JPH1062422A - 錠剤型磁気粒子含有試薬調製物 - Google Patents
錠剤型磁気粒子含有試薬調製物Info
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Abstract
物を使用する核酸の結合方法、該調製物を使用する核酸
の精製方法、試料中での磁気粒子懸濁物の調製方法およ
び試料中へ磁気粒子を取り込む方法を提供すること。 【解決手段】成分が本質的に完全に結合可能な表面を有
する多数の磁気粒子および賦形剤からなる試料中の成分
を結合させるための錠剤型試薬調製物、該調製物を使用
する核酸の結合方法、該調製物を使用する核酸の精製方
法、試料中での磁気粒子懸濁物の調製方法および試料中
へ磁気粒子を取り込む方法、磁気粒子および溶解可能な
賦形剤を含む錠剤を試料に添加する工程および試料中の
錠剤を揺動させる工程からなる試料中で磁気粒子懸濁物
を調製する方法ならびに多数の磁気粒子含有錠剤を含む
ディスペンサーを提供する工程およびディスペンサーを
活性化して錠剤を放出する工程からなる試料中へ磁気粒
子を取り込む方法。
Description
る錠剤型試薬調製物、該調製物を使用する核酸の結合方
法、該調製物を使用する核酸の精製方法、試料中での磁
気粒子懸濁物の調製方法および試料中へ磁気粒子を取り
込む方法に関する。
問題は、分析対象の成分がごく微量でしか存在しないと
いうことである。さらに、試料は、測定対象ではなく測
定をより不正確にする多くの粒子をも含む。従って、分
析対象物を固相に結合させて測定対象でない粒子を液体
と共に除去することが好都合である。次いで、単離され
た分析対象物は、固相において検出可能である。最近、
主として管等の反応容器の内壁が固相として用いられて
いる。別の選択は、分析対象物と結合可能なビーズを反
応容器に添加することである。ビーズのサイズは、液体
とビーズの分離が単純なピペッティングにより行なわれ
ることができるようなサイズである。しかし、最近、分
析対象物が磁気粒子に結合し、結合した分析対象物を磁
気粒子と共に磁場により周りの液体から分離する持続操
作器具が設計されている。分析対象物を結合可能な表面
を有する磁気粒子が、提供されている。
定目的の分析対象物を含む液体がピペッティングにより
添加される懸濁物の型で提供される。これらのピペッテ
ィング工程は、ピペッティング手段と連動して通常見ら
れる偏差を被る。さらに、ピペッティング誤差も原因を
突き止めることが困難である。
は、従来技術における欠点を除去した、試料成分を結合
する錠剤型試薬調製物を提供することにある。本発明の
他の目的は、該調製物を使用する核酸の結合方法を提供
することにある。本発明の他の目的は、該調製物を使用
する核酸の精製方法を提供することにある。本発明の他
の目的は、試料中での磁気粒子懸濁物の調製方法を提供
することにある。本発明のさらに他の目的は、試料中へ
磁気粒子を取り込む方法を提供することにある。
は、(1) 試料中の成分を結合させるための下記から
なる錠剤型試薬調製物、 −該成分が本質的に完全に結合可能な表面を有する多数
の磁気粒子、および −賦形剤、(2) 該成分の結合を容易にする添加剤を
も含むことを特徴とする前記(1)記載の試薬調製物、
(3) 磁気粒子が100μm未満の平均粒径を有する
ことを特徴とする前記(1)または(2)記載の試薬調
製物、(4) 磁気粒子がガラス様表面を有することを
特徴とする前記(1)〜(3)いずれか記載の試薬調製
物、(5) 錠剤が5mgより重いことを特徴とする前
記(1)〜(4)いずれか記載の試薬調製物、(6)
添加剤がカオトロピズム塩であることを特徴とする前記
(2)記載の試薬調製物、(7) 前記(1)〜(6)
いずれか記載の試薬調製物を用いて、試料中の核酸を結
合させる方法、(8) 前記(1)〜(6)いずれか記
載の試薬調製物を用いて、試料中の核酸を精製する方
法、(9) 下記工程からなる試料中で磁気粒子懸濁物
を調製する方法、 −磁気粒子および溶解可能な賦形剤を含む錠剤を試料に
添加する工程、および −試料中の錠剤を揺動させる工程、(10) 下記工程
からなる試料中へ磁気粒子を取り込む方法、 −多数の磁気粒子含有錠剤を含むディスペンサーを提供
する工程、および −ディスペンサーを活性化して錠剤を放出する工程、に
関する。
完全に結合可能な表面を有する多数の粒子および賦形剤
からなる、錠剤型で試料中の成分を結合させる試薬調製
物である。本発明の他の主題は、これらの試薬調製物の
使用および磁気懸濁物の調製方法である。
は、具体的には、ウイルスまたは細菌等の細胞、白血球
細胞等の単離されたヒトまたは動物細胞、ハプテン、抗
原、抗体および核酸等の免疫活性な低分子および高分子
化合物をも含む。特に好ましいものは、DNAまたはR
NA等の核酸である。
血清、うがい液、尿、脳脊髄液、痰、便、斑紋、骨髄試
料等の臨床検体である。試料は、環境分析、食品分析ま
たは、細菌培養物、ファージ溶解物およびPCR等の増
幅手段産物等の分子生物学的研究等の領域由来であって
もよい。
あり、好ましくは円盤状またはほぼ完全球状型であるこ
とが望ましい。他の類似の態様も考えられる。この種類
の錠剤は、薬剤から通常知られている。錠剤は、5mg
を越える一定の重量を有することが好ましい。
能な物質、すなわち、強磁性または超常磁性物質から作
られる粒子である。本発明においては、超常磁性粒子が
特に好ましく、とりわけ前帯磁していないものが好まし
い。本明細書において前帯磁とは、物質を磁石と接触さ
せて共鳴を増加させる工程をいう。磁性体Fe3 O4ま
たはFe2 O3 が特に好ましい。しかし、磁気粒子は、
(より小さな)磁気粒子を含有する物質を含むとも解釈
される。これは、特に、Merck(Darmstadt 、ドイ
ツ) から購入可能な顔料であるIriodin600を
含む。本発明は、100μm未満の平均粒径を有する粒
子が特に好ましい。特に好ましい平均粒径は、10〜6
0μmの範囲である。好ましい粒子分布は、比較的均一
であり、特に、10μm以下または60μm以上の粒子
をほとんど含まない。この要求を満たす粒子は例えば、
国際公開第90/06045号パンフレットに記載され
ている。
面を有する磁気粒子という事実である。この結合は、特
異的または比較的非特異的であってもよい。特異的結合
は、抗体と抗原、抗体とハプテンまたは相補的核酸等の
結合特異的相互作用を利用することにより達成できる。
これらの相互作用の組み合わせも可能である。
トレプトアビジン層で粒子を被覆することである。従っ
て、ビオチンとある種の抗体、ハプテンまたは核酸との
コンジュゲートを介して試料から特異的成分が結合可能
な普遍的なマトリックスを生成することが可能である。
当業者、特に免疫アッセイの分野出身の者は、かかる態
様に精通している。
核酸間の相互作用である。ヨウ化ナトリウム存在下、粉
末フリントガラスにおけるアガロースゲルからの核酸の
結合は、Proc. Natl. Acad. USA 76, 615-619(1979) に
より公知である。米国特許出願第4,233,169号
明細書に、ガラス部分が核酸と結合可能な磁気粒子が記
載されている。
完全に磁気粒子に結合することが提供される。当業者
は、添加される磁気粒子の量を変えることにより必要量
の粒子を容易に決定することができる。本発明によれ
ば、本質的に完全な結合とは、60%以上の結合を意味
し、特に好ましくは試料中に見出される結合対象の成分
の90%以上の結合である。
めに、すなわち、磁気粒子を連結して錠剤を形成するた
めに供する。本発明の好ましい賦形剤は、反応が行なわ
れる試料中で迅速に溶解するものである。好ましい液体
試料としては、水溶液が挙げられ、薬剤の製造に通常用
いられる賦形剤を使用することができる。ポリエチレン
グリコール(PEG)およびポリビニルピロリドン(P
VP)が特に好ましい。
書に、作用成分の吸収が改良された磁気貯留薬が記載さ
れている。錠剤は、円盤様磁石を含み、作用成分が数時
間以上放出される。The International Journal of Pha
rmaceutics 119, 47-55(1995)にも薬剤の遅延放出を伴
う錠剤が記載されている。
4) には、フェライト含有磁気錠剤およびそのイヌへの
投与が記載されている。
よい。好ましい方法において、D−マンニット、トレハ
ロースおよびソルビット等の糖が添加される。
面を有するものは、明らかなガラスの加水分解なしに、
従って明らかな磁気部分からの鉄の溶出なしに、錠剤型
で保存することが可能である。
囲の平均粒径を有するガラス磁石顔料、ポリマー磁気ビ
ーズまたは他の磁気粒子が好ましく、これらは、独国特
許第19520390号明細書に記載されている。
するために、添加剤を含んでもよい。これは、前記コン
ジュゲートのような特異性を高める物質のみならず成分
の表面への結合が容易になるように試料の性質を変える
物質をも含む。核酸を用いた場合、これらは、グアニジ
ニウム ヒドロクロリド、ヨウ化ナトリウム、過塩素酸
ナトリウム等のカオトロピズム塩である。この種類のカ
オトロピズム塩は、Anal. Biochem. 121, 382-387(198
2) および独国特許出願公開第3734442号明細書
から公知である。
らしめる型に成分を変換する試薬も含んでもよい。これ
は、核酸を含む細胞等の区画を溶解する試薬を含む。か
かる試薬としては、例えば、プロテアーゼKまたは前記
カオトロピズム塩が挙げられる。
に水素結合、疎水結合およびイオン結合等の結合分離剤
ならびに免疫アッセイの成分で公知のような物質の特異
的検出試薬または指示薬も含んでよい。
ことがわかった。
うに、不活性な充填剤等の他の成分を含んでもよいのは
当然である。割合は、重量パーセントで示す。
他の薬剤に対応して製造することができる。これを行な
うために、すべての必須成分を十分混合し、アリコート
を錠剤プレスで錠剤化する。このことは、特に、加圧す
ることにより行なわれる。しかし、本発明の錠剤は、成
分の混合物を造粒することによっても得られる。この目
的のために、一定量の乾燥混合物を溶解液を用いて造粒
する。次いで、このように得られた造粒物から液体を再
び回収する。一定の粒径は、造粒物をふるいにかけるこ
とにより得られる。
非常に低く、従って、実施の際に試薬を投与する場合、
高い再現性を伴う。そして、誤った投与は低減し、より
追跡が容易になる。本発明の錠剤は、磁気粒子が容易に
かつ前もって分散可能な限り、好ましくは30秒未満、
特に好ましくは1ないし10秒未満に迅速に溶解可能で
あることが望ましい。また、錠剤型は、保存という点に
関して好都合である。錠剤ディスペンサーにより、投与
は手動で行なうこともできる。懸濁状で起こり、粒子の
沈殿により生じる不純物混和は観察されない。
を使用する核酸の結合方法である。これを行なうため
に、試薬調製物を試料に添加し、(1)錠剤の溶解が完
了するまで、および(2)核酸を本質的に完全に表面に
結合させるまでインキュベートする。所望ならば、錠剤
を機械的に動かすことが可能である。このことにより、
錠剤の溶解速度および成分の結合速度が上昇する。
を使用する核酸の精製方法である。これを行なうため
に、磁気粒子およびそれに結合した核酸を周りの試料液
体から分離する。このことは、磁場を適用して磁気粒子
を容器中または装置の一定の部位に留め、次いで、ピペ
ッティングまたは排除等により試料液体を除去し、所望
ならば、別の液体を用いる洗浄工程を1ないし数回行な
うという点で有意に成される。所望ならば、適当な条件
を適用した場合、結合した核酸を磁気粒子から再び分離
することができる。ガラス様表面の場合、これらは低塩
条件、すなわち、溶離液の塩濃度が100mmol/l
未満である。
可能な賦形剤を含む錠剤を試料に添加する工程および好
ましくは可動性磁場を用いる試料中で錠剤を揺動する工
程からなる、試料中で磁気粒子懸濁物を調製する方法で
ある。磁場は、磁気粒子が持続的に動くように、試料に
近接した磁石を前後に動かすように移動させることがで
きる。しかし、錠剤および磁気粒子を有する試料を含む
容器を磁石の方へ移動させることも可能である。
子含有錠剤を含むディスペンサーを提供する工程および
ディスペンサーを活性化して錠剤を放出させる工程から
なる試料中へ磁気粒子を取り込む方法である。錠剤を提
供するディスペンサーは、錠剤型の薬剤を投与する際に
通常用いられるものである。本発明の方法では、かかる
ディスペンサーを、投与手段により手動で用いることが
できる。試料当たり1つの錠剤のみを放出させる必要は
必ずしもない。また、試料に対して予定された使用によ
り、例えば、2〜10個の間の一定の数の錠剤を放出す
ることも可能である。
明するが、本発明はこれらの実施例によりなんら限定さ
れるものではない。
攪拌下、溶液(SiO2 :B2 O3 =7:3)を調製し
た。 86.6ml テトラエチルオルトシリケート +7ml 無水非変性エタノール +14.1ml 0.15M HCl。
温で攪拌した。次いで、37.8mlのトリメチルボレ
ートを滴下した。次いで、溶液を2時間、50℃の温度
で保温した。次いで、14.1mlの0.15M HC
lを添加した。
n600(黒雲母、Merck, Darmstadt, ドイツ) を、攪
拌下、150mlの溶液に添加し、次いで噴霧−乾燥機
(Buchi 190, Mini Spray Dryer)で被覆した。
を、窒素雰囲気下、温度処理に供した。加熱速度は、1
K/分であり、成形温度での滞留時間は、2時間であっ
た。成形後、追送処理の温度まで温度を下げ、窒素雰囲
気を大気と置換し、追送処理後、粉末を室温まで冷却し
た。形成可能な凝集物を、50μmのふるいにかけるこ
とにより除去した。
グアニジニウム ヒドロクロリドと混合し、GLA−O
RV Frewittふるい機を用いて0.2mmのふ
るいにかけた。収量は、536.4gであり、98.7
%の収率に相当する。
を、2.2mlの再留水に溶解した。次いで、266.
4gの前混合物と共に溶液を造粒した。全部で7mlの
再留水を添加した。得られた造粒物を、24時間かけて
室温で真空乾燥させた後、0.6mmのふるいにかけ
た。
EG6000と混合し、5mmの打ち抜き型を有するK
orsch PH106錠剤プレスで錠剤化した。収量
は、186.63gすなわち2902錠であった。錠剤
は、64.32mgの重量を有し、1.5kpの硬度を
有し、室温で蒸留水中の溶解時間は6秒であり、0.8
%の磨耗率であり、2.77mmの高さを有していた。
り、打ち抜き型の底は光沢を保ち、打ち抜き型は何も被
覆されていなかった。大部分は、幾分ゆっくり通り抜
け、最小の技術手段により有意に改良された4.65%
のCV値の重量となった。
ラス容器に添加し、室温で約50%rFの実験室で、開
放したまま保存した。4週間重量をモニターした。重量
変化はなかった。
料調製 核酸の単離 10mgのガラス磁石粒子GMP2を、Eppendorf 試験
管で調製した。40μlのプロテアーゼK(20mg/
ml、凍結乾燥品から得られたもの)を、200μlの
解凍した全血液それぞれに添加し、すぐに混合した。次
いで、200μlの結合緩衝液(6M グアニジン−H
Cl、10mM Tris−HCl、10mM尿素、3
0% TritonX−100、pH4.4)を添加
し、混合して70℃で10分間インキュベートした。2
00μlのイソプロパノールを添加後、混合物を10秒
間、vortexミキサーで混合し、試料を室温で20
分間インキュベートして前記のように10秒間再び混合
した。磁気の分離は、Boehringer Mannheim 磁石粒子セ
パレーター(Cat. no. 1641 794)で少なくとも30秒間
行なった。上清を除去し、さらに、下記記載のように分
析した。
Cl、10mM Tris−HCl、pH7.5(25
℃)、70%エタノール)を用いて、10秒間混合、室
温で1分間インキュベートおよび10秒間再混合、それ
から磁気粒子セパレーターを用いる管壁での沈殿により
磁気粒子を洗浄した。上清を除去して捨てた。洗浄上清
が無色になるまで洗浄過程を繰り返した(全5回)。そ
こで、70℃で前加熱した各回200μlの溶出緩衝液
(10mM Tris−HCl、pH8.5)を用い
て、10秒間3回混合し、次いで、再び室温で10分間
インキュベートし、10分間再混合することにより核酸
を溶出した。
以下のようにして、その核酸含有量を調べた。上清を濾
過管(Boehringer Mannheim Cat. no. 1744003、High P
ure PCR Product Purification Kitに含まれる) に移
し、Eppendorf 卓上遠心機を用いて8000rpmで1
分間遠心分離した。フロースルーを捨て、濾過管を各回
500μlの洗浄緩衝液で2回洗浄した(前記のように
再び遠心分離した)。乾燥するまで濾過管を遠心分離
し、次いで、遠心分離を繰り返し、70℃で前加熱した
200μlの1×溶出緩衝液を2回使用することにより
溶出した。
管により処理された上清に添加した。次いで、その45
μlを、0.8%アガロースゲル、120Vで90分間
電気泳動により分離した。
を、Uvikon710(Kontron)を用いる260nm
と280nmでの分光光度分析を行なった。
te PCR(Boehringer Mannheim Cat. no. 168183
4) を使用して、ヒトtPA遺伝子特異的プライマー
(予想増幅長が15kb)を用いて溶出液の2つの5μ
lのアリコートを試験した。
し、次いで、5μlの溶出液を添加し、次いで、混合液
IIを添加した。混合液を短時間混合し、30μlのミネ
ラルオイルを液の上部に重層した。以下のプログラムで
Perkin Elmer Thermocycler
9600中、バッチを増幅した: 2分 92℃ 10秒 92℃ 30秒 65℃ 12分 68℃ 10サイクル 10秒 92℃ 30秒 65℃ 12分+サイクル当たり20秒 68℃ 20サイクル 7分 68℃ 次いで 7℃。
Rバッチに添加し、次いで、その45μlを、0.8%
アガロースゲル、120Vで90分間電気泳動により分
離した。
顔料の使用 実施例2の2個の錠剤を、Eppendorf 試験管に添加し、
40μlのプロテアーゼK(20mg/ml)および2
00μlの解凍した全血液(実施例4a参照)を添加
し、すぐに10秒間、vortexミキサーで混合し
た。200μlの30% TritonX−100を添
加し、10分間、vortexミキサーで混合した。次
いで、実施例4aの記載に従って、処理を続けた。
第1の溶出工程および増幅能力における両DNA収量に
関して同一であった。
型試薬調製物、該調製物を使用する核酸の結合方法、該
調製物を使用する核酸の精製方法、試料中での磁気粒子
懸濁物の調製方法および試料中へ磁気粒子を取り込む方
法が提供される。
Claims (10)
- 【請求項1】 試料中の成分を結合させるための下記か
らなる錠剤型試薬調製物、 −該成分が本質的に完全に結合可能な表面を有する多数
の磁気粒子、および −賦形剤。 - 【請求項2】 該成分の結合を容易にする添加剤をも含
むことを特徴とする請求項1記載の試薬調製物。 - 【請求項3】 磁気粒子が100μm未満の平均粒径を
有することを特徴とする請求項1または2記載の試薬調
製物。 - 【請求項4】 磁気粒子がガラス様表面を有することを
特徴とする請求項1〜3いずれか記載の試薬調製物。 - 【請求項5】 錠剤が5mgを越える重量を有すること
を特徴とする請求項1〜4いずれか記載の試薬調製物。 - 【請求項6】 添加剤がカオトロピズム塩であることを
特徴とする請求項2記載の試薬調製物。 - 【請求項7】 請求項1〜6いずれか記載の試薬調製物
を用いて、試料中の核酸を結合させる方法。 - 【請求項8】 請求項1〜6いずれか記載の試薬調製物
を用いて、試料中の核酸を精製する方法。 - 【請求項9】 下記工程からなる試料中で磁気粒子懸濁
物を調製する方法、 −磁気粒子および溶解可能な賦形剤を含む錠剤を試料に
添加する工程、および −試料中の錠剤を揺動させる工程。 - 【請求項10】 下記工程からなる試料中へ磁気粒子を
取り込む方法、 −多数の磁気粒子含有錠剤を含むディスペンサーを提供
する工程、および −ディスペンサーを活性化して錠剤を放出する工程。
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