JP4273504B2 - プラスチックの分解法及びそれを利用した有用物質の製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、プラスチック結合性タンパク質の存在下でプラスチックを分解する方法、特に、アスペルギルス・オリゼ又はアスペルギルス・ソーヤの作用によりプラスチックを分解する方法、更に、生分解性プラスチックに微生物を接触させ、プラスチックを分解する過程で、プラスチック中の炭素を微生物により新たな有用物質に転換する生産技術、並びに、以上の方法に使用される各種のタンパク質及びそれをコードする遺伝子等に関するものである。

日本のプラスチックの需要量は、１９９７年の統計によれば１４００〜１５００万トンに達し、そのうち９００万トン以上が廃棄プラスチックとして排出されており、環境問題及び化石燃料の消費抑制の観点から対応が必要とされている（社団法人プラスチック処理協会発行「プラスチックリサイクルの基礎知識」）。その対策として、石油化学系プラスチックの焼却による炭酸ガスおよびダイオキシン類の発生と、非分解性プラスチックの環境への廃棄の抑制を目的に、生分解性プラスチックが開発されてきた。生分解性プラスチックは、２０１０年には全プラスチックの約３−７％、すなわち５０−１００万トン／年の流通量が予測されているが（「生分解性ポリマーの市場拡大シナリオ」株式会社富士キメラ総研版，２３頁）、現状の技術である生分解性プラスチックの自然土壌中における分解処理許容量の限界と生分解性プラスチック自身のコスト高が問題として指摘されている。
ところで、糸状菌の中でも、特にアスペルギウス・オリゼ（キコウジ菌）等を含む麹菌は、清酒、みそ、醤油、及び、みりん等を製造する、わが国における醸造産業において古くから利用され、直接に食されてきた菌類であり、米国のＦＤＡ（食品医薬局）によりＧＲＡＳ（Ｇｅｎｅｒａｌｌｙ Ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ａｓ Ｓａｆｅ）にリストアップされている安全な遺伝子源である。
更に、麹菌は、蛋白質などを菌体外に分泌する能力に優れており、その為に、様々な有用物質の生産に利用されている。
特許文献１には、微生物として放線菌の一種であるアミコラトプシス・メディテラーネイＨＴ−６を用いてポリブチレンサクシネート系樹脂を分解する方法が記載されている。
特許文献２には、リパーゼ及びクチナーゼ等の酵素を用いる生分解性ポリマーの酵素分解方法が記載されている。
これらの方法ではバイオサーファクタントを反応系に共存されることについては何等開示されていない。又、プラスチック分解成分以外の有用物質を製造することについても何等教示されていない。
特許文献１： 特開平９−２５２７１号公報
特許文献２： 特表２００１−５１２５０４号公報
現状の生分解性プラスチック分解技術は土壌中での微生物によるプラスチックの水と二酸化炭素への単純な分解を前提としており、有用付加価値物質への転換を前提にはしていない。この状況は国内外を問わず同じである。現在の生分解性プラスチックは従来の石油化学系プラスチックに比較してコスト高（３〜５倍）であり（「’０１生分解性ポリマーの現状と新展開」株式会社ダイヤリサーチマーテック，株式会社中央リサーチセンター版５１３−５２１頁）、コストダウンあるいは何らかのコスト回収技術が求められている。
更に、生分解性プラスチックの土壌埋め立てによる分解は、もっぱら地表近く（深さ３０〜５０ｃｍ程度）のみで行なわれているが、元来土壌中の菌密度は少なく、深い部分に至ってはさらに菌密度が低下することから、自然界における土壌中での分解速度は遅い。したがって、生分解性プラスチックの需要が予測通りに拡大した場合、大量に廃棄されるプラスチック負荷を土壌中での分解で賄いきるのは不可能である。さらに、国土の狭い日本においては広大な埋め立て分解地の確保が困難であり、廃棄量の多い都市近郊では特に問題となる。現在は包装材・農業資材・コンポスト対応包材が先行しているが、今後、自動車内装部品、コンピュータ・家電包材など大量消費財への生分解性プラスチックの利用が進展した場合、生分解性プラスチックの高密度処理施設が必要となる。生分解性ポリマー使用に関する問題点としても各種アンケート結果によれば、コスト高と同時に大量処理施設のインフラ整備が指摘されている（「’０１生分解性ポリマーの現状と新展開」株式会社ダイヤリサーチマーテック，株式会社中央リサーチセンター版５１３−５２１頁）。
これらの課題に対して、本発明者らは鋭意研究した結果、全く新しいコンセプトとして、バイオサーファクタントのような界面活性物質とプラスチック分解酵素を生産する微生物あるいは界面活性物質及び／又はプラスチック分解酵素そのものを活用することで、高密度のプラスチックの大規模分解を効率的に進行させることに加えて、酵素タンパク質や抗生物質などの有用物質生産性の高い微生物（糸状菌や放線菌）を用いることによって、有用物質の生産も同時に行うことができる新規な方法を発明するにいたった。

本発明は、プラスチック結合性タンパク質等のバイオサーファクタントがプラスチックの疎水表面に吸着し、それによって、プラスチック分解酵素と共同してプラスチックの分解を有効に促進することできる、という新たな知見に基づくものである。
即ち、本発明は第一の態様として、プラスチック結合性タンパク質等のバイオサーファクタントの存在下でプラスチックを分解する方法、特に、プラスチック分解酵素を用いてプラスチックを分解する方法に係る。
本発明は、第二の態様として、プラスチックに微生物を接触させ、微生物の作用によりプラスチックを分解し、更に、分解されたプラスチックの成分を微生物により有用物質に転換することから成る、プラスチックから有用物質を製造する方法に係る。
この方法は、プラスチック廃材を微生物の発酵基質として分解しつつ、付加価値の高い有用物質（酵素・医薬品・化成品など）の生産に転換する新たな分解・物質生産が可能な循環再生システムとして有用である。
ここで、有用物質の種類に特に制限はなく、当業者に公知の任意の物質を包含するが、例えば、有用物質の生合成系に関与する酵素等のタンパク質、一次代謝産物（有機酸等）、二次代謝産物（抗生物質及び化成品前駆体等）、及びバイオサーファクタント等を挙げることが出来る。特に、有用物質が菌体外に分泌される物質である場合には、製造した後の精製等の操作が容易となり、効率及び経済性の点で有利である。又、プラスチックが分解されたときに得られるモノマー及びオリゴマーもプラスチック再生のための原料として有用であるので、有用物質に含めることが出来る。
プラスチックを分解する微生物と、分解されたプラスチックの成分を有用物質に転換する微生物とは、同一であってもよいし、夫々別の種類の微生物でも良い。
分解されたプラスチックの成分を有用物質に転換する為に使用する微生物としては、例えば、紫外線照射、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）等の薬剤による突然変異処理で得ることが出来、有用物質を高発現する変異株を挙げることが出来る。更に、以下に記載するような、有用物質の生合成系に関与する酵素等の各種の有用物質をコードする遺伝子によって組換えられ、該酵素を高発現する形質転換菌を使用することが好ましい。
更に本発明は、第三の態様として、バイオサーファクタント及び／又はプラスチック分解酵素の共存下で、プラスチックに微生物を接触させ、微生物の作用によりプラスチックを分解することから成る、プラスチックを分解する方法に係る。
以上の本発明の各態様で使用する微生物は、プラスチックを分解する能力、又は、分解されたプラスチックを転換して有用物質を産生する能力を有するものである限り、特に制限はないが、微生物の代表例として、糸状性細菌及び真核糸状真菌を挙げることが出来る。
糸状性細菌の例としてはストレプトマイセス属等の放線菌がある。更に、ストレプトマイセス属のストレプトマイセス・グリゼウスまたはストレプトマイセス・セリカラーを挙げることが出来る。
一方、真核糸状真菌としては、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属、リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属、フミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）属、マグナポルサ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）属、メタリチウム（Ｍｅｔａｒｈｉｚｉｕｍ）属、ノイロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）属、モナスカス（Ｍｏｎａｓｃｕｓ）属、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）属及びフザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属を挙げることが出来る。アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属には、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｏｊａｅ）、及びアスペルギルス・ニドランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）等が包含される。
この中で、アスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０株（ＦＥＲＭ Ｐ−１８２７３）は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１）に平成１３年３月２８日付けで寄託されている。
更に、Ａｓｐｅｒｇｉｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ｐＮ−ｃｈａ株（クチナーゼ、ハイドロホービン、アミラーゼ三重高発現株）は、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に基づき、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１）に２００３年（平成１５年）９月１１日付けで国際寄託され、受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−０８４８６を付されている。
更に、上記の糸状性細菌及び真核糸状真菌等から当業者に公知の遺伝子工学的手法によって得られる各種形質転換菌も本発明で有利に使用することが出来る。
即ち、本発明のハイドロホービン等のプラスチック結合性タンパク質若しくはバイオサーファクタントをコードする遺伝子を含むＤＮＡ、クチナーゼ等のプラスチック分解酵素をコードする遺伝子を含むＤＮＡ、及び、有用物質（例えば、有用物質の生合成や、高分子物質の低分子化、各種転位反応により有用物質を生成するような酵素である水酸化酵素や酸化酵素、ポリケタイド合成酵素、チトクロームオキシダーゼ、エステラーゼ，フェノールオキシダーゼ，α−アミラーゼ，セルラーゼ，リパーゼ，及びプロテアーゼ）をコードする遺伝子を含むＤＮＡから選択される少なくとも一つ以上のＤＮＡによって組換えられた形質転換菌を挙げることが出来る。これらの形質転換菌は、該界面活性物質を高発現し、プラスチック分解酵素を高発現し、又は有用物質の生合成に関与する酵素を高発現することが可能である。
従って、本発明は、第四の態様としてこのような各種形質転換菌にも係るものである。
このような形質転換菌を作成する元となる微生物の例として、上記の微生物以外に、アスペルギルス属であるアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・カワチ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｋａｗａｃｈｉｉ）、アスペルギルス・フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、アスペルギルス・フラバス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ）、アスペルギルス・パラシティクス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｐａｒａｓｉｔｉｃｕｓ）、アスペルギルス・ノミウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｏｍｉｕｓ）、アスペルギルス・タマリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔａｍａｒｉ）及びアスペルギルス・レペンス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｒｅｐｅｎｓ）等を挙げることが出来る。
更に、第五の態様として、本発明は、上記の方法等に使用することが出来る、新規なプラスチック結合性タンパク質及びプラスチック分解酵素、並びに、これらをコードする遺伝子に係る。それらは、特に、アスペルギルス・オリゼ由来のものである。

図１は、Ａ．ｏｒｙｚａｅ等のアスペルギルス属糸状菌がＰＢＳ転換能力を持つことを確認した写真である。
図２は、Ａ．ｏｒｙｚａｅがＰＬＡ転換能力を持つことを確認した写真である。
図３は、ＤＮＡマイクロアレイ解析用の培地の組み合わせを示す。
図４は、ＰＢＳ存在時に特異的に発現する遺伝子群を模式的に示す。
図５は、Ｓｕ３ＰＰ５、Ｓｕ３ＰＥ５、Ｓｕ３Ｂｕ５のＤＮＡマイクロアレイの結果を視覚的に解析した結果であり、各数字は、遺伝子発現を（Ｃｙ５／Ｃｙ３）の比で表わしている。
図６は、ハイドロホービンの完全長を含むＪＺ３９８１の塩基配列を示す。
図７は、麹菌用ハイドロホービン高発現プラスミドの構築を示す模式図である。
図８は、ハイドロホービン高発現麹菌が高度にハイドロホービンを培養上清に分泌していることを示すゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）の写真である。
図９は、ＰＢＳ分解酵素であるクチナーゼ遺伝子が染色体ＤＮＡ中に挿入されたアスペルギルス・オリゼ形質転換株の培養上清中にのみＰＢＳ分解酵素精製標品と同じ位置にタンパク質が発現していることを示すゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）の写真（左）、及び該形質転換株によるＰＢＳの分解を示す写真（右）である。
図１０は、ｇｌａＡ １４２ ｐｒｏｍｏｔｅｒを目的遺伝子の上流に融合したｐＰＴＲ−ｇｌａ−ｈｙｐの作製を示す。
図１１は、クチナーゼ−ハイドロホービン共高発現株が取得されたことを示す、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの写真である。
図１２は、ハイドロホービン高発現用プラスミドｐＰＴＲ−ｅｎｏ−ｈｙｐの作製を示す。
図１３は、麹菌αアミラーゼ高発現用プラスミドｐＮＧ−ａｍｙの作製を示す。
図１４は、クチナーゼ−ハイドロホービン−αアミラーゼ三重共高発現株がハイドロホービンを高発現することを示す、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの写真である。
図１５は、ｇｌａＡ １４２ ｐｒｏｍｏｔｅｒをｈｙｐ Ｂ遺伝子の上流に融合させたｐＮＧ−ｇｌａ−ｈｙｐ Ｂの作製を示す。
図１６は、ｇｌａＡ １４２ ｐｒｏｍｏｔｅｒをｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｎ−３１５遺伝子の上流に融合させたｐＮＧ−ｇｌａ−ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｎ−３１５の作製を示す。
図１７は、糸状菌由来ハイドロホービン及びその類似体の系統樹を示す。
図１８は、各種生分解性プラスチックへのハイドロホービンの吸着の様子を示す。
図１９は、糸状菌由来タンパク質分解酵素及びその類似体の系統樹を示す。
図２０は、ＰＢＳ分解培養上清中のオクチルセルロファインカラムの溶出画分中のタンパク質濃度を示すグラフ、及び各画分中に含まれるタンパク質の存在を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥの写真である。
図２１は、ＰＢＳ結合タンパク質高発現系の構築を示す。
図２２は、アスペルギルス・オリゼ形質転換株の培養上清中にのみ目的タンパク質の位置（約１４ｋＤａ）にバンドが観察されたことを示すＳＤＳ−ＰＡＧＥの写真である。
図２３は、疎水表面上での約１４ｋＤａタンパク質及びハイドロホービン高発現株の生育が野性株のものを上回ることを示す写真である。
図２４は、インビトロでのＰｂｐＡのＰＢＳへの吸着を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥの写真である。
図２５は、ＰｂｐＡ及びＰｂｐＢ相同配列の系統樹を示す。
図２６は、白金線ＰＢＳ被覆物のクチナーゼによる分解を示す写真である。
図２７は、ＲｏｌＡによるＰＢＳフィルムのクチナーゼ分解の促進を示す写真である。
図２８は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＲｏｌＡのクチナーゼによるＰＢＳ乳化液分解促進効果を示す。
図２９は、ＰｂｐＡをＰＢＳに吸着させた際の分解促進の様子を示す。
図３０は、ＰＢＳフィルムのクチナーゼ分解に対するハイドロホービン及び人工界面活性剤との比較を示す。

本発明の第一の態様において使用するバイオサーファクタントは、一般的に、生物が生産する界面活性剤であり、特に、微生物が菌体外に生産する界面活性剤であり、菌体プラスチック吸着因子の一種である。
バイオサーファクタントとしては、プラスチック結合性タンパク質以外に、当業者に公知の任意の物質、例えば、リン脂質や親水性の糖と疎水性の脂肪酸が結合しているグリコリピド等がある。例えば、マンノシルエリスリトールリピッド及びラムノリピッド等の糖脂質エステル、環状リポペプチド、環状ポリペプチド、並びに、サーファクチン等の両親媒性タンパク質等を挙げることが出来る。
プラスチック結合性タンパク質は、以下の実施例で具体的に示されるようなハイドロホービン及びそのホモログ類、並びにその他のプラスチック結合性タンパク質を挙げることが出来る。その取得源に特に制約はないが、上記の各種の糸状性細菌及び真核糸状真菌由来のもの、特に、以下の実施例に具体的に記載したような、アスペルギルス・オリゼ等のアスペルギルス属カビに代表される糸状性細菌などの各種微生物由来のものを使用することが出来る。
一方、本発明方法で使用するプラスチック分解酵素も当業者に公知の任意のものを使用することが出来る。例えば、エステラーゼ、プロテアーゼ、ペプチダーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、及びセリンハイドロラーゼ等から選択される少なくとも一種を使用することが出来る。プラスチック分解酵素も、上記の各種の糸状性細菌及び真核糸状真菌由来のもの、特に、以下の実施例に具体的に記載したような、例えば、アスペルギルス・オリゼ等のアスペルギルス属カビに代表される糸状性細菌などの各種微生物由来のものを使用することが出来る。
従って、例えば、プラスチック結合性タンパク質としてアスペルギルス・オリゼ由来のハイドロホービン、プラスチック分解酵素としてアスペルギルス・オリゼ由来のクチナーゼを使用することが出来る。
本発明方法で分解の対象となるプラスチックに、特に制限はない。その代表例として、「生分解性プラスチック」として知られているものを挙げることが出来る。
生分解性プラスチックとは、「使用状態ではその使用目的において必要とされる充分な機能を保ち、廃棄されたときには土中又は水中の微生物の働きによって、より単純な分子レベルにまで分解されるプラスチック」ともいうべき物質である。分解の程度に基づいて、「完全分解型生分解性プラスチック」と「部分分解（崩壊）型生分解性プラスチック」とに分けられ、更に、材料及び製造方法からは、「微生物生産系」、「天然高分子系」及び「化学合成系」に大きく分けることが出来る。本発明方法では、これらのいずれの種類の生分解性プラスチックも使用することが出来る。
従って、本発明方法において用いられるプラスチックの具体例は、例えば、ポリエステル、ポリウレタン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニール、ナイロン、ポリスチレン、デンプン、及びそれらの混合物から成る群から選択される。更に、ポリエステルとしては、ポリブチレンサクシネート（ＰＢＳ）、ポリブブチルサクシネート・アジペート（ＰＢＳＡ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、脂肪族ポリエステル、ポリカプロラクトンそれらの混合物から成る群から選択される。
更に、本発明の全ての方法において、分解の対象となるプラスチックは、所謂「複合材料」の一構成要素として含まれているものでもよい。ここで、「複合材料」とは一般的に２種類以上の異なる物質から構成されている材料であり、例えば、プラスチックと各種金属及びその他の無機物質から構成されているものがある。このような複合材料は各種産業素材として多方面で各種の目的に利用されている。
従って、本発明により、プラスチックを含む複合材料から、プラスチック部分を選択的に分解して、プラスチックをモノマー又はオリゴマーとして回収し、一方で、プラスチックを実質的に含まない金属等のその他の部分を回収することが出来る。
本発明方法において、プラスチックの分解反応は、目的・規模などに応じて、当業者に公知の任意の反応系（例えば、水溶系及び固相系）及び反応条件を適宜選択して実施することが出来る。例えば、プラスチック乳化液を含む液体培養系及びプラスチック固型ペレット又はプラスチック粉体等を使用する固体培養系等の当業者に公知の任意の培養系において行うことが出来る。
従って、分解の対象となるプラスチックは、乳化液状及び固型ペレット等の、夫々の培養系に応じた任意の形態をとることが出来る。
本発明の第一の態様において、バイオサーファクタントの存在下でプラスチックを分解させるためには、バイオサーファクタントを反応系に添加する必要があるが、その添加量、時期、手段及び方法等は当業者が適宜選択することが出来る。
本発明の効果を得るには、まず、バイオサーファクタントがプラスチックに効果的に吸着するように両者間の疎水的相互作用が強まるような条件下で処理することが好ましい。
その為に、本発明方法の好適例としては、低水分活性状態でバイオサーファクタントをプラスチックと混合するステップ、高水分活性状態でプラスチック分解酵素によりプラスチックを分解するステップからなる。
ここで、「水分活性」は当業者に公知の因子であり、「溶質の溶けた水溶液と純粋の蒸気圧との比を水分活性」と定義するものである（Ｊｏｈｎ Ａ．Ｔｒｏｌｌｅｒ ＆ Ｊ．Ｈ．Ｂ．Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ著，”Ｗａｔｅｒ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ Ｆｏｏｄ”Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）。本発明において、「低水分活性状態」とは、バイオサーファクタントがプラスチックの疎水表面に有効に吸着できるような条件を意味し、具体的には、例えば、水分活性が０．９７以下、好ましくは０．９５以下、さらに好ましくは、０．９以下であるような状態をいう。又、「高水分活性状態」とは、このような低水分活性状態ではない状態を意味する。この時の溶質としては、例えば、塩類、糖類、アルコール類などが挙げられる。
従って、一具体例として、低水分活性状態でフィルム状又はペレット状のプラスチックとバイオサーファクタントを混合して、該プラスチックに有効量のバイオサーファクタント吸着させ、その後、水分活性を高めてプラスチック分解酵素により該フィルムの分解を促進させることが可能である。
或いは、バイオサーファクタントがプラスチックの間の疎水的相互作用が強まるような別の好適例としては、高塩濃度状態でバイオサーファクタントをプラスチックと混合するステップ、低塩濃度状態でプラスチック分解酵素によりプラスチックを分解するステップからなる。ここで、「高塩濃度状態」とはバイオサーファクタントがプラスチックの疎水表面に有効に吸着できるような条件を意味し、具体的には、例えば、塩としてＮａＣｌを用いた場合、濃度が４％以上、好ましくは８％以上、さらに好ましくは１４％以上であるような状態をいう。又、「低塩濃度状態」とは、このような高塩濃度状態ではない状態を意味する。しかしながら必ずしも低溶質濃度状態でプラスチック分解酵素を作用させる必要はなく、高溶質濃度状態で、サーファクタントを結合させ、その状態でプラスチック分解酵素を作用させることもできる。
又、本発明方法の反応温度としては、例えば、０〜１００℃、好ましくは、０〜８０℃、より好ましくは、１５〜８０℃である。
更に、プラスチックの分解により発生するモノマー及びオリゴマーなどの酸性物質の影響で反応溶液が酸性化し、その結果、反応系のｐＨ値がプラスチック分解酵素の至適ｐＨ範囲から外れることがあるので、それを防ぐために、分解反応を高緩衝能を有する緩衝液中で実施したり、又は、分解反応中に、外部から塩基性物質を加えるなどして適宜反応系を中和し、適当な中性状態、例えば、ｐＨ４〜１１、好ましくはｐＨ６〜１０、より好ましくはｐＨ７〜９に維持することが好ましい。
更に、バイオサーファクタント及びプラスチック分解酵素は、夫々、タンパク質製剤として使用することも出来るし、このようなタンパク質製剤を用いずに、プラスチックにアスペルギルス・オリゼ又はアスペルギルス・ソーヤを接触させ、アスペルギルス・オリゼ又はアスペルギルス・ソーヤがその場で産生するバイオサーファクタント及びプラスチック分解酵素の作用によりプラスチックを分解することも可能である。
本発明の第二〜第四の各態様において、バイオサーファクタント及び／又はプラスチック分解酵素を培養系に共存させることにより、プラスチックの分解を促進することが出来る。これらの物質は微生物自体により産生されたものでも良いし、それらに加えて、更に培養系の外部より添加することが可能である。添加の量及び割合・添加の時期等の諸条件は当業者が適宜選択することが出来る。これらの物質は必ずしも同時に添加する必要はなく、方法の各段階で逐次的に添加することも可能である。
界面活性物質若しくはバイオサーファクタントを反応系叉は培養系に共存させることにより、微生物のプラスチックへの接触を増強することが出来、プラスチックの分解効率を促進させることが出来る。
培養系に共存させることができるバイオサーファクタント及び／又はプラスチック分解酵素は、既に本発明の第一の態様において記載したものである。
既に記載したように、本発明方法においては、バイオサーファクタント、プラスチック分解酵素、及び／又は有用物質を高発現する形質転換菌を使用することによって、プラスチックを分解し、分解されたプラスチックを有用物質に転換することをより促進することが可能となる。
本発明方法においては、上記各物質をコードする遺伝子を夫々別の微生物に導入して、こうして得られた複数種類の形質転換菌を用いて反応させることができる。即ち、バイオサーファクタントをコードする遺伝子によって組換えられた形質転換菌、プラスチック分解酵素をコードする遺伝子によって組換えられ形質転換菌、及び、有用物質遺伝子によって組換えられ形質転換菌のうちの任意の組み合わせからなる複数の形質転換菌を使用することによって本発明の各方法を実施することができる。
尚、本発明の形質転換菌において導入される、バイオサーファクタント、プラスチック分解酵素、又は有用物質をコードする遺伝子は一種類とは限らず、夫々、複数種類のバイオサーファクタントの遺伝子、複数種類のプラスチック分解酵素の遺伝子、又は複数種類の有用物質の遺伝子で組換えることも可能である。
或いは、実施例に記載されているように、同一の微生物をバイオサーファクタント、プラスチック分解酵素をコードする双方の遺伝子によって組換えられた、この両物質が同時に高発現される共高発現菌である形質転換菌を使用することが出来る。その結果、プラスチック分解酵素を生産する微生物菌体がプラスチック表面により強く吸着して、プラスチック分解酵素を生産することからプラスチック分解が促進される。
こうして得られたプラスチックを分解する能力のある形質転換菌と有用物質生産用の微生物の２種類の微生物を共存させて培養することによって有用物質の製造を行なうことも可能である。
更に、実施例に記載されているように、同一の微生物をバイオサーファクタント、プラスチック分解酵素、及び有用物質の夫々をコードする遺伝子によって組換えられた、これらの物質が同時に高発現される三重共高発現菌である形質転換菌を使用することが出来る。
例えば、上記の共高発現菌を元の菌株として使用して、既に記載したように、有用物質を高発現する変異株、又は、有用物質をコードする遺伝子によって組換えられこれらの物質を高発現する形質転換菌を作成することによって、プラスチック分解能を高めた微生物に有用酵素の遺伝子を導入して高発現させることが可能となり、こうして得られる一種類の三重共高発現菌である形質転換菌を使用することによって、プラスチックを分解すると同時に有用物質の生産を効率よく行なわせることができる。
本発明において、複数種類の微生物を使用する場合には、これら複数種類の微生物を同時に培養する共培養系で実施したり、又は、本発明方法が夫々分解反応及び転換反応を担う複数の連続的な培養段階から構成されており、その各段階において、夫々前の段階で得られた培養液に更に異なる微生物を逐次的に作用させて処理することも可能である。
又、以上のような各種形質転換菌を使用した場合でも、更に、界面活性物質若しくはバイオサーファクタント及び／又はプラスチック分解酵素を、例えば外部より添加することによって反応系に共存させ、プラスチックの分解及び転換を更に効率化することも可能である。
界面活性物質としては、当業者に公知の任意の物質を使用することが出来る。しかしながら、生物、特に、微生物が細胞表面又は菌体外に生産する生物系界面活性物質であるバイオサーファクタントが環境面等の点で好ましい。
本発明の微生物を利用してプラスチックを分解する方法、及び、プラスチックから有用物質を製造する方法において、分解反応及び転換反応は、プラスチック乳化液を含む液体培養系及びプラスチック固型ペレット又はプラスチック粉体等を使用する固体培養系等の当業者に公知の任意の培養系において行うことが出来る。
従って、分解の対象となるプラスチックは、固型ペレット状及び乳化液等の、夫々の培養系に応じた任意の形態をとることが出来る。培養液及び培地等の組成、並びに、温度、ｐＨ等の各種培養温度条件は、プラスチック及び使用する微生物の種類等に応じて当業者が適宜選択することが出来る。
ただし、既に記載したように、バイオサーファクタントとプラスチック分解酵素とが共同して有効に作用してプラスチックを分解させるためには、まず、バイオサーファクタントがプラスチックに効果的に吸着するように両者間の疎水的相互作用が強まるような条件下で処理することが好ましい。
従って、例えば、プラスチックに緩衝液等を添加して適当な低水分活性状態とした後、本発明の形質転換菌のような微生物の菌体（細胞、胞子、菌糸など）を接種して恒温恒湿器内で培養して麹を作成し、それによって、微生物が産生するバイオサーファクタントがプラスチックに作用した後、適当な緩衝液を加えて高水分活性状態にし、プラスチック分解酵素によりプラスチックを分解する方法が考えられる。この際に、外部からの界面活性剤又はバイオサーファクタントの添加は低水分活性状態で行ない、一方、プラスチック分解酵素の添加は高水分活性状態で行なうことが好ましい。
尚、既に記載したように、分解する際には、プラスチックの分解により発生するモノマー及びオリゴマーなどの酸性物質の影響を防ぐために、高緩衝能を有する緩衝液を使用したり、又は、分解反応中に、外部から塩基性物質を加えるなどして適宜反応系を中和し、中性状態に維持することが好ましい。
本発明で使用するアスペルギルス・オリゼ由来のハイドロホービン及びハイドロホービンホモログ遺伝子の具体例として、以下の（ａ）又は（ｂ）ポリペプチドをコードする塩基配列を含むＤＮＡ：
（ａ）配列番号：１、２又は３で示されるアミノ酸配列と同一又は実質的に同一であるアミノ酸配列からなるポリペプチド、（ｂ）（ａ）で示されるアミノ酸配列において、一部のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列からなりハイドロホービンと実質的に同等の機能を有するポリペプチド、を挙げることが出来る。
別の具体例として、以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡ：
（ａ）配列番号：１、２又は３でで示される塩基配列又はその部分配列を含むＤＮＡ、（ｂ）（ａ）の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、（ａ）のＤＮＡと実質的に同等の機能を有するＤＮＡ、を挙げることが出来る。
本発明で使用するアスペルギルス・オリゼ由来のプラスチック分解酵素遺伝子の具体例として、以下の（ａ）又は（ｂ）ポリペプチドをコードする塩基配列を含むＤＮＡ：
（ａ）配列番号：４又は５で示されるアミノ酸配列と同一又は実質的に同一であるアミノ酸配列からなるポリペプチド、（ｂ）（ａ）で示されるアミノ酸配列において、一部のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列からなりプラスチック分解酵素と実質的に同等の機能を有するポリペプチド、を挙げることが出来る。
別の具体例として、以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡ：
（ａ）配列番号：４又は５で示される塩基配列又はその部分配列を含むＤＮＡ、（ｂ）（ａ）の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、（ａ）のＤＮＡと実質的に同等の機能を有するＤＮＡ、を挙げることが出来る。
本発明で使用するアスペルギルス・オリゼ由来のプラスチック結合性タンパク質遺伝子の具体例として、以下の（ａ）又は（ｂ）ポリペプチドをコードする塩基配列を含むＤＮＡ：
（ａ）配列番号：６又は７で示されるアミノ酸配列と同一又は実質的に同一であるアミノ酸配列からなるポリペプチド、（ｂ）（ａ）で示されるアミノ酸配列において、一部のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列からなりプラスチック結合性タンパク質と実質的に同等の機能を有するポリペプチド、を挙げることが出来る。
別の具体例として、以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡ：
（ａ）配列番号：６又は７で示される塩基配列又はその部分配列を含むＤＮＡ、（ｂ）（ａ）の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、（ａ）のＤＮＡと実質的に同等の機能を有するＤＮＡ、を挙げることが出来る。
ここで、ポリペプチドの「機能」とは、それが細胞（菌体）の内部及び／又は外部において示す生物学的機能又は活性を意味する。更に、「実質的に同等」とは、それらの示す機能（活性）が程度の差はあるものの細胞（菌体）の内部及び／又は外部における機能として同等であると見做し得るものであることを示す。
本発明ＤＮＡは当業者に公知の方法で調製することが出来る。例えば、寄託されている菌株から実施例で記載した方法によって容易にクローニングすることが出来る。或は、本明細書に記載された本発明ＤＮＡの塩基配列又はアミノ酸産配列の情報に基づき、当業者に周知の化学合成、又は、本発明のプライマーを使用したＰＣＲにより増幅して調製することも出来る。
本明細書において、「ストリンジェントな条件下」とは、各塩基配列間の相同性の程度が、例えば、全体の平均で約８０％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上であるような、高い相同性を有する塩基配列間のみで、特異的にハイブリッドが形成されるような条件を意味する。具体的には、例えば、温度６０℃〜６８℃において、ナトリウム濃度１５０〜９００ｍＭ、好ましくは６００〜９００ｍＭ、ｐＨ６〜８であるような条件を挙げることが出来る。
ハイブリダイゼーションは、例えば、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ（ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９８７））に記載の方法等、当業界で公知の方法あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。
本発明における特定のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列とは、該アミノ酸配列と全アミノ酸配列に亘ってアラインメントして比較した場合に、全体の平均で８０％以上、好ましくは９０％以上、特に好ましくは９９％以上のアミノ酸が同一であるようなアミノ酸配列を意味する。従って、或るアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列から成るポリペプチドは、該アミノ酸配列から成るポリペプチドと実質的に同等の機能を有するものと考えられる。
又、本発明ポリペプチドにおける特定のアミノ酸配列において一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列とは、該アミノ酸配列から成るポリペプチドと実質的に同等の機能を有する限りにおいて、好ましくは、１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加したアミノ酸配列、或いはそれらを組み合わせたアミノ酸配列から成るものと意味する。又、ポリペプチドの「機能」とは、それが細胞（菌体）の内部及び／又は外部において示す生物学的機能又は活性を意味する。
上記の特定のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列から成るポリペプチド、又はその一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加したアミノ酸配列から成るポリペプチドは、例えば、部位特異的変異導入法、遺伝子相同組換え法、プライマー伸長法、及びＰＣＲ法等の当業者に周知の方法を適宜組み合わせて、容易に作成することが可能である。
尚、その際に、実質的に同等の機能を有するためには、当該ポリペプチドを構成するアミノ酸のうち、同族アミノ酸（極性・非極性アミノ酸、疎水性・親水性アミノ酸、陽性・陰性荷電アミノ酸、芳香族アミノ酸など）同士の置換が可能性として考えられる。又、実質的に同等の機能の維持のためには、本発明の各ポリペプチドに含まれる機能ドメイン内のアミノ酸は保持されることが望ましい。
本発明の各方法で有利に使用することができる微生物の好適例として既に記載した各種形質転換菌は、当該技術分野における周知の様々な技術及び手段を用いて、夫々のＤＮＡ又は遺伝子を含む組換えベクターを作成し、該組換えベクターで上記の糸状性細菌、真核糸状真菌、及びそれらの変異株等の宿主を、例えば、プロトプラストーＰＥＧ法、エレクトロポレーション法、Ｔｉ−プラスミド法、及びパーティクルガン等のような当業者に公知の組換え法によって得ることが出来る。
既に記載したように、これら形質転換菌においては各物質の生産誘導の抑制が解除されていることが望ましい。その為には、例えば、これらの物質をコードする遺伝子を構成的発現プロモーター又は各種の誘導型発現プローター等の制御下で発現させることができる。その結果、これら物質を高発現され、細胞表面又は菌体外に多量に生産されプラスチック分解が促進され、更に、有用物質の生産が促進される。
これらの各種プロモーターは当業者に公知である。例えば、アスペルギルス・オリゼ用の構成的発現プロモーターとしては、ｅｎｏＡプロモーター、ｐｇｋＡプロモーター、及びｔｅｆ１プロモーター等を挙げることが出来る。又、アスペルギルス・オリゼ用の誘導型発現プロモーターとしては、マルトースを誘導基質とするグルコアミラーゼプロモーター又はα−アミラーゼプロモーター、及びキシロースを誘導基質とするキシラナーゼプロモーター等を挙げることが出来る。

以下に、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はそれに限定されるものではない。なお、実施例における各種遺伝子操作は、上記のＣｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ（ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９８７）に記載されている方法に従った。

（１）菌体プラスチック吸着因子−ハイドロホービン遺伝子の取得
（１−１）Ａ．ｏｒｙｚａｅによる生分解性プラスチック転換確認
［材料］
▲１▼試薬
特にことわりの無い限り、ナカライテスク（株）の特級試薬を用いた。生分解性プラスチックとしてポリブチレンサクシネート（ＰＢＳ）を選択し、ＰＢＳエマルジョンは昭和高分子（株）製のビオノーレエマルジョンＯＬＸ−０７５２７を用いた。試薬の調製はミリＱ水を用いた。
▲２▼菌体
麹菌Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＲＩＢ４０を用いた。
▲３▼培地
以下の表１に示した。

［方法］
炭素源をＰＢＳに限定した最少寒天培地（ＰＢＳ ｅｍｕｌｓｉｏｎ ｍｉｎｉｍａｌ ｍｅｄｉｕｍ）に各種のアスペルギルス属糸状菌（Ａ．ｏｒｙｚａｅ，Ａ．ｓｏｊａｅ，Ａ．ｋａｗａｃｈｉｉ，Ａ．ａｗａｍｏｒｉ，Ａ．ｎｉｇｅｒ，Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）の胞子懸濁液をスポットし３７℃で７日間培養した。同様にＰＢＳを唯一の炭素源とした最少液体培地５ｍｌにＡ．ｏｒｙｚａｅ胞子懸濁液を終濃度０．５×１０^５個／ｍｌとなるよう植菌し、３０℃で５日間振盪培養した。なお、液体培養は試験管で行なった。
［結果］
固体培養ではＡ．ｏｒｙｚａｅ，及びＡ．ｓｏｊａｅの場合に、夫々、約１．９ｃｍ及び約１．５ｃｍ幅のｈａｌｏが観察された（図１（Ａ））。又、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓでもｈａｌｏが観察された。又、Ａ．ｏｒｙｚａｅの液体培養でもＰＢＳの濁度の顕著な低下が観察された（図１（Ｂ））。これらのことから、Ａ．ｏｒｙｚａｅ等のアスペルギルス属糸状菌がＰＢＳ転換能力を持つことを確認された。
更に、生分解性プラスチックとしてＰＢＳの代わりにポリ乳酸（ＰＬＡ）を使用した各培養系において、Ａ．ｏｒｙｚａｅによるプラスチックの分解を確認した。その結果を図２に示す。
（１−２）ＤＮＡマイクロアレイを用いた発現遺伝子解析
（１−２−１）麹菌Ｔｏｔａｌ ＲＮＡの調製
［材料］
菌体からのＴｏｔａｌ ＲＮＡの調製には、Ｓｅｐａｓｏｌ−ＲＮＡＩＳｕｐｅベナカライテスク（株））を用いた。
▲２▼培地
培地の組成、ＤＮＡマイクロアレイ解析を行なう上での培養条件とその組み合わせを表２及び図３に示した。

［方法］
５００ｍｌ容羽根付き三角フラスコ内のＣｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ培地１５０ｍｌに終濃度が０．５×１０^７個／ｍｌになるよう胞子懸濁液を植菌し、３０℃で１２時間培養した。菌体をミラクロス（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ）で集菌し、滅菌水で洗浄後余分な水分を取り除いた。この回収した菌を、ＰＢＳ固型ペレット，ＰＢＳエマルジョン，コハク酸，１、４−ブタンジオールを各々唯一の炭素源とした最少培地へと移し、３０℃で振盪培養を行なった。培養時間はＰＢＳｐｅｌｌｅｔｓは１２０時間、ＰＢＳエマルジョンは７０時間、コハク酸は１２時間、１、４−ブタンジオールは２４時間とした。培養終了後、ＰＢＳエマルジョン，コハク酸，１、４−ブタンジオール培地は、ミラクロスを用いて菌体を回収し、滅菌水で洗浄後余分な水分を取り除いた。ＰＢＳ固型ペレットは、茶漉しを用いて菌体とＰＢＳ固型ペレットを分離した。得られた湿菌体の湿重量を計測した後、乳鉢中で液体窒素を注ぎながらパウダー状になるまで破砕した。湿重量の４倍量のＳｅｐａｓｏｌ−ＲＮＡＩＳｕｐｅｒを入れた５０ｍｌ容チューブにパウダー状の菌体を移し、激しく撹拌後室温で５分間放置した。Ｓｅｐａｓｏｌ−ＲＮＡＩＳｕｐｅｒの１／５量のクロロホルムを加え、よく撹拌した後、室温で３分放置した。１０，０００×ｇ、４℃で１５分遠心した後、水層を１５ｍｌ容チューブに移し同量の水飽和酸性フェノール・クロロホルム（フェノール／クロロホルム＝１／１）を加え混合後、１２，０００×ｇ、４℃で１０分遠心し水層を別の１５ｍｌ容チューブに移した。等量のイソプロパノールを加え室温で放置１０分間放置後１２，０００×ｇ、４℃で１０分遠心し、上清を捨て、１０ｍｌの７０％エタノールでリンスした。風乾後、適量のＤＥＰＣ（ｄｉｅｔｈｙｌｐｉｒｏｃａｒｂｏｎａｔｅ）処理水に溶解させた。
（１−２−２）ｍＲＮＡの精製
［材料］
ｍＲＮＡの精製には、Ｍｅｓｓａｇｅ Ｍａｋｅｒ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を用いた。
［方法］
精製操作はＭｅｓｓａｇｅ Ｍａｋｅｒ添付マニュアルに従った。以下、Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ量１ｍｇを用いた時の手順を示した。
１ｍｇのｔｏｔａｌ ＲＮＡを１５ｍｌ容チューブに１．８ｍｌにＤＥＰＣ処理水を用いてフィルアップ（終濃度０．５５ｍｇ／ｍｌ）し、６５℃で５分間インキュベート後、氷上にて急冷した。５Ｍ ＮａＣｌを２００μｌ加え、よく撹拌後ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎを１ｍｌ添加し、よく混合した後、３７℃で１０分間インキュベートした。サンプルをシリンジに入れプランジャーで押し切った後、ディスポのカップに入れた３ｍｌのＷａｓｈ ｂｕｆｆｅｒ１をシリンジで吸った。シリンジ中の液をよく懸濁し、液をプランジャーで押し切った。同様の操作を３ｍｌのＷａｓｈ ｂｕｆｆｅｒ２で行なった。次に６５℃に保温しておいたＤＥＰＣ処理水１ｍｌをシリンジで吸い上げ、よく懸濁後、１５ｍｌチューブに押し出した。再度、ＤＥＰＣ処理水１ｍｌで溶出した後、溶出液を合わせ、１２，０００×ｇ、４℃で３分間遠心し、ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎを取り除いた。この上清約２ｍｌに対し、５ｍｇ／ｍｌのグリコーゲン溶液を２０μｌ、７．５Ｍ酢酸アンモニウム（ｐＨ５．２）を２００μｌ加えて混合し、エッペンドルチューブ５本に分注し、２倍量の氷冷エタノールを加え、−２０℃にて一晩エタノール沈殿を行なった。１２，０００×ｇ、４℃で３０分間遠心した後、上清を捨て７５％エタノールでリンスした、風乾後、適量のＤＥＰＣ処理水に溶解させた。
（１−２−３）ｍＲＮＡのラベリング
［材料］
精製したｍＲＮＡの蛍光色素によるラベリングはＣｙ３−ｄＵＴＰ、Ｃｙ５−ｄＵＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いた。
［方法］
エッペンドルフチューブに、ｍＲＮＡ０．５^〜１．０μｇ、ランダムプライマー（９ｍｅｒ）（２μｇ／μｌ）１μｌ、ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）ｐｒｉｍｅｒ（１２−１８ｍｅｒ）（０．５μｇ／μｌ）１μｌ、ＤＥＰＣ処理水を加え１０μｌとした。７０℃で１０分インキュベートした後、室温に１０分放置し、その後氷上で５分間以上放置し、ｍＲＮＡにプライマーをアニーリングさせた。次に、この反応液に５×Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ Ｂｕｆｆｆｅｒ（２５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．３、３７５ｍＭ ＫＣｌ、１５ｍＭ ＭｇＣｌ_２）４μｌ、０．１Ｍ ＤＴＴ２μｌ、５０×ｄＮＴＰｓ（２５ｍＭ ｄＡＴＰ，ＧＴＰ，ＣＴＰ、１０ｍＭ ＴＴＰ）０．４μｌ、Ｃｙ−ｄｙｅ（３ｏｒ５）２μｌ、Ｓｕｐｅｒ Ｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＲＴ（２００Ｕ／μｌ）１．５μｌを加えピペッティングによる撹拌後４２℃で１時間インキュベートし逆転写反応させた。なお、この操作以降直接光が当たらないように注意して行なった。その後再びＳｕｐｅｒ Ｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＲＴ（２００Ｕ／μｌ）１．５μｌを加え撹拌し、４２℃，１時間、７０℃，１０分、３７℃，５分インキュベートした後、ＲＮａｓｅ Ｈ（１０Ｕ／μｌ）０．３μｌ加え、３７℃，１５分、７０℃，１０分インキュベートし未反応ｍＲＮＡを分解させた。専用のチューブに装着したＭｉｃｒｏｃｏｎ−３０のカップに各々の組み合わせ（図３）でＣｙ３、Ｃｙ５でラベルした溶液を混合し、３００μｌのＴＥを加え、１０，０００ｇ室温で２０分間遠心濃縮した。再度４００μｌのＴＥを加え１０，０００×ｇ室温で２０分間遠心濃縮した。次にＨｕｍａｎ Ｃｏｔ１−ＤＮＡ（１ｍｇ／ｍｌ）６０μｌとＴＥ３００μｌ加え、１０，０００×ｇ室温で３０分間遠心濃縮した。Ｍｉｃｒｏｃｏｎ−３０のカップを取り出し、新しいチューブに逆さに挿入し、３，０００×ｇ室温で３分間遠心してカップ中の溶液を回収した。これをＴＥで２８μｌにフィルアップした後、ｙｅａｓｔ ｔＲＮＡ（１０ｍｇ／ｍｌ）４μｌ、ｐｏｌｙ ｄＡ（１ｍｇ／ｍｌ）１６μｌ、２０×ＳＳＣ １０．２μｌ、１０％ ＳＤＳ １．８μｌを加えた。この混合液６０μｌを１分間煮沸し、室温に戻したものを用いてハイブリダイゼーションを行なった。
（１−２−４）ハイブリダイゼーション、洗浄、検出
［材料］
Ａ．ｏｒｙｚａｅの２１４６個のＥＳＴクローンを搭載したｃＤＮＡマイクロアレイ（旭テクノグラス（株）製）を用いた。ギャップカバーグラス（２５×５０ｍｍ）はＭＡＴＳＵＮＡＭＩ（株）製を用いた。ハイブリダイゼーションカセットはＡｒｒａｙ ＩＴを用いた。また、スキャナー解析はＡｘｏｎ社製Ｇｅｎｅ Ｐｉｘ ４０００Ｂ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ｓｃａｎｎｅｒにて、画像解析はＡｘｏｎ社製Ｇｅｎｅ Ｐｉｘ Ｐｒｏ ３．０ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｐａｃｋａｇｅおよび Ｍｅｓｉａ Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ社製Ａｒｒａｙ Ｐｒｏ ｐｒｏｇｒａｍを用いた。
［方法］
スライドグラスの上に遺伝子がスポットされた領域を囲むように、ギャップカバーグラスをのせ、端から上記で調製したラベル化溶液３０μｌを毛細現象により流し込んだ。スライドグラスをハイブリダイゼーションカセットにセットし乾燥を防ぐためにカセット内の窪みに３０μｌの精製水とガラス上のカバーグラスと離れた２点に５μｌの３×ＳＳＣを滴下した。ハイブリダイゼーションは５５℃８時間ゆるやかに振盪させながら行なった。ハイブリダイゼーション終了後、以下の操作でスライドグラスの洗浄を行なった。ハイブリダイゼーションカセットを外し、スライドグラスを２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳに浸して液中ですばやく滑り落とした。別に準備した２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中で５分間室温にて振盪した。続いて、４０℃に保温してある０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中で５分間振盪した後、０．２×ＳＳＣ中に３分間放置した。３００×ｇで１分間遠心し、スライドグラスの水分を除いた後、検出を行なった。コントロール（コハク酸）の発現量がサンプル（ＰＢＳ固型ペレット，ＰＢＳエマルジョン，１、４−ブタンジオール）のそれよりも多い場合、ＤＮＡチップのスポットは緑色に発色する。発現量が同程度の場合は黄色に発色し、サンプルの発現量がコントロールより上回る場合は、赤色に発色する。よって、ＰＢＳ存在時に特異的に発現している遺伝子はＳｕ３ＰＰ５とＳｕ３ＰＥ５で赤色に発色し、Ｓｕ３Ｂｕ５では発色がないものである（図４）。よって、Ｓｕ３ＰＰ５とＳｕ３ＰＥ５で赤色に発色している遺伝子群から、Ｓｕ３Ｂｕ５で赤色に発色している遺伝子群を差し引き、ＰＢＳ存在時に特異的に発現している遺伝子を検索した。なお、Ｓｕ３ＰＰ５、Ｓｕ３ＰＥ５、Ｓｕ３Ｂｕ５全てに共通して発現するヒストンをコードする遺伝子を黄色、つまり、シグナル強度（Ｃｙ５／Ｃｙ３）約１に設定した。
［結果］
Ｓｕ３ＰＰ５、Ｓｕ３ＰＥ５、Ｓｕ３Ｂｕ５のＤＮＡマイクロアレイの結果を視覚的に解析すると、ＪＺ３９８１が、Ｓｕ３ＰＰ５とＳｕ３ＰＥ５でのみ赤色に発色していた（図５）。尚、スポットの下に示された各数字は、遺伝子発現を（Ｃｙ５／Ｃｙ３）の比で表わしている。ヒストンはコントロールである。このことから、ＪＺ３９８１がＰＢＳ分解に関わる遺伝子であることが示された。次にこのクローンについて、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＥＳＴデータベース（ｗｗｗ．ａｉｓｔ．ｇｏ．ｊｐ／ｆｆｄｂ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）に対するＢＬＡＳＴネットワークサービスを用いて、相同性の高いクローン情報を得た。
（１−２−５）ＥＳＴデータベースを用いたＪＺ３９８１の探索
［結果］
Ａ．ｏｒｙｚａｅ ＥＳＴデータベースに対してＢＬＡＳＴネットワークサービスを用いて、相同性の高いクローン情報を検索した。ＪＺ３９８１はＥｍｅｒｉｃｅｌｌａ ｎｉｄｕｌａｎｓのＲＯＤＬＥＴ ＰＲＯＴＥＩＮ ＰＲＥＣＵＲＳＯＲに４ｅ−５７、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓのＨＹＤＲＯＰＨＯＢＩＮ ＰＲＥＣＵＲＳＯＲに９ｅ−５７の相同性を示した。さらに、ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｎ（ハイドロホービン）に保存されている８つのシステイン残基を含んでおり、このクローンはＡ．ｏｒｙｚａｅのｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｎ（ハイドロホービン）遺伝子（ｈｙｐ）であることが明らかとなった。
（１−３）麹菌Ａ．ｏｒｙｚａｅハイドロホービン遺伝子（ｈｙｐ）の単離
（１−３−１）ＪＺ３９８１の塩基配列の解析
ＥＳＴクローンＪＺ３９８１のＥＳＴ情報は部分配列のみであったので、ＪＺ３９８１の全塩基配列を決定した。
［方法］
ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒを用いてシークエンシングを行なった。

上記のような反応系を作製し、ＴａＫａＲａ ＰＣＲ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ ＰＥＲＳＯＮＡＬ（宝酒造（株））にてＰＣＲ反応を行なった。ＰＣＲ反応条件は９６℃３分、９６℃１０分、５０℃５分、６０℃４分を３０ｃｙｃｌｅとした。ＰＣＲ反応後、エタノール沈殿を行なった後、ｌｏａｄｉｎｇ ｄｙｅ １５μｌに溶解し３分間煮沸したのち、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒに供し、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ Ｓｅａｑｕｅｎｃｉｎｇ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｖｅｒｓｉｏｎ ３．０で解析した。
［結果］ＪＺ３９８１がハイドロホービンの完全長を含むことを確認した（図６）。

（２）ハイドロホービン高発現麹菌の育種
（２−１）麹菌用ハイドロホービン高発現プラスミドの構築
ハイドロホービン高発現麹菌を育種するために、麹菌用ハイドロホービン高発現プラスミドを構築した。麹菌発現用ベクターであるｐＮＧＡ１４２系ベクターを用いた（「キノコとカビの基礎科学とバイオ技術」宍戸和夫・編著（アイピーシー）ｐ．５３４）。また、ハイドロホービンの高発現には構成的プロモーターの存在が不可欠であるため、目的遺伝子の上流に目的遺伝子（ｈｙｐ）の上流にｅｎｏＡ ｐｒｏｍｏｔｅｒを融合させたｐＮＧ−ｅｎｏＰ−ｈｙｐを作製した（図７）。
［材料］
▲１▼試薬
各種制限酵素、修飾酵素類は宝酒造（株）、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ山之内（株）、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓのものを適宜用いた。試薬を調製する際はミリＱ水を用い、特に断りのない限り１２１℃、２０分間オートクレーブ滅菌した。
▲２▼菌株
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）はＸＬ１−Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いた。麹菌はＡｏｒｙｚａｅ ＲＩＢ４０を用いた。
▲３▼培地
用いた大腸菌用培地は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社のＸＬ１−Ｂｌｕｅ添付のマニュアルに従った。
１−４−１）ｐＮＧ−ｅｎｏＰ−ｈｙｐの構築
「材料」
▲４▼ベクター
ベクターとしては、ｅｎｏＡ ｐｒｏｍｏｔｅｒを含むｐＮＧＥＧ−ｄ１（Ｔｏｄａ Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．４０：２６０−２６７，［２００１］）を使用した。インサートを含むＪＺ３９８１（ｐＳＰＯＲＴ１−ｈｙｐ）は醸造研究所（現在の独立行政法人酒類総合研究所：広島県広島市鏡山３−７−１）から分譲を受けた。
「方法」
▲１▼制限酵素によるＤＮＡの切断
ｐＮＧＥＧ−ｄ１、ｐＳＰＯＲＴ １−ｈｙｐ各々をＸｂａＩとＳａＡにより切断した。
▲２▼ベクターＤＮＡ、インサートＤＮＡの調製
ベクターＤＮＡ、インサートＤＮＡともに、制限酵素で完全に切断した後、アガロースゲル電気泳動に供し、長波長（３６６ｎｍ）ＵＶ下でＤＮＡフラグメントを切り出した。その後、ｐｒｅｐ Ａ ｇｅｎｅ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ−Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）にてＤＮＡを回収し、ベクターＤＮＡ、インサートＤＮＡとした。
▲３▼ライゲーション
ライゲーション反応は調整したベクターＤＮＡとインサートＤＮＡ、さらにＴ４ ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、５×ｌｉｇａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（２５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ；ｐＨ７．６、５０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、５ｍＭ ＡＴＰ、５ｍＭ ＤＴＴ、２５％ＰＥＧ−８０００）、滅菌水で２０μｌにし１６℃で１６時間反応させた。
▲４▼大腸菌の形質転換
ライゲーション液１０μｌに１０μｌの１０×ＫＣＭ（１Ｍ ＫＣｌ、０．３Ｍ ＣａＣｌ_２、０．５Ｍ ＭｇＣｌ_２）、７μｌの３０％ポリエチレングリコール（＃６０００）、７３μｌの滅菌水を加え、よく撹拌した。これを氷中でよく冷却した後、氷上解凍したコンピテントセルを１００μｌ加え穏やかに撹拌し、氷中で２０分間、続いて室温で１０分間放置した。これに、２００μｌのＬＢ液体培地を加え、終濃度１００μｇ／ｍｌになるようにアンピシリンを添加したＬＢ平板培地にまき、３７℃で一晩培養した。
▲５▼プラスミドＤＮＡの調製
目的のプラスミドＤＮＡを用いて形質転換した大腸菌の単一のコロニーを、終濃度１００μｇ／ｍｌになるようにアンピシリンを添加した３ｍｌＬＢ液体培地に植菌し、３７℃で一晩振盪培養した。１．５ｍｌの培養液を２ｍｌのエッペンドルフチューブに移して１５，０００×ｇで１分間遠心分離し、沈殿を１００μｌの氷冷したＴＥＧ（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭ Ｇｌｕｃｏｓｅ、ｐＨ８．０）で懸濁し、これに２００μｌの０．２Ｎ ＮａＯＨ−１％ＳＤＳを加えて穏やかに撹拌した後、１５０μｌの３Ｍ ＮａＯＡｃ ｐＨ５．２を加えて混合した。これを１５，０００×ｇで４℃で５分間遠心分離し上清を回収し４５０μｌのフェノール・クロロホルム・イソアミルアルコール（２５：２４：１）を加えて激しく撹拌した後、１５，０００×ｇ、室温で５分間遠心分離し上層を回収した。この溶液に−２０℃で氷冷した９００μｌのエタノールを加えて−２０℃で１０分間放置後、１５，０００×ｇで４℃で５分間遠心分離した。沈殿を５００μｌの７０％エタノールでリンスしたのち、乾燥させ、最後にＲＮａｓｅＨ（１００μｇ／ｍｌ）を含むＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）５０μｌに溶解した。得られたプラスミドをＸｂａＩとＳａＡで切断後、アガロース電気泳動により挿入断片の存在を認め、ｐＮＧ−ｅｎｏＰ−ｈｙｐの完成を確認した。
（２−２）ハイドロホービン高発現麹菌の形質転換・育種
アスペルギルス・オリゼの形質転換はプロトプラスト−ＰＥＧ法を改良した方法を用い、形質転換するプラスミドＤＮＡは上記で作製したｐＮＧ−ｅｎｏＰ−ｈｙｐ，ｐＮＧ−ｅｎｏＰ（ｐＮＧ−ｅｎｏＰ−ｈｙｐのハイドロホービン遺伝子インサート無し−ベクターのみ）を用いた。これらのプラスミドＤＮＡ１０μｇをＭｕｎＩで完全消化し、定法によりフェノール抽出、エタノール沈澱処理を行った後１０μｌのＴＥに溶解し形質転換用ＤＮＡ溶液とした。
アスペルギルス・オリゼｎｉａＤ３００株（ＲＩＢ４０株由来の硝酸還元酵素遺伝子（ｎｉａＤ）欠損変異株：醸造研究所より分与）の胞子懸濁液をＹＰＤ液体培地に添加し、３０℃、１２時間振盪培養した。培養液よりガラスフィルターを用いで集菌した。菌体を５０ｍｌ容の遠心チューブに移し、１０ｍｌのプロトプラスト化溶液（０．６Ｍ ＫＣｌ，０．２Ｍ ＮａＨ_２ＰＯ_４，ｐＨ５．５，５ｍｇ／ｍｌ Ｌｙｓｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．），１０ｍｇ／ｍｌ Ｃｅｌｌｕｌａｓｅ Ｏｎｏｚｕｋａ Ｒ−１０（Ｙａｋｕｌｔ Ｐｈｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｉｎｄ．Ｃｏ．，Ｌｔｄ．），１０ｍｇ／ｍｌ Ｙａｔａｌａｓｅ（ＴａＫａＲａ））を加え懸濁し、３０℃９０ｒｐｍ，３時間振盪しプロトプラスト化反応を行った。滅菌したＭＩＲＡＣＬＯＴＨ（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ）にて濾過し、濾液中のプロトプラストを３０００×ｇ，４℃，５分間遠心分離することで沈澱として得た。ＳｏｌＩ（１．２Ｍソルビトール，５０ｍＭ ＣａＣｌ_２，Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｂｕｆｆｅｒ，ｐＨ７．５）にて３回プロトプラストを洗浄し、３０００×ｇ，４℃，５分間遠心分離することで沈澱として得た。このプロトプラストを１×１０^９個プロトプラスト／ｍｌになるようにＳｏｌＩに懸濁した。プロトプラスト懸濁液１００μｌに前述の形質転換用プラスミドＤＮＡ溶液各１０μｌと１２．５μｌのＳｏｌＩ（５０（ｗ／ｖ％）ＰＥＧ＃４０００，５０ｍＭ ＣａＣｌ_２，１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｂｕｆｆｅｒ，ｐＨ７．５を加えよく混合し、氷中で３０分間放置した。次にこの混合液を５０ｍｌ容の遠心チューブに移し、１ｍｌのＳｏｌＩを加え混合した後、２ｍｌの１．２Ｍソルビトール，５０ｍＭ ＣａＣｌ_２，Ｔｔｉｓ−ＨＣｌ ｂｕｆｆｅｒ，ｐＨ７．５を加えよく混合した。５５℃に温めておいたＣｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ軟寒天培地にプロトプラスト懸濁液を加え混合し、Ｃｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ寒天培地に重層した。その後、３０℃で胞子を形成するまで培養した。
胞子形成後、白金針にて分生子柄をかきとり、０．０１％（ｖ／ｖ％）Ｔｗｅｅｎ８０に懸濁し、この懸濁液を希釈し、Ｃｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ寒天培地に広げ３０℃で培養することを繰り返し単胞子分離をおこなった。単胞子分離の確認はＨｏｎｄｅｌ法（胞子ＰＣＲ法）を改変しておこなった。白金針にて２００μｌのＹＰＤ培地が入った１．５ｍｌ容マイクロチューブに分生子を添加し、３０℃で４０時間培養した。培養菌体を新しい１．５ｍｌ容マイクロチューブに移し、５０μｌのプロトプラスト化溶液０．８Ｍ ＫＣｌ，１０ｍＭクエン酸，ｐＨ６．５，２．５ｍｇ／ｍｌ Ｌｙｓｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ（Ｓｉｇｎａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．），２．５ｍｇ／ｍｌ Ｙａｔａｌａｓｅ（ＴａＫａＲａ））を加えて懸濁し、３７℃で一時間放置した後、９５℃で３分間加温し、次いで５分間以上氷上に放置し菌体を沈澱させた。この上清５μｌを鋳型としてＰＣＲの反応系に用いた。
ｐＮＧ−ｅｎｏＰ−ｈｙｐの胞子ＰＣＲ用のプライマーとして５’−ＡＴＴＣＧＣＧＡＡＡＡＴＧＧＴＡＧＣＴＣＧＡＧＧＡ−３’と５’−ＧＴＡＧＡＡＴＣＡＣＧＡＡＴＧＡＧＡＣＣＴＴＴＧＡＣＧＡＣＣ−３’の２種のオリゴヌクレオチドを合成し、ｐＮＧ−ｅｎｏＰのプライマーとして５’−ＧＴＡＧＡＡＴＣＡＣＧＡＡＴＧＡＧＡＣＣＴＴＴＧＡＣＧＡＣＣ−３’と５’−ＧＴＴＡＧＴＣＧＡＣＴＧＡＣＣＡＡＴＴＣＣＧＣＡＧ−３’の２種のオリゴヌクレオチドを合成した。ＰＣＲ用装置はＰＣＲ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ ＰＥＲＳＯＮＡＬ（宝酒造）を用いた。ポジティブコントロールとして形質転換に使用にしたプラスミドＤＮＡを鋳型とした。ｐＮＧ−ｅｎｏＰ−ｈｙｐの増幅反応は９５℃，３分間鋳型ＤＮＡを変性し、９４℃，１分間，５５．５℃，１分間，７２℃，９０秒間保持するサイクルを３０サイクルおこなった後、７２℃，９５秒間で完全伸長させ４℃で保持した。ｐＮＧ−ｅｎｏＰの増幅反応は９５℃，３分間鋳型ＤＮＡを変性し、９４℃，１分間，５７℃，１分間，７２℃，９０秒間保持するサイクルを３０サイクルおこなった後、７２℃，９５秒間で完全伸長させ４℃で保持した。得られたＰＣＲ増幅断片をアガロース電気泳動に供したところ、ポジティブコントロールと同じ位置にＰＣＲ断片の増幅が確認され、その結果より、麹菌の染色体ＤＮＡ上にエノラーゼプロモーター配列下流にハイドロホービン遺伝子の挿入された配列の存在が確認され、ｐＮＧ−ｅｎｏＰもまた形質転換されたことが確認された。
形質転換されたハイドロホービン高発現麹菌とハイドロホービン遺伝子を挿入していない麹菌（ｐＮＧ−ｅｎｏＰ）を２００ｍｌのＹＰＤ培地（１（ｗ／ｖ％）酵母エキス，２（ｗ／ｖ％）ペプトン，２（ｗ／ｖ％）グルコース）に２５００胞子／ｍｌ濃度で植菌し、３０℃，２４時間振盪培養しガラスフィルターで菌体を濾過し、培養上清を得た。培養上清１ｍｌに対して５００μｌの１００（ｗ／ｖ％）冷トリクロロ酢酸を加え、よく混合した後、氷中に１２−１６時間放置した。サンプルを１５０００×ｇ，４℃，２０分間遠心分離し上清を完全に除いた後、沈澱を１５μｌのＳＤＳ化溶液（０．０６３Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｂｕｆｆｅｒ，ｐＨ６．８，２（ｗ／ｖ％）ＳＤＳ，１（ｖ／ｖ％）２−メルカプトエタノール，１０（ｗ／ｖ％）グリセロール，０．０５（ｗ／ｖ％）ブロモフェノールブルー）に溶解させたあと、沸騰湯浴中に５分間放置しＳＤＳ化をおこない、これをサンプルとした。以後のＳＤＳ−ＰＡＧＥとＰＶＤＦ膜へのブロッティングの方法はＳｃｈａｇｇｅｒら（Ｓｃｈａｇｇｅｒ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１６６，３６８−３７９）の方法にしたがった。泳動板は、１６０ｍｍ×１６０ｍｍ，１ｍｍ厚のものを使用し、電流１０ｍＡ一定で泳動を開始しサンプルのグリセロール前線が泳動板の先端まで泳動したところで電気泳動を止めた。その後、電気泳動したゲルをＰＶＤＦ膜に転写し、ＰＶＤＦ膜上より１４．３ｋＤａの断片を切り抜き、そのままアミノ末端アミノ酸配列の解析をおこなった。解析の結果アミノ末端からＬＰＰＡＳであり、麹菌ハイドロホービンＥＳＴクローンの塩基配列をアミノ酸置換したものと相同検索をしたところ一致したため培養上清にハイドロホービンがあることが確認された。またＰＶＤＦ膜に転写すると同時にＣＢＢ染色をしたところハイドロホービン遺伝子を挿入していない麹菌の培養上清からは、分子量１４．３ｋＤａにバンドが確認されなかったことから。ハイドロホービン高発現麹菌はその細胞表層のみならず高度にハイドロホービンを培養上清に分泌していることが確認された（図８）。
尚、プラスミドＤＮＡ（ｐＮＧ−ｅｎｏＰ−ｈｙｐ）で形質転換されたハイドロホービン高発現麹菌は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１）に平成１４年１０月４日付けで寄託され、受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−１９０５５を付与されている。

（３）生分解性プラスチック分解酵素クチナーゼ遺伝子の取得とその高発現麹菌の育種
生分解性プラスチック分解因子として分解酵素があげられる。そこで、生分解性プラスチック分解酵素遺伝子を取得するとともに、その高発現麹菌株の育種を行った。生分解性プラスチックとしてはＰＢＳを用いた。
（３−１）アスペルギルス・オリゼ由来ＰＢＳ（ポリブチレンサクシネート）分解酵素の精製
０．５×１０^６個胞子／ｍｌとなるようにアスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０胞子懸濁液を５００ｍｌ容三角フラスコ内の１００ｍｌの１（ｖ／ｖ％）ＰＢＳ乳化液（昭和高分子）を含み、唯一の炭素源としたＣｚａｐｅｋ Ｄｏｘ培地（３４μｇ／ｍｌクロラムフェニコール）（Ｎａｋａｊｉｍａ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．，３７，３２２−３２７）に添加した。添加後３０℃，１２５ｒｐｍ，５日間培養した。培養液をＭＩＲＡＣＬＯＴＨ（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ（登録商標））にて濾過し、その濾液を８０００ｇ，４℃，２０分間遠心分離し得られた上清を粗酵素液とした。粗酵素液に２０％飽和となるように硫酸アンモニウムを加えた後、８０００ｇ，４℃，２０分間遠心分離し得られた上清画分を得た。上清画分を１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液，ｐＨ８．０，２０％飽和硫酸アンモニウムにて平衡化したＯｃｔｙｌ−Ｃｅｌｌｕｌｏｆｉｎｅ（生化学工業）に供し、吸着画分を２０−０％飽和硫酸アンモニウムの直線濃度勾配による溶出させた。分画した溶液に対して０．１（ｖ／ｖ％）となるようにＰＢＳ乳化液を添加し、３７℃にて保温し、その濁度の低下（ＰＢＳの分解）によって活性画分を追跡した。得られた活性画分を１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液，ｐＨ８．０に対して透析し、同緩衝液にて平衡化したＤＥＡＥ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ６５０Ｓカラム（東ソー）に供し、吸着画分を０−０．３Ｍ ＮａＣｌの直線濃度勾配により溶出させた。得られた活性画分を１０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液，ｐＨ５．５に対して透析し、同緩衝液にて平衡化したＨｉＴｒａｐ ＳＰカラム（アマシャムファルマシア バイオテク）に供し、吸着画分を０−０．３Ｍ ＮａＣｌの直線濃度勾配により溶出させた。得られた活性画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｕ．Ｋ．（１９７０）Ｎａｔｕｒｅ，２２７，６８０−６８５）に供し電気泳動的に均一であることが確認されたため、ここで得られた活性画分をＰＢＳ分解酵素精製標品とした。
（３−２）ＰＢＳ分解酵素の内部アミノ酸配列の決定
上記で得られた精製酵素溶液（０．４ｍｇ／ｍｌ）２５０μｌに対して２００μｌの１００（ｗ／ｖ％）冷トリクロロ酢酸を加え、よく混合した後、氷中に１２−１６時間放置した。サンプルを１５０００ｇ，４℃，２０分間遠心分離し、上清を完全に除いた後、沈殿を５０μｌのＳＤＳ化溶液｛０．０６３Ｍトリス−塩酸緩衝液，ｐＨ６．８，２（ｗ／ｖ％）ＳＤＳ，１（ｖ／ｖ％）２−メルカプトエタノール，１０（ｗ／ｖ％）グリセロール｝に溶解させた後、沸騰湯浴中に５分間放置しＳＤＳ化をおこない、これをサンプル溶液とした。別にＶ８プロテアーゼ溶液｛６．３μｇのＶ８プロテアーゼを２５μｌの０．０５（ｗ／ｖ％）ブロモフェノールブルー，０．０１９Ｍトリス−塩酸緩衝液，ｐＨ６．８，０．６（ｗ／ｖ％）ＳＤＳ，０．３（ｖ／ｖ％）２−メルカプトエタノール，３（ｗ／ｖ％）グリセロールに溶解させたもの｝を調製した。以後のＳＤＳ−ＰＡＧＥとＰＶＤＦ膜へのブロッティングの方法はＳｃｈａｇｇｅｒらの方法（Ｓｃｈａｇｇｅｒ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１６６，３６８−３７９）に従った。１６０ｍｍ×１６０ｍｍ，１ｍｍ厚の泳動板を使用した。５０μｌのサンプル溶液をウェルにアプライし、さらに２５μｌのＶ８プロテアーゼ溶液を重層した。電流１５ｍＡ一定で泳動を開始し、色素（ブロモフェノールブルー）が濃縮ゲルのほぼ中間まで泳動された時点で泳動を停止し、そのまま室温にて１時間放置し、ゲル内でのＶ８プロテアーゼによる限定分解をおこなった。その後電気泳動を再開し、泳動後ゲル内のタンパク質をＰＶＤＦ膜に転写した。ＰＶＤＦ膜上より７．９ｋＤａ、１０．３ｋＤａ、１１．９ｋＤａの断片を切り抜き、そのままアミノ末端アミノ酸配列の解析をおこなった（Ｍａｔｓｕｄａｉｒａ，Ｐ．（１９８７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６２，１００３５−１００３８）。１０．３ｋＤａ、１１．９ｋＤａのアミノ末端アミノ酸配列を解析した結果、両者共にアミノ末端側より、ＡＱＧＬＦＥＱＡＶＳ、であった。得られたアミノ酸配列に対してＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｉｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）のＢＬＡＳＴ検索（Ｚｈａｎｇ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．，７，６４９−６５６）を利用して相同検索をおこなったところ、アスペルギルス・オリゼの産生するクチナーゼの内部アミノ酸配列と一致した（Ｏｈｎｉｓｈｉ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．（１９９５）ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，１２６（２），１４５−１５０）。
（３−３）ＰＢＳ分解酵素遺伝子を含む染色体ＤＮＡのクローニング
ＰＢＳ分解酵素遺伝子を含む染色体ＤＮＡを取得するために、アスペルギルス・オリゼの菌糸より染色体ＤＮＡを調製した。０．５×１０^６個胞子／ｍｌとなるようにアスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０胞子懸濁液を５００ｍｌ容三角フラスコ内の１００ｍｌのＹＰＤ液体培地｛１（ｗ／ｖ％）酵母エキス，２（ｗ／ｖ％）ペプトン，２（ｗ／ｖ％）グルコース｝に添加した。添加後３０℃，１２５ｒｐｍ，１６時間培養した。培養液をガラスフィルターで濾過し菌糸を集め、蒸留水で洗浄した。菌糸を脱水した後、予め−２０℃に冷やしておいた乳鉢に菌体を入れ、液体窒素を注いで凍結させ、直ちに冷やした乳棒で細かく粉砕した。粉砕した菌糸をスパーテルで１．５ｍｌ容マイクロチューブにとり、０．４ｍｌのＴＥ（１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液，ｐＨ８．０，１ｍＭ ＥＤＴＡ）に懸濁した後、溶菌溶液｛２（ｗ／ｖ％）ＳＤＳ，０．１Ｍ ＮａＣｌ，１０ｍＭ ＥＤＴＡ，５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液，ｐＨ７．０｝を０．４ｍｌ加えてゆっくり撹拌し、室温に１５分間放置した。１５，０００×ｇ，１０分間遠心分離して上清を新しい１．５ｍｌ容マイクロチューブに回収した。フェノール・クロロホルム・イソアミルアルコール（２５：２４：１）を等量加え、ゆっくりチューブを上下に撹拌した後、１５０００ｇ，５分間遠心分離して上清を新しい１．５ｍｌ容マイクロチューブに回収した。−２０℃に冷やしたエタノールを２．５倍量加えて、−２０℃に１０分間放置した後、１５，０００×ｇ，４℃，１５分間遠心分離し上清を完全に除き沈殿を得た。沈殿を０．５ｍｌのＴＥに溶解させ、５μｌのＲＮａｓｅ Ａ（１０ｍｇ／ｍｌ）溶液を加え、３７℃に３０分間放置しＲＮＡを分解した。０．５ｍｌのフェノール・クロロホルム・イソアミルアルコール（２５：２４：１）を加え、ゆっくりチューブを上下に撹拌した後、１５，０００×ｇ，５分間遠心分離して上清を新しい１．５ｍｌ容マイクロチューブに回収した。この操作をもう１回繰り返した。０．５ｍｌのクロロホルム・イソアミルアルコール（２４：１）を加え、ゆっくりチューブを上下に撹拌した後、１５，０００×ｇ，５分間遠心分離して上清を新しい１．５ｍｌ容マイクロチューブに回収した。５０μｌの５Ｍ ＮａＣｌと１ｍｌの冷エタノールを加え、−２０℃に１０分間放置した後、１５，０００×ｇ，４℃，１５分間遠心分離し上清を完全に除き沈殿を得た。７０（ｖ／ｖ％）エタノールでＤＮＡを洗浄して１５，０００×ｇ，４℃，１０分間遠心分離し上清を完全に除き沈殿を得た。沈殿を０．１ｍｌのＴＥで溶解し、これを染色体ＤＮＡ溶液とした。
次に、前述の内部アミノ酸配列をもとに、３０塩基からなるオリゴヌクレオチド（５’−ＧＣＡＣＡＡＧＧＡＣＴＧＴＴＴＧＡＡＣＡＡＧＣＴＧＴＴＴＣＣ−３’）と、既知のクチナーゼ遺伝子塩基配列を基に、３０塩基からなるオリゴヌクレオチド（５’−ＣＣＡＧＧＣＡＧＡＣＡＡＧＡＴＣＴＣＣＣＡＣＧＧＣＧＣＡＡＴ−３’）を合成した。この１組のプライマーセットを用い、染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲをおこないサザンハイブリダイゼーションのプローブを増幅した。ＰＣＲ用装置はＰＣＲ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ ＰＥＲＳＯＮＡし（宝酒造）を用いた。染色体ＤＮＡは１００ｎｇ用い、ポリメラーゼはＥｘ ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造）を用いた。増幅反応は、９５℃，３分間鋳型ＤＮＡを変性し、９５℃，１分間、６０℃，１分間、７２℃，３０秒間保持するサイクルを３０サイクルおこなった後、７２℃，１分間で完全伸長させ、４℃で保持した。得られたＰＣＲ増幅断片をアガロースゲル電気泳動に供したところ、３００塩基対からなる断片の増幅が確認された。
次に、ＮＥＮ ＲａｎｄｏｍＰｒｉｍｅｒ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ ｗｉｔｈ Ａｎｔｉｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−ＡＰ（Ｅｉｚｏ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．）を用いてサザンハイブリダイゼーションとコロニーハイブリダイゼーションをおこなった。また今後使用したＳＳＣ液は２０倍濃度（２０ｘＳＳＣ）（１７５．４ｇ ＮａＣｌと８８．２ｇ Ｓｏｄｉｕｍ Ｃｉｔｒａｔｅ Ｄｉｈｙｄｒａｔｅを水に溶解し、１ｌに合わせた後、オートクレーブ滅菌したもの）を適宜滅菌水で希釈し調製したものを用いた。染色体ＤＮＡ１０μｇを５０ユニットのＥｃｏＲ Ｖ（宝酒造）で完全消化しアガロースゲル電気泳動に供した。トレイにアルカリトランスファー緩衝液（０．４Ｎ ＮａＯＨ）を入れ、ガラス板をのせ、緩衝液に届くまでの長さに予め切った濾紙（ＡＤＶＡＮＴＥＣ ＴＯＹＯ）をのせて緩衝液で湿らせた。この上に泳動後のゲルをのせ、同じ大きさに切ったナイロンメンブラン（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋；アマシャムファルマシア バイオテク）をゲル上に置き、さらにその上に滅菌水で湿らせた濾紙を３枚のせた。ペーパータオルを５ｃｍの高さに積み重ね、重りをのせた。１２時間ブロッティングしたあと、メンブランを４ｘＳＳＣで洗浄し、ハイブリダイゼーションをおこなった。
次に、前述のＰＣＲ反応液に対して１／１０量の５Ｍ ＮａＣｌを加えさらに２．５倍量の冷エタノールを加え、−２０℃に１０分間放置した後、１５，０００×ｇ，４℃，１５分間遠心分離し上清を完全に除き沈殿を得た。７０（ｖ／ｖ％）エタノールでＤＮＡを洗浄して１５，０００×ｇ，４℃，１０分間遠心分離し上清を完全に除き沈殿を得た。沈殿を１μｇ／μｌとなるようにＴＥに溶解した。このＤＮＡ溶液２０μｌとＮＥＮ Ｒａｎｄｏｍ Ｐｒｉｍｅｒ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ ｗｉｔｈ Ａｎｔｉｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−ＡＰのＲａｎｄｏｍ Ｐｒｉｍｅｒｓ ａｎｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ Ｍｉｘ ５μｌ、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｍｉｘ ５μｌ、Ｋｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔ １μｌを加え、ピペッティングにより混合し、３７℃で１時間反応させた。反応後、０．１Ｍ ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０を５μｌ加え、２０ｎｇ／ｍｌとなるようにｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ｛２×ＳＳＣ，０．１（ｗ／ｖ％）ＳＤＳ，５（ｗ／ｖ％）Ｄｅｘｔｒａｎ Ｓｕｌｐｈａｔｅ，０．５（ｖ／ｖ％）Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔ｝と混合したものをプローブ溶液とした。
次にブロッティング後のメンブランを２×ＳＳＣでリンスし、ハイブリダイゼーションバッグに移し、０．１ｍｌ／ｃｍ^２となるようにｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒと終濃度５０μｇ／ｍｌとなるようにＣａｒｒｉｅｒ ＤＮＡを加え、６０℃で１時間保温した。続いて２００μｌのｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒとプローブ溶液２０μｌ、Ｃａｒｒｉｅｒ ＤＮＡ（１０ｍｇ／ｍｌ）３５μｌをマイクロチューブ中で混合し、１００℃で５分間煮沸した。氷中で急冷しそのまま５分間放置した。これを予め６０℃に温めておき、ハイブリダイゼーションバッグ中の溶液と交換し、６０℃で１６時間保温した。メンブランをハイブリダイゼーションバッグより取り出し、１ｃｍ^２のメンブランあたり１ｍｌ以上の２×ＳＳＣ，１（ｗ／ｖ％）ＳＤＳで６０℃，１５分間激しく振盪することによって洗浄し、次に０．２×ＳＳＣ，０．１（ｗ／ｖ％）ＳＤＳで６０℃，１５分間同様に洗浄した。以後の操作は室温でおこなった。１ｃｍ^２のメンブランあたり１ｍｌ以上の０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液，ｐＨ７．５，０．１５Ｍ ＮａＣｌ中で激しく５分間振盪することで洗浄した。次にプラスチックバッグ内の１ｃｍ^２のメンブランあたり０．１ｍｌ以上の０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液，ｐＨ７．５，０．１５Ｍ ＮａＣｌ，０．５（ｖ／ｖ％）Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔ中で１時間振盪した。次にプラスチックバッグ内の１ｃｍ^２のメンブランあたり０．１ｍｌ以上の０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液，ｐＨ７．５，０．１５Ｍ ＮａＣｌ，０．５（ｖ／ｖ％）Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔ，１／１０００（ｖ／ｖ）Ａｎｔｉｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−ＡＰ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅとの混合液中で１時間振盪した。その後メンブランを取り出し０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液，ｐＨ７．５，０．１５Ｍ ＮａＣｌ中で５分間ずつ４回激しく振盪することで洗浄した。０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液，ｐＨ９．５，０．１Ｍ ＮａＣｌ中で５分間ずつ２回激しく振盪することで洗浄した。メンブランをプラスチックバッグに移し、これにＥＣＦ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ａｕｔｏ Ｐｈｏｓ（Ｅｉｚｏ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．）を１ｍｌ加え、遮光下で３０分間反応させた。メンブランをプラスチックバッグから取り出しさらに４時間遮光下で放置した後、蛍光分析機（ＦＬＡ−２０００；ＦＵＪＩＦＩＬＭ）にて解析した。その結果約１３００塩基対からなる強くハイブリダイズするバンドが検出された。
次に、染色体ＤＮＡ１０μｇを５０ユニットのＥｃｏＲ Ｖで完全消化しアガロースゲル電気泳動に供しエチジウムブロマイドで染色後、１３００塩基対付近のゲルをＵＶ照射下で切り出した。ゲル中よりｐｒｅｐ Ａ ｇｅｎｅ（ＢｉｏＲａｄ）を用いてＤＮＡを抽出し、これを挿入ＤＮＡ断片とした。
次にプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ＋ＤＮＡ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）２．５μｇをＥｃｏＲ Ｖ（宝酒造）にて消化し、定法によりフェノール抽出、エタノール沈殿処理をおこなった後、アルカリフォスファターゼ（宝酒造）により５’末端のリン酸を除去した。この反応液を定法によりフェノール抽出、エタノール沈殿処理をおこなった後ＴＥに溶解したものをベクターＤＮＡ溶液とした。
次に、ベクターＤＮＡ１μｇと挿入ＤＮＡ断片１．５μｇをＴ４ ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅ（宝酒造）により連結させ、連結ＤＮＡ溶液を得た。この連結ＤＮＡ溶液１０μｌと１０μｌの１０ｘＫＣＭ（１Ｍ ＫＣｌ，０．３Ｍ ＣａＣｌ_２，０．５Ｍ ＭｇＣｌ_２）、７μｌの３０（ｗ／ｖ％）ＰＥＧ＃６０００、７３μｌの滅菌水を混合し、１００μｌの形質転換可能な大腸菌ＤＨ５α（宝酒造）を加え、氷中に２０分間、室温に１０分間放置し形質転換大腸菌懸濁液を得た。ナイロンメンブラン（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋；アマシャムファルマシア バイオテク）を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地上に置き、その上に形質転換大腸菌懸濁液をまき、３７℃で１６時間培養した。メンブランを培地上より剥がし取りメンブランを１０（ｗ／ｖ％）ＳＤＳに３分間、０．５Ｎ ＮａＯＨ，１．５Ｍ ＮａＣｌに１０分間浸し、溶液を除いた後、１Ｍトリス−塩酸緩衝液，ｐＨ８．０，１．５Ｍ ＮａＣｌに浸し、溶液を除いた後、２ｘＳＳＣで洗浄した。メンブランを０．４Ｎ ＮａＯＨに１時間浸し２ｘＳＳＣで洗浄した。このメンブランを前述のサザンハイブリダイゼーションの時と同様の操作をおこない、プローブをハイブリダイズした。その結果ポジティブシグナルを得た。
次に、元の寒天培地上からポジティブシグナルとなるプラスミドＤＮＡを有する大腸菌を白金針にて拾い、ＬＢ液体培地（５０μｇ／ｍｌアンピシリン）に移植し３７℃にて１６時間振盪培養した。培養液１．５ｍｌを１．５ｍｌ容マイクロチューブに移し、１５，０００×ｇ，１分間遠心分離し培地を除いた。菌体を１００μｌのＴＥＧ（２５ｍＭトリス−塩酸緩衝液，ｐＨ８．０，１０ｍＭ ＥＤＴＡ，５０ｍＭグルコース）で懸濁し、これに２００μｌの１（ｗ／ｖ％）ＳＤＳ，０．２Ｎ ＮａＯＨを加え穏やかに混合し氷中に５分間放置した。さらに１５０μｌの３Ｍ酢酸ナトリウム，ｐＨ５．２を加え穏やかに混合し氷中に５分間放置した。これに１０Ｍ酢酸アンモニウムを１５０μｌ加え穏やかに混合し、１５，０００×ｇ，４℃，１０分間遠心分離し上清を新しい１．５ｍｌ容マイクロチューブに移した。これに６００μｌの２−プロパノールを加え、よく混合した後１５，０００×ｇ，４℃，１０分間遠心分離し上清を除いた。７０（ｖ／ｖ％）エタノールでＤＮＡを洗浄して１５，０００×ｇ，４℃，１０分間遠心分離し上清を完全に除き沈殿を得た。沈殿を０．１ｍｌのＴＥで溶解し、これをプラスミドＤＮＡ溶液とした。このプラスミドＤＮＡ中の挿入ＤＮＡ断片の塩基配列をＡＢＩ ＰＲＩＳＭ^ＴＭ ３７７ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ Ｌｏｎｇ Ｒｅａｄ（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）のプロトコールに従い、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ^ＴＭ ３７７ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）にて解析した。その結果、プラスミドＤＮＡに挿入された１３３４塩基対からなる染色体ＤＮＡのＥｃｏＲＶ消化断片には、プローブの塩基配列を含むオープンリーディングフレームが見出された。このオープンリーディングフレームは３箇所のイントロン塩基配列を含み、さらに開始メチオニンをコードする塩基配列ＡＴＧとストップコドンを含み、すなわちＰＢＳ分解酵素遺伝子の全長を有していた（Ｏｈｎｉｓｈ Ｋ．ｅｔ ａｌ．（１９９５）ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ．，１２６（２），１４５−１５０）。
（３−４）ＰＢＳ分解酵素高発現系の構築
前述のＰＢＳ分解酵素遺伝子全長を有するプラスミドＤＮＡ５μｇをＥｃｏＲＶ（宝酒造）にて消化し、アガロースゲル電気泳動に供し、エチジウムブロマイドで染色後ＵＶ照射下で１３３４塩基対からなる断片を切り出した。ゲル中よりｐｒｅｐ Ａ ｇｅｎｅ（ＢｉｏＲａｄ）を用いてＤＮＡを抽出し、これを挿入ＤＮＡ断片とした。次に塩基配列中にグルコアミラーゼのプロモーター配列（ＰｇｌａＡ１４２）を有するプラスミドｐＮＧＡ１４２ ＤＮＡ ５μｇをプロモーター配列の直後にある制限酵素ＰｍａＣＩ認識配列の位置でＰｍａＣＩ（宝酒造）で消化し、定法によりフェノール抽出、エタノール沈殿処理をおこなった後、アルカリフォスファターゼ（宝酒造）により５’末端のリン酸を除去した。この反応液を定法によりフェノール抽出、エタノール沈殿処理をおこなった後ＴＥに溶解したものをベクターＤＮＡ溶液とした。次に、ベクターＤＮＡ １μｇと挿入ＤＮＡ断片１．５μｇをＴ４ ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅ（宝酒造）により連結させ、連結ＤＮＡ溶液を得た。この連結ＤＮＡ溶液１０μｌと１０μｌの１０×ＫＣＭ（１Ｍ ＫＣｌ，０．３Ｍ ＣａＣｌ_２，０．５Ｍ ＭｇＣｌ_２）、７μｌの３０（ｗ／ｖ％）ＰＥＧ＃６０００、７３μｌの滅菌水を混合し、１００μｌの形質転換可能な大腸菌ＤＨ５α（宝酒造）を加え、氷中に２０分間、室温に１０分間放置し形質転換大腸菌懸濁液を得た。次に５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地上にに形質転換大腸菌懸濁液をまき、３７℃で１６時間培養した。培地上のコロニーを白金針にて拾い、ＬＢ液体培地（５０μｇ／ｍｌアンピシリン）に移植し３７℃にて１６時間振盪培養した。培養菌体中より前述と同様にプラスミドＤＮＡを抽出し、この麹菌形質転換用プラスミドＤＮＡ（ｐＮＧ−ｃｕｔ）を得た。このプラスミドＤＮＡ１０μｇをＭｕｎＩで消化し、定法によりフェノール抽出、エタノール沈殿処理をおこなった後 １０μｌのＴＥに溶解し形質転換用ＤＮＡ溶液とした。アスペルギルス・オリゼの形質転換はＶｏｌｌｍｅｒらのプロトプラスト−ＰＥＧ法（Ｖｏｌｌｍｅｒ，Ｓ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８３，４８６９−４８７３）を改良して行った。詳細は実施例２（２−２）に従った。
形質転換再生培地で胞子形成後、白金針にて分生子柄をかきとり、０．０１（ｖ／ｖ％）Ｔｗｅｅｎ８０に懸濁し、この懸濁液を適宜希釈し、Ｃｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ寒天培地に広げ３０℃で培養することを繰り返すことで単胞子分離をおこなった。単胞子分離の確認はＨｏｎｄｅｌ法（胞子ＰＣＲ法）（ｖａｎ，Ｚｅｉｊｉ，Ｃ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，Ｊａｎ ３；５９（３），２２１−２２４）を改変しておこなった。単胞子分離の詳細は実施例２（２−２）記載の方法に従った。胞子ＰＣＲ用プライマーとして、２種のオリゴヌクレオチド（５’−ＴＧＣＡＧＴＧＧＣＧＧＡＴＣＣＧＧＴＧＧＡＣ−３’，５’−ＧＴＡＧＡＡＴＣＡＣＧＡＡＴＧＧＡＧＣＣＴＴＴＧＡＣＧＡＣＣ−３’）を合成した。ＰＣＲ用装置はＰＣＲ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ ＰＥＲＳＯＮＡＬ（宝酒造）を用いた。ポジティブコントロールとして麹菌形質転換用プラスミドＤＮＡを鋳型とした。ポリメラーゼはＥｘ Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造）を用いた。増幅反応は、９４℃，３分間鋳型ＤＮＡを変性し、９４℃，１分間、５５．５℃，１分間、７２℃，９０秒間保持するサイクルを３０サイクルおこなった後、７２℃，９５秒間で完全伸長させ、４℃で保持した。得られたＰＣＲ増幅断片をアガロースゲル電気泳動に供したところ、ポジティブコントロールと同じ位置にＰＣＲ断片の増幅が確認され、その結果より染色体ＤＮＡ上にグルコアミラーゼ・プロモーター配列の下流にＰＢＳ分解酵素遺伝子が連結した塩基配列が挿入されたことと、それを有するアスペルギルス・オリゼ形質転換株が得られたことが確認された。このＰＢＳ分解酵素遺伝子が染色体ＤＮＡ中に挿入されたアスペルギルス・オリゼ形質転換株と、挿入されていない（ｐＮＧＡ１４２にて形質転換した）アスペルギルス・オリゼ形質転換株の胞子懸濁液を０．５×１０^６個胞子／ｍｌとなるようにグルコアミラーゼ・プロモーターの誘導物質であるマルトースを含む１００ｍｌのＹＰＭ液体培地｛１（ｗ／ｖ％）酵母エキス，２（ｗ／ｖ％）ペプトン，２（ｗ／ｖ％）マルトース｝にそれぞれ添加した。添加後３０℃，１２５ｒｐｍ，１６時間培養し、培養上清をＭＩＲＡＣＬＯＴＨ（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ（登録商標））にて濾過することで得た。得られた培養上清に対して０．１（ｖ／ｖ％）となるようにＰＢＳ乳化液を添加し、３７℃にて保温し、その濁度の低下（ＰＢＳの分解）によってＰＢＳ分解酵素の発現を確認したところ、ＰＢＳ分解酵素遺伝子が染色体ＤＮＡ中に挿入されたアスペルギルス・オリゼ形質転換株の培養上清中にのみその活性の存在が認められた。次に培養上清１００μｌに５０μｌの冷トリクロロ酢酸を加えよく混合した後、氷中で２０分間放置し、１５，０００×ｇ，４℃，１５分間遠心分離し上清を完全に除き、沈殿画分を得た。これに１５μｌのＳＤＳ化溶液｛０．０６３Ｍトリス−塩酸緩衝液，ｐＨ６．８，２（ｗ／ｖ％）ＳＤＳ，１（ｖ／ｖ％）２−メルカプトエタノール，１０（ｗ／ｖ％）グリセロール，０．０５（ｗ／ｖ％）ブロモフェノールブルー｝を加え溶解させた後、沸騰湯浴中にて５分間放置しＳＤＳ化をおこなった。これを前述のＰＢＳ分解酵素精製標品と共にＳＤＳ−ＰＡＧＥに供したところ、ＰＢＳ分解酵素遺伝子が染色体ＤＮＡ中に挿入されたアスペルギルス・オリゼ形質転換株の培養上清中にのみＰＢＳ分解酵素精製標品と同じ位置にタンパク質の発現が確認された（図９）。
尚、プラスミドＤＮＡ（ｐＮＧ−ｃｕｔ）で形質転換された生分解性プラスチック分解酵素クチナーゼ遺伝子の高発現麹菌は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１）に平成１４年１０月４日付けで寄託され、受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−１９０５４を付与されている。

（４）麹菌アスペルギルス・オリゼ ハイドロホービン高発現菌、クチナーゼ高発現菌の単独培養、及び、これらの共培養によるプラスチック分解試験（液体培養系）
ハイドロホービン高発現麹菌（ｐＮＧ−ｅｎｏＰ−ｈｙｐ）単独、クチナーゼ高発現麹菌（ｐＮＧ−ｃｕｔ）単独、コントロールとして宿主であるＲＩＢ４０株にベクターのみを導入した株（ｐＮＧＡ１４２）を実施例１記載のＣｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ最少培地にＰＢＳ乳化液０．２％，誘導基質としてマルトース０．５％を加えた培地に胞子を１×１０^６／ｍｌで添加し３０℃で２日間振盪培養した。さらにハイドロホービン高発現株とクチナーゼ高発現麹菌の共培養した試験区（ｐＮＧ−ｃｕｔ＋ｐＮＧｅｎｏＰ−ｈｙｐ）も設けた。培養２日目の培養液をＭＩＲＡＣＬＯＴＨでろ過して菌体を除き、培養ろ液の濁度（６３０ｎｍで測定）の低下を表３に示した。尚、初発の濁度（ＯＤ_６３０）は８．７３であった。その結果、共培養株＞クチナーゼ発現株＞ハイドロホービン発現株＞コントロールの順序で濁度低下が大きかった。

（５）麹菌アスペルギルス・オリゼハイドロホービン高発現菌、クチナーゼ高発現菌の単独培養、及び、これらの共培養によるプラスチック分解試験（固体培養系）
実施例４で用いたそれぞれの菌株を１×１０^７胞子個／ｍｌに調整し、０．５％（ｗ／ｖ）のＰＢＳ粉末を懸濁した最小培地（０．５％マルトース）に接種して、３０℃で８日間培養した。培養後、菌体が取り込んでいるＰＢＳ微細粉末を洗浄（菌体を５０ｍｌファルコンチューブに取り２５ｍｌ程度の滅菌水を加えボルテックスミキサーで撹拌）し、菌体とＰＢＳ微細粉末を完全に分離した。洗浄液をミラクロスろ紙で濾過し、濾液を遠心（１０，０００ｒｐｍ１５ｍｉｎ）後、上清を除き初期培養条件の液量になるように最小培地で調整し懸濁させた。その懸濁液を３００倍希釈し６３０ｎｍで吸光度を測定した。得られた結果を表４に示す。
これらの結果から、ハイドロホービン高発現株、クチナーゼ高発現株共に、宿主のＲＩＢ４０株に比較して、粉体の固形ＰＢＳにおける生育も著しく増加し、ＰＢＳの転換能が向上していることが確認された。

（６）麹菌アスペルギルス・オリゼハイドロホービン高発現菌、クチナーゼ高発現菌、及び、有用物質の生合成系に関与する酵素（有用物質）を高発現菌の共培養による有用物質の製造
次いで生分解性プラスチックＰＢＳの分解に共役した、有用物質生産の例として工業用酵素α−アミラーゼの生産を行った。実施例４と同様の培地を用いて、クチナーゼ高発現株（ｐＮＧ−ｃｕｔ組み換え体）とハイドロホービン高発現株（ｐＮＧ−ｅｎｏＰ−ｈｙｐ）の共培養、クチナーゼ高発現株（ｐＮＧ−ｃｕｔ組み換え体）とハイドロホービン高発現株（ｐＮＧ−ｅｎｏＰ−ｈｙｐ）とα−アミラーゼ高発現株（ｐＮＧ−ａｍｙ）の共培養を行った。コントロールとしてｐＮＧＡ１４２のインサートを持たないベクターのみを有するＲＩＢ４０株を用いた。ｐＮＧ−ａｍｙを保持するＲＩＢ４６形質転換体は、麹菌α−アミラーゼ遺伝子（Ｓ．Ｔａｄａ ｅｔ ａｌ．：Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，５９３−５９９［１９８９］）をクチナーゼ遺伝子同様にｐＮＧＡ１４２に挿入して作製し、ＲＩＢ４０株を形質転換して得た。実施例４の実験と同様に、培地に１×１０^６個の胞子を接種し、３０℃で２日間培養した。培養液をＭＩＲＡＣＬＯＴＨでろ過して菌体を除き、培養ろ液を得、１５０００×ｇ，４℃，１０分間遠心分離し残存するＰＢＳを完全に除き培養上清を得た。
α−アミラーゼ活性の測定は、培養上清を水にて１００倍に希釈したものを用いた。各培養上清中のα−アミラーゼ活性発現量はヨウ素呈色法にて測定した。測定用試薬溶液として、Ａ液；５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ６．８）中に可溶性澱粉を０．３％となるように溶かしたもの、Ｂ液；１Ｎ塩酸中にヨウ素を２×１０^−４％、ヨウ化カリウムを２×１０^−３％になるように溶かしたものを調製した。Ａ液４００μｌに５０μｌの希釈した培養上清を加え３７℃で１０分間反応させた。そこにＢ液を５０μｌ加え、よく混合し、直ちに６２０ｎｍの吸光度を測定し、Ｂｌａｎｋ（未接種）の値に比した吸光度の減少量をα−アミラーゼの相対活性量として表５に示した。ＰＢＳ減少量は三重共培養株＝二重共培養株＞コントロールの順序で大きかった。α−アミラーゼ活性誘導は三重共培養株＞二重共培養株＞コントロールの順序で大きく、ＰＢＳ分解で供給されるＰＢＳモノマーをエネルギー源として、三重共培養区では工業用α−アミラーゼ生産されることが明らかになった。

（７）クチナーゼーハイドロホービン共高発現株の育種
実施例３−４で得られたクチナーゼ高発現株を用いてクチナーゼーハイドロホービン共高発現株を取得するために、麹菌用ハイドロホービン高発現プラスミドを構築した。麹菌発現用ベクターであるｐＰＴＲ１ベクターを用いた。また、ハイドロホービンの高発現にはマルトースで強力に誘導がかかるｇｌａＡ１４２ ｐｒｏｍｏｔｅｒを目的遺伝子の上流に融合したｐＰＴＲ−ｇｌａ−ｈｙｐを作製した。（図１０）
（７−１）ｐＰＴＲ−ｇｌａ−ｈｙｐの構築
［材料］
ｐＰＴＲ−ｇｌａ−ｈｙｐの構築にあたり２種類のベクター（ｐＮＧＡ１４２，ｐＰＴＲ１）を使用しインサートの調製には実施例２で作成したｐＮＧ−ｅｎｏＰ−ｈｙｐを使用した。
［方法］
▲１▼制限酵素によるＤＮＡの切断
ｐＮＧＡ１４２とｐＮＧ−ｅｎｏＰ−ｈｙｐ各々をＸｂａＩとＳａｌＩにより切断した。
▲２▼ベクターＤＮＡ、インサートＤＮＡの調製
▲３▼ライゲーション
▲４▼大腸菌の形質転換
▲５▼プラスミドＤＮＡの調製
上記方法▲２▼から▲５▼については、実施例２と同様に行った。得られたプラスミドをＸｂａＩとＳａｌＩで切断後、アガロース電気泳動により挿入断片の存在を認め、ｐＮＧ−ｇｌａ−ｈｙｐの完成を確認した。
▲６▼制限酵素によるＤＮＡの切断
ｐＰＴＲ１とｐＮＧ−ｇｌａ−ｈｙｐ各々をＰｓｔＩ，ＳｍａＩで切断した
▲７▼ベクターＤＮＡ、インサートＤＮＡの調製
▲８▼ライゲーション
▲９▼大腸菌の形質転換
▲１０▼プラスミドＤＮＡの調製
上記方法▲７▼から▲１０▼については、実施例２と同様に行った。得られたプラスミドをＰｓｔＩとＳｍａＩで切断後、アガロース電気泳動により挿入断片の存在を認め、ｐＰＴＲ−ｇｌａ−ｈｙｐの完成を確認した。
（７−２）クチナーゼ−ハイドロホービン共高発現麹菌の育種
アスペルギルス・オリゼ（実施例３−４で得られたクチナーゼ高発現株）の形質転換はプロトプラスト−ＰＥＧ法を改良した方法を用い、形質転換するプラスミドＤＮＡは上記で作製したｐＰＴＲ−ｇｌａ−ｈｙｐを用いた。これらのプラスミドＤＮＡ１０μｇをＳａｃＩＩで完全消化し、定法によりフェノール抽出、エタノール沈澱処理を行った後１０μｌのＴＥに溶解し形質転換用ＤＮＡ溶液とした。以降のアスペルギルス・オリゼの形質転換については実施例２（２−２）に記した方法に従った。
但しプロトプラスト再生培地であるＣｚａｐｅｃ−Ｄｏｘ軟寒天培地には１００μｇ／ｍｌとなるようにピリチアミン（ＴａＫａＲａ）を添加したものを用いた。さらに培地上で形成した胞子をピリチアミンを含むＣｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ寒天培地に植え継ぐことで単胞子分離を行った。ｐＰＴＲ−ｇｌａ−ｈｙｐの胞子ＰＣＲ用のプライマーとして５’−ＡＴＴＣＧＣＧＡＡＡＡＴＧＧＴＡＧＣＴＣＧＡＧＧＡ−３’と５’−ＣＴＧＴＧＴＣＣＣＧＴＡＴＧＴＡＡＣＧＧＴＧ−３’の２種のオリゴヌクレオチドを合成した。ＰＣＲ用装置はＰＣＲ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ ＰＥＲＳＯＮＡＬ（宝酒造）を用いた。ポジティブコントロールとして形質転換に使用にしたプラスミドＤＮＡを鋳型とした。ｐＰＴＲ−ｇｌａ−ｈｙｐの増幅反応は９５℃，３分間鋳型ＤＮＡを変性し、９４℃，１分間，５５．５℃，１分間，７２℃，９０秒間保持するサイクルを３０サイクルおこなった後、７２℃，９５秒間で完全伸長させ４℃で保持した。得られたＰＣＲ増幅断片をアガロース電気泳動に供したところ、ポジティブコントロールと同じ位置にＰＣＲ断片の増幅が確認され、その結果より、麹菌の染色体ＤＮＡ上にｇｌａＡ１４２ ｐｒｏｍｏｔｅｒ一配列下流にハイドロホービン遺伝子の挿入された配列の存在が確認された。
形質転換されたクチナーゼ−ハイドロホービン共高発現株を２００ｍｌのＹＰＭ培地｛実施例２（２−２）｝に１×１０^６胞子／ｍｌ濃度で植菌し、３０℃，２４時間振盪培養しガラスフィルターで菌体を濾過し、培養上清を得た。培養上清２００μｌに対して１００μｌの１００（ｗ／ｖ％）冷トリクロロ酢酸を加え、よく混合した後、氷中に１２−１６時間放置した。サンプルを１５，０００×ｇ，４℃，２０分間遠心分離し上清を完全に除いた後、沈澱を１５μｌのＳＤＳ化溶液｛実施例２（２−２）｝に溶解させたあと、沸騰湯浴中に５分間放置しＳＤＳ化をおこない、これをサンプルとした。以後のＳＤＳ−ＰＡＧＥの方法は実施例２（２−２）に記した通りとした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した後、ＣＢＢ染色により１４ｋＤａにクチナーゼ高発現株には確認されないバンドが確認されたことから、クチナーゼ−ハイドロホービン共高発現株が取得された（図１１）。

（８）麹菌アスペルギルス・オリゼクチナーゼ高発現株、ハイドロホービン高発現株、クチナーゼ・ハイドロホービン共高発現株によるプラスチック分解試験（液体培養）
実施例２で作製したハイドロホービン高発現麹菌、実施例３で作製したクチナーゼ高発現麹菌、実施例７で作製したクチナーゼ・ハイドロホービン共高発現麹菌、及びコントロールとしてｐＮＧＡ１４２株の胞子をＹＰＭ培地（１（ｗ／ｖ％）酵母エキス，２（ｗ／ｖ％）ペプトン，４（ｗ／ｖ％）マルトース）にＰＢＳ乳化液０．１％を加えた培地に１×１０^６個／ｍｌになるように植菌する。３０℃，２４時間培養し培養液をＭＩＬＡＣＬＯＴＨにて分離し培養ろ液の濁度を６３０ｎｍの波長で吸光度を測定しＰＢＳ分解率を算出した。
その結果、クチナーゼ・ハイドロホービン共高発現株＞クチナーゼ高発現株＞ハイドロホービン高発現株＞コントロール（ｐＮＧＡ１４２株）の順序で濁度の低下が大きかった。（表６）

（９）クチナーゼーハイドロホービン−アミラーゼ三重共高発現株の育種
（９−１）実施例３−４で得られたクチナーゼ高発現株を用いてクチナーゼ−ハイドロホービン−アミラーゼ三重高発現株を取得するために、ハイドロホービン高発現用プラスミドｐＰＴＲ−ｅｎｏ−ｈｙｐを作製（図１２）した。また、麹菌αアミラーゼ高発現用プラスミドｐＮＧ−ａｍｙ（図１３）は東北大学大学院農学研究科応用生命科学生命工学研究室より分譲を受けた。また、ハイドロホービンの高発現には構成的に誘導がかかるｅｎｏ Ａ ｐｒｏｍｏｔｅｒを目的遺伝子の上流に融合させたｐＰＴＲ−ｅｎｏ−ｈｙｐを作成した。α−アミラーゼの高発現には、マルトースで強力に誘導がかかるｇｉａＡ１４２ ｐｒｏｍｏｔｅｒを目的遺伝子の上流に融合させたｐＮＧ−ａｍｙも分譲を受けた。
［材料］
ｐＰＴＲ−ｅｎｏＰ−ｈｙｐの構築にあたりベクターにｐＰＴＲ１を使用しインサートは実施例２で作成したｐＮＧ−ｅｎｏＰ−ｈｙｐを使用した。
［方法］
▲１▼制限酵素によるＤＮＡの切断
ｐＰＴＲ１とｐＮＧ−ｅｎｏＰ−ｈｙｐ各々をＰｓｔＩとＳｍａＩにより切断した。
▲２▼ベクターＤＮＡ、インサートＤＮＡの調製
▲３▼ライゲーション
▲４▼大腸菌の形質転換
▲５▼プラスミドＤＮＡの調製
上記方法▲２▼から▲５▼については、実施例２と同様に行った。得られたプラスミドをＰｓｔＩとＳｍａＩで切断後、アガロース電気泳動により挿入断片の存在を認め、ｐＰＴＲ−ｅｎｏＰ−ｈｙｐの完成を確認した。
（９−２）クチナーゼ−ハイドロホービン−アミラーゼ三重共高発現麹菌の育種
アスペルギルス・オリゼの形質転換はプロトプラストＰＥＧ法を改良した方法を用い、形質転換するプラスミドＤＮＡは上記で作製したｐＰＴＲ−ｅｎｏＰ−ｈｙｐとｐＮＧ−ａｍｙを用いた。ｐＰＴＲ−ｅｎｏＰ−ｈｙｐプラスミドＤＮＡ１０μｇをＳａｃＩＩで完全消化し、定法によりフェノール抽出、エタノール沈澱処理を行った後１０μｌのＴＥに溶解し形質転換用ＤＮＡ溶液とした。さらにｐＮＧ−ａｍｙプラスミドＤＮＡについては１０μｇを制限酵素処理をせずに１０μｌのＴＥに溶解し形質転換用ＤＮＡ溶液とした。以降のアスペルギルス・オリゼの形質転換については実施例７（７−１−２）に記した方法を踏襲した。ｐＰＴＲ−ｅｎｏＰ−ｈｙｐの胞子ＰＣＲ用のプライマーとして５’−ＡＴＴＣＧＣＧＡＡＡＡＴＧＧＴＡＧＣＴＣＧＡＧＧＡ−３’と５’−ＣＴＧＴＧＴＣＣＣＧＴＡＴＧＴＡＡＣＧＧＴＧ−３’の２種のオリゴヌクレオチドを合成した。ｐＮＧ−ａｍｙの胞子ＰＣＲ用のプライマーとして５’−ＧＧＴＴＣＧＣＴＴＣＧＴＡＡＧＴＣＴＴＣＣＣＴＴ−３’と５’−ＧＴＡＧＡＡＴＣＡＣＧＡＡＴＧＡＧＡＣＣＴＴＴＧＡＣＧＡＣＣ−３’のオリゴヌクレオチドを合成した。ＰＣＲ用装置はＰＣＲ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ ＰＥＲＳＯＮＡＬ（宝酒造）を用いた。ポジティブコントロールとして形質転換に使用にしたプラスミドＤＮＡを鋳型とした。ｐＰＴＲ−ｇｌａ−ｈｙｐの増幅反応は９５℃，３分間鋳型ＤＮＡを変性し、９４℃，１分間，５５．５℃，１分間，７２℃，９０秒間保持するサイクルを３０サイクルおこなった後、７２℃，９５秒間で完全伸長させ４℃で保持した。得られたＰＣＲ増幅断片をアガロース電気泳動に供したところ、ポジティブコントロールと同じ位置にＰＣＲ断片の増幅が確認され、その結果より、麹菌の染色体ＤＮＡ上にｅｎｏＡ ｐｒｏｍｏｔｅｒ配列下流にハイドロホービン遺伝子の挿入された配列とｇｌａＡ１４２ ｐｒｏｍｏｔｅｒ配列下流にαアミラーゼ遺伝子の挿入された配列の存在が確認された。
形質転換されたクチナーゼ−ハイドロホービン共高発現株を２００ｍｌのＹＰＭ培地｛実施例２（２−２）｝に１×１０^６胞子／ｍｌ濃度で植菌し、３０℃，２４時間振盪培養しガラスフィルターで菌体を濾過し、培養上清を得た。培養上清２００μｌに対して１００μｌの１００（ｗ／ｖ％）冷トリクロロ酢酸を加え、よく混合した後、氷中に１２−１６時間放置した。サンプルを１５，０００×ｇ，４℃，２０分間遠心分離し上清を完全に除いた後、沈澱を１５μｌのＳＤＳ化溶液｛実施例２（２−２）｝に溶解させたあと、沸騰湯浴中に５分間放置しＳＤＳ化をおこない、これをサンプルとした。以後のＳＤＳ−ＰＡＧＥの方法は実施例２（２−２）に記した通りとした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した後、、ＣＢＢ染色により１４ｋＤａにクチナーゼ高発現株には、確認されないバンドが確認されたことから、クチナーゼ−ハイドロホービン−αアミラーゼ三重共高発現株（Ａ．ｏｒｙｚａｅ ｐＮ−ｃｈａ株）がハイドロホービンを高発現することが確認された。（図１４）。
（９−３）αアミラーゼ発現の確認
次いで生分解性プラスチックＰＢＳの分解に共役した、物質生産の例として工業用酵素α−アミラーゼの生産を行った。表５同様の培地を用いて、実施例７で作製したクチナーゼ・ハイドロホービン共高発現株、及び本実施例で作製したクチナーゼ−ハイドロホービン−アミラーゼ三重共高発現株（Ａ．ｏｒｙｚａｅ ｐＮ−ｃｈａ株）の培養を行った。コントロールとしてｐＮＧＡ１４２のインサートを持たないベクターのみを有するｐＮＧＡ１４２株を用いた。培地に１×１０^６個の胞子を接種し、３０℃で２４時間培養した。培養液をＭＩＲＡＣＬＯＴＨでろ過して菌体を除き、培養ろ液を得、１５，０００×ｇ，４℃，１０分間遠心分離し残存するＰＢＳを完全に除き培養上清を得た。α−アミラーゼ活性の測定は、培養上清を水にて１００倍に希釈したものを用い実施例６の方法と同様のヨウ素呈色法にて測定した。
即ち、測定用試薬溶液として、Ａ液；５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ６．８）中に可溶性澱粉を０．２％となるように溶かしたもの、Ｂ液；１Ｎ塩酸中にヨウ素を２×１０^−４％、ヨウ化カリウムを２×１０^−３％になるように溶かしたものを調製した。Ａ液４００μｌに５０μｌの希釈した培養上清を加え３７℃で１０分間反応させた。そこにＢ液を５０μｌ加え、よく混合し、直ちに６２０ｎｍの吸光度を測定し、Ｂｌａｎｋ（未接種）の値に比した吸光度の減少量をα−アミラーゼの相対活性量として表７に示した。αアミラーゼ活性測定結果からアミラーゼ遺伝子を挿入した三重高発現株がもっとも高いαアミラーゼ活性を示した事から、三重共高発現株の取得を確認した。

（１０）ハイドロホービンホモログ
（１０−１）Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＥＳＴデータベースを用いたハイドロホービンホモログの探索
現在までに報告されている糸状菌、担糸菌のハイドロホービンの塩基配列、アミノ酸配列からＡ．ｏｒｙｚａｅ ＥＳＴデータベースに対してＢＬＡＳＴネットワークサービスを用い、相同性の高いクローン情報を探索した。
探索結果としてＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅハイドロホービンｈｙｐ Ｂ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＥＳＴデータベースのマッチング結果：塩基配列のｅ値：０．０、アミノ酸配列のｅ値：６ｅ−３６）（配列表２）、Ｐｈｏｌｉｏｔａ ｎａｍｅｋｏハイドロホービンと相同性（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＥＳＴデータベースのマッチング結果：塩基配列のｅ値：０．０２９、アミノ酸配列のｅ値：１ｅ−１９）を示すクローンｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｎ−３１５（配列表３）の情報が得られ、ハイドロホービンに保持されている８つのシステイン残基を含んでいた。このことより、このクローンはＡ．ｏｒｙｚａｅのハイドロホービンであることが明らかになった。
（１０−２）麹菌Ａ．ｏｒｙｚａｅハイドロホービン遺伝子ホモログのクローニングと高発現株の育種
（１０−２−１）ｈｙｐＢのクローニング
ＢＬＡＳＴネットワークサービスの情報からｈｙｐＢのＯＲＦ（オープンリーディングフレム）を予想し、ＰＣＲにて増幅される断片にＯＲＦが含まれるように２種類のオリゴヌクレオチド５’−ＣＡＡＣＣＣＡＡＣＣＧＴＣＧＡＣＡＴＧＡＡＧＴＴＣＴ−３’と５’−ＧＣＣＡＡＡＴＧＧＣＧＴＣＴＡＧＡＴＴＡＣＡＧＡＣＣ−３’を合成しクローニング用のｐｒｉｍｅｒとした。鋳型ＤＮＡとして実施例３−３で調整したＡ．ｏｒｙｚａｅ ＲＩＢ ４０染色体ＤＮＡを使用した。ＰＣＲ用装置はＰＣＲ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ ＰＥＲＳＯＮＡＬ（宝酒造）を用いた。増幅反応は９５℃，３分間鋳型ＤＮＡを変性し、９５℃，１分間，５７．２℃，３０秒間，７２℃，９０秒間保持するサイクルを３０サイクル行った後、７２℃，９０秒間で完全伸長させ４℃で保持した。実際にＰＣＲによってＤＮＡ断片が増幅されているかをアガロース電気泳動により確認した。さらにＰＣＲで目的遺伝子に変異が入っているかを確認するため、塩基配列のシークエンスを行った。ＰＣＲ増幅断片をアガロース電気泳動に供し長波長（３６３ｎｍ）ＵＶ下でＤＮＡフラグメントを切り出しｐｒｅｐ Ａ ｇｅｎｅ（ＢＩＯ−Ｒａｄ−Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）にてＤＮＡを回収した。ＰＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用し回収したＰＣＲ断片をＰＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍｓに添付のプロトコルに沿ってＴＡクローニングを行った。このプラスミドＤＮＡ（ＴＡ−ｈｙｐＢ）中の挿入ＤＮＡ断片の塩基配列をＡＢＩ ＰＲＩＳＭ^ＴＭ ３７７ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ Ｌｏｎｇ Ｒｅａｄ（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）のプロトコールに従い、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ^ＴＭ ３７７ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）にて解析した。解析結果からＰＣＲ反応によって得られた増幅断片中の塩基配列の変異は確認されなかった。
（１０−２−２）ｈｙｐ Ｂ高発現プラスミドの構築
ｈｙｐＢ高発現麹菌を育種するために、麹菌用ｈｙｐＢ高発現プラスミドを構築した。麹菌発現用ベクターであるｐＮＧＡ１４２系ベクターを用いた。またｈｙｐＢ高発現にはマルトースで強力に誘導がかかるｇｌａＡ１４２ ｐｒｏｍｏｔｅｒを目的遺伝子の上流に融合させたｐＮＧ−ｇｌａ−ｈｙｐＢを作製した。（図１５）
［材料］
ｐＮＧ−ｇｌａ−ｈｙｐＢの構築にあたりベクターをｐＮＧＡ１４２をインサートはＴＡ−ｈｙｐＢを使用した。
［方法］
▲１▼制限酵素によるＤＮＡの切断
ｐＮＧＡ１４２とＴＡ−ｈｙｐＢ各々をＸｂａＩとＳａ／Ｉにより切断した。
▲２▼ベクターＤＮＡ、インサートＤＮＡの調製
▲３▼ライゲーション
▲４▼大腸菌の形質転換
▲５▼プラスミドＤＮＡの調製
上記方法▲２▼から▲５▼については、実施例２と同様に行った。得られたプラスミドをＸｂａＩとＳａｌＩで切断後、アガロース電気泳動により挿入断片の存在を認め、ｐＮＧ−ｇｌａ−ｈｙｐＢの完成を確認した。
（１０−２−３）ｈｙｐＢ高発現株の育種
アスペルギルス・オリゼの形質転換はプロトプラストＰＥＧ法を改良した方法を用い、形質転換するプラスミドＤＮＡは上記で作製したｐＮＧ−ｇｌａ−ｈｙｐＢを用いた。これらのプラスミドＤＮＡ１０μｇをＭｕｎＩで完全消化し、定法によりフェノール抽出、エタノール沈澱処理を行った後１０μｌのＴＥに溶解し形質転換用ＤＮＡ溶液とした。以降のアスペルギルス・オリゼの形質転換についてはは実施例２（２−２）に記した方法を踏襲した。集菌した菌体を実施例２と同様にｐＮＧ−ｇｌａ−ｈｙｐＢを用いて形質転換し、ＰＮＧ−ｇｌａ−ｈｙｐＢの胞子ＰＣＲ用のプライマーとして５’−ＣＡＡＣＣＣＡＡＣＣＧＴＣＧＡＣＡＴＧＡＡＧＴＴＣＴ−３’と５’−ＧＴＡＧＡＡＴＣＡＣＧＡＡＴＧＡＧＡＣＣＴＴＴＧＡＣＧＡＣＣ−３’の２種のオリゴヌクレオチドを合成した。ＰＣＲ用装置はＰＣＲ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ ＰＥＲＳＯＮＡＬ（宝酒造）を用いた。ポジティブコントロールとして形質転換に使用にしたプラスミドＤＮＡを鋳型とした。ｐＮＧ−ｇｌａ−ｈｙｐＢの増幅反応は９５℃，３分間鋳型ＤＮＡを変性し、９４℃，１分間，５７．０℃，１分間，７２℃，９０秒間保持するサイクルを３０サイクルおこなった後、７２℃，９５秒間で完全伸長させ４℃で保持した。得られたＰＣＲ増幅断片をアガロース電気泳動に供したところ、ポジティブコントロールと同じ位置にＰＣＲ断片の増幅が確認され、その結果より、麹菌の染色体ＤＮＡ上にｇｌａＡ１４２ ｐｒｏｍｏｔｅｒ−配列下流にｈｙｐＢ遺伝子の挿入された配列の存在が確認された。
（１０−２−４）ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｎ−３１５のクローニング
Ａ．ｏｒｙｚａｅ ＥＳＴデータベースの情報からｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｎ−３１５のＯＲＦ（オープンリーディングフレム）を予想し、ＰＣＲにて増幅される断片にＯＲＦが含まれるように２種類のオリゴヌクレオチド５’−ＣＴＧＣＴＴＣＣＴＴＴＧＴＣＧＡＣＡＴＧＡＡＧＧＴ−３’と５’−ＴＣＡＡＴＧＧＴＣＴＡＧＡＡＧＣＣＣＴＴＧＧＣ−３’を合成しクローニング用のｐｒｉｍｅｒとした。鋳型ＤＮＡとして実施例３−３で調整したＡ．ｏｒｙｚａｅ ＲＩＢ ４０染色体ＤＮＡを使用した。ＰＣＲ用装置はＰＣＲ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ ＰＥＲＳＯＮＡＬ（宝酒造）を用いた。増幅反応は９５℃，３分間鋳型ＤＮＡを変性し、９５℃，１分間，５５．４℃，３０秒間，７２℃，９０秒間保持するサイクルを３０サイクル行った後、７２℃，９０秒間で完全伸長させ４℃で保持した。実際にＰＣＲによってＤＮＡ断片が増幅されているかをアガロース電気泳動により確認した。さらにＰＣＲで目的遺伝子に変異が入っているかを確認するため、塩基配列のシークエンスを（８−２−２）の方法と同様に行った。解析結果からＰＣＲ反応によって得られた増幅断片中の塩基配列の変異は確認されなかった。
（１０−２−５）ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｎ−３１５高発現プラスミドの構築
ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｎ−３１５高発現麹菌を育種するために、麹菌用ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｎ−３１５高発現プラスミドを構築した。麹菌発現用ベクターであるｐＮＧＡ１４２系ベクターを用いた。またｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｎ−３１５高発現にはマルトースで強力に誘導がかかるｇｌａＡ１４２ ｐｒｏｍｏｔｅｒを目的遺伝子の上流に融合させた
ｐＮＧ−ｇｌａ−ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｎ−３１５を作製した。（図１６）
［材料］
ｐＮＧ−ｇｌａ−ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｎ−３１５の構築にあたりベクターはｐＮＧＡ１４２をインサートはＴＡ−ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｎ−３１５を使用した。
［方法］
▲１▼制限酵素によるＤＮＡの切断
ｐＮＧＡ１４２とＴＡ−ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｎ−３１５各々をＸｂａＩとＳａｌＩにより切断した。
▲２▼ベクターＤＮＡ、インサートＤＮＡの調製
▲３▼ライゲーション
▲４▼大腸菌の形質転換
▲５▼プラスミドＤＮＡの調製
上記方法▲２▼から▲５▼については、実施例２と同様に行った。得られたプラスミドをＸｂａＩとＳａｌＩで切断後、アガロース電気泳動により挿入断片の存在を認め、ｐＮＧ−ｇｌａ−ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｎ−３１５の完成を確認した。
（１０−２−６）ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｎ−３１５高発現株の育種
アスペルギルス・オリゼの形質転換はプロトプラスト−ＰＥＧ法を改良した方法を用い、形質転換するプラスミドＤＮＡは上記で作製した
ｐＮＧ−ｇｌａ−ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｎ−３１５を用いた。これらのプラスミドＤＮＡ１０μｇをＭｕｎＩで完全消化し、定法によりフェノール抽出、エタノール沈澱処理を行った後１０μｌのＴＥに溶解し形質転換用ＤＮＡ溶液とした。以降のアスペルギルス・オリゼの形質転換についてはは実施例２（２−２）に記した方法を踏襲した。
ｐＮＧ−ｇｌａ−ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｕｎ−３１５の形質転換は、実施例２の形質転換と同様に行って、形質転換体をｐＮＧ−ｇｌａ−ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｎ−３１５の胞子ＰＣＲ用のプライマーとして５’−ＣＴＧＣＴＴＣＣＴＴＴＧＴＣＧＡＣＡＴＧＡＡＧＧＴ−３’と５’−ＧＴＡＧＡＡＴＣＡＣＧＡＡＴＧＡＧＡＣＣＴＴＴＧＡＣＧＡＣＣ−３’の２種のオリゴヌクレオチドを合成した。ＰＣＲ用装置はＰＣＲ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ ＰＥＲＳＯＮＡＬ（宝酒造）を用いた。ポジティブコントロールとして形質転換に使用にしたプラスミドＤＮＡを鋳型とした。ｐＮＧ−ｇｌａ−ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｎ−３１５の増幅反応は９５℃，３分間鋳型ＤＮＡを変性し、９４℃，１分間，５７．０℃，１分間，７２℃，９０秒間保持するサイクルを３０サイクルおこなった後、７２℃，９５秒間で完全伸長させ４℃で保持した。得られたＰＣＲ増幅断片をアガロース電気泳動に供したところ、ポジティブコントロールと同じ位置にＰＣＲ断片の増幅が確認され、その結果より、麹菌の染色体ＤＮＡ上にｇｌａＡ１４２ ｐｒｏｍｏｔｅｒ配列下流にｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｎ−３１５遺伝子の挿入された配列の存在が確認された。
（１０−２−７）カビのハイドロホービン相同遺伝子
以上、プラスチックに吸着性の麹菌のハイドロホービン遺伝子群の単離を述べたが、それらＤＮＡ及びアミノ酸配列を既知のＤＮＡ及びタンパク質データベースに対して検索を行った。その結果を、遺伝的系統樹として図１７に示した。その結果、イモチ菌Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓに相同遺伝子が存在することが明らかとなった。これらはいずれもハイドロホービン特有のシステイン残基を有していたことから、ハイドロホービンであることが確認される。これら遺伝子産物も、プラスチックの疎水表面に吸着し、生分解性プラスチック分解酵素と共同して、プラスチック分解を促進する因子として働くと予想される。
尚、図１７に示された各ハイドロホービン遺伝子のアノテーションに関する現時点での情報は以下の通りである。
Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ ＭＰＧ１
→植物感染に重要な接着因子。クローニング済
ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ ＮＯ．Ｌ２０６８５（Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ），ＡＡＡ２０１２８（Ｐｒｏｔｅｉｎ）
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ ＲｏｄＡ
→アスペルギル症感染に重要な因子。クローニング済
ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ ＮＯ．ＡＦ０５７３３５（Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ），ＡＡＢ６０７１２（Ｐｒｏｔｅｉｎ）
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ ＲｏｄＢ
→ウイルスの胞子への感染を防ぐ。クローニング済
ＡＥＭ．Ｍａｒ．２００３．ｐ１５８１−１５８８
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ ＲｏｄＡ
→胞子形成時に発現し菌体表面を疎水性にする。クローニング済
ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ ＮＯ．Ｍ６１１１３（Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ），ＡＡＡ３３３２１（Ｐｒｏｔｅｉｎ）
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ ＤｅｗＡ
→胞子形成時に発現し菌体表面を疎水性にする。クローニング済
ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ ＮＯ．Ｕ０７９３５（Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ），Ｓ６７９２４（Ｐｒｏｔｅｉｎ）
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＤｅｗＡ
→Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓのｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｎ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ ＤｅｗＡ）と相同性をもつものとして見出された。
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＲｏｌＡ
ＬＯＣＵＳ ＡＢ０９４４９６ ８６１ ｂｐ ＤＮＡ ｌｉｎｅａｒ ＰＬＮ ０７−ＭＡＲ−２００３
ＤＥＦＩＮＩＴＩＯＮ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ｒｏｌＡ ｇｅｎｅ ｆｏｒ ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｎ ｐｕｔａｔｉｖｅ，ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｃｄｓ．
ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ ＡＢ０９４４９６
ＶＥＲＳＩＯＮ ＡＢ０９４４９６．１ ＧＩ：２８８７５５２８
ＳＯＵＲＣＥ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ
ＯＲＧＡＮＩＳＭ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ
Ｅｕｋａｒｙｏｔａ；Ｆｕｎｇｉ；Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ；Ｐｅｚｉｚｏｍｙｃｏｔｉｎａ；Ｅｕｒｏｔｉｏｍｙｃｅｔｅｓ；
Ｅｕｒｏｔｉａｌｅｓ；Ｔｒｉｃｈｏｃｏｍａｃｅａｅ；ｍｉｔｏｓｐｏｒｉｃ Ｔｒｉｃｈｏｃｏｍａｃｅａｅ；Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ．
ＲＥＦＥＲＥＮＣＥ １
ＡＵＴＨＯＲＳ Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｔ．，Ｙｏｎｅｄａ，Ｓ．，Ｍａｅｄａ，Ｈ．，Ｙａｍａｇａｔａ，Ｙ．，Ａｂｅ，Ｋ．，Ｍａｃｈｉｄａ，Ｍ．，Ｇｏｍｉ，Ｋ．ａｎｄ Ｎａｋａｊｉｍａ，Ｔ．
ＴＩＴＬＥ Ｈｙｐｅｒ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｎ−ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ，ＲｏｌＡ，ｏｆ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ｂｙ ｐｏｌｙｂｕｔｙｌｅｎｅｓｕｃｃｉｎａｔｅ ｉｎ ｌｉｑｕｉｄ ｃｕｌｔｕｒｅ
ＪＯＵＲＮＡＬ Ｕｎｐｕｂｌｉｓｈｅｄ
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ｎａｍｅｋｏ（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｎ−３１５）
新規遺伝子（実施例１０参照）
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＨｙｐＢ
→本遺伝子及びその発現産物であるタンパク質は既知であり、以下のアクセッション番号にて登録されている。クローニングは既報の情報を基に行い、Ａ．ｏｒｙｚａｅ染色体ＤＮＡより単離した（実施例１０）。また本遺伝子はＰＢＳ存在時に特異的に発現することを確認している。
ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ ＮＯ．ＡＢ０９７４４８（Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ），ＢＡＣ７７２４８（Ｐｒｏｔｅｉｎ）

（１１）ＲｏｌＡの生分解性プラスチックへの吸着
ハイドロホービン（ＲｏｌＡ）が存在する系での生分解性プラスチックの分解において、ＲｏｌＡは両親媒性という物理学的特性から、生分解性プラスチックの表面に吸着することが考えられた。生分解性プラスチックとしてフィルム状（１ｍｍ）のＰＢＳ，ＰＢＳＡ，ＰＬＡを用いＲｏｌＡがこれらの生分解性プラスチックに吸着するか否かを確認した。
（１１−１）Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｎ（ＲｏｌＡ）高発現麹菌からのＲｏｌＡの精製
実施例２で得られたｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｎ高発現麹菌の胞子を１×１０^６個胞子／ｍｌになるように、１％マルトースを含む１Ｌの最少培地を入れた３Ｌ容坂口フラスコに接種し３０℃で４８時間培養した。培養液をＭＩＲＡＣＬＯＴＨ（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ）にて濾過し、培養上清を得た。培養上清に４０％飽和となるように硫酸アンモニウムを加えた後、８，０００×ｇ，４℃，２０分間遠心分離し得られた上清画分を得た。上清画分を１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液，ｐＨ８．０，４０％飽和硫酸アンモニウムにて平衡化したＯｃｔｙｌ−Ｃｅｌｌｕｌｏｆｉｎｅ（生化学工業）に供し、吸着画分を４０−０％飽和硫酸アンモニウムの直線濃度勾配による溶出させた。溶出させた全画分をＳＤＳ−ｐａｇｅに供し、予想された大きさのところにバンドが確認された画分を回収した。回収した画分を１０ｍＭクエン酸−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ．４．０）で透析し、同緩衝液で平衡化したＳ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦに供し吸着画分をＮａＣｌ，０−０．５Ｍの直線勾配で溶出させた。回収した全画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供しＣＢＢ染色により目的の大きさのバンドが均一であることが確認されたため、これを精製ＲｏｌＡとした。
（１１−２）ＲｏｌＡ抗体の作製
（１１−１）で得た、ＲｏｌＡ精製タンパク質を用いて、マウス抗ＲｏｌＡ抗体を作製した（株式会社ティーケークラフト）。
（１１−３）イミュノブロッティングによる生分解性プラスチックへのＲｏｌＡの吸着の確認
フィルム状のＰＢＳ，ＰＢＳＡ（昭和高分子）及びＰＬＡ（三井化学）、コントロールとしてスライドガラスに１ｃｍ^２に切り抜いたろ紙（Ｗｈａｔｍａｎ）に精製ＲｏｌＡ溶液（２．５μｇ ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｂｕｆｆｅｒ，ｐＨ８．０）を１０μｌろ紙にスポットし３０℃，１３時間，湿度９５％でインキュベートした。このフィルムを入れた容器に１１−２）で作製した一次抗体の１０００倍希釈液（１％ＢＳＡ，０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０，１０ｍＭリン酸緩衝液，ｐＨ７．２，０．９ｗ／ｖ ＮａＣｌ）１０ｍｌを加え１時間振盪し１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．２で三回洗浄する。次に５０００倍した二次抗マウス杭体（生化学工業社製）希釈液１０ｍｌを容器に入れ３０分間軽く振盪し１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．２で三回洗浄する。二次抗体にはアルカリフォスファターゼが固定化してあるため、基質として６６μＬのＮＢＴ（ｎｉｔｒｏ ｂｌｕｅ ｔｅｔｒａｚｄｉｕｍ ５０ｍｇ／ｍｌ ｉｎ ７０％ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ）を１０ｍＬのアルカリフォスファターゼｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ＰＨ９．５），１００ｍＭ ＮａＣｌ，５ｍＭ ＭｇＣｌ_２と混合。その後、この溶液に３３μｌのＢＩＰＣ（５０ｍｇ／ｍＬ ｉｎ ７０％ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ）を混合したものを用いた。
この基質溶液をフィルムの入っている容器に加え、生分解性プラスチックに吸着しているＲｏｌＡを検出した。その結果、ＲｏｌＡタンパク質は、ガラス表面には吸着せず、ＰＢＳ，ＰＢＳＡ，ＰＬＡの全ての表面に吸着していることが検出された（図１８）。

（１２）新規プラスチック分解酵素遺伝子の探索
（１２−１）ＰＢＳ分解酵素類似体遺伝子を含む染色体ＤＮＡのクローニング
ＰＢＳ分解酵素類似体遺伝子を含む染色体ＤＮＡのクローニングを行なうにあたり、サザンハイブリダイゼーションに用いるプローブとなるＰＣＲ断片を以下のＲＴ−ＰＣＲ法により得た。
プローブ配列を取得するために、ＰＢＳ存在下での培養時に発現している遺伝子群のライブラリーを取得した（以下ｃＤＮＡライブラリーと省略）。０．５×１０^６個胞子／ｍｌとなるようにアスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０胞子懸濁液を５００ｍｌ容三角フラスコ内の１００ｍｌのＣｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ培地に添加した。添加後３０℃，２４時間培養した。菌糸体をミラクロス（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ）にて集菌し、滅菌水で洗浄後余分な水分を取り除いた。この回収した菌糸体を、ＰＢＳエマルジョンを唯一の炭素源とした最少培地へと移し、３０℃，３日間振盪培養を行った。培養終了後ミラクロスを用いて菌糸体を回収した。菌糸体から実施例１に従って、ｔｏｔａｌ ＲＮＡ及びｍＲＮＡを取得した。次に、得られたｍＲＮＡを鋳型とした逆転写反応を行った。エッペンドルフチューブに、ｍＲＮＡ（９２ｎｇ／μｌ）５μｌ、ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）ｐｒｉｍｅｒ（０．５μｇ／μｌ）１μｌ、２．５ｍＭ ｄＮＴＰ ＭＩＸ（２．５ｍＭ ｅａｃｈ）４μｌ、ＤＥＰＣ処理水２μｌを加え、７０℃で１０分間インキュベートした後氷上で１分間以上放置し、ｍＲＮＡにｏｌｉｇｏ（ｄＴ）ｐｒｉｍｅｒをアニーリングさせた。次に、この反応液に５×Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ Ｂｕｆｆｆｅｒ（２５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．３、３７５ｍＭ ＫＣｌ、１５ｍＭ ＭｇＣｌ_２）４μｌ、０．１Ｍ ＤＴＴ ２μｌを加え、４２℃で５分間インキュベートした後、逆転写酵素Ｓｕｐｅｒ Ｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＲＴ（２００Ｕ／μｌ）１μｌを加えピペッティングによる撹拌後４２℃で５０分間インキュベートし、さらにＳｕｐｅｒ Ｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＲＴ（２００Ｕ／μｌ）１μｌを加えピペッティングによる撹拌後４２℃で５０分間インキュベートし逆転写反応させた。この溶液を７０℃で１５分間インキュベートすることで、逆転写酵素を失活させ、さらにＲＮａｓｅＨ（１０Ｕ／μｌ）１μｌを加え、３７℃で２０分間インキュベートすることで、未反応ｍＲＮＡを分解した。この逆転写反応で得られた溶液をｃＤＮＡライブラリー溶液とした。
次に実施例３にて同定したＰＢＳ分解酵素タンパク質（クチナーゼ）と、アスペルギルス・フミガタス由来の既知の類似酵素タンパク質の相同性の比較から、１８塩基からなるミックスオリゴヌクレオチド｛５’−ＧＴ（Ｔ／Ｃ／Ａ／Ｇ）ＧＣ（Ｔ／Ｃ／Ａ／Ｇ）ＴＧ（Ｔ／Ｃ）ＣＡ（Ａ／Ｇ）ＧＧ（Ｔ／Ｃ／Ａ／Ｇ）ＧＴ（Ｔ／Ｃ／Ａ／Ｇ）−３’｝と１５塩基からなるミックスオリゴヌクレオチド｛５’−（Ｇ／Ａ）ＴＡ（Ｃ／Ｔ／Ｇ／Ａ）ＣＣ（Ｃ／Ｔ／Ｇ／Ａ）ＣＣ（Ｃ／Ｔ／Ｇ／Ａ）ＧＣ（Ｃ／Ｔ／Ｇ／Ａ）ＡＣ（Ｔ／Ｇ／Ａ）ＡＴ−３’｝を合成した。この１組のプライマーセットを用い、ｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてＰＣＲを行い、サザンハイブリダイゼーションのプローブを増幅した。ＰＣＲ用装置はＰＣＲ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ ＰＥＲＳＯＮＡＬ（宝酒造）を用いた。ｃＤＮＡライブラリーは上記のｃＤＮＡライブラリー溶液を１μｌ用い、ポリメラーゼはＥｘ ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造）を用いた。増幅反応は、９５℃，３分間鋳型ＤＮＡを変性し、９５℃，１分間、５３℃，１分間、７２℃，３０秒間保持するサイクルを３０サイクルおこなった後、７２℃，１分間で完全伸長させ、４℃で保持した。得られたＰＣＲ増幅断片をアガロースゲル電気泳動に供したところ、およそ１６０塩基対からなる断片の増幅が確認された。
次に、ＮＥＮ Ｒａｎｄｏｍ Ｐｒｉｍｅｒ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ ｗｉｔｈ Ａｎｔｉｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−ＡＰ（Ｅｉｚｏ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．）を用いて実施例３（３−３）と同様にサザンハイブリダイゼーションをおこなった。ターゲットとして染色体ＤＮＡ１０μｇを５０ユニットのＨｉｎｃＩＩ（宝酒造）またはＳａｃＩ（宝酒造）とＨｉｎｄＩＩＩ（宝酒造）で完全消化したものを用いた。その結果ＨｉｎｃＩＩにて完全消化した場合約２７００塩基対からなり、ＳａｃＩとＨｉｎｄＩＩＩにて完全消化した場合約１８００塩基からなる強くハイブリダイズするバンドが検出された。
次に、実施例３（３−３）に従ってコロニーハイブリダイゼーションを行った。染色体ＤＮＡ１０μｇを５０ユニットのＨｉｎｃＩＩ（宝酒造）またはＳａｃＩ（宝酒造）とＨｉｎｄＩＩＩ（宝酒造）で完全消化しアガロースゲル電気泳動に供しエチジウムブロマイドで染色後、各々、２７００塩基対、１８００塩基対付近のゲルをＵＶ照射下で切り出した。ゲル中よりｐｒｅｐＡ ｇｅｎｅ（ＢｉｏＲａｄ）を用いてＤＮＡを抽出し、これを挿入ＤＮＡ断片とした。
次にプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＫＳ＋ＤＮＡ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）２．５μｇをＨｉｎｃＩＩ宝酒造）またはＳａｃＩ（宝酒造）とＨｉｎｄＩＩＩ（宝酒造）にて消化し、定法によりフェノール抽出、エタノール沈殿処理をおこなった後、アルカリフォスファターゼ（宝酒造）により５‘末端のリン酸を除去した。この反応液を定法によりフェノール抽出、エタノール沈殿処理をおこなった後ＴＥに溶解したものをベクターＤＮＡ溶液とした。さらに、前述の挿入ＤＮＡ断片と連結させることで、連結ＤＮＡ溶液を得た。これら連結ＤＮＡ溶液を用いて大腸菌ＤＨ５α株を形質転換し、コロニーハイブリダイゼーションに供した。その結果ポジティブシグナルを得た。
次に元の寒天培地上からポジティブシグナルとなるプラスミドＤＮＡを有する大腸菌から実施例３（３−３）に記した方法によりプラスミドＤＮＡ溶液を得た。このプラスミドＤＮＡ中の挿入ＤＮＡ断片の塩基配列を解析した。その結果、プラスミドＤＮＡに挿入された２７１３塩基対からなる染色体ＤＮＡのＨｉｎｃＩＩ消化断片には、プローブの塩基配列を含むオープンリーディングフレームが見出され（配列表４）、また１８０１塩基対からなる染色体ＤＮＡのＳａｃＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ消化断片には、プローブの塩基配列を含むオープンリーディングフレームが見出された（配列表５）。この２種のオープンリーディングフレームは各々２または３箇所のイントロン塩基配列を含み、さらに開始メチオニンをコードする塩基配列ＡＴＧとストップコドンを含み、すなわちＰＢＳ分解酵素類似体遺伝子の全長を有していた。
（１２−２）ＰＢＳ分解酵素ならびにＰＢＳ分解酵素類似体の大腸菌を宿主とした発現系の構築
実施例３に記したＰＢＳ分解酵素遺伝子、ならびに前述の２種のＰＢＳ分解酵素類似体遺伝子を含むｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてＰＣＲを行い、大腸菌用発現プラスミド（ｐＥＴ−１２ｂ；Ｎｏｖａｇｅｎ）に挿入すべくＰＣＲ断片を調製した。前述のＰＢＳ存在下での培養時に発現している遺伝子群を含むｃＤＮＡライブラリーに対して、ＰＢＳ分解酵素遺伝子に対しては、５’−ＴＧＣＡＧＴＧＧＣＧＧＡＴＣＣＧＧＴＧＧＡＣ−３’と５’−ＧＡＣＣＧＧＡＴＧＧＡＴＣＣＣＧＡＡＡＡＴＴＴＡＴＣＣ−３’のオリゴヌクレオチドプライマーセットを、麹菌ゲノム中にて２７１３塩基対のオープンリーディングフレームからなるＰＢＳ分解酵素類似体遺伝子に対しては、５‘−ＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＧＡＴＣＣＣＡＴＣＧＣＴＧ−３’と５‘−ＣＧＴＡＧＣＣＣＡＣＡＣＴＣＧＧＡＴＣＣＴＡＡＧＣＴＧＡＣ−３’のオリゴヌクレオチドプライマーセットを、麹菌ゲノム中にて１８０１塩基対のオープンリーディングフレームからなるＰＢＳ分解酵素類似体遺伝子に対しては、５‘−ＧＧＣＧＧＣＴＧＣＧＧＡＴＣＣＡＧＴＡＧＡＴＡＴＣ−３’と５‘−ＣＡＧＴＴＣＡＧＧＧＧＧＡＴＣＣＴＡＴＡＧＡＧＴＣＣ−３’のオリゴヌクレオチドプライマーセットを合成し、ＰＣＲに用いた。ＰＣＲ用装置はＰＣＲ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ ＰＥＲＳＯＮＡＬ（宝酒造）を用いた。ｃＤＮＡライブラリーは上記のｃＤＮＡライブラリー溶液を１μｌ用い、ポリメラーゼはＥｘ ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造）を用いた。増幅反応は、９５℃，３分間鋳型ＤＮＡを変性し、９５℃，１分間、５７℃，１分間、７２℃，１分間保持するサイクルを３０サイクルおこなった後、７２℃，１分間で完全伸長させ、４℃で保持した。得られたＰＣＲ増幅断片をＢａｍＨ Ｉ（宝酒造）で消化し、アガロースゲル電気泳動に供しエチジウムブロマイドで染色後ＵＶ照射下で各々、６２５塩基対、６５０塩基対、７５９塩基対からなる断片を切り出した。ゲル中よりｐｒｅｐ Ａ ｇｅｎｅ（ＢｉｏＲａｄ）を用いてＤＮＡを抽出し、これを挿入ＤＮＡ断片とした。次に塩基配列中にＴ７プロモーター配列とシグナル配列（ＯｍｐＴ−ｌｅａｄｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を有するプラスミドｐＥＴ−１２ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ）ＤＮＡ ５μｇをシグナル配列の直後にある制限酵素ＢａｍＨ Ｉ認識配列の位置でＢａｍＨ Ｉ（宝酒造）で消化し、定法によりフェノール抽出、エタノール沈殿処理をおこなった後、アルカリフォスファターゼ（宝酒造）により５’末端のリン酸を除去した。この反応液を定法によりフェノール抽出、エタノール沈殿処理をおこなった後ＴＥに溶解したものをベクターＤＮＡ溶液とした。次に、ベクターＤＮＡ １μｇと挿入ＤＮＡ断片１．５μｇをＴ４ ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅ（宝酒造）により連結させ、連結ＤＮＡ溶液を得た。この連結ＤＮＡ溶液を用いて大腸菌ＤＨ５α（宝酒造）を形質転換し、各々のプラスミドＤＮＡを保持する形質転換大腸菌を得た。形質転換大腸菌の培養菌体中より前述と同様にプラスミドＤＮＡを抽出し、この大腸菌形質転換用プラスミドＤＮＡを得た（ｐＥＴ−ｃｕｔ，ｐＥＴ−ｃｕｔｈｏｍ１，ｐＥＴ−ｃｕｔｈｏｍ２）。このプラスミドＤＮＡ １μｇを用い前述と同様にして、大腸菌ＢＬ２１−ＳＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を形質転換し、ＮａＣｌを含まない５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地上にて各々の形質転換株を取得した。
次にＰＢＳ分解酵素遺伝子が挿入されたプラスミドＤＮＡを用いて形質転換された大腸菌形質転換株（ｐＥＴ−ｃｕｔ）と、ＰＢＳ分解酵素類似体遺伝子が挿入されたプラスミドＤＮＡを用いて形質転換された大腸菌形質転換株２種（ｐＥＴ−ｃｕｔｈｏｍ１、ｐＥＴ−ｃｕｔｈｏｍ２）と、挿入されていない（ｐＥＴ−１２ｂにて形質転換した）大腸菌形質転換株のコロニーを白金針にて拾い、ＬＢ液体培地（５０μｇ／ｍｌアンピシリン、ＮａＣｌを含まない）にそれぞれ植菌した。植菌後３７℃，１６時間振盪培養することで前培養とした。各々の前培養溶液５００μｌを５００ｍｌ容坂口フラスコ内の５０ｍｌのＬＢ培地（０．５％ＮａＣｌを含む）に添加した。添加後３０℃にて１２時間振盪培養することで、目的の酵素タンパク質を培養上清中に誘導・発現させた。培養液５０ｍｌを５０ｍｌ容マイクロチューブに移し、８０００ｇ，１０分間遠心分離し培養上清を得た。得られた培養上清に対して０．１（ｖ／ｖ％）となるようにＰＢＳ乳化液を添加し、３７℃にて保温し、その濁度の低下（ＰＢＳの分解）によってＰＢＳ分解酵素の発現を確認したところ、ＰＢＳ分解酵素遺伝子およびＰＢＳ分解酵素類似体遺伝子が挿入されたプラスミドＤＮＡにより形質転換された大腸菌形質転換株の培養上清中にのみその活性の存在が認められた（表８）。

次に上記と同様の方法で得られた培養上清に対して０．１（ｗ／ｖ％）となるようにポリ乳酸（ＰＬＡ）乳化液を添加し、３７℃にて保温し、その濁度の低下（ＰＬＡの分解）によってＰＬＡ分解活性の有無を確認したところ、ＰＢＳ分解酵素遺伝子およびＰＢＳ分解酵素類似体遺伝子が挿入されたプラスミドＤＮＡにより形質転換された大腸菌形質転換株の培養上清中にのみその活性の存在が認められた（表８）。すなわち実施例３で得られたＰＢＳ分解酵素および、２種のＰＢＳ分解酵素類似体にはポリブチレンサクシネート（ＰＢＳ）分解活性と併せてポリ乳酸（ＰＬＡ）分解活性をも有することが分かった。
（１２−３）イモチ菌由来の生分解性プラスチック分解酵素遺伝子群
これまでに麹菌アスペルギルス・オリゼ由来のＰＢＳ分解酵素遺伝子及びそのタンパク質の存在を確認したが、そこで麹菌のＰＢＳ分解酵素相同遺伝子を既知のＤＮＡ及びプロティンデータベースに対して検索した後、図１９の系統樹を作成した。相同遺伝子の多くが糸状菌（カビ）由来であり、特にＭａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａには８種の相同遺伝子の存在が確認された。そこで、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ７０−１５株を以下の条件にてＰＢＳ乳化液若しくはＰＬＡ乳化液中で培養し、その培養上清中のＰＬＡおよびＰＢＳの分解活性を測定した（表９）。
即ち、Ｖｏｇｅｌ−Ｎ培地（２％Ｓｕｃｒｏｓｅ）にて２４℃、４日間振盪培養した後、菌糸体を濾過により取得し、Ｃ源が各々ＰＢＳＡ又はＰＬＡ乳化液（１ｗ／ｖ％）に限定されたＶｏｇｅｌ−Ｎ培地に移し、２４℃、２日間振盪培養した。各々の培養上清を濾過及び遠心分離により取得し、各培養上清にＰＢＳＡ乳化液又はＰＬＡ乳化液を０．１（ｗ／ｖ％）となるように加え、３７℃にて２４時間インキュベートし、Ｏ．Ｄ．６３０を測定し、分解率（Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｒａｒｉｏ）を算出した。その結果、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ７０−１５株はＰＬＡ及びＰＢＳ分解活性を有することが明らかとなった。

尚、図１９に示された各生分解性プラスチック分解酵素遺伝子のアノテーションに関する現時点での情報は以下の通りである。
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ

Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ
・Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓゲノムデータベース中において、ｔｂｌａｓｔｎ検索の結果見出されたｈｏｍｏｌｏｇｕｅであり、ａｎｎｏｔａｔｅｄ ｇｅｎｅではない。よって遺伝子、タンパク質としての登録は行われていない。

Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ
・Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓゲノムデータベース中において、ｔｂｌａｓｔｎ検索の結果見出されたｈｏｍｏｌｏｇｕｅである。ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡとして各ｃｏｎｔｉｇｕｅ毎に登録されているが、以下の３種についてはａｎｎｏｔａｔｅｄ ｇｅｎｅ並びにｃｕｔｉｎａｓｅとしての登録もない。

Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ
・Ｃｕｔ１−８についてはすべてゲノムデータベース中において、ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ済み。
・Ｃｕｔ１のみがタンパク質的にｃｕｔｉｎａｓｅとして確認されている。
・Ｃｕｔ２−８についてはいずれもデータベース中において、ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ ｐｒｏｔｅｉｎとして扱われている。

以下４種のｃｕｔｉｎａｓｅは既知の遺伝子及びタンパク質で、その機能も確認されているものである。

以下の既知の遺伝子及びタンパク質は、その機能は確認されていないものである。

（１３）麹菌アスペルギルス・オリゼからの生分解性プラスチック結合タンパク質と高発現株の育種
（１３−１）生分解性プラスチック結合タンパク質（ＰｂｐＡ、ＰｂｐＢ）遺伝子の取得
アスペルギルス・オリゼの染色体ＤＮＡより生分解性プラスチック結合タンパク質ＰｂｐＡ、ＰｂｐＢのクローニングを行った。そしてアスペルギルス・オリゼのＰｂｐＡ高発現株の育種を行ったのでその過程を以下に示す。
［方法］
３Ｌ容の三角フラスコに１（ｗ／ｖ％）となるようにＰＢＳ乳化液を含み、唯一の炭素源としたＣｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ培地を７５０ｍｌ調製し、アスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０株の胞子懸濁液を終濃度１．０×１０^６となるように接種して５日間振盪培養した。その培養液をミラクロスで濾過し菌体を除いた。その濾液を２０％の硫酸アンモニウムで飽和させ１時間氷冷し、１０，０００×ｇ、４℃にて３０分間遠心分離による沈殿を除去した。その上清を１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液，ｐＨ８．０，２０％飽和硫酸アンモニウムで飽和させたオクチル−セルロファイン カラム（生化学工業）に供し、硫酸アンモニウム濃度２０−０％の直線勾配で吸着タンパク質の溶出を行った。溶出フラクションに対してＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い溶出タンパク質の確認を行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のゲルはシルベストステイン，ＰＡＧＥ蛋白質用（ナカライテクス）を用いて行い、方法は説明書に記載されている方法に基づいて行った。
硫酸アンモニウム０％飽和付近に分子量約１４ｋＤａのタンパク質の存在を確認した（図２０）。このタンパク質は疎水クロマトグラフィーの硫酸アンモニウム濃度０％飽和付近で溶出したことから、疎水性が高いタンパク質であることが考えられた。このタンパク質のＮ末端配列の解析を行ったところその配列はＤＡＳＡＶＬＡＤＦＮＴＬＳＴであった。
この配列をＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＥＳＴ ｂｌａｓｔ ｓｅａｒｃｈ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｒｉｂ．ｇｏ．ｊｐ／ｋｅｎ／ＥＳＴ／ｄｂ／ｂｌａｓｔ．ｈｔｍｌ）にて相同性検索を行った結果、１３８残基のアミノ酸配列と相同性を示した。この１３８アミノ酸残基を日本ＤＮＡデータバンク（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／Ｗｅｌｃｏｍｅ−ｊ．ｈｔｍｌ）にて相同性検索を行った結果メタリジウム・アニソプリエの産生する４ＭｅＳタンパク質と相同性を示した。また、１３８アミノ酸残基をアスペルギルス・フミガタスのゲノムデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔｉｇｒ．ｏｒｇ／ｔｄｂ／ｅ２ｋ１／ａｆｕ１／）上で相同性を確認したところ、コンティグ４８７５内に含まれる配列と、コンティグ４８２０内に含まれる配列と相同性を示すことが明らかとなった。
尚、以上の相同性（パーセント）に関する具体的な値を表１０に示した。

そこでこの両者の配列を基に、アスペルギルス・オリゼの染色体ＤＮＡからクローニングを試みることとした。
アスペルギルス・フミガタスの相同配列とアスペルギルス・オリゼのコドン頻出頻度（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／）を参考にして二組のオリゴヌクレオチド（５’−ＡＴＧＣＴＣＧＣＣＡＡＧＣＡＣＧＴＣ−３’、５’−ＧＧＣＣＴＴＣＴＴＧＴＡＣＴＣＧＧＣ−３’）、（５’−ＧＡＣＧＣＡＡＴＣＴＣＣＡＣＣＡＣ−３’、５’−ＴＣＡＡＡＣＧＣＡＴＣＣＧＣＡＡＴＣＴＧ−３’）を設計した。この２組のプライマーセットを用い、染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲをおこないサザンハイブリダイゼーション用のプローブを増幅した。ＰＣＲ用装置はＰＣＲ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ ＰＥＲＳＯＮＡＬ（宝酒造）を用いた。染色体ＤＮＡは１００ｎｇ用い、ポリメラーゼはＥｘ ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造）を用いた。増幅反応は、９５℃，３分間鋳型ＤＮＡを変性し、９５℃，１分間、５０℃，１分間、７２℃，３０秒間保持するサイクルを３０サイクルおこなった後、７２℃，１分間で完全伸長させ、４℃で保持した。得られたＰＣＲ増幅断片をアガロースゲル電気泳動に供したところ、約５７０塩基対と約３００塩基対からなる断片の増幅が確認された。
次に、ＮＥＮ ＲａｎｄｏｍＰｒｉｍｅｒ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ ｗｉｔｈ Ａｎｔｉｆｉｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−ＡＰ（Ｅｉｚｏ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．）を用いて実施例３（３−３）と同様にサザンハイブリダイゼーションをおこなった。ターゲットとして染色体ＤＮＡ１０μｇを５０ユニットのＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ（宝酒造）それぞれで完全消化したものを用いた。サザンハイブリダイゼーションの結果ＥｃｏＲＩ消化断片に対して約５７０塩基対プローブを用いた時に約３０００塩基対からなるバンドが検出され、ＢａｍＨＩ消化断片に対し３００塩基対のプローブを用いた時に２０００塩基対からなるバンドが検出された。
次に、染色体ＤＮＡ１０μｇを５０ユニットのＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩそれぞれで完全消化しアガロースゲル電気泳動に供しエチジウムブロマイドで染色後３０００塩基対および２０００付近のゲルをＵＶ照射下で切り出した。ゲル中よりｐｒｅｐ Ａ ｇｅｎｅ（ＢｉｏＲａｄ）を用いてＤＮＡを抽出し、これを挿入ＤＮＡ断片とした。
次にプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ＋ＤＮＡ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）２．５μｇをＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩそれぞれで（宝酒造）にて消化し、定法によりフェノール抽出、エタノール沈殿処理をおこなった後、アルカリフォスファターゼ（宝酒造）により５’末端のリン酸を除去した。この反応液を定法によりフェノール抽出、エタノール沈殿処理をおこなった後ＴＥに溶解したものをベクターＤＮＡ溶液とした。さらに、前述の挿入ＤＮＡ断片と連結させることで、連結ＤＮＡ溶液を得た。これら連結ＤＮＡ溶液を用いて大腸菌ＤＨ５α株を形質転換し、コロニーハイブリダイゼーションに供した。その結果ポジティブシグナルを得た。
次に元の寒天培地上からポジティブシグナルとなるプラスミドＤＮＡを有する大腸菌から実施例３（３−３）に記した方法によりプラスミドＤＮＡ溶液を得た。このプラスミドＤＮＡ中の挿入ＤＮＡ断片の塩基配列を解析した。その結果、プラスミドＤＮＡに挿入された３００８、及び２００４塩基対からなる染色体ＤＮＡのＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩそれぞれの消化断片には、約５７０、３００塩基対それぞれのプローブの塩基配列を含むオープンリーディングフレームが見出された。前者のオープンリーディングフレームは５８４塩基対（ＰｂｐＡ−配列表６）で後者は５６１塩基対（ＰｂｐＢ−配列表７）であり、変換された推定アミノ酸配列はそれぞれ１７４残基及び１８６アミノ酸残基であった。また、前者オープンリーディングフレームは１箇所のイントロン塩基配列を含み、後者はイントロンを含んでいなかった。
両アミノ酸配列と麹菌ＥＳＴデータベースより得られた１３８アミノ酸を比較した結果、前者のものと１００％の相同性を示した。したがって前者の配列が目的のタンパク質であることが明らかになった。
（１３−２）ＰＢＳ結合タンパク質高発現麹菌の育種
ＰＢＳ結合タンパク質高発現系の構築（図２１）
クローニングされた目的遺伝子の周辺塩基配列を参考に一組のオリゴヌクレオチドを設計した（５‘−ＣＴＴＧＣＡＴＴＣＡＡＧＴＣＧＡＣＣＴＧＡＡＣＡＣ−３’、５‘−ＣＴＡＴＴＧＡＡＣＴＡＴＧＣＴＴＣＴＡＧＡＡＧＧＣＣＴＡＡＴＣ−３’）。アスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０株のゲノムＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲ反応を行った。増幅反応は、９５℃１３分間鋳型ＤＮＡを変性し、９５℃，１分間、６０℃，１分間、７２℃，３０秒間保持するサイクルを３０サイクルおこなった後、７２℃，１分間で完全伸長させ、４℃で保持した。そのＰＣＲによる増幅断片をアガロース電気泳動にて確認を行ったところ約７３０塩基対の増幅が見られた。この増幅断片をＳａｌＩ（宝酒造）及びＸｂａＩ（宝酒造）で消化し、その消化断片をアガロースゲル電気泳動に供したゲル中よりｐｒｅｐ Ａ ｇｅｎｅ（ＢｉｏＲａｄ）を用いてＤＮＡを抽出し、これを挿入ＤＮＡ断片とした。次に塩基配列中にグルコアミラーゼのプロモーター配列（ＰｇｉａＡ１４２）を有するプラスミドｐＮＧＡ１４２ ＤＮＡ ５μｇをＳａｌＩ及びＸｂａＩで消化し、定法によりフェノール抽出、エタノール沈殿処理をおこなった後、アルカリフォスファターゼ（宝酒造）により５’末端のリン酸を除去した。この反応液を定法によりフェノール抽出、エタノール沈殿処理をおこなった後ＴＥに溶解したものをベクターＤＮＡ溶液とした。次に、ベクターＤＮＡ １μｇと挿入ＤＮＡ断片１．５μｇをＴ４ ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅ（宝酒造）により連結させ、連結ＤＮＡ溶液を得た。この連結ＤＮＡ溶液を用いて大腸菌ＤＨ５α（宝酒造）を形質転換し、各々のプラスミドＤＮＡを保持する形質転換大腸菌を得た。形質転換大腸菌の培養菌体中より前述と同様にプラスミドＤＮＡを抽出し、この麹菌形質転換用プラスミドＤＮＡを得た実施例３（３−３）に記した方法により培養菌体中よりプラスミドＤＮＡを抽出し、麹菌形質転換用プラスミドＤＮＡを得た。このプラスミドＤＮＡ１０μｇをＢａｍＨＩで消化し、定法によりフェノール抽出、エタノール沈殿処理をおこなった後１０μｌのＴＥに溶解し形質転換用ＤＮＡ溶液とした。以降のアスペルギルス・オリゼの形質転換については実施例７（７−１−２）に記した方法を踏襲して行い、形質転換体を得た。また胞子ＰＣＲ用プライマーとして、２種のオリゴヌクレオチド（５’−ＣＴＴＧＣＡＴＴＣＡＡＧＴＣＧＡＣＣＴＧＡＡＣＡＣ−３’，５’−ＧＴＡＧＡＡＴＣＡＣＧＡＡＴＧＧＡＧＣＣＴＴＴＧＡＣＧＡＣＣ−３’）を合成した。ＰＣＲ用装置はＰＣＲ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ ＰＥＲＳＯＮＡＬ（宝酒造）を用いた。ポジティブコントロールとして麹菌形質転換用プラスミドＤＮＡを鋳型とした。ポリメラーゼはＥｘ Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造）を用いた。増幅反応は、９４℃，３分間鋳型ＤＮＡを変性し、９４℃，１分間、５５．５℃，１分間、７２℃，９０秒間保持するサイクルを３０サイクルおこなった後、７２℃，９５秒間で完全伸長させ、４℃で保持した。得られたＰＣＲ増幅断片をアガロースゲル電気泳動に供したところ、ポジティブコントロールと同じ位置にＰＣＲ断片の増幅が確認され、その結果より染色体ＤＮＡ上にグルコアミラーゼ・プロモーター配列の下流に目的遺伝子が連結した塩基配列が挿入されたことと、それを有するアスペルギルス・オリゼ形質転換株が得られたことが確認された。この目的遺伝子が染色体ＤＮＡ中に挿入されたアスペルギルス・オリゼ形質転換株と、挿入されていない（ｐＮＧＡ１４２にて形質転換した）アスペルギルス・オリゼ形質転換株の胞子懸濁液を０．５×１０^６個胞子／ｍｌとなるようにグルコアミラーゼ・プロモーターの誘導物質であるマルトースを含む１００ｍｌのＹＰＭ液体培地｛実施例２（２−２）｝にそれぞれ添加した。添加後３０℃，１２５ｒｐｍ，１６時間培養し、培養上清をＭＩＲＡＣＬＯＴＨ（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ登録商標）にて濾過することで得た。培養上清１００μｌに５０μｌの冷トリクロロ酢酸を加えよく混合した後、氷中で２０分間放置し、１５０００ｇ，４℃，１５分間遠心分離し上清を完全に除き、沈殿画分を得た。これに１５μｌのＳＤＳ化溶液｛実施例２（２−２）｝に溶解させたあと、沸騰湯浴中に５分間放置しＳＤＳ化をおこない、これをサンプルとした。以後のＳＤＳ−ＰＡＧＥの方法は実施例２（２−２）に記した通りとした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、に供した結果、目的遺伝子が染色体ＤＮＡ中に挿入されたアスペルギルス・オリゼ形質転換株の培養上清中にのみ目的タンパク質の位置（約１４ｋＤａ）にバンドが観察された（図２２）。その後、電気泳動したゲル中よりタンパク質をＰＶＤＦ膜に転写し、ＰＶＤＦ膜上より約１４ｋＤａのバンドを切り抜き、そのままアミノ末端アミノ酸配列の解析をおこなった。解析の結果アミノ末端からＤＡＳＡＶであったことこから、この約１４ｋＤａタンパク質が目的タンパク質であることが確認された。
（１３−３）ＰｂｐＡ高発現株の疎水表面上での生育
φ９０ｍｍのプラスチックシャーレに２０ｇの粒状ＰＢＳ（１ｍｍ^３）を入れ、１５ｍｌのＹＰＭ液体培地を加えて、良くかき混ぜＹＰＭ培地を均一にした。その培地上に前述した高発現株、ハイドロホービン高発現株、そして野性株の胞子を１０^８個接種した後、良くかき混ぜ胞子を均一にした。またポリウレタン製の家庭用スポンジを縦、横６ｃｍ、高さ１ｃｍに切り取り、十分にＹＰＭ液体培地をしみ込ませた。その中心部に約１４ｋＤａタンパク質高発現株、ハイドロホービン高発現株、そして野性株の胞子を１０^８個接種した。この両培地を３０℃にて７日間培養を行ったところ、疎水表面上での約１４ｋＤａタンパク質及びハイドロホービン高発現株の生育は明らかに野性株のものを上回り旺盛な生育を示した（図２３）。このことから今回高発現を行ったこのタンパク質は、実施例１にて見出されたハイドロホービンと同様に、カビがＰＢＳのような疎水表面上に展開するための補助因子であり、疎水表面への吸着を促すものと考えられた。そこで、このタンパク質をＰＢＳｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎとし、ＰｂｐＡとした。そしてＰｂｐＡのクローニングの際に得られた相同配列をＰｂｐＢとした。
（１３−４）ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＰｂｐＡのＰＢＳへの吸着
ＰｂｐＡ高発現株の胞子をを７５０ｍｌのＹＰＭ液体培地に１０^６（／ｍｌ）になるように接種して２日間培養を行った。その培養液をミラクロスにて濾過し、その濾液に６０％になるように硫酸アンモニウムを加え１時間氷冷した。１０，０００×ｇ、４℃にてその濾液を遠心分離し沈殿物を除去した。その遠心上清ををオクチル−セルロファインカラム（生化学工業）、デアエ−セルロファインカラム（生化学工業）、Ｓ−セファロースカラムＦＦ（ファルマシア）に供しＰｂｐＡをＳＤＳ−ＰＡＧＥ的に単一バンドになるまで精製を行った。
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）バッファーに濃度が０、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０％になるように硫酸アンモニウムを加えた。それぞれ１ｍｌのバッファーに対して０．２ｇのＰＢＳ粉末（１ｍｍ^３）を加えよく懸濁した。このＰＢＳ懸濁液に対してＰｂｐＡ精製標品（０．１ｍｇ／ｍｌ）を１００μｌ加えて３０℃にて３時間振盪（１２５ｒｐｍ）し、吸着処理を行った。この混合液をフィルター（孔径０．２μｍミリポア）に通して完全にＰＢＳを除き、その濾過液をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した（図２４）。
その結果、硫酸アンモニウム濃度０、１０、２０％時の濾過液中にはＰｂｐＡの存在が確認されたが３０％以降は濾過液中にＰｂｐＡは見られなかった。この結果よりＰｂｐＡは硫酸アンモニウム３０％存在下でＰＢＳに吸着していることが示唆される。
（１３−５）ＰｂｐＡ相同遺伝子
以上、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅにはＰＢＳなどの生分解性プラスチック表面への吸着因子ＰｂｐＡ及びびＰｂｐＢが存在することを示したが、既存のＤＮＡデータベース検索から、カビアスペルギルス・フミガタスとメタリジウム・アニスプリエに相同遺伝子が存在することが見出された（図２５）。これら遺伝子産物の機能はこれまで全く推定されていなかったが、ＰｂｐＡの結果から、同様にプラスチック吸着機能を有するタンパク質と考えられる。
尚、図２５に示された各ＰｂｐＡ及びＰｂｐＢ相同遺伝子のアノテーションに関する現時点での情報は以下の通りである。
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＰｂｐＡ
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＰｂｐＢ
本実施例に記載。
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ ｃｏｎｔｉｇ ４８７５内の配列
ＰｂｐＡと相同性を示す配列で塩基配列、アミノ酸配列共にＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓのゲノムデータベースより取得された。発現は確認されておらず、機能未知。
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ ｃｏｎｔｉｇ ４８２０内の配列
ＰｂｐＢと相同性を示す配列で塩基配列、アミノ酸配列共にＡ．ｆｕｍｉｌｇａｔｕｓのゲノムデータベースより取得された。発現は確認されておらず、機能未知。
Ｍｅｔａｒｈｉｚｉｕｍ ａｎｉｓｏｐｌｉａｅ ４ＭｅＳ
ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ Ｎｏ．ＡＦ０１２０９２（Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ），ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ Ｎｏ．ＡＡＢ６９３１１（Ｐｒｏｔｅｉｎ）
Ｍ．ａｎｉｓｏｐｌｉａｅを培養時のｃＤＮＡから得られた配列。培養条件は不明。機能も全く分かっていない。

（１４）生分解性プラスチックと他のマテリアルとの複合材料からの生分解性プラスチックの選択的分解
生分解性プラスチック複合材料から生分解性プラスチックを分解酵素により選択的に分解し、生分解性プラスチックはモノマー及びオリゴマーとして可溶性区分に回収し、もう一方の複合材料を回収する。
今回、複合材料の一方は白金線、生分解性プラスチックにはＰＢＳを用いた。分解酵素には実施例３に記載したＰＢＳ分解酵素精製標品（クチナーゼ）を用いた。１００ｍｌ容ビーカー内に２０（ｗ／ｖ％）となるように２０ｍｌのクロロホルムに４ｇＰＢＳを溶解した。この溶液にひたしたφ０．５ｍｍ白金線を取り出した後、乾燥させ表面をＰＢＳで被膜した金属（白金線）断片を得た。１２ｍｍ×９０ｍｍ試験管中にて蒸留水で洗浄した０．５ｍｍ×８ｍｍのＰＢＳ被膜金属断片に対し、６００μｌの１２０μｇ／ｍｌＰＢＳ分解酵素溶液（５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液，ｐＨ９．０）を加え、３７℃にて、１Ｎ ＮａＯＨにてｐＨを９．０に保持しながら７日間保温した（コントロールとして５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液，ｐＨ９．０を用いた）。その結果、酵素添加区においてＰＢＳ被膜が選択的に分解され金属断片は固型物として回収された（図２６）。この結果より、生分解性プラスチックと他の材料との複合材料より、生分解性プラスチックともう一方の複合材料を分別して回収可能なことを示している。

（１５−１）クチナーゼによるＰＢＳフィルムの分解に対するＲｏｌ Ａの分解促進効果
７６×２６ｍｍのスライドガラス（ＭＡＴＳＵＮＡＭＩ）社製に同じ大きさに切り出したＰＢＳフィルムに１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｂｕｆｆｅｒ ｐＨ８．０に溶解したＲｏｌＡ（２．５μｇ／ｍｌ）を１０μｌしみ込ませたろ紙（１ｃｍ^２）（Ｗｈａｔｍａｎ）を置き、１２時間，３０℃で反応させた。コントロールには、ＲｏｌＡが溶解しているｂｕｆｆｅｒを１０μｌしみ込ませたろ紙（１ｃｍ^２）をＰＢＳフィルム上に置いた。１２時間後２０μｇ／ｍｌ濃度のｃｕｔｉｎａｓｅ １０μｌをろ紙に加え６時間，３７℃で分解反応を行った。分解反応後、ろ紙を置いていた所が白く濁っているのが観察された。濁度はＲｏｌＡを前もって吸着させていたろ紙の方が高く、ＲｏｌＡを吸着させていなかった方の濁度は低かった。予備実験の結果よりｃｕｔｉｎａｓｅによるＰＢＳフィルム分解では、ＰＢＳ分解率が高い程、ｃｕｔｉｎａｓｅ接触面が白濁することが、分かっている。これらの結果から、ＲｏｌＡによるｃｕｔｉｎａｓｅのＰＢＳ分解が促進されることが分かった（図２７）。図２７では白黒が反転して表示されており、黒い部分が分解を示している。
（１５−２）クチナーゼによるＰＢＳ乳化液の分解に対するＲｏｌＡの分解促進効果
９６穴マイクロタイタープレートに０．１ｗ／ｖに調整したＰＢＳ乳化液８９．５μｌを入れ、そこに１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｂｕｆｆｅｒ ｐＨ８．０に溶解したＲｏｌＡ（２５０ｎｇ／ｍｌ）を１０μｌ加え１２時間，３０℃でＲｏｌＡのＰＢＳへの吸着反応を行った。コントロールとしてＲｏｌＡの替わりに１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｂｕｆｆｅｒ ｐＨ８．０を１０μｌ ＰＢＳ乳化液に加えたものを用いた
吸着反応後、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｂｕｆｆｅｒ ｐＨ８．０に溶解した１ｍｇ／ｍｌ濃度のｃｕｔｉｎａｓｅを０．５μｌ加え４０℃で分解反応を行い、３０分毎にＰＢＳの濁度を６３０ｎｍの波長で吸光度を測定しＰＢＳ分解率を算出した（図２８）。結果としてＰＢＳ分解率に有意な差が確認されたため、ＰＢＳ乳化液中でのＲｏｌＡによるＰＢＳ分解促進効果が認められた。
（１５−３）クチナーゼによるＰＢＳフィルムの分解に対するＰｂｐＡの分解促進効果
ＰｂｐＡは硫酸アンモニウム３０％以上の水分活性の低い状態条件でＰＢＳに吸着する。そこでＰＢＳフィルム上でＰｂｐＡを乾燥させることで水分活性を下げ、ＰｂｐＡがＰＢＳに吸着している状態でクチナーゼによるＰＢＳ分解を試みた。
ＰｂｐＡの精製標品を精製水で希釈し、１．０、５．０、１０、５０、１００（μｇ／ｍｌ）の濃度に調整した。それぞれの濃度のＰｂｐＡ溶液１０μｌをＰＢＳフィルム上にスポットし３７℃にて完全に乾燥させＰｂｐＡのＰＢＳに対する吸着を促した。ＰＢＳフィルム上に吸着したＰｂｐＡ状に直径６ｍｍの濾紙を静置し、１０μｌのクチナーゼ溶液（２０μｇ／ｍｌ）をしみ込ませた。この状態のＰＢＳフィルムを３７℃で６時間保温しＰＢＳフィルムの分解を観察した。
反応後のＰＢＳフィルムを観察したところ、１００、５０（μｇ／ｍｌ）のＰｂｐＡをスポットした部分では濾紙を静置した部分全体に有為なＰＢＳの分解が観察された（図２９）。そして１０、５．０（μｇ／ｍｌ）のＰｂｐＡをスポットした部分では、１０μｌのＰｂｐＡ溶液をスポットした部分にのみ有為な分解が観察された。したがって、ＰｂｐＡがＰＢＳに吸着した場合においてより有効にクチナーゼの分解が促進されることが明らかになった。
（１５−４）クチナーゼによる）ＰＢＳフィルムの分解に対するハイドロホービン及びＰｂｐＡと人工界面活性剤との分解促進効果の比較
実施例１５−１、１５−３においてハイドロホービンとＰｂｐＡがクチナーゼによるＰＢＳを促進することが確認された。これらのバイオサーファクタントが人工界面活性剤と比較した場合に有意に促進効果を示すかどうかを検討した。本実験では人工界面活性剤としてプライサーフＡ２１０Ｇ（第一工業製薬）を用いた。
実施例１５−１、１５−３において促進効果が観察された濃度（ハイドロホービン：２．５μｇ／ｍｌ、ＰｂｐＡ：１０μｇ／ｍｌ）のバイオサーファクタントをＰＢＳのフィルム上に実施例１５−１、１５−３の方法に従って吸着させた。また、同様に２．５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌのプライサーフＡ２１０ＧをＰＢＳフィルム上に吸着させた。このとき界面活性成分を含まないコントロールとしてハイドロホービンの場合は１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）を、そしてＰｂｐＡの場合は精製水を用い、同様に吸着処理を行った。吸着しているバイオサーファクタントとプライサーフＡ２１０Ｇを被うように直径６ｍｍの濾紙を静置し、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）に溶解している１０μｌのクチナーゼ溶液（２０μｇ／ｍｌ）をしみ込ませた。このＰＢＳフィルムを実施例１５−１、１５−３に記載されている条件で反応を行った（ハイドロホービン：３０℃にて１２時間、ＰｂｐＡ：３７℃にて６時間）。反応後のＰＢＳフィルムを精製水で洗浄後、乾燥させた後に観察を行った。
その結果、ＰＢＳフィルム状の両バイオサーファクタントを吸着させた部位はコントロールと比較してＰＢＳが有意に分解されていた（図３０）。そしてプライサーフＡ２１０Ｇを吸着させた部位においては、コントロールと比較した場合に有意なＰＢＳの分解は観察されなかった（図３０）。尚、ＰＢＳのフィルムを透過画像として取り込んだので、図３０においてＰＢＳ分解部分は黒色で表されている。このことからハイドロホービンやＰｂｐＡといったバイオサーファクタントはプライサーフＡ２１０Ｇのような人工界面活性剤よりも強力にクチナーゼのＰＢＳ分解を促進することが明らかになった。

本発明はプラスチック結合性タンパク質等のバイオサーファクタントがプラスチックの疎水表面に吸着し、それによって、プラスチック分解酵素と共同してプラスチックの分解を有効に促進することできる、という新たな知見に基づくものである。
従って、本発明においては、バイオサーファクタントの存在下でプラスチックをより効果的に分解する方法が提供される。更に、バイオサーファクタントとプラスチック分解酵素を生産する微生物、或いは、あるいはバイオサーファクタント及び／又はプラスチック分解酵素そのものを活用することで、高密度のプラスチックの大規模分解を効率的に進行させることが可能となり、更に、酵素タンパク質や抗生物質などの有用物質生産性の高い微生物（糸状菌や放線菌）を用いることによって、有用物質の生産も同時に行うことができる新規な方法を提供することが出来る。

Claims (22)

1. プラスチック結合性タンパク質の存在下、プラスチック分解酵素を用いてプラスチックを分解する方法であって、
   該プラスチック結合性タンパク質がハイドロホービン若しくはハイドロホービンホモログであるか、又は、該プラスチック結合性タンパク質が以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチド：
   （ａ）配列番号：６又は７で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
   （ｂ）（ａ）で示されるアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列からなり（ａ）のポリペプチドと実質的に同等の機能を有するポリペプチド、である前記方法。
2. 以下の形質転換菌から選ばれた少なくとも一種の形質転換菌を用いる、請求項１記載の方法：
   （１）プラスチック結合性タンパク質をコードする遺伝子を含むＤＮＡによって組換えられた形質転換菌；
   （２）プラスチック分解酵素をコードする遺伝子を含むＤＮＡによって組換えられた形質転換菌；又は
   （３）プラスチック結合性タンパク質をコードする遺伝子及びプラスチック分解酵素をコードする遺伝子を含むＤＮＡによって組換えられた形質転換菌。
3. プラスチック結合性タンパク質がアスペルギルス・オリゼ由来である、請求項１又は２記載の方法。
4. ハイドロホービンまたはハイドロホービンホモログをコードする遺伝子を含むＤＮＡが、以下の（ａ）又は（ｂ）ポリペプチドをコードする塩基配列を含むＤＮＡ：
   （ａ）配列番号：１、２又は３で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
   （ｂ）（ａ）で示されるアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列からなりハイドロホービンと実質的に同等の機能を有するポリペプチド、である請求項３記載の方法。
5. ハイドロホービンまたはハイドロホービンホモログをコードする遺伝子を含むＤＮＡが、以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡ：
   （ａ）配列番号：１、２又は３で示される塩基配列を含むＤＮＡ、
   (ｂ)（ａ）の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、（ａ）のＤＮＡがコードするポリペプチドと実質的に同等の機能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡである請求項４記載の方法。
6. プラスチック結合性タンパク質をコードする遺伝子を含むＤＮＡが、以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡ：
   （ａ）配列番号：６又は７で示される塩基配列を含むＤＮＡ、
   (ｂ)（ａ）の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、（ａ）のＤＮＡがコードするポリペプチドと実質的に同等の機能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡである、請求項１記載の方法。
7. プラスチック分解酵素がアスペルギルス・オリゼ由来のセリンハイドラーゼである、請求項１ないし６のいずれか一項に記載の方法。
8. セリンハイドラーゼがエステラーゼである、請求項７記載の方法。
9. エステラーゼがクチナーゼである、請求項８記載の方法。
10. プラスチック分解酵素をコードする遺伝子を含むＤＮＡが、以下の（ａ）又は（ｂ）ポリペプチドをコードする塩基配列を含むＤＮＡ：
    （ａ）配列番号：４又は５で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
    （ｂ）（ａ）で示されるアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列からなりプラスチック分解酵素と実質的に同等の機能を有するポリペプチドである、請求項１ないし６のいずれか一項に記載の方法。
11. プラスチック分解酵素をコードする遺伝子を含むＤＮＡが、以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡ：
    （ａ）配列番号：４又は５で示される塩基配列を含むＤＮＡ、
    (ｂ）（ａ）の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、プラスチック分解酵素をコードするＤＮＡである、請求項１０記載の方法。
12. プラスチック結合性タンパク質をコードする遺伝子を含むＤＮＡによって組換えられた形質転換菌、及びプラスチック分解酵素をコードする遺伝子を含むＤＮＡによって組換えられた形質転換菌を二重共培養することを特徴とする、請求項２ないし１１のいずれか一項に記載の方法。
13. 更に、分解されたプラスチックの成分を有用物質に転換することから成る、請求項１記載の方法。
14. 有用物質をコードする遺伝子を含むＤＮＡによって組換えられた形質転換菌を用いる、請求項１３記載の方法。
15. プラスチック結合性タンパク質をコードする遺伝子を含むＤＮＡによって組換えられた形質転換菌、プラスチック分解酵素をコードする遺伝子を含むＤＮＡによって組換えられた形質転換菌、及び、有用物質をコードする遺伝子を含むＤＮＡによって組換えられた形質転換菌を三重共培養することを特徴とする、請求項１３又は１４記載の方法。
16. アスペルギルス・オリゼ由来のハイドロホービンをコードする遺伝子、アスペルギルス・オリゼ由来のクチナーゼをコードする遺伝子、及びα−アミラーゼをコードする遺伝子によって組換えられた形質転換菌を用いる、請求項１３記載の方法。
17. 有用物質が、タンパク質、一次代謝産物、二次代謝産物、及びバイオサーファクタントから成る群から選択されることを特徴とする、請求項１３ないし１６のいずれか一項に記載の方法。
18. 有用物質が菌体外に分泌される物質であることを特徴とする、請求項１３ないし１７のいずれか一項に記載の方法。
19. プラスチック結合性タンパク質をコードする遺伝子、プラスチック分解酵素をコードする遺伝子、又は、有用物質をコードする遺伝子の少なくとも一つが他の遺伝子由来のプロモーターの制御下で発現される、請求項２ないし１８のいずれか一項に記載の方法。
20. 形質転換菌が、アスペルギルス属、ペニシリウム属、トリコデルマ属、リゾプス属マグナポルサ属、メタリチウム属、ノイロスポラ属、モナスカス属、アクレモニウム属及びムコール属から成る群から選択される真核糸状真菌である、請求項２ないし１９のいずれか一項記載の方法。
21. アスペルギルス属微生物である、請求項２０に記載の方法。
22. アスペルギルス・オリゼである、請求項２１記載の方法。

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