ES2226869T3 - Composicion a base de particulas magneticas. - Google Patents

Composicion a base de particulas magneticas.

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Abstract

Composición de partículas magnéticas que consiste en un material magnético combinado con un intercambiador de iones cargado negativamente, en la cual las partículas presentan un diámetro entre 20 m (micras) y 1 mm y donde la composición se forma por medio de mezclado de un polvo de un material magnético con un polvo de un intercambiador de iones cargado negativamente.

Description

Composición a base de partículas magnéticas.
La presente invención se refiere a un procedimiento para la fabricación de partículas magnéticas y paramagnéticas que se pueden utilizar en la separación de biomoléculas o compuestos en volúmenes desde la escala de laboratorio hasta la industrial.
Para separar biomoléculas como ácidos nucleicos de mezclas que las contienen se conoce la utilización de partículas magnéticas que se recubren con un revestimiento que se fijará a la biomolécula que se quiere separar. Las partículas se añaden a continuación a la mezcla y las partículas fijadas a las biomoléculas se pueden separar utilizando un campo magnético.
Las partículas magnéticas o perlas deben ser de un tamaño que permita que permanezcan en suspensión en los líquidos que se utilizan. Sin embargo si son demasiado pequeñas o contienen finos u otras partículas similares pueden permanecer en suspensión y ser demasiado lentas de separar.
Procedimientos conocidos para la fabricación de partículas magnéticas y paramagnéticas comprenden:
1) Incorporar magnetita (óxido de hierro Fe_{3}O_{4}) dentro de agarosa o celulosa porosa seguido de trituración o cribado para obtener un campo de diámetros de partículas, normalmente de 1 a 10 micras.
2) Incorporar magnetita dentro de sílice seguido por triturado o cribado para obtener un campo de diámetros de partículas, normalmente de 1 a 10 \mum (micras).
3) Producir magnetita menor que 10 \mum (micras) por precipitación de sales de hierro, seguido por revestimiento de superficie con un silano u otro grupo funcional.
4) Revestir una perla de poliestireno monodisperso menor que 10 \mum (micras) con óxido de hierro submicrónico, seguido por otro revestimiento de poliestireno con o sin grupos funcionales.
5) Precipitación interna de óxido de hierro en una perla de poliestireno monodisperso (menor que 10 micras) seguida de revestimiento de superficie con grupos funcionales.
Típicamente, las perlas magnéticas presentan un diámetro menor que 10 \mum (micras) pues en caso contrario sus tasas de sedimentación son demasiado elevadas bajo gravedad para una manipulación sencilla y el área de superficie demasiado pequeña para enlazar la cantidad deseada de la molécula objetivo. Algunas perlas mayores como las de agarosa-magnetita pueden ser de hasta 100 \mum (micras) pero depende de que sean muy porosas para ligar internamente las moléculas objetivo y se separan por efecto de la gravedad de forma extremadamente rápida.
Las patentes US 4.695.392 y US 5.091.206, WO 96/18731, EP 515484B1 describen procedimientos para la formación y la utilización de dichas partículas magnéticas.
DE 196 24 426 A describe partículas magnéticas estratificadas para la administración a pacientes para el diagnóstico o tratamiento de tumores. Las partículas presentan diámetros entre 200 y 500 nm.
Hemos probado partículas magnéticas mejoradas y un procedimiento para su fabricación.
Según la presente invención se proporciona una composición de partículas magnéticas que comprende un material magnético combinado con un intercambiador de iones cargado negativamente como se define en la reivindicación 1.
La presente invención proporciona también un procedimiento para la formación de una composición de partículas magnéticas que comprende poner en contacto un material magnético con un intercambiador de iones cargado negativamente como se define en la reivindicación 13.
Los materiales magnéticos preferiblemente presentan un diámetro menor que diez micras y más preferiblemente que cinco micras o menos.
El material magnético puede ser cualquiera de los materiales magnéticos utilizados convencionalmente como magnetita, óxidos de hierro, óxidos de metal de transición o cualquier material ferromagnético o paramagnético.
El intercambiador de iones puede ser poroso o no poroso y los intercambiadores de iones que se pueden utilizar comprenden intercambiadores de iones de polimetacrilato carboxilo, partículas de sílice revestidas con una carga negativa, celulosa o agarosa con grupos fosfato o sulfato o cualquier sustancia cargada negativamente.
El intercambiador de iones se puede fijar directamente al material magnético por ejemplo solamente por carga o se puede fijar utilizando un agente aglutinante como ácido acrílico polimerizado, o cualquier agente que forma un revestimiento o recubrimiento de superficie ayuda en la cohesión de los materiales. La partícula se puede todavía derivar con grupos funcionales como carboxilo, amina, amidazol, etc.
La composición se puede formar directamente por mezclado de los componentes en forma de polvo o por premezcla en soluciones acuosas o no acuosas con o sin el agente aglutinante.
Las composiciones de la presente invención, es decir el material magnético combinado con el intercambiador de iones, presentan preferiblemente un diámetro desde 20 \mum (micras) hasta 1 mm y más preferiblemente son de 20 a 150 \mum (micras) de diámetro.
La relación de partículas magnéticas a intercambiador de iones no es crítica y puede variar según la aplicación, siendo relaciones típicas desde 5 a 50% en peso de óxido de hierro.
Preferiblemente una suspensión de la composición de partículas de la presente invención en un líquido que contiene el material a separar se puede tratar en sistemas convencionales de tratamiento y dispensación de fluidos.
Una característica de la presente invención es que las composiciones de partículas proporcionan una separación magnética o sedimentación por gravedad más rápida en grandes volúmenes sin finos residuales o partículas que permanecen en suspensión. Las partículas mayores, por ejemplo de 20 a 150 micras, permanecen también en suspensión durante más tiempo en comparación con otras perlas magnéticas de tamaño similar realizadas a partir de otros materiales conservando de esta forma cinéticas efectivas de mezclado y enlace.
Las partículas se pueden mantener en suspensión para el dispensado con mínima agitación y pueden pasar también preferiblemente a través de puntas de pipeta estándar.
Las composiciones de la presente invención se pueden utilizar para separar biomoléculas de mezclas que las contienen, por ejemplo se pueden utilizar para separar ácidos nucleicos y para purificar soluciones o suspensiones por medio de la eliminación de impurezas como desechos celulares, etc.
Cuando las composiciones se van a utilizar para separar una biomolécula de un líquido que contiene la biomolécula la composición de partículas se pone en contacto con un agente aglutinante para la biomolécula, por ejemplo las biomoléculas biotiniladas se pueden aislar utilizando partículas magnéticas revestidas con estreptavidina.
La presente invención proporciona también un procedimiento para separar biomoléculas de mezclas que las contienen como se define en la reivindicación 25, comprendiendo dicho procedimiento hacer entrar en contacto una suspensión líquida de la biomolécula con la composición de partículas magnéticas como se ha descrito anteriormente para formar una suspensión de la composición de partículas magnéticas en la cual las partículas magnéticas se fijan a la biomolécula y aplicar un campo magnético a la suspensión para separar las partículas magnéticas con la biomolécula fijada a las mismas.
La biomolécula se puede separar de las partículas magnéticas por medios convencionales.
El procedimiento de la presente invención se puede utilizar para eliminar desechos celulares o material insoluble sin centrifugado o filtrado.
Por ejemplo, en la eliminación de desechos celulares de una extracción de ADN microbiano, de plásmido o de planta, las partículas se pueden utilizar para eliminar rápidamente contaminantes no deseados dejando el ADN de objetivo en solución.
La presente invención se describe con mayor profundidad en los siguientes ejemplos.
Ejemplo 1
6 gramos de un intercambiador de iones de polimetacrilato carboxilo granular poroso (100-500 malla) se mezclaron con 2 gramos de magnetita (Fe_{3}O_{4}) de 5 \mum (micras) de diámetro o menos. Este material se mojó a continuación con 2% Tween 20 con 1M de cloruro sódico y se utilizó para extraer ADN de sangre, por ejemplo: se mezclaron 100 mg de las perlas magnéticas anteriormente descritas con 1 ml de sangre completa diluida previamente en 10 mM de bicarbonato de amonio, 1% Tween 20, pH 9. El ADN fijado se limpió de contaminantes con agua y se eluyó utilizando Tris pH 9 a 80ºC.
Ejemplo 2
6 gramos de un intercambiador de iones de polimetacrilato carboxilo granular poroso (100-500 malla) se mezclaron con 2 gramos de magnetita (Fe_{3}O_{4}) de menos de 5 \mum (micras) de diámetro. Este material se mezcló a continuación con 50 ml de 2% en volumen de ácido acrílico, 2% persulfato de amonio y se calentó a 70ºC durante 30 minutos. Este material se lavó a continuación en detergentes y sales y se utilizó para extraer ADN de sangre como arriba se ha descrito.
Ejemplo 3
6 gramos de un intercambiador de iones de polimetacrilato carboxilo granular poroso (100-500 malla) se mezclaron con 2 gramos de magnetita (Fe_{3}O_{4}) de menos de 5 \mum (micras) de diámetro. Este material se mezcló a continuación con 50 ml de 2% en volumen de ácido acrílico, 2% persulfato de amonio más 0,02% de divinilo benceno y se calentó a 70ºC durante 30 minutos.
Ejemplo 4
Se preparó un cultivo de un día de E.coli conteniendo un plásmido de alto número de copia. 1 ml de este cultivo se ajustó a 0,1M NaOH con 1% SDS y se mezcló suavemente durante 5 minutos. A continuación se añadieron las partículas magnéticas como se ha descrito para el ejemplo 1 y la suspensión se ajustó a 1M acetato de potasio pH 5,5. Después de la separación magnética se quitó todo el desecho insoluble en menos de 1 minuto dejando un sobrenadante aclarado conteniendo ADN de plásmido preparado para procesado posterior.

Claims (29)

1. Composición de partículas magnéticas que consiste en un material magnético combinado con un intercambiador de iones cargado negativamente, en la cual las partículas presentan un diámetro entre 20 \mum (micras) y 1 mm y donde la composición se forma por medio de mezclado de un polvo de un material magnético con un polvo de un intercambiador de iones cargado negativamente.
2. Composición de partículas magnéticas de la reivindicación 1, donde las partículas presentan un diámetro entre 20 y 150 \mum (micras).
3. Composición de partículas magnéticas de la reivindicación 1, donde el mezclado tiene lugar en presencia de un agente aglutinante.
4. Composición de partículas magnéticas según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el material magnético son partículas con un diámetro menor que 10 \mum (micras).
5. Composición de partículas magnéticas de la reivindicación 4, donde el material magnético son partículas con un diámetro menor que 5 \mum (micras).
6. Composición de partículas magnéticas de la reivindicación 5, donde el material magnético son partículas con un diámetro menor que 1 \mum (micra).
7. Composición de partículas magnéticas según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el intercambiador de iones es no poroso.
8. Composición de partículas magnéticas según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el intercambiador de iones es un intercambiador de iones de polimetacrilato carboxilo.
9. Composición de partículas magnéticas según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el intercambiador de iones se fija directamente al material magnético.
10. Composición de partículas magnéticas según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde las partículas se forman en presencia de un agente aglutinante.
11. Composición de partículas magnéticas según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el aglutinante es un monómero o un polímero de ácido acrílico, una acroleína, una amina, una amida, un alcohol, un aldehído, un ácido orgánico, un amidazol, un fosfato, o una amina o sulfato secundario, terciario o cuaternario.
12. Composición de partículas magnéticas según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la relación de material magnético respecto a intercambiador de iones es desde 0,05 a 0,2.
13. Procedimiento para la formación de una composición de partículas magnéticas que consiste en un material magnético combinado con un intercambiador de iones cargado negativamente, donde las partículas presentan un diámetro entre 20 \mum (micras) y 1 mm, comprendiendo el procedimiento el mezclado de un polvo de un material magnético con un polvo de un intercambiador de iones cargado negativamente para formar la composición de partículas magnéticas.
14. Procedimiento de la reivindicación 13, donde las partículas presentan un diámetro entre 20 y 150 \mum (micras).
15. Procedimiento de la reivindicación 13 o la reivindicación 14, donde el mezclado tiene lugar en presencia de un agente aglutinante.
16. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, donde el material magnético son partículas con un diámetro menor que 10 \mum (micras).
17. Procedimiento de la reivindicación 16, donde el material magnético son partículas con un diámetro menor que 5 \mum (micras).
18. Procedimiento de la reivindicación 17, donde el material magnético son partículas con un diámetro menor que 1 \mum (micra).
19. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 18, donde el intercambiador de iones es no poroso.
20. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 19, donde el intercambiador de iones es un intercambiador de iones de polimetacrilato carboxilo.
21. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 20, donde el intercambiador de iones se fija directamente al material magnético.
22. Procedimiento de la reivindicación 15, donde el aglutinante es un monómero o polímero de ácido acrílico, una acroleína, una amina, una amida, un alcohol, un aldehído, un ácido orgánico, un amidazol, un fosfato, o una amina o sulfato secundario, terciario o cuaternario.
23. Procedimiento de la reivindicación 13, donde la relación de material magnético respecto a intercambiador de iones es desde 0,05 hasta 0,2.
24. Procedimiento para la separación de biomoléculas a partir de mezclas que las contienen, comprendiendo el procedimiento:
poner en contacto una suspensión líquida de las biomoléculas con una composición de partículas magnéticas de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12;
formar una suspensión de dicha composición de partículas magnéticas y dicha suspensión de biomoléculas donde la composición de partículas se fija a las biomoléculas; y
aplicar un campo magnético a la composición para separar las partículas magnéticas con las biomoléculas fijadas a las mismas.
25. Procedimiento de la reivindicación 24, donde las partículas magnéticas fijan ácido nucleico presente en la mezcla junto con impurezas.
26. Procedimiento de la reivindicación 25, donde el ácido nucleico se selecciona del grupo que consiste en ADN microbiano, ADN de planta y ADN de plásmido.
27. Procedimiento de la reivindicación 26, donde las impurezas son desecho celular o material insoluble.
28. Utilización de una composición de partículas magnéticas según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 para eliminar desecho celular o material insoluble de una solución o suspensión que contiene ácido nucleico para proporcionar una solución que contiene el ácido nucleico.
29. Utilización de una composición de partículas magnéticas según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 para fijarse a ácido nucleico presente en una muestra líquida que contiene el ácido nucleico e impurezas.
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