JP5800172B2 - 新規ウレタン分解菌およびその利用 - Google Patents
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Description
1)水分散型ポリウレタンを含む培地に、候補微生物を作用させ、培地の濁度の減少を評価する工程、および
2)ポリウレタンを含む培地に、候補微生物を作用させ、ポリウレタンの分解を評価する工程。
本発明で用いられる微生物は、ストレプトマイセス属に属する微生物であって、ウレタンに吸着し、これを分解する能力を有する。
本発明のウレタンの吸着・浄化方法は、前述したウレタン吸着・分解能を有するストレプトマイセス(Streptomyces)属に属する微生物を、ウレタンを含有する試料に作用させることを特徴とする。
少量の酵母エキス、カザミノ酸、ペプトン、マルトエキス等を含んでいても良い。基本培地としては、例えば、YES-PG培地、SSYP培地(可溶性でんぷん(10g)、ショ糖(1g)、酵母エキス(1g)、リン酸水素1カリウム(0.1g)、塩化カリウム(0.1g)、硝酸ナトリウム(0.1g)、硫酸マグネシウム7水和(0.1g)から成るSSY培地(pH7.0)にポリウレタン(superflex860:0.3%)を加えた培地)等を用いることができる。
本発明は、上記した微生物を含むウレタンの吸着・浄化剤も提供する。本発明のウレタンの吸着・浄化剤は、本発明の微生物あるいは当該微生物を固定化した担体を、適当な溶媒(培地)に溶解あるいは懸濁して含む。微生物の固定化は、公知の方法にしたがい、微生物のウレタンへの作用を損なわないように、適当な多孔質担体表面に微生物を吸着させればよい。固定化した微生物は、使用後容易に回収して再利用することもできる。たとえば、本発明の微生物菌体を含む培養液にクレー等の多孔質担体を加えた水和剤を調製し、これをウレタン吸着・浄化剤として用いることができる。
本発明は、上記したウレタンの吸着・分解能を有する微生物のスクリーニング方法も提供する。
<工程1:吸着能の評価>
微生物のウレタン吸着能は、水分散型ポリウレタンを含む培地に、候補微生物を作用させ、培地の濁度の減少を評価することにより、容易に評価することができる。
微生物のウレタン分解能は、公知の方法にしたがい、ポリウレタンを含む培地に候補微生物を作用させ、
・ポリウレタンの分解による培地の濁りや変色
・ポリウレタンの分解によって生成するジアミン等の同定
・分解によるポリウレタンの重量や形状変化
等を指標として、評価できる。
本発明の方法によって、試料中から分離除去されたウレタンは、適当な方法で回収して再利用(リサイクル)することができる。具体的には、分解されたポリウレタンをガス化して化学原料に戻したり、高炉還元剤としてコークスの代わりに利用したり、燃焼させてエネルギーに変換することができる。
十勝の上士幌町の埋立地から単離された。YES-PG寒天培地上におけるハロー形成の有無から分解菌を選抜した。ハローを見やすくするため、クマシブルー溶液で染色された。すなわち、単離菌をYES-PG寒天培地で、37℃、18-20時間培養後、寒天培地にクマシブルー溶液を流し入れて静置し、20分後に溶液を取り除いた。次に、メタノール酢酸溶液(クマシブルー溶液からクマシブルーを除いた溶液)を流し入れ、20分間静置した後に取り除いた。青いバックグラウンドの中に、透明なゾーン(分解円のハロー)が観察できたものを、ポリウレタン(PUR)分解菌とした。
40% methanol(試薬特級), 10% acetic acid(試薬特級)(v/v), 0.1% Coomassie blue R-250(w/v)
Hickey Tresner Agar Medium:
0.2%可溶性でんぷん、0.04% NZ amine TypeA, 0.02% 肉エキス、0.02%酵母エキス、50ppmナイスタチン、100ppmシクロヘキシミド、5ppmナリジキシ酸、寒天1.5%、pH7.2
埋め立て地から単離されたグラム陽性菌(Streptomyces sp.)について、ポリウレタン(PUR)原材料の浄化活性を調べた。
(1)菌体を1白金取り、200mlフラスコ中のYES-PG培地(PUR「super flex 860」0.3%, ゼラチン0.4%, 酵母エキス0.002%, 硫安0.05%, リン酸一カリウム0.004%, リン酸二ナトリウム0.015%, 硫酸マグネシウム0.05%, 微量要素液「塩化マンガン0.2%, 塩化銅0.003%, 塩化亜鉛0.002%, 塩化カルシウム0.003%, モリブデンナトリウム0.002%, 塩化第二鉄0.015%」1ml/l)100mlに接種して、30℃、12日間、120rpmで震盪培養した。
その結果、PURが菌体に吸着・沈降するとともに、乳濁していた培地が透明になった(図1)。
その結果、いずれのPUR原材料においても、時間とともにPURが菌体に吸着・沈降するとともに、乳濁していた培地が透明になった(図2)。
その結果、32℃、40℃の条件で、時間とともにPURが菌体に吸着・沈降するとともに、乳濁していた培地が透明になった(図4)。
また、30℃で5.0, 6.5, 8.0或は10.0の初期pHの条件で6日間、120rpmで震盪培養した。その結果、いずれのpHでも、時間とともにPURが菌体に吸着・沈降するとともに、乳濁していた培地が透明になった(図4)。
(1)菌体を1白金取り、YES-PG培地に接種して、30℃、7〜9日間、120rpmで震盪培養した。培養上清はメンブランフィルター(0.45μm)で吸引濾過して得た。また、遠心・集菌後に20mM KPB(pH7.0)で調製した0.2% deoxy-BIGCHAPで菌体を30分間激しく攪拌し、菌体結合画分を得た。一方、YES寒天培地(酵母エキス0.002%, 硫安0.05%, リン酸一カリウム0.004%, リン酸二ナトリウム0.015%, 硫酸マグネシウム0.05%, 寒天1.5%, 微量要素液「塩化マンガン0.2%, 塩化銅0.003%, 塩化亜鉛0.002%, 塩化カルシウム0.003%, モリブデンナトリウム0.002%, 塩化第二鉄0.015%」1ml/l, pH6.5)に0.3% PUR(Impranil)を加えて寒天プレートを作成した。ウェルに培養菌液、培養上清、或は、菌体結合画分の90μlを入れ、30℃、7日間インキュベート後にCBB染色を行い、分解円(ハロー)を観察した。
その結果、培養菌液では菌体の増殖域、培養上清と菌体結合画分はウェルの周囲に、それぞれ分解円(ハロー)を形成した(図6)。
本微生物は、好気性で、光は要求しない。分岐する基生菌糸と気菌糸を作り、気菌糸の先端に連鎖上の胞子を形成し、直径2-3mmの灰色の扁平で菌糸状のコロニーを形成した。菌糸幅0.5-2.0μmで枝分かれした菌糸集合体を形成し、広範囲の有機化合物をエネルギーに利用できる。
1)YES-PG培地にStreptomyces C13a(以下、「C13a株」という)を接種し、30℃で培養し、培養7日までの培養液のpHを経時的に測定した(図8A)。その結果、培養につれてpHの上昇が見られたが、その変化は6.5〜9の範囲であった。
1)C13a株の培養温度と増殖:
C13a株をカゼイン寒天培地に塗抹し、30℃及び45℃で1日培養した(図9)。その結果、増殖は45℃の方が旺盛であった。
YES-PG培地で1ヶ月間培養した菌液にポリウレタン(PUR)製の指サック及びチューブを入れ、30℃で25日間培養を続けた。その結果、指サックは細かく断片化された(図10A)。一方、チューブは断片化されなかったが、内壁に菌体の付着が見られた(図10B)。
培養菌液をクレー(粘土)に混合する方法で水和剤を作成した。水道水を用いて培養菌液の濃度0.5, 5.0, 50%の3種を調製した。この水和剤をYES-P培地(PUR: ImpranilTM)のウエルに入れ、30℃、1週間静置後、CBB染色により分解円を観察した。その結果、水和剤中のC13a株による分解円が観察された(図11A)。
図12Cに指サックの分解率を示した。5%水和剤でおよそ5%程度が分解された。
その結果、30℃と比べて、45℃の方が指サックの分解が顕著であることがわかった。また、SSYPで分解が最も顕著であることがわかった。
でんぷん培地: 10g可溶性でんぷん,1g K2HPO4, 1g MgSO4・7H2O, 1g NaCl, 2g (NH4)2SO4, 1mg FeSO4・7H2O, 1mg MnCl2・4H2O, 1mg ZnSO4・7H2O per L, pH 7.2.
SSYP: SSY培地にPUR (0.3%)を加えたもの
でんぷんP培地:でんぷん培地にPUR (0.3%)を加えたもの
試験管にポリエチレン(PE)ビーズ(およそ30粒:正確に秤量)を入れ、オートクレーブした。これに5mlの各種培地(YMG培地, casein培地, YES-G培地)を入れた。C13a株をYES-G培地で前培養(37℃, 2日間震盪培養)後、その0.5mlを試験管に入れ、30℃で2ヶ月間震盪培養した。培養後のビーズ重量を測定し、分解能を算出した。測定は少なくとも4反復行った。その結果、PEの分解率はYMG培地0.033%、casein培地0.104%、YES-G培地0.097%となり、PURに対する分解能と比較すると弱いものの、C13a株はPEも分解できることが確認された。
Casein培地:0.2g Sodium casein, 0.5g K2HPO4, 0.2g MgSO4・7H2O, 0.01g FeCl3 per L, pH 6.6
下表2に示す手順で、C13a株の分泌する分解酵素(エステラーゼ)の部分精製を行った。その結果、回収率は低いものの、比活性値で約700倍に精製された。
Claims (8)
- ウレタン吸着能及び分解能を有するストレプトマイセス(Streptomyces)属に属する微生物を、ウレタンを含有する試料に作用させてウレタンを分解し、分解したウレタンを前記微生物に吸着、凝集させて除去することを特徴とする、ウレタンの吸着・浄化方法であって、前記微生物が受託番号FERMP-21770で特定される微生物である方法。
- ウレタンがポリウレタンである、請求項1記載の方法。
- ポリウレタンが試料中に微粒子状で分散されている、請求項2記載の方法。
- 微生物がさらにポリエチレン分解能を有し、試料中のポリエチレンも浄化可能である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 受託番号FERM P-21770で特定される微生物。
- 請求項5に記載の微生物を含む、ウレタンの吸着・浄化剤。
- 下記の工程を含む、ウレタン吸着能及び分解能を有する微生物のスクリーニング方法:
1)水分散型ポリウレタンを含む培地に、候補微生物を作用させ、培地の濁度の減少を評価する工程、および
2)ポリウレタンを含む培地に、候補微生物を作用させ、ポリウレタンの分解を評価する工程。 - ポリウレタンの分解を分解円の形成あるいはポリウレタン塊の目視による分解確認により評価することを特徴とする、請求項7記載のスクリーニング方法。
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