JP3821541B2 - 錠剤型磁気粒子含有試薬調製物 - Google Patents
錠剤型磁気粒子含有試薬調製物 Download PDFInfo
- Publication number
- JP3821541B2 JP3821541B2 JP16504297A JP16504297A JP3821541B2 JP 3821541 B2 JP3821541 B2 JP 3821541B2 JP 16504297 A JP16504297 A JP 16504297A JP 16504297 A JP16504297 A JP 16504297A JP 3821541 B2 JP3821541 B2 JP 3821541B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- sample
- magnetic particles
- tablet
- reagent preparation
- glass
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/566—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using specific carrier or receptor proteins as ligand binding reagents where possible specific carrier or receptor proteins are classified with their target compounds
- G01N33/567—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using specific carrier or receptor proteins as ligand binding reagents where possible specific carrier or receptor proteins are classified with their target compounds utilising isolate of tissue or organ as binding agent
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
- G01N33/54326—Magnetic particles
- G01N33/5434—Magnetic particles using magnetic particle immunoreagent carriers which constitute new materials per se
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Sampling And Sample Adjustment (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、試料成分を結合する錠剤型試薬調製物、該調製物を使用する核酸の結合方法、該調製物を使用する核酸の精製方法、試料中での磁気粒子懸濁物の調製方法および試料中へ磁気粒子を取り込む方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
液体試料の分析においてたびたび起こる問題は、分析対象の成分がごく微量でしか存在しないということである。さらに、試料は、測定対象ではなく測定をより不正確にする多くの粒子をも含む。従って、分析対象物を固相に結合させて測定対象でない粒子を液体と共に除去することが好都合である。次いで、単離された分析対象物は、固相において検出可能である。最近、主として管等の反応容器の内壁が固相として用いられている。別の選択は、分析対象物と結合可能なビーズを反応容器に添加することである。ビーズのサイズは、液体とビーズの分離が単純なピペッティングにより行なわれることができるようなサイズである。しかし、最近、分析対象物が磁気粒子に結合し、結合した分析対象物を磁気粒子と共に磁場により周りの液体から分離する持続操作器具が設計されている。分析対象物を結合可能な表面を有する磁気粒子が、提供されている。
【０００３】
これらの磁気粒子を含む試薬調製物は、測定目的の分析対象物を含む液体がピペッティングにより添加される懸濁物の型で提供される。これらのピペッティング工程は、ピペッティング手段と連動して通常見られる偏差を被る。さらに、ピペッティング誤差も原因を突き止めることが困難である。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の目的は、従来技術における欠点を除去した、試料成分を結合する錠剤型試薬調製物を提供することにある。本発明の他の目的は、該調製物を使用する核酸の結合方法を提供することにある。本発明の他の目的は、該調製物を使用する核酸の精製方法を提供することにある。本発明の他の目的は、試料中での磁気粒子懸濁物の調製方法を提供することにある。本発明のさらに他の目的は、試料中へ磁気粒子を取り込む方法を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
すなわち、本発明の要旨は、
（１）試料中の核酸を結合させるための、
−該核酸が本質的に完全に結合可能なガラス様表面を有する多数の磁気粒子、および
−賦形剤、
を含有してなる錠剤型試薬調製物、
（２）該核酸の結合を容易にする添加剤をも含むことを特徴とする前記（１）記載の試薬調製物、
（３）磁気粒子が１００μｍ未満の平均粒径を有することを特徴とする前記（１）または（２）記載の試薬調製物、
（４）錠剤が５ｍｇを越える重量を有することを特徴とする前記（１）〜（３）いずれか記載の試薬調製物、
（５）添加剤がカオトロピック塩であることを特徴とする前記（２）記載の試薬調製物、
（６）前記（１）〜（５）いずれか記載の試薬調製物を用いて、試料中の核酸を結合させる方法、
（７）前記（１）〜（５）いずれか記載の試薬調製物を用いて、試料中の核酸を精製する方法、
（８）下記工程：
−ガラス様表面を有する磁気粒子および溶解可能な賦形剤を含む錠剤を試料に添加する工程、および
−試料中の錠剤を揺動させる工程、
を含む、試料中でのガラス様表面を有する磁気粒子懸濁物の調製方法、
（９）下記工程：
−ガラス様表面を有する磁気粒子を含有する多数の磁気粒子含有錠剤を含むディスペンサーを提供する工程、および
−ディスペンサーを活性化して錠剤を放出する工程、
を含む、試料中へガラス様表面を有する磁気粒子を取り込む方法、
に関する。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明の主題は、成分が本質的に完全に結合可能な表面を有する多数の粒子および賦形剤からなる、錠剤型で試料中の成分を結合させる試薬調製物である。本発明の他の主題は、これらの試薬調製物の使用および磁気懸濁物の調製方法である。
【０００７】
成分は、粒子または分子物質である。これは、具体的には、ウイルスまたは細菌等の細胞、白血球細胞等の単離されたヒトまたは動物細胞、ハプテン、抗原、抗体および核酸等の免疫活性な低分子および高分子化合物をも含む。特に好ましいものは、ＤＮＡまたはＲＮＡ等の核酸である。
【０００８】
本発明において試料とは、例えば、血液、血清、うがい液、尿、脳脊髄液、痰、便、斑紋、骨髄試料等の臨床検体である。試料は、環境分析、食品分析または、細菌培養物、ファージ溶解物およびＰＣＲ等の増幅手段産物等の分子生物学的研究等の領域由来であってもよい。
【０００９】
本発明において錠剤とは、固体の成形体であり、好ましくは円盤状またはほぼ完全球状型であることが望ましい。他の類似の態様も考えられる。この種類の錠剤は、薬剤から通常知られている。錠剤は、５ｍｇを越える一定の重量を有することが好ましい。
【００１０】
磁気粒子は磁石に引きつけられることが可能な物質、すなわち、強磁性または超常磁性物質から作られる粒子である。本発明においては、超常磁性粒子が特に好ましく、とりわけ前帯磁していないものが好ましい。本明細書において前帯磁とは、物質を磁石と接触させて共鳴を増加させる工程をいう。磁性体Ｆｅ3 Ｏ4 またはＦｅ2 Ｏ3 が特に好ましい。しかし、磁気粒子は、（より小さな）磁気粒子を含有する物質を含むとも解釈される。これは、特に、Ｍｅｒｃｋ（Darmstadt 、ドイツ) から購入可能な顔料であるＩｒｉｏｄｉｎ６００を含む。本発明は、１００μｍ未満の平均粒径を有する粒子が特に好ましい。特に好ましい平均粒径は、１０〜６０μｍの範囲である。好ましい粒子分布は、比較的均一であり、特に、１０μｍ以下または６０μｍ以上の粒子をほとんど含まない。この要求を満たす粒子は例えば、国際公開第９０／０６０４５号パンフレットに記載されている。
【００１１】
本発明の必須要素は、成分が結合可能な表面を有する磁気粒子という事実である。この結合は、特異的または比較的非特異的であってもよい。特異的結合は、抗体と抗原、抗体とハプテンまたは相補的核酸等の結合特異的相互作用を利用することにより達成できる。これらの相互作用の組み合わせも可能である。
【００１２】
表面を修飾する公知の方法は、例えば、ストレプトアビジン層で粒子を被覆することである。従って、ビオチンとある種の抗体、ハプテンまたは核酸とのコンジュゲートを介して試料から特異的成分が結合可能な普遍的なマトリックスを生成することが可能である。当業者、特に免疫アッセイの分野出身の者は、かかる態様に精通している。
【００１３】
比較的非特異的結合とは、ガラス様表面と核酸間の相互作用である。ヨウ化ナトリウム存在下、粉末フリントガラスにおけるアガロースゲルからの核酸の結合は、Proc. Natl. Acad. USA 76, 615-619(1979) により公知である。米国特許出願第４，２３３，１６９号明細書に、ガラス部分が核酸と結合可能な磁気粒子が記載されている。
【００１４】
本発明により、測定対象の成分が本質的に完全に磁気粒子に結合することが提供される。当業者は、添加される磁気粒子の量を変えることにより必要量の粒子を容易に決定することができる。本発明によれば、本質的に完全な結合とは、６０％以上の結合を意味し、特に好ましくは試料中に見出される結合対象の成分の９０％以上の結合である。
【００１５】
賦形剤は、本質的に錠剤の形を維持するために、すなわち、磁気粒子を連結して錠剤を形成するために供する。本発明の好ましい賦形剤は、反応が行なわれる試料中で迅速に溶解するものである。好ましい液体試料としては、水溶液が挙げられ、薬剤の製造に通常用いられる賦形剤を使用することができる。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）が特に好ましい。
【００１６】
独国特許出願公開第４４０６１３９号明細書に、作用成分の吸収が改良された磁気貯留薬が記載されている。錠剤は、円盤様磁石を含み、作用成分が数時間以上放出される。The International Journal of Pharmaceutics 119, 47-55(1995)にも薬剤の遅延放出を伴う錠剤が記載されている。
【００１７】
STP Pharmasciences Vol 4, 425-430(1994) には、フェライト含有磁気錠剤およびそのイヌへの投与が記載されている。
【００１８】
さらに、本発明の錠剤は、安定剤も含んでよい。好ましい方法において、Ｄ−マンニット、トレハロースおよびソルビット等の糖が添加される。
【００１９】
驚くべきことに、磁気粒子、特にガラス表面を有するものは、明らかなガラスの加水分解なしに、従って明らかな磁気部分からの鉄の溶出なしに、錠剤型で保存することが可能である。
【００２０】
磁気粒子は、０．１μｍ〜１００μｍの範囲の平均粒径を有するガラス磁石顔料、ポリマー磁気ビーズまたは他の磁気粒子が好ましく、これらは、独国特許第１９５２０３９０号明細書に記載されている。
【００２１】
また、調製物は、成分の結合工程を容易にするために、添加剤を含んでもよい。これは、前記コンジュゲートのような特異性を高める物質のみならず成分の表面への結合が容易になるように試料の性質を変える物質をも含む。核酸を用いた場合、これらは、グアニジニウム ヒドロクロリド、ヨウ化ナトリウム、過塩素酸ナトリウム等のカオトロピズム塩である。この種類のカオトロピズム塩は、Anal. Biochem. 121, 382-387(1982) および独国特許出願公開第３７３４４４２号明細書から公知である。
【００２２】
試薬調製物は、根本的に結合工程を可能ならしめる型に成分を変換する試薬も含んでもよい。これは、核酸を含む細胞等の区画を溶解する試薬を含む。かかる試薬としては、例えば、プロテアーゼＫまたは前記カオトロピズム塩が挙げられる。
【００２３】
また、試薬調製物は、ｐＨ緩衝物質ならびに水素結合、疎水結合およびイオン結合等の結合分離剤ならびに免疫アッセイの成分で公知のような物質の特異的検出試薬または指示薬も含んでよい。
【００２４】
以下の成分が、好ましい錠剤に適していることがわかった。
【００２５】
【表１】
【００２６】
本発明の錠剤は、総量が１００％となるように、不活性な充填剤等の他の成分を含んでもよいのは当然である。割合は、重量パーセントで示す。
【００２７】
錠剤型の本発明の試薬調製物は、錠剤型の他の薬剤に対応して製造することができる。これを行なうために、すべての必須成分を十分混合し、アリコートを錠剤プレスで錠剤化する。このことは、特に、加圧することにより行なわれる。しかし、本発明の錠剤は、成分の混合物を造粒することによっても得られる。この目的のために、一定量の乾燥混合物を溶解液を用いて造粒する。次いで、このように得られた造粒物から液体を再び回収する。一定の粒径は、造粒物をふるいにかけることにより得られる。
【００２８】
これらの製造工程は、錠剤重量の変動率が非常に低く、従って、実施の際に試薬を投与する場合、高い再現性を伴う。そして、誤った投与は低減し、より追跡が容易になる。本発明の錠剤は、磁気粒子が容易にかつ前もって分散可能な限り、好ましくは３０秒未満、特に好ましくは１ないし１０秒未満に迅速に溶解可能であることが望ましい。また、錠剤型は、保存という点に関して好都合である。錠剤ディスペンサーにより、投与は手動で行なうこともできる。懸濁状で起こり、粒子の沈殿により生じる不純物混和は観察されない。
【００２９】
本発明の他の主題は、本発明の試薬調製物を使用する核酸の結合方法である。これを行なうために、試薬調製物を試料に添加し、（１）錠剤の溶解が完了するまで、および（２）核酸を本質的に完全に表面に結合させるまでインキュベートする。所望ならば、錠剤を機械的に動かすことが可能である。このことにより、錠剤の溶解速度および成分の結合速度が上昇する。
【００３０】
本発明の他の主題は、本発明の試薬調製物を使用する核酸の精製方法である。これを行なうために、磁気粒子およびそれに結合した核酸を周りの試料液体から分離する。このことは、磁場を適用して磁気粒子を容器中または装置の一定の部位に留め、次いで、ピペッティングまたは排除等により試料液体を除去し、所望ならば、別の液体を用いる洗浄工程を１ないし数回行なうという点で有意に成される。所望ならば、適当な条件を適用した場合、結合した核酸を磁気粒子から再び分離することができる。ガラス様表面の場合、これらは低塩条件、すなわち、溶離液の塩濃度が１００ｍｍｏｌ／ｌ未満である。
【００３１】
本発明の他の主題は、磁気粒子および溶解可能な賦形剤を含む錠剤を試料に添加する工程および好ましくは可動性磁場を用いる試料中で錠剤を揺動する工程からなる、試料中で磁気粒子懸濁物を調製する方法である。磁場は、磁気粒子が持続的に動くように、試料に近接した磁石を前後に動かすように移動させることができる。しかし、錠剤および磁気粒子を有する試料を含む容器を磁石の方へ移動させることも可能である。
【００３２】
本発明のさらに他の主題は、多数の磁気粒子含有錠剤を含むディスペンサーを提供する工程およびディスペンサーを活性化して錠剤を放出させる工程からなる試料中へ磁気粒子を取り込む方法である。錠剤を提供するディスペンサーは、錠剤型の薬剤を投与する際に通常用いられるものである。本発明の方法では、かかるディスペンサーを、投与手段により手動で用いることができる。試料当たり１つの錠剤のみを放出させる必要は必ずしもない。また、試料に対して予定された使用により、例えば、２〜１０個の間の一定の数の錠剤を放出することも可能である。
【００３３】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例によりなんら限定されるものではない。
【００３４】
実施例１
ガラス磁石顔料の調製
２５０ｍｌの丸底フラスコで、下記指示を守って、定常攪拌下、溶液（ＳｉＯ2 ：Ｂ2 Ｏ3 ＝７：３）を調製した。
８６．６ｍｌ テトラエチルオルトシリケート
＋７ｍｌ 無水非変性エタノール
＋１４．１ｍｌ ０．１５Ｍ ＨＣｌ。
【００３５】
二相の混合物が得られ、一相になるまで室温で攪拌した。次いで、３７．８ｍｌのトリメチルボレートを滴下した。次いで、溶液を２時間、５０℃の温度で保温した。次いで、１４．１ｍｌの０．１５Ｍ ＨＣｌを添加した。
【００３６】
成熟させた後、２２．５ｇのＩｒｉｏｄｉｎ６００（黒雲母、Merck, Darmstadt, ドイツ) を、攪拌下、１５０ｍｌの溶液に添加し、次いで噴霧−乾燥機（Buchi 190, Mini Spray Dryer)で被覆した。
【００３７】
次いで、噴霧−乾燥過程で得られた粉末を、窒素雰囲気下、温度処理に供した。加熱速度は、１Ｋ／分であり、成形温度での滞留時間は、２時間であった。成形後、追送処理の温度まで温度を下げ、窒素雰囲気を大気と置換し、追送処理後、粉末を室温まで冷却した。形成可能な凝集物を、５０μｍのふるいにかけることにより除去した。
【００３８】
【表２】
【００３９】
実施例２
錠剤生産
前混合過程
４３．６２ｇのガラス磁石顔料ＧＭＰ２を、５００ｇのグアニジニウム ヒドロクロリドと混合し、ＧＬＡ−ＯＲＶ Ｆｒｅｗｉｔｔふるい機を用いて０．２ｍｍのふるいにかけた。収量は、５３６．４ｇであり、９８．７％の収率に相当する。
【００４０】
造粒化
０．６７４ｇのＴｒｉｓ−ＨＣｌと０．２５９ｇの尿素を、２．２ｍｌの再留水に溶解した。次いで、２６６．４ｇの前混合物と共に溶液を造粒した。全部で７ｍｌの再留水を添加した。得られた造粒物を、２４時間かけて室温で真空乾燥させた後、０．６ｍｍのふるいにかけた。
【００４１】
錠剤化
２４６．９８ｇの造粒物を、７．４１ｇの噴霧−硬化ＰＥＧ６０００と混合し、５ｍｍの打ち抜き型を有するＫｏｒｓｃｈ ＰＨ１０６錠剤プレスで錠剤化した。収量は、１８６．６３ｇすなわち２９０２錠であった。錠剤は、６４．３２ｍｇの重量を有し、１．５ｋｐの硬度を有し、室温で蒸留水中の溶解時間は６秒であり、０．８％の磨耗率であり、２．７７ｍｍの高さを有していた。
【００４２】
錠剤機と打ち抜き型は、洗浄が容易であり、打ち抜き型の底は光沢を保ち、打ち抜き型は何も被覆されていなかった。大部分は、幾分ゆっくり通り抜け、最小の技術手段により有意に改良された４．６５％のＣＶ値の重量となった。
【００４３】
実施例３
保存
実施例２の１０個の錠剤を、重量を測定し、開放したガラス容器に添加し、室温で約５０％ｒＦの実験室で、開放したまま保存した。４週間重量をモニターした。重量変化はなかった。
【００４４】
実施例４
ａ．磁気ガラス粒子を用いるヒト全血液からのＰＣＲ試料調製
核酸の単離
１０ｍｇのガラス磁石粒子ＧＭＰ２を、Eppendorf 試験管で調製した。４０μｌのプロテアーゼＫ（２０ｍｇ／ｍｌ、凍結乾燥品から得られたもの）を、２００μｌの解凍した全血液それぞれに添加し、すぐに混合した。次いで、２００μｌの結合緩衝液（６Ｍ グアニジン−ＨＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ尿素、３０％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、ｐＨ４．４）を添加し、混合して７０℃で１０分間インキュベートした。２００μｌのイソプロパノールを添加後、混合物を１０秒間、ｖｏｒｔｅｘミキサーで混合し、試料を室温で２０分間インキュベートして前記のように１０秒間再び混合した。磁気の分離は、Boehringer Mannheim 磁石粒子セパレーター（Cat. no. 1641 794)で少なくとも３０秒間行なった。上清を除去し、さらに、下記記載のように分析した。
【００４５】
５００μｌの洗浄緩衝液（２０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５（２５℃）、７０％エタノール）を用いて、１０秒間混合、室温で１分間インキュベートおよび１０秒間再混合、それから磁気粒子セパレーターを用いる管壁での沈殿により磁気粒子を洗浄した。上清を除去して捨てた。洗浄上清が無色になるまで洗浄過程を繰り返した（全５回）。そこで、７０℃で前加熱した各回２００μｌの溶出緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．５）を用いて、１０秒間３回混合し、次いで、再び室温で１０分間インキュベートし、１０分間再混合することにより核酸を溶出した。
【００４６】
上清処理
磁気ガラス粒子に最初に結合した後に得られた上清を、以下のようにして、その核酸含有量を調べた。上清を濾過管（Boehringer Mannheim Cat. no. 1744003、High Pure PCR Product Purification Kitに含まれる) に移し、Eppendorf 卓上遠心機を用いて８０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。フロースルーを捨て、濾過管を各回５００μｌの洗浄緩衝液で２回洗浄した（前記のように再び遠心分離した）。乾燥するまで濾過管を遠心分離し、次いで、遠心分離を繰り返し、７０℃で前加熱した２００μｌの１×溶出緩衝液を２回使用することにより溶出した。
【００４７】
溶出液および試料上清の分析
１０μｌの試料緩衝液を、５０μｌの溶出液および濾過管により処理された上清に添加した。次いで、その４５μｌを、０．８％アガロースゲル、１２０Ｖで９０分間電気泳動により分離した。
【００４８】
溶出液および処理済上清の種々の希釈物を、Ｕｖｉｋｏｎ７１０（Kontron)を用いる２６０ｎｍと２８０ｎｍでの分光光度分析を行なった。
【００４９】
ＥｘｐａｎｄTM Ｌｏｎｇ Ｔｅｍｐｌａｔｅ ＰＣＲ（Boehringer Mannheim Cat. no. 1681834) を使用して、ヒトｔＰＡ遺伝子特異的プライマー（予想増幅長が１５ｋｂ）を用いて溶出液の２つの５μｌのアリコートを試験した。
【００５０】
【表３】
【００５１】
混合液Ｉを、管壁の薄いＰＣＲ管に添加し、次いで、５μｌの溶出液を添加し、次いで、混合液IIを添加した。混合液を短時間混合し、３０μｌのミネラルオイルを液の上部に重層した。以下のプログラムでＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ９６００中、バッチを増幅した：
２分 ９２℃
１０秒 ９２℃
３０秒 ６５℃
１２分 ６８℃ １０サイクル
１０秒 ９２℃
３０秒 ６５℃
１２分＋サイクル当たり２０秒 ６８℃ ２０サイクル
７分 ６８℃
次いで ７℃。
【００５２】
１０μｌの試料緩衝液を、５０μｌのＰＣＲバッチに添加し、次いで、その４５μｌを、０．８％アガロースゲル、１２０Ｖで９０分間電気泳動により分離した。
【００５３】
ｂ．本発明により錠剤化された実施例２の顔料の使用
実施例２の２個の錠剤を、Eppendorf 試験管に添加し、４０μｌのプロテアーゼＫ（２０ｍｇ／ｍｌ）および２００μｌの解凍した全血液（実施例４ａ参照）を添加し、すぐに１０秒間、ｖｏｒｔｅｘミキサーで混合した。２００μｌの３０％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を添加し、１０分間、ｖｏｒｔｅｘミキサーで混合した。次いで、実施例４ａの記載に従って、処理を続けた。
【００５４】
ｃ．比較
通常許容される偏差を考慮して、４ａと４ｂの結果は、第１の溶出工程および増幅能力における両ＤＮＡ収量に関して同一であった。
【００５５】
【発明の効果】
本発明により、試料成分を結合する錠剤型試薬調製物、該調製物を使用する核酸の結合方法、該調製物を使用する核酸の精製方法、試料中での磁気粒子懸濁物の調製方法および試料中へ磁気粒子を取り込む方法が提供される。
【発明の属する技術分野】
本発明は、試料成分を結合する錠剤型試薬調製物、該調製物を使用する核酸の結合方法、該調製物を使用する核酸の精製方法、試料中での磁気粒子懸濁物の調製方法および試料中へ磁気粒子を取り込む方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
液体試料の分析においてたびたび起こる問題は、分析対象の成分がごく微量でしか存在しないということである。さらに、試料は、測定対象ではなく測定をより不正確にする多くの粒子をも含む。従って、分析対象物を固相に結合させて測定対象でない粒子を液体と共に除去することが好都合である。次いで、単離された分析対象物は、固相において検出可能である。最近、主として管等の反応容器の内壁が固相として用いられている。別の選択は、分析対象物と結合可能なビーズを反応容器に添加することである。ビーズのサイズは、液体とビーズの分離が単純なピペッティングにより行なわれることができるようなサイズである。しかし、最近、分析対象物が磁気粒子に結合し、結合した分析対象物を磁気粒子と共に磁場により周りの液体から分離する持続操作器具が設計されている。分析対象物を結合可能な表面を有する磁気粒子が、提供されている。
【０００３】
これらの磁気粒子を含む試薬調製物は、測定目的の分析対象物を含む液体がピペッティングにより添加される懸濁物の型で提供される。これらのピペッティング工程は、ピペッティング手段と連動して通常見られる偏差を被る。さらに、ピペッティング誤差も原因を突き止めることが困難である。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の目的は、従来技術における欠点を除去した、試料成分を結合する錠剤型試薬調製物を提供することにある。本発明の他の目的は、該調製物を使用する核酸の結合方法を提供することにある。本発明の他の目的は、該調製物を使用する核酸の精製方法を提供することにある。本発明の他の目的は、試料中での磁気粒子懸濁物の調製方法を提供することにある。本発明のさらに他の目的は、試料中へ磁気粒子を取り込む方法を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
すなわち、本発明の要旨は、
（１）試料中の核酸を結合させるための、
−該核酸が本質的に完全に結合可能なガラス様表面を有する多数の磁気粒子、および
−賦形剤、
を含有してなる錠剤型試薬調製物、
（２）該核酸の結合を容易にする添加剤をも含むことを特徴とする前記（１）記載の試薬調製物、
（３）磁気粒子が１００μｍ未満の平均粒径を有することを特徴とする前記（１）または（２）記載の試薬調製物、
（４）錠剤が５ｍｇを越える重量を有することを特徴とする前記（１）〜（３）いずれか記載の試薬調製物、
（５）添加剤がカオトロピック塩であることを特徴とする前記（２）記載の試薬調製物、
（６）前記（１）〜（５）いずれか記載の試薬調製物を用いて、試料中の核酸を結合させる方法、
（７）前記（１）〜（５）いずれか記載の試薬調製物を用いて、試料中の核酸を精製する方法、
（８）下記工程：
−ガラス様表面を有する磁気粒子および溶解可能な賦形剤を含む錠剤を試料に添加する工程、および
−試料中の錠剤を揺動させる工程、
を含む、試料中でのガラス様表面を有する磁気粒子懸濁物の調製方法、
（９）下記工程：
−ガラス様表面を有する磁気粒子を含有する多数の磁気粒子含有錠剤を含むディスペンサーを提供する工程、および
−ディスペンサーを活性化して錠剤を放出する工程、
を含む、試料中へガラス様表面を有する磁気粒子を取り込む方法、
に関する。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明の主題は、成分が本質的に完全に結合可能な表面を有する多数の粒子および賦形剤からなる、錠剤型で試料中の成分を結合させる試薬調製物である。本発明の他の主題は、これらの試薬調製物の使用および磁気懸濁物の調製方法である。
【０００７】
成分は、粒子または分子物質である。これは、具体的には、ウイルスまたは細菌等の細胞、白血球細胞等の単離されたヒトまたは動物細胞、ハプテン、抗原、抗体および核酸等の免疫活性な低分子および高分子化合物をも含む。特に好ましいものは、ＤＮＡまたはＲＮＡ等の核酸である。
【０００８】
本発明において試料とは、例えば、血液、血清、うがい液、尿、脳脊髄液、痰、便、斑紋、骨髄試料等の臨床検体である。試料は、環境分析、食品分析または、細菌培養物、ファージ溶解物およびＰＣＲ等の増幅手段産物等の分子生物学的研究等の領域由来であってもよい。
【０００９】
本発明において錠剤とは、固体の成形体であり、好ましくは円盤状またはほぼ完全球状型であることが望ましい。他の類似の態様も考えられる。この種類の錠剤は、薬剤から通常知られている。錠剤は、５ｍｇを越える一定の重量を有することが好ましい。
【００１０】
磁気粒子は磁石に引きつけられることが可能な物質、すなわち、強磁性または超常磁性物質から作られる粒子である。本発明においては、超常磁性粒子が特に好ましく、とりわけ前帯磁していないものが好ましい。本明細書において前帯磁とは、物質を磁石と接触させて共鳴を増加させる工程をいう。磁性体Ｆｅ3 Ｏ4 またはＦｅ2 Ｏ3 が特に好ましい。しかし、磁気粒子は、（より小さな）磁気粒子を含有する物質を含むとも解釈される。これは、特に、Ｍｅｒｃｋ（Darmstadt 、ドイツ) から購入可能な顔料であるＩｒｉｏｄｉｎ６００を含む。本発明は、１００μｍ未満の平均粒径を有する粒子が特に好ましい。特に好ましい平均粒径は、１０〜６０μｍの範囲である。好ましい粒子分布は、比較的均一であり、特に、１０μｍ以下または６０μｍ以上の粒子をほとんど含まない。この要求を満たす粒子は例えば、国際公開第９０／０６０４５号パンフレットに記載されている。
【００１１】
本発明の必須要素は、成分が結合可能な表面を有する磁気粒子という事実である。この結合は、特異的または比較的非特異的であってもよい。特異的結合は、抗体と抗原、抗体とハプテンまたは相補的核酸等の結合特異的相互作用を利用することにより達成できる。これらの相互作用の組み合わせも可能である。
【００１２】
表面を修飾する公知の方法は、例えば、ストレプトアビジン層で粒子を被覆することである。従って、ビオチンとある種の抗体、ハプテンまたは核酸とのコンジュゲートを介して試料から特異的成分が結合可能な普遍的なマトリックスを生成することが可能である。当業者、特に免疫アッセイの分野出身の者は、かかる態様に精通している。
【００１３】
比較的非特異的結合とは、ガラス様表面と核酸間の相互作用である。ヨウ化ナトリウム存在下、粉末フリントガラスにおけるアガロースゲルからの核酸の結合は、Proc. Natl. Acad. USA 76, 615-619(1979) により公知である。米国特許出願第４，２３３，１６９号明細書に、ガラス部分が核酸と結合可能な磁気粒子が記載されている。
【００１４】
本発明により、測定対象の成分が本質的に完全に磁気粒子に結合することが提供される。当業者は、添加される磁気粒子の量を変えることにより必要量の粒子を容易に決定することができる。本発明によれば、本質的に完全な結合とは、６０％以上の結合を意味し、特に好ましくは試料中に見出される結合対象の成分の９０％以上の結合である。
【００１５】
賦形剤は、本質的に錠剤の形を維持するために、すなわち、磁気粒子を連結して錠剤を形成するために供する。本発明の好ましい賦形剤は、反応が行なわれる試料中で迅速に溶解するものである。好ましい液体試料としては、水溶液が挙げられ、薬剤の製造に通常用いられる賦形剤を使用することができる。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）が特に好ましい。
【００１６】
独国特許出願公開第４４０６１３９号明細書に、作用成分の吸収が改良された磁気貯留薬が記載されている。錠剤は、円盤様磁石を含み、作用成分が数時間以上放出される。The International Journal of Pharmaceutics 119, 47-55(1995)にも薬剤の遅延放出を伴う錠剤が記載されている。
【００１７】
STP Pharmasciences Vol 4, 425-430(1994) には、フェライト含有磁気錠剤およびそのイヌへの投与が記載されている。
【００１８】
さらに、本発明の錠剤は、安定剤も含んでよい。好ましい方法において、Ｄ−マンニット、トレハロースおよびソルビット等の糖が添加される。
【００１９】
驚くべきことに、磁気粒子、特にガラス表面を有するものは、明らかなガラスの加水分解なしに、従って明らかな磁気部分からの鉄の溶出なしに、錠剤型で保存することが可能である。
【００２０】
磁気粒子は、０．１μｍ〜１００μｍの範囲の平均粒径を有するガラス磁石顔料、ポリマー磁気ビーズまたは他の磁気粒子が好ましく、これらは、独国特許第１９５２０３９０号明細書に記載されている。
【００２１】
また、調製物は、成分の結合工程を容易にするために、添加剤を含んでもよい。これは、前記コンジュゲートのような特異性を高める物質のみならず成分の表面への結合が容易になるように試料の性質を変える物質をも含む。核酸を用いた場合、これらは、グアニジニウム ヒドロクロリド、ヨウ化ナトリウム、過塩素酸ナトリウム等のカオトロピズム塩である。この種類のカオトロピズム塩は、Anal. Biochem. 121, 382-387(1982) および独国特許出願公開第３７３４４４２号明細書から公知である。
【００２２】
試薬調製物は、根本的に結合工程を可能ならしめる型に成分を変換する試薬も含んでもよい。これは、核酸を含む細胞等の区画を溶解する試薬を含む。かかる試薬としては、例えば、プロテアーゼＫまたは前記カオトロピズム塩が挙げられる。
【００２３】
また、試薬調製物は、ｐＨ緩衝物質ならびに水素結合、疎水結合およびイオン結合等の結合分離剤ならびに免疫アッセイの成分で公知のような物質の特異的検出試薬または指示薬も含んでよい。
【００２４】
以下の成分が、好ましい錠剤に適していることがわかった。
【００２５】
【表１】
本発明の錠剤は、総量が１００％となるように、不活性な充填剤等の他の成分を含んでもよいのは当然である。割合は、重量パーセントで示す。
【００２７】
錠剤型の本発明の試薬調製物は、錠剤型の他の薬剤に対応して製造することができる。これを行なうために、すべての必須成分を十分混合し、アリコートを錠剤プレスで錠剤化する。このことは、特に、加圧することにより行なわれる。しかし、本発明の錠剤は、成分の混合物を造粒することによっても得られる。この目的のために、一定量の乾燥混合物を溶解液を用いて造粒する。次いで、このように得られた造粒物から液体を再び回収する。一定の粒径は、造粒物をふるいにかけることにより得られる。
【００２８】
これらの製造工程は、錠剤重量の変動率が非常に低く、従って、実施の際に試薬を投与する場合、高い再現性を伴う。そして、誤った投与は低減し、より追跡が容易になる。本発明の錠剤は、磁気粒子が容易にかつ前もって分散可能な限り、好ましくは３０秒未満、特に好ましくは１ないし１０秒未満に迅速に溶解可能であることが望ましい。また、錠剤型は、保存という点に関して好都合である。錠剤ディスペンサーにより、投与は手動で行なうこともできる。懸濁状で起こり、粒子の沈殿により生じる不純物混和は観察されない。
【００２９】
本発明の他の主題は、本発明の試薬調製物を使用する核酸の結合方法である。これを行なうために、試薬調製物を試料に添加し、（１）錠剤の溶解が完了するまで、および（２）核酸を本質的に完全に表面に結合させるまでインキュベートする。所望ならば、錠剤を機械的に動かすことが可能である。このことにより、錠剤の溶解速度および成分の結合速度が上昇する。
【００３０】
本発明の他の主題は、本発明の試薬調製物を使用する核酸の精製方法である。これを行なうために、磁気粒子およびそれに結合した核酸を周りの試料液体から分離する。このことは、磁場を適用して磁気粒子を容器中または装置の一定の部位に留め、次いで、ピペッティングまたは排除等により試料液体を除去し、所望ならば、別の液体を用いる洗浄工程を１ないし数回行なうという点で有意に成される。所望ならば、適当な条件を適用した場合、結合した核酸を磁気粒子から再び分離することができる。ガラス様表面の場合、これらは低塩条件、すなわち、溶離液の塩濃度が１００ｍｍｏｌ／ｌ未満である。
【００３１】
本発明の他の主題は、磁気粒子および溶解可能な賦形剤を含む錠剤を試料に添加する工程および好ましくは可動性磁場を用いる試料中で錠剤を揺動する工程からなる、試料中で磁気粒子懸濁物を調製する方法である。磁場は、磁気粒子が持続的に動くように、試料に近接した磁石を前後に動かすように移動させることができる。しかし、錠剤および磁気粒子を有する試料を含む容器を磁石の方へ移動させることも可能である。
【００３２】
本発明のさらに他の主題は、多数の磁気粒子含有錠剤を含むディスペンサーを提供する工程およびディスペンサーを活性化して錠剤を放出させる工程からなる試料中へ磁気粒子を取り込む方法である。錠剤を提供するディスペンサーは、錠剤型の薬剤を投与する際に通常用いられるものである。本発明の方法では、かかるディスペンサーを、投与手段により手動で用いることができる。試料当たり１つの錠剤のみを放出させる必要は必ずしもない。また、試料に対して予定された使用により、例えば、２〜１０個の間の一定の数の錠剤を放出することも可能である。
【００３３】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例によりなんら限定されるものではない。
【００３４】
実施例１
ガラス磁石顔料の調製
２５０ｍｌの丸底フラスコで、下記指示を守って、定常攪拌下、溶液（ＳｉＯ2 ：Ｂ2 Ｏ3 ＝７：３）を調製した。
８６．６ｍｌ テトラエチルオルトシリケート
＋７ｍｌ 無水非変性エタノール
＋１４．１ｍｌ ０．１５Ｍ ＨＣｌ。
【００３５】
二相の混合物が得られ、一相になるまで室温で攪拌した。次いで、３７．８ｍｌのトリメチルボレートを滴下した。次いで、溶液を２時間、５０℃の温度で保温した。次いで、１４．１ｍｌの０．１５Ｍ ＨＣｌを添加した。
【００３６】
成熟させた後、２２．５ｇのＩｒｉｏｄｉｎ６００（黒雲母、Merck, Darmstadt, ドイツ) を、攪拌下、１５０ｍｌの溶液に添加し、次いで噴霧−乾燥機（Buchi 190, Mini Spray Dryer)で被覆した。
【００３７】
次いで、噴霧−乾燥過程で得られた粉末を、窒素雰囲気下、温度処理に供した。加熱速度は、１Ｋ／分であり、成形温度での滞留時間は、２時間であった。成形後、追送処理の温度まで温度を下げ、窒素雰囲気を大気と置換し、追送処理後、粉末を室温まで冷却した。形成可能な凝集物を、５０μｍのふるいにかけることにより除去した。
【００３８】
【表２】
実施例２
錠剤生産
前混合過程
４３．６２ｇのガラス磁石顔料ＧＭＰ２を、５００ｇのグアニジニウム ヒドロクロリドと混合し、ＧＬＡ−ＯＲＶ Ｆｒｅｗｉｔｔふるい機を用いて０．２ｍｍのふるいにかけた。収量は、５３６．４ｇであり、９８．７％の収率に相当する。
【００４０】
造粒化
０．６７４ｇのＴｒｉｓ−ＨＣｌと０．２５９ｇの尿素を、２．２ｍｌの再留水に溶解した。次いで、２６６．４ｇの前混合物と共に溶液を造粒した。全部で７ｍｌの再留水を添加した。得られた造粒物を、２４時間かけて室温で真空乾燥させた後、０．６ｍｍのふるいにかけた。
【００４１】
錠剤化
２４６．９８ｇの造粒物を、７．４１ｇの噴霧−硬化ＰＥＧ６０００と混合し、５ｍｍの打ち抜き型を有するＫｏｒｓｃｈ ＰＨ１０６錠剤プレスで錠剤化した。収量は、１８６．６３ｇすなわち２９０２錠であった。錠剤は、６４．３２ｍｇの重量を有し、１．５ｋｐの硬度を有し、室温で蒸留水中の溶解時間は６秒であり、０．８％の磨耗率であり、２．７７ｍｍの高さを有していた。
【００４２】
錠剤機と打ち抜き型は、洗浄が容易であり、打ち抜き型の底は光沢を保ち、打ち抜き型は何も被覆されていなかった。大部分は、幾分ゆっくり通り抜け、最小の技術手段により有意に改良された４．６５％のＣＶ値の重量となった。
【００４３】
実施例３
保存
実施例２の１０個の錠剤を、重量を測定し、開放したガラス容器に添加し、室温で約５０％ｒＦの実験室で、開放したまま保存した。４週間重量をモニターした。重量変化はなかった。
【００４４】
実施例４
ａ．磁気ガラス粒子を用いるヒト全血液からのＰＣＲ試料調製
核酸の単離
１０ｍｇのガラス磁石粒子ＧＭＰ２を、Eppendorf 試験管で調製した。４０μｌのプロテアーゼＫ（２０ｍｇ／ｍｌ、凍結乾燥品から得られたもの）を、２００μｌの解凍した全血液それぞれに添加し、すぐに混合した。次いで、２００μｌの結合緩衝液（６Ｍ グアニジン−ＨＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ尿素、３０％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、ｐＨ４．４）を添加し、混合して７０℃で１０分間インキュベートした。２００μｌのイソプロパノールを添加後、混合物を１０秒間、ｖｏｒｔｅｘミキサーで混合し、試料を室温で２０分間インキュベートして前記のように１０秒間再び混合した。磁気の分離は、Boehringer Mannheim 磁石粒子セパレーター（Cat. no. 1641 794)で少なくとも３０秒間行なった。上清を除去し、さらに、下記記載のように分析した。
【００４５】
５００μｌの洗浄緩衝液（２０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５（２５℃）、７０％エタノール）を用いて、１０秒間混合、室温で１分間インキュベートおよび１０秒間再混合、それから磁気粒子セパレーターを用いる管壁での沈殿により磁気粒子を洗浄した。上清を除去して捨てた。洗浄上清が無色になるまで洗浄過程を繰り返した（全５回）。そこで、７０℃で前加熱した各回２００μｌの溶出緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．５）を用いて、１０秒間３回混合し、次いで、再び室温で１０分間インキュベートし、１０分間再混合することにより核酸を溶出した。
【００４６】
上清処理
磁気ガラス粒子に最初に結合した後に得られた上清を、以下のようにして、その核酸含有量を調べた。上清を濾過管（Boehringer Mannheim Cat. no. 1744003、High Pure PCR Product Purification Kitに含まれる) に移し、Eppendorf 卓上遠心機を用いて８０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。フロースルーを捨て、濾過管を各回５００μｌの洗浄緩衝液で２回洗浄した（前記のように再び遠心分離した）。乾燥するまで濾過管を遠心分離し、次いで、遠心分離を繰り返し、７０℃で前加熱した２００μｌの１×溶出緩衝液を２回使用することにより溶出した。
【００４７】
溶出液および試料上清の分析
１０μｌの試料緩衝液を、５０μｌの溶出液および濾過管により処理された上清に添加した。次いで、その４５μｌを、０．８％アガロースゲル、１２０Ｖで９０分間電気泳動により分離した。
【００４８】
溶出液および処理済上清の種々の希釈物を、Ｕｖｉｋｏｎ７１０（Kontron)を用いる２６０ｎｍと２８０ｎｍでの分光光度分析を行なった。
【００４９】
ＥｘｐａｎｄTM Ｌｏｎｇ Ｔｅｍｐｌａｔｅ ＰＣＲ（Boehringer Mannheim Cat. no. 1681834) を使用して、ヒトｔＰＡ遺伝子特異的プライマー（予想増幅長が１５ｋｂ）を用いて溶出液の２つの５μｌのアリコートを試験した。
【００５０】
【表３】
混合液Ｉを、管壁の薄いＰＣＲ管に添加し、次いで、５μｌの溶出液を添加し、次いで、混合液IIを添加した。混合液を短時間混合し、３０μｌのミネラルオイルを液の上部に重層した。以下のプログラムでＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ９６００中、バッチを増幅した：
２分 ９２℃
１０秒 ９２℃
３０秒 ６５℃
１２分 ６８℃ １０サイクル
１０秒 ９２℃
３０秒 ６５℃
１２分＋サイクル当たり２０秒 ６８℃ ２０サイクル
７分 ６８℃
次いで ７℃。
【００５２】
１０μｌの試料緩衝液を、５０μｌのＰＣＲバッチに添加し、次いで、その４５μｌを、０．８％アガロースゲル、１２０Ｖで９０分間電気泳動により分離した。
【００５３】
ｂ．本発明により錠剤化された実施例２の顔料の使用
実施例２の２個の錠剤を、Eppendorf 試験管に添加し、４０μｌのプロテアーゼＫ（２０ｍｇ／ｍｌ）および２００μｌの解凍した全血液（実施例４ａ参照）を添加し、すぐに１０秒間、ｖｏｒｔｅｘミキサーで混合した。２００μｌの３０％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を添加し、１０分間、ｖｏｒｔｅｘミキサーで混合した。次いで、実施例４ａの記載に従って、処理を続けた。
【００５４】
ｃ．比較
通常許容される偏差を考慮して、４ａと４ｂの結果は、第１の溶出工程および増幅能力における両ＤＮＡ収量に関して同一であった。
【００５５】
【発明の効果】
本発明により、試料成分を結合する錠剤型試薬調製物、該調製物を使用する核酸の結合方法、該調製物を使用する核酸の精製方法、試料中での磁気粒子懸濁物の調製方法および試料中へ磁気粒子を取り込む方法が提供される。
Claims (9)
- 試料中の核酸を結合させるための、
−該核酸が本質的に完全に結合可能なガラス様表面を有する多数の磁気粒子、および
−賦形剤、
を含有してなる錠剤型試薬調製物。 - 該核酸の結合を容易にする添加剤をも含むことを特徴とする請求項１記載の試薬調製物。
- 磁気粒子が１００μｍ未満の平均粒径を有することを特徴とする請求項１または２記載の試薬調製物。
- 錠剤が５ｍｇを越える重量を有することを特徴とする請求項１〜３いずれか記載の試薬調製物。
- 添加剤がカオトロピック塩であることを特徴とする請求項２記載の試薬調製物。
- 請求項１〜５いずれか記載の試薬調製物を用いて、試料中の核酸を結合させる方法。
- 請求項１〜５いずれか記載の試薬調製物を用いて、試料中の核酸を精製する方法。
- 下記工程：
−ガラス様表面を有する磁気粒子および溶解可能な賦形剤を含む錠剤を試料に添加する工程、および
−試料中の錠剤を揺動させる工程、
を含む、試料中でのガラス様表面を有する磁気粒子懸濁物の調製方法。 - 下記工程：
−ガラス様表面を有する磁気粒子を含有する多数の磁気粒子含有錠剤を含むディスペンサーを提供する工程、および
−ディスペンサーを活性化して錠剤を放出する工程、
を含む、試料中へガラス様表面を有する磁気粒子を取り込む方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19622885A DE19622885A1 (de) | 1996-06-07 | 1996-06-07 | Reagenzzubereitung enthaltend magnetische Partikel in Form einer Tablette |
| DE19622885.9 | 1996-06-07 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1062422A JPH1062422A (ja) | 1998-03-06 |
| JP3821541B2 true JP3821541B2 (ja) | 2006-09-13 |
Family
ID=7796390
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP16504297A Expired - Lifetime JP3821541B2 (ja) | 1996-06-07 | 1997-06-05 | 錠剤型磁気粒子含有試薬調製物 |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US6274386B1 (ja) |
| EP (1) | EP0811694B1 (ja) |
| JP (1) | JP3821541B2 (ja) |
| KR (1) | KR100260326B1 (ja) |
| AT (1) | ATE234366T1 (ja) |
| AU (1) | AU715803B2 (ja) |
| CA (1) | CA2206760C (ja) |
| DE (2) | DE19622885A1 (ja) |
| DK (1) | DK0811694T3 (ja) |
| ES (1) | ES2195053T3 (ja) |
| IL (1) | IL121008A (ja) |
Families Citing this family (29)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE19520398B4 (de) * | 1995-06-08 | 2009-04-16 | Roche Diagnostics Gmbh | Magnetisches Pigment |
| KR100463475B1 (ko) | 1995-06-08 | 2005-06-22 | 로셰 디아그노스틱스 게엠베하 | 자기성피그먼트 |
| DE19743518A1 (de) * | 1997-10-01 | 1999-04-15 | Roche Diagnostics Gmbh | Automatisierbare universell anwendbare Probenvorbereitungsmethode |
| ATE426456T1 (de) | 1998-05-01 | 2009-04-15 | Gen Probe Inc | Automatische diagnostische analysevorrichtung |
| US8337753B2 (en) | 1998-05-01 | 2012-12-25 | Gen-Probe Incorporated | Temperature-controlled incubator having a receptacle mixing mechanism |
| DE19836559A1 (de) | 1998-08-12 | 2000-03-23 | Antigen Gmbh | Gefäß zur Entnahme von Blut |
| ATE248911T1 (de) | 1998-11-30 | 2003-09-15 | Roche Diagnostics Gmbh | Magnetische partikel zur reinigung von nukleinsäuren |
| DE60025529T2 (de) * | 1999-11-17 | 2006-08-24 | Roche Diagnostics Gmbh | Magnetische glasteilchen, herstellungsverfahren und benutzung |
| WO2001057247A2 (de) * | 2000-02-04 | 2001-08-09 | Qiagen Gmbh | Nukleinsäure-isolierung aus stuhlproben und anderen biologischen materialien, die reich an inhibitoren sind |
| DE10006662A1 (de) * | 2000-02-15 | 2001-08-23 | Antigen Produktions Gmbh | Gefäß zur Nukleinsäureanalytik |
| KR20030011796A (ko) * | 2000-03-17 | 2003-02-11 | 하. 룬트벡 아크티에 셀스카브 | 시약의 투약 형태, 유기 화학 합성에서 상기 투약 형태의사용, 및 상기 투약 형태의 제조 |
| CA2402584A1 (en) * | 2000-03-17 | 2001-09-20 | H. Lundbeck A/S | Dosing form for a polymer support, use of said dosing form in organic chemical synthesis and method for production of said dosing form |
| US6602718B1 (en) | 2000-11-08 | 2003-08-05 | Becton, Dickinson And Company | Method and device for collecting and stabilizing a biological sample |
| AU2003219759B2 (en) * | 2002-02-14 | 2011-01-20 | Veridex, Llc | Methods and algorithms for cell enumeration in a low-cost cytometer |
| US9267167B2 (en) | 2004-06-28 | 2016-02-23 | Becton, Dickinson And Company | Dissolvable films and methods including the same |
| US20080070308A1 (en) * | 2004-06-28 | 2008-03-20 | Thomas Ruhland | Portous Article For Delivering Chemical Substances |
| US8189899B2 (en) * | 2004-07-30 | 2012-05-29 | Veridex, Llc | Methods and algorithms for cell enumeration in a low-cost cytometer |
| KR100850430B1 (ko) * | 2006-12-11 | 2008-08-05 | (주)바이오니아 | 입자상 물질을 사용하는 핵산 분리 방법 및 핵산 분리용조성물 |
| EP2143496A1 (en) * | 2008-07-09 | 2010-01-13 | F. Hoffmann-Roche AG | Lysis reagent formulation containing magnetic particles in tablet form |
| TW201113523A (en) * | 2009-08-31 | 2011-04-16 | Mbio Diagnostics Inc | Integrated sample preparation and analyte detection |
| TWI407994B (zh) | 2009-10-22 | 2013-09-11 | Ind Tech Res Inst | 分離核酸的方法、試劑及套組 |
| CN111757934A (zh) | 2017-12-21 | 2020-10-09 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 通过单向双重探针引物延伸的靶标富集 |
| JP7096893B2 (ja) | 2018-02-05 | 2022-07-06 | エフ．ホフマン－ラ ロシュ アーゲー | 単一分子のための一本鎖環状ｄｎａ鋳型の作製 |
| EP4230748A1 (en) | 2018-03-02 | 2023-08-23 | F. Hoffmann-La Roche AG | Generation of double-stranded dna templates for single molecule sequencing |
| EP3853362A1 (en) | 2018-09-21 | 2021-07-28 | F. Hoffmann-La Roche AG | System and method for modular and combinatorial nucleic acid sample preparation for sequencing |
| EP4031679A1 (en) | 2019-09-20 | 2022-07-27 | F. Hoffmann-La Roche AG | Immune repertoire profiling by primer extension target enrichment |
| US20240279725A1 (en) | 2020-07-08 | 2024-08-22 | Roche Sequencing Solutions, Inc. | Targeted depletion of non-target library molecules using poison primers during target capture of next-generation sequencing libraries |
| US20220177950A1 (en) | 2020-12-03 | 2022-06-09 | Roche Sequencing Solutions, Inc. | Whole transcriptome analysis in single cells |
| WO2024013241A1 (en) | 2022-07-14 | 2024-01-18 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Variant allele enrichment by unidirectional dual probe primer extension |
Family Cites Families (20)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3981776A (en) * | 1967-02-16 | 1976-09-21 | Rolf Saxholm | Magnetically responsive, biologically active substance and associated methods and apparatus |
| US4169804A (en) * | 1976-08-19 | 1979-10-02 | Minnesota Mining And Manufacturing Company | Magnetically responsive composite microparticle |
| US4115534A (en) * | 1976-08-19 | 1978-09-19 | Minnesota Mining And Manufacturing Company | In vitro diagnostic test |
| US4233169A (en) * | 1979-04-13 | 1980-11-11 | Corning Glass Works | Porous magnetic glass structure |
| US4343901A (en) | 1980-10-22 | 1982-08-10 | Uop Inc. | Magnetic support matrix for enzyme immobilization |
| US4483920A (en) * | 1982-05-17 | 1984-11-20 | Hahnemann University | Immobilization of message RNA directly from cells onto filter material |
| US4735796A (en) * | 1983-12-08 | 1988-04-05 | Gordon Robert T | Ferromagnetic, diamagnetic or paramagnetic particles useful in the diagnosis and treatment of disease |
| US5746999A (en) * | 1984-11-23 | 1998-05-05 | Schering Aktiengesellschaft | Magnetic particles for diagnostic purposes |
| US5597531A (en) * | 1985-10-04 | 1997-01-28 | Immunivest Corporation | Resuspendable coated magnetic particles and stable magnetic particle suspensions |
| US5009994A (en) * | 1986-03-24 | 1991-04-23 | Em Diagnostic Systems, Inc. | Particles containing mannitol suitable for tabletting into diagnostic reagents |
| US4820627A (en) * | 1986-03-24 | 1989-04-11 | Em Diagnostic Systems, Inc. | Method of preparing particles suitable for tabletting into diagnostic reagents |
| US4712310A (en) * | 1986-09-15 | 1987-12-15 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Co-spray technique |
| DK269889A (da) * | 1988-06-06 | 1989-12-07 | Photest Diagnostics Inc | Heterogen immunoassay |
| US5512439A (en) * | 1988-11-21 | 1996-04-30 | Dynal As | Oligonucleotide-linked magnetic particles and uses thereof |
| CA2003508C (en) * | 1988-11-21 | 2000-01-25 | Erik Hornes | Monodisperse superparamagnetic particles for use in nucleic acid analyses |
| US5234809A (en) * | 1989-03-23 | 1993-08-10 | Akzo N.V. | Process for isolating nucleic acid |
| JPH04323560A (ja) * | 1991-04-22 | 1992-11-12 | Nippon Telegr & Teleph Corp <Ntt> | レーザ磁気免疫測定に用いられる磁性微粒子標識材料並びに検体調整方法 |
| DE4406139A1 (de) * | 1994-02-25 | 1995-08-31 | Matthias Werner | Magnetische Depotarzneimittel für die perorale Applikation mit verbesserter Resorption der Wirkstoffe |
| US5593824A (en) * | 1994-09-02 | 1997-01-14 | Pharmacia Biotech, Inc. | Biological reagent spheres |
| DE19520398B4 (de) * | 1995-06-08 | 2009-04-16 | Roche Diagnostics Gmbh | Magnetisches Pigment |
-
1996
- 1996-06-07 DE DE19622885A patent/DE19622885A1/de not_active Withdrawn
-
1997
- 1997-05-29 AU AU23705/97A patent/AU715803B2/en not_active Ceased
- 1997-06-04 CA CA002206760A patent/CA2206760C/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-06-05 JP JP16504297A patent/JP3821541B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1997-06-05 IL IL12100897A patent/IL121008A/en not_active IP Right Cessation
- 1997-06-06 DE DE59709467T patent/DE59709467D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1997-06-06 US US08/870,385 patent/US6274386B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-06-06 ES ES97109177T patent/ES2195053T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1997-06-06 DK DK97109177T patent/DK0811694T3/da active
- 1997-06-06 AT AT97109177T patent/ATE234366T1/de active
- 1997-06-06 EP EP97109177A patent/EP0811694B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1997-06-07 KR KR1019970023487A patent/KR100260326B1/ko not_active IP Right Cessation
-
2001
- 2001-06-29 US US09/893,533 patent/US6746874B2/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE59709467D1 (de) | 2003-04-17 |
| KR100260326B1 (ko) | 2003-03-15 |
| AU715803B2 (en) | 2000-02-10 |
| AU2370597A (en) | 1997-12-11 |
| DK0811694T3 (da) | 2003-07-14 |
| DE19622885A1 (de) | 1997-12-11 |
| KR980003584A (ko) | 1998-03-30 |
| IL121008A (en) | 2001-08-08 |
| IL121008A0 (en) | 1997-11-20 |
| CA2206760C (en) | 2003-08-19 |
| US6746874B2 (en) | 2004-06-08 |
| JPH1062422A (ja) | 1998-03-06 |
| ES2195053T3 (es) | 2003-12-01 |
| ATE234366T1 (de) | 2003-03-15 |
| CA2206760A1 (en) | 1997-12-07 |
| EP0811694A2 (de) | 1997-12-10 |
| US20010046714A1 (en) | 2001-11-29 |
| US6274386B1 (en) | 2001-08-14 |
| EP0811694A3 (de) | 1999-01-13 |
| EP0811694B1 (de) | 2003-03-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP3821541B2 (ja) | 錠剤型磁気粒子含有試薬調製物 | |
| JP2536995B2 (ja) | 酵素固定法 | |
| EP0688429B1 (en) | Macromolecular microparticles and methods of production | |
| EP0837871B1 (de) | Magnetisches pigment | |
| RU2160154C2 (ru) | Магнитные полимерные частицы на основе поливинилового спирта, способ их получения | |
| JP5656339B2 (ja) | タンパク質固定化担体およびその製造方法 | |
| AU2001260507B2 (en) | Nucleic acid isolation | |
| ES2226869T3 (es) | Composicion a base de particulas magneticas. | |
| CN101627065A (zh) | 颗粒和其在分离核酸的方法或分离磷蛋白的方法中的应用 | |
| KR100463475B1 (ko) | 자기성피그먼트 | |
| JP2002507116A (ja) | 固体相核酸の単離 | |
| JPH0560759A (ja) | スクシンイミド含有ポリマー由来の生物学的活性試薬の製造方法及びそれを含んでなる分析要素並びにその用途 | |
| EP2706354A1 (en) | Multifunctionalized materials | |
| JP2001514192A (ja) | カチオンナノ粒子を使用した、水性系からのアニオン有機物質の単離方法 | |
| CN110088282A (zh) | 用磁性颗粒分离高纯度核酸的方法 | |
| JP2003528181A (ja) | 磁性シラン化ポリビニルアルコール系キャリア材料 | |
| KR101402390B1 (ko) | 생체 기능화된 자성 나노입자 및 이를 이용한 핵산의 분리방법 | |
| Shin et al. | Patterns of strongly protein-associated simian virus 40 DNA replication intermediates resulting from exposures to specific topoisomerase poisons | |
| US20100173353A1 (en) | Lysis Reagent Formulation | |
| Kubinski et al. | Interactions of nucleic acids and cellular membranes: behavior of membranes in CsCl density gradients | |
| JP2004201648A (ja) | 遺伝子のスクリーニング方法 | |
| JPWO2005095969A1 (ja) | 反応性色素結合磁性粒子及びタンパク質分離精製法 | |
| US7332352B2 (en) | Separation particles | |
| Saiyed et al. | Advancement in the field of magnetic fluids for drug discovery, medicine and biotechnology | |
| JPS6339895A (ja) | 液体支持体を用いるバイオアフイニテイ−およびイオン交換分離 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20040216 |
|
| A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20050525 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20050530 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20050826 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20060613 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20060620 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100630 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100630 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110630 Year of fee payment: 5 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120630 Year of fee payment: 6 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130630 Year of fee payment: 7 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |