JP2005176825A - 好冷微生物を利用したタンパク質の生産法及び環境浄化法 - Google Patents
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Abstract
【課題】好冷微生物を宿主として利用した、熱安定性の低い物質の生産システムを提供する。
【解決手段】目的のタンパク質をコードするＤＮＡを好冷微生物内で発現可能な状態で含む発現ベクターを好冷微生物に導入して、当該好冷微生物を培養し、該培養物から上記タンパク質を採取してタンパク質を製造する。当該発現ベクターとして、目的のタンパク質をコードするＤＮＡ、好冷微生物内で機能するプロモーター、及び好冷微生物内で機能するレプリコンを機能可能に連結して含むものを用いる。
【選択図】 なし
【解決手段】目的のタンパク質をコードするＤＮＡを好冷微生物内で発現可能な状態で含む発現ベクターを好冷微生物に導入して、当該好冷微生物を培養し、該培養物から上記タンパク質を採取してタンパク質を製造する。当該発現ベクターとして、目的のタンパク質をコードするＤＮＡ、好冷微生物内で機能するプロモーター、及び好冷微生物内で機能するレプリコンを機能可能に連結して含むものを用いる。
【選択図】 なし
Description
本発明は、好冷微生物を利用したタンパク質生産法に関する。さらに本発明は、当該好冷微生物を利用したタンパク質生産法に好適に用いられる発現系、具体的には目的タンパク質をコードする遺伝子を組み込むためのベクター、当該遺伝子を組み込んだ発現ベクター、及び当該発現ベクターを導入してなる形質転換体、並びに当該タンパク質生産法を用いて得られるタンパク質に関する。また本発明は、かかる好冷微生物によるタンパク質合成系を利用した環境浄化方法に関する。
酵素は、一般に高い基質特異性と反応特異性を有し、穏和な条件で反応を促進する優れた触媒として、産業上有用なタンパク質であり、医薬品などのファインケミカルの合成のみならず、コモディティーケミカルの生産にも利用されつつある。こうした工業生産に利用される酵素の大部分は微生物に由来するものである。また、かかる酵素、並びに酵素を生産する微生物（酵素生産系）は、上記のような有用物質の生産だけでなく、汚染された環境浄化にも有効である。例えば、廃水処理、生ゴミ処理、及び汚染土壌の浄化処理など、有害物質の分解浄化における酵素またはこれを生産する微生物（酵素生産系）の利用価値は極めて高い。
特に、物質生産や環境浄化を行う環境が多様であることを考えると、常温以外の環境下で機能する、酵素等の有用タンパク質の生産系を確立することの重要性は図りしれない。
例えば、アミラーゼ、リパーゼ、及びプロテアーゼは、種々の合成反応の触媒のみならず、食品加工用酵素として、また洗剤への添加剤として、利用価値の高い酵素である。例えば、衣類に付着した油脂、タンパク質または炭水化物を分解除去して綺麗にするには、リパーゼ、プロテアーゼまたはアミラーゼを配合した洗剤が有効であるし、また油脂を含む廃水や土壌の浄化処理には、リパーゼまたはリパーゼを産生する微生物の利用が有効である。特に、低温で高い活性を有する酵素や微生物を利用したその生産系は、衣類の洗浄には通常水が使用されることや、寒冷地や冬季においても廃水や土壌を浄化する必要性があることから、有用であり、その早急な確立が求められている。また、食肉の柔化処理に使用されるコラゲナーゼも、食肉の品質を保持する必要から、低温下で使用されて食肉の柔化という所期の目的が達成できるものであることが望ましい。
本発明者らは、こうした目的のもと、本発明に至るにあたり、南極海水から分離した好冷微生物に由来する好冷酵素（アミラーゼ、リパーゼ、及びプロテアーゼ）の高生産を目指して、これらの酵素の遺伝子をT7プロモーターの下流に挿入し、大腸菌を宿主とした発現系の構築を試みる実験を行ったが、これらの酵素は全く産生されなかった。その理由として、定かではないものの、好冷微生物に由来するような好冷酵素は、大腸菌の生育温度（37℃）では不安定であり、分解されてしまった可能性が考えられる。
このように、大腸菌や酵母などのような従来の常温菌を宿主として利用して、熱安定性の低い酵素等のタンパク質を生産することは困難であり、その方法の確立が求められるところである。
なお、関連する技術として、特許文献１には、枯草菌のゲノムに耐高温性または耐低温性を付与するＤＮＡと環境浄化に優れた遺伝子群を導入することによって調製した形質転換体を、常温以外の環境下における浄化に利用することが記載されている。
特開２０００−３１６５７６号公報
本発明の目的は、好冷微生物を宿主として利用した、熱安定性の低い物質の生産システムを提供することである。より詳細には、本発明は、好冷微生物を利用したタンパク質生産法を提供すること、ならびに当該タンパク質生産法に好適に使用される発現・生産系、具体的には目的タンパク質をコードする遺伝子を組み込むためのベクター、当該遺伝子を組み込んだ発現ベクター、及び当該発現ベクターを導入してなる形質転換体を提供することを目的とする。さらに本発明は、かかる好冷微生物によるタンパク質合成系を利用したバイオレメディエーションによる環境浄化方法を提供することを目的とする。
低温環境下で生育する好冷微生物は、熱安定性の低いタンパク質、特に酵素を生産する宿主として、低温環境での環境浄化やバイオコンバージョンに有用である。本発明者らは、上記目的を達成すべく、鋭意研究を重ねた結果、下記に掲げる実施態様により、本発明の目的を達成することができることを見いだした。
本発明は下記に掲げる実施態様を含む：
項１． 目的のタンパク質をコードするＤＮＡを好冷微生物の細胞内で発現可能な状態で含む発現ベクターを好冷微生物の細胞内に導入して、当該好冷微生物またはその細胞を培養し、該培養物から上記タンパク質を採取することを特徴とするタンパク質の製造方法。
項２． タンパク質が熱安定性の低いものであることを特徴とする項１に記載するタンパク質の製造方法。
項３． 培養を低温条件下で行うことを特徴とする項１または２に記載するタンパク質の製造方法。
項４． 発現ベクターが、目的のタンパク質をコードするＤＮＡ、好冷微生物の細胞内で機能するプロモーター、及び好冷微生物の細胞内で機能するレプリコンを機能可能に連結して含むものである、項１乃至３のいずれかに記載するタンパク質の製造方法。
項５． 発現ベクターが、レプリコンとして、さらに好冷微生物の細胞内で機能するレプリコン以外のレプリコンを、機能可能に連結して含むものである、項４に記載するタンパク質の製造方法。
項６． 発現ベクターが、好冷微生物の細胞内で機能するレプリコンと大腸菌由来のレプリコンを有する、好冷微生物と大腸菌とのシャトルベクターである項５に記載するタンパク質の製造方法。
項７． 好冷微生物がAcinetobacter属に属する微生物である、項１乃至６のいずれかに記載するタンパク質の製造方法。
項7-1． 好冷微生物がAcinetobacter sp. Strain No.6（受託番号：FERM P-19662）ある、項１乃至６のいずれかに記載するタンパク質の製造方法。
項８． プロモーターが、下記(Ａ）または（Ｂ）に記載する塩基配列からなるものである項１乃至7-1のいずれかに記載するタンパク質の製造方法：
（Ａ）配列番号１、２または３のいずれかに記載する塩基配列、
（Ｂ）配列番号１、２または３のいずれかに記載する塩基配列において、１または複数の塩基が欠失、置換または付加されてなる塩基配列であって、プロモーター活性（転写活性）を有する塩基配列。
項8-1．（Ｂ）に記載する塩基配列が、好冷微生物の細胞内でプロモーター活性（転写活性）を有する塩基配列である、項１乃至７のいずれかに記載するタンパク質の製造方法。
項8-2．（Ｂ）に記載する塩基配列が、Acinetobacter属に属する好冷微生物の細胞内でプロモーター活性（転写活性）を有する塩基配列である、項１乃至７のいずれかに記載するタンパク質の製造方法。
項8-3．（Ｂ）に記載する塩基配列が、Acinetobacter sp. Strain No.6（受託番号：FERM P-19662）の細胞内でプロモーター活性（転写活性）を有する塩基配列である、項１乃至７のいずれかに記載するタンパク質の製造方法。
項９． （Ｂ）に記載する塩基配列が、配列番号１、２または３のいずれかに記載する塩基配列と相補的な塩基配列に対して、ストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列であって、プロモーター活性（転写活性）を有する塩基配列である、項８乃至8-3のいずれかに記載するタンパク質の製造方法。
項１０． （Ｂ）に記載する塩基配列が、下記(a)〜(d)のいずれかである項８乃至９のいずれかに記載するタンパク質の製造方法：
(a) 配列番号４に記載する塩基配列、
(b) 配列番号５に記載する塩基配列、
(c) 配列番号６に記載する塩基配列、
(d) 配列番号７に記載する塩基配列。
項１． 目的のタンパク質をコードするＤＮＡを好冷微生物の細胞内で発現可能な状態で含む発現ベクターを好冷微生物の細胞内に導入して、当該好冷微生物またはその細胞を培養し、該培養物から上記タンパク質を採取することを特徴とするタンパク質の製造方法。
項２． タンパク質が熱安定性の低いものであることを特徴とする項１に記載するタンパク質の製造方法。
項３． 培養を低温条件下で行うことを特徴とする項１または２に記載するタンパク質の製造方法。
項４． 発現ベクターが、目的のタンパク質をコードするＤＮＡ、好冷微生物の細胞内で機能するプロモーター、及び好冷微生物の細胞内で機能するレプリコンを機能可能に連結して含むものである、項１乃至３のいずれかに記載するタンパク質の製造方法。
項５． 発現ベクターが、レプリコンとして、さらに好冷微生物の細胞内で機能するレプリコン以外のレプリコンを、機能可能に連結して含むものである、項４に記載するタンパク質の製造方法。
項６． 発現ベクターが、好冷微生物の細胞内で機能するレプリコンと大腸菌由来のレプリコンを有する、好冷微生物と大腸菌とのシャトルベクターである項５に記載するタンパク質の製造方法。
項７． 好冷微生物がAcinetobacter属に属する微生物である、項１乃至６のいずれかに記載するタンパク質の製造方法。
項7-1． 好冷微生物がAcinetobacter sp. Strain No.6（受託番号：FERM P-19662）ある、項１乃至６のいずれかに記載するタンパク質の製造方法。
項８． プロモーターが、下記(Ａ）または（Ｂ）に記載する塩基配列からなるものである項１乃至7-1のいずれかに記載するタンパク質の製造方法：
（Ａ）配列番号１、２または３のいずれかに記載する塩基配列、
（Ｂ）配列番号１、２または３のいずれかに記載する塩基配列において、１または複数の塩基が欠失、置換または付加されてなる塩基配列であって、プロモーター活性（転写活性）を有する塩基配列。
項8-1．（Ｂ）に記載する塩基配列が、好冷微生物の細胞内でプロモーター活性（転写活性）を有する塩基配列である、項１乃至７のいずれかに記載するタンパク質の製造方法。
項8-2．（Ｂ）に記載する塩基配列が、Acinetobacter属に属する好冷微生物の細胞内でプロモーター活性（転写活性）を有する塩基配列である、項１乃至７のいずれかに記載するタンパク質の製造方法。
項8-3．（Ｂ）に記載する塩基配列が、Acinetobacter sp. Strain No.6（受託番号：FERM P-19662）の細胞内でプロモーター活性（転写活性）を有する塩基配列である、項１乃至７のいずれかに記載するタンパク質の製造方法。
項９． （Ｂ）に記載する塩基配列が、配列番号１、２または３のいずれかに記載する塩基配列と相補的な塩基配列に対して、ストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列であって、プロモーター活性（転写活性）を有する塩基配列である、項８乃至8-3のいずれかに記載するタンパク質の製造方法。
項１０． （Ｂ）に記載する塩基配列が、下記(a)〜(d)のいずれかである項８乃至９のいずれかに記載するタンパク質の製造方法：
(a) 配列番号４に記載する塩基配列、
(b) 配列番号５に記載する塩基配列、
(c) 配列番号６に記載する塩基配列、
(d) 配列番号７に記載する塩基配列。
項１１．項１乃至１０に記載する製造方法によって得られるタンパク質。
項11-1．熱安定性の低いタンパク質である、項１１に記載するタンパク質。
項11-2．酵素である項１１に記載するタンパク質。
項11-3．アミラーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、プロテアーゼ、フィターゼ、ラッカーゼ、カタラーゼ、ペルオキシダーゼ、亜硝酸還元酵素、及びＰＣＢ分解酵素よりなる群から選択される１またはそれ以上の酵素である項１１に記載するタンパク質。
項11-4．熱安定性の低いα−アミラーゼである、項１１に記載するタンパク質。
項11-1．熱安定性の低いタンパク質である、項１１に記載するタンパク質。
項11-2．酵素である項１１に記載するタンパク質。
項11-3．アミラーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、プロテアーゼ、フィターゼ、ラッカーゼ、カタラーゼ、ペルオキシダーゼ、亜硝酸還元酵素、及びＰＣＢ分解酵素よりなる群から選択される１またはそれ以上の酵素である項１１に記載するタンパク質。
項11-4．熱安定性の低いα−アミラーゼである、項１１に記載するタンパク質。
項１２． 好冷微生物の細胞内で機能するプロモーター、及び好冷微生物の細胞内で機能するレプリコンを機能可能に連結して含むものであるベクター。
項１３． さらに、リポソーム結合部位、翻訳開始コドン、シグナルペプチドをコードする塩基配列をもつＤＮＡ、翻訳終始コドン、ターミネーター、選択マーカー遺伝子、及び相同領域よりなる群から選択される構成成分（ＤＮＡ成分）を１または２以上、機能可能に連結して含むものである項１２に記載のベクター。
項１４． 好冷微生物の細胞内で機能するプロモーターが、下記(Ａ）または（Ｂ）に記載する塩基配列からなるものである項１２または１３に記載するベクター：
（Ａ）配列番号１、２または３のいずれかに記載する塩基配列、
（Ｂ）配列番号１、２または３のいずれかに記載する塩基配列において、１または複数の塩基が欠失、置換または付加されてなる塩基配列であって、プロモーター活性（転写活性）を有する塩基配列。
項14-1．（Ｂ）に記載する塩基配列が、好冷微生物の細胞内でプロモーター活性（転写活性）を有する塩基配列である、項１２または１３に記載するベクター。
項14-2．（Ｂ）に記載する塩基配列が、Acinetobacter属に属する好冷微生物の細胞内でプロモーター活性（転写活性）を有する塩基配列である、項１２または１３に記載するベクター。
項14-3．（Ｂ）に記載する塩基配列が、Acinetobacter sp. Strain No.6（受託番号：FERM P-19662）の細胞内でプロモーター活性（転写活性）を有する塩基配列である、項１２または１３に記載するベクター。
項１５． （Ｂ）に記載する塩基配列が、配列番号１、２または３のいずれかに記載する塩基配列と相補的な塩基配列に対して、ストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列である項１４乃至13-4のいずれかに記載するベクター。
項１６．（Ｂ）に記載する塩基配列が、下記(a)〜(d)のいずれかである項１４乃至１５のいずれかに記載するベクター：
(a) 配列番号４に記載する塩基配列、
(b) 配列番号５に記載する塩基配列、
(c) 配列番号６に記載する塩基配列、
(d) 配列番号７に記載する塩基配列。
項１３． さらに、リポソーム結合部位、翻訳開始コドン、シグナルペプチドをコードする塩基配列をもつＤＮＡ、翻訳終始コドン、ターミネーター、選択マーカー遺伝子、及び相同領域よりなる群から選択される構成成分（ＤＮＡ成分）を１または２以上、機能可能に連結して含むものである項１２に記載のベクター。
項１４． 好冷微生物の細胞内で機能するプロモーターが、下記(Ａ）または（Ｂ）に記載する塩基配列からなるものである項１２または１３に記載するベクター：
（Ａ）配列番号１、２または３のいずれかに記載する塩基配列、
（Ｂ）配列番号１、２または３のいずれかに記載する塩基配列において、１または複数の塩基が欠失、置換または付加されてなる塩基配列であって、プロモーター活性（転写活性）を有する塩基配列。
項14-1．（Ｂ）に記載する塩基配列が、好冷微生物の細胞内でプロモーター活性（転写活性）を有する塩基配列である、項１２または１３に記載するベクター。
項14-2．（Ｂ）に記載する塩基配列が、Acinetobacter属に属する好冷微生物の細胞内でプロモーター活性（転写活性）を有する塩基配列である、項１２または１３に記載するベクター。
項14-3．（Ｂ）に記載する塩基配列が、Acinetobacter sp. Strain No.6（受託番号：FERM P-19662）の細胞内でプロモーター活性（転写活性）を有する塩基配列である、項１２または１３に記載するベクター。
項１５． （Ｂ）に記載する塩基配列が、配列番号１、２または３のいずれかに記載する塩基配列と相補的な塩基配列に対して、ストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列である項１４乃至13-4のいずれかに記載するベクター。
項１６．（Ｂ）に記載する塩基配列が、下記(a)〜(d)のいずれかである項１４乃至１５のいずれかに記載するベクター：
(a) 配列番号４に記載する塩基配列、
(b) 配列番号５に記載する塩基配列、
(c) 配列番号６に記載する塩基配列、
(d) 配列番号７に記載する塩基配列。
項１７. 項１２乃至１６のいずれかに記載するベクターに含まれる好冷微生物の細胞内で機能するプロモーターの下流域に、目的のタンパク質をコードするＤＮＡを、発現可能な状態に連結して含むことを特徴とする発現ベクター。
項１８． 目的のタンパク質が、熱安定性の低いものである項１７に記載する発現ベクター。
項１９． 目的のタンパク質が、酵素である項１７または１８に記載する発現ベクター。
項２０． 目的のタンパク質が、アミラーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、プロテアーゼ、フィターゼ、ラッカーゼ、カタラーゼ、ペルオキシダーゼ、亜硝酸還元酵素、及びＰＣＢ分解酵素よりなる群から選択される１またはそれ以上の酵素である項１９に記載する発現ベクター。
項１８． 目的のタンパク質が、熱安定性の低いものである項１７に記載する発現ベクター。
項１９． 目的のタンパク質が、酵素である項１７または１８に記載する発現ベクター。
項２０． 目的のタンパク質が、アミラーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、プロテアーゼ、フィターゼ、ラッカーゼ、カタラーゼ、ペルオキシダーゼ、亜硝酸還元酵素、及びＰＣＢ分解酵素よりなる群から選択される１またはそれ以上の酵素である項１９に記載する発現ベクター。
項２１． 項１７乃至２０のいずれかに記載する発現ベクターを好冷微生物の細胞内に導入してなる形質転換体。
項２２． 項２１に記載する形質転換体を用いてバイオレメディエーションを行うことを特徴とする環境浄化方法。
項２３． 低温条件下で行われることを特徴とする、項２２に記載する環境浄化方法。
以下、本発明を詳細に説明する。
（１）タンパク質の製造方法、並びにそれに使用する発現ベクター及び形質転換体
本発明のタンパク質の製造方法は、目的のタンパク質をコードするＤＮＡを好冷微生物の細胞内で発現可能な状態で含む発現ベクターを、好冷微生物の細胞内に導入して、当該好冷微生物またはその細胞を培養し、該培養物から上記タンパク質を採取することを特徴とするものである。
項２３． 低温条件下で行われることを特徴とする、項２２に記載する環境浄化方法。
以下、本発明を詳細に説明する。
（１）タンパク質の製造方法、並びにそれに使用する発現ベクター及び形質転換体
本発明のタンパク質の製造方法は、目的のタンパク質をコードするＤＮＡを好冷微生物の細胞内で発現可能な状態で含む発現ベクターを、好冷微生物の細胞内に導入して、当該好冷微生物またはその細胞を培養し、該培養物から上記タンパク質を採取することを特徴とするものである。
本発明が対象とするタンパク質は、特に制限されることはないが、好ましくは熱安定性の低いもの、具体的には常温〜高温において保存安定性の低いタンパク質、常温〜高温において構造的または機能的に何らかの変性を受けるタンパク質などを挙げることができる。かかるタンパク質としては好適には酵素を挙げることができる。また酵素としては、特に制限されないが、例えばアミラーゼ（特にα-アミラーゼ）、グルコアミラーゼ、プルラナーセ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、セルビアーゼ、β１,４マンナナーゼ、ペルオキシダーゼ、カタラーゼ、セリンプロテアーゼ、β−ガラクトシダーゼ、トランスグルタミナーゼ、リパーゼ、エステラーゼ、エンドグルカナーゼ、エキソベータ１,３グルカナーゼ、ベータチロシナーゼ、トリプトファナーゼ、ラセマーゼ、トリプトファナーゼアミノアシラーゼアスパルターゼ、インベルターゼ、ヘルペリジナーゼ、メリビアーゼ、プロトペクチナーゼ、ポリガラクチュロナーゼ、ペクチンエステラーゼ、ナリギナーゼ、ケラチナーゼ、カテコール１,２オキシゲナーゼ、ウレアーゼ、ガラクトアセチルトランスフェラーゼ、ビフェニルエーテル構造開裂酵素、ＰＣＢ分解酵素、トリハロース合成酵素、セルラーゼ、キチナーゼ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、フィターゼ、ラッカーゼ、ポリ乳酸分解酵素、亜硝酸還元酵素、アンモニア酸化酵素、及びグルコースイソメラーゼ等を例示することができる。本発明の製造方法は、かかる酵素の中でも、特に熱安定性の低い酵素の製造に適している。熱安定性の低い酵素として、例えば好冷微生物に由来する酵素など、一般に好冷酵素と称されるものを挙げることができる。また、熱安定性の低いタンパク質として、酵素以外にも130 Kd 等の殺虫タンパク質（δ-endotoxin）、コレスチン等の抗生物質、および氷結タンパク質などのタンパク質が知られている。
なお、これらのタンパク質をコードするＤＮＡは、遺伝子工学的手法によりこれらのタンパク質からｍＲＮＡを調製し、それからｃＤＮＡを調製することもできるし、また公知の遺伝子情報に基づいて化学合成または遺伝子工学的手法により調製することもでき、こうした由来を問わず、いずれのＤＮＡを用いることもできる。
本発明で用いられる発現ベクターは、上記目的のタンパク質をコードするＤＮＡを、宿主として用いる好冷微生物の細胞内で発現可能な状態で含むものであればよい。
一般に発現ベクターは、目的のタンパク質を対象とする宿主細胞内で発現させるために、転写の下流方向順に必要に応じて(1) プロモーター機能領域、(2) リポソーム結合部位、(3) 翻訳開始コドン、(4) シグナルペプチドをコードする塩基配列をもつＤＮＡ、(5)構造タンパク質をコードする塩基配列をもつＤＮＡ、(6) 翻訳終始コドン、(7) ターミネーター、(8) 選択マーカー遺伝子、(9) 宿主中で自己複製可能な自律性複製配列（レプリコン）、(10)相同領域等を、含むように構築される。
本発明の製造方法で用いられる発現ベクターには、目的のタンパク質を好冷微生物の細胞内で発現させ、そして生産するための、また好適には、さらに産生されたタンパク質を好冷微生物の細胞外に分泌するための成分を最小限含むことが求められる。かかる発現ベクターは、上記成分のうち、(1) プロモーター機能領域として好冷微生物内で機能するプロモーターを、(5)構造タンパク質をコードする塩基配列をもつＤＮＡとして、上記目的のタンパク質をコードする塩基配列をもつＤＮＡを、(9) 宿主中で自己複製可能な自律性複製配列（レプリコン）として、好冷微生物の細胞内で機能するレプリコンを有する。なお、発現ベクター内において、(5) タンパク質をコードする塩基配列をもつＤＮＡは、(1) プロモーター機能領域（好冷微生物の細胞内で機能するプロモーター）の下流域に発現可能な状態で配置されており、他の構成成分もまた機能可能な状態で連結されて存在する。なお、ここで発現可能とは、発現ベクターを好冷微生物に導入した場合に、発現ベクターが好冷微生物の細胞内で目的のタンパク質をコードする遺伝子を発現するように機能することを意味する。また、機能可能とは、発現ベクターを好冷微生物に導入した場合に、発現ベクターが好冷微生物の細胞内で目的のタンパク質をコードする遺伝子を発現し、目的のタンパク質を産生するように機能することを意味する。
本発明が対象とする好冷微生物は、低温域、例えば−１０〜５℃、好ましくは０〜５℃の低温条件下で生育可能な微生物である。かかる好冷微生物としては、Shewanella sp.、Polaromanos vacuorata、Shewamella omeidemsis、Alteromonas holoplanctis、Vibrio、Alcaligenes、Pseudomonas、Acinetobacter、Flavobacterium、Moritella marina、Bacillus psychrophilus、Colwellia maris ABE-1などの属に属する細菌やRhodotorula、Saccharomyces、Candidaなどの属に属する酵母等の従来公知の微生物を挙げることができる。好ましくはAcinetobacter属に属する細菌である。
本発明の発現ベクターに用いられるプロモーターは、かかる好冷微生物の細胞内でプロモーター機能を発揮するものであれば、特に制限されない。好ましくは、好冷微生物に由来するものである。その具体例としては、後述する実施例において、本発明の態様の１つとして掲げたプロモーター、すなわち、配列番号１に記載する塩基配列からなるプロモーター（以下、「プロモーターP1」ともいう）、配列番号２に記載する塩基配列からなるプロモーター（以下、「プロモーターP3Δ1」ともいう）、及び配列番号３に記載する塩基配列からなるプロモーター（以下、「プロモーターP6Δ１」ともいう）を例示することができる。これらのプロモーターの中でも好ましくはプロモーターP1、及びプロモーターP3Δ1である。
なお、これらのプロモーターは、発現系においてプロモーター機能（プロモーターの転写活性）を発揮することを限度として、それを構成する塩基配列の一部が変更または修飾されていてもよい。かかるプロモーターとしては、具体的には、配列番号１、２または３のそれぞれに記載する塩基配列において１若しくは複数の塩基が置換、欠失または付加されてなる塩基配列からなり、プロモーター機能（プロモーターの転写活性）を有するものを挙げることができる。当該配列番号１、２または３のそれぞれに記載する塩基配列において１若しくは複数の塩基が置換、欠失または付加されてなる塩基配列からなるプロモーターには、配列番号１、２または３のそれぞれに記載する塩基配列と相補的な塩基配列に対して、ストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有するプロモーターが含まれる。なお、ここでストリンジェントな条件とは、０.１％ＳＤＳを含む０.１％ＳＳＣ中、６０℃の条件を挙げることかできる。
上記の発現系として、好ましくは好冷微生物を宿主とする発現系を挙げることができる。
また、当該配列番号１、２または３のそれぞれに記載する塩基配列において１若しくは複数の塩基が置換、欠失または付加されてなる塩基配列からなるプロモーターには、配列番号１、２または３のそれぞれに記載する塩基配列と相同性を有する塩基配列を有するプロモーター配列が含まれる。ここで相同性とは、比較対象とする塩基配列（配列番号１、２または３）と、少なくとも５０％の配列同一性、好ましくは７０％以上の配列同一性、より好ましくは８０％以上の配列同一性、さらに好ましくは８５％以上の配列同一性、最も好ましくは９０〜９５％以上の配列同一性、特には少なくとも９８％の配列同一性を有することを意味する。
かかるプロモーターとしては、プロモーターＰ１（配列番号１）と相同性を有するものとして配列番号４に記載する塩基配列からなるプロモーター（以下、「プロモーターP1Δ1」ともいう）；プロモーターＰ３Δ１（配列番号２）と相同性を有するものとして配列番号５に記載する塩基配列からなるプロモーター（以下、「プロモーターP3」ともいう）、及び配列番号６に記載する塩基配列からなるプロモーター（以下、「P3Δ2」ともいう）；並びに、プロモーターＰ６Δ１（配列番号３）と相同性を有するものとして配列番号７に記載する塩基配列からなるプロモーター（以下、「プロモーターP6」ともいう）を例示することができる。なお、プロモーターP1Δ1はプロモーターP1の塩基配列のうち5'領域の塩基配列を欠失したものであり、プロモーターP3はプロモーターP3Δ1の塩基配列の5'領域に複数個の塩基からなる塩基配列を付加してなるものであり、プロモーターP3Δ2はプロモーターP3Δ1の塩基配列のうち5'領域の塩基配列を欠失したものであり、さらにプロモーターP6はプロモーターP6Δ1の塩基配列の5'領域に複数個の塩基からなる塩基配列を付加してなる態様を有するものである。
かかるプロモーターは、本発明で示す塩基配列に基づいて、化学的に合成することによって調製することができる。また、後述する実施例に示すように、Acinetobacter sp. strain No.6（Acinetobacter No.6）（受託番号：FERM P-19662）から遺伝子工学的手法に基づいて調製することもできる。なお、配列番号１、２または３の塩基配列について１乃至複数の塩基を欠失、置換または付加する技術も当業界で公知であり、例えば、かかる方法として部位指定削除法（Site-directed deletion; Nucl. Acid Res., 11, 1645 (1983)）、部位特異的変異法（Site-directed Mutagenesis）、制限酵素処理、合成遺伝子による方法、ＰＣＲ法などの通常の遺伝子工学的手法を挙げることができる。
本発明の発現ベクターで用いられるレプリコンは、好冷微生物の細胞内で自己複製可能なように機能するようなレプリコンであればよい。かかるレプリコンは好冷微生物に由来するものであってもよいが、後述する実施例で示すように、必ずしも好冷微生物に由来するものである必要はない。好適なレプリコンとしては、宿主として用いる好冷微生物と同じ範疇、好ましくは同じ属、または同じ種に属する微生物に由来するレプリコンを挙げることができる。
本発明の発現ベクターは、宿主中で自己複製可能な自律性複製配列として、上記好冷微生物の細胞内で機能するレプリコンを有するものであればよいが、他にそれ以外のレプリコン（好冷微生物内で機能しないレプリコン）を含むものであってもよい。かかるレプリコンとしては、特に制限されず、例えば大腸菌、酵母、枯草菌、放射菌、藍藻等の藻類、植物細胞、昆虫細胞及び哺乳動物細胞に由来するレプリコンを挙げることができる。好ましくは微生物由来のレプリコンであり、特に大腸菌に由来するレプリコンを好適に挙げることができる。
自律性複製配列として好冷微生物の細胞内で機能するレプリコンとそれ以外のレプリコンを有することによって、発現ベクターは、好冷微生物とそれ以外の生物の細胞内（例えばレプリコン由来の生物細胞内）で複製可能な状態に構築されており、その意味でシャトルベクターとして位置づけることもできる。例えば、後述する実施例で使用した発現ベクターは、好冷微生物（特にAcinetobacter属に属する微生物）の細胞内で機能するレプリコンと大腸菌由来のレプリコンの２つを含んでいることから、好冷微生物（特にAcinetobacter属に属する微生物）と大腸菌との間で相互に複製可能な状態に構築されたシャトルベクターということができる。
かかる本発明の発現ベクターは、操作の便宜上、さらに好適には少なくとも１つの選択マーカー遺伝子を含むことができる。
選択マーカー遺伝子としては、一般に、抗生物質耐性遺伝子または栄養要求性遺伝子などが例示される。具体的には、目的とするタンパク質をコードする遺伝子の発現に用いられる宿主が細菌である場合、抗生物質耐性遺伝子を用いることができ、抗生物質耐性遺伝子としてはシクロヘキシミド耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子（β-ラクタマーゼ遺伝子）、テトラマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、ブレオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、Ｇ−４１８耐性遺伝子等が例示される。また、宿主がそれ以外の、例えば酵母等の場合、栄養要求性遺伝子を用いることができ、栄養要求性遺伝子としてはＨＩＳ４、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＡＲＧ４等が例示される。なお、これらの選択マーカーは、１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。
本発明の発現ベクターは、他の成分として必要に応じて、(2)リポソーム結合部位、(3)翻訳開始コドン、(4)シグナルペプチドをコードする塩基配列をもつＤＮＡ、(6)翻訳終始コドン、(7)ターミネーター、(10)相同領域等、を１または２以上組み合わせて含むことができる。なおこれらの構成成分（ＤＮＡ配列）は、当該発現ベクターを宿主に導入した場合に、目的とするタンパク質をコードする遺伝子が宿主内で発現及び産生可能に機能するように連結されなることが好ましい。
ここで、例えば翻訳開始コドンとしてはＡＴＧ、翻訳終止コドンとしてはＴＡＡ、ＴＧＡ、またはＴＡＧが例示される。これらそれぞれのコドンは、必要に応じてその各領域において１つ以上組み合わされて配列されてもよく、これらに特に限定はない。
ターミネーターとしては、目的とするタンパク質をコードする遺伝子の発現に用いられる宿主 に対応したものであれば、特に制限されず、当業界に技術常識に基づいて選択することができる。
また、宿主染色体上に導入するための相同領域としても、目的とするタンパク質をコードする遺伝子の発現に用いられる宿主に対応したものであれば、特に制限されず、当業界に技術常識に基づいて選択することができる。
なお、かかる発現ベクターは、各機能成分（ＤＮＡ成分）を公知のプラスミドに挿入することによって調製することができる。各機能成分のプラスミドへの挿入は、ＤＮＡ組換えの一般方法、例えば Molecular Cloning.(1989),(Cold Spring Harbor Lab.) に記載の方法に従って行うことができる。
以上説明する発現ベクターは、本発明の製造方法で好適に使用される発現ベクターであるほか、本発明の対象でもある。すなわち、本発明はかかる発現ベクターを提供するものでもある。
本発明の製造方法は、斯くして調製される発現ベクターを好冷微生物に導入し、形質転換体を調製する工程を備える。
当該形質転換体は、詳細には、上述の発現ベクターを公知の方法、例えばコンピテント細胞法(J. Mol. Biol., 53, 154, 1970)、プロトプラストポリエチレン融合法(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929, 1978) 、リン酸カルシウム法 (Science, 221, 551, 1983) 、ＤＥＡＥデキストラン法 (Science, 215, 166, 1982) 、電気パルス法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 7161, 1984）、インビトロパッケージング法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72, 581, 1975 ）、ウイルスベクター法（Cell, 37, 1053, 1984）、またはマイクロインジェクション法（Exp. Cell. Res., 153, 347, 1984)などによって、宿主となる好冷微生物に導入することによって調製することができる。
本発明において使用される宿主は好冷微生物である。好冷微生物とは、前述するように、低温域、例えば−１０〜５℃、好ましくは０〜５℃の低温条件下で生育可能な微生物である。かかる好冷微生物としては、Shewanella sp.、Polaromanos vacuorata、Shewamella omeidemsis、Alteromonas holoplanctis、Vibrio、Alcaligenes、Pseudomonas、Acinetobacter、Flavobacterium、Moritella marina、Bacillus psychrophilus、Colwellia maris ABE-1などの属に属する細菌やRhodotorula、Saccharomyces、Candida、など属に属する酵母等の従来公知の微生物を挙げることができる。好ましくは、Acinetobacter属に属する微生物である。
発現ベクターの宿主細胞中での存在様式は、染色体中に挿入されて、あるいは置換されて組み込まれる。またはプラスミド状態で存在してもよい。宿主に導入される外来遺伝子のコピー数は１コピーでも複数であってもよい。
このようにして得られた形質転換体は、次いで目的とするタンパク質を産生させるために、その宿主に応じて適切な培地中で培養することができる。なお、上記に記載する形質転換体もまた本発明の対象であり、本発明はかかる形質転換体をも提供するものである。
培地には上記形質転換体の生育に必須な炭素源、窒素源、無機物、ビタミン、薬剤などが含有される。
培地の一例としては、形質転換体の宿主として使用する好冷微生物が、大腸菌やAcinetobacter属に属する細菌等のグラム陰性菌、ならびに枯草菌などのグラム陽性菌といった細菌の場合は、ＬＢ培地（日水製薬）、Ｍ９培地（J. Exp. Mol. Genet., Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1972. p.431)などが；また宿主として使用する好冷微生物が、酵母の場合、ＹＰＤ培地（１％ Bacto Yeast Extract, ２％ Bacto Peptone, ２％ Glucose）、ＹＰＧ培地（１％ Bacto Yeast Extract, ２％ Bacto Peptone, ２％ Glycerol）、ＹＰＭ培地（１％ Bacto Yeast Extract, ２％ Bacto Peptone, ２％ Methanol)、ＹＰＤＭ培地（１％Bacto Yeast Extract, ２％ Bacto Peptone, ２％ Dextrose,２％ Methanol)、０．１〜５％メタノールを含有したＹＮＢ液体培地〔０．７％ Yeast NitrogenBase(Difco社）〕、及び０．０１〜５％メタノールを含有したＹＰ培地〔１％ Bacto Yeast Extract(Difco社), ２％ Poly Peptone(大五栄養社）〕、及びＳＭＭ培地 (２％ Methanol,０．５％ CH3COONH4-synthetic medium)などが例示される。
また、その他、宿主として使用する生物がPsychtobacter属に属する微生物の場合、Yeast extract 0.12%，polypeptone 0.23%，sodium citrate 0.03%，glutamic acid 0.03%，sodium nitrate 0.05mg/L，ferrous sulfate 5mg/L，synthetic sea salts Jamarin S．を含有する培地；Shewanella sp属に属する微生物の場合、polypeptone 15%，yeast extract 1%，glycerol 1%，K2HPO4 2%，KH2PO4 1%，magnesium sulfate 0.01%，sodium chloride 0.3%を含有する培地；Acienetobactor属に属する微生物の場合、Bacto-tryptone 1%，Bacto−yeast extract 0.5%，NaCl 1%（pH7.0）を含有する培地；Aureobacterium sp属に属する微生物の場合、Bacto-tryptone 1%，Bacto-yeast extract 0.5% ，NaCl 0.5%を含有する培地が； Pseudomonas sp属に属する微生物の場合、Yeast extract 1%，Meat extract 1%を含有する培地；また Bacillus sp属に属する微生物の場合、Polypeptone 0.2%，Meat extract 0.2%，Yeast extract 0.5%，Glycerol 0.2%，NaCl 0.2%，K2HPO4 0.2%，KH2PO4 0.2%，MgSO4−7H2O 0.2%，Biotin 4μg/Lを含有する培地を、それぞれ一例として挙げることができる。
培養は、通常０〜４５℃の温度範囲で数〜３６０時間程度実施され、必要に応じて通気、攪拌を加えることもできる。培養温度として、好ましくは０〜２５℃、より好ましくは０〜２０℃、さらに好ましくは０〜１５℃、一層好ましくは０〜１０℃の低温条件である。
本発明の製造方法は、さらに、斯くして得られる培養物から目的のタンパク質を採取することによって実施される。目的タンパク質の採取は、培養後、培養上清中または形質転換体（菌体）中に蓄積された目的のタンパク質を公知の方法で抽出し、また必要に応じて精製することによって行うことができる。分離精製は、例えば、塩析法、溶媒沈澱法、透析法、限外濾過法、ゲル電気泳動法、あるいはゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の手法を組み合わせて行うことができる。
（２）タンパク質
本発明は、上記の製造方法によって得られるタンパク質を提供する。
本発明は、上記の製造方法によって得られるタンパク質を提供する。
本発明が対象とするタンパク質は、特に制限されることはないが、好ましくは熱安定性の低いもの、具体的には常温〜高温において保存安定性の低いタンパク質、常温〜高温において構造的または機能的に何らかの変性を受けるタンパク質などを挙げることができる。かかるタンパク質としては好適には酵素を挙げることができる。また酵素としては、特に制限されないが、例えばアミラーゼ（特にα-アミラーゼ）、グルコアミラーゼ、プルラナーセ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、セルビアーゼ、β１,４マンナナーゼ、ペルオキシダーゼ、カタラーゼ、セリンプロテアーゼ、β−ガラクトシダーゼ、トランスグルタミナーゼ、リパーゼ、エステラーゼ、エンドグルカナーゼ、エキソベータ１,３グルカナーゼ、ベータチロシナーゼ、トリプトファナーゼ、ラセマーゼ、トリプトファナーゼアミノアシラーゼアスパルターゼ、インベルターゼ、ヘルペリジナーゼ、メリビアーゼ、プロトペクチナーゼ、ポリガラクチュロナーゼ、ペクチンエステラーゼ、ナリギナーゼ、ケラチナーゼ、カテコール１,２オキシゲナーゼ、ウレアーゼ、ガラクトアセチルトランスフェラーゼ、ビフェニルエーテル構造開裂酵素、ＰＣＢ分解酵素、トリハロース合成酵素、セルラーゼ、キチナーゼ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、フィターゼ、ラッカーゼ、ポリ乳酸分解酵素、亜硝酸還元酵素、アンモニア酸化酵素、及びグルコースイソメラーゼ等を例示することができる。中でも好ましくは、特に熱安定性の低い酵素である。熱安定性の低い酵素として、例えば好冷微生物に由来する酵素など、一般に好冷酵素と称されるものを挙げることができる。また、熱安定性の低いタンパク質として、酵素以外にも130 Kd 等の殺虫タンパク質（δ-endotoxin）、コレスチン等の抗生物質、および氷結タンパク質などのタンパク質が知られている。
熱安定性の低い酵素、例えば低温域で最適活性があり、４０℃以上では熱安定性の低いα−アミラーゼによると、低温条件下で、糊化した澱粉、α化澱粉又はこれらを含む溶液を液化することができ、一方、必要に応じて４０℃以上という比較的低い温度で処理することで反応を停止することができる。すなわち、熱安定性の低い酵素は、穏和な温度条件で反応（酵素活性）が制御できるため、熱安定性の高い酵素に比して、熱エネルギーを削減することができ、また反応系に熱耐性が低い物質が共存している場合でも、当該共存物質の熱変性を回避することができる。さらに、本酵素は、比較的穏和な高温条件で完全に酵素を死活させることが可能であるため、本酵素による環境汚染を比較的容易に防止することができる。
なお、熱安定性の低いα−アミラーゼの用途としては、下記のものを挙げることができる：澱粉工業における酵素変性デキストリンの製造、接着剤やインク製造分野における澱粉糊の粘度調整、食品工業におけるインスタント食品の加工や調味料の加工、α化食品の味付けや風味調整、飲料水製造、繊維加工工業における糊抜き剤や奈染糊除去、家庭品製造分野における浴用剤、家庭洗剤や食器用洗剤、消臭剤、醸造分野における穀類の抽出や醸造残渣物の分解、洗浄剤製品工業における澱粉系しみ抜き、厨房、工場等の洗浄剤、紙パルプ工業におけるサイジング剤の調整、製紙改質、脱墨、飼料製造分野や医薬品食品、化粧品分野における錠剤、顆粒のコーテング加工フィルム製造、農産加工分野農における産物からの有用物の抽出やきのこの菌床製造、土壌改良剤、デキストリン皮膜の製造、忌避剤や農薬安定剤、土壌改良剤、並びに酵素農薬における使用。
（３）環境浄化方法
本発明はまたバイオレメディエーションによる環境浄化方法を提供する。本発明の環境浄化方法は、バイオレメディエーションに使用する微生物として、上記本発明の形質転換体（組み換え好冷微生物）を用いることを特徴とする。かかる形質転換体としては、環境の汚染要因となる油脂、タンパク質、炭水化物、または各種の有毒物質を分解する機能を備えた酵素を発現産生するように形質転換されてなる組み換え好冷微生物を好適に使用することができる。
本発明はまたバイオレメディエーションによる環境浄化方法を提供する。本発明の環境浄化方法は、バイオレメディエーションに使用する微生物として、上記本発明の形質転換体（組み換え好冷微生物）を用いることを特徴とする。かかる形質転換体としては、環境の汚染要因となる油脂、タンパク質、炭水化物、または各種の有毒物質を分解する機能を備えた酵素を発現産生するように形質転換されてなる組み換え好冷微生物を好適に使用することができる。
一般に、浄化の対象となるものとして、具体的には、産業廃棄物、農水産廃棄物、家庭廃棄物、工場排水、家庭廃水、汚染土壌、汚染河川などを挙げることができる。また汚染原因物質としては、油脂、タンパク質、及び炭水化物の他、有機水銀、亜硝酸、エチレンオキサイド、ダイオキシン類、ポリ塩化ビフェニル、シマジン、マラチオン、4−オクチルフェノール、ビスフェノールＡ、フタル酸ジ（2−エチルヘキシル、フタル酸ブチルベンジン、フタル酸ジシクロヘキシル、フタル酸ジエチル、フタル酸ジヘプチル、フタル酸ジイソノニル、アジピン酸ジ（2−エチルヘキシ）、ベンゾ（a）ピレン、DDT、ベンゾフェノン、4−ニトロトルエン、マンネブ、シペルメトリン、スチレンモノマー、アクリル
アミド、アクリル酸エチル、アクリルニトリル、アセトアルデヒト、エピクロロヒドリン、酸化プロピレン、1,4−ジオキサン、1,2−ジクロロエタン、クロロメタン、トリフルラリン、パラコート、フェニレンジアミン類、プロポキスル、ベンゾエピン、イソプレン、クロルピクリン、テトラヒドロフラン、クロルメチルベンゼン、1,3ジクロロプロペン、p−ジクロロベンゼン、ジクロロメタン、N−N′ジメチルホルムアルデヒド、テトラクロロエチレン、トリクロロエチレン、ヒドラジン、1,3ブタジエン、ジクロルボス、酢酸ビニールモノマー、 ジニトロトルエン、o−ニトロアニソール、p−クレシジン、o−トルイジン、アニリン、ニトロベンゼン、グリオキサール、ヘキサメチレンジアミン、ダイアジノン、フェニトロチオン、セレンとその化合物、フェンチオン、ホルムアルデヒト、臭化メチル、アルキル水銀、 EPN、キシレン類、トルエン、ピリダフェンチオン、ノニルフェノール、メチルアミン類、メチルメルカプタン、1,1,
1-トリクロロエタン、０−クレゾール、アセトン、酢酸エチル、エチルベンゼン、シクロヘキサン、リン酸トリブチル、メチルイソブチルケトン、カプロラクタム、ポリカーボネートなどの有毒物質を例示することができる。
アミド、アクリル酸エチル、アクリルニトリル、アセトアルデヒト、エピクロロヒドリン、酸化プロピレン、1,4−ジオキサン、1,2−ジクロロエタン、クロロメタン、トリフルラリン、パラコート、フェニレンジアミン類、プロポキスル、ベンゾエピン、イソプレン、クロルピクリン、テトラヒドロフラン、クロルメチルベンゼン、1,3ジクロロプロペン、p−ジクロロベンゼン、ジクロロメタン、N−N′ジメチルホルムアルデヒド、テトラクロロエチレン、トリクロロエチレン、ヒドラジン、1,3ブタジエン、ジクロルボス、酢酸ビニールモノマー、 ジニトロトルエン、o−ニトロアニソール、p−クレシジン、o−トルイジン、アニリン、ニトロベンゼン、グリオキサール、ヘキサメチレンジアミン、ダイアジノン、フェニトロチオン、セレンとその化合物、フェンチオン、ホルムアルデヒト、臭化メチル、アルキル水銀、 EPN、キシレン類、トルエン、ピリダフェンチオン、ノニルフェノール、メチルアミン類、メチルメルカプタン、1,1,
1-トリクロロエタン、０−クレゾール、アセトン、酢酸エチル、エチルベンゼン、シクロヘキサン、リン酸トリブチル、メチルイソブチルケトン、カプロラクタム、ポリカーボネートなどの有毒物質を例示することができる。
ゆえに、形質転換体（組み換え微生物）として、かかる汚染原因物質を分解して無毒化しえる酵素を発現産生するように形質転換されてなるものを用いることが好ましい。
かかる酵素としては、具体的には、リパーゼ、セルラーゼ、プロテアーゼ、フィターゼ、ラッカーゼ、カタラーゼ、ペルオキシダーゼ、亜硝酸還元酵素、ＰＣＢ分解酵素、ビフェニルエーテル構造開裂酵素、ＰＥＧ分解酵素、α-アミラーゼ、セルビアーゼ、β１,４マンナナーゼ、セリンプロテアーゼ、β-ガラクトシダーゼ、トランスグルタミナーゼ、エステラーゼ、エンドグルカナーゼ、エキソベータ１,３グルカナーゼ、プロトペクチナーゼ、ポリガラクチュロナーゼ、ペクチンエステラーゼ、ナリギナーゼ、ケラチナーゼ、カテコール１,２オキシゲナーゼ、ウレアーゼ、ビフェニルエーテル構造開裂酵素、トリハロース合成酵素、キチナーゼ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、ポリ乳酸分解酵素、アンモニア酸化酵素を例示することができるが、特にこれに制限されるものではない。好ましくはリパーゼ、セルラーゼ、プロテアーゼ、フィターゼ、ラッカーゼ、カタラーゼ、ペルオキシダーゼ、亜硝酸還元酵素、ＰＣＢ分解酵素である。
本発明の環境浄化方法は、上記形質転換体（組み換え好冷微生物）を浄化の対象とする汚染対象物（産業廃棄物、農水産廃棄物、家庭廃棄物、工場排水、家庭廃水））や汚染環境（汚染土壌、汚染河川、汚染海）などに播種することによって実施することができる。形質転換体が特に好気性微生物である場合は、播種後、浄化対象物を随時攪拌することによって通気してもよい。本発明の環境浄化方法は、バイオレメディエーションに用いる微生物として低温条件下で上記汚染物質分解酵素を産生し得るように構成してなる好冷微生物を使用したものであり、ゆえに低温条件下でも効果的に汚染物質の分解浄化を行うことができるという効果を有する。
（４）ベクター
本発明はさらに、目的のタンパク質をコードする遺伝子を組み込むために使用されるベクターを提供する。当該ベクターは、前述する発現ベクターにおいて、その構成成分のうち(5)構造タンパク質をコードする塩基配列をもつＤＮＡを、有さないものである。
本発明はさらに、目的のタンパク質をコードする遺伝子を組み込むために使用されるベクターを提供する。当該ベクターは、前述する発現ベクターにおいて、その構成成分のうち(5)構造タンパク質をコードする塩基配列をもつＤＮＡを、有さないものである。
具体的には、(1)プロモーター機能領域として好冷微生物の細胞内で機能するプロモーター、(9)宿主内で自己複製可能な自律性複製配列（レプリコン）として少なくとも好冷微生物の細胞内で機能する自律性複製配列（レプリコン）を、機能可能なように連結して有するものを挙げることができる。なお、レプリコンとして、前述するように好冷微生物の細胞内で機能するもの以外のレプリコンを別途含むこともできる。さらに好適には、選択マーカーをコードする遺伝子を含む。さらに本発明のベクターは、他の成分として必要に応じて、(2)リポソーム結合部位、(3)翻訳開始コドン、(4)シグナルペプチドをコードする塩基配列をもつＤＮＡ、(6)翻訳終始コドン、(7)ターミネーター、(10)相同領域等、を１または２以上組み合わせて含むことができる。なおこれらの構成成分（ＤＮＡ配列）は、目的とするタンパク質をコードする遺伝子を挿入することによって調製される発現ベクターを、宿主に導入した場合に、目的とするタンパク質をコードする遺伝子が宿主内で発現及び産生可能に機能するように互いに連結されなることが好ましい。
当該ベクターは、目的とするタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列を挿入して目的の発現ベクターを調製するための、いわゆるベヒクルとして使用することができる。目的とするタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列は、遺伝子工学的手法によって、当該ベクター内の(1)プロモーター機能領域（好冷微生物内で機能するプロモーター）の下流域に発現可能な状態に挿入される。
本発明のタンパク質の製造方法によれば、熱に対して不安定なタンパク質を低温条件下で効果的に製造することができる。また、本発明の発現ベクター及び形質転換体は、かかる本発明のタンパク質の製造方法に好適に利用することができる。さらに本発明の環境浄化方法によれば、冬季や低温地域における汚染土壌や汚染廃水の浄化に有効に利用することができる。
以下、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
なお、下記の実施例では、好冷微生物の一具体例として、Acinetobacter属に由来する微生物（Acinetobacter sp. Strain No.6：以下、単に「Acinetobacter No.6」と記載する）を使用した。当該微生物は、シベリア永久凍土から分離された公知の好気性グラム陰性菌であり、０.８〜１.０×１.０〜２.０μmを有する球状桿菌である（Journal of Bioscience and Bioengineering, Vol.92, No.2, p.144-148, 2001；Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 16 (2002) 255-263; Biosci. Biotechnol. Biochem.,66(8),1682-1690, 2002; Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 23 (2003) 357-365）。当該微生物は、表１に示すように、常温菌（下記の表では、Acinetobacter sp. ATCC9957）が生育できない４℃でも良好に生育する反面、３７℃では生育せず、好冷微生物としての特性を備えている。なお、当該「Acinetobacter No.6」は、京都大学化学研究所生体分子機構研究部門II、江崎研究室において分譲可能な状態で保存されている。また、当該「Acinetobacter No.6」は、平成１６年２月４日付けで、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６に住所を有する独立行政法人産業技術総合研究所、特許生物寄託センターに、寄託者が付した識別のための表示を「Acinetobacter sp. Strain No.6」とし、受託番号を「ＦＥＲＭ Ｐ−１９６６２」として寄託されている（通知番号：15産生寄第1851号）。
（１）Acinetobacter No.6の薬剤耐性
アンピシリン、テトラサイクリン、カナマイシン及びクロラムフェニコールを薬剤として用いて、これらをそれぞれＬＢ液体培地に配合して、各薬剤を各種の希釈系列を有する液体培地を調整した。調整した各培地に、Acinetobacter No.6を植菌して、18℃で48時間培養し、Acinetobacter No.6の薬剤耐性を調べた。その結果、Acinetobacter No.6は、アンピシリン、テトラサイクリン、及びカナマイシンの各薬剤に対しては５μg/ml濃度で、またクロラムフェニコールに対しては１７μg/ml濃度で、生育が阻止された。
このことから、Acinetobacter No.6は、アンピシリン、テトラサイクリン、カナマイシン及びクロラムフェニコールに対して非抵抗性であり、宿主として有効に利用できること、またAcinetobacter No.6を宿主として利用した場合は、これらの薬剤に対する耐性遺伝子がプラスミドの選択マーカーとして利用できることが確認できた。
（２）好冷微生物（Acinetobacter No.6）と大腸菌内で複製するシャトルベクターの構築（図１）
Acinetobacter calcoaceticus （常温微生物）から単離されたプラスミド pWH1277 のレプリコン（2.2 AccI/HincII fragment)を含むプラスミド pWH1266（ATCC より入手可能、ATCC No.77092）をテンプレートとし、以下のプライマーセットを用いてＰＣＲを行い、上記レプリコン配列を含むＤＮＡ断片を増幅した。
(a) プラスミドpBR322に挿入するＤＮＡ断片の増幅に使用したプライマーセット5'-TACAGCTGGATCGTAGAAATATCTAA-3'（下線部はPvuIIサイト）（配列番号８）
5'-GGCAGCTGGGATTTTAACATTTTGCG-3'（下線部はPvuIIサイト）（配列番号９）
(b) プラスミドpUC118に挿入するＤＮＡ断片の増幅に使用したプライマーセット：5'-TACGAATTCGATCGTAGAAAT-3' （下線部はEcoRIサイト）（配列番号１０）
5'-AAAGGATCC GGATTTTAACAT-3'（下線部はBamHIサイト）（配列番号１１）
なお、ＰＣＲには、ポリメラーゼとしてKOD plus DNA polymerase (東洋紡)を用い、下記の条件を採用した：
変性94℃、30秒；アニーリング55℃、30秒；伸長68℃、1.5分；30サイクル。
Acinetobacter calcoaceticus （常温微生物）から単離されたプラスミド pWH1277 のレプリコン（2.2 AccI/HincII fragment)を含むプラスミド pWH1266（ATCC より入手可能、ATCC No.77092）をテンプレートとし、以下のプライマーセットを用いてＰＣＲを行い、上記レプリコン配列を含むＤＮＡ断片を増幅した。
(a) プラスミドpBR322に挿入するＤＮＡ断片の増幅に使用したプライマーセット5'-TACAGCTGGATCGTAGAAATATCTAA-3'（下線部はPvuIIサイト）（配列番号８）
5'-GGCAGCTGGGATTTTAACATTTTGCG-3'（下線部はPvuIIサイト）（配列番号９）
(b) プラスミドpUC118に挿入するＤＮＡ断片の増幅に使用したプライマーセット：5'-TACGAATTCGATCGTAGAAAT-3' （下線部はEcoRIサイト）（配列番号１０）
5'-AAAGGATCC GGATTTTAACAT-3'（下線部はBamHIサイト）（配列番号１１）
なお、ＰＣＲには、ポリメラーゼとしてKOD plus DNA polymerase (東洋紡)を用い、下記の条件を採用した：
変性94℃、30秒；アニーリング55℃、30秒；伸長68℃、1.5分；30サイクル。
斯くして増幅したＤＮＡ断片（それぞれ約1.3 kbp）を、(a)の場合はPvuIIで、(b)の場合はEcoRIとBamHIで消化した。これらをそれぞれアガロースゲル電気泳動に供し、ＤＮＡ断片を抽出した。次いで、(a)について得られたＤＮＡ断片を、プラスミドpBR322のPvuIIサイトに挿入し、他方、(b)について得られたＤＮＡ断片は、プラスミドpUC118のEcoRI/BamHIサイトに挿入し、Acinetobacter 属細菌で機能し得るレプリコンと大腸菌で機能するレプリコンとを併せ持つ２種類のプラスミド（シャトルベクター）を構築し、前者をpBAE1（5.8kb）、後者をpUAE1（4.6kb）と命名した。
（３）コンピテント細胞の調製と形質転換
(3-1)エレクトロポレーション法
BioRad Gene Pulser II（BioRad社製）を用いて、下記のようにエレクトロポレーション法を行った（なお、キュベットは0.2cmのものを使用した）。
(3-1)エレクトロポレーション法
BioRad Gene Pulser II（BioRad社製）を用いて、下記のようにエレクトロポレーション法を行った（なお、キュベットは0.2cmのものを使用した）。
Acinetobacter No.6を、5 mlのＬＢ培地（1% DifcoTryptone、1% NaCl、0.5% Difco Yeast Extract, pH7.0）中、18℃で振盪培養(170 rpm)した。log後期（A660 = 1）まで菌体を培養した後、1.5 mlの培養液を採り、1900 g x 6分の条件で遠心分離を行って集菌した。これを、氷冷した10％グリセロール水溶液200μlで３回洗菌した後、氷冷した10％グリセロール水溶液100μlに懸濁して、これをコンピテント細胞懸濁液とした。なお、当該コンピテント細胞懸濁液は、調製してから２時間以内に使用した。
50μl のコンピテント細胞懸濁液に プラスミドＤＮＡとして上記（２）で調製したシャトルベクター（pUAE1）（0.5μg)を加え、表２に記載する各種の条件でエレクトロポレーションを行った。エレクトロポレーション後直ちに、得られた細胞懸濁液を、0.5 mlの氷冷したＬＢ培地に添加懸濁し、18℃で6時間振盪した。その後、100μg/mlのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地にプレーティングし、18℃で48時間培養して、生じたコロニーの数をカウントした。
(3-2)ポリエチレングリコール法（ＴＳＳ法）
Acinetobacter No.6 を、ＳＯＣ培地〔1% DifcoTryptone、10 mM NaCl、2.5 mM KCl、及び0.5% Difco Yeast Extractを含有する液体培地（pH7.0）をオートクレーブした後、20 mM グルコース及び10μM MgCl2を配合して調製〕（5 ml）中、18℃で振盪培養(170 rpm)した。Log中期（A660 = 0.6）まで菌体を培養した後、2.0 mlの培養液を採り、1900 g x 6分の条件で遠心分離して集菌した。これを、氷冷した1x TSS溶液（10% PEG6000、5% DMSO、50 mM MgCl2 を含むＬＢ培地）200 μl に懸濁し、これをコンピテント細胞懸濁液とした。
Acinetobacter No.6 を、ＳＯＣ培地〔1% DifcoTryptone、10 mM NaCl、2.5 mM KCl、及び0.5% Difco Yeast Extractを含有する液体培地（pH7.0）をオートクレーブした後、20 mM グルコース及び10μM MgCl2を配合して調製〕（5 ml）中、18℃で振盪培養(170 rpm)した。Log中期（A660 = 0.6）まで菌体を培養した後、2.0 mlの培養液を採り、1900 g x 6分の条件で遠心分離して集菌した。これを、氷冷した1x TSS溶液（10% PEG6000、5% DMSO、50 mM MgCl2 を含むＬＢ培地）200 μl に懸濁し、これをコンピテント細胞懸濁液とした。
調製直後のコンピテント細胞懸濁液100μlに、ＤＮＡとして上記（２）で調製したベクター（pUAE1）（0.5μg)（10μl 以下）を加え、氷上で30分静置した。その後、37℃で90秒間、熱処理を行い、その後、500μl のＳＯＣ培地に懸濁して、18℃で6時間、振盪培養した。その後、100 μg/ml のアンピシリンを含むＬＢ寒天培地にプレーティングし、18℃で48時間培養して、生じたコロニーの数をカウントした。
結果を表２に示す。
実施例２ プロモーターの調製
（１）プロモーター探索用ベクターの構築（図２）
プラスミドpBR322（4.4kb）をSspIとSalIで切断し、β-ラクタマーゼ遺伝子（アンピシリン耐性遺伝子：Ampr）上流のプロモーター配列と、テトラサイクリン耐性遺伝子（Tetr）を除去した。
一方、広宿主域コスミドpJRD215のカナマイシン耐性遺伝子（Kmr）を含む1.13 kbp の領域を下記のプライマーを使用して、ＰＣＲで増幅した。
・5'-CCCAAAGCTTG-GATCCCGGGTATGGACAGCAAGCGAACCGGAA-3'（カナマイシン耐性遺伝子の5'末端に相補的な部分と、HindIII、BamHI、SmaIサイト（下線部）を含む。）(配列番号１２)
・5'-CGGAATTCGTCGACTGGGCGAAGAACTCCAGCATGAGA-3' （カナマイシン耐性遺伝子の3'末端に相補的な部分と、EcoRI、SalIサイト（下線部）を含む。）(配列番号１３)
なお、ポリメラーゼとしてKOD plus DNA polymeraseを使用した。得られた増幅産物をSalIで切断し（なお、HindIII/BamHI/SmaI のサイトのある側は、SalI では切断されないので、平滑末端のままである）、SspI（平滑末端）と SalIで切断した上記の pBR322 に連結した。斯くして調製したベクターをpBAPT（4.7kb）と命名した。
・5'-CCCAAAGCTTG-GATCCCGGGTATGGACAGCAAGCGAACCGGAA-3'（カナマイシン耐性遺伝子の5'末端に相補的な部分と、HindIII、BamHI、SmaIサイト（下線部）を含む。）(配列番号１２)
・5'-CGGAATTCGTCGACTGGGCGAAGAACTCCAGCATGAGA-3' （カナマイシン耐性遺伝子の3'末端に相補的な部分と、EcoRI、SalIサイト（下線部）を含む。）(配列番号１３)
なお、ポリメラーゼとしてKOD plus DNA polymeraseを使用した。得られた増幅産物をSalIで切断し（なお、HindIII/BamHI/SmaI のサイトのある側は、SalI では切断されないので、平滑末端のままである）、SspI（平滑末端）と SalIで切断した上記の pBR322 に連結した。斯くして調製したベクターをpBAPT（4.7kb）と命名した。
一方、pWH1266を鋳型とし、AccIIIサイト（下線部）を含むように設計したプライマー（5'-CACACACATCCGGAGATCGTAGAAATATCTATGATT-3' [配列番号１４]、5'-CACACACATCCGGAGGATTTTAACATTTTGCGTTGT-3' [配列番号１５]、）を用いて、ＰＣＲにより、そのレプリコン部分（2.2 AccI/HincII fragment）を増幅した。次いで得られた増幅産物を、AccIIIで消化し、これを、上記で得られたベクターpBAPTのAccIII サイトに導入した。斯くして調製したベクターをpBAP1（6.0kb）と命名した。
以上の操作により調製したプロモーター探索用ベクターpBAP1（プロモーターを欠損し、Acinetobacter 属細菌で機能するレプリコン（Acinetobacter ori）とβ-ラクタマーゼ遺伝子を持つベクター）を用いて、宿主として用いる好冷微生物（ここでは、Acinetobacter No.6を使用）に好適に使用できるプロモーターを探索した。
（２）プロモーターの探索
プロモーターの探索は、次のようにして行った。まず上記ベクターpBAP1（6.0kb）のβ-ラクタマーゼ遺伝子（Ampr）の上流に、Acinetobacter No.6 のゲノムＤＮＡから調製した各種のＤＮＡ断片を挿入し（下記参照）、次いでこれらを用いてAcinetobacter No.6を形質転換する。得られた形質転換体を培養し、β-ラクタマーゼ遺伝子の発現の有無（すなわち、アンピシリン耐性獲得の有無）から、プロモーター活性を持つ断片の挿入の有無を評価し、アンピシリン耐性を獲得した宿主に導入したＤＮＡ断片を特定する。
プロモーターの探索は、次のようにして行った。まず上記ベクターpBAP1（6.0kb）のβ-ラクタマーゼ遺伝子（Ampr）の上流に、Acinetobacter No.6 のゲノムＤＮＡから調製した各種のＤＮＡ断片を挿入し（下記参照）、次いでこれらを用いてAcinetobacter No.6を形質転換する。得られた形質転換体を培養し、β-ラクタマーゼ遺伝子の発現の有無（すなわち、アンピシリン耐性獲得の有無）から、プロモーター活性を持つ断片の挿入の有無を評価し、アンピシリン耐性を獲得した宿主に導入したＤＮＡ断片を特定する。
なお、ベクターpBAP1のβ-ラクタマーゼ遺伝子（Ampr）の上流に挿入するゲノムＤＮＡ断片の調製、ライブラリーの構築、及びスクリーニングは、下記の方法に従って行った。
［ゲノムDNA断片の調製、ライブラリーの構築、スクリーニング］
Acinetobacter No.6をＬＢ培地で18℃、24時間振盪培養した。次いで、Blood & Cell Culture DNA Kit（QIAGEN社、Germany）を用いてゲノムＤＮＡを単離した。単離したゲノムＤＮＡをSau3AIまたはAluIで部分消化し、これを1.5％アガロースゲル電気泳動で分離した。100-1000 bp のＤＮＡ断片をゲルから抽出し、Sau3AI処理で得られた断片は（１）で調製したプロモーター探索用ベクターpBAP1のBamHIサイトに、またAluI処理で得られた断片はpBAP1のSmaIサイトに挿入した。このようにして得られたプラスミドを E. coli JM109に導入し、40 μg/ml のカナマイシンを含むＬＢプレート上で、37℃で生育させた。
Acinetobacter No.6をＬＢ培地で18℃、24時間振盪培養した。次いで、Blood & Cell Culture DNA Kit（QIAGEN社、Germany）を用いてゲノムＤＮＡを単離した。単離したゲノムＤＮＡをSau3AIまたはAluIで部分消化し、これを1.5％アガロースゲル電気泳動で分離した。100-1000 bp のＤＮＡ断片をゲルから抽出し、Sau3AI処理で得られた断片は（１）で調製したプロモーター探索用ベクターpBAP1のBamHIサイトに、またAluI処理で得られた断片はpBAP1のSmaIサイトに挿入した。このようにして得られたプラスミドを E. coli JM109に導入し、40 μg/ml のカナマイシンを含むＬＢプレート上で、37℃で生育させた。
Sau3AI部分消化断片をもつプラスミドによる形質転換で得られたコロニー（30000コロニー）を全て、10 ml のＬＢ培地に植菌し、37℃で4時間振盪培養した。ここから菌体を遠心分離によって回収し、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN社、Germany）でプラスミドを回収した。得られたプラスミド 0.5μg をAcinetobacter No.6 に、上述条件（条件４）のエレクトロポレーション法によって導入した。これを20 μg/ml のアンピシリンを含むＬＢ寒天培地にプレーティングし、18℃で48時間培養し、アンピシリン耐性を獲得した組換え体を選抜した（260コロニー）。これらを100、200、500、1000、及び2000μg/ml
のアンピシリンを含むＬＢ寒天培地にそれぞれレプリカプレーティングし、高いアンピシリン耐性を持つ菌株を選抜した。2000μg/ml のアンピシリンを含むプレートでは、260株の内、17株が生育した。これらを、500μg/ml のアンピシリンを含むＬＢ培地に植菌し、18℃で培養したところ５株が生育した。
のアンピシリンを含むＬＢ寒天培地にそれぞれレプリカプレーティングし、高いアンピシリン耐性を持つ菌株を選抜した。2000μg/ml のアンピシリンを含むプレートでは、260株の内、17株が生育した。これらを、500μg/ml のアンピシリンを含むＬＢ培地に植菌し、18℃で培養したところ５株が生育した。
これらの株からプラスミドを回収し、E. coli JM109 に導入したところ、アンピシリン耐性を獲得した。このことから、これらのプラスミドに導入されたＤＮＡ断片は、好冷微生物内（Acinetobacter No.6）だけでなく、大腸菌内でもプロモーターとして機能することが示された。
他方、AluI部分消化断片をもつプラスミドについては、直接 Acinetobacter No.6 に導入した。20μg/ml のアンピシリンを含むＬＢ寒天培地では、３つのコロニーが得られた。これらを500、1000、2000μg/ml のアンピシリンを含む各々のＬＢ寒天培地にプレーティングしたところ、2000μg/ml のアンピシリンを含むプレートで生育する株が１株得られた。この株は500μg/ml のアンピシリンを含むＬＢ液体培地中、18℃で生育した。また、この株からプラスミドを回収し、E. coli JM109 に導入したところ、アンピシリン耐性を獲得した。このことから、このプラスミドに導入されたＤＮＡ断片もまた、好冷微生物（Acinetobacter No.6）内だけでなく、大腸菌内でもプロモーターとして機能することが示された。
（３）プロモーターの特定
(3-1) 挿入ＤＮＡ断片の配列決定
（２）で得られたプラスミド（合計６種（Sau3AI断片：5種、AluI断片：１種））に挿入されていた、Acinetobacter No.6 由来のＤＮＡ断片の配列を常法に従って決定した。これら６種類のプラスミドの内、２種類は図３に示すP1（174bp）の配列を有し、３種類は図３に示すP3（445bp）の配列を有し、残りの１種類は図３に示すP6（163bp）の配列を有していた（P6 はAluI断片、P1及びP3はSau3AI断片）。
(3-1) 挿入ＤＮＡ断片の配列決定
（２）で得られたプラスミド（合計６種（Sau3AI断片：5種、AluI断片：１種））に挿入されていた、Acinetobacter No.6 由来のＤＮＡ断片の配列を常法に従って決定した。これら６種類のプラスミドの内、２種類は図３に示すP1（174bp）の配列を有し、３種類は図３に示すP3（445bp）の配列を有し、残りの１種類は図３に示すP6（163bp）の配列を有していた（P6 はAluI断片、P1及びP3はSau3AI断片）。
(3-2) 挿入ＤＮＡ断片の転写開始点の決定
上記で得られたP1、P3及びP6 について、常法に従ってプライマー伸長法により、転写開始点を調べた。その結果を図４に示す。図中、四角で囲った部位が、判明した転写開始部位である。図４に示すように、P1及びP3については、それぞれ２箇所に転写開始部位がみつかった。また、各ＤＮＡ断片について、転写開始部位の上流に-10配列、及び-35配列と考えられる配列が見つかった（ただし、P3の下流側に位置する転写開始部位に関しては、-35配列に相当する配列は見つからなかった。）。これらの-10配列及び-35配列を、図４中、下線により示す。
上記で得られたP1、P3及びP6 について、常法に従ってプライマー伸長法により、転写開始点を調べた。その結果を図４に示す。図中、四角で囲った部位が、判明した転写開始部位である。図４に示すように、P1及びP3については、それぞれ２箇所に転写開始部位がみつかった。また、各ＤＮＡ断片について、転写開始部位の上流に-10配列、及び-35配列と考えられる配列が見つかった（ただし、P3の下流側に位置する転写開始部位に関しては、-35配列に相当する配列は見つからなかった。）。これらの-10配列及び-35配列を、図４中、下線により示す。
(3-3) プロモーター領域の決定
上記で得られた挿入ＤＮＡ断片（P1、P3及びP6）について、deletion試験によってプロモーターとして機能するのに必要は領域を決定した。deletion試験は、表４に示すプライマーを用いて、次の方法によって行った。
上記で得られた挿入ＤＮＡ断片（P1、P3及びP6）について、deletion試験によってプロモーターとして機能するのに必要は領域を決定した。deletion試験は、表４に示すプライマーを用いて、次の方法によって行った。
(1) 挿入ＤＮＡ断片：P1
P1 をもつプラスミド（上記（２）参照）をテンプレートとし、表３に記載するP1-F1またはP1-F2をフォワードプライマー、PRPVUI2をリバースプライマーとしてＰＣＲを行った。得られたＤＮＡ断片を、SmaI と PvuIで切断し、プロモーター探索用ベクターpBAP1のSmaI-PvuIサイトに挿入した。
(2) 挿入ＤＮＡ断片：P3
P3 をもつプラスミド（上記（２）参照）をテンプレートとし、表３に記載するP3-F1またはP3-F2またはP3-F3をフォワードプライマー、PRPVUI2をリバースプライマーとしてＰＣＲを行い、得られたＤＮＡ断片をSmaI と PvuIで切断し、プロモーター探索用ベクターpBAPIのSmaI-PvuIサイトに挿入した。
P3 をもつプラスミド（上記（２）参照）をテンプレートとし、表３に記載するP3-F1またはP3-F2またはP3-F3をフォワードプライマー、PRPVUI2をリバースプライマーとしてＰＣＲを行い、得られたＤＮＡ断片をSmaI と PvuIで切断し、プロモーター探索用ベクターpBAPIのSmaI-PvuIサイトに挿入した。
(3) 挿入ＤＮＡ断片：P6
P6 をもつプラスミド（上記（２）参照）をテンプレートとし、表３に記載するP6-F1またはP6-F2をフォワードプライマー、PRPVUI2をリバースプライマーとしてＰＣＲを行い、得られたＤＮＡ断片をSmaI と PvuIで切断し、プロモーター探索用ベクターpBAPIのSmaI-PvuIサイトに挿入した。
P6 をもつプラスミド（上記（２）参照）をテンプレートとし、表３に記載するP6-F1またはP6-F2をフォワードプライマー、PRPVUI2をリバースプライマーとしてＰＣＲを行い、得られたＤＮＡ断片をSmaI と PvuIで切断し、プロモーター探索用ベクターpBAPIのSmaI-PvuIサイトに挿入した。
(4) 上記で得られた各プラスミドをAcinetobacter No.6 に導入し、18℃で定常期まで培養し、培養液中のβ-ラクタマーゼ（菌体外に分泌されたβ-ラクタマーゼ）の比活性を測定した。なお、β-ラクタマーゼの活性測定は、100μMの nitrocefin（OXOID 社）を基質とし、50 mM リン酸カリウム緩衝液 (pH7.0)中で行った。具体的には、各プラスミドを導入したAcinetobacter No.6 の培養液及びnitrocefinを含む50 mM リン酸カリウム緩衝液 (pH7.0)を、25℃でインキュベーションし、482 nm の吸光度（生成物のモル吸光係数は 15,000 M-1cm-1）の増加をモニターすることで活性を測定した。
結果を図５に示す。なお、図５には、各ＤＮＡ断片を挿入することによって得られるβ-ラクタマーゼ活性を、挿入ＤＮＡ断片（P1、P3、P6）の全長物を挿入した場合のβ-ラクタマーゼ比活性（100％）に対する相対活性として表示する。
図５に示すように、P1に関しては、5'末端から1-48bp領域を削除することによって、β-ラクタマーゼ活性は低下したものの、30％は維持されていた。但し、5'末端から1-132bp領域を削除すると、β-ラクタマーゼ活性は完全に消失した。P3に関しては、5'末端から1-204bp領域を削除してもβ-ラクタマーゼ活性は100％維持されていた。5'末端から1-336bp領域を削除することによって、β-ラクタマーゼ活性は低下したものの50％は維持されていた。但し、5'末端から1-401bp領域を削除すると、β-ラクタマーゼ活性は完全に消失した。P6に関しては、5'末端から1-65bp領域を削除してもβ-ラクタマーゼ活性は100％維持されていた。但し、5'末端から1-137bp領域を削除すると、β-ラクタマーゼ活性は完全に消失した。
このことから、P1については1-174bp領域、P3については205-445bp領域、及びP6 については66-163bp領域に、プロモーター活性に重要な配列が含まれていることがわかった。
(3-4) プロモーター活性の評価
上記P1、P3及びP6の各々について、リアルタイム RT-PCR 法を用いてmRNA を定量することにより、プロモーター活性（転写活性）を評価した。
上記P1、P3及びP6の各々について、リアルタイム RT-PCR 法を用いてmRNA を定量することにより、プロモーター活性（転写活性）を評価した。
具体的には、P1、P3及びP6のそれぞれを、ベクターpBAP1（6.0kb）のβ-ラクタマーゼ遺伝子（Ampr）の上流に挿入し、これをAcinetobacter No.6に導入した。調製したAcinetobacter No.6を18℃で log後期まで培養し、1.5 ml の培養液から、常法に従ってトータルＲＮＡを単離した（RNeasy Mini Kit (QIAGEN 社)使用）。なお、残存するＤＮＡは、2.5 U RNase-free DNase (QIAGEN 社)と20μl のリボヌクレアーゼインヒビター（TaKaRa社）で室温下、２時間処理することで除去した。その後、95℃、15分の熱処理で、酵素を失活させた。
RT-PCRは、200ngのトータルＲＮＡを使用し、下記配列を有するプライマーを用いて、QuantiTect SYBR Green RT-PCR Kit (QIAGEN 社)により行った。
Lac-RTF (5'-ACTGCGGCCAACT TACTTCTGACA-3') （配列番号２４）
Lac-RTR (5'-CTACGATACGGGAGGGCTTACCAT-3') （配列番号２５）。
Lac-RTF (5'-ACTGCGGCCAACT TACTTCTGACA-3') （配列番号２４）
Lac-RTR (5'-CTACGATACGGGAGGGCTTACCAT-3') （配列番号２５）。
具体的には、25μl SYBR Green PCR master mix、0.5μl RT mixture、プライマーセット（1μMずつ）を含む 50μl の系で、下記の反応条件でＰＣＲを行った。
＜反応条件＞
50℃、30 min；95℃、10 min、その後、「94℃、15秒；54℃、30 秒；72℃、30秒」の反応を35サイクル。
＜反応条件＞
50℃、30 min；95℃、10 min、その後、「94℃、15秒；54℃、30 秒；72℃、30秒」の反応を35サイクル。
反応サイクルに対して、蛍光強度をプロットし、iCycler iQ Optical System Software Ver 3.0A (BioRad 社)で、データ解析を行った。各P1、P3またはP6を挿入したプラスミドから転写されるmRNAの量を図６に示す。なお、比較のため、pBAE1（β-ラクタマーゼ遺伝子本来のプロモーターを有するプラスミド）、pBAP1（プロモーター欠損プラスミド）を用いて同様にして、ｍRNAの量を求めた。なお、図６において、mRNAの量は、pBAE1から転写される mRNA量を１として、これとの相対量として示す。
この結果からわかるように、P1、P3、及びP6のプロモーター活性は、いずれも、pBAE1（β-ラクタマーゼ遺伝子本来のプロモーターをもつ）のプロモーター活性よりも高かった。但し、pBAE1は、プロモーター欠損プラスミドpBAP1に比べると、mRMAの発現量は有意に多かったことから、β-ラクタマーゼ遺伝子本来のプロモーターも、少ないながらもプロモーター機能を発揮することがわかる。
実施例３ タンパク質の生産（β-ラクタマーゼ）
（1）P1、及びP3のそれぞれを、ベクターpBAP1（6.0kb）のβ-ラクタマーゼ遺伝子（Ampr）の上流に挿入し（P1/ pBAP1、P3/ pBAP1）、これをAcinetobacter No.6に導入した。これを、7℃、15℃、20℃、及び25℃の各々の温度で ＬＢ培地を用いてlog後期まで培養し、実施例２に記載する方法に従って、培養上清のβ-ラクタマーゼ活性（分泌β-ラクタマーゼ活性）を測定した。また、pBAE1（β-ラクタマーゼ遺伝子本来のプロモーターを有するプラスミド）、またはpBAP1（プロモーター欠損プラスミド）を導入したAcinetobacter No.6も、同様に各温度でlog後期まで培養し、培養上清のβ-ラクタマーゼ活性を測定し
た。
実施例３ タンパク質の生産（β-ラクタマーゼ）
（1）P1、及びP3のそれぞれを、ベクターpBAP1（6.0kb）のβ-ラクタマーゼ遺伝子（Ampr）の上流に挿入し（P1/ pBAP1、P3/ pBAP1）、これをAcinetobacter No.6に導入した。これを、7℃、15℃、20℃、及び25℃の各々の温度で ＬＢ培地を用いてlog後期まで培養し、実施例２に記載する方法に従って、培養上清のβ-ラクタマーゼ活性（分泌β-ラクタマーゼ活性）を測定した。また、pBAE1（β-ラクタマーゼ遺伝子本来のプロモーターを有するプラスミド）、またはpBAP1（プロモーター欠損プラスミド）を導入したAcinetobacter No.6も、同様に各温度でlog後期まで培養し、培養上清のβ-ラクタマーゼ活性を測定し
た。
結果を図７に示す。なお、β-ラクタマーゼ活性は、比活性（U/mg protein）として示す。図７の結果から、P1またはP3をプロモーターとするプラスミド（P1/ pBAP1、P3/ pBAP1）を導入した組換え体を用いることにより、pBAE1を導入した組換え体を用いるよりも、β-ラクタマーゼが高生産できることがわかる。また、これらの組換え体は、いずれも低温培養でβ-ラクタマーゼの生産量が増大する傾向が見られた。
（2）上記の各プラスミドを導入した組換え体（Acinetobacter No.6） をＬＢ培地中、18℃で定常期まで培養し、得られた培養上清を濃縮して、SDS-PAGE に供した。ゲルをCBB R-250 で染色し、NIH Image software (ver 1.62) を用いて、β-ラクタマーゼのバンド（29kDa）の濃さから、各組換え体についてβ-ラクタマーゼの産生量を定量した。結果を図８に示す。その結果、P1またはP3を保持する組換え体（P1/ pBAP1またはP3/ pBAP1導入した組換え体）を用いた場合、全菌体外タンパク質（100％）のうち、それぞれ34％または56％が、β-ラクタマーゼであることが判明した。
以上のことから、P1、P3及びP6、好ましくはP1及びP3、並びにこれらの塩基配列中に含まれるプロモーター機能領域は、低温で外来タンパク質を高生産するシステムにおいて、プロモーターとして有用であると考えられる。また、かかるプロモーターを含む系は、低温で外来タンパク質を高生産することのできる発現システムとして有用であると考えられる。また、電気泳動の結果から、本菌を用いた分泌生産系では、高生産させたタンパク質を容易に精製できると考えられる。
実施例４ α-アミラーゼ発現系の構築、及びα-アミラーゼの生産（図９及び図１０）
（１）Vibrio 属細菌のα-アミラーゼの配列に基づいてデジェネレートプライマーを設計し、これを用いたPCRによって、南極海水から分離した好冷微生物 Shewanella sp. Ac10 のα-アミラーゼ遺伝子の一部を増幅し、塩基配列を決定した。さらに、決定した塩基配列に基づいてプライマーを設計し、インバース PCR法によって、全長遺伝子を単離し、塩基配列を決定した。図９に示すように、α-アミラーゼ遺伝子を PCRで増幅した後、両端に HindIIIとPvuIサイトを導入した。次いで、これをプラスミドpP3（pBAP1/P3）のP3プロモーターの下流（HindIII-PvuI サイト）に挿入し、プラスミドpP3-amyを作成した。これをAcinetobacter No.6に導入し、１％デンプンを含む寒天培地で15℃、48時間インキュベートした。その後、寒天培地をヨウ素で処理し、ヨウ素デンプン反応による紫色の着色の有無を観察した。なお、ネガティブコントロールとして、α-アミラーゼ遺伝子を挿入しないプラスミドpP3（pBAP1/P3）についても同様に試験を行った。結果を図９に合わせて示す。図９に示すように、P3プロモーターの下流にα-アミラーゼ遺伝子を持つプラスミドpP3-amyを導入した組換え体では、菌体の周りの寒天培地が紫色に着色したことから、デンプンが分解されており、α-アミラーゼが生産されたことがわかる。
（１）Vibrio 属細菌のα-アミラーゼの配列に基づいてデジェネレートプライマーを設計し、これを用いたPCRによって、南極海水から分離した好冷微生物 Shewanella sp. Ac10 のα-アミラーゼ遺伝子の一部を増幅し、塩基配列を決定した。さらに、決定した塩基配列に基づいてプライマーを設計し、インバース PCR法によって、全長遺伝子を単離し、塩基配列を決定した。図９に示すように、α-アミラーゼ遺伝子を PCRで増幅した後、両端に HindIIIとPvuIサイトを導入した。次いで、これをプラスミドpP3（pBAP1/P3）のP3プロモーターの下流（HindIII-PvuI サイト）に挿入し、プラスミドpP3-amyを作成した。これをAcinetobacter No.6に導入し、１％デンプンを含む寒天培地で15℃、48時間インキュベートした。その後、寒天培地をヨウ素で処理し、ヨウ素デンプン反応による紫色の着色の有無を観察した。なお、ネガティブコントロールとして、α-アミラーゼ遺伝子を挿入しないプラスミドpP3（pBAP1/P3）についても同様に試験を行った。結果を図９に合わせて示す。図９に示すように、P3プロモーターの下流にα-アミラーゼ遺伝子を持つプラスミドpP3-amyを導入した組換え体では、菌体の周りの寒天培地が紫色に着色したことから、デンプンが分解されており、α-アミラーゼが生産されたことがわかる。
（２）プラスミドpP3-amyをAcinetobacter No.6に導入して、7℃と15℃の２条件下で培養し、培養上清のα-アミラーゼ活性を、Megazyme 社のAmylase HR Reagent を用いて測定した。また、E. coli BL21(DE3) pLysS を宿主とした系では、プラスミドpCR T7/CT-TOPO （invitrogen 社）のT7プロモーターの下流にα-アミラーゼ遺伝子を挿入して調製したプラスミド(pCR-amy)を、E. coliに導入して調製したものを、37℃で培養して、培養上清のα-アミラーゼ活性を、上記のようにして測定した。
なお、ネガティブコントロールとして、α-アミラーゼ遺伝子を挿入しない各プラスミドpP3（P3/pBAP1）及びpCR T7/CT-TOPOについても同様に試験を行った。結果を図１０に示す。図中、ネガティブコントロールを「−」、α-アミラーゼ遺伝子を導入した系（プラスミドpP3-amyを導入した系、プラスミドpCR-amyを導入した系）を「amy」として標記する。
結果を図１０に示す。これからわかるように、大腸菌を宿主としたときには好冷微生物由来のα-アミラーゼはほとんど生産されないが、Acinetobacter No.6 を宿主とした場合には好冷微生物由来のα-アミラーゼが有意に生産されることが確認された。またこのα-アミラーゼの生産量は、低温での培養によって増加する傾向が見られた。
（2）上記プラスミドpP3-amyを導入した組換え体（Acinetobacter No.6）をＬＢ培地中、18℃で定常期まで培養し、得られた培養上清を濃縮して、SDS-PAGE に供した。ゲルをCBB R-250 で染色し、NIH Image software (ver 1.62) を用いて、α-アミラーゼのバンド（67kDa）の濃さから、当該組換え体についてα-アミラーゼの産生量を定量した（図１１参照）。その結果、全菌体外タンパク質（100％）のうち、α-アミラーゼの占める割合は35％であり、α-アミラーゼの高生産が確認された。
次いで、プラスミドpP3-amyを導入した組換え体（Acinetobacter No.6）をＬＢ培地中、13℃で定常期まで培養し、得られた培養上清中のα-アミラーゼの熱安定性を調べた。培養上清を20℃、30℃、40℃、50℃の各温度で、0〜60分間インキュベーションし、Megazyme 社のAmylase HR Reagentを使用して残存活性を測定した。結果を図１２に示す。30℃、20分間のインキュベーションでα-アミラーゼの活性は半減し、本酵素の熱安定性がきわめて低いことが明らかとなった。
以上に示すように、大腸菌を宿主とした系では殆ど生産されなかった好冷微生物 Shewanella sp. Ac10の熱安定性の低いα-アミラーゼを、好冷微生物を宿主とする本発明の発現・生産系で、全細胞外タンパク質の３５％を占めるほどに大量に生産することに成功した。これらのことから、本発明の発現・生産系を利用すれば、好冷微生物に由来する低温活性酵素などの好冷酵素を大量にかつ簡便に生産することが可能になると考えられる。すなわち、以上の実施例から、本発明のタンパク質の発現・生産系は好冷微生物由来の酵素などといった好冷酵素の発現・生産系として有用であることが示された。
本発明のタンパク質の製造方法によれば、熱に対して不安定なタンパク質を低温条件下で効果的に製造することができる。また、本発明の発現ベクター及び形質転換体は、かかる本発明のタンパク質の製造方法に好適に利用することができる。すなわち、本発明のタンパク質の発現・生産系を利用すれば、好冷微生物に由来する低温活性酵素などの好冷酵素を、大量にかつ簡便に生産することが可能になると考えられる。さらに本発明の環境浄化方法によれば、冬季や低温地域における汚染土壌や汚染廃水の浄化に有効に利用することができ、環境浄化に貢献することができる。
Claims (23)
- 目的のタンパク質をコードするＤＮＡを好冷微生物の細胞内で発現可能な状態で含む発現ベクターを、好冷微生物の細胞内に導入して、当該好冷微生物またはその細胞を培養し、該培養物から上記タンパク質を採取することを特徴とするタンパク質の製造方法。
- タンパク質が熱安定性の低いものであることを特徴とする請求項１に記載するタンパク質の製造方法。
- 培養を低温条件下で行うことを特徴とする請求項１または２に記載するタンパク質の製造方法。
- 発現ベクターが、目的のタンパク質をコードするＤＮＡ、好冷微生物の細胞内で機能するプロモーター、及び好冷微生物の細胞内で機能するレプリコンを機能可能に連結して含むものである、請求項１乃至３のいずれかに記載するタンパク質の製造方法。
- 上記発現ベクターが、レプリコンとして、さらに好冷微生物の細胞内で機能するレプリコン以外のレプリコンを、機能可能に連結して含むものである、請求項４に記載するタンパク質の製造方法。
- 発現ベクターが、好冷微生物の細胞内で機能するレプリコンと大腸菌由来のレプリコンを有する、好冷微生物と大腸菌とのシャトルベクターである請求項５に記載するタンパク質の製造方法。
- 好冷微生物がAcinetobacter属に属する微生物である、請求項１乃至６のいずれかに記載するタンパク質の製造方法。
- プロモーターが、下記(Ａ）または（Ｂ）に記載する塩基配列からなるものである請求項１乃至７のいずれかに記載するタンパク質の製造方法：
（Ａ）配列番号１、２または３のいずれかに記載する塩基配列、
（Ｂ）配列番号１、２または３のいずれかに記載する塩基配列において、１または複数の塩基が欠失、置換または付加されてなる塩基配列であって、プロモーター活性（転写活性）を有する塩基配列。 - （Ｂ）に記載する塩基配列が、配列番号１、２または３のいずれかに記載する塩基配列と相補的な塩基配列に対して、ストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列であって、プロモーター活性（転写活性）を有する塩基配列である、請求項８に記載するタンパク質の製造方法。
- （Ｂ）に記載する塩基配列が、下記(a)〜(d)のいずれかである請求項８または９に記載するタンパク質の製造方法：
(a) 配列番号４に記載する塩基配列、
(b) 配列番号５に記載する塩基配列、
(c) 配列番号６に記載する塩基配列、
(d) 配列番号７に記載する塩基配列。 - 請求項１乃至１０のいずれかに記載する製造方法によって得られるタンパク質。
- 好冷微生物の細胞内で機能するプロモーター、及び好冷微生物の細胞内で機能するレプリコンを機能可能に連結して含むものであるベクター。
- さらに、リポソーム結合部位、翻訳開始コドン、シグナルペプチドをコードする塩基配列をもつＤＮＡ、翻訳終始コドン、ターミネーター、選択マーカー遺伝子、及び相同領域よりなる群から選択される構成成分（ＤＮＡ成分）を１または２以上、機能可能に連結して含むものである請求項１２に記載のベクター。
- 好冷微生物の細胞内で機能するプロモーターが、下記(Ａ）または（Ｂ）に記載する塩基配列からなるものである請求項１２または１３に記載するベクター：
（Ａ）配列番号１、２または３のいずれかに記載する塩基配列、
（Ｂ）配列番号１、２または３のいずれかに記載する塩基配列において、１または複数の塩基が欠失、置換または付加されてなる塩基配列であって、プロモーター活性（転写活性）を有する塩基配列。 - （Ｂ）に記載する塩基配列が、配列番号１、２または３のいずれかに記載する塩基配列と相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列であって、プロモーター活性（転写活性）を有する塩基配列である、請求項１４に記載するベクター。
- （Ｂ）に記載する塩基配列が、下記(a)〜(d)のいずれかである請求項１４または１５に記載するベクター：
(a) 配列番号４に記載する塩基配列、
(b) 配列番号５に記載する塩基配列、
(c) 配列番号６に記載する塩基配列、
(d) 配列番号７に記載する塩基配列。 - 請求項１２乃至１６のいずれかに記載するベクターに含まれる好冷微生物の細胞内で機能するプロモーターの下流域に、目的のタンパク質をコードするＤＮＡを発現可能な状態で連結して含むことを特徴とする発現ベクター。
- 目的のタンパク質が、熱安定性の低いものである請求項１７に記載する発現ベクター。
- 目的のタンパク質が、酵素である請求項１７または１８に記載する発現ベクター。
- 目的のタンパク質が、アミラーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、プロテアーゼ、フィターゼ、ラッカーゼ、カタラーゼ、ペルオキシダーゼ、亜硝酸還元酵素、及びＰＣＢ分解酵素より選択される１またはそれ以上の酵素である請求項１９に記載する発現ベクター。
- 請求項１７乃至２０のいずれかに記載する発現ベクターを好冷微生物の細胞内に導入してなる形質転換体。
- 請求項２１に記載する形質転換体を用いてバイオレメディエーションを行うことを特徴とする環境浄化方法。
- 低温条件下で行われることを特徴とする、請求項２２に記載する環境浄化方法。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009219383A (ja) * | 2008-03-13 | 2009-10-01 | Kagawa Univ | コラーゲン分解酵素を産生する低温細菌、コラーゲン分解酵素、その製造方法、およびその酵素を用いた軟化食肉の製造方法 |
| CN102660651A (zh) * | 2012-06-05 | 2012-09-12 | 湖南大学 | 用于检测链霉菌two-domain漆酶基因的简并引物及其检测方法 |
| US8618712B2 (en) | 2008-10-07 | 2013-12-31 | Mitsuba Corporation | Electric motor and reduction motor |
-
2004
- 2004-03-30 JP JP2004101560A patent/JP2005176825A/ja not_active Withdrawn
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