JP4374918B2

JP4374918B2 - 位相差顕微鏡

Info

Publication number: JP4374918B2
Application number: JP2003169786A
Authority: JP
Inventors: 俊明二星
Original assignee: Nikon Corp
Current assignee: Nikon Corp
Priority date: 2003-06-13
Filing date: 2003-06-13
Publication date: 2009-12-02
Anticipated expiration: 2023-06-13
Also published as: JP2005004087A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、位相差顕微鏡に関する。
【０００２】
【従来技術】
従来の位相差顕微鏡は、位相差観察の際、位相差法の必須要件である照明光学系に配置されたリング状開口絞りと、対物レンズ側に配置された位相膜と結像関係を維持するために、照明光学系と対物レンズとの位置関係を固定し、ステージに載置された標本の位置を移動することで標本の異なる場所の位相差観察を行っている（例えば、特許文献１参照。）。
【０００３】
【特許文献１】
特開平５−３３３２７２号公報
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
一方、生体・培養標本の中にはステージを移動する際の振動等によって、標本の状態に変化が生じてしまう虞があり、標本を移動して観察できない場合がある。このような標本の異なる部位を標本を移動させずに位相差観察したいと言う要望がある。特に、標本の複数の部位についてそれぞれの経時変化を観察する場合には、標本を移動させることなく、かつ標本の状態を変化させずに複数の部位を位相差観察できる位相差顕微鏡が望まれている。しかし、これまで標本を移動させずに位相差観察する手段がなかった。
【０００５】
また、従来の位相差顕微鏡では、対物レンズまたは対物レンズを含む結像光学系を光軸に垂直な方向に移動させた場合、照明光学系のリング状開口絞りと対物レンズ側に設けられた位相膜との結像関係を維持することが難しく、良好なコントラストを有する観察像が得にくいという問題が有る。
【０００６】
本発明は、上記問題に鑑みて行われたものであり、固定された標本の異なる場所の位相差観察を可能とする位相差顕微鏡を提供することを目的としている。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するために、本発明では、光源と、前記光源からの光を標本に照射するコンデンサレンズと、前記標本からの透過光を集光する対物レンズと、前記標本像を結像させる結像光学系と、前記コンデンサレンズの前側焦点位置に配設されたリング状開口絞りと、前記対物レンズの後側焦点位置に配設された位相膜とを有し、前記コンデンサレンズは、前記リング状開口絞りの開口部のある点から射出した光が、前記コンデンサレンズを介することにより、前記標本上において前記コンデンサレンズの光軸に対して所定の角度をなす平行光束に変換されるように構成され、前記対物レンズまたは前記対物レンズと前記結像光学系とを光軸に対して垂直な方向に移動したとしても、前記リング開口絞りと前記位相膜との結像関係が略維持されてなることを特徴とする位相差顕微鏡を提供する。
【０００８】
また、本発明にかかる位相差顕微鏡では、前記標本の少なくとも直径８ｍｍの範囲において、前記所定の角度をなす平行光束の開口数が０．２〜０．３であることが好ましい。
【０００９】
また、本発明にかかる位相差顕微鏡では、前記コンデンサレンズは、標本側から順に、正屈折力の第１レンズ群と、正屈折力の第２レンズ群とからなり、以下の条件式を満足することが好ましい。
【００１０】
Ｄ＞ｆ／２
Ｒ１＞−１．２×ｆ
０．１５＜ｆ１／ｆ２＜１０
但し、
Ｄ：前記コンデンサレンズの作動距離、
ｆ：前記コンデンサレンズ全系の焦点距離、
Ｒ１：前記コンデンサレンズの最も標本面側のレンズ面の曲率半径、
ｆ１：前記第１レンズ群の焦点距離、
ｆ２：前記第２レンズ群の焦点距離である。
【００１１】
また、本発明にかかる位相差顕微鏡では、前記コンデンサレンズは、正屈折力のレンズからなり、以下の条件式を満足することが好ましい。
【００１２】
Ｄ＞ｆ／２
ｎｄ＞１．６
Ｒ１＞ｆ
但し、
Ｄ：前記コンデンサレンズの作動距離、
ｆ：前記コンデンサレンズ全系の焦点距離、
Ｒ１：前記コンデンサレンズの最も標本面側のレンズ面の曲率半径、
ｎｄ：レンズ材料のｄ線（波長λ＝５８７．６ｎｍ）における屈折率である。
【００１３】
【発明の実施形態】
本発明の実施の形態を図面を参照しつつ説明する。
【００１４】
図１は、本発明の実施の形態にかかる位相差顕微鏡の光学系の概略構成図である。図２は、位相差観察時における、リング状開口絞りと位相膜との好適な位置関係を示す図である。図３は、本発明の第１実施の形態にかかるコンデンサレンズの構成と、対物レンズを光軸に垂直な方向に移動した際の、リング状開口絞りと位相膜との関係を説明する図である。図４は、本発明の第２実施の形態にかかるコンデンサレンズの構成と、対物レンズを光軸に垂直な方向に移動した際の、リング状開口絞りと位相膜との関係を説明する図である。
【００１５】
図１において、光源１からの光は、コレクタレンズ３で集光され、リング状開口絞り５に略平行光で照射される。リング状開口絞り５の開口部７からの光はコンデンサレンズ９により標本面１１照射される。リング状開口絞り５は、コンデンサレンズ９の前側焦点位置に配置されており、開口部７の一点からの光は、コンデンサレンズ９により標本面１１の所定の領域に略平行光として照射される。不図示の標本は培養シャーレ１３の中に入れられ、恒温・高湿状態を維持するためにシャーレ１３は保護ガラス１５で覆われている。シャーレ１３は不図示のステージに載置されている。
【００１６】
標本面１１を透過した光は、対物レンズ１７で集光され、図２に示すように、対物レンズ１７の後側焦点位置に配置された位相膜１９上に結像する。この位相膜１９を透過した光と、位相膜１９以外を通過した光とが干渉して、結像光学系である第２対物レンズ２１を介して結像面２３に明暗の差として結像され、位相差観察が行われる。標本の所望の部位の位相差観察は、対物レンズ１７と位相膜１９とを一体にして光軸に対して垂直な方向（図中の矢印）に移動させて行っている。このようにして、位相差顕微鏡１００が構成されている。
【００１７】
位相差顕微鏡における位相差観察法は公知であり、説明を省略する。標本を位相差観察する場合には、コンデンサレンズ９の前側焦点位置に設けられたリング開口絞り５の開口部７と、対物レンズ１７の後側焦点位置に設けられた位相膜１９との結像関係を良好に維持することが必須である。このため、従来の位相差顕微鏡では、リング状開口絞り５と位相膜１９との位置関係は固定とし、標本を動かして標本の観察位置を選択していた。
【００１８】
本実施の形態では、位相差観察する標本の位置は固定しておき、対物レンズ側を所定量移動させることで観察する位置を選択可能としており、対物レンズ側を移動させた際においても上述のリング開口絞り５と位相膜１９との結像関係を維持するようにコンデンサレンズ９を設計しているところに特徴がある。
【００１９】
本実施の形態における位相差顕微鏡１００の場合、２０倍ないし４０倍の対物レンズ１７を用い、シャーレ１３の標本観察領域は約８ｍｍ^φ程度としている。したがって、２０ないし４０倍の対物レンズ１７の実視野は、視野数２０の場合０．５ｍｍ^φないし１ｍｍ^φであるので、±約４ｍｍ程度、対物レンズ１７を移動した際に、リング状開口絞り５の開口部７が位相膜１９上に結像するようなコンデンサレンズ９を用いている。この±約４ｍｍの対物レンズ１７の移動量に対応するには、リング開口絞り５の開口部７の一点から発し標本面１１で約８ｍｍ^φとなる照明光束が光軸に対して同じ角度の平行光束となるようにコンデンサレンズ９が設計されていれば良い。換言すると、標本から発した約８ｍｍ^φの所定のＮＡを有する光束がコンデンサレンズ９を通過後、開口絞り５の面上で一点に収束するようにコンデンサレンズ９が構成されていることになる。所定のＮＡとは、リング開口絞り５の開口部７の径に対応したＮＡである。リング開口絞り５の開口部７の一点から発した光束が平行光束となれば、光束のどの部分を切り取っても同じＮＡとなり位相膜１９の所定の位置に結像される。
【００２０】
位相差像観察における必須条件は、図２に示すように、リング開口絞り５の開口部７の像が位相膜１９からはみ出ることなく結像することである。開口部７の像が位相膜１９からはみ出ると、結像した像のコントラストは著しく劣化してしまう。開口部７の像が位相膜１９からはみ出るのを防ぐには、位相膜１９の幅を広くすることが考えられるが、位相膜１９の瞳面にしめる割合が大きくなると結像全体のコントラストに悪影響を及ぼすので適当な幅に制限されている。
【００２１】
本実施の形態の位相差顕微鏡では、実使用照野よりずっと大きな約８ｍｍ^φ程度の光束においても、ＮＡが０．２４〜０．２９、入射角では１４°〜１７°の光束を結像性能良く結像するコンデンサレンズ９が用いられている。ＮＡは、例えば開口数が０．３のコンデンサレンズ９から標本に射出された光のＮＡであって、開口部７のどこから（内側か外側か）射出された光であるかによって、標本上でのＮＡが０．２４〜０．２９の範囲で変化する。
【００２２】
また、本コンデンサレンズの目的は、約８ｍｍ^φで所定のＮＡの光束が一点に集光させる良好な集光状態が必要であり、通常のコンデンサレンズのように視野絞りの結像という機能は重視されていない。標本面からコンデンサレンズの作動距離、およびリング状開口絞りの位置は通常のコンデンサレンズのように各々の焦点位置に設ける必要はなく、位相差顕微鏡の有する光学系に好適な位置を選択して配置すればよい。
【００２３】
（第１実施の形態）
図３は、本発明の第１実施の形態にかかるコンデンサレンズの構成と、対物レンズを光軸に垂直な方向に移動した際のリング状開口絞りと位相膜との関係を説明する図である。
【００２４】
図３において、コンデンサレンズ２９は、標本面１１側から順に、正屈折力の第１レンズ群Ｇ１と、正屈折力の第２レンズ群Ｇ２とからなり、以下の条件式（１）、（２）、（３）を満足している。
【００２５】
（１）Ｄ＞ｆ／２
（２）Ｒ１＞−１．２×ｆ
（３）０．１５＜ｆ１／ｆ２＜１０
但し、
Ｄ：前記コンデンサレンズ２９の作動距離、
ｆ：前記コンデンサレンズ２９全系の焦点距離、
Ｒ１：前記コンデンサレンズ２９の最も標本面１１側のレンズ面の曲率半径、
ｆ１：前記第１レンズ群Ｇ１の焦点距離、
ｆ２：前記第２レンズ群Ｇ２の焦点距離を表す。
【００２６】
条件式（１）〜（３）は、いずれも作動距離規定に関連する条件式である。
【００２７】
条件式（１）において、この範囲を超えると作動距離Ｄが小さくなりすぎ、標本を入れてあるシャーレ１３等を不図示のステージに載置して位相差観察することが困難になるので好ましくない。本実施の形態におけるコンデンサレンズ２９は、観察する標本が所定の高さを有するシャーレ１３に入れられ、標本の環境維持のためコンデンサレンズ９とシャーレ１３との間には保護ガラス１５が設けられる場合があるなどの理由から、コンデンサレンズ２９の作動距離は２０ｍｍ以上の距離が得られるよにしている。
【００２８】
条件式（２）は、光学系の諸収差量を良好な範囲とするための条件であり、この範囲を超えてＲ１が小さくなると、例えば、非点収差におけるメリディオナル像面の曲がりが大きくなり、リング状開口絞り５の開口部７の外周端と内周端とが位相膜１９上に同時に合焦できなくなるので好ましくない。なお、リング状開口絞り５に湾曲を持たせメリディオナル像面の曲がりに合わせて補正することが可能であるが、加工コストが高くなる。
【００２９】
条件式（３）は、コンデンサレンズ２９の屈折力配置に関する条件であり、上限値および下限値を超えると、光学系の諸収差特性が悪化すると共に所定の作動距離を確保することが困難となるため好ましくない。
【００３０】
コンデンサレンズ２９が条件式（１）〜（３）を満足することで、諸収差を所定の範囲内に抑え所定の作動距離を有する位相差顕微鏡を得ることができる。
【００３１】
「実施例１」
以下の表１に本第１実施の形態にかかるコンデンサレンズ２９の数値実施例を示す。
【００３２】
【表１】
（全体諸元）
ｆ＝２８．０ｍｍ
ＮＡ＝０．３
光束＝８ｍｍ^φ
（レンズデータ）

（条件式対応値）
（１）Ｄ＝２０
（２）Ｒ１＝∞
（３）ｆ１／ｆ２＝１
なお、数値実施例において、Ｒiは曲率半径を、ｎｄはｄ線（λ＝５８７．６ｎｍ）における屈折率をそれぞれ示している。また、ｄ0は、標本面１１から第１レンズ群Ｇ１のレンズ面１までの間隔を、d1は、レンズ面１とレンズ面２との間隔を、d2は、レンズ面２とレンズ面３との間隔を、d3はレンズ面３とレンズ面４との間隔を、d4はレンズ面４とリング状開口絞り５との間隔をそれぞれ示している。また、曲率半径Ｒi＝０は、平面を表している。
【００３３】
また、掲載されている焦点距離ｆ、曲率半径Ｒi、面間隔ｄiその他の長さ等は、特記の無い場合一般に「ｍｍ」が使われるが、光学系は比例拡大または比例縮小しても同等の光学性能が得られるので、これに限られるものではない。また、単位は「ｍｍ」に限定されること無く他の適当な単位を用いることもできる。さらに、これらの記号の説明は、以降の他の実施例においても同様とする。
【００３４】
図３において、対物レンズ１７または対物レンズ１７と結像光学系（図１の第２対物レンズ２１）とを光軸を中心として、光軸位置と図中上下方向にそれぞれ所定距離（本実施例ではそれぞれ約４ｍｍ）移動させたときにリング状開口絞り５の開口部７の一点から発した光が位相膜１９上に集光する光束の様子をそれぞれ実線ａ、破線ｂ、ｃで示している。
【００３５】
本実施例１よるコンデンサレンズ２９では、対物レンズ１７等を所定距離移動しても、位相膜１９上に開口部７からの光束を集光することが可能であり、位相差観察がコントラストの劣化なしに行えることが分かる。
【００３６】
（第２実施の形態）
図４は、本発明の第２実施の形態にかかるコンデンサレンズの構成と、対物レンズを光軸に垂直な方向に移動した際のリング状開口絞りと位相膜との関係を説明する図である。
【００３７】
図４において、コンデンサレンズ３９は、正屈折力の１枚レンズからなり、以下の条件式（１）、（４）、（５）を満足している。
【００３８】
（１）Ｄ＞ｆ／２
（４）ｎｄ＞１．６
（５）Ｒ１＞ｆ
但し、
Ｄ：前記コンデンサレンズ３９の作動距離、
ｆ：前記コンデンサレンズ３９全系の焦点距離、
Ｒ１：前記コンデンサレンズ３９の最も標本面１１側のレンズ面の曲率半径、
ｎｄ：レンズ材料のｄ線（波長λ＝５８７．６ｎｍ）における屈折率を表す。
【００３９】
条件式（１）は、第１実施の形態と同様に作動距離を規定する条件式である。この範囲を超えると作動距離Ｄが小さくなりすぎ、標本を入れてあるシャーレ１３等を不図示のステージに載置して位相差観察することが困難になるので好ましくない。本実施の形態におけるコンデンサレンズ３９は、観察する標本は所定の高さを有するシャーレ１３に入れられ、標本の環境維持のためコンデンサレンズ３９とシャーレ１３との間には保護ガラス１５が設けられる場合があるなどの理由から、コンデンサレンズ３９の作動距離は２０ｍｍ以上の距離が得られるよう設計している。
【００４０】
条件式（４）は、光学系の諸収差量を良好な範囲とするための条件であり、この範囲を超えて屈折率が小さくなると、光学系の収差が大きくなり結像性能が劣化するため好ましくない。
【００４１】
条件式（５）は、光学系の諸収差量を所定値以下に抑えるための条件であり、この範囲を超えてＲ１が小さくなると、例えば、非点収差におけるメリディオナル像面の曲がりが大きくなり、リング状開口絞り５の開口部７の外周端と内周端とが位相膜１９上に同時に合焦できなくなるので好ましくない。なお、リング状開口絞り５に湾曲を持たせメリディオナル像面の曲がりに合わせて補正することが可能であるが、加工コストが高くなる。
【００４２】
コンデンサレンズ３９が条件式（１）、（４）、（５）を満足することで、光学系の諸収差を所定の範囲内に抑え所定の作動距離を有する位相差顕微鏡を得ることができる。
【００４３】
「実施例２」
以下の表２に本第２実施の形態にかかるコンデンサレンズ３９の数値実施例を示す。
【００４４】
【表２】
（全体諸元）
ｆ＝２８．０ｍｍ
ＮＡ＝０．３
光束＝８ｍｍ^φ
（レンズデータ）

（条件式対応値）
（１）Ｄ＝２０
（４） nd＝1.713
（５） R1＝28.0
なお、数値実施例において、Ｒiは曲率半径を、ｎｄはｄ線（λ＝５８７．６ｎｍ）における屈折率をそれぞれ示している。また、ｄ0は、標本面１１からコンデンサレンズ３９のレンズ面１までの距離を、d1は、レンズ面１とレンズ面２との距離を、d2は、レンズ面２とリング状開口絞り５との距離をそれぞれ示している。
【００４５】
図４において、対物レンズ１７または対物レンズ１７と結像光学系（図１の第２対物レンズ２１）とを光軸を中心として、光軸位置と図中上下方向にそれぞれ所定距離（本実施例ではそれぞれ約４ｍｍ）移動させたとき、リング状開口絞り５の開口部７の一点から発した光が位相膜１９上に集光する光束の様子をそれぞれ実線ａ、破線ｂ、ｃで示している。
【００４６】
本実施例２よるコンデンサレンズ３９では、対物レンズ１７等を所定距離移動しても、位相膜１９上にリング状開口絞り５の開口部５からの光束を集光することが可能であり、位相差観察がコントラストの劣化なしに行えることが分かる。
【００４７】
以上述べたように、本実施の形態にかかるコンデンサレンズを用いることによって、対物レンズまたは対物レンズを含む結像光学系を光軸に対して垂直な方向に標本観察範囲に亘って移動しても、コントラストの劣化なしに位相差観察可能な位相差顕微鏡を構成することが可能となる。
【００４８】
なお、上述の実施の形態は例に過ぎず、上述の構成や形状に限定されるものではなく、本発明の範囲内において適宜修正、変更が可能である。
【００４９】
【発明の効果】
上述のように、本発明では、固定された標本の異なる場所の位相差観察を可能とする位相差顕微鏡を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施の形態にかかる位相差顕微鏡の光学系の概略構成図である。
【図２】リング状開口絞りと位相膜との好適な位置関係を示す図である。
【図３】本発明の第１実施の形態にかかるコンデンサレンズの構成と、対物レンズを光軸に垂直な方向に移動した際の、リング状開口絞りと位相膜面との関係を説明する図である。
【図４】本発明の第２実施の形態にかかるコンデンサレンズの構成と、対物レンズを光軸に垂直な方向に移動した際の、リング状開口絞りと位相膜面との関係を説明する図である。
【符号の説明】
１光源
３コレクタレンズ
５リング状開口絞り
７開口部
９、２９、３９コンデンサレンズ
１１標本面
１３シャーレ
１５保護ガラス
１７対物レンズ
１９位相膜
２１第２対物レンズ
２３像面
１００位相差顕微鏡

Claims

光源と、
前記光源からの光を標本に照射するコンデンサレンズと、
前記標本からの透過光を集光する対物レンズと、
前記標本像を結像させる結像光学系と、
前記コンデンサレンズの前側焦点位置に配設されたリング状開口絞りと、
前記対物レンズの後側焦点位置に配設された位相膜とを有し、
前記コンデンサレンズは、前記リング状開口絞りの開口部のある点から射出した光が、前記コンデンサレンズを介することにより、前記標本上において前記コンデンサレンズの光軸に対して所定の角度をなす平行光束に変換されるように構成され、
前記対物レンズまたは前記対物レンズと前記結像光学系とを光軸に対して垂直な方向に移動したとしても、前記リング開口絞りと前記位相膜との結像関係が略維持されてなることを特徴とする位相差顕微鏡。
請求項１に記載の位相差顕微鏡において、
前記標本の少なくとも直径８ｍｍの範囲において、前記所定の角度をなす平行光束の開口数が０．２〜０．３であることを特徴とする位相差顕微鏡。
請求項２に記載の位相差顕微鏡において、
前記コンデンサレンズは、標本側から順に、正屈折力の第１レンズ群と、正屈折力の第２レンズ群とからなり、以下の条件式を満足することを特徴とする位相差顕微鏡。
Ｄ＞ｆ／２
Ｒ１＞−１．２×ｆ
０．１５＜ｆ１／ｆ２＜１０
但し、
Ｄ：前記コンデンサレンズの作動距離、
ｆ：前記コンデンサレンズ全系の焦点距離、
Ｒ１：前記コンデンサレンズの最も標本面側のレンズ面の曲率半径、
ｆ１：前記第１レンズ群の焦点距離、
ｆ２：前記第２レンズ群の焦点距離．
請求項２に記載の位相差顕微鏡において、
前記コンデンサレンズは、正屈折力のレンズからなり、以下の条件式を満足することを特徴とする位相差顕微鏡。
Ｄ＞ｆ／２
ｎｄ＞１．６
Ｒ１＞ｆ
但し、
Ｄ：前記コンデンサレンズの作動距離、
ｆ：前記コンデンサレンズ全系の焦点距離、
Ｒ１：前記コンデンサレンズの最も標本面側のレンズ面の曲率半径、
ｎｄ：レンズ材料のｄ線（波長λ＝５８７．６ｎｍ）における屈折率．