JP6879331B2 - 位相差顕微鏡及びプログラム - Google Patents

Description

本発明は、位相差顕微鏡及びプログラムに関し、特に、メニスカスによる像質の劣化を抑制するようにした位相差顕微鏡及びプログラムに関する。

位相差顕微鏡を用いて細胞等のサンプルを培養観察する場合、一般的にサンプルとサンプルを培養するための培地と呼ばれる液体をシャーレ（ディッシュ）やウェルプレート（マイクロプレート）等の培養容器に入れ、その中でサンプルの培養及び観察が行われる。

この場合、培養容器内の培地の液面が表面張力によって凹状の曲面となるメニスカスが発生し、そのメニスカスの影響により、サンプルの観察像の像質が劣化する。具体的には、培地のメニスカスにより、リング状の開口部を有する位相絞りを通過した照明光が屈折されるとともに、位相絞りの像（以下、絞り像と称する）の形状に歪みが生じる。その結果、サンプルを透過した直接光が対物レンズの射出瞳面に配置されているリング状の位相膜に入射する量が減り、観察像のコントラストが低下する。

そこで、従来、観察前の心合わせ時に、位相絞りを動かすことによりメニスカスによる絞り像のズレを補正するとともに、位相絞りの補正位置とステージの位置を観察情報として記録し、その観察情報を用いて、位相絞りを適切な位置に設定してから、サンプルの観察を行うことが提案されている（例えば、特許文献１参照）。

特開２００９−１２２３５６号公報

しかしながら、絞り像と位相膜との位置合わせは、手間と時間がかかる作業である。特にサンプルの観察位置が増え、各位置においてメニスカスによる絞り像のズレを補正しようとすると、さらにユーザの負担は大きくなる。

本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、位相差顕微鏡の絞りの像と位相膜との位置合わせを簡単に行うことができるようにするものである。

本発明の第１の側面の位相差顕微鏡は、観察位置を移動させるステージに配置される容器内のサンプルに照明光を照射して観察する位相差顕微鏡であって、前記サンプルからの観察光を集光する対物レンズと、前記対物レンズの入射側に配置された絞りと、位相膜が設けられ、前記対物レンズの射出瞳面又は前記射出瞳面と共役な瞳共役面に配置された位相板と、前記対物レンズの光軸上に配置され、前記位相膜と前記位相板上における前記絞りの像との相対位置を調整する光学部材であって、前記対物レンズと前記位相板の間の前記対物レンズの像面近傍に配置され、光軸を中心に独立して回転可能な一対の偏差プリズム、又は、前記対物レンズと前記位相板の間の前記対物レンズの像面近傍又は前記位相板の入射側の近傍に配置され、前記観察光に対する傾きを調整可能な平行平板ガラスから成る光学部材と、記憶部に記憶されている、前記絞りの像と前記位相膜との位置合わせに用いる前記観察位置ごとのズレ補正量に基づいて前記光学部材を駆動して、各前記観察位置において前記絞りの像と前記位相膜との相対位置を調整する調整部とを備える。

本発明の第１の側面のプログラムは、観察位置を移動させるステージに配置される容器内のサンプルに照明光を照射して観察する位相差顕微鏡であって、前記サンプルからの観察光を集光する対物レンズと、前記対物レンズの入射側に配置された絞りと、位相膜が設けられ、前記対物レンズの射出瞳面又は前記射出瞳面と共役な瞳共役面に配置された位相板と、前記対物レンズの光軸上に配置され、前記位相膜と前記位相板上における前記絞りの像との相対位置を調整する光学部材であって、前記対物レンズと前記位相板の間の前記対物レンズの像面近傍に配置され、光軸を中心に独立して回転可能な一対の偏差プリズム、又は、前記対物レンズと前記位相板の間の前記対物レンズの像面近傍又は前記位相板の入射側の近傍に配置され、前記観察光に対する傾きを調整可能な平行平板ガラスから成る光学部材とを備える位相差顕微鏡を制御するコンピュータに、記憶部に記憶されている、前記絞りの像と前記位相膜との位置合わせに用いる前記観察位置ごとのズレ補正量に基づいて前記光学部材を駆動して、各前記観察位置において前記絞りの像と前記位相膜との相対位置を調整する処理を実行させる。

本発明の第２の側面の位相差顕微鏡は、ステージに配置される容器内のサンプルに照明光を照射して観察する位相差顕微鏡であって、対物レンズと、前記対物レンズの入射側に配置された絞りと、位相膜が設けられ、前記対物レンズの射出瞳面又は前記射出瞳面と共役な瞳共役面に配置された位相板と、前記容器内の液体に計測光を入射し、前記液体を透過した前記計測光を受光する受光部を備える計測光学系と、前記サンプルの画像又は前記位相板の画像を取得し、前記画像に基づいて前記絞りの像と前記位相膜との重なり具合を示す検出結果を出力する検出部と、前記受光部への前記計測光の入射位置に基づいて、前記液体を透過することによる前記計測光のズレ量を検出するズレ検出部と、前記液体の液面の複数の位置における前記計測光のズレ量に基づいて、前記液面の形状を算出する液面形状算出部と、前記検出部の検出結果及び前記液面の形状に基づいて、前記絞りの像と前記位相膜との位置が合うように、前記対物レンズの光軸と垂直な方向に前記位相板を移動させる調整部とを備える。

本発明の第２の側面のプログラムは、ステージに配置される容器内のサンプルに照明光を照射して観察する位相差顕微鏡であって、対物レンズと、前記対物レンズの入射側に配置された絞りと、位相膜が設けられ、前記対物レンズの射出瞳面又は前記射出瞳面と共役な瞳共役面に配置された位相板と、前記容器内の液体に計測光を入射し、前記液体を透過した前記計測光を受光する受光部を備える計測光学系とを備える位相差顕微鏡を制御するコンピュータに、前記サンプルの画像又は前記位相板の画像を取得し、前記画像に基づいて前記絞りの像と前記位相膜との重なり具合を示す検出結果を出力させる手順と、前記受光部への前記計測光の入射位置に基づいて、前記液体を透過することによる前記計測光のズレ量を検出する手順と、前記液体の液面の複数の位置における前記計測光のズレ量に基づいて、前記液面の形状を算出する手順と、前記検出結果及び前記液面の形状に基づいて、前記絞りの像と前記位相膜との位置が合うように、前記対物レンズの光軸と垂直な方向に前記位相板を移動させる手順とを実行させる。

本発明の第１の側面においては、記憶部に記憶されている、絞りの像と位相膜との位置合わせに用いる観察位置ごとのズレ補正量に基づいて、各前記観察位置において前記絞りの像と前記位相膜との相対位置が調整される。

本発明の第２の側面においては、絞りの像と位相膜との位置が合うように、前記対物レンズの光軸と垂直な方向に前記位相板が移動される。

本発明の第１の側面又は第２の側面によれば、位相差顕微鏡の絞りの像と位相膜との位置合わせを簡単に行うことができる。

本発明を適用した位相差顕微鏡の一実施の形態の外観の構成例を示す図である。 本発明を適用した位相差顕微鏡の光学系の第１の実施の形態の構成例を示す図である。 偏差プリズムユニットによる絞り像の移動方向の例を示す図である。 位相差顕微鏡の制御及び駆動を行う部分の機能の構成例を示すブロック図である。 位置合わせ制御部の第１の実施の形態の機能の構成例を示すブロック図である。 位相差顕微鏡により実行される観察処理について説明するためのフローチャートである。 絞り像位置調整処理の第１の実施の形態の詳細を説明するためのフローチャートである。 絞り像位置調整処理の第２の実施の形態の詳細を説明するためのフローチャートである。 位置合わせ制御部の第２の実施の形態の機能の構成例を示すブロック図である。 絞り像位置調整処理の第３の実施の形態の詳細を説明するためのフローチャートである。 位相板画像の例を模式的に示す図である。 位置合わせ制御部の第３の実施の形態の機能の構成例を示すブロック図である。 絞り像位置調整処理の第４の実施の形態の詳細を説明するためのフローチャートである。 位置合わせ制御部の第４の実施の形態の機能の構成例を示すブロック図である。 絞り像位置調整処理の第５の実施の形態の詳細を説明するためのフローチャートである。 位相差顕微鏡により実行されるタイムラプス観察処理の第１の実施の形態について説明するためのフローチャートである。 本発明を適用した位相差顕微鏡の光学系の第２の実施の形態の構成例を示す図である。 本発明を適用した位相差顕微鏡の光学系の第３の実施の形態の構成例を示す図である。 ステージを傾けて絞り像の位置合わせを行う方法を説明するための図である。 ステージを傾ける方法の一例を説明するための図である。 ステージを傾けて絞り像の位置合わせを行う場合の問題点を説明するための図である。 ステージのチルトと位相絞りのシフトを組み合わせて絞り像の位置合わせを行う方法について説明するための図である。 偏差プリズムユニット又は平行平板ガラスと位相絞りのシフトを組み合わせて絞り像の位置合わせを行う方法について説明するための図である。 観察光学系と計測光学系を設ける場合について説明するための図である。 位置合わせ制御部の第６の実施の形態の機能の構成例を示すブロック図である。 位相差顕微鏡により実行されるタイムラプス観察処理の第２の実施の形態について説明するためのフローチャートである。 位置合わせ制御部の第７の実施の形態の機能の構成例を示すブロック図である。 コンピュータの構成例を示すブロック図である。

以下、本発明を実施するための形態（以下、実施の形態という）について説明する。なお、説明は以下の順序で行う。
１．実施の形態
２．変形例

＜１．実施の形態＞
［位相差顕微鏡１１の構成例］
図１及び図２は、本発明を適用した位相差顕微鏡の一実施の形態を示している。図１は、位相差顕微鏡１１の外観構成例を示し、図２は、位相差顕微鏡１１の光学系の構成例を示している。

位相差顕微鏡１１には、ステージ２７が設けられており、このステージ２７上には、ウェルプレート又はシャーレなどの培養容器１２（図２）が配置される。培養容器１２には、観察対象となる細胞等のサンプル（不図示）及び培地が入れられる。

また、位相差顕微鏡１１の図１内の上側には、サンプルに照射する照明光を発する光源２１が設けられている。光源２１の種類は特に限定されるものではないが、例えば、照明均一性と長寿命性、及び、培地内のフェノールレッドが培地の劣化により色が変化し、可視広域の光を吸収することにより、培養状態によって明るさが変化することを考慮して、赤色ＬＥＤが用いられる。

光源２１から発せられた照明光は、後述する図２の光学系を介して、コンデンサレンズ２５に入射する。コンデンサレンズ２５は、照明光を集光して、ステージ２７上の培養容器１２内のサンプルに照射する。

ステージ２７は、コンデンサレンズ２５の光軸と垂直な方向（以下、Ｘ方向及びＹ方向と称する）、及び、コンデンサレンズ２５の光軸と平行な方向（以下、Ｚ方向と称する）に移動させることができる。また、ステージ２７は、後述するように、コンデンサレンズ２５の光軸に対して傾けることが可能である。

サンプルに照射された照明光は、サンプル又は培地を透過するか、又は、サンプルにおいて回析して対物レンズ２８に入射する。すなわち、照明光を照射したサンプル及びその周囲から対物レンズ２８に入射する観察光は、サンプル又は培地を透過した直接光と、サンプルにおいて回析し、サンプルの内部やサンプルと培地との境界等の形状情報を含む回析光とからなる。そして、観察光は、対物レンズ２８により集光され、後述する光学系を介してカメラ３９及び接眼レンズ４３に入射する。

カメラ３９は、対物レンズ２８から入射した観察光による像を撮影し、得られた画像を、例えば、図示せぬ他の装置に供給して表示させたり、記憶装置に記憶させたりする。観察者であるユーザは、他の装置に表示された画像を見ることでもサンプルを観察することができる。

接眼レンズ４３は、対物レンズ２８から入射した観察光を集光して、観察光による像を結像させる。これにより、ユーザは、接眼レンズ４３を介してサンプルを観察することができる。

ここで、図２を参照して、位相差顕微鏡１１の光学系の詳細について説明する。なお、図２では、位相板３７から接眼レンズ４３までの光学系の図示を省略している。

光源２１から発せられた照明光は、レンズ２２を透過した後、コレクタレンズ２３により集光され、コンデンサレンズ２５の前側焦点面（対物レンズ２８の入射瞳面又は入射瞳面に共役な面）に配置されている位相絞り２４により光束の径が絞られる。位相絞り２４の略円形の開口部を通過した照明光は、コンデンサレンズ２５を経由し、ミラー２６により光路が変更されて、培養容器１２内のサンプルに照射される。

サンプルに照射された照明光は、上述したように直接光及び回析光からなる観察光となり、対物レンズ２８に入射する。そして、観察光は、対物レンズ２８により集光され、第２対物レンズ２９を透過し、ミラー３０により光路が変更され、１次像面Ｐ１において像を結ぶ。

１次像面Ｐ１の近傍には、一対の偏差プリズム３１ａと偏差プリズム３１ｂからなる偏差プリズムユニット３１が配置されている。偏差プリズム３１ａと偏差プリズム３１ｂは、１次像面Ｐ１を挟んで対向し、対物レンズ２８等と光軸が一致するように配置されている。また、偏差プリズム３１ａ及び偏差プリズム３１ｂは、それぞれ光軸を中心に独立して回転させることができ、少なくとも一方が回転することにより、偏差プリズムユニット３１から射出される観察光が偏向される。これにより、後述するように、位相板３７への観察光の入射位置を調整し、観察光による位相絞り２４の開口部の像（以下、絞り像と称する）の結像位置を調整することができる。

ここで、偏差プリズムとは、偏角プリズム（deviation prism）とも呼ばれるプリズムである。偏差プリズムの形状は様々である。本実施の形態では、例えば、くさび形状をした偏差プリズムが使用可能である。このくさび形状とは、円柱の上面の中心と下面の中心とを結ぶ軸に対して垂直な方向から斜めに円柱を切断した形状である。

例えば、図２の偏差プリズムユニット３１の場合、各々が上記の様なくさび形状をした２つの偏差プリズム３１ａと偏差プリズム３１ｂを光軸に沿って並設した状態で使用する。さらに、偏差プリズム３１ａと偏差プリズム３１ｂは、円柱部材の上面と下面に相当する面どうしを対向させた状態で配置する。

なお、本実施の形態で使用可能な偏差プリズムは、上記のものに限定されるものではない。

偏差プリズムユニット３１から射出された観察光は、レンズ３２及びレンズ３３を透過し、ミラー３４により光路が変更され、レンズ３５及びレンズ３６を透過し、位相板３７に入射する。

位相板３７は、対物レンズ２８の射出瞳面（対物レンズ２８の後側焦点面）と共役な瞳共役面Ｐ２に配置されており、位相板３７上で、位相絞り２４の開口部の像（すなわち、絞り像）が結像する。

また、位相板３７には、光軸を中心とする円形の位相膜３７Ａが設けられている。なお、位相膜３７Ａの面積は、瞳共役面Ｐ２の視野の１０％程度に設定することが良いことが経験的に分かっている。この面積に設定することにより、培養容器１２内の培地のメニスカスにより絞り像の形状が変形しても、絞り像を位相膜３７Ａ内に収めることが可能になる。

位相板３７に入射した照明光のうち、位相膜３７Ａに入射した観察光は、光量が弱められるとともに、所定量（例えば、４分の１波長）だけ位相がシフトする。なお、位相膜３７Ａにより、観察光の位相を進めるようにしてもよいし、遅らせるようにしてもよい。一方、位相板３７の位相膜３７Ａ以外の部分に入射した観察光は、そのまま位相板３７を透過する。

従って、絞り像が位相膜３７Ａ内に収まるように調整されていれば、位相板３７に入射する観察光のうち直接光がほぼ全て位相膜３７Ａに入射し、減光されるとともに、位相がシフトする。一方、回折光のほとんどが、位相板３７の位相膜３７Ａ以外の部分に入射し、そのまま位相板３７を透過する。その結果、直接光と回折光の干渉効果を高め、高コントラストで質の高いサンプルの観察像を得ることができる。

絞り像と位相膜３７Ａの位置合わせは、偏差プリズムユニット３１を用いて行われる。
具体的には、上述したように偏差プリズムユニット３１により観察光を偏向し、瞳共役面Ｐ２（位相板３７）上の絞り像の結像位置を光軸と垂直な方向に移動させることにより位置合わせが行われる。

例えば、偏差プリズム３１ａ及び偏差プリズム３１ｂを光軸を中心に異なる角速度で回転させた場合、図３に示されるように、絞り像Ｉが瞳共役面Ｐ２上で螺旋状に移動する。
また、図示は省略するが、偏差プリズム３１ａ及び偏差プリズム３１ｂを光軸を中心に同じ方向に同じ角速度で回転させることにより、絞り像が瞳共役面Ｐ２上で光軸を中心とする円周上を周方向に移動する。さらに、図示は省略するが、偏差プリズム３１ａ及び偏差プリズム３１ｂを光軸を中心に逆方向に同じ角速度で回転させることにより、絞り像が瞳共役面Ｐ２上で光軸を中心とする径方向に直線上に移動する。

そして、偏差プリズム３１ａ及び偏差プリズム３１ｂの回転方向の位置を適切に調整することにより、絞り像が位相膜３７Ａ内に収まるように位置合わせをすることができる。

なお、偏差プリズム３１ａ及び偏差プリズム３１ｂの回転方向の位置の調整は、手動又は電動のいずれで行うようにすることも可能である。ただし、絞り像と位相膜３７Ａの位置合わせを自動で行う場合には、少なくとも電動で調整できるようにする必要がある。

なお、以下、絞り像が位相膜３７Ａ内に収まることを、絞り像と位相膜３７Ａの位置が合うと表現し、特に、絞り像の中心と位相膜３７Ａの中心が一致することを、絞り像と位相膜３７Ａの位置が一致すると表現する。

位相板３７を透過した観察光は、結像レンズ３８により、１次像面Ｐ１と共役な像面に配置されているカメラ３９内のイメージセンサ３９Ａ（の撮像面）において結像する。そして、イメージセンサ３９Ａにおいて、直接光と回折光が干渉することにより、サンプルの観察像（以下、サンプル像と称する）が形成される。

カメラ３９は、イメージセンサ３９Ａ上に結像したサンプル像等を撮影する。また、カメラ３９は、撮影の結果得られた画像を、図示せぬ他の装置に供給して表示させたり、制御部７２（図４）に供給したり、図示せぬ記憶装置に記憶させたりする。

ベルトランレンズ４０は、必要に応じて、位相板３７と結像レンズ３８の間の光路上の所定の位置に挿入される。ベルトランレンズ４０が挿入されると、瞳共役面Ｐ２の像、すなわち、位相板３７の像が、イメージセンサ３９Ａ（の撮像面）において結像する。位相板３７上には絞り像が結像しているため、その結果、絞り像と位相膜の像（以下、位相膜像と称する）を含む位相板３７の像をカメラ３９により撮影することができる。

ミラー４１は、必要に応じて、位相板３７と結像レンズ３８の間の光路上の所定の位置に挿入され、挿入された状態において、位相板３７を透過した後の観察光を光検出器４２に入射させる。

光検出器４２は、例えば、ＰＭＴ（光電子増倍管）等の入射光量の検出が可能なセンサにより構成される。光検出器４２は、ミラー４１により反射されて入射する観察光の光量を検出し、その結果を示す信号（以下、光検出信号と称する）を制御部７２（図４）に供給する。

また、図２には図示されていていないが、接眼レンズ４３は、位相板３７を透過した観察光を集光して、観察光による像を結像させる。これにより、ユーザは、接眼レンズ４３を介してサンプルを観察することができる。

図４は、位相差顕微鏡１１の制御及び駆動等を行う部分の機能の構成例を示している。

入力部７１は、例えば、ボタン、スイッチ、キー等の操作部材や入力デバイス等により構成される。ユーザは、入力部７１を介して位相差顕微鏡１１の各種の操作を行ったり、データの入力を行ったりすることができる。例えば、ユーザは、入力部７１を介して、ステージ２７の位置や傾き等を調整したり、偏差プリズムユニット３１の回転方向の位置を調整したりすることができる。

制御部７２は、カメラ３９から供給される画像、光検出器４２から供給される光検出信号、入力部７１から供給される指令やデータ等に基づいて、位相差顕微鏡１１の各部の制御を行う。例えば、制御部７２は、駆動部７３を制御することにより、ステージ２７の位置や傾き等を調整したり、偏差プリズムユニット３１の回転方向の位置を調整したりする。また、例えば、制御部７２は、カメラ３９の撮影処理の制御を行う。

駆動部７３は、例えば、ステージ２７、偏差プリズムユニット３１等の位相差顕微鏡１１の可動部分を駆動するためのアクチュエータやモータ等からなる機構により構成される。

図５は、制御部７２の機能の一部である位置合わせ制御部１０１ａの機能の構成例を示している。

位置合わせ制御部１０１ａは、絞り像と位相板３７の位相膜３７Ａとの位置合わせの制御を行う。位置合わせ制御部１０１ａは、輝度検出部１１１及び調整部１１２を含むように構成される。

輝度検出部１１１は、カメラ３９から供給される画像の輝度を検出し、検出結果を調整部１１２に供給する。

調整部１１２は、画像の輝度の検出結果に基づいて、駆動部７３を制御して、絞り像と位相膜３７Ａの位置が合うように、偏差プリズムユニット３１の回転方向の位置を調整する。

［位相差顕微鏡１１の処理］
次に、位相差顕微鏡１１の処理について説明する。

（観察処理）
まず、図６のフローチャートを参照して、位相差顕微鏡１１により実行される観察処理について説明する。

ステップＳ１において、位相差顕微鏡１１は、観察位置に培養容器１２を移動させる。
具体的には、位相差顕微鏡１１の制御部７２は、駆動部７３を制御して、培養容器１２内の観察対象となるサンプルが対物レンズ２８の光軸上に配置されるように、ステージ２７を水平方向（ＸＹ方向）に移動させる。

なお、ステージ２７の移動は、ユーザ操作によりマニュアルで行うようにしてもよいし、或いは、予め設定されている設定値に基づいて、位相差顕微鏡１１が自動で行うようにしてもよい。

ステップＳ２において、位相差顕微鏡１１は、ピント調整を行う。ピント調整の方法は、特に限定されるものはないが、例えば、位相差顕微鏡１１の制御部７２が、オートフォーカス機能を利用して、観察対象となるサンプルにピントが合うように、対物レンズ２８の上下方向（Ｚ方向）の位置を調整する。

ステップＳ３において、位相差顕微鏡１１は、絞り像位置調整処理を実行する。ここで、図７及び図８のフローチャートを参照して、絞り像位置調整処理の詳細について説明する。

なお、この絞り像位置調整処理は、サンプルの像を撮影した画像（以下、サンプル画像と称する）、又は、位相板３７の像を撮影した画像（以下、位相板画像と称する）のいずれかを用いて実行される。

（絞り像位置調整処理の第１の実施の形態）
まず、図７のフローチャートを参照して、サンプル画像を用いて絞り像位置調整処理を実行する場合について説明する。

ステップＳ２１において、位相差顕微鏡１１は、サンプルの画像を取得する。具体的には、この処理は、位相板３７と結像レンズ３８の間の光路上にベルトランレンズ４０もミラー４１も挿入されていない状態で行われ、カメラ３９のイメージセンサ３９Ａ上には、位相板３７を透過した後の観察光によるサンプル像が結像する。そして、カメラ３９は、制御部７２の制御の下に、サンプル像の撮影を行い、得られたサンプル画像を輝度検出部１１１に供給する。

ステップＳ２２において、輝度検出部１１１は、画像（サンプル画像）全体の輝度を検出する。

ステップＳ２３において、輝度検出部１１１は、輝度が閾値以下であるか否かを判定する。具体的には、位相板３７上において絞り像と位相膜３７Ａが重なる面積が大きくなるほど、観察光に含まれる直接光が減光されないため、サンプル画像の輝度は低くなる。一方、絞り像と位相膜３７Ａが重なる面積が小さくなるほど、観察光に含まれる直接光が減光されるため、サンプル画像の輝度は高くなる。従って、サンプル画像の輝度により、絞り像と位相膜３７Ａの重なり具合を把握することができる。また、閾値を適切に設定することにより、サンプル画像の輝度に基づいて、絞り像が位相膜３７Ａ内に収まっているか、或いは、位相膜３７Ａ内に収まらずにはみ出しているかを判定することが可能になる。

そして、輝度検出部１１１が、サンプル画像全体の輝度が閾値を超えていると判定した場合、すなわち、絞り像が位相膜３７Ａ内に収まっていないと想定される場合、処理はステップＳ２４に進む。

ステップＳ２４において、位置合わせ制御部１０１ａは、絞り像の位置を調整する。具体的には、輝度検出部１１１は、サンプル画像の輝度の検出結果を調整部１１２に供給する。調整部１１２は、サンプル画像全体の輝度を下げる方向に、駆動部７３を介して偏差プリズム３１ａ及び偏差プリズム３１ｂの回転方向の位置を調整する。これにより、絞り像が、位相板３７上において位相膜３７Ａ内に収まる方向に移動する。

その後、処理はステップＳ２１に戻り、ステップＳ２３において、サンプル画像の輝度が閾値以下であると判定されるまで、ステップＳ２１乃至Ｓ２４の処理が繰り返し実行される。これにより、サンプル画像の輝度が下がるように、偏差プリズム３１ａ及び偏差プリズム３１ｂの回転方向の位置が調整される。

なお、絞り像位置調整処理の開始時に、サンプル画像全体の輝度が下がる方向が不明である場合が想定される。この場合、例えば、まず偏差プリズム３１ａ及び偏差プリズム３１ｂの回転方向や回転量を変化させながら、サンプル画像の輝度が下がる方向を特定するようにすればよい。

また、例えば、サンプル画像を所定の数の領域に分割し、各領域の輝度を検出し、輝度が最も明るい領域の位置に基づいて、絞り像が位相膜３７Ａからずれている方向を特定するようにしてもよい。これにより、絞り像を位相膜３７Ａ内に収めるのに必要な偏差プリズム３１ａ及び偏差プリズム３１ｂの回転方向及び回転量を推定することができ、より迅速に絞り像の位置合わせをすることができる。

一方、ステップＳ２３において、サンプル画像の輝度が閾値以下であると判定された場合、絞り像位置調整処理は終了する。

このようにして、培養容器１２内の培地のメニスカスによる絞り像のズレが自動的に補正される。

（絞り像位置調整処理の第２の実施の形態）
次に、図８のフローチャートを参照して、位相板画像を用いて絞り像位置調整処理を実行する場合について説明する。

ステップＳ４１において、位相差顕微鏡１１は、位相板３７の画像を取得する。具体的には、まず、駆動部７３は、例えば、図示せぬターレット等を駆動して、位相板３７と結像レンズ３８の間の光路上の所定の位置にベルトランレンズ４０を挿入する。これにより、カメラ３９のイメージセンサ３９Ａ上には、絞り像及び位相膜像を含む位相板３７の像が結像する。この状態で、カメラ３９は、制御部７２の制御の下に、位相板３７の像の撮影を行い、得られた位相板画像を輝度検出部１１１に供給する。

なお、ベルトランレンズ４０の挿入は、ユーザ操作によりマニュアルで行うようにしてもよいし、或いは、位相差顕微鏡１１が自動で行うようにしてもよい。

ステップＳ４２乃至Ｓ４４の処理において、図６のステップＳ２２乃至Ｓ２４と同様の処理が行われ、ステップＳ４３において、位相板画像の輝度が閾値以下であると判定されるまで、ステップＳ４１乃至Ｓ４４の処理が繰り返し実行される。

一方、ステップＳ４３において、位相板画像の輝度が閾値以下であると判定された場合、絞り像位置調整処理は終了する。

なお、絞り像位置調整処理の終了後に、位相板３７と結像レンズ３８の間の光路上からベルトランレンズ４０が除去される。なお、ベルトランレンズ４０の除去は、ユーザ操作によりマニュアルで行うようにしてもよいし、或いは、位相差顕微鏡１１が自動で行うようにしてもよい。

このようにして、サンプル画像を用いる場合と同様に、培養容器１２内の培地のメニスカスによる絞り像のズレが自動的に補正される。また、位相板画像は、サンプル画像と比較して、絞り像の位置の変化に伴う輝度の変化量が大きいため、より正確に絞り像の位置を位相膜３７Ａに合わせることができる。

なお、サンプル画像又は位相板画像全体の輝度ではなく、例えば、画像の中央の所定の範囲の輝度など、画像の一部の輝度を用いて、絞り像の位置を調整するようにしてもよい。

また、例えば、閾値を用いずに、サンプル画像又は位相板画像の輝度が最小になるように、偏差プリズム３１ａ及び偏差プリズム３１ｂの回転方向の位置を調整するようにしてもよい。

図６に戻り、ステップＳ４において、位相差顕微鏡１１は、サンプルの撮影等を行う。
例えば、カメラ３９は、制御部７２の制御の下に、サンプル像の撮影を行い、得られたサンプル画像を図示せぬ他の装置（例えば、パーソナルコンピュータ、ディスプレイ等）に供給して表示させる。ユーザは、その他の装置に表示された画像により、サンプルを観察する。或いは、ユーザは、接眼レンズ４３を介して、位相板３７を透過した観察光によるサンプル像を観察する。

その後、観察処理は終了する。

以上のようにして、絞り像と位相膜３７Ａの位置合わせを、簡単、迅速かつ適切に行うことができる。また、培養容器１２内の培地のメニスカスの影響を受けずに、高コントラストで高品質のサンプル像を得ることができる。

さらに、位相絞り２４をシフトさせるためのステージを設けることなく、偏差プリズムユニット３１を回転させるだけのシンプルかつ安価な構成及び方法により、絞り像と位相膜３７Ａの位置合わせを行うことができる。

また、照明光が照射される領域が光軸の中心部の狭い領域内に限定され、対物レンズ２８の実質的な開口数（ＮＡ）が小さくなるため、低倍率から高倍率の広い範囲で使用することができる。また、培養容器１２の端部のサンプルを観察する場合に、照明光と培養容器１２の壁面との干渉が発生しにくくなる。

さらに、例えば９６穴のウェルプレートのように、穴の径に対する壁面の高さの比率が大きい培養容器１２では、位相絞り２４のシフトにより絞り像の位置合わせを行う場合、位相絞り２４の僅かな動きで照明光が培養容器１２の壁面と干渉してしまい、観察可能な範囲が狭くなってしまう。一方、この方法では、対物レンズ２８より後段において、絞り像の位置を調整するので、そのような現象が発生しない。

なお、以上の説明では、図６のステップＳ３において、画像の輝度を用いて絞り像の位置合わせを行う例を示したが、画像の輝度以外を用いることも可能である。

（絞り像位置調整処理の第３の実施の形態）
まず、図９乃至図１１を参照して、図６のステップＳ３の絞り像位置調整処理の第３の実施の形態について説明する。

図９は、位置合わせ制御部の第２の実施の形態である位置合わせ制御部１０１ｂの機能の構成例を示している。

位置合わせ制御部１０１ｂは、位置検出部１３１及び調整部１３２を含むように構成される。

位置検出部１３１は、カメラ３９から供給される位相板画像における絞り像と位相膜像の位置を検出し、検出結果を調整部１３２に供給する。

調整部１３２は、絞り像と位相膜像の位置の検出結果に基づいて、駆動部７３を制御して、絞り像と位相膜３７Ａの位置が合うように、偏差プリズムユニット３１の回転方向の位置を調整する。

次に、図１０のフローチャートを参照して、図６のステップＳ３の絞り像位置調整処理の第３の実施の形態について説明する。

ステップＳ６１において、図８のステップＳ４１の処理と同様に、位相板画像が取得され、取得された位相板画像が、カメラ３９から位置検出部１３１に供給される。

ステップＳ６２において、位置検出部１３１は、位相板画像の中から、絞り像と位相膜像の位置を検出する。

図１１は、位相板画像の例を模式的に示す図である。絞り像Ｉａ及び位相膜像Ｉｂとも略円形であり大きさも既知である。また、絞り像Ｉａの方が位相膜像Ｉｂより小さく、かつ、輝度が高い。従って、培地のメニスカスにより絞り像Ｉａの歪みが発生したとしても、形状認識等の方法により、位相板画像の中から２つの像を個別に検出し、各像の位置を検出することは容易である。

そこで、位置検出部１３１は、所定の方法により、位相板画像の中から絞り像及び位相膜像を個別に検出し、各像の位置（例えば、中心位置）を検出する。この検出結果に基づいて、絞り像と位相膜３７Ａの重なり具合を把握することができる。

ステップＳ６３において、位置検出部１３１は、ステップＳ６２の結果に基づいて、絞り像が位相膜像内に収まっているか否かを判定する。絞り像が位相膜像に収まっていないと判定された場合、処理はステップＳ６４に進む。

ステップＳ６４において、位置合わせ制御部１０１ｂは、絞り像の位置を調整する。具体的には、位置検出部１３１は、絞り像と位相膜像の位置の検出結果を調整部１３２に供給する。調整部１３２は、絞り像の中心が位相膜像の中心と一致する方向に絞り像が移動するように、駆動部７３を介して偏差プリズム３１ａ及び偏差プリズム３１ｂの回転方向の位置を調整する。

その後、処理はステップＳ６１に戻り、ステップＳ６３において、絞り像が位相膜像内に収まっていると判定されるまで、ステップＳ６１乃至Ｓ６４の処理が繰り返し実行される。

一方、ステップＳ６３において、絞り像が位相膜像内に収まっていると判定された場合、絞り像位置調整処理は終了する。

なお、図８の絞り像位置調整処理と同様に、絞り像位置調整処理の終了後に、位相板３７と結像レンズ３８の間の光路上からベルトランレンズ４０が除去される。

このようにして、培養容器１２内の培地のメニスカスによる絞り像のズレが自動的に補正される。また、実際に絞り像と位相膜３７Ａの相対位置を検出して、絞り像の位置合わせを行うので、上述した画像の輝度に基づいて調整する場合と比較して、より正確に位置合わせを行うことができる。

（絞り像位置調整処理の第４の実施の形態）
次に、図１２及び図１３を参照して、図６のステップＳ３の絞り像位置調整処理の第４の実施の形態について説明する。

図１２は、位置合わせ制御部の第３の実施の形態である位置合わせ制御部１０１ｃの機能の構成例を示している。

位置合わせ制御部１０１ｃは、サンプル検出部１５１、コントラスト検出部１５２、及び、調整部１５３を含むように構成される。

サンプル検出部１５１は、サンプル画像内のサンプル及びその細部を検出する。サンプル検出部１５１は、検出結果を及びサンプル画像とともにコントラスト検出部１５２に供給する。

コントラスト検出部１５２は、サンプル画像内のサンプルのコントラストの強度を検出し、検出結果を調整部１５３に供給する。

調整部１５３は、サンプル画像内のサンプルのコントラストの強度の検出結果に基づいて、駆動部７３を制御して、絞り像と位相膜３７Ａの位置が合うように、偏差プリズムユニット３１の回転方向の位置を調整する。

次に、図１３のフローチャートを参照して、図６のステップＳ３の絞り像位置調整処理の第４の実施の形態について説明する。

ステップＳ８１において、図７のステップＳ２１の処理と同様に、サンプルの画像が取得され、取得されたサンプル画像が、カメラ３９からサンプル検出部１５１に供給される。

ステップＳ８２において、サンプル検出部１５１は、画像内のサンプルを検出する。例えば、サンプル検出部１５１は、観察対象となるサンプルが細胞である場合、既知の細胞の形態情報を用いて、サンプル画像内の細胞の核や細胞膜等を検出する。サンプル検出部１５１は、検出結果をサンプル画像とともにコントラスト検出部１５２に供給する。

ステップＳ８３において、コントラスト検出部１５２は、サンプル画像内のサンプルのコントラストの強度を検出し、検出結果を調整部１５３に供給する。

ステップＳ８４において、コントラスト検出部１５２は、コントラストの強度が閾値以上であるか否かを判定する。具体的には、位相板３７上において絞り像と位相膜３７Ａが重なる面積が大きくなるほど、サンプル像における直接光と間接光の干渉が大きくなり、サンプル画像内のサンプル像のコントラストが強くなる。逆に、位相板３７上において絞り像と位相膜３７Ａが重なる面積が小さくなるほど、サンプル像における直接光と間接光の干渉が小さくなり、サンプル画像内のサンプル像のコントラストが弱くなる。従って、サンプル像のコントラストに基づいて、絞り像と位相膜３７Ａの重なり具合を把握することができる。また、閾値を適切に設定することにより、サンプル画像のコントラストの強度に基づいて、絞り像が位相膜３７Ａ内に収まっているか、或いは、位相膜３７Ａ内に収まらずにはみ出しているかを判定することが可能になる。

そして、コントラスト検出部１５２が、コントラストの強度が閾値未満であると判定した場合、すなわち、位相板３７上において絞り像が位相膜３７Ａ内に収まっていないと想定される場合、処理はステップＳ８５に進む。

ステップＳ８５において、位置合わせ制御部１０１ｄは、絞り像の位置を調整する。具体的には、コントラスト検出部１５２は、サンプル画像のコントラストの検出結果を調整部１５３に供給する。調整部１５３は、サンプル画像のコントラストが強くなる方向に、駆動部７３を介して偏差プリズム３１ａ及び偏差プリズム３１ｂの回転方向の位置を調整する。

その後、処理はステップＳ８１に戻り、ステップＳ８４において、サンプル画像のコントラストの強度が閾値以上であると判定されるまで、ステップＳ８１乃至Ｓ８５の処理が繰り返し実行される。これにより、サンプル画像のコントラストが強くなるように、偏差プリズム３１ａ及び偏差プリズム３１ｂの回転方向の位置が調整される。

なお、絞り像位置調整処理の開始時に、サンプル画像のコントラストが強くなる方向が不明である場合が想定される。この場合、例えば、偏差プリズム３１ａ及び偏差プリズム３１ｂの回転方向や回転量を変化させながら、サンプル画像のコントラストが強くなる方向を特定するようにすればよい。

一方、ステップＳ８４において、サンプル画像のコントラストが閾値以上であると判定された場合、絞り像位置調整処理は終了する。

このようにして、培養容器１２内の培地のメニスカスによる絞り像のズレが自動的に補正される。

なお、例えば、閾値を用いずに、サンプル画像のコントラストが最大になるように、偏差プリズム３１ａ及び偏差プリズム３１ｂの回転方向の位置を調整するようにしてもよい。

（絞り像位置調整処理の第５の実施の形態）
次に、図１４及び図１５を参照して、図６のステップＳ３の絞り像位置調整処理の第５の実施の形態について説明する。

図１４は、位置合わせ制御部の第４の実施の形態である位置合わせ制御部１０１ｄの機能の構成例を示している。

位置合わせ制御部１０１ｄは、調整部１７１を含むように構成される。

調整部１７１は、光検出器４２から供給される光検出信号に基づいて、駆動部７３を制御して、絞り像と位相膜３７Ａの位置が合うように、偏差プリズムユニット３１の回転方向の位置を調整する。

次に、図１５のフローチャートを参照して、図６のステップＳ３の絞り像位置調整処理の第５の実施の形態について説明する。

ステップＳ１０１において、位相差顕微鏡１１は、観察光の光量を検出する。具体的には、まず、駆動部７３は、例えば、図示せぬターレット等を駆動して、位相板３７と結像レンズ３８の間の光路上の所定の位置にミラー４１を挿入する。これにより、位相板３７を透過した後の観察光が光検出器４２に入射する。光検出器４２は、入射する観察光の光量を検出し、検出結果を示す光検出信号を調整部１７１に供給する。

ステップＳ１０２において、調整部１７１は、観察光の光量が閾値以下であるか否かを判定する。具体的には、位相板３７上において絞り像と位相膜３７Ａが重なる面積が大きくなるほど、観察光に含まれる直接光が減光される量が増えるため、観察光の光量が下がる。逆に、絞り像と位相膜３７Ａが重なる面積が小さくなるほど、観察光に含まれる直接光が減光される量が減るため、観察光の光量が上がる。従って、観察光の光量により、絞り像と位相膜３７Ａの重なり具合を把握することができる。また、閾値を適切に設定することにより、観察光の光量に基づいて、絞り像が位相膜３７Ａ内に収まっているか、或いは、位相膜３７Ａ内に収まらずにはみ出しているかを判定することが可能になる。

そして、調整部１７１が、観察光の光量が閾値を超えていると判定した場合、すなわち、絞り像が位相膜３７Ａ内に収まっていないと想定される場合、処理はステップＳ１０３に進む。

ステップＳ１０３において、調整部１７１は、絞り像の位置を調整する。具体的には、調整部１７１は、観察光の光量が下がる方向に、駆動部７３を介して偏差プリズム３１ａ及び偏差プリズム３１ｂの回転方向の位置を調整する。これにより、絞り像が、位相板３７上において位相膜３７Ａ内に収まる方向に移動する。

その後、処理はステップＳ１０１に戻り、ステップＳ１０２において、観察光の光量が閾値以下であると判定されるまで、ステップＳ１０１乃至Ｓ１０３の処理が繰り返し実行される。これにより、観察光の光量が下がるように、偏差プリズム３１ａ及び偏差プリズム３１ｂの回転方向の位置が調整される。

なお、絞り像位置調整処理の開始時に、観察光の光量が下がる方向が不明である場合が想定される。この場合、例えば、偏差プリズム３１ａ及び偏差プリズム３１ｂの回転方向や回転量を変化させながら、観察光の光量が下がる方向を特定するようにすればよい。

また、例えば、光検出器４２を複数のセンサにより構成し、観察光の光量を所定の領域毎に分割して検出し、光量が最も大きい領域の位置に基づいて、絞り像が位相膜３７Ａからずれている方向を特定するようにしてもよい。これにより、絞り像を位相膜３７Ａ内に収めるのに必要な偏差プリズム３１ａ及び偏差プリズム３１ｂの回転方向及び回転量を推定することができ、より迅速に絞り像の位置合わせをすることができる。

一方、ステップＳ１０２において、観察光の光量が閾値以下であると判定された場合、絞り像位置調整処理は終了する。

このようにして、培養容器１２内の培地のメニスカスによる絞り像のズレが自動的に補正される。

なお、例えば、閾値を用いずに、観察光の光量が最小になるように、偏差プリズム３１ａ及び偏差プリズム３１ｂの回転方向の位置を調整するようにしてもよい。

（タイムラプス観察処理）
次に、図１６のフローチャートを参照して、位相差顕微鏡１１により実行されるタイムラプス観察処理について説明する。ここで、タイムラプス観察とは、例えば、予め設定されている撮影スケジュールに基づいて、所定の時間毎にサンプルを撮影することにより、サンプルの時系列の変化を観察するものである。なお、撮影スケジュールには、例えば、各観察位置に対応するステージ２７の位置、撮影時刻等が設定されている。

なお、以下、１回の撮影タイミングにおいて、複数の観察位置において撮影を行う場合を例に挙げて説明する。これは、例えば、ウェルプレートの各ウェル内のサンプルを撮影する場合や、サンプルを複数の領域に分割してタイリング撮影を行う場合等である。

ステップＳ２０１において、位相差顕微鏡１１は、次の観察位置に培養容器１２を移動させる。具体的には、位相差顕微鏡１１の制御部７２は、撮影スケジュールに設定されている次の位置までステージ２７を水平方向に動かすことにより、次の観察位置に培養容器１２を移動させる。

ステップＳ２０２において、図６のステップＳ２の処理と同様に、ピント調整が行われる。

ステップＳ２０３において、図６のステップＳ３の処理と同様に、絞り像位置調整処理が実行される。なお、図７、図８、図１０、図１３又は図１５を参照して上述したいずれの絞り像位置調整処理を採用することも可能である。ただし、処理時間を考慮すれば、ベルトランレンズ４０やミラー４１の挿脱が不要な図７又は図１３の処理を採用することが望ましい。

なお、以下、図５の位置合わせ制御部１０１ａ及び図７の絞り像位置調整処理を採用した場合の例について説明する。

ステップＳ２０４において、調整部１１２は、ズレ補正量を記憶する。例えば、調整部１１２は、ステップＳ２０３の処理で絞り像の位置合わせを行った後の偏差プリズム３１ａ及び偏差プリズム３１ｂの回転方向の位置と所定の基準位置との差を、現在の観察位置におけるズレ補正量として、図示せぬ記憶装置に記憶させる。すなわち、この場合、ズレ補正量は、絞り像を位相膜３７Ａに合わせるために必要な偏差プリズム３１ａ及び偏差プリズム３１ｂの基準位置からの回転方向及び回転量を表す。例えば、偏差プリズム３１ａ及び偏差プリズム３１ｂがステッピングモータにより駆動される場合には、ズレ補正量は、ステッピングモータの原点からのステップ位置により表される。

ステップＳ２０５において、位相差顕微鏡１１は、撮影を行う。具体的には、カメラ３９は、制御部７２の制御の下に、サンプル像の撮影を行い、得られたサンプル画像を図示せぬ他の装置に送信したり、記憶装置に記憶させたりする。

ステップＳ２０６において、制御部７２は、全ての観察位置の撮影が終了したか否かを判定する。まだ全ての観察位置の撮影が終了していないと判定された場合、処理はステップＳ２０１に戻る。

その後、ステップＳ２０１において、全ての観察位置の撮影が終了したと判定されるまで、ステップＳ２０１乃至Ｓ２０６の処理が繰り返し実行される。これにより、全ての観察位置において、絞り像の位置合わせが行われた後、サンプル像の撮影が行われる。また、各観察位置において、絞り像を適切な位置に設定するために必要なズレ補正量が検出され、記憶される。

一方、ステップＳ２０６において、全ての観察位置の撮影が終了したと判定された場合、処理はステップＳ２０７に進む。

ステップＳ２０７において、制御部７２は、撮影スケジュールに基づいて、観察期間が終了したか否かを判定する。まだ観察期間が終了していないと判定された場合、処理はステップＳ２０８に進む。

ステップＳ２０８において、制御部７２は、撮影スケジュールに基づいて、撮影時刻になったか否かを判定する。ステップＳ２０８の判定処理は、撮影時刻になったと判定されるまで、所定の間隔で繰り返し実行され、撮影時刻になったと判定された場合、処理はステップＳ２０９に進む。

ステップＳ２０９において、制御部７２は、培地の液面の状態が変化したか否かを判定する。培地の液面の状態が変化していないと判定された場合、処理はステップＳ２１０に進む。

ステップＳ２１０において、ステップＳ２０１の処理と同様に、次の観察位置に培養容器１２が移動する。

ステップＳ２１１において、図６のステップＳ２の処理と同様に、ピント調整が行われる。

ステップＳ２１２において、調整部１１２は、記憶したズレ補正量に基づいて、絞り像の位置合わせを行う。具体的には、調整部１１２は、現在の観察位置におけるズレ補正量を、図示せぬ記憶装置から読み出す。そして、調整部１１２は、駆動部７３を制御して、偏差プリズム３１ａ及び偏差プリズム３１ｂを、所定の基準位置から、読み出したズレ補正量により表される方向及び角度だけそれぞれ回転させる。

これにより、ステップＳ２０３の処理のような絞り像位置調整処理を行わずに、絞り像の位置合わせを適切かつ迅速に行うことができる。

ステップＳ２１３において、ステップＳ２０５の処理と同様に、撮影が行われる。

ステップＳ２１４において、ステップＳ２０６の処理と同様に、全ての観察位置の撮影が終了したか否かが判定される。まだ全ての観察位置の撮影が終了していないと判定された場合、処理はステップＳ２１０に戻る。

その後、ステップＳ２１４において、全ての観察位置の撮影が終了したと判定されるまで、ステップＳ２１０乃至Ｓ２１４の処理が繰り返し実行される。これにより、全ての観察位置において、記憶しているズレ補正量を用いて絞り像の位置合わせが行われた後、サンプル像の撮影が行われる。従って、各観察位置において、高コントラストで高品質のサンプル画像を迅速に撮影することができる。

一方、ステップＳ２１４において、全ての観察位置の撮影が終了したと判定された場合、処理はステップＳ２０７に戻り、ステップＳ２０７以降の処理が実行される。

また、ステップＳ２０９において、培地の液面の状態が変化したと判定された場合、処理はステップＳ２０１に戻る。これは、例えば、前回の撮影が終了してから今回の撮影までの間に培地の交換が行われた場合等である。

その後、ステップＳ２０６において、全ての観察位置の撮影が終了したと判定されるまで、ステップＳ２０１乃至Ｓ２０６の処理が繰り返し実行される。すなわち、培地の液面の状態が変化した場合、再度各観察位置において、絞り像の位置調整をしながら撮影が行われるとともに、各観察位置におけるズレ補正量が記憶される。

一方、ステップＳ２０７において、観察期間が終了したと判定された場合、タイムラプス観察処理は終了する。

以上のようにして、タイムラプス観察を行う場合も同様に、培養容器１２内の培地のメニスカスの影響を受けずに、高コントラストで高品質のサンプル像を得ることができる。

＜２．変形例＞
以下、上述した本技術の実施の形態の変形例について説明する。

［絞り像の位置合わせ方法の変形例］
以上の説明では、偏差プリズムユニット３１を用いて、絞り像の位置合わせを行う例を示したが、他の方法を採用することも可能である。

（平行平板ガラス（ハービング）を用いる方法）
例えば、図１７に示されるように、偏差プリズムユニット３１の代わりに、平行平板ガラス２０１を用いることが可能である。

平行平板ガラス２０１は、例えば、一次像面Ｐ１の近傍（一次像面Ｐ１上を含む）に、対物レンズ２８等と光軸が一致するように配置される。平行平板ガラス２０１は、例えば、駆動部７３により観察光に対する傾きを調整できるように設置される。

或いは、平行平板ガラス２０１を、例えば、位相板３７の入射側の近傍に、位相板３７と光軸が一致するように配置することも可能である。より正確には、平行平板ガラス２０１を、位相板３７の入射側に配置されているレンズ３６の入射側の近傍に、レンズ３６及び位相板３７と光軸が一致するように配置することも可能である。

いずれの位置に平行平板ガラス２０１を設置した場合も、平行平板ガラス２０１を観察光に対して傾けることにより、平行平板ガラス２０１に入射される観察光の中心軸に対して、平行平板ガラス２０１から出射される観察光の中心軸を平行にずらすことができる。
従って、平行平板ガラス２０１の傾きを調整することにより、位相板３７への観察光の入射位置を調整し、その結果、位相板３７上の絞り像の位置を調整することができる。

従って、平行平板ガラス２０１を傾けるだけのシンプルかつ安価な構成及び方法により、絞り像と位相膜３７Ａの位置合わせを行うことができる。

なお、平行平板ガラス２０１を、一次像面Ｐ１の近傍及び位相板３７の入射側の近傍の両方に配置することも可能である。

また、平行平板ガラス２０１の傾きの調整は、手動又は電動のいずれで行うようにすることも可能である。ただし、上述したように絞り像と位相膜３７Ａの位置合わせを自動で行う場合には、少なくとも電動で調整できるようにする必要がある。

（培養容器１２を傾ける方法）
また、例えば、培養容器１２を直接または間接的に照明光に対して傾けて、培養容器１２の底面をプリズムとして機能させることにより、絞り像の位置合わせを行うことも可能である。ここで、培養容器１２を直接傾けるとは、例えば、培養容器１２を直接動かして傾けることである。一方、培養容器１２を間接的に傾けるとは、例えば、培養容器１２が置かれているステージ２７を傾けることにより、培養容器１２を傾けることである。

図１８は、培養容器１２を傾ける方法を採用した場合の位相差顕微鏡１１の光学系の構成例を示している。図１８の光学系は、図２の光学系から偏差プリズムユニット３１を削除した構成を有している。

ここで、図１９を参照して、図１８の光学系を有する位相差顕微鏡１１における絞り像の位置合わせの方法について説明する。

図１９Ａは、ステージ２７を観察光に対して傾ける前の状態を模式的に示し、図１９Ｂは、ステージ２７を観察光に対して傾けた後の状態を模式的に示している。

図１９Ａに示されるように、駆動部７３を介してステージ２７を照明光に対して傾けることにより、培養容器１２の底面が照明光に対して傾き、培養容器１２の底面で照明光が屈折する。従って、例えば、図１９Ｂに示されるように、培養容器１２の底面を左斜め上（右斜め下）に傾けることにより、観察光の進行方向は、傾ける前と比較して右方向にシフトする。一方、例えば、図１９Ｂとは逆に、培養容器１２の底面を右斜め上（左斜め下）に傾けることにより、観察光の進行方向は、傾ける前と比較して左方向にシフトする。

従って、ステージ２７を傾ける方向及び角度を変えることにより、位相板３７への観察光の入射位置を調整し、その結果、位相板３７上の絞り像の位置を調整することができる。そして、ステージ２７を傾ける方向及び角度を適切に調整することにより、絞り像の位置を位相膜３７Ａに合わせることができる。

従って、ステージ２７を傾けるだけのシンプルかつ安価な構成及び方法により、絞り像と位相膜３７Ａの位置合わせを行うことができる。

なお、培養容器１２内の観察対象となるサンプルの位置（すなわち観察位置）近傍を中心にしてステージ２７を傾けることにより、対物レンズ２８のピント位置を観察位置に合わせたままステージ２７を傾けることができる。これにより、ステージ２７を傾けた後のピント調整が不要になる。

ここで、図２０を参照して、観察位置近傍を中心にしてステージ２７を傾ける方法の一例について説明する。

図２０Ａは、ステージ２７を傾ける前の状態を示している。ステージ２７は、点Ｐ１乃至Ｐ３の３点で支持される傾斜ステージにより構成され、３点のうちのいずれか１点を支点にして傾けることが可能である。また、点Ｑは、観察位置を示している。なお、点Ｐ１乃至Ｐ３と点Ｑとの位置関係は既知であるものとする。

図２０Ｂは、点Ｐ１を支点としてステージ２７を所望の向きに所望の角度だけ傾けた状態を示している。ステージ２７を傾けることにより、点Ｑは、図２０Ａに示される最初の位置から移動する。

ここで、点Ｐ１乃至Ｐ３と点Ｑとの位置関係は既知なので、ステージ２７のチルト量に基づいて、点ＱのＸ方向、Ｙ方向、Ｚ方向のシフト量をそれぞれ算出することができる。
従って、点Ｑのシフト方向と逆方向に、ステージ２７全体をＸ方向、Ｙ方向、Ｚ方向に平行移動させることにより、点Ｑを元の位置（図２０Ａの位置）に戻すことができる。

これにより、図２０Ｃに示されるように、結果的に点Ｑを中心にステージ２７を所望の向き及び角度に傾けることができる。その結果、ステージ２７を傾ける前後で、対物レンズ２８のピント位置が点Ｑに合った状態が維持され、ステージ２７の傾きを調整した後のピント調整が不要になる。

なお、以上の説明では、ステージ２７を傾けることにより、間接的に培養容器１２を傾ける例を示したが、上述したように培養容器１２を直接傾けるようにしてもよい。例えば、ステージ２７上に設けた複数のピンにより培養容器１２を支持し、各ピンを個別に上下方向に移動させることにより、培養容器１２の傾きを調整することが可能である。

また、ステージ２７又は培養容器１２の傾きの調整は、手動又は電動のいずれで行うようにすることも可能である。ただし、上述したように絞り像と位相膜３７Ａの位置合わせを自動で行う場合には、少なくとも電動で調整できるようにする必要がある。

また、培養容器１２を傾けて絞り像の位置合わせを行う場合、位相板３７を対物レンズ２８の射出瞳面に配置するようにすることも可能である。

（培養容器１２のチルトと位相絞り２４のシフトを組み合わせる方法）
例えば、培養容器１２の端部にあるサンプルを観察しようとした場合、図２１に模式的に示されるように、培養容器１２（ステージ２７）の傾きが大きくなると、照明光が培養容器１２の壁面と干渉し、照野が制限される。これを防止するために、例えば、ステージ２７又は培養容器１２を傾けるのに加えて、位相絞り２４を光軸と垂直な方向にシフトさせることが考えられる。

図２２は、位相絞り２４から位相膜３７Ａまでの照明光及び観察光の光路を模式的に示している。なお、図２２では、位相絞り２４と位相膜３７Ａの間のコンデンサレンズ２５及び対物レンズ２８以外の光学部品、及び、光路の折り曲げの図示を省略している。

図２２Ａは、位置合わせ前の照明光及び観察光の光路を示している。この図では、培地のメニスカスにより観察光による絞り像の結像位置が位相膜３７Ａの外にはみ出している。

そこで、まず、照明光と培養容器１２の壁面との干渉の発生の有無に関わらず、位相絞り２４をシフトさせ、絞り像の位置を位相膜３７Ａに合わせる。この時点で照明光と培養容器１２の壁面との干渉が発生しなければ（照明光の一部が培養容器１２の壁面にぶつからなければ）、ここで位置合わせは終了する。

一方、図２２Ｂに示されるように、位相絞り２４をシフトさせた後、照明光と培養容器１２の壁面が干渉し、照明光のケラレが発生している場合には、図２２Ｃに示されるように、ステージ２７を傾けることにより、照明光と培養容器１２の壁面の干渉を解消させる。このとき、図１９を参照して上述した、ステージ２７のみを傾けて絞り像の位置合わせをする場合と逆方向に、ステージ２７が傾けられる。

そして、ステージ２７とともに培養容器１２が傾けられることにより、絞り像の位置がシフトする。その結果、絞り像が位相膜３７Ａからはみ出した場合には、再度位相絞り２４をシフトさせて、位相膜３７Ａ内に収まるように絞り像の位置を調整すればよい。

これにより、照明光と培養容器１２の壁面との干渉を発生させずに、培養容器１２の端部にあるサンプルを観察することが可能になる。

なお、位相絞り２４の位置の調整は、手動又は電動のいずれで行うようにすることも可能である。ただし、上述したように絞り像と位相膜３７Ａの位置合わせを自動で行う場合には、少なくとも電動で調整できるようにする必要がある。

（偏差プリズムユニット３１又は平行平板ガラス２０１と位相絞り２４のシフトを組み合わせる方法）
また、図２又は図１７の光学系において、位相絞り２４をシフトできるようにしてもよい。すなわち、偏差プリズムユニット３１又は平行平板ガラス２０１と、位相絞り２４のシフトを組み合わせて、絞り像の位置合わせを行うようにすることも可能である。

例えば、まず、図２３の点線で示されるように、照明光と培養容器１２の壁面との干渉が発生しているか否かに関わらず、偏差プリズムユニット３１又は平行平板ガラス２０１を用いて、絞り像の位置を位相膜３７Ａに合わせる。照明光と培養容器１２の壁面との干渉が発生していない場合には、ここで位置合わせは終了する。

一方、照明光と培養容器１２の壁面との干渉が発生している場合には、位相絞り２４の光軸が培養容器１２の中央に近づく方向に位相絞り２４をシフトする。これにより、図２３の実線で示されるように、照明光と培養容器１２の壁面との干渉が解消される一方、メニスカスの影響が大きくなり、位相板３７上において、位相絞り２４をシフトさせた方向と逆方向に絞り像がシフトする。その結果、絞り像が位相膜３７Ａからはみ出した場合には、再度偏差プリズムユニット３１又は平行平板ガラス２０１を用いて、絞り像の位置を調整するようにすればよい。

これにより、照明光と培養容器１２の壁面との干渉を発生させずに、培養容器１２の端部にあるサンプルを観察することが可能になる。

なお、位相絞り２４とコンデンサレンズ２５の間に照明光の輝度ムラを軽減するためのフライアイレンズを設け、位相絞り２４の代わりに、フライアイレンズを光軸と垂直な方向にシフトすることにより、絞り像の位置を調整するようにしてもよい。

また、位相絞り２４のシフトのみを用いて、絞り像と位相膜３７Ａの位置合わせを行うようにすることも可能である。

［光学系を複数設ける例］
以上の説明では、位相差顕微鏡１１に光学系を１つのみ設ける例を示したが、２つ以上設けるようにすることも可能である。

（同じ光学系を複数設ける場合）
例えば、図２、図１７又は図１８に示される光学系を複数設けるようにすることが可能である。この場合、各光学系を全く独立させることも可能であるし、一部を共有することも可能である。一部を共有する場合、例えば、ステージのみを共有することが考えられる。また、例えば、光源２１からコンデンサレンズ２５までの照明系及び対物レンズ２８を光学系毎に個別に設け、対物レンズ２８より後の部品を共有することが考えられる。なお、図１８の光学系を採用する場合には、ステージの傾きにより絞り像の位置を調整するため、光学系毎にステージを個別に設けるようにすることが望ましい。

例えば、同じ光学系を２つ設けるようにした場合、一方の光学系（以下、光学系Ａと称する）でウェルプレートの１つのウェル内のサンプルを観察するのに並行して、他方の光学系（以下、光学系Ｂと称する）で次に観察するウェルに対する絞り像の位置合わせを行うことができる。そして、光学系Ａによる観察が終わると直ぐに光学系Ｂによる観察を開始し、それと並行して、光学系Ａにより次に観察するウェルに対する絞り像の位置合わせを行うことができる。これを繰り返すことにより、ウェルプレートの各ウェル内のサンプルを迅速に観察しながら、サンプルの像質を向上させることも可能になる。

また、光学系Ａと光学系Ｂが全く独立している場合、全く独立に並行してサンプルの観察を行うようにすることも可能であるし、各光学系で役割を分担するようにすることも可能である。後者の場合、例えば、光学系Ａでズレ補正量の検出を用い、光学系Ｂで検出されたズレ補正量を用いて絞り像と位相膜３７Ａの位置合わせを行い、サンプルの観察を行うようにすることが可能である。

（メニスカスによる光束のズレを検出するための光学系を独立して設ける場合）
また、例えば、図２４に模式的に示されるように、サンプルの観察を行うための観察光学系３０１とは別に、培養容器１２内の培地のメニスカスによる光束のズレを計測するための計測光学系３０２を独立して設けるようにすることも可能である。

なお、以下、培養容器１２としてウェルプレート３０３を用いた場合の例について説明する。

観察光学系３０１には、図２、図１７又は図１８を参照して上述した光学系のうちのいずれかを用いることが可能である。ただし、観察光学系３０１では、上述したような絞り像と位相膜３７Ａの重なり具合を示すデータの検出は行われない。

なお、以下、観察光学系３０１に図２の光学系を採用した場合の例について説明する。

計測光学系３０２は、計測光を用いて、ウェルプレート３０３の各ウェル内の培地を透過することによる光束のズレ、すなわち、培地のメニスカスによる光束のズレを計測するための光学系である。

計測光には、指向性に優れ、径が十分に小さい光を用いることが望ましい。また、計測光の光源に、観察光学系３０１と同じ光源２１を用いるようにしてもよいし、或いは、別の光源を用いるようにしてもよい。観察光学系３０１と同じ光源２１を用いる場合には、例えば、光源２１から発せられる照明光からピンホールやレンズ等を用いて計測光を生成し、その計測光を、光ファイバ等を用いてコレクタレンズ２３に入射させることが考えられる。

そして、計測光は、傾斜させずに水平な状態のステージ２７に対して垂直な方向にコンデンサレンズ２５から出射され、ステージ２７上のウェルプレート３０３の各ウェルの観察位置に、ウェルの底面に対して垂直に入射される。そして、観察位置がウェルのほぼ中央である場合、図２４の計測光Ｌ１のように、そのまま直進し、観察位置がウェルの壁面に近い場合、計測光Ｌ２のように、培地のメニスカスにより屈折される。

ウェルプレート３０３及びステージ２７を透過した計測光は、観察光学系３０１の対物レンズ２８等の光学部品を介さずに、直接イメージセンサ３９Ａに入射する。なお、計測光の光路を変更し、イメージセンサ３９Ａに導くためのミラーを、観察光学系３０１のもの（例えば、図２のミラー３０及びミラー３４）と共用するようにしてもよいし、観察光学系３０１とは別に設けるようにしてもよい。

また、それぞれ個別に光学部品、ステージ及びイメージセンサを設け、観察光学系３０１と計測光学系３０２を独立させるようにしてもよい。なお、観察光学系３０１と計測光学系３０２を独立させた場合でも、光源は共有することが可能である。

図２５は、図２４の光学系を位相差顕微鏡１１に採用した場合に、制御部７２（図４）により実現される機能の一部である位置合わせ制御部３５１の機能の構成例を示している。

位置合わせ制御部３５１は、ズレ検出部３６１及び調整部３６２を含むように構成される。

ズレ検出部３６１は、カメラ３９から供給される、計測光の像を撮影した画像に基づいて、計測光の（中心軸の）ズレ量を検出する。具体的には、図２４に示されるように、計測光の（中心軸の）光路は、計測光Ｌ１のようにウェル内の培地のメニスカスにより屈折しない場合に、イメージセンサ３９Ａの所定の基準位置（画素）に入射するように調整されている。そこで、ズレ検出部３６１は、イメージセンサ３９Ａへの計測光の入射位置と基準位置との差を計測光のズレ量として検出する。ズレ検出部３６１は、検出結果を調整部３６２に供給する。

調整部３６２は、計測光のズレ量に基づいて、駆動部７３を制御して、絞り像と位相膜３７Ａの位置が合うように、偏差プリズムユニット３１の回転方向の位置を調整する。

従って、この光学系では、ウェルプレート３０３の１つのウェル内のサンプルの観察と並行して、これから観察するウェルにおける計測光のズレ量の検出を行うことができる。
これにより、複数のサンプルを迅速に観察するとともに、各サンプルの像質を向上させることができる。

同様に、例えば、シャーレやウェルプレートのウェル内のサンプルを複数の領域に分割してタイリング撮影を行う場合に、１つの観察位置の撮影を行いながら、これから撮影する観察位置における計測光のズレ量の検出を行うことができる。これにより、迅速にタイリング撮影を行うとともに、タイリング撮影により得られる画像の画質を向上させることができる。

なお、観察光学系３０１と計測光学系３０２を独立させた場合、例えば、観察光学系３０１を用いて１つのウェルプレートを観察しながら、計測光学系３０２を用いて別のウェルプレートにおける計測光のズレ量の検出を行うことができる。また、例えば、観察光学系３０１を用いてタイリング撮影を行いながら、計測光学系３０２を用いて別の培養容器のタイリング撮影の各観察位置における計測光のズレ量の検出を行うことができる。

ここで、図２６のフローチャートを参照して、図２４の光学系を位相差顕微鏡１１に採用した場合に位相差顕微鏡１１により実行されるタイムラプス観察処理について説明する。

ステップＳ３０１において、図１６のステップＳ２０１の処理と同様に、次の観察位置に培養容器１２が移動される。

ステップＳ３０２において、位相差顕微鏡１１は、計測光のズレ量を検出する。具体的には、カメラ３９は、制御部７２の制御の下に、照明光を照射せずに計測光のみを照射した状態で撮影を行い、得られた画像をズレ検出部３６１に供給する。

ズレ検出部３６１は、画像内の計測光の像の位置を検出し、その像の位置と所定の基準位置との差を計測光のズレ量として検出する。なお、この基準位置は、計測光が屈折せずにイメージセンサ３９Ａに入射した場合の計測光の像の画像上の位置に設定されている。

ステップＳ３０３において、位置合わせ制御部３５１は、ズレ量を記憶する。具体的には、ズレ検出部３６１は、ズレ量の算出結果を調整部３６２に供給する。調整部３６２は、現在の観察位置とズレ量を対応付けて、図示せぬ記憶装置に記憶させる。

ステップＳ３０４において、ズレ検出部３６１は、全ての観察位置においてズレ量を検出したか否かを判定する。まだ全ての観察位置においてズレ量を検出していないと判定された場合、処理はステップＳ３０１に戻る。

その後、ステップＳ３０４において、全ての観察位置においてズレ量が検出されたと判定されるまで、ステップＳ３０１乃至Ｓ３０４の処理が繰り返し実行される。これにより、タイムラプス観察を行う前に、全ての観察位置において計測光のズレ量が検出される。

一方、ステップＳ３０４において、全ての観察位置においてズレ量が検出されたと判定された場合、処理はステップＳ３０５に進む。

ステップＳ３０５において、図１６のステップＳ２０９の処理と同様に、培地の液面の状態が変化したか否かが判定される。培地の液面の状態が変化していないと判定された場合、処理はステップＳ３０６に進む。

ステップＳ３０６において、図１６のステップＳ２０８の処理と同様に、撮影時刻になったか否かが判定される。撮影時刻になっていないと判定された場合、処理はステップＳ３０５に戻る。

その後、ステップＳ３０５において、培地の液面の状態が変化したと判定されるか、ステップＳ３０６において、撮影時刻になったと判定されるまで、ステップＳ３０５及びＳ３０６の処理が繰り返し実行される。

一方、ステップＳ３０６において、撮影時刻になったと判定された場合、処理はステップＳ３０７に進む。

ステップＳ３０７において、図１６のステップＳ２０１の処理と同様に、次の観察位置に培養容器１２が移動される。

ステップＳ３０８において、図６のステップＳ２の処理と同様に、ピント調整が行われる。

ステップＳ３０９において、調整部３６２は、記憶したズレ量に基づいて、絞り像の位置合わせを行う。具体的には、調整部３６２は、現在の観察位置におけるズレ量に基づいて、位相板３７上における絞り像と位相膜３７Ａのズレ量を算出する。この絞り像と位相膜３７Ａのズレ量は、例えば、絞り像の中心と位相膜３７Ａの中心との差により表される。

なお、観察光学系３０１及び計測光学系３０２を構成する部品の特性及び位置は既知なので、それらのデータを用いることにより、計測光のズレ量に基づいて、絞り像の中心と位相膜３７Ａのズレ量を容易に算出することができる。

さらに、調整部３６２は、絞り像のズレ量に基づいて、絞り像を位相膜３７Ａに一致させるために必要な偏差プリズム３１ａ及び偏差プリズム３１ｂの回転方向及び回転量を算出する。そして、調整部３６２は、駆動部７３を制御して、偏差プリズム３１ａ及び偏差プリズム３１ｂを、所定の基準位置から算出した回転方向及び回転量だけそれぞれ回転させる。これにより、絞り像と位相膜３７Ａの位置が一致する。

なお、各観察位置における絞り像と位相膜３７Ａのズレ量を事前に算出し、光軸のズレ量の代わりに記憶しておき、絞り像の位置合わせに用いるようにしてもよい。

ステップＳ３１０において、図１６のステップＳ２０５の処理と同様に、撮影が行われる。

ステップＳ３１１において、図１６のステップＳ２０６の処理と同様に、全ての観察位置の撮影が終了したか否かが判定される。まだ全ての観察位置の撮影が終了していないと判定された場合、処理はステップＳ３０７に戻る。

その後、ステップＳ３１１において、全ての観察位置の撮影が終了したと判定されるまで、ステップＳ３０７乃至Ｓ３１１の処理が繰り返し実行される。

一方、ステップＳ３１１において、全ての観察位置の撮影が終了したと判定された場合、処理はステップＳ３１２に進む。

ステップＳ３１２において、図１６のステップＳ２０８の処理と同様に、観察期間が終了したか否かが判定される。まだ観察期間が終了していないと判定された場合、処理はステップＳ３０５に戻り、ステップＳ３０５以降の処理が実行される。

一方、ステップＳ３０５において、培地の液面の状態が変化したと判定された場合、処理はステップＳ３０１に戻り、ステップＳ３０１以降の処理が実行される。すなわち、培地の液面の状態が変化した場合、各観察位置における計測光のズレ量の再検出が行われる。

また、ステップＳ３１２において、観察期間が終了したと判定された場合、タイムラプス観察処理は終了する。

以上のようにして、タイムラプス観察を行う場合に、培地のメニスカスの影響を受けずに、高コントラストで高品質のサンプル像を得ることができる。

また、培地交換等により培地の液面の状態が変化した場合、撮影処理を行う前に、計測光のズレ量の再検出が行われるため、撮影処理のスループットが向上し、１回あたりの撮影時間を短縮することができる。

なお、計測光のズレ量の検出処理時に、サンプルの位置情報や光量情報を取得するようにしてもよい。これにより、撮影時の位置出し、光量調整の処理時間を短縮することができ、撮影処理のスループットをさらに向上させることができる。

また、例えば、タイリング撮影を行う場合、互いに近接する観察位置では、メニスカスによる光束の屈折率は大きく変化しないため、計測光のズレ量の差は小さいと考えられる。そこで、タイリング撮影を行う場合には、例えば、適度に観察位置を間引いてズレ量の検出を行い、補間法等の各種の手法を用いて、未検出の観察位置におけるズレ量を求めるようにしてもよい。

さらに、計測光学系３０２において、培養容器１２の下方から計測光を入射した場合も同様に、培地のメニスカスにより計測光が屈折する。従って、培養容器１２の下方から底面に対して垂直に計測光を入射し、培養容器１２の上方でイメージセンサにより計測光を受光して、計測光のズレ量を検出するようにすることも可能である。

また、以上の説明では、計測光の入射位置を検出するための受光部としてイメージセンサを用いる例を示したが、例えば、複数の光センサを用いるようにしてもよい。

［培地の液面の形状に基づいて絞り像の位置合わせを行う例］
また、例えば、計測光学系３０２を用いて検出した計測光のズレ量に基づいて、培地の液面の形状（Ｒ形状）を算出し、培地の液面の形状に基づいて、絞り像の位置合わせを行うようにしてもよい。

図２７は、培地の液面の形状により絞り像の位置合わせを行う場合に、制御部７２（図４）により実現される機能の一部である位置合わせ制御部３７１の機能の構成例を示している。

位置合わせ制御部３７１は、ズレ検出部３８１、液面形状算出部３８２、及び、調整部３８３を含むように構成される。

ズレ検出部３８１は、図２５のズレ検出部３６１と同様の機能を有しており、培地の液面の複数の位置における計測光のズレ量を検出し、検出結果を液面形状算出部３８２に供給する。

液面形状算出部３８２は、培地の液面の各位置における計測光のズレ量に基づいて、培地の液面の形状を算出し、その結果を調整部３８３に供給する。例えば、計測光のズレ量から、培地の液面の各位置における計測光の屈折方向及び屈折角等を求めることができ、その結果から培地の液面の形状を容易に検出することができる。

調整部３８３は、培地の液面の形状に基づいて、位相板３７上における絞り像と位相膜３７Ａのズレ量を算出し、そのズレ量を補正するように、駆動部７３を制御して、偏差プリズム３１ａ及び偏差プリズム３１ｂを回転させ、絞り像の位置合わせを行う。

これにより、計測光のズレ量に基づいて絞り像の位置合わせを行う場合と比較して、絞り像のズレ量の計算量が少なくてすみ、絞り像の位置合わせの処理時間を短くすることができる。

また、例えば、同じ培養容器及び同じ培地を使用する場合、培地の液面の形状は、基本的にほぼ同じになる。従って、一度培地の液面の形状を求めておけば、以降同じ培養容器及び同じ培地を使用する場合に、そのデータを流用することができ、培地の液面の形状の再検出が不要になる。

［培地の液面情報の取得方法の変形例］
なお、培地の液面に関する情報（以下、液面情報と称する）を他の方法により取得し、取得した液面情報に基づいて、絞り像の位置合わせを行うようにしてもよい。そのような液面情報として、例えば、液面の高さ及び曲率を用いることが考えられる。

液面の高さを計測する方法としては、例えば、以下の２つの方法が考えられる。

１．パルスレーザを液面から鉛直方向に照射し、培養容器１２の底面からの反射光が検出器に到達するまでの時間を計測する方法
２．導電性のプローブを培地に挿入して液深を直接計測する方法

液面の曲率を計測する方法としては、例えば、以下の６つの方法が考えられる。

１．導電性のプローブを液面に直接接触させて、接触位置の高さ方向の情報をマッピングして求める方法。なお、この方法では、液面の高さと曲率を同時に計測することが可能である。
２．斜めから光を当てて撮影した容器全体のマクロ画像の輝度分布から求める方法
３．ミクロ画像の輝度情報の２次元配列からＲ面を近似して算出する方法
４．培養容器１２の横からＲ形状と高さを読み取る方法
５．入射角０＜θ＜９０°で液面に入射させた光の正反射光を検出して２次元マッピングして算出する方法
６．液面の上から風を吹きつけて、曲率が大きいほど波紋間距離が小さくなる関係に基づいて、波紋の伝搬パターンから計算する方法

なお、培地の液面の高さと曲率を適切に間引いて計測し、補間法等の各種の手法を用いて、間引いた位置の液面の高さと曲率を求めるようにしてもよい。

そして、例えば、計測した液面情報をステージ２７上の位置と対応付けて記憶しておき、観察対象となるサンプルのステージ２７上の位置に基づいて、そのサンプルの位置における培地の液面の高さと曲率から当該位置における照明光の屈折方向を算出することができる。さらに、その結果に基づいて、位相板３７上における絞り像のズレ量を算出し、算出したズレ量に基づいて、絞り像の位置合わせを行うことができる。

なお、例えば、液面情報の実測を行わずに、サンプルを保持する培養容器１２の形状及び大きさに基づいて、標準的な液面情報を算出して用いるようにしてもよい。この場合、培養容器１２の形状及び大きさ、並びに、培養容器１２の中心のステージ２７上での位置（以下、単に中心位置とも称する）の各情報が必要になる。

それらの各情報を取得する方法として、例えば、以下の３つの方法が考えられる。

１．事前に使用することが想定される全ての培養容器１２の形状及び大きさを含む情報（以下、容器情報と称する）を取得し、ステージ２７上の設置位置（設置座標）とともに記憶しておき、使用する培養容器１２を判別して、該当する容器情報を取得する方法

なお、使用する培養容器１２を判別する方法として、例えば、以下の２つの方法が考えられる。

１ａ．ユーザに培養容器１２のメーカ、製品名等の製品情報を入力させる方法

１ｂ．ステージ２７の端から移動しながらミクロ画像を撮影し、培養容器１２全体の輪郭を検出し、検出した輪郭の形状を、記憶している容器情報と照合する方法。ミクロ画像から容器の輪郭を求める方法としては、例えば、輝度値、又は、隣接微小空間間のコントラスト差の２次元マップを作成し、その分布に基づいて求めることが可能である。

なお、培養容器１２がウェルプレートにより構成される場合、ミクロ画像を連続撮影することより、容器の輪郭（外形及びウェル部分）と各ウェルの中心位置を検出することが可能である。この場合、容器全体の輪郭を実測してもよいし、輪郭の一部を計測して等倍することで全体の値を得てもよい。

２．マクロ撮影により培養容器１２全体を撮影し、得られた画像に基づいて、容器の形状及び大きさ並びに中心位置を検出する方法。なお、この方法では、テンプレート画像を用いたパターンマッチングの手法を適用することが可能である。

３．レーザ光等の計測光を培養容器１２に入射し、容器の底面から容器の形状と中心位置を検出する方法

培養容器１２がプラスチック製である場合、プラスチック容器の成型の特性上、容器の端部において底面に凸状構造が形成される。従って、対物レンズ２８の中心を通るレーザ光を容器の底面に当てると、容器端では底面の表面が平らでないため、戻り光が減少する。一方、容器の中心部では底面が平坦なため、容器全体を２次元的にスキャンして戻り光の強度のマッピングを行うことにより、容器端と中心位置を検出することができ、その結果から容器の形状と大きさを割り出すことができる。

なお、計測光は、必ずしも対物レンズ２８を通す必要はなく、例えば、対物レンズ２８の近傍から入射して、別途設けた検出器により反射光を検出するようにしてもよい。

また、底面がガラス製の場合でも、底面自体の平坦性は一様であるが、側面（壁面）部があるので、この３番目の方法を応用することが可能である。

そして、例えば、上述した３つの方法のいずれかにより、培養容器１２の形状及び大きさ、並びに、中心位置を求める。また、培養容器１２の形状及び大きさに基づいて、培地の液面の高さ及び曲率を推測する。さらに、サンプルの観察位置のステージ２７上の位置、及び、培養容器１２の中心位置に基づいて、当該観察位置の培養容器１２内における位置を求め、その位置の培地の液面の高さと曲率から当該位置における照明光の屈折方向を算出することができる。そして、その結果に基づいて、位相板３７上における絞り像のズレ量を算出し、算出したズレ量に基づいて、絞り像の位置合わせを行うことができる。

［計測光のズレ量を用いた画像補正］
また、計測光のズレ量に基づいて、サンプル画像の補正を行う画像処理部を設けるようにすることも可能である。

例えば、培地のメニスカスにより照明光が屈折することにより、対物レンズ２８の射出瞳面及び瞳共役面において絞り像の輝度のムラが生じ、これにより、イメージセンサ３９Ａにより撮影されるサンプル画像上でシェーディングが発生する。

そこで、例えば、各観察位置における計測光のズレ量及びその方向に基づいて、シェーディングの方向を特定することが可能なので、特定した方向に対してシェーディング補正を行うことにより、サンプル画像の輝度のムラを補正することが可能である。

［位相絞り及び位相膜の形状の変形例］
また、以上の説明では、位相絞り２４の開口部及び位相膜３７Ａの形状を円形にする例を示したが、他の形状にすることも可能である。例えば、従来の位相差顕微鏡と同様にリング状にすることも可能である。

なお、円形にした場合とリング状にした場合とを比較すると、サンプルに照射する照明光の光量が同じになるように、位相絞り２４の開口部の面積を同じにした場合、開口部の径は、円形よりリング状の方が大きくなる。従って、円形の方が、リング状よりも培地のメニスカスによる形状の歪みが小さくなり、絞り像と位相膜３７Ａの位置合わせが容易になり、サンプル像のコントラストがより鮮明になる。一方、リング状の方が、円形よりも実質的な開口数（ＮＡ）が大きくなるため、サンプル像の解像度が向上する。

［絞り像と位相膜３７Ａの位置合わせ方法の変形例］
以上の説明では、絞り像を移動させて、絞り像と位相膜３７Ａの位置合わせを行う例を示したが、位相板３７（位相膜３７Ａ）、又は、絞り像と位相板３７（位相膜３７Ａ）の両方を移動させて、絞り像と位相膜３７Ａの相対位置を調整するようにしてもよい。

なお、位相板３７を移動させるようにした場合には、位相板３７を、瞳共役面ではなく、対物レンズ２８の射出瞳面に配置することも可能である。

また、位相板３７を物理的に動かすことにより位相膜３７Ａを移動させる方法以外にも、例えば、AOMやAOTF等の音響光学素子により位相板３７を構成し、位相板３７内で電子的な位相膜３７Ａを生成及び移動させるようにしてもよい。

上述した制御部７２、位置合わせ制御部１０１ａ乃至１０１ｄ、位置合わせ制御部３５１、及び、位置合わせ制御部３７１の一連の処理は、ハードウエアにより実行することもできるし、ソフトウエアにより実行することもできる。一連の処理をソフトウエアにより実行する場合には、そのソフトウエアを構成するプログラムが、コンピュータにインストールされる。ここで、コンピュータには、専用のハードウエアに組み込まれているコンピュータや、各種のプログラムをインストールすることで、各種の機能を実行することが可能な、例えば汎用のパーソナルコンピュータなどが含まれる。

図２８は、上述した一連の処理をプログラムにより実行するコンピュータのハードウエアの構成例を示すブロック図である。

コンピュータにおいて、CPU（Central Processing Unit）５０１，ROM（Read Only Memory）５０２，RAM（Random Access Memory）５０３は、バス５０４により相互に接続されている。

バス５０４には、さらに、入出力インタフェース５０５が接続されている。入出力インタフェース５０５には、入力部５０６、出力部５０７、記憶部５０８、通信部５０９、及びドライブ５１０が接続されている。

入力部５０６は、キーボード、マウス、マイクロフォンなどよりなる。出力部５０７は、ディスプレイ、スピーカなどよりなる。記憶部５０８は、ハードディスクや不揮発性のメモリなどよりなる。通信部５０９は、ネットワークインタフェースなどよりなる。ドライブ５１０は、磁気ディスク、光ディスク、光磁気ディスク、又は半導体メモリなどのリムーバブルメディア５１１を駆動する。

以上のように構成されるコンピュータでは、CPU５０１が、例えば、記憶部５０８に記憶されているプログラムを、入出力インタフェース５０５及びバス５０４を介して、RAM５０３にロードして実行することにより、上述した一連の処理が行われる。

コンピュータ（CPU５０１）が実行するプログラムは、例えば、パッケージメディア等としてのリムーバブルメディア５１１に記録して提供することができる。また、プログラムは、ローカルエリアネットワーク、インターネット、デジタル衛星放送といった、有線または無線の伝送媒体を介して提供することができる。

コンピュータでは、プログラムは、リムーバブルメディア５１１をドライブ５１０に装着することにより、入出力インタフェース５０５を介して、記憶部５０８にインストールすることができる。また、プログラムは、有線または無線の伝送媒体を介して、通信部５０９で受信し、記憶部５０８にインストールすることができる。その他、プログラムは、ROM５０２や記憶部５０８に、あらかじめインストールしておくことができる。

なお、コンピュータが実行するプログラムは、本明細書で説明する順序に沿って時系列に処理が行われるプログラムであっても良いし、並列に、あるいは呼び出しが行われたとき等の必要なタイミングで処理が行われるプログラムであっても良い。

さらに、本技術の実施の形態は、上述した実施の形態に限定されるものではなく、本技術の要旨を逸脱しない範囲において種々の変更が可能である。

また、上述のフローチャートで説明した各ステップは、１つの装置で実行する他、複数の装置で分担して実行することができる。

さらに、１つのステップに複数の処理が含まれる場合には、その１つのステップに含まれる複数の処理は、１つの装置で実行する他、複数の装置で分担して実行することができる。

１１ 位相差顕微鏡， １２ 培養容器， ２１ 光源， ２３ コレクタレンズ， ２４ 位相絞り， ２５ コンデンサレンズ， ２７ ステージ， ２８ 対物レンズ， ２９ 第２対物レンズ， ３１ 偏差プリズムユニット， ３１ａ，３１ｂ 偏差プリズム， ３７ 位相板， ３７Ａ 位相膜， ３８ 結像レンズ， ３９ カメラ， ３９Ａ イメージセンサ， ４０ ベルトランレンズ， ４１ ミラー， ４２ 光検出器， ４３ 接眼レンズ， ７２ 制御部， ７３ 駆動部， １０１ａ乃至１０１ｄ 位置合わせ制御部， １１１ 輝度検出部， １１２ 調整部， １３１ 位置検出部， １３２ 調整部， １５１ サンプル検出部， １５２ コントラスト検出部， １５３ 調整部， １７１ 調整部， ２０１ 平行平板ガラス， ３０１ 観察光学系， ３０２ 計測光学系， ３０３ ウェルプレート， ３５１ 位置合わせ制御部， ３６１ ズレ検出部， ３６２ 調整部， ３７１ 位置合わせ調整部， ３８１ ズレ検出部， ３８２ 液面計状算出部， ３８３ 調整部

Claims (18)

1. 観察位置を移動させるステージに配置される容器内のサンプルに照明光を照射して観察する位相差顕微鏡であって、
   前記サンプルからの観察光を集光する対物レンズと、
   前記対物レンズの入射側に配置された絞りと、
   位相膜が設けられ、前記対物レンズの射出瞳面又は前記射出瞳面と共役な瞳共役面に配置された位相板と、
   前記対物レンズの光軸上に配置され、前記位相膜と前記位相板上における前記絞りの像との相対位置を調整する光学部材であって、前記対物レンズと前記位相板の間の前記対物レンズの像面近傍に配置され、光軸を中心に独立して回転可能な一対の偏差プリズム、又は、前記対物レンズと前記位相板の間の前記対物レンズの像面近傍又は前記位相板の入射側の近傍に配置され、前記観察光に対する傾きを調整可能な平行平板ガラスから成る光学部材と、
   記憶部に記憶されている、前記絞りの像と前記位相膜との位置合わせに用いる前記観察位置ごとのズレ補正量に基づいて前記光学部材を駆動して、各前記観察位置において前記絞りの像と前記位相膜との相対位置を調整する調整部と
   を備える位相差顕微鏡。
2. 前記ズレ補正量は、前記観察位置における前記絞りの像と前記位相膜とのずれに基づいて算出される
   請求項１に記載の位相差顕微鏡。
3. 前記ズレ補正量は、前記絞りの像と前記位相膜との相対位置を調整した後の前記光学部材の位置と前記光学部材の所定の基準位置との差である
   請求項１に記載の位相差顕微鏡。
4. 前記調整部は、前記絞りの像と前記位相膜との位置が合うように、前記対物レンズの光軸と垂直な方向に前記絞りの像又は前記位相板を移動させる
   請求項１乃至３のいずれかに記載の位相差顕微鏡。
5. 前記調整部は、前記絞りの像と前記位相膜との位置が合うように、前記対物レンズの光軸と垂直な方向に前記絞りの像と前記位相板との両方を移動させる
   請求項１乃至３のいずれかに記載の位相差顕微鏡。
6. 前記観察位置における前記容器内の液面の状態が変化したか否かを判定する制御部を
   さらに備え、
   前記調整部は、前記容器内の液面の状態が変化していないと判定された場合、前記記憶部に記憶されている前記観察位置ごとの前記ズレ補正量に基づいて、各前記観察位置において前記絞りの像と前記位相膜との相対位置を調整し、前記容器内の液面の状態が変化していると判定された場合、前記ズレ補正量を用いずに、各前記観察位置において前記絞りの像と前記位相膜との相対位置を調整する
   請求項１乃至５のいずれかに記載の位相差顕微鏡。
7. 前記調整部は、前記容器内の液面の状態が変化していると判定された場合、各前記観察位置において前記絞りの像と前記位相膜との相対位置を調整した後の前記ズレ補正量を前記記憶部に記憶させる
   請求項６に記載の位相差顕微鏡。
8. 前記調整部は、１回目の観察時に、前記ズレ補正量を用いずに、各前記観察位置において前記絞りの像と前記位相膜との相対位置を調整し、前記絞りの像と前記位相膜との相対位置を調整した後の前記ズレ補正量を前記記憶部に記憶させる
   請求項６又は７に記載の位相差顕微鏡。
9. 前記絞りの像と前記位相膜との重なり具合を示すデータを検出する検出部を
   さらに備え、
   前記調整部は、前記容器内の液面の状態が変化していると判定された場合、検出された前記データに基づいて、各前記観察位置において前記絞りの像と前記位相膜との相対位置を調整する
   請求項６乃至８のいずれかに記載の位相差顕微鏡。
10. 観察位置を移動させるステージに配置される容器内のサンプルに照明光を照射して観察する位相差顕微鏡であって、
    前記サンプルからの観察光を集光する対物レンズと、
    前記対物レンズの入射側に配置された絞りと、
    位相膜が設けられ、前記対物レンズの射出瞳面又は前記射出瞳面と共役な瞳共役面に配置された位相板と、
    前記対物レンズの光軸上に配置され、前記位相膜と前記位相板上における前記絞りの像との相対位置を調整する光学部材であって、前記対物レンズと前記位相板の間の前記対物レンズの像面近傍に配置され、光軸を中心に独立して回転可能な一対の偏差プリズム、又は、前記対物レンズと前記位相板の間の前記対物レンズの像面近傍又は前記位相板の入射側の近傍に配置され、前記観察光に対する傾きを調整可能な平行平板ガラスから成る光学部材と
    を備える位相差顕微鏡を制御するコンピュータに、
    記憶部に記憶されている、前記絞りの像と前記位相膜との位置合わせに用いる前記観察位置ごとのズレ補正量に基づいて前記光学部材を駆動して、各前記観察位置において前記絞りの像と前記位相膜との相対位置を調整する
    処理を実行させるためのプログラム。
11. ステージに配置される容器内のサンプルに照明光を照射して観察する位相差顕微鏡であって、
    対物レンズと、
    前記対物レンズの入射側に配置された絞りと、
    位相膜が設けられ、前記対物レンズの射出瞳面又は前記射出瞳面と共役な瞳共役面に配置された位相板と、
    前記容器内の液体に計測光を入射し、前記液体を透過した前記計測光を受光する受光部を備える計測光学系と、
    前記サンプルの画像又は前記位相板の画像を取得し、前記画像に基づいて前記絞りの像と前記位相膜との重なり具合を示す検出結果を出力する検出部と、
    前記受光部への前記計測光の入射位置に基づいて、前記液体を透過することによる前記計測光のズレ量を検出するズレ検出部と、
    前記液体の液面の複数の位置における前記計測光のズレ量に基づいて、前記液面の形状を算出する液面形状算出部と、
    前記検出部の検出結果及び前記液面の形状に基づいて、前記絞りの像と前記位相膜との位置が合うように、前記対物レンズの光軸と垂直な方向に前記位相板を移動させる調整部と
    を備える位相差顕微鏡。
12. 前記調整部は、前記対物レンズの光軸と垂直な方向に前記絞りの像と前記位相板との両方を移動させる
    請求項１１に記載の位相差顕微鏡。
13. 前記照明光に対する前記容器の傾きを調整する機構を
    さらに備え、
    前記調整部は、さらに前記機構を介して前記照明光に対する前記容器の傾きを調整して、前記絞りの像と前記位相膜との相対位置を調整する
    請求項１１又は１２に記載の位相差顕微鏡。
14. 前記検出部は、前記サンプルの画像又は前記位相板の画像の輝度を検出し、
    前記調整部は、前記画像の輝度を下げるように前記位相板を移動させる
    請求項１１又は１２に記載の位相差顕微鏡。
15. 前記検出部は、前記位相板の画像における前記絞りの像及び前記位相膜の像の位置を検出し、
    前記調整部は、前記画像において前記絞りの像が前記位相膜の像内に収まるように前記位相板を移動させる
    請求項１１又は１２に記載の位相差顕微鏡。
16. 前記検出部は、前記サンプルの画像における前記サンプルのコントラストを検出し、
    前記調整部は、前記サンプルのコントラストを強めるように前記位相板を移動させる
    請求項１１又は１２に記載の位相差顕微鏡。
17. 前記検出部は、前記照明光が照射された前記サンプルからの観察光の光量を検出し、
    前記調整部は、前記観察光の光量を下げるように前記位相板を移動させる
    請求項１１又は１２に記載の位相差顕微鏡。
18. ステージに配置される容器内のサンプルに照明光を照射して観察する位相差顕微鏡であって、
    対物レンズと、
    前記対物レンズの入射側に配置された絞りと、
    位相膜が設けられ、前記対物レンズの射出瞳面又は前記射出瞳面と共役な瞳共役面に配置された位相板と、
    前記容器内の液体に計測光を入射し、前記液体を透過した前記計測光を受光する受光部を備える計測光学系と
    を備える位相差顕微鏡を制御するコンピュータに、
    前記サンプルの画像又は前記位相板の画像を取得し、前記画像に基づいて前記絞りの像と前記位相膜との重なり具合を示す検出結果を出力させる手順と、
    前記受光部への前記計測光の入射位置に基づいて、前記液体を透過することによる前記計測光のズレ量を検出する手順と、
    前記液体の液面の複数の位置における前記計測光のズレ量に基づいて、前記液面の形状を算出する手順と、
    前記検出結果及び前記液面の形状に基づいて、前記絞りの像と前記位相膜との位置が合うように、前記対物レンズの光軸と垂直な方向に前記位相板を移動させる手順と
    を実行させるプログラム。

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