(tR=33分,0.1Mトリエチルアンモニウム酢酸塩バ
ッファー中のアセトニトリルのグラジエント)に付した。常法の脱塩により(W
aters Sep−Pakカートリッジ)によりオリゴヌクレオチドを得た。 収率:17.6OD。物質の同一性を,ESIマススペクトロスコピー:M(C
alc.)=3082D,(M+2H)2+(found)=1541.9Dに
より証した。実施例7 複合体(conjugates)の製造 1.逐次法(sequential process) 先ず、配列(sequence)A8のp−RNAオリゴマーすなわちオクタ
マー(octamer)を実施例2に記載したようにEppendorf Ec osyn D300+上で調製し、次いで、試剤を次のとおりそれぞれ変更する :すなわち濃度2%のトリクロロ酢酸に代えて濃度6%のジクロロ酢酸を、ピリ
ジン中のヨウ素に代えてコリジン中のヨウ素を、テトラゾール溶液に代えてベン
ズイミダゾリウムトリフレート溶液をそれぞれ用いる。合成プログラムを変えた
後、さらに配列GATTCのDNAオリゴマーを既知の方法に従い合成する(M
.J.Gait,オリゴヌクレオチド合成,IRL Press,Oxford ,UK1984)。脱アリル化、ヒドラジン分解、HPLクロマトグラフィー及
び脱塩をp−RNAオリゴマー用に記載されているように(上記参照)行い、所
望の複合体を得る。 2.集中法(convergent process) 実施例2に記載されているように、配列4′−インドールリンカー−A8−2′
をもつp−RNAオリゴマーを調製し、精製し、ヨウドアセチル化する。配列G
ATTC−チオールリンカーのDNAオリゴマーを既知の方法に従い合成し(M
.J.Gait,オリゴヌクレオチド合成,IRL Press,Oxford ,英国1984)、精製する(Glen Research:No.20−29 33からの3′−チオールリンカー)。二つの断片を緩衝液中に放置すると(T
.Zhu.ら,Bioconjug.Chem.1994,5,312)複合体
を生じ、これを最後にHPLCで精製する。実施例8 ビオチン基のアミノ変性p−RNAへの複合 先ず、実施例6に記載された方法に類似して、Eurogentec [2− (2−(4−(モノメトキシトリチル)アミノエトキシ)エチル2−シアノエチ
ル (N,N−ジイソプロピル)ホスホルアミダイト)]の5′−アミノ変性剤 5の手段で4′−末端にアミノ基を具備させた、配列TAGGCAATのp−R
NAオリゴマーを合成した。オリゴヌクレオチド(17.04OD,0.175
μmol)を塩基性バッファー0.5mlにとり、ビオチン−N−ヒドロキシス
クシンイミドエステル1.14mg(2.5μmol)を無水DMF114μl
に溶解し、溶液を室温で1時間放置した。生成した複合体を予備(prepar
ative)HPLCで精製し、純粋な生成物をSepakを用いて脱塩した。 収率:8.6OD(49%)。M(calc.)=3080D,M(fef)=
3080.4D。実施例9 シアニン又はビオチン−標識p−RNAオンライン(online)製造 先ず、種々のA,T,G,C及びInd(Ind=核酸塩基としてのアミノエ
チルインドール)ホスホルアミダイトを既知の方法により製造した。シアニン(
Cy3−CE)及びビオチンホスホルアミダイトをGlen Research から得た。
の工程からなる。 (a)脱トリチル化: CH2Cl2(79ml)中6%DCA(ジクロロ酢酸) で5分; (b) CH2Cl2(20ml)、アセトニトリル(20ml)で洗浄及び次 いでのアルゴンでのフラッシング(flushing); (c)カップリング:活性化剤での樹脂の洗浄( CH2Cl20.2ml中の 0.5MピリジンHCl);活性化剤(0.76ml)及び相当するホスホルアミ
ダイト(0.76ml:8当量;アセトニトリル中0.1M)の比1:1での30
分処理; (d)キャッピング:Perseptiveからの50%CapA(10.5m
l)及び50%CapB(10.5ml)(CapA:THF、ルチジン、無水
酢酸;CapB:1−メチルイミダゾール、THF、ピリジン)で2分 (e)酸化:ヨウ素溶液(アセトニトリル100ml、水46ml及びsym−
コリジン9.2ml中のヨウ素400mg)120mlで1分; (f)アセトニトリル(22ml)で洗浄。
DMT(ジメトキシトリチル)又はMMT(モノメトキシトリチル)保護基をビ
オチン又はシアニンモノマーからは除去しなかった。最後のカップリングの変性
ホスホルアミダイトでの検出は合成後にUV(503nm)でのトリチルカチオ
ン吸収の手段で樹脂の1%で実施される。 オリゴヌクレオチドの作製(work−up): アリルエーテル保護基を、CH2Cl2(15ml)中のテトラキス(トリフェ
ニルホスフィン)パラジウム(272mg)、トリフェニルホスフィン(272
mg)及びジエチルアンモニウム重炭酸塩の溶液で室温で5時間処理して除去し
た。次いで、ガラス担体をCH2Cl2(30ml)、アセトン(30ml)及び
水(30ml)で洗浄した。パラジウム錯体残渣を除去するために、樹脂を0.
1Mナトリウムジエチルジチオカルバメート水和物水溶液でリンスした。上述の
洗浄操作を反対の順でもう一度行った。次いで、樹脂を高真空で10分乾燥した
。同時に脱ベンゾイル化を伴うガラス担体からの除去工程を24%ヒドラジン水
和物溶液(6ml)中4℃で行った。RP18上でのHPLCチェッキング(1
8−25時間)後、オリゴヌクレオチド「Trityl ON」を、活性化され た(アセトニトリル、20ml)Waters Sep−Pak Cartrid
geでヒドラジンから取り除いた。ヒドラジンをTEAB0.1M(30ml)
で洗浄した。次いで、オリゴヌクレオチドをアセトニトリル/TEAB0.1M
(10ml)で溶出した。次いで、混合物をHPLC(断片配列の分離用)で精
製し、DMT脱保護(80%濃度水性ギ酸30ml)を行った。最後に脱塩して
(TEABバッファー0.1M/アセトニトリル:1/1を用いたSep−Pa
k Cartridgeで)、純粋なシアニン−又はビオチン−標識オリゴマー を得た。このオリゴ溶液の一部(アリコート)をESI−MSを行うために用い
た。4′Cy−AIndTTCCTA2′:M=3026、(M+H)+=30 27。4′ビオチン−TAGGAAIndT2′:M=3014、(M+H)2+ m/e1508及び(M+H)+m/e 3015。 オリゴ体(Oligos)を貯蔵のため凍結乾燥した。実施例10 p−RNAのN−(ヨードアセチルオキシ)−スクシンイミドでのヨードアセチ
ル化 p−RNA配列:4′AGGCAIndT2′Mw=2266.56g/モル(
Ind=インドール−CH2−CH2−NH2−リンカー p−RNA1当量を0.1モル重炭酸ナトリウム溶液(pH8.4)に溶解し
(350nmol当たり1ml)、DMSO中のN−(ヨードアセチルオキシ)
スクシンイミド溶液で処理した(mg当たり40μl)。バッチをAlフィルム
で暗くし(blacked out)、室温で30−90分放置した。
モニウム酢酸塩バッファー グラジエント:10%Bから出発して40分で50%Bへ カラム材:Merck Darmstadt GmbH製の、10μMのLiCh
rosphere(登録商標)100RP−18;250×4mm 出発物質の保持時間:18.4分 この場合の生成物の保持時間:23.1分 反応が完了した後、バッチを水で4倍容に希釈した。Waters Sep− Pak Cartridge RP−18(15 OD 2gのパッキングから)を
2×10mlのアセトニトリル及び2×10mlの水で活性化し、オリゴを適用
し、埋入させ(sink in)、塩及び試剤を除去するために反応容器を2× 10mlの水で洗浄し、3×10mlの水で再洗浄し、先ず5×1mlの水:ア
セトニトリル(50:1)、次いで水:アセトニトリル(1:1)で溶出した。
生成物を非常に良い純度で1:1画分で溶出した。画分は冷却して暗所で濃縮し
、併せ、再度濃縮した。収率をUV吸収分光計で260nmで決定した。質量分
析: 配列:4′AGGCAInd(CH2CH2NHCOCH2−I)T2′ 算出(calculated)質量:2434.50g/モル 質量MH2 2+:2433g/モル実施例11 p−RNAの配列CYSKVGのペプチドへの複合 ヨードアセチル化p−RNA(Mw=2434.50g/モル)をバッファー 系に溶解し(114nmol当たり1000μl)、次いでバッファーでのペプ
チド溶液(2モルのCYSKVGペプチド; Mw=655.773g/モル;バ
ッファー20μl中の228nmol)で処理した。 バッファー系:Riedel−de Haen製のBorax/HClバッファ ー(pH8.0)を、10ミリモルのEDTAジナトリウム塩の水溶液と1:1
比で混合し、HClを用いpH6.3に調整した。このようにして5mMのNa 2 EDTAを含む溶液を得た。
視した。標準条件は次のとおりである。 バッファーA;水での0.1モルのトリエチルアンモニウム酢酸塩バッファー バッファーB;水:アセトニトリル(1:4)での0.1モルのトリエチルアン
モニウム酢酸塩バッファー グラジエント:10%Bから出発して40分で50%Bへ カラム材:Merck Darmstadt GmbH製の、10μMのLiCh
rosphere(登録商標)100RP−18;250×4mm 出発物質の保持時間:17.6分 生成物の保持時間:15.5分 反応が完了した後、バッチをRP−HPLCで直接精製した。(標準条件は上
記参照)。
た。Waters Sep−Pak Cartridge RP−18(15 OD
2gのパッキングから)を2×10mlのアセトニトリル及び2×10mlの 水で活性化し、オリゴを適用し、埋入させ、塩を除去するために反応容器を2×
10mlの水で洗浄し、3×10mlの水で再洗浄し、水:アセトニトリル(1
:1)で溶出した。生成物画分は濃縮し、併せ、再度濃縮した。収率をUV吸収
分光計で260nmで決定した。それは理論値の70−95%に達した。 質量分析: 配列:4′AGGCAInd(CH2CH2NHCOCH2−CYSKVG)T2 ′ 算出(calculated)質量:2962.36g/モル 質量MH2 2+:2962g/モル実施例12 p−RNAのペプチドライブラリへの複合 ヨードアセチル化p−RNA(Mw=2434.50g/モル)をバッファー系
に溶解し(832nmol当たり1300μl)、次いでペプチドライブラリ(
CKR−XX−OH;X=Arg、Asn、Glu、His、Leu、Lys、
Phe、Ser、Trp、Tyr)溶液でバッファー[8モル;平均分子質量M
m=677.82g/モル;バッファー200μmol中の4.5mg(6.6
6μmol)]中で処理した。 バッファー系:Riedel−de Haen製のBorax/HClバッファ ー(pH8.0)を、10ミリモルのEDTAジナトリウム塩の水溶液と1:1
比で混合し、HClを用いpH6.6に調整した。このようにして5mMのNa
2EDTAを含む溶液を得た。バッチを転化が完了するまで室温で暗所に放置し
た。反応をHPLC分析で監視した。この場合、出発物質は70時間後に消失し
た。分析用HPLCの標準条件は次のとおりである。 バッファーA;水での0.1モルのトリエチルアンモニウム酢酸塩バッファー バッファーB;水:アセトニトリル(1:4)での0.1モルのトリエチルアン
モニウム酢酸塩バッファー グラジエント:10%Bから出発して40分で50%Bへ カラム材:Merck Darmstadt GmbH製の、10μMのLiCh
rosphere(登録商標)100RP−18;250×4mm 出発物質の保持時間:18.8分 生成物の保持時間:13.9−36.2分から数個のピーク 反応が完了した後、バッチを水を用い4倍容に希釈した。Waters Se p−Pak Cartridge RP−18(15 OD 2gのパッキングから
)を3×10mlのアセトニトリル及び3×10mlの水で活性化し、オリゴを
適用し、埋入させ、反応容器を2×10mlの水で再洗浄し、塩及び過剰のペプ
チドを除去するためにカートリッジを3×10mlの水で再洗浄し、生成物がも
はやUV分光計で溶出されなくなるまで水:アセトニトリル(1:1)で溶出し
た。画分は冷却して暗所で濃縮し、併せ、再度濃縮した。
示す。
レオチドの合成を図式的に示す。
Claims (25)
- 【請求項1】未保護ペントピラノシドから出発して、(a)第1の工程で、ペン
トピラノシドの2′,3′又は4′−位を先ず保護し、(b)第2の工程で、残
りの2′,3′又は4′−位を保護することを特徴とするペントピラノシルヌク
レオシドの製造方法。 - 【請求項2】下記の式(I)又は式(II)のペントピラノシルヌクレオシドを
製造することを特徴とする請求項1記載の方法。 式(I) 【化1】 {ここで、R1はH、OH、Hal(ここでHalはBr又はClである)、又 は式 【化2】 、又は式 【化3】 又は−O−P[N(i−Pr)2]−(OCH2CH2CN)(ここでi−Prは イソプロピルである)から選ばれた基であり、R2,R3及びR4はそれぞれ、互 いに独立して、同一であるか又は異なって、H、Hal(ここでHalはBr又
はClである)、NR5R6、OR7、SR8、=O、CnH2n+1(ここでnは1− 12、好ましくは1−8、特に1−4の整数である)、β−脱離性基、好ましく
は式−OCH2CH2R18(ここでR18はシアノ基、p−ニトロフェニル基、又は
フルオレニルメチルオキシカルボニル(Fmoc)基である)、式 【化4】 〔ここで、R12,R13,R14及びR15はそれぞれ、互いに独立して、同一である
か又は異なって、H、OR7(ここでR7は上記の意味をもつ)、又はCnH2n+1 又はCnH2n-1(ここでnは上記の意味をもつ)である〕の基であって、かつR5 ,R6,R7及びR8はそれぞれ、互いに独立して、同一であるか又は異なって、 H、CnH2n+1又はCnH2n-1(ここでnは上記の意味をもつ)、又は−C(O)
R9(ここでR9は直鎖状又は分枝状の、場合により置換されたアルキル又はアリ
ール基、好ましくはフェニル基である)であり、X,Y及びZはそれぞれ、互い
に独立して、同一であるか又は異なって、=N−、=C(R16)−又は−N(R 17 )−(ここでR16及びR17はそれぞれ、互いに独立して、同一であるか又は異
なって、H、又は上記の意味をもつCnH2n+1又は(CnH2n)NR10R11である
)であり、そしてSc1及びSc2はそれぞれ、互いに独立して、同一であるか又は
異なって、H、又はアシル、トリチル又はアリルオキシカルボニル基、好ましく
はベンゾイル若しくは4,4′−ジメトキシトリチル(DMT)基から選ばれた
保護基である} 式(II) 【化5】 [ここで、R1′はH、OH、Hal(ここでHalはBr又はClである)、 又は式 【化6】 、又は式 【化7】 又は−O−P[N(i−Pr)2]−(OCH2CH2CN)(ここでi−Prは イソプロピルである)から選ばれた基であり、R2′,R3′及びR4′はそれぞ れ、互いに独立して、同一であるか又は異なって、H、Hal(ここでHalは
Br又はClである)、=O、CnH2n+1、CnH2n-1、β−脱離性基、好まし くは式−OCH2CH2R18(ここでR18はシアノ基、p−ニトロフェニル基、フ
ルオレニルメチルオキシカルボニル(Fmoc)基である)、又は(CnH2n) NR10′R11′(ここでR10′,R11′は互いに独立して、上記のR10又はR11 の意味をもつ)の基であり、X′、Y′及びZ′はそれぞれ、互いに独立して、
同一であるか又は異なって、=N−、=C(R16′)−又は−N(R17′)−(
ここでR16′及びR17′は互いに独立して上記のR16又はR17の意味をもつ)で
あり、そしてSc1′及びSc2′は上記のSc1及びSc2の意味をもつ] - 【請求項3】ペントピラノシルヌクレオシドがリボ−、アラビノ−、リキソ−及
び/又はキシロピラノシルヌクレオシド、好ましくはリボピラノシルヌクレオシ
ドであることを特徴とする請求項1又は2記載の方法。 - 【請求項4】ペントピラノシル部がD又はL配置であることを特徴とする請求項
1ないし3のいずれかに記載の方法。 - 【請求項5】用いられるペントピラノシルヌクレオシドがペントピラノシルプリ
ン、−2,6−ジアミノプリン、−6−プリンチオール、−ピリジン、−ピリミ
ジン、−アデノシン、−グアノシン、−イソグアノシン、−6−チオグアノシン
、−キサンチン、−ヒポキサンチン、−チミジン、−シトシン、−イソシトシン
、−インドール、−トリプタミン、−N−フタロイルトリプタミン、−ウラシル
、−カフェイン、−テオブロミン、−テオフィリン、−ベンゾトリアゾール又は
−アクリジンであることを特徴とする請求項1ないし4のいずれかに記載の方法
。 - 【請求項6】R2、R3、R4、R2′、R3′及び/又はR4′が2−フタルイミド
エチル又はアリルオキシ基又は式−N[C(O)R9]2の基であることを特徴と
する請求項1ないし5のいずれかに記載の方法。 - 【請求項7】ペントピラノシルヌクレオシドが[(2′,4′−ジ−O−ベンゾ
イル)−β−リボピラノシル]ヌクレオシド、特に[(2′,4′−ジ−O−ベ
ンゾイル)−β−リボピラノシル]−アデニン、−グアニン、−シトシン、−チ
ミジン、−ウラシル、−キサンチン又は−ヒポキサンチン、N−ベンゾイル−2
′,4′−ジ−O−ベンゾイルリボピラノシルヌクレオシド、特に−アデニン、
−グアニン又は−シトシン、N−イソブチロイル−2′,4′−ジ−O−ベンゾ
イルリボピラノシルヌクレオシド、特に−アデニン、−グアニン又は−シトシン
、O6−(2−シアノエチル)−N2−イソブチロイル−2′,4′−ジ−O−ベ
ンゾイルリボピラノシルヌクレオシド、特に−グアニン、O6−(2−(4−ニ トロフェニル)エチル)−N2−イソブチロイル−2′,4′−ジ−O−ベンゾ イルリボピラノシルヌクレオシド、特に−グアニン、β−リボピラノシルヌクレ
オシド、特にβ−リボピラノシルアデニン、−グアニン、−シトシン、−チミジ
ン若しくは−ウラシル、−キサンチン若しくは−ヒポキサンチン、N−ベンゾイ
ル−、N−イソブチロイル−、 O6−(2−シアノエチル)−若しくはO6−( 2−(4−ニトロフェニル)エチル)−N2−イソブチロイル−β−リボピラノ シルヌクレオシド、4′−DMT−ペントピラノシルヌクレオシド、好ましくは
4′−DMT−リボピラノシルヌクレオシド、特に4′−DMT−リボピラノシ
ルアデニン、−グアニン、−シトシン、−チミジン、−ウラシル、−キサンチン
若しくは−ヒポキサンチン、N−ベンゾイル−4′− DMT−リボピラノシル ヌクレオシド、特にN−ベンゾイル−4′− DMT−リボピラノシルアデニン 、−グアニン又は−シトシン、N−イソブチロイル−4′− DMT−リボピラ ノシルヌクレオシド、特にN−イソブチロイル−4′− DMT−リボピラノシ ルアデニン、−グアニン又は−シトシン、O6−(2−シアノエチル)− N2− イソブチロイル−4′− DMT−リボピラノシルヌクレオシド、特にO6−(2
−シアノエチル)− N2−イソブチロイル−4′− DMT−リボピラノシルグ アニン、O6−(2−(4−ニトロフェニル)エチル)−N2−イソブチロイル−
4′− DMT−リボピラノシルヌクレオシド、特にO6−(2−(4−ニトロフ
ェニル)エチル)−N2−イソブチロイル−4′− DMT−リボピラノシルグア
ニン又はβ−リボピラノシル−N,N′−ジベンゾイルアデノシン又はβ−リボ
ピラノシル−N,N′−ジベンゾイルグアノシンであることを特徴とする請求項
1ないし5のいずれかに記載の方法。 - 【請求項8】2′−保護位の場合に、保護基の転位が2′−位から3′−位へ行
われることを特徴とする請求項1ないし7のいずれかに記載の方法。 - 【請求項9】転位が塩基の存在下に、特にN−エチルジイソプロピルアミン及び
/又はトリエチルアミンの存在下に行われることを特徴とする請求項8記載の方
法。 - 【請求項10】ピラノシルヌクレオシドが、酸に不安定であるか、塩基に不安定
であるか、又は金属接触で除去されうる保護基Sc1、Sc2、 Sc1′又はSc2′ によって保護されていることを特徴とする請求項1ないし9のいずれかに記載の
方法。 - 【請求項11】 Sc1及びSc1′がSc2及びSc2′と異なることを特徴とする請 求項1ないし10のいずれかに記載の方法。
- 【請求項12】保護基Sc1、Sc2、 Sc1′又はSc2′がアシル基、好ましくは アセチル、ベンゾイル、ニトロベンゾイル及び/又はメトキシベンゾイル基、ト
リチル基、好ましくは4,4′−ジメトキシトリチル(DMT)基又はβ−脱離
性基、好ましくは式OCH2CH2R18(ここで、R18はシアノ基、p−ニトロフ
ェニル基又はフルオレニルメチルオキシカルボニル(Fmoc)基である)の基
から選択されることを特徴とする請求項1ないし11のいずれかに記載の方法。 - 【請求項13】2′−又は3′−位が、塩基に不安定であるか、又は金属接触で
除去されうる保護基、好ましくはアシル基、特にアセチル、ベンゾイル、ニトロ
ベンゾイル及び/又はメトキシベンゾイル基で保護されていることを特徴とする
請求項1ないし12のいずれかに記載の方法。 - 【請求項14】4′−位が、酸又は塩基に不安定である保護基、好ましくはトリ
チル基及び/又はFmoc基、特にDMT基で保護されていることを特徴とする
請求項1ないし13のいずれかに記載の方法。 - 【請求項15】(a)保護された核酸塩基を保護されたペントピラノースと反応
させ、(b)工程(a)からの生成物のペントピラノシル部位から保護基を除去
し、(c)工程(b)からの生成物を請求項1−14のいずれかによる方法に従
い反応させることを特徴とするペントピラノシルヌクレオシドの製造方法。 - 【請求項16】保護されたペントピラノースがアノマーとして純粋であることを
特徴とする請求項15記載の方法。 - 【請求項17】(a)式(II)[ここで、R4′は(CnH2n)OSc3又は(C n H2n)Hal(ここで、nは上記の意味をもち、Sc3は保護基、好ましくはメ シレート基であり、Halは塩素又は臭素である)である]の化合物をアジドと
反応させ、 (b)(a)からの反応生成物を還元し、 (c)(b)からの反応生成物を適当なフタルイミドと反応させ、 (d)(c)からの反応生成物を適当な保護されたピラノースと反応させ、そし
て、 (e)保護基を除去し、そして、 (f)請求項7ないし16のいずれかに記載の工程を実施することを特徴とする
、式(II)[ここで、 R4′は(CnH2n)NR10′R11′であり、 R10′R 11 ′は式(III)の基を介して請求項1に定義した意味に結合されている]に
よるリンカーの製造のための請求項15記載の方法。 - 【請求項18】(a)適当なインドリンをピラノースと反応させてヌクレオシド
トリオールを生成させ、 (b)(a)からの生成物のピラノシル部位のヒドロキシル基を好ましくはアシ
ル基で保護し、 (c)(b)からの生成物を酸化し、 (d)(c)からの生成物のピラノシル部位のヒドロキシル保護基を除去するこ
とを特徴とする、式(I)[ここでX及びYはそれぞれ、互いに独立して、同一
であるか又は異なって、=C(R16)(ここでR16はH又はCnH2nである)で あり、Zは=C(R16)−(ここでR16は請求項1に定義した意味をもつ(Cn H2n)NR10R11である)である]によるリンカーの製造のための請求項15記
載の方法。 (f)請求項7ないし16のいずれかに記載の工程を実施することを特徴とする - 【請求項19】4′−保護ペントピラノシルヌクレオシドをさらなる工程でホス
フィチル化し、あるいは固相に結合させることを特徴とする請求項1ないし18
のいずれかに記載の方法。 - 【請求項20】(a)第1工程で、請求項1ないし19のいずれかに記載の方法
により製造された、保護されたペントピラノシルヌクレオシドを固相に結合させ
、そして、 (b)第2工程で工程(a)により固相に結合された3′−,4′−保護ペント
ピラノシルヌクレオシドをホスフィチル化3′−,4′−保護ペントピラノシル
ヌクレオシドにより伸長させ、そして、 (c)工程(b)を繰り返すことを特徴とするペントピラノシル核酸の製造方法
。 - 【請求項21】工程(a)及び/又は工程(b)でペントフラノシルヌクレオシ
ドもまた併合されることを特徴とする請求項19記載の方法。 - 【請求項22】工程(b)による伸長のために用いられるカップリング試薬が、
ホスホルアミダイトを用いる場合にはピリジニウム塩酸塩、好ましくはニトロフ
ェニルテトラゾール、特にベンズイミダゾリウムトリフレートなどの酸性活性化
剤であり、H−ホスホネートを用いる場合には、アリールスルホニルクロリド、
ジフェニルクロロホスホネート、ピバロイルクロリド又はアダマントイルクロリ
ドであることを特徴とする請求項20又は21記載の方法。 - 【請求項23】さらなる工程(d)において、保護基及び形成されたオリゴマー
を固相から除去することを特徴とする、請求項20ないし22のいずれかに記載
の方法。 - 【請求項24】ヒドラジン分解での除去が好ましくは塩の存在下に行われること
を特徴とする請求項23記載の方法。 - 【請求項25】さらなる工程で、式:Sc4NH(CnH2n)CH(OPSc5Sc6 )CnH2nSc7(式中、Sc4及びSc7はそれぞれ、互いに独立して、同一である か又は異なって、特にFmoc及び/又はDMTから選ばれた保護基であり、S c5 及びSc6はそれぞれ、互いに独立して、同一であるか又は異なって、アリルオ
キシ及び/又はジイソプロピルアミノ基であり、 nは請求項1に規定されたと おりのものである)のアリルオキシリンカーが併合されることを特徴とする請求
項20ないし24のいずれかに記載の方法。
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