CN103646191A - 黄杆菌ys-80-122碱性金属蛋白酶小分子可逆抑制剂的虚拟筛选方法 - Google Patents

Abstract

黄杆菌YS-80-122碱性金属蛋白酶的小分子可逆抑制剂的虚拟筛选方法，属于海洋生物技术领域，包括以下步骤：根据已知来源于黄杆菌YS-80-122碱性金属蛋白酶的结构数据，确定小分子可逆抑制剂的类别；测试所述类别的小分子可逆抑制剂对来源于黄杆菌碱性金属蛋白酶活性的抑制常数，确定训练集的组成化合物；训练集中的化合物与黄杆菌YS-80-122碱性金属蛋白酶进行分子对接；获得的训练集中的化合物与来源于黄杆菌YS-80-122碱性金属蛋白酶的理论结合自由能和理论可逆抑制常数，结合所述的测试数据，制定筛选规则，建立筛选模型；然后进行虚拟筛选。本发明筛选方法比较快速，可以迅速减少候选分子的数量，减少时间和试验材料的浪费。

Description

黄杆菌YS-80-122碱性金属蛋白酶小分子可逆抑制剂的虚拟筛选方法

技术领域

本发明属于海洋生物技术领域，具体的涉及小分子可逆抑制剂的虚拟筛选方法，尤其涉及以黄杆菌YS-80-122碱性金属蛋白酶为结合目标的小分子可逆抑制剂的虚拟筛选方法。

背景技术

酶的特点是用量少、催化效率高、专一性强。酶制剂产业在经历了半个多世纪的迅猛发展后，现已经形成一个富有活力的高技术产业，在食品、纺织、洗涤、造纸、饲料和生物能源等行业都有广泛应用。目前，液体酶制剂技术相比同类产品生产制造过程节约用水约30%～50%、节能50%以上,更符合低碳经济的发展需要；毫无疑问，高活性、高纯度、液体酶将成为今后酶制剂的发展方向。

由于酶制剂产业受其自身特点所限，工业用酶制剂在液体条件下的稳定性已成为制约其产业化及应用的技术瓶颈。如纺织、食品、饲料行业用酶要耐温和稳定剂、防腐剂的作用；洗涤剂行业用酶要耐受表面活性剂、氧化剂和漂白剂的氧化作用；用于有机合成的酶还要耐受有机溶剂的变性作用等。因此，液体酶稳定化技术研究为这些行业及相关应用领域提供了发展所必需的条件，是保障其产业化及应用的核心。液体酶制剂稳定化技术的关键点就是以酶晶体结构为基础，生物信息学技术为手段，通过筛选酶可逆抑制剂分子，开发应用于不同领域的酶制剂稳定体系。

蛋白酶作为酶制剂中最大的一类，其市场占有率已经超过了40%。20世纪60年代，来自地衣芽孢杆菌的Carlsberg丝氨酸蛋白酶首次作为洗涤添加剂推向市场，可以有效水解去除衣物上的奶渍、汗渍、血渍等，受到了世界范围的酶制剂市场的关注。随着绿色环保节能理念的深入，人们越来越重视洗涤剂中的添加剂成分，为了获得更好的洗涤效果，并且能与洗涤剂的碱性环境相配伍，许多国家都开展了寻找更新更好碱性蛋白酶的研究。

海洋环境不同于陆地环境，自海洋黄杆菌YS-80-122分泌产物中分离得到的金属蛋白酶，具有独特的低温催化性能，为目前我国紧缺的蛋白酶增添了新来源，深入研究开发是我国酶制剂工业急需迫切任务。该酶的GenBank编号ACY25898.1，包含全长480个氨基酸的序列。

酶的活性功能决定于其分子结构的完整和严格的构象，环境因素的变化极易导致酶的空间结构破坏，从而丧失其原有的生物活性。一些小分子的物质，可以与酶活中心的氨基酸残基相互作用并进行锁定，对酶的构象进行空间限位，使酶进入休眠的状态。之后在某种激活条件下，小分子物质与酶活性中心的作用力变弱，从而解除下来，活性中心的功能基团重新获得自由伸展，酶的活性得到恢复，这是酶可逆抑制剂作用的基本原理。20世纪60年代初，Umezawa最早提出了酶抑制的概念，发展至今，主要用于药物筛选领域，研究者设计了许多计算方法，构建了各种模型，用于小分子药物和药物先导化合物的设计和筛选，使其能够特异性作用于与疾病相关的酶，而不对机体产生损害。而工业用酶可逆抑制剂还没有现成的专一筛选模型和可参考的结构信息数据库，一直以来都是研究领域的难点问题。

近年来，随组合化学和高通量筛选技术的发展，国际上筛选酶可逆抑制剂也成为酶稳定化关键技术的研发热点。从酶晶体结构和已知的可逆抑制剂出发，建立一套高效可靠的工业酶小分子可逆抑制剂的筛选方法，寻找新型的可逆抑制剂分子，针对性强，筛选效率高，可以突破技术瓶颈，实现液体蛋白酶制剂的规模化生产和应用。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种来源于黄杆菌YS-80-122碱性金属蛋白酶小分子可逆抑制剂的虚拟筛选方法，弥补现有技术存在的不足，适用于黄杆菌YS-80-122碱性金属蛋白酶在工业液体酶制剂上的应用，提高其稳定性。

本发明的设计思路如下：首先根据已有的黄杆菌YS-80-122碱性金属蛋白酶结构数据，确定小分子可逆抑制剂的类别，测试所述类别的小分子可逆抑制剂对黄杆菌YS-80-122碱性金属蛋白酶活性的抑制常数，根据测试数据，建立训练集的组成化合物；然后进行分子对接，获得所述类别的小分子可逆抑制剂与黄杆菌YS-80-122碱性金属蛋白酶活性的理论抑制常数和理论结合自由能，最后结合测试数据、所述获得的理论抑制常数和理论结合自由能建立筛选规则和筛选模型，使用该规则和模型分别对小分子化合物数据库进行筛选、排序和打分，逐渐缩小范围，最终根据由上到下几次排序的结果，初步确定可以作为黄杆菌YS-80-122碱性金属蛋白酶小分子可逆抑制剂的化合物，并进行进一步的实验验证。

黄杆菌YS-80-122碱性金属蛋白酶的小分子可逆抑制剂的虚拟筛选方法，包括以下步骤：

（1）根据已知来源于黄杆菌YS-80-122碱性金属蛋白酶的结构数据，确定小分子可逆抑制剂的类别；测试所述类别的小分子可逆抑制剂对来源于黄杆菌YS-80-122碱性金属蛋白酶活性的抑制常数，根据测试数据，确定训练集的组成化合物；

（2）将步骤（1）所述训练集中的化合物与来源于黄杆菌YS-80-122碱性金属蛋白酶进行分子对接；

（3）根据步骤（2）获得的训练集中的化合物与来源于黄杆菌YS-80-122碱性金属蛋白酶的理论结合自由能和理论可逆抑制常数，结合步骤（1）所述的测试数据，制定筛选规则，建立筛选模型；

（4）虚拟筛选，根据步骤（3）制定的筛选规则和建立的筛选模型分别对小分子化合物数据库进行筛选。

进一步，根据已知来源于黄杆菌YS-80-122碱性金属蛋白酶的结构数据，确定小分子可逆抑制剂的类别为硼酸及其他硼源衍生化合物。

进一步，所述的步骤（1）进入训练集的组成化合物为4-甲酰苯基硼酸

（4-formyl-phenyl-boronic acid），噻吩-3-硼酸（Thiophene-3-boronic acid），4-甲基噻吩-2-硼酸（4-Methylthiophene-2-boronic acid），5-乙基噻吩-2-硼酸（5-Ethylthiophene-2-boronic acid），5-溴噻吩-2-硼酸（5-Bromothiophene-2-boronic acid），二苯并呋喃-4-硼酸（Dibenzofuran-4-boronic acid），3-甲氧基噻吩-2-硼酸（3-Methoxythiophene-2-boronic acid），3-溴噻吩硼酸（3-Bromothiophene-boronic acid），5-乙基呋喃-2-硼酸（5-Ethylfuran-2-boronicacid），5-甲氧基呋喃-2-硼酸（5-Methoxyfuran-2-boronic acid）；这些化合物均属于硼酸类衍生物，能够与来源于黄杆菌YS-80-122碱性金属蛋白酶可逆性的稳定结合

进一步，所述的步骤（2）中的分子对接方法为：利用REDUCE、Autodock Tools和Autodoc4共同完成。首先为MP和可逆抑制剂分子添加氢键和Gaussian电荷，再采用小分子和MP活性位点区域完全柔性的对接方法；在对接过程中，将Zn²⁺的参数分别修改为：离子半径：势阱深度：0.35kcal/mol,电荷：+0.95e；打分采用Autodock4自带打分和Xscore打分相结合。

进一步，所述的筛选规则-6.000≤Ei≤-5.000，50≤Ki≤200；按照Xscore打分，低于5.0分的被排除。

进一步，所述的建立的筛选模型是一个有效的药效团模型，该模型具有3个疏水中心、2个氢键受体和6个给体。

进一步，所述的虚拟筛选方法为将数据库中所有小分子化合物与来源于黄杆菌YS-80-122碱性金属蛋白酶一一进行分子对接，按照步骤（3）制定的筛选规则从小分子数据库中筛选的化合物组成化合物池A；

将化合物池A中的化合物按照理论结合自由能和理论可逆抑制常数重新按降序排列，取排在前2000位的分子使用X-score打分函数联合打分，计算小分子化合物与黄杆菌YS-80-122碱性金属蛋白酶的亲和力，取打分值大于5.0的化合物再组成化合物池B；

获取化合物池B后，使用筛选模型进行拟合模拟，其中与模型中的集团不匹配的或者比模型分子集团的数量多了2倍以上的化合物被去除，使用X-score打分函数重新基于复合体结构打分，并按降序排列。

本发明所建立的黄杆菌YS-80-122碱性金属蛋白酶的小分子可逆抑制剂的虚拟筛选方法，具有以下优点：（1）筛选方法比较快速，可以迅速减少候选分子的数量，减少时间和试验材料的浪费；（2）方法可靠，因为筛选规则和模型的建立是在对已有可逆抑制小分子训练集的基础上进行的，最终的筛选结果也使用实验数据验证，理论与实验结果想互补充，可靠性高；（3）针对性好，该方法中使用的分子对接，是建立在黄杆菌YS-80-122碱性金属蛋白酶已有结构数据基础上的，针对性强。这种筛选方法，适用于黄杆菌YS-80-122碱性金属蛋白酶在工业液体酶制剂上的应用。

附图说明

图1黄杆菌YS-80-122碱性金属蛋白酶小分子可逆抑制剂的虚拟筛选模型

图2ZINC01006243,ZINC03025346和ZINC02961282的抑制动力学曲线

图3ZINC01006243,ZINC03025346和ZINC02961282的结合模型

具体实施方式

本发明用下列实施例来进一步说明本发明，但本发明保护范围并非受限于下列实施例。

实施例1黄杆菌YS-80-122碱性金属蛋白酶的纯化：利用黄杆菌YS-80-122获得碱性金属蛋白酶的方法，可参考文献（Zhang S C,Sun M,Li T,et al.Structure analysis of a new psychrophilic marine protease[J].PloSone,2011,6(11):e26939.）

采用膜超滤和分子筛凝胶层析（Superdex200）的方法进行纯化黄杆菌YS-80-122碱性金属蛋白酶。在纯化过程中，酶活力使用azo-酪素作为底物检测，酶的反应温度是30℃，反应物中包含400μL0.1mol/l Tris-HCl缓冲液(pH9)，250μL酶溶液和100μL1%(w/v)的底物溶液，三氯乙酸用来终止反应。反应后的溶液在345nm条件下测试吸光值，一个酶活力单位定义为每分钟在345nm条件下提高0.01个吸光度所需要的酶量。

实施例2

一种来源于黄杆菌YS-80-122碱性金属蛋白酶的小分子可逆抑制剂的筛选方法，包括以下步

（1）根据已知来源于黄杆菌YS-80-122碱性金属蛋白酶的结构数据，确定小分子可逆抑制剂的类别；测试所述类别的小分子可逆抑制剂对黄杆菌YS-80-122碱性金属蛋白酶活性的抑制常数，根据测试数据（表1），确定训练集的组成化合物；

硼酸及其他硼源衍生化合物因具有良好的抑制活性，一直以来都是蛋白酶抑制剂的重要来源之一。本实施例测试18种硼酸衍生物对黄杆菌YS-80-122碱性金属蛋白酶的抑制效果，结果如表1：

表1.硼酸衍生物对黄杆菌YS-80-122碱性金属蛋白酶活性的抑制常数

名称	抑制常数Ki(mM)
		硼酸（boric acid）	2.03±0.040

4-甲酰苯基硼酸（4-formyl-phenyl-boronic acid）	0.57±0.027
		噻吩-3-硼酸（Thiophene-3-boronic acid）	0.81±0.034
3-乙酰氨基苯硼酸（3-acetamidophenyl boronic acid）	0.07±0.003
		4-甲基噻吩-2-硼酸（4-Methylthiophene-2-boronic acid）	0.94±0.040
5-乙基噻吩-2-硼酸（5-Ethylthiophene-2-boronic acid）	0.21±0.010
		5-溴噻吩-2-硼酸（5-Bromothiophene-2-boronic acid）	0.27±0.008
二苯丙噻吩-1-硼酸（Dibenzothiophene-1-boronic acid）	0.026±0.001
		二苯并呋喃-4-硼酸（Dibenzofuran-4-boronic acid）	0.24±0.009
呋喃-2-硼酸（Furan-2-boronic）	1.48±0.053
		呋喃-3-硼酸（Furan-3-boronic）	1.81±0.089
3-甲氧基噻吩-2-硼酸（3-Methoxythiophene-2-boronic acid）	0.40±0.022
		5-n-正丙基噻吩-2-硼酸（5-n-Propylthiophene-2-boronic acid）	0.07±0.003
3-溴噻吩硼酸（3-Bromothiophene-boronic acid）	1.16±0.038
		3-溴噻吩-4-硼酸（3-Bromothiophene-4-boronic acid）	0.16±0.007
5-乙基呋喃-2-硼酸（5-Ethylfuran-2-boronic acid）	0.39±0.020
		联二苯硼酸（Diphenyl borinic acid）	0.06±0.002
5-甲氧基呋喃-2-硼酸（5-Methoxyfuran-2-boronic acid）	0.98±0.033

抑制常数的计算方法：

黄杆菌YS-80-122碱性金属蛋白酶催化的米氏常数(K_m)使用Lineweaver–Burk双倒数作图法完成，抑制常数K_i值通过Dixon作图法得到。Lineweaver–Burk方程可以写作：

$\frac{1}{v_i}=\frac{K_m}{V_{\max }}(1+\frac{\left[I\right]}{K_i})\frac{1}{\left[S\right]}+\frac{1}{V_{\max }}---\left(1\right)$

二次求导后得到：

$K_m^{\mathrm{app}}=\frac{K_m\left[I\right]}{K_i}+K_m---\left(2\right)$

从中可以求得抑制常数K_i。

抑制常数（Ki）可以反映出化合物与酶结合的能力大小，在这18种化合物中，二苯丙噻吩-1-硼酸（Dibenzothiophene-1-boronic acid）,3-乙酰氨基苯硼酸（3-acetamidophenyl boronicacid）,联二苯硼酸（Diphenyl borinic acid）,3-溴噻吩-4-硼酸（3-Bromothiophene-4-boronic acid）和5-n-正丙基噻吩-2-硼酸（5-n-Propylthiophene-2-boronic acid）因为与金属蛋白酶分子的结合能力太强（Ki<0.2），容易导致酶分子完全变性，被排除掉。硼酸（boric acid），呋喃-2-硼酸（Furan-2-boronic），呋喃-3-硼酸（Furan-3-boronic）则与金属蛋白酶分子的结合能力太弱（Ki>1.4）,使得化合物与酶分子形成的复合物结构及其不稳定，容易分解，因此也被排除。最终确定了4-甲酰苯基硼酸（4-formyl-phenyl-boronic acid），噻吩-3-硼酸（Thiophene-3-boronicacid），4-甲基噻吩-2-硼酸（4-Methylthiophene-2-boronic acid），5-乙基噻吩-2-硼酸（5-Ethylthiophene-2-boronic acid），5-溴噻吩-2-硼酸（5-Bromothiophene-2-boronic acid），二苯并呋喃-4-硼酸（Dibenzofuran-4-boronic acid），3-甲氧基噻吩-2-硼酸（3-Methoxythiophene-2-boronic acid），3-溴噻吩硼酸（3-Bromothiophene-boronic acid），5-乙基呋喃-2-硼酸（5-Ethylfuran-2-boronic acid），5-甲氧基呋喃-2-硼酸（5-Methoxyfuran-2-boronic acid）共计10种小分子化合物进入小分子可逆抑制剂的训练集，这些化合物可以与黄杆菌YS-80-122碱性金属蛋白酶实现可逆性的稳定结合。

（2）将步骤（1）所述的训练集中的化合物与来源于黄杆菌YS-80-122碱性金属蛋白酶进行分子对接；

使用的分子对接方法为：利用REDUCE、Autodock Tools和Autodoc4来完成。首先通过REDUCE程序为MP添加氢键，然后用Autodock Tools脚本分别为MP和可逆抑制剂分子添加Gaussian电荷。选取以坐标点（12.403，-20.749，24.022）为中心，

的范围内的空间区域为对接的格点区，利用AutoGrid来划定格点。采用小分子和MP活性位点区域完全柔性的对接方法，利用Autodock4来进行对接。在对接过程中，将ZN2+的参数分别修改为：离子半径：

势阱深度：0.35kcal/mol，电荷：+0.95e。打分采用Autodock4自带打分和Xscore打分相结合的方法。对接后的结果如表2。

表2.18种小分子化合物对接后的理论结合自由能（Ei)和理论可逆抑制常数（Ki)

（3）根据步骤（2）获得的训练集中的化合物与来源于黄杆菌YS-80-122碱性金属蛋白酶的理论结合自由能和理论可逆抑制常数，结合步骤（1）所述的测试数据，制定筛选规则，建立筛选模型；

获取训练集中的化合物与来源于黄杆菌YS-80-122碱性金属蛋白酶的理论结合自由能（Ei，kcal/mol)和理论可逆抑制常数（Ki，μM)后，参考表1、表2的测试数据和实验结果，进入训练集的小分子化合物的理论结合自由能和理论可逆抑制常数（Ki)需要满足选择条件(-6.000≤Ei≤-5.000，50≤Ki≤200)，因此以此作为筛选规则，在这个范围内的，可逆抑制结果为阳性。

据此建立的筛选模型（图1）是一个有效的药效团模型，该模型具有3个疏水中心、2个氢键受体和6个给体。按照X-score打分，低于5.0分的被排除。

（4）虚拟筛选

首先将ZINC数据库中所有小分子化合物与来源于黄杆菌YS-80-122碱性金属蛋白酶一一进行分子对接，获得所有小分子化合物与来源于黄杆菌YS-80-122碱性金属蛋白酶的理论结合自由能和理论可逆抑制常数，再使用获得的筛选规则(-6.000≤Ei≤-5.000,50≤Ki≤200)对这些大约1900万个小分子化合物进行初步筛选，获得了13000种小分子化合物，组成化合物池A。

将化合物池A中的化合物按照理论结合自由能（Ei)和理论可逆抑制常数（Ki)重新按降序排列，取排在前2000位的小分子化合物使用X-score打分函数联合打分，计算小分子化合物与黄杆菌YS-80-122碱性金属蛋白酶的亲和力，取打分值大于5.0的，共计283种化合物再组成化合物池B。

获取化合物池B后，进行筛选模型的拟合。使用步骤（3）获得的筛选模型对化合物池B中的283种化合物进行匹配，其中与模型中的集团不匹配的或者比模型分子集团的数量多了2倍以上的化合物被去除，使用X-score打分函数重新基于复合体结构打分并按降序排列，最终获得了排名在前10位的结构最为匹配的化合物（表3）：

表3.十种与筛选模型匹配的化合物

这些化合物可以作为黄杆菌YS-80-122碱性金属蛋白酶的候选小分子可逆抑制剂。

实施例3化合物ZINC01006243，ZINC03025346和ZINC02961282的抑制常数和抑制类型

合成了其中3种化合物分子：ZINC02961282，ZINC03025346和ZINC01006243，测试其抑制常数值分别为：0.84±0.13，1.02±0.044和1.28±0.055mmol，且添加不同浓度抑制剂后，最大反应速度V_m保持一致，米氏常数K_m与抑制剂浓度呈正相关，均属于可逆抑制作用。其抑制常数的测试结果如图2，与金属蛋白酶作用的模式图见附图3。

Claims (7)

1.黄杆菌碱性金属蛋白酶的小分子可逆抑制剂的虚拟筛选方法，其特征在于它包括以下步骤：

（1）根据已知来源于黄杆菌碱性金属蛋白酶的结构数据，确定小分子可逆抑制剂的类别；测试所述类别的小分子可逆抑制剂对来源于黄杆菌碱性金属蛋白酶活性的抑制常数，根据测试数据，确定训练集的组成化合物；

（2）将步骤（1）所述训练集中的化合物与来源于黄杆菌YS-80-122碱性金属蛋白酶进行分子对接；

（3）根据步骤（2）获得的训练集中的化合物与来源于黄杆菌YS-80-122碱性金属蛋白酶的理论结合自由能和理论可逆抑制常数，结合步骤（1）所述的测试数据，制定筛选规则，建立筛选模型；

（4）虚拟筛选，根据步骤（3）制定的筛选规则和建立的筛选模型分别对小分子化合物数据库进行筛选。

2.根据权利要求1所述的黄杆菌碱性金属蛋白酶的小分子可逆抑制剂的虚拟筛选方法，其特征在于根据已知来源于黄杆菌碱性金属蛋白酶的结构数据，确定小分子可逆抑制剂的类别为硼酸及其他硼源衍生化合物。

3.根据权利要求1所述的黄杆菌碱性金属蛋白酶的小分子可逆抑制剂的虚拟筛选方法，其特征在于所述的步骤（1）进入训练集的组成化合物为4-甲酰苯基硼酸，噻吩-3-硼酸，4-甲基噻吩-2-硼酸，5-乙基噻吩-2-硼酸，5-溴噻吩-2-硼酸，二苯并呋喃-4-硼酸，3-甲氧基噻吩-2-硼酸，3-溴噻吩硼酸，5-乙基呋喃-2-硼酸，5-甲氧基呋喃-2-硼酸；这些化合物均属于硼酸类衍生物，能够与来源于黄杆菌YS-80-122碱性金属蛋白酶可逆性的稳定结合。

4.根据权利要求1所述的黄杆菌碱性金属蛋白酶的小分子可逆抑制剂的虚拟筛选方法，其特征在于，所述的步骤（2）中的分子对接方法为：利用REDUCE、Autodock Tools和Autodoc4共同完成；首先为MP和可逆抑制剂分子添加氢键和Gaussian电荷，再采用小分子和MP活性位点区域完全柔性的对接方法；在对接过程中，将Zn2+的参数分别修改为：离子半径：

势阱深度：0.35kcal/mol，电荷：+0.95e；打分采用Autodock4自带打分和Xscore打分相结合。

5.根据权利要求1所述的黄杆菌碱性金属蛋白酶的小分子可逆抑制剂的虚拟筛选方法，其特征在于所述的筛选规则-6.000≤Ei≤-5.000，50≤Ki≤200；按照Xscore打分，低于5.0分的被排除。

6.根据权利要求1所述的黄杆菌碱性金属蛋白酶的小分子可逆抑制剂的虚拟筛选方法，其特征在于所述的建立的筛选模型是一个有效的药效团模型，该模型具有3个疏水中心、2个氢键受体和6个给体。

7.根据权利要求1所述的黄杆菌碱性金属蛋白酶的小分子可逆抑制剂的虚拟筛选方法，其特征在于所述的虚拟筛选方法为将数据库中所有小分子化合物与来源于黄杆菌YS-80-122碱性金属蛋白酶一一进行分子对接，按照步骤（3）制定的筛选规则从小分子数据库中筛选的化合物组成化合物池A；

将化合物池A中的化合物按照理论结合自由能和理论可逆抑制常数重新按降序排列，取排在前2000位的分子使用X-score打分函数联合打分，计算小分子化合物与黄杆菌YS-80-122碱性金属蛋白酶的亲和力，取打分值大于5.0的化合物再组成化合物池B；

获取化合物池B后，使用筛选模型进行拟合模拟，其中与模型中的集团不匹配的或者比模型分子集团的数量多了2倍以上的化合物被去除，使用X-score打分函数重新基于复合体结构打分，并按降序排列。

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