JP3895377B2 - 酵素安定剤としての4−置換フェニルボロン酸 - Google Patents
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Description
本発明は、酵素および改良された酵素安定剤を含んで成る液体組成物、特に液体洗剤組成物に関する。
発明の背景
1または複数の酵素を含有する液体に関する貯蔵安定性の課題は周知である。特に酵素含有液体洗剤では、洗剤がプロテアーゼを含む場合は特に、規定時間を超えて酵素活性を確保することが主な課題である。
従来技術は、例えばプロテアーゼ阻害剤を添加することにより、貯蔵安定性を改善することを広く扱っている。
ホウ酸およびボロン酸は、タンパク質分解酵素を可逆的に阻害することが知られている。セリンプロテアーゼの1つであるサブチリシンのボロン酸による阻害はMolecular & Cellular Biochemistry 51, 1983, 5-32頁に論じられている。メチル、ブチルまたは2−シクロヘキシルエチルのようなアルキル基のみを含有するボロン酸は貧弱な阻害剤であり、メチルボロン酸が最も貧弱な阻害剤であるが、一方でフェニル、4−メトキシフェニルまたは3,5−ジクロロフェニルのような芳香族基を含むボロン酸は優良な阻害剤であり、3,5−ジクロロフェニルボロン酸が特に有効な阻害剤である(Keller他,Biochem. Biophys. Res. Com. 176, 401-405頁を参照のこと)。
ホウ素に関して3位に置換を有するアリールボロン酸が意外にも良好な可逆的プロテアーゼ阻害剤であることも開示されている。特に、アセトアミドフェニルボロン酸はタンパク質分解酵素の有力な阻害剤であると開示されている(WO 92/19707参照)。
阻害定数(Ki)は元来、酵素活性を阻害する能力の尺度として使われ、低いKi値ほど有力な阻害剤を示す。しかしながら、ボロン酸のKi値がどれくらい有効な阻害剤であるかを常に表すわけではないことは以前から認識されている(例えばWO 92/19707参照)。
発明の要約
驚くべきことに、本発明では、フェニルボロン酸に隣接した>C=Oによりパラ位で置換されたフェニルボロン酸誘導体が、液体中で酵素安定剤として非常に優秀な能力を有することが発見された。
従って本発明は、酵素と下記式:
(上式中、Rは水素、ヒドロキシ、C1〜C6アルキル、置換C1〜C6アルキル、C1〜C6アルケニルおよび置換C1〜C6アルケニルから成る群より選ばれる)
のフェニルボロン酸誘導体酵素安定剤とを含んで成る液体組成物に関する。
発明の具体的開示
本発明の一態様は、酵素と下記式:
(上式中、Rは水素、ヒドロキシ、C1〜C6アルキル、置換C1〜C6アルキル、C1〜C6アルケニルおよび置換C1〜C6アルケニルから成る群より選ばれる)
のフェニルボロン酸誘導体酵素安定剤とを含んで成る液体組成物を提供する。
本発明の好ましい態様は、酵素と、RがC1〜C6アルキルであり、特にRがCH3、CH3CH2もしくはCH3CH2CH2であるか、またはRが水素である、上記式のフェニルボロン酸誘導体酵素安定剤とを含んで成る液体組成物を提供する。
本発明の更に好ましい態様は、界面活性剤、酵素および上記式のフェニルボロン酸誘導体酵素安定剤を含んで成る液体洗剤組成物を提供する。
フェニルボロン酸誘導体の調製
フェニルボロン酸誘導体は、当業者に周知の方法を使って、例えばグリニャール試薬を使うことによって調製することができる。
グリニャール試薬は、無水エーテル中の適当なブロモベンゼン出発材料を無水エーテル中のマグネシウム屑にゆっくりと滴下添加することにより調製される。無水エーテルは、例えばナトリウム乾燥させたジエチルエーテルまたはナトリウム乾燥させたテトラヒドロフランであることができる。この反応は少量のヨウ素結晶の添加により促進される。
無水エーテル(例えばナトリウム乾燥させたジエチルエーテルまたはナトリウム乾燥させたテトラヒドロフラン)中のトリメチルボレートまたはトリ−n−ブチルボレートを約−70℃に冷却し、そしてボレート溶液を約−70℃に維持しながら且つ連続的に攪拌しながら、前記グリニャール試薬を約2時間に渡り滴下添加する。
反応混合物を一晩放置して室温に温め、その時点で冷却した希硫酸の滴下添加によりそれを加水分解する。エーテル層を分離し、水性層をエーテルで抽出する。エーテル含有画分を合わせ、溶媒を除去する。残渣をはっきりとアルカリ性にし、それによって生成したメタノールまたはブタノールを除去する。アルカリ性溶液を酸性にし、冷却し、そして生成した所望のボロン酸の結晶を濾過により取り出す。全ての生成物を好ましくは蒸留水または別の何らかの適当な溶媒から再結晶せしめる。
上述した方法を使った、例えば4−ホルミルフェニルボロン酸の調製は、Chem. Ber. 123, 1990, 1841-1843に記載されている。
フェニルボロン酸はベンゼンの直接リチオ化および/またはブロミドのリチオ化のいずれかを使って調製することもできる。
いずれかの官能基の保護または核置換は、当業者に周知の標準法を使うことによって達成することができる。
安定剤
本発明によれば、液体組成物は500mMまでの安定剤(フェニルボロン酸誘導体)を含むことができ、好ましくは洗剤組成物は0.001〜250mMの安定剤を含むことができ、より好ましくは液体組成物は0.005〜100mMの安定剤を含むことができ、最も好ましくは液体組成物は0.01〜10mMの安定剤を含むことができる。フェニルボロン酸誘導体は酸または前記酸のアルカリ金属塩であることができる。
酵素
本発明によれば、液体組成物は少なくとも1種の酵素を含む。この酵素は任意の市販の酵素であることができ、特にプロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、オキシドレダクターゼおよびそれらの任意の混合物から成る群より選ばれた酵素であることができる。同じ酵素分類(例えばプロテアーゼ)からの酵素の混合物も包含される。
本発明によれば、プロテアーゼを含んで成る液体組成物が好ましく、より好ましいのは、第一の酵素がプロテアーゼでありそして第二の酵素がアミラーゼ、リパーゼ、セルラーゼおよびオキシドレダクターゼから成る群より選ばれる2以上の酵素を含んで成る液体組成物であり、更により好ましいのは、第一の酵素がプロテアーゼでありそして第二の酵素がリパーゼである液体組成物である。
液体組成物において使われる酵素の量は酵素のタイプによって異なる。各酵素の量は典型的には、純粋酵素タンパク質として計算して0.04〜40μMであり、特に0.2〜30μM、特に0.4〜20μM(通常1〜1000mg/l、特に5〜750mg/l、特に10〜500mg/l)である。
プロテアーゼ:適当なプロテアーゼとしては動物、植物または微生物起源のものが挙げられる。微生物起源が好ましい。化学修飾されたまたは遺伝子修飾された変異体も含まれる。プロテアーゼはセリンプロテアーゼ、好ましくはアルカリ性微生物プロテアーゼまたはトリプシン様プロテアーゼであることができる。アルカリ性プロテアーゼの例はサブチリシン、特にバシラス菌(Bacillus)由来のもの、例えばサブチリシンNovo、サブチリシンCarlsberg、サブチリシン309、サブチリシン147およびサブチリシン168(WO 89/06279中に記載)である。トリプシン様プロテアーゼの例はトリプシン(例えばブタまたはウシ起源のもの)およびWO 89/06270中に記載のフザリウム(Fusarium)プロテアーゼである。
好ましい市販のプロテアーゼ酵素としては、Novo Nordisk A/S(デンマーク国)により商品名Alcalase, Savinase, Primase, DurazymおよびEsperaseのもとに販売されているもの、Gist-Brocadesにより商品名Maxatase, Maxacal, MaxapemおよびProperaseのもとに販売されているもの、Genencor Intemationalにより商品名PurafectおよびPurafect OXPのもとに販売されているもの、並びにSolvay Enzymesにより商品名OpticleanおよびOptimaseのもとに販売されているものが挙げられる。
リパーゼ:適当なリパーゼとしては細菌または真菌起源のものが挙げられる。化学修飾されたまたは遺伝子修飾された変異体も含まれる。
有用なリパーゼの例としては、例えば欧州特許第258 068号および欧州特許第305 216号に記載のようなフミコーラ・ランギノーザ(Humicola lanuginosa)リパーゼ、例えば欧州特許第238 023号に記載のようなリゾムーコル・ミーヘイ(Rhizomucor miehei)リパーゼ、カンジダ(Candida)リパーゼ、例えば欧州特許第214 761号に記載のC.アンタークティカ(C. antarctica)リパーゼAもしくはB、シュードモナス(Pseudomonas)リパーゼ、例えば欧州特許第218 272号に記載のようなP.シュードアルカリゲネス(P. pseudoalcaligenes)およびP.アルカリゲネス(P. alcaligenes)リパーゼ、例えば欧州特許第331 376号に記載のようなP.セパシア(P. cepacia)リパーゼ、例えば英国特許第1,372,034号に開示されたようなP.スタッツェリ(P. stutzeri)リパーゼ、P.フルオレッセンス(P. fluorescens)リパーゼ、バシラス(Bacillus)リパーゼ、例えばB.サチリス(B. subtilis)リパーゼ〔Dartois他(1993), Biochemica et Biophysica Acta 1131, 253-260〕、B.ステアロサーモフィラス(B. stearothermophilus)リパーゼ(特公昭64-744992号)およびB.ピュミルス(B. pumilus)リパーゼ(WO 91/16422)が挙げられる。
更に、多数のクローン化されたリパーゼ、例えばペニシリウム・カメンベルティ(Penicillium camenbertii)リパーゼ〔Yamaguchi他(1991), Gene 103, 61-67〕、ゲオトリカム・カンジダム(Geotricum candidum)リパーゼ〔Schimada, Y.他(1989), J. Biochem. 106, 383-388〕、並びに様々なリゾプス(Rhizopus)リパーゼ、例えばR.デレマー(R. delemar)リパーゼ〔Hass, M.J.他(1991), Gene 109, 117-113〕、R.ニベウス(R. niveus)リパーゼ〔Kugimiya他(1992), Biosci. Biotech. Biochem. 56, 716-719〕およびR.オリゼ(R. oryzae)リパーゼが挙げられる。
クチナーゼのような他のタイプの脂質分解酵素も有用であり、例えばWO 88/09367号に記載されたようなシュードモナス・メンドシナ(Pseudomonas mendocina)由来のクチナーゼ、またはフザリウム・ソラニ・ピシ(Fusarium solani pisi)由来のクチナーゼ(例えばWO 90/09446に記載)も有用である。
特に適当なリパーゼは、M1 LipaseTM, Luma fastTMおよびLipomaxTM(Genencor)、LipolaseTMおよびLipolase UltraTM(Novo Nordisk A/S)、並びにLipase P“Amano”(Amano Phamaceutical Co. Ltd.)のようなリパーゼである(TMは商標)。
アミラーゼ:適当なアミラーゼ(αおよび/またはβ)としては、細菌または真菌起源のものが挙げられる。化学的にまたは遺伝子的に修飾された変異体も含まれる。アミラーゼとしては、例えば、英国特許第1,296,839号明細書に詳細に記載されているB.リヘニフォルミス(B. licheniformis)の特殊株から得られるα−アミラーゼが挙げられる。市販のアミラーゼはDuramylTM, TermamylTM, FungamylTMおよびBANTM(Novo Nordisk A/Sから入手可能)並びにRapidaseTMおよびMaxamyl PTM(Gist-Brocadesから入手可能)である。
セルラーゼ:適当なセルラーゼとしては細菌または真菌起源のものが挙げられる。化学的にまたは遺伝子的に修飾された変異体も含まれる。適当なセルラーゼは、フミコーラ・インソレンス(Humicola insolens)から生産される真菌セルラーゼを記載している米国特許第4,435,307号明細書に開示されている。特に適当なセルラーゼは色彩保護(color care)に役立つセルラーゼである。そのようなセルラーゼの例は欧州特許出願第0 495 257号明細書に記載されたセルラーゼである。
市販されているセルラーゼはフミコーラ・インソレンス(Humicola insolens)の株により生産されたCelluzymeTM(Novo Nordisk A/S)およびKAC-500(B)TM(花王)である。
オキシドレダクターゼ:液体組成物での使用に適する任意のオキシドレダクターゼ、例えばペルオキシダーゼまたはオキシダーゼ、例えばラッカーゼを本発明において用いることができる。適当なペルオキシダーゼとしては、植物、細菌または真菌起源のものが挙げられる。化学的にまたは遺伝子的に修飾された変異体も含まれる。適当なペルオキシダーゼの例は、コプリナス(Coprmus)、例えばC.シネレウス(Coprinus cinereus)もしくはC.マクロリザス(C. macrorhizus)の菌株由来、またはバシラス(Bacillus)、例えばB.ピュミラス(B. pumilus)の菌株由来のもの、特にWO 91/05858に係るペルオキシダーゼである。適当なラッカーゼとしては細菌または真菌起源のものが挙げられる。適当なラッカーゼの例はトラメテス(Trametes)、例えばT.ビロサ(T. villosa)もしくはT.ベルシコロール(T. versicolor)の菌株、コプリナス(Coprmus)、例えばC.シネレウス(C. cinereus)の菌株、またはミセリオフトラ(Myceliophthora)、例えばM.サーモフィラ(M. thermophila)の菌株から得られるものである。
洗剤
本発明によれば、液体洗剤組成物は1または複数の酵素および安定剤の他に、界面活性剤を含んで成るだろう。洗剤組成物は、例えば洗濯用洗剤組成物または食器洗い用洗剤組成物であることができる。
洗剤組成物は、典型的には水70%までと有機溶剤0〜30%を含有する水性であってもよく、または非水性であってもよい。
洗剤組成物は1または複数の界面活性剤を含んで成り、その各々がアニオン性、非イオン性、カチオン性または両性(両イオン性)であることができる。洗剤は一般に、0〜50%のアニオン性界面活性剤、例えば直鎖アルキルベンゼンスルホネート(LAS)、α−オレフィンスルホネート(A0S)、アルキルスルフェート(脂肪アルコールスルフェート)(AS)、アルコールエトキシスルフェート(AEOSまたはAES)、第二級アルカンスルホネート(SAS)、α−スルホ脂肪酸メチルエステル、アルキル−もしくはアルケニル−コハク酸、または石鹸を含むだろう。それは0〜40%の非イオン性界面活性剤、例えばアルコールエトキシレート(AEOまたはAE)、アルコールプロポキシレート、カルボキシル化アルコールエトキシレート、ノニルフェノールエトキシレート、アルキルポリグリコシド、アルキルジメチルアミンオキシド、エトキシル化脂肪酸モノエタノールアミド、脂肪酸モノエタノールアミド、またはポリヒドロキシアルキル脂肪酸アミド(例えばWO 92/06154中に記載)を含有してもよい。
洗剤は通常1〜65%の洗剤ビルダー(ある食器洗い用洗剤は90%までもの洗剤ビルダーを含むことがある)、または錯生成剤、例えばゼオライト、ジホスフェート、トリホスフェート、ホスホネート、シトレート、ニトリロ三酢酸(NTA)、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、ジエチレントリアミン五酢酸(DTMPA)、アルキル−もしくはアルケニル−コハク酸、可溶性シリケートまたは積層シリケート(例えばHoechstからのSKS-6)を含んでもよい。
洗剤ビルダーは含リン型と無リン型に細分することができる。含リン型無機アルカリ洗剤ビルダーの例としては、水溶性塩、特にアルカリ金属のピロリン酸塩、オルトリン酸塩、ポリリン酸塩およびホスホン酸塩が挙げられる。無リン型無機ビルダーの例としては、水溶性アルカリ金属炭酸塩、ホウ酸塩およびケイ酸塩並びに積層ジシリケート、更には様々な種類の水不溶性結晶質または非晶質アルミノシリケート(その中でゼオライトが最も良く知られている代表例である)が挙げられる。
適当な有機ビルダーの例としては、スクシネート、マロネート、脂肪酸マロネート、脂肪酸スルホネート、カルボキシメトキシスクシネート、ポリアセテート、カルボキシレート、ポリカルボキシレート、アミノポリカルボキシレートおよびポリアセチルカルボキシレートのアルカリ金属塩、アンモニウム塩または置換アンモニウム塩が挙げられる。洗剤はビルダー無添加(unbuilt)であってもよく、即ち洗剤ビルダーを本質的に含まなくてもよい。
洗剤は1または複数のポリマーを含んでもよい。ポリマーの例はカルボキシメチルセルロース(CMC)、ポリ(ビニルピロリドン)(PVP)、ポリエチレングリコール(PEG)、ポリ(ビニルアルコール)(PVA)、ポリカルボキシレート、例えばポリアタリレート、ポリマレエート、マレイン酸/アクリル酸コポリマー、およびラウリルメタクリレート/アクリル酸コポリマーである。
洗剤組成物は塩素/臭素型のまたは酸素型の漂白剤を含んでもよい。前記漂白剤はコーティングまたはカプセル化されてもよい。無機塩素/臭素型漂白剤の例は、次亜塩素酸もしくは次亜臭素酸リチウム、ナトリウムもしくはカルシウム、または塩素化リン酸三ナトリウムである。前記漂白系は、過酸を形成する漂白活性化剤〔例えばテトラアセチルエチレンジアミン(TAED)またはノナノイルオキシベンゼンスルホネート(NOBS)〕と組み合わせることができるH2O2源(例えば過ホウ酸塩または過炭酸塩)を含んで成ってもよい。
有機塩素/臭素型漂白剤の例は複素環式N−ブロモおよびN−クロロイミド、例えばトリクロロイソシアヌル酸、トリブロモイソシアヌル酸、ジブロモイソシアヌル酸およびジクロロイソシアヌル酸、並びにそれらと水溶性カチオン(例えばカリウムおよびナトリウムカチオン)との塩である。ヒダントイン化合物も適当である。漂白系は例えばアミド型、イミド型またはスルホン型のペルオキシ酸を含んで成ってもよい。
食器洗い用洗剤では、酸素漂白剤が好ましく、例えば好ましくは漂白剤前駆体との無機過塩の形のまたはペルオキシ酸化合物としての酸素漂白剤が好ましい。適当なペルオキシ漂白剤化合物の典型例はアルカリ金属過ホウ酸塩(四水和物と一水和物の両者)、アルカリ金属過炭酸塩、過珪酸塩および過リン酸塩である。好ましい活性化剤はTAEDまたはNOBSである。
本発明の洗剤組成物の酵素は、常用の安定化剤、例えばポリオール(例えばプロピレングリコールもしくはグリセロール)、糖もしくは糖アルコール、または乳酸を使って更に安定化することができる。
該洗剤組成物は他の常用の洗剤成分、例えば織物コンディショナー(クレーを含む)、起泡増進剤/泡止め剤(食器洗い用洗剤の場合は泡止め剤)、消泡剤、防錆剤、汚れ懸濁剤、汚れ再付着防止剤、色素、脱水剤、殺菌剤、蛍光増白剤、または香料を含んでもよい。
pH(使用濃度の水溶液中で測定した時の)は通常は中性またはアルカリ性、例えば7〜11の範囲であろう。
本発明の範囲内の洗濯用洗剤組成物の特定形態としては下記のものが挙げられる:
1)下記の成分を含んで成る水性液体洗剤
2)下記の成分を含んで成る水性液体洗剤
3)下記の成分を含んで成る水性液体洗剤組成物
4)下記の成分を含んで成る水性液体洗剤組成物
5)直鎖アルキルベンゼンスルホネートの全部または一部が(C12〜C18)アルキルスルフェートに置き換えられている、1)〜4)に記載の洗剤組成物。
6)追加の成分としてまたは既に明記してある漂白系の代替物として、安定化されたまたはカプセル化された過酸を含有する、1)〜5)に記載の洗剤組成物。
7)液体非イオン性界面活性剤(例えば直鎖アルコキシル化第一級アルコール)、ビルダー系(例えばホスフェート)、酵素およびアルカリを含んで成る非水性液体洗剤として製剤化された洗剤組成物。この洗剤はアニオン性界面活性剤および/または漂白系を含んでもよい。
本発明の範囲内の食器洗い用洗剤組成物の特定態様としては次のものが挙げられる:
1)洗浄界面活性剤系を有する食器洗い用液体組成物
2)自動食器洗い機用非水性液体組成物
3)非水性食器洗い用液体組成物
4)自動食器洗い機用チキソトロープ液体組成物
5)自動食器洗い機用液体組成物
6)保護された漂白粒子を含有する自動食器洗い機用液体組成物
7)過ホウ酸塩が過炭酸塩に置き換えられている、1)と5)に記載の自動食器洗い機用組成物。
8)更にマンガン触媒を含有する1)に記載の自動食器洗い機用組成物。マンガン触媒は、例えば、“Efficient manganese catalysts for low-temperature bleaching”, Nature, 369,(1994), 637-639に記載された化合物の1つであることができる。
安定剤の試験
本発明によれば、次の試験のうちの1つまたは複数において、各安定剤の有効性を調べることができる。
a) 液体洗剤における貯蔵安定性試験:1または複数の酵素および安定剤を液体洗剤組成物に添加し、そして明確に限定された条件下で貯蔵する。各酵素の酵素活性を時間の関数として、例えば0,3,7および14日後に測定する。
貯蔵安定性データから阻害効力を計算するために、反応機構が提案される。次の反応は、プロテアーゼ(P)、リパーゼ(L)および阻害剤(I)を含む液体洗剤についての比較的単純であるがしかしなお的確である機構を与える:
I)プロテアーゼの自己消化:
P+P→DP+P
II)プロテアーゼの変性:
P→DP
III)プロテアーゼの阻害:
IV)阻害された酵素のプロテアーゼ消化:
P+PI→P+DP+I
V)阻害された酵素の変性:
PI→DP+I
VI)リパーゼのプロテアーゼ消化:
P+L→P+DL
VII)リパーゼの変性:
L→DL
ここでDPおよびDLは変性された(即ち不活性の)プロテアーゼおよびリパーゼである。
それらの反応から、P,LおよびPIの失活を表す3つの組み合わされた微分方程式が誘導される。反応速度定数は、パラメーター推定法(レベンバーク変形を伴ったガウス−ニュートン法)を使って貯蔵安定性データから誘導される。貯蔵安定性データは時間の関数としての(P+PI)とLの濃度を与える。
反応IIIは他の反応よりもずっと速く、計算上は平衡が仮定される。パラメーターの数を減らすために反応IVは系から除外され、それによってただ1つの反応速度定数により、阻害された酵素の安定性が説明される(方程式Vから)。
全ての実験において、プロテアーゼ分子に比べて阻害剤分子は過剰であり、即ち阻害剤が一定濃度(阻害剤の添加量に相当する)であるというのは道理に適った仮定である。
反応速度定数の特定値は、データの変動に対して幾分敏感であるが、この敏感性はホウ酸からの値に対して相対的に結果を提示することによりかなり減らされる。改善係数(Improvement Factor)は下記の如く誘導される:
IFlは反応IIIからの阻害定数Kiにより与えられる阻害効力を意味する。
b) K i の決定:阻害定数Kiは標準法を使うことによって決定することができる。例えばKeller他,Biochem. Biophys. Res. Com. 176, 1991, 401-405頁;J. Bieth著,Bayer-Symposium“Proteinase Inhibitors”, 463-469頁,Springer-Verlag, 1974;およびLone Kierstein Hansen著, “Determmation of Specific Activity, Molecular Weights, Kinetic Parameters and Inhibition Kinetics” PhDレポート,Novo Nordisk A/SおよびUniversity of Copenhagen, 1991を参照のこと。
本発明を下記の実施例において更に説明するが、この実施例は請求される本発明の範囲を限定するものではない。
実施例1
4−ホルミルフェニルホウ素酸の調製
4−ホルミルフェニルボロン酸はChem. Ber. 123, 1990, 1841-1843頁に開示された通りに調製することができ、またはそれはLancaster Synthesis GmbHから購入することができる(4−ホルミルベンゼンボロン酸)。
実施例2
K i の決定
サビナーゼ(SavinaseTM;Novo Nordisk A/Sから入手可能)の阻害についての阻害定数Kiは、次の条件下で標準法を使って決定した。
基質:スクシニル−アラニン−アラニン−プロリン−フェニルアラニン−p−ニトロアニリド=SAAPFpNA(Sigma S-7388)。
緩衝液:0.1M Tris-HCl pH8.6;25℃。
アッセイ中の酵素濃度:サビナーゼ:1×10-10〜3×10-10M。
Cobas Fara自動分光光度計を使って、0.01〜2mMの範囲の9種類の基質濃度において基質加水分解の初速度を測定した。速度論パラメーターVmaxおよびKmはENZFITTER(非線形回帰データ解析プログラム)を使って決定した。
κcatは、方程式Vmax=κcat×〔EO〕から計算した。活性酵素の濃度〔EO〕は、密着結合性のタンパク質プロテイナーゼ阻害剤を使った活性部位滴定により決定した。阻害定数Kiは、阻害剤の濃度の関数としてのKm/κcatのプロットから算出した。阻害剤を100%純度であると仮定しそして秤量値と分子量を使ってモル濃度を決定した。
試験したフェニルボロン酸誘導体酵素安定剤の阻害定数Kiの結果を下記に示す。
比較目的で同じ系においてアセトアミドフェニルボロン酸も試験した。その結果を下記に示す。
上記に与えた結果から、4−ホルミルフェニルボロン酸の阻害性質はアセトアミドフェニルボロン酸のそれの少なくとも3倍であることは明らかである。
実施例3
液体洗剤を使った貯蔵安定性試験
フェニルボロン酸誘導体を下記条件下で前述した方法を使って液体洗剤の貯蔵安定性試験においても試験した。
洗剤基剤(US型)
試験したフェニルボロン酸酵素安定剤の阻害効力IFIの結果を下記に示す。
比較目的で同じ系においてアセトアミドフェニルボロン酸、2−ホルミルフェニルボロン酸および3−ホルミルフェニルボロン酸(全てLancasterで購入)も試験した。その結果を下記に示す。
上記に与えた結果から、4−ホルミルフェニルボロン酸の貯蔵安定性はアセトアミドフェニルボロン酸のそれの少なくとも3倍、3−ホルミルフェニルボロン酸のそれの少なくとも4倍、そして2−ホルミルフェニルボロン酸のそれの少なくとも25倍(全てモルを基準にして計算した)優れていることは明らかである。
実施例4
市販洗剤を使った貯蔵安定性試験
4−ホルミルフェニルボロン酸の阻害効力IFIを市販洗剤Omo Microにおいても調べた。
Omo Microはデンマークのスーパーマーケットで購入した。酵素を90℃で失活させた(一晩)。
洗剤中次の量を使った:
4−ホルミルフェニルボロン酸:1.33mM、または
ホウ酸:160mM、並びに
プロテアーゼ:1%(w/w)Savinase(8KNPU/g)および
リパーゼ:1%(w/w)Lipolase(100KLU/g)
貯蔵:40℃で0,7,15および21日間。
結果:IFI=2500。
実施例5
液体洗剤における4−カルボキシベンゼンボロン酸の貯蔵安定性試験
4−カルボキシベンゼンボロン酸(Lancasterで購入)を下記条件下で前述した方法を使って液体洗剤の貯蔵安定性試験においても試験した。
洗剤基剤(US型)
Claims (14)
- RがC1〜C6アルキルである、請求項1に記載の液体組成物。
- Rが水素である、請求項1に記載の液体組成物。
- 第二の酵素、特にアミラーゼ、リパーゼ、セルラーゼもしくはオキシドレダクターゼ、またはそれらの任意の混合物を更に含んで成る、請求項1に記載の液体組成物。
- 前記第二の酵素がリパーゼである、請求項4に記載の液体組成物。
- 前記フェニルボロン酸誘導体酵素安定剤が該ボロン酸のアルカリ金属塩である、請求項1〜5のいずれか一項に記載の液体組成物。
- 前記フェニルボロン酸誘導体酵素安定剤が、500mMまでの量で添加される、請求項1〜6のいずれか一項に記載の液体組成物。
- RがC1〜C6アルキルである、請求項8に記載の液体洗剤組成物。
- Rが水素である、請求項8に記載の液体洗剤組成物。
- 第二の洗剤適合酵素、特にアミラーゼ、リパーゼ、セルラーゼもしくはオキシドレダクターゼ、またはそれらの任意の混合物を更に含んで成る、請求項8に記載の液体洗剤組成物。
- 前記第二の酵素がリパーゼである、請求項11に記載の液体洗剤組成物。
- 前記フェニルボロン酸誘導体酵素安定剤が該ボロン酸のアルカリ金属塩である、請求項8〜12のいずれか一項に記載の液体洗剤組成物。
- 前記フェニルボロン酸誘導体酵素安定剤が、500mMまでの量で添加される、請求項8〜13のいずれか一項に記載の液体洗剤組成物。
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