JP2701953B2 - アレルギー診断用の方法および手段 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 発明の分野 本発明は、試料、特に全血中に存在するヒスタミンを
測定するための方法および試験セットを提供する。

この方法は、或る種の物質に対するヒスタミンの選択的
結合にもとづいており、特定のアレルゲンに関連するア
レルギーの診断に有用できる。

情報の開示記述 アレルギー患者の環境または食物中に存在する、どの
アレルゲンがアレルギー反応を生じさせるかを知ること
はアレルギー患者にとって必須である。従って、患者に
関連するアレルゲンを同定するための、精確で、正確な
容易に利用でき、しかも安価な方法の開発が強く求めら
れている。

インビボ反応をまねた方法には、次の方法が包含され
る： 患者から得た或る種の細胞を、重要であると考えられ
るアレルゲンにさらし、この細胞からヒスタミン放出を
誘発し、引続いて放出されたヒスタミンの量を測定する
ことによって、アレルゲン性の評価をすることができる
ことは知られている。

この原則にもとづく方法は、米国特許4,550,085に記
載されている。この特許の一般的態様に関して、この特
許には、体液中のヒスタミンの検出または測定方法が記
載されており、この方法は、ガラスマイクロファイバー
と体液との間の量的比率を、このマイクロファイバーに
結合されるヒスタミンの量を検出または測定できるよう
な比率にして、担体上に配置されているガラスマイクロ
ファイバーと体液試料とを接触させ、次いでヒスタミン
の結合量を記録もしくは測定する方法である。

特に、アレルギー反応によって体液中に放出される可
能性があるヒスタミンの検出方法が記載されており、こ
の方法では、体液を試験アレルゲンと接触させ、ファイ
バーに結合された、放出された可能性のあるヒスタミン
を直接に、または競合的に記録する。

上記特許の実施例に従えば、問題のアレルゲンと接触
させる細胞相は、特別に調製された血液細胞懸濁液、す
なわち白血球に富むように調製された細胞懸濁液であ
る。この懸濁液を調製するためには、血液を患者から採
取し、赤血球を沈降させる。得られた白血球に富む血漿
層を別の容器に注意深く移し、緩衝液中に懸濁し、次い
で遠心処理し、血漿の大部分から白血球を単離する。得
られた上澄液を除去し、ペレット状白血球を緩衝液中に
再懸濁する。この工程をさらに反復し、好塩基球に特に
富んでいる細胞懸濁液を生成させる。

従って、担体上に配置されているガラスマイクロファ
イバーと接触させる試料は、全血ではなく、数回の中間
処理を施された血液試料である。

審査中の米国分割特許出願Ser.No.791,722は、特に米
国特許第4,550,085号の方法に従うヒスタミン検出に使
用するための分析剤に関するものであり、この分析剤
は、担体上に固定されている個別のガラスマイクロファ
イバーよりなり、この分析剤は、少なくとも１種の試験
アレルゲンを可逆的に沈着させてさらに含有しており、
アレルギー反応によって体液中に放出される可能性があ
るヒスタミンを検出もしくは測定する用途に適してい
る。

米国特許4,550,085と同一の優先権出願DK2982/81にも
とづいて、国際特許出願WO83/00229が出願されている。
米国特許およびその分割出願に対する、この国際特許出
現の唯一の基本的差違は、ここに直接的ヒスタミン測定
を行なうための手段として、微量滴定板を用いる好適態
様を示す例がさらに提示されていることにある。この国
際特許出願にもとづき、多くの特許、たとえばEP特許N
o.82,862、FI特許No.74,818およびAU特許No.563,306が
得られている。

上記の一族の特許による方法は、その実現のための多
くの物品を提供している。

Agents and Actions、14巻、3/4（1984年）、414〜41
6頁には、出願WO83/02229に従うヒスタミン試験方法が
さらに明らかに説明されている。

種々の洗浄行程中におけるマイクロファイバーの損失
を回避するために、粉砕したガラスマイクロファイバー
を、微量滴定板の底部に、水溶性接着剤とともに固定し
ている。

Allergy、42巻（1987年）、366〜373頁では、WO83/00
229による方法を使用し、慣用のヒスタミン放出検定
法、（たとえば皮膚刺傷試験および気管支反応誘発試
験）とこのマイクロファイバーにもとづくヒスタミン分
析法とが比較されている。

この方法では、全血細胞がマイクロファイバー中に捕
獲されるのを避けるために、血液試料を、Pips−AMC緩
衝液を用いて洗浄することが報告されている。

ヒスタミンの放射線酵素検定法の研究中に、ガラス表
面によるヒスタミンの吸着現象を制限する技術をうるた
めに、この現象が研究された〔VerburgおよびHenryによ
るAgents and Actions、14巻、516、（1984年）、633〜
636頁〕。リン酸カリウム緩衝液はヒスタミン結合を完
全に防止すること、牛血清アルブミンは吸着を阻止する
こと、しかしTris−緩衝液（pH7.8）およびK₂ EDTAは吸
着を制限することが報告された。

FR特許No.1,443,167およびC.A.66巻（1967年）4642頁
によって、ファイバーに結合剤、たとえばデンプンペー
ストまたはPhOH−HCHO−樹脂を付与し、次いで溶剤を蒸
発させ、樹脂を重合させることによって、凝集物の形態
の鉱物ファイバー、すなわちロックウール、スラブウー
ル、ガラススールを凝集物の形態にすることにより、そ
の機械的特性および水分に対する良好な耐性が改善され
ることが知られている。しかしながら、このような凝集
物を分析の目的に使用することに関しては、何ら開示さ
れていない。

上記従来技術、特にDK出願No.2982/81にもとづく一族
の特許を引用して、ここに組入れる。

本発明の要旨 本発明は、全血中の白血球によって放出されるヒスタ
ミンの測定方法を提供する。この方法は、全血を直接に
使用することを可能にし、初期の単離／洗浄工程を必要
としない方法である。いくつかの理由で、全血を直接に
使用できる。すなわちヒスタミン放出誘発剤およびヒス
タミン結合性物質を含有する容器と血液とを直接に接触
させることができることは、明らかに有利である； 種々の分別行程を省略することによって、検定の精度
および正確度が増大される； 時間を消費する血液分別が避けられ、従って総検査時
間が格別に減少される； 遠心処理用装置の必要性が排除される； 分別工程中における試料物質の汚染の危険が排除され
る； 遠心処理および洗浄処理中における細胞のヒスタミン
放出能に係る人意的変化の誘発の危険性が排除される； 血液試料中に存在するいずれかの病原体、たとえば感
染性病原体および（または）毒性体と接触する、操作者
の危険性が最低にされる； 異なる患者からの試料との取り間違いの危険性が減じ
られる； 検査に必要な血液の量が減じられる。

全血試料を検査することに係るこれらの理由に加え
て、特別に処理された白血球試料を使用して、アレルゲ
ン度（allergenicity）を直接に検査することができ
る。全血が、ヒスタミン結合検査を干渉しうる種々の成
分、特にアルブミン、フイブリノーゲンおよびヘモグロ
ビンなどのタンパク質を含有することは認められてい
る。本発明者は、干渉性成分、たとえばヘモグロビンに
対するヒスタミン結合性物質の親和性を減じるが、その
ヒスタミン結合能は実質的に保留されているように、処
理されているヒスタミン結合性無機質物質を試料と接触
させることによって、この問題を克服した。

試料を、ヒスタミン結合性物質とともにインキュベー
トした後に、これらの２種の成分を分離し、次いで結合
したヒスタミンに対して有意に作用を及ぼすことなく、
干渉性成分を除去する作用剤で、このヒスタミン結合性
物質を洗浄すると好ましい。ヒスタミン結合性物質が顆
粒、フレーク、ファイバーなどの形態で利用できる場合
には、これらの分離している個体を、適当な結合剤によ
り、集塊状形態にすると好ましく、生成する集塊状物
は、厳しい洗浄工程に良好に耐えられる。従って、もう
一つの好適態様においては、意図する検査に、ヒスタミ
ン結合性物質として、このような集塊状物、好ましく
は、干渉成分に対するその親和性を減少させる処理が施
されている集塊状物を使用する。

要約すると、本発明は次の利点を有する： 1.ファイバー被覆した担体の製造時間を減じることがで
きる。

2.ファイバーは担体に、さらに堅固に固定される。

3.バックグラウンド螢光が減じられる。

4.ヒスタミン結合が驚くほど改良される。

5.螢光検出に係る標準偏差値が減少される。

6.試験を全血血漿、細胞懸濁液または生検物質に対して
行なうことができ、その用途が改善される。

本発明のさらに別の態様を、以下の記載および請求の
範囲に記載する。

図面の簡単な説明 図１は、ヒスタミン結合性ガラスファイバーをその中
に含有するへこみ（ウェル）を有するトレイの形態の、
本発明に係る試験セットを示す図解式図面である。

図２は、図１に示されているウェルのうちの１個を示
す拡大断面図である。

図３〜５は、トレイの調製および処理の過程の工程を
示すものである。

図６は、全血試料中に放出されたヒスタミンの量（ng
ヒスタミン／試料として測定）の温度による変化を抗−
IgEの濃度の函数として示すグラフである；温度:20℃、
37℃、38℃および39℃。

図７は、カラムの形態の試験セットを示す図解式図面
である。

本発明の詳細な説明 本発明は特に、人間または動物から得られる試料中の
ヒスタミンの測定に関するものである。特に、本発明
は、体液中のヒスタミンの測定に関するものである。体
液の重要な例には、ヒスタミン含有細胞および（また
は）ヒスタミンを放出する細胞を含む、血液およびその
他の種々の体液がある。

このような液体およびその他の体液は、タンパク質成
分を含有しており、これらのタンパク質成分は、ヒスタ
ミン結合性物質に付着する傾向および（または）ヒスタ
ミン結合性物質に対するヒスタミンの効果的な結合を干
渉する傾向を有する。これらの干渉成分は、体液試料に
存在する液相中に、または細胞中に存在することができ
る。このような生物学的成分が、ヒスタミン結合性物
質、特にヒスタミン結合性無機物質に対して、高度の親
和性を有する場合には、これらは相もしくは物理−化学
的障壁を形成する傾向を有し、ヒスタミンがヒスタミン
結合性物質と適度に結合することを妨害し、そして（ま
たは）これらの成分は、ヒスタミン結合性物質に対する
結合に関して、ヒスタミンと競合することがある。従っ
て、このような成分の干渉に対抗する作用剤および方法
を使用することが重要である。本発明は、このための解
決手段を提供する。

ヒスタミン以外であって、表面に強力に付着する生物
学的成分の結合が、減じられ、しかもヒスタミン結合が
不当に悪化されないような方法で、ヒスタミン結合性物
質の表面を変性する、ヒスタミン結合性物質の変性は特
別の関連性を有する。

「全血または実質的な全血」の用語が、しばしば使用
されている。「実質的な全血」の用語は、患者からの血
液試料中に元から存在する赤血球の全部または相当な部
分を保有する血液試料を表わす用語である。全血は、患
者から採取した全血または遠心処理あるいはその他の労
力を要する血液分別処理による分別などの処理とは異な
る、稀釈によるなどの僅かな変化を施された全血である
ことができる。

血液は、各対象から静脈穿刺によって採取することが
でき、適当な容器、たとえばプラスティックまたはガラ
スの管（たとえば、「Venoject」管）に集める。この容
器には、血液を集める前に、適当な抗凝血剤を存在させ
ると好ましい。この抗凝血剤は、好ましくは対象の細胞
からのヒスタミン放出を実質的に干渉しない、たとえば
この放出または検査方法に含まれる反応に対して必須で
ある成分を干渉しない、抗凝血剤である。ヘパリン、た
とえばナトリウムまたはカリウムヘパリネートの形態の
ヘパリンは好適な抗凝血剤である。代表的には、血液5m
lを集める場合には、30μヘパリン/ml溶液0.5mlを使用
し、３μヘパリン／血液mlを得る。通常、5mlの血液が
集められるが、数種のアレルゲンに対するアレルギーを
試験するためには、２〜3mlの試料で充分であり、たと
えば96個のウェルを有する板の場合には、2.5mlを使用
する。１種だけのアレルゲンに対するアレルギーを試験
する場合には、試料およびブランクを含めて、1mlほど
の少量の血液でも充分である。

本明細書において、「無機質ヒスタミン結合性物質」
の用語は、ヒスタミンを結合させることができ、かつま
た無機質の特性もしくは主として無機質の特性を有する
物質のいずれをも意味する。このような無機質物質の例
は、以下に詳細に示すが、少割合で有機残基を含有しう
る、実験室製造ガラス型のものを包含し、これらも本発
明において、無機質物質と考える。

本発明に関連して使用されている「測定」の用語は、
通常、濃度の測定を表わすものとして使用されている
が、或る場合には、質的同定を表わすためにも使用す
る。

ヒスタミンの測定は、必要な感受性を有する適当な測
定方法、たとえばラベル付きヒスタミンの使用を包含す
る競合測定あるいは、たとえばスペクトル光度測定によ
る直接測定などのいずれの方法によっても行なうことが
できる。

本発明による方法の好適態様において使用されるヒス
タミンの測定方法の例には、一例として、螢光測定法が
ある。この方法は、螢光環構造の実質的な定量的形成を
ともなう、ヒスタミンと発螢光団、たとえばオルト−フ
タルジアルデヒドとのカップリングにもとづく方法であ
り、この螢光環構造が測定される螢光強度に関連するこ
とができる。この評価方法の基本原則は、Hoppe−Seyle
rによるZ.Physiol,Chem、353、911〜920頁、1972年に記
載されている。

本明細書に記載の好適態様においては、ヒスタミン
を、高pH（＞10）でヒスタミン結合性物質から放出させ
る。この高いpHはまた、遊離されたヒスタミンとオルト
−フタルジアルデヒド（OPT）との間の充分の反応に必
要である。

過塩素酸を次いで加え、ヒスタミンとOPTとの間で生成
された螢光反応生成物の適度の溶解性を確保するのに要
する低い数値にまで、pHを減少させる。

「集塊状物」（conglomerate）の用語は、ヒスタミン
結合性物質と結合剤との物理的複合体のいずれをも意味
するものとする。ヒスタミン結合性物質は、比較的顕微
鏡的寸法の個体（body）または複数個の個体（bodies）
の形態であることができる；これはまた、さらに小さい
顕微鏡的寸法であってもよく、適当にはファイバーの形
態である。本発明に係るファイバーは、一般に、少なく
とも4:1の長さ：直径比を有する。

個体形態のヒスタミン結合性物質がファイバーの形態
である場合には、これらのファイバーは、マイクロファ
イバーの形態、たとえば長いファイバーの粉砕によって
形成されるマイクロファイバーの形態で使用すると有利
である。このようなマイクロファイバーの長さは、好ま
しくは0.5〜100（あるいは200でさえある）μｍであ
り、さらに好ましくは１〜50μｍ、特に１〜25μｍ、さ
らに特に２〜20μｍである。その径は、好ましくは0.1
〜10μｍ、さらに好ましくは0.2〜５μｍ、特に0.3〜２
μｍである。

従って、この集塊状物は、ヒスタミン結合性物質のフ
ラグメント、たとえばフレーク、シート状片または数ミ
リメーターより大きいか、または数ミリメーターに等し
い寸法のかたまりよりなることができ、これらは全体的
に、または部分的に結合剤でおおわれている。

その他の極端な場合には、この集塊状物は、マイクロ
ファイバーに係り上記したもののような寸法を有する顕
微鏡的大きさの個体の形態のヒスタミン結合性物質より
なり、これらの顕微鏡的大きさの個体が結合剤によって
一緒に結合されて全体に結合しているか、またはかたま
りを形成しているものである。

このかたまり、または全体的に結合しているものは、
たとえば粗い球状形態あるいはさらに、不規則な形態で
あることができ、この場合の顕微鏡的大きさの個体はそ
れぞれ、全体的にまたは部分的に結合剤によりおおわれ
ていてもよく、あるいはおおわれていなくてもよい。こ
れはまた、本発明の好ましい態様において、この集塊状
物が固定される担体の形状によって指定される形態に適
する形であることもできる。本発明の好ましい態様にお
いては、担体はポリスチレン製血中のウェルの底部であ
り、この場合には、集塊状物は、図１（後記）に図示さ
れている形状に適合する形態を有する。

個体状のヒスタミン結合性物質はまた、粉末または多
孔質粒子を含むその他の粒子の形態であることもでき
る；これらはまた、たとえば実質的に連続している個
体、たとえばシート（あるいは、たとえばウェルの側面
および／または底部）のうちの多孔質および（または）
繊維状、あるいは別様に細分化されている領域（大きい
表面積を得るため）であることもでき、この場合には、
この領域は、たとえば成型によりあるいは機械的、熱
的、電気的および（または）化学的にでこぼこする処
理、たとえばエッチグにより、あるいは大きい表面積を
有する部分を有する領域を得るのに適する、その他の手
段により、調製される。

本発明に係り、「担体」の用語は、集塊状物を適当に
固定することができる。適当な支持要素のいずれをも意
味し、たとえば容器もしくは入れ物、あるいは微細容器
もしくは微細な入れ物、あるいは管または集塊状物を検
査の目的に対して適当に固定することができる、いずれ
かその他の種類の固形支持体を包含する。

一例として、担体は、個体状ガラスを支持することが
できるフィルターを有する微小なカラムの形態であるこ
ともでき、この場合には、個体状ガラスをそれぞれ、ヒ
スタミン含有試料と接触させることができ、次いで相当
する試薬または媒質で溶出することができる。

しかしながら、また、その他の種類の担体もしくは支
持体を使用することもでき、たとえばそれら自体は液体
の収容能力を有していないが、液体中に浸漬することが
できる形態の物体、たとえば固形もしくは中空のビーズ
のようなビーズ、あるいは試料中に浸漬して用いられる
小さい寸法の種々の形状の物体であることもできる。

担体は好ましくは、測定中に一般的な反応条件の下
に、実質的に不活性である物質、たとえばポリスチレン
などの熱可塑性合成樹脂よりなる。

無機質ヒスタミン結合性物質は、実質的に無定形また
は実質的に結晶形の構造であることができる。二酸化ケ
イ素を基材とする物質、すなわちかなりの割合または主
要割合で二酸化ケイ素を含有する物質、あるいはかなり
の割合または主要割合が二酸化ケイ素よりなる物質から
製造または形成された物質は、非常に適することができ
る。このような物質は、たとえば二酸化ケイ素を基材と
するガラス物質または石英であることができる。

本明細書で使用されているものとして、「ガラス物
質」の用語は、全体的に、または部分的に二酸化ケイ素
を基材としており、実質的に無定形の構造を有し、そし
て極めて高い粘度を有する物質を意味する。

本発明において使用することができる重要な種類のガ
ラスの例には、下記のガラスが包含される： 無定形の融合した二酸化ケイ素よりなる、二酸化ケイ
素ガラス； 代表的に、シリカ（約75％）、ソーダ灰（約20％）お
よび石灰（約５％）の融合した均質混合物よりなる、ソ
ーダー石灰型ガラス； 通常、酸化ホウ素（多くの場合に、約５％）をさらに
含有するソーダー石灰型ガラスである、ホウケイ酸ガラ
ス。

ホワットマン（Whatman）GF/Bガラスファイバーシー
ト（後記する）のガラス物質は、代表的なホウケイ酸ガ
ラスの例である。

特定の物性に係る要件に適合するように調製された、
多くのタイプのソーダー石灰型ガラスはまた、或る種の
金属酸化物、たとえばマグネシウム、バリウム、鉛、ア
エン、アルミニウム、リチウムまたはセリウムの酸化物
をさらに配合することによって製造される。

米国特許4,550,085には、ホワットマンGF/Bの名前で
市販されているガラスマイクロファイバーフィルターシ
ートから調製されたガラスマイクロファイバーを、ヒス
タミンの選択的結合に使用することに関する利点が記載
されている。この製造会社の製品情報によれば、これら
のファイバーを形成しているホウケイ酸ガラスは、次表
（表１）に示すことができるように、比較的高い酸化ホ
ウ素含有量を有するホウケイ酸ガラスである。この表１
は、このガラスの代表的組成を、ヒスタミン結合性に関
して試験した（後記する）その他のガラス物質とともに
示すものである。

本発明による方法で使用するのに充分のレベルでヒス
タミンを選択的に結合するガラス物質は、ホウケイ酸型
ガラス、たとえば純粋な二酸化ケイ素ガラスに限られる
ものではなく、成分として酸化カルシウムを含有してい
ない、ソーダー石灰型のガラスに類似する組成の多くの
実験室で製造されるガラスおよび成分として、金属アル
コキシドまたは非金属アルコキシドを基材の一部として
製造される多くの実験室で製造されるガラスはいずれ
も、有用なヒスタミン結合性を示すものと見做される。

結晶二酸化ケイ素を基材とする物質の例には、石英、
すなわち純粋な結晶SiO₂があり、これはヒスタミン結合
性を有することが、本出願人によって見い出された。

米国特許4,550,085、その一族の特許および本発明の
記載にもとづいて、当業者は、ここには特にあげられて
いないその他のタイプの物質のヒスタミン結合性を測定
することができるであろう。

しかしながら、ホワットマンGF/Bガラスマイクロファ
イバーは、市場から容易に入手でき、かつまた複製する
ことができるという観点から、現時点では、本発明によ
る方法で使用するためのガラスマイクロファイバーの調
製における原材料として好適である。ホワットマンGF/B
ガラスファイバーフィルターシートからのガラスマイク
ロファイバーの好適な製造方法は、例１（後記する）に
詳細に記載する。

本発明に係り、「結合剤」の用語は、別の物質を表面
付着により相互に結合させることができる物質のいずれ
をも意味するものとする。混乱をさけるために、米国特
許4,550,085およびその一族の特許において、「ヒスタ
ミン結合性物質」を示すものとして、「結合剤」の用語
が従来から使用されていたことに留意すべきである。こ
れに対して、本発明に係り使用されている結合剤の有利
な配合は、本発明以前には実現されていなかったことで
あることは勿論のことである。当然のこととして、本発
明に係り使用される結合剤は、ヒスタミン結合性個体の
適当な集塊状物形成をもたらすが、同時に、これらの個
体にヒスタミン含有流体を充分に接触させる結合剤であ
るべきである。化学的観点から、結合剤は、これらが測
定結果に有害に作用しないように選択しなければならな
い。結合剤は、適当には、合成有機ポリマーである結合
剤であることができ、通常水を含有する試料と接触して
いる間に、その場で集塊状物を結合させ、その結合状態
を保持するものであるべきものとして、これらのポリマ
ーは実質的に水不溶性であると好ましい。しかしなが
ら、たとえば水性分散液から適用される結合剤は、これ
らが一度適用されたならば、実質的に水不溶性を保持す
るかぎり、本発明の目的に完全に適している。

適当な結合剤の例としては、ポリビニルアセテートな
どのポリビニルエステル類またはビニルアセテート／エ
チレンコポリマーなどのコポリマーをあげることがで
き、これらは場合により、ポリビニルアルコールと組合
せて使用することができる。以下の説明から明らかなよ
うに、後者の種類の結合剤は、相互集塊状物形成および
集塊状物と担体との間の両方に対する付着物質としての
それらの結合能とともに、試料中のタンパク質などの体
液成分からの、存在する可能性のある干渉を減じるとい
う点で、干渉減少剤として、驚くほどの利点を示す。

結合剤の使用量は、結合剤およびヒスタミン結合性個
体の特性に依存する。結合剤の適当範囲は、ヒスタミン
結合性物質にもとづいて計算して、約0.1〜約20％結合
剤固体重量、特に約２〜約10％、好ましくは約４〜約８
％であると認められる。

本発明の特別の、重要な態様に従う場合には、ヒスタ
ミン結合性物質は、被験試料、特に体液試料（特に、赤
血球または赤血球成分／フラクション、あるいは類似の
干渉特性を有する成分、たとえばタンパク質成分などが
かなりの量で存在している全血または実質的な全血、あ
るいはその他の体液の試料）中の干渉成分に対する親和
性を減少させるように処理されているが、そのガラスの
ヒスタミン結合能は実質的に保留されている無機質物質
である。

いずれの特定の仮説にも束縛されないが、この干渉成
分に対する無機質物質の親和性の減少メカニズムは、こ
の物質の表面の極性および（または）表面張力の減少と
組合されており、これによって、干渉成分に対する無機
質物質の接着力が減じされる現象であるということがで
きるものと信じられる。

理解されるように、タンパク質、たとえばヘモグロビ
ンに対する接着力が減じられている無機質物質また、本
発明の方法において、格別に有利であり、これは通常、
このような物質が体液試料中のその他の干渉成分に対し
ても実質的に減少された接着力を示すからである（これ
は、本発明に関連するかなりの場合において、ヘモグロ
ビンが代表的な干渉成分であると考えられるからであ
る）。

従って、干渉成分に対するその接着力を減少させるた
めの、無機質物質の処理の有効性の尺度っは、通常、処
理された物質のヘモグロビンまたはモグロビン類縁体あ
るいは別の関連グロビン類（たとえば、ミオグロビンな
ど）に対する挙動を推定することによって、得ることが
できる； 適度のヒスタミン結合性を保有する状態におけるヘモ
グロビンまたはヘモグロビン類縁体あるいはその他のグ
ロビン類に対する接着力の減少は、本発明の一般的目的
に対する、処理された無機質ヒスタミン結合性物質の有
用性を増大する。

本明細書において、「処理」の用語が使用されている
が、干渉成分の無機質ヒスタミン結合性物質に対する減
少された親和性はまた、無機質物質の製造中に、この干
渉を減少する物質、たとえば極性減少物質を配合するこ
とによっても得ることができるものと理解されるべきで
ある；本明細書および請求の範囲において、この可能性
は、「処理された」、または「処理」あるいは「調製」
の用語に含まれるものとする。

「干渉成分に対する親和性」の用語は、干渉成分が固
体相と液体相との間に分布して、これらがヒスタミン結
合を干渉することを意味する。

この干渉成分の親和性は物理的および化学的な性質の
ものであることができ、固体相と液体相との、それぞれ
の極性に関して、あるいあ前記したように、非極性物質
の場合には、表面張力に関して、表わすことができる。

ヒスタミン結合性無機質物質（以下の説明において、
ガラスをその例として用いる）の表面の極性および（ま
たは）表面張力の減少は、極性有機ポリマーまたは極性
有機ポリマーの混合物による処理によって得ることがで
きる。この処理によって、中でも極性誘引力がヘモグロ
ビンおよびその他のタンパク質系巨大分子、ならびに血
液または生物学的液体中のその他の成分をガラスに結合
させる傾向がある場合に、ガラス表面を極性が低い方向
に変え、これらの物質に対する誘引力または接着力を低
下させる効果が得られる。２相間の界面を可逆的に分離
するために必要な力、すなわち接着力は、次式で表わす
ことができる： γ＝γＡ＋γＢ−γAB この式において、γＡは相Ａの表面張力であり、γＢ
は相Ｂの表面張力であり、そしてγABは２相間の界面張
力である。

すなわち、たとえばＡがガラス表面であり、そしてＢ
がタンパク質分子である場合には、γＡおよびγＢは、
両方ともに高い数値を有し、他方、γABは比較的低い数
値を有する。従って、高い接着力γが生じる。ガラス表
面を変性することによって、γＡがさらに低く、γＢが
その数値を保有し、そしてγABが同一であるか、または
さらに高くてもよい、変性ガラス表面を得ることによ
り、さらに低い接着力γを得ることができる。

この原則を使用することによって、ヒスタミンの結合
に対して、ヘモグロビンなどの高度に接着性の血液中の
巨大分子の結合が減じられる。このような変性ガラスに
対するヒスタミン結合に関して、変性ガラス表面および
ヒスタミンに対する表面張力の関与の合計は非変性ガラ
スの場合よりも低下させることができるが、他方で、生
じる接着力γを未処理ガラスの接着力と充分に、実質的
に等しくすることができるように、界面張力γABが低下
される。

従って、本発明の目的に対して施される、無機質ヒス
タミン結合性物質の処理は、この物質の表面の極性また
は表面張力を適当に低下させるが、ガラスの測定するヒ
スタミンの結合能を保留させる処理剤を用いることによ
って達成することができる。

この目的に必要な処理剤は、たとえばいわゆる溶解パ
ラメーターが極性ヒスタミン分子に近似しており、ヒス
タミン結合表面に対するヒスタミンの接近に関して障壁
作用を示さない、極性ポリマー、すなわち特に、酸素ま
たは窒素などのヘテロ原子を含有するポリマーである。
このようなヘテロ原子含有基の例には、ヒドロキシ基、
カルボキシ基、エステル基、カルボニル基、エーテル基
および酸素または窒素などのヘテロ原子を含有するヘテ
ロ環状基がある。

適当なポリマーに係り、特定の広い制限はないが、こ
れらのポリマーは、ガラス表面上に均一に分布させるこ
とができないほどの高い分子量を有するべきでないこと
に留意しなければならない。

ポリマーは、液状分散液または溶液から、いずれか適
当な方法で適用することができ、あるいはその場でモノ
マーから重合させることもできる。

ポリマーはホモポリマーに制限されず、適当には、ま
た或る場合には有利に、コポリマーあるいはポリマーの
混合物、あるいはポリマーとコポリマーとの混合物であ
ることができる。全ての場合に、決定的特徴は、ポリマ
ーがガラス表面の実質的なヒスタミン結合能を保留させ
ながら、ガラス表面に対して極性または表面張力を低下
させる能力を有することである。

ポリマーあるいはコポリマー、またはポリマーおよび
（または）コポリマーの混合物の、本発明の目的に対す
る適当性は、既知の方法で行なわれる初期的試験、たと
えば接触角度の測定および溶解パラメーターの試験によ
って、決めることができる。大部分の場合に実用される
試験項目は、生成する処理ガラス表面が、未処理ガラス
表面と比較して、必要なヒスタミン結合能を保留しなが
ら、潜在的に干渉性の試料成分に対し減じられた親和性
を有することにある。

使用される溶解パラメーターは、適当には、「Hand b
ook of Solubility Parameters and other Cohesion Pa
rameters」.A.F.M.Barton,CRC Press（1983年）（以下
で参考文献Ａと記す）の記載のパラメーターであること
ができ、この文献の記載を関連記載として、ここに組入
れる。Charles M. Hansenによって開発された、３次元
溶解パラメーター理論は有用なモデルであり、この理論
は、溶剤または溶剤混合物の重合体を溶解させる能力の
予想に有用である。このモデルで用いられる３種の溶解
パラメーターは、「分散」、「極性」および「水素結
合」と称されるパラメーター（それぞれ、δ_D，δ_Pおよ
びδ_H）である。

ヒスタミンの溶解パラメーターは、参考文献Ａ、6.8
章に記載されているようなグループ−関与（group−con
tribution）法を用いて計算することができ、あるいは
経験的に決定することができる。結合剤の溶解パラメー
ターはまた、グループ−関与法（参考文献A,14.5章参
照）により、または経験的に決定することができ、ある
いはまた、データ作成により決定することができる（た
とえば、参考文献A,14.3章参照）。本発明の場合に、こ
れは、干渉減少剤としての結合剤の溶解パラメーターが
ヒスタミンの溶解パラメーターと近似しているべきであ
ることを意味する。

Hansenの３次元等位系におけるヒスタミンの溶解パラ
メーターは、結合剤の溶解パラメーター範囲内に含まれ
る。ヒスタミン溶解パラメーターの位置が結合剤の溶解
パラメータ範囲に包含されていない場合には、このよう
な結合剤はヒスタミンに対する障壁として作用し、これ
によって、ヒスタミン結合物質に対するヒスタミンの接
近が妨げられる。好ましくは、ヒスタミンは結合剤中で
自由に溶解する。

本発明に係り用いられるものとして、好適な結合剤
は、上記物性を示すことに加えて、また試料中の干渉成
分、たとえばタンパク質またはその他の生物学的巨大分
子の接着を実質的に防止するのに充分に低い表面張力を
示すべきである。関連する表面張力データは、たとえば
「Polymer Interface and Adhesion」、S.Wu,Marcel De
kker,New York and Basel（1982年）に見い出すことが
でき、この記載をここに引用し、関連記載として組入れ
る。

ポリビニルアルコールで安定化されているビニルアセ
テート／エチレンコポリマーの水性懸濁液または分散液
は、干渉減少剤として、集塊状物表面の処理に、および
ガラスファイバーを相互に付着させて、集塊状物を形成
するために、かつまた、本発明のもう一つの態様に関連
して、この集塊状物を支持体に固定するために、優れた
ポリマーであることが見い出された。従って、現時点で
は、このような懸濁液または分散液を使用すると好まし
く、以下の例で例示する。

前記Hansenの理論を本発明によるヒスタミン結合性物
質と結合剤との好ましい組合せに適用した場合には、こ
の理論は、３次元等位系におけるヒスタミンの溶解パラ
メーターの位置が使用タイプのビニルアセテートを基材
とするコポリマーの溶解パラメーター範囲に包含される
ことが確実に予想される。換言すれば、ヒスタミンは、
ヒスタミン結合性物質上に存在するこのような結合剤の
層を通過して、自由に移動できるものと予想される。好
ましくは、その溶解パラメーター範囲がヒスタミンの溶
解パラメーター範囲を含む処理剤によって、ヒスタミン
結合性物質を処理する。

この処理に使用するポリマーの量は、使用される特定
の無機質物質および特定のポリマーに適合するものでな
ければならない。干渉の減少（表面変性）効果および結
合剤付着効果の両方を得るために、同一のポリマーまた
はポリマー混合物を使用する場合には、この量は、表面
変性だけを目的とする場合よりも、一般に多い。しかし
ながら、僅かな程度の表面変性が得られる条件から、無
機質ヒスタミン結合性物質の集塊状物が得られる条件ま
での種々の量を使用することができ、試料中のヒスタミ
ン以外の成分の干渉の減少が主要理由である場合のポリ
マーの量は、ヒスタミン結合表面またはその近隣におけ
る、変化された空間的／立体的状態にさらに関連するこ
とがある。

結合剤を用いて、ガラスマイクロファイバーが、板の
ウェルに固定されている本発明の好ましい態様によっ
て、これらのファイバーがウェルに機械的に固定されて
おり、かつまた望ましくない血液成分の除去に必要な洗
浄処理を確実に実施できる利点が得られる。

本発明のもう一つの態様において、全血試料中のヒス
タミンの測定方法はさらに、当該作用剤に対して感受性
の細胞からのヒスタミン放出を誘発することができる作
用剤を存在させることを包含しており、この場合には、
この作用剤は、試料がこの作用剤と集塊状物との両方に
接触するように存在させる。このような作用剤は、アレ
ルゲン、すなわち或る対象においてアレルギー反応を生
じさせる抗原であることができる。重要で、関連性を有
するアレルゲンの例には、通常、空気中に存在し、従っ
て吸入されうるアレルゲン、たとえばカンバ、芝および
ヨモギの花粉中のアレルゲン、ウマ、イヌまたはネコの
フケ中のアレルゲン、ダニ、アレルゲンおよびカビアレ
ルゲンがある。食物および食品中に存在することがで
き、従って摂取することができるアレルゲンには、牛
乳、鶏卵、ライムギ粉、小麦粉、オートミール、豚肉、
牛肉、タラ肉、大豆およびグリーンピースのアレルゲン
が含まれる。

細胞からのヒスタミン放出を誘発することができる重
要な作用剤は、抗−IgEである。

集塊状物として、同一区画内にアレルゲンを配合する
と、明らかに有利であり、これはこの試験セットの使用
者がアレルゲンエキスを入手し、そして添加する必要が
ないからである。

貯蔵寿命および取り扱い上の観点から、アレルゲン
は、集塊状物と一緒に、実質的に乾燥状態で存在させる
と、特に有利である。本発明の試験セットの好ましい態
様（後記する）においては、微量滴定板のウェルの形態
の担体に、乾燥させ、標準化したアレルゲンエキスを、
集塊状物とともに存在させる。

本発明のさらにもう一つの態様において、当該作用剤
に対して感受性のある細胞からのヒスタミン放出を誘発
することができる作用剤が、集塊状物と一緒に存在して
いる、全血試料中のヒスタミンの測定方法はまた、この
ようなヒスタミン放出誘発作用剤に対して感受性の細胞
からのヒスタミンの放出を増強することができる作用剤
を含有することを含んでいる。この場合には、ヒスタミ
ン放出−増強作用剤は、集塊状物およびヒスタミン放出
誘発作用剤とともに存在させる。

本発明によって開示された方法のうちの好適態様で用
いられる方法、すなわち螢光測定法などの測定方法を使
用する場合には、中程度のバックグラウンド濃度のヒス
タミンを存在させることが有利であると考えられ、これ
によって、ヒスタミンによる螢光のベースラインレベル
が、細胞からのヒスタミンの最低放出レベルの測定の不
確実性を格別に減少させる結果が得られる。

本発明のもう一つの態様は、非特異的に結合した血液
成分の脱離または分解を促進する作用剤を含有する媒質
を使用する特別の洗浄処理の使用を包含している。これ
によって、検査に全血を容易に使用することができるよ
うになる。

このような作用剤は、使用される媒質中における表面
張力に影響を及ぼす作用剤、好ましくは界面活性剤（su
rfactants）、特に洗剤よりなる群から選択することが
できる。洗剤は、アニオン性、カチオン性、双イオン性
またはイオン性の洗剤であることができ、好ましくは非
イオン性洗剤である。適当な洗剤の例を以下に示す。

表2:洗剤 アニオン性洗剤 アルキルスルフェート塩、たとえばラウリル硫酸ナト
リウム、ラウリル硫酸トリエタノールアンモニウム、セ
チル硫酸トリエタノールアンモニウムおよびオレイル硫
酸トリエタノールアンモニウム： アルキルスルホネート塩、たとえば“Hostapur SAF−
60"〔これは、CH₃CH（Ｒ）SO₃ ^- Na⁺タイプの化合物で
あり、Ｒ＝長鎖状アルキルである〕； アルキルベンゼンスルホネート塩、たとえばナトリウ
ムドデシルベンゼンスルホネート。

カチオン性洗剤： 四級アンモニウム塩、たとえばセチルトリメチルアン
モニウムブロマイドおよび“ベンザルコニウムクロライ
ド”〔これは、一般式C₆H₅CH₂N(CH₃)₂(R)⁺Cl^-（式中、
Ｒ＝C₈〜C₁₈アルキル）で示されるアルキルジメチルベ
ンジルアンモニウムクロライドの混合物である〕。

双イオン性洗剤： “Sulfobetaines"、“Lysolecithin"、“Empigen B
B"、“Zwittergent 3−12"および“Zwittergent 3−1
4"。

非イオン性洗剤： アルキルフェニルポリオキシエチレン、“Berol 09"
などのノニルフェニルポリオキシエチレン類および“Tr
iton X−100"、“Triton X−102"、“Triton X−114"お
よび“Triton X−165"などのｐ−tert−オクチルフェニ
ルポリオキシエチレン類を包含する； ポリオキシエチレンアルコール類、たとえば“Brij 3
5"、“Brij 38"、“Lipal 9LA"、“Lipocol C−20"、
“Lauromacrogol 400"および“Cetomacrogol 1000"、 ポリオキシエチレンソルビトールエステル類、たとえ
ば“Tween 80"。

所望により、異なる洗剤の混合物を使用することもで
きる。

１種または２種以上の干渉成分の構造を、それらのヒ
スタミン結合性物質からの脱離が促進されるように変え
る酵素はまた、適当な作用剤であることができる。この
ような酵素は、たとえばタンパク質様の血液成分をさら
に小さい断片に分解するタンパク質分解酵素であること
ができる。市販されている「広いスペクトル」を有する
タンパク質分解酵素の例には、“Alcalase"、“Esperas
e"、“Savinase"、“Maxatase"および“Rapidase"があ
る。

別の態様では、洗剤／酵素組合せ作用剤を使用するこ
とができる。この種の適当な組合せには、“Biotrinon"
（Bie ＆ Berntsen製、Denmark）があり、これは、非イ
オン性洗剤“Berol 09"とプロテアーゼ“Alcalase"とを
含有する（後記参照）。

本発明の方法に供する試料は、生検試料であることが
できる。生検材料は、当該材料がヒスタミンを放出する
ことのできる細胞を含有しているかぎり、動物または人
間から得られる材料のいずれでもあることができる。生
検材料は、呼吸器系、特に気管支器官系の組織の一部分
および肺組織； 胃腸器官；腹腔または胸腔からの材料；あるいは病理
学的組織から得ることができる。

内視鏡検査、たとえば胃、12指腸および（または）空
腸／回腸などの胃腸器官の内視鏡検査において得られる
生検材料も、しばしば使用される。さらにまた、気管支
鏡検査により得られる細胞を検査することもできる。

生検材料は、適当な条件の下に保持しなければならな
い。すなわち適当な媒質中に保持しなければならない。
代表的な細胞分散液は、生検材料を小片に切り、これら
の小片を、たとえばコラゲナーゼを含有する媒質中に入
れ、引続いて、インキュベートして、細胞を分散して含
有する調製物を得ることによって得られる。

ヒスタミン放出性細胞に富む調製物の例には、肥満細
胞および（または）好塩基球の調製物がある。

人間の腸の肥満細胞に対する、本発明の方法の適用可
能性は、Nolte等によるAgents and Actions,26巻3/4（1
989年）に示されており、ここに引用して組入れる。

本発明のもう一つの態様は、ヒスタミン含有細胞か
ら、ヒスタミン放出を誘発することができる作用剤を同
定または定量するための方法および試験セットに関する
ものである。この方法は、該当作用剤と接触すると、媒
質中にヒスタミンを放出することができる細胞ととも
に、この作用剤を媒質中でイソキュベートし、この媒質
を、（ａ）ヒスタミンを結合することができる物質およ
び（ｂ）結合剤よりなる集塊状物と接触させ、試料中の
ヒスタミンの少なくとも一部分をこのヒスタミン結合性
物質に結合させ、結合したヒスタミンの量に基づいて、
試料中のヒスタミンの量を測定し、この結合ヒスタミン
の量を、既知量の当該作用剤から得た標準値に対比し、
次いでこの作用剤を同定または定量することよりなる方
法である。

この目的に有用な市販の試験セットは、たとえば図１
に例示されているようなカセットである。ただし、この
図１における試験セットのウェルはアレルゲンを含有し
ていない。

本発明のこれらの態様を使用する標準化されている方
法は、広範囲のアレルゲンの簡単で、再現性を有する標
準化方法を提供する。これは、これらの方法が、“イン
ビボアレルギー反応のミニチュア”と称することができ
る方法にもとづいているからである。

図面の詳細な説明 図１は、上方表面12から下方に向って伸びているウェ
ル11を有する微量滴定型の部品10を示す透視画図であ
る。

ウェル11はそれぞれ、その底部に、図２に関して詳細
に説明するようなヒスタミン結合性個体よりなる、固定
されている集塊状物を有する。

図２は、図１に示されているウェル11のうちの１個の
横断面を示している。ウェルの底部の集塊状物13は、２
〜20μｍの長さと0.3〜２μｍの厚さとを有し、ビニル
アセテート／エチレンコポリマーのような結合剤によっ
て結合されている、ガラスマイクロファイバーのような
ヒスタミン結合性物質の個体よりなる。この結合剤はそ
の水性懸濁液から適用される。14は、集塊状物の主要部
分の上部に形成されることがしばしば見い出される結合
剤のミニスカス（miniscus）を示し、そして15は、集塊
状物の上方表面を示す。このファイバー集塊状物は、こ
の集塊状物中のマイクロファイバーのサイズおよびサイ
ズ−分布などの多くの因子、ならびに本明細書に説明さ
れ、例示されているような、集塊状物の生成方法によっ
て決定されるファイバー濃度（あるいは別様には、有孔
度）を有する。このファイバー集塊状物の製造は、たと
えば例1a〜ｄに記載する。

図３〜４には、ウェル11の底部における集塊状物の製
造方法の工程が例示されている。図３において、前記さ
れており、例１に例示されている、ビニルアセテート／
エチレンコポリマー結合剤の分散液のような、結合剤と
ガラスマイクロファイバーとを含有する懸濁液が、分配
器具16からウェル11に適用されている。この懸濁液は、
代表的に、例１に記載の水性懸濁液である。結合剤の分
散微小粒子とファイバーとの両方の存在は、数字31およ
び33によって、示されている。

図４は、図３において適用された分散液を蒸発させ、
図２に関連して説明されているものに相当する構造が得
られた後の、状態を示すものである。

図５は、アレルゲンの水性溶液のような、ヒスタミン
放出誘発作用剤の液状供給物30（溶液）をウェル中に導
入する例を示すものである。この水性溶液30の導入の後
に、水を蒸発させると、その上方面15がヒスタミン放出
誘発作用剤を組合されている集塊状物13を含有するウェ
ルが得られる。このように、ヒスタミン放出誘発作用剤
を、蒸発される液体から適用する場合には、このウェル
内の集塊状物と組合される、アレルゲンのようなヒスタ
ミン放出誘発作用剤の配置様相は、種々の因子、たとえ
ばアレルゲンの化学的特徴、アレルゲンの分子サイズな
どに依存するが、いずれの場合にも、ヒスタミン放出誘
発作用剤は、試料がアレルゲンと接触し、その後で、あ
るいは実質的に同時に、集塊状物と接触するように、集
塊状物と組合せるべきである。しかしながら、本発明の
この態様の主要特徴は、試料がアレルゲンおよび集塊状
物と接触する、正確な時間的順序にあるのではなく、放
出されたヒスタミンを示す、或る量のヒスタミンが、集
塊状物中のヒスタミン結合性物質に結合され、これによ
って本発明の方法によって、この結合した量のヒスタミ
ンを測定できるような方法で、アレルゲンを試料導入の
前に、ウェル中に存在させ、試料中の細胞からのヒスタ
ミン放出を誘発できる（これは試料とアレルゲンとの反
応による）ことにあるものと理解されるべきである。

図６は、例6.1で説明する。

図７は、本発明の方法に有用な試験セットの別の態様
を示すものである。この試験セットは、内容物（その全
体を17で示す）を有する容器よりなる。この容器は、固
定もしくは収容されているヒスタミン結合性物質を充填
して含有するカラムのような円柱形状容器18であること
ができる。

適当な材料、たとえばポリスチレンから形成されてい
る容器カラム18内には、床または層19の形態のヒスタミ
ン結合性物質の個体、特に二酸化ケイ素を基材とする物
質、特にガラス物質から製造されている粒子またはファ
イバーが、底部フィルターおよび場合により、頂上部フ
ィルター21によって、固定もしくは収容されて、配置さ
れている。

別の態様として、ヒスタミン結合性個体、特にガラス
物質から製造されているファイバー（たとえば、マイク
ロファイバー）または粒子（たとえば、粉末）の形態の
ヒスタミン結合性個体を、結合剤およびこれらの個体か
らなる集塊状物の形態で存在させることもできる。特定
の態様において、層19は、それら自体はヒスタミン結合
能を有していないか、または実質的に有していないが、
ヒスタミン結合性物質の粉末またはファイバーのような
粒子の支持体として作用するファイバーよりなる層を表
わすこともでき、この場合には、ヒスタミン結合能を有
していないか、または実質的に有していない、上記ファ
イバーにより構成されているファイバー塊状物内に、ヒ
スタミン結合性物質が分布するようにする。この態様で
は、それら自体が、この層を通る試料流にとって最適で
はないような幾何学的特徴を有し、そして（または）充
分のフィルター効果または分布作用を有していない、ヒ
スタミン結合性物質も、支持体として作用するファイバ
ーと組合せた場合には、有用であることがある。

層19の頂上部に存在する任意のフィルター21は、層19
の境界をさらに定めるものとしての役目を果し、体液ま
たは体組織の試料が、誘発作用剤、たとえばアレルゲン
にさらされた後に、ヒスタミン結合性物質と接触される
ように、たとえばその頂上部に誘発作用剤と備えていて
もよい。図８に示されている態様では、層19は、１種の
個体からなるか、あるいは上記したような２種または３
種以上の個体の複合体よりなり、この層19は、所望によ
り、結合剤が、存在する粒子またはファイバーを集塊状
物に形成している、１つまたは２つ以上の集塊状物の形
態であることもできる。

層19に関して説明されている複合体はまた、図２に関
連して示され、説明した、ウェル内に配置される層13で
も有用でありうるものと理解される。すなわち、図２の
層13はまた、たとえばヒスタミン結合性物質の個体（こ
の個体は所望により、結合剤によりファイバー物質と集
塊状物を形成していてもよい）のための支持体および
（または）分配体として働く、“不活性ファイバー”よ
りなることもできる。このような複合体層を沈降によっ
て調製する場合には、粉末状粒子などの粒子の沈降速度
は、ファイバーの沈降速度に適応させなければならず、
これによって、ファイバー塊中における粒子の所望の分
布を得るべきであり、そして（あるいは）ファイバー層
が先ず形成され、そこに粉末および場合により、追加の
ファイバーが配置されるように、粉末より先に、ファイ
バーを沈降させるべきである。この結果として、ファイ
バー塊中におけるヒスタミン結合性個体の実質的に均一
な分布を得ることができ、あるいはヒスタミン結合性個
体をファイバー塊中の実質的に１つまたは２つ以上の層
として配置することができる。

容器17は、使用される特定の方法に応じて、数ミリリ
ッターの容積を収容することができ、たとえば数ミリメ
ーターの直径を有する管であることができ、あるいは容
器17は、毛細管であることもできる。

例１ ガラスファイバー被覆を有する微量滴定板の調製 a.ガラスファイバー懸濁液の調製 ホワットマンGF/Bガラスマイクロファイバーフィルタ
ーシート（5g）を、2cm×2cmの断片に切り、ボールミル
内で粉砕し、粉砕ガラスマイクロファイバーを得た。

この粉砕ガラスファイバー24g（上記の処理を全部で
５回行なって得られたもの）を、１褐色ガラスビン中
で、室温において、新しく蒸留した水1000ml中に懸濁し
た。

この懸濁液を１分間、充分に攪拌し、次いで直ちに、
２個の1000mlガラスビーカーに移した（それぞれ、500m
l;各ビーカーの液体の高さは8cmである）。粉砕ファイ
バーを次いで、室温で２分間沈降させ、その後、上澄液
を、注意深くデカンテーションすることによって、清潔
な１褐色ガラスビンに移した。この上澄液は、約２μ
ｍ〜約20μｍの寸法の粉砕ファイバーを含有する。

b.結合剤分散液の調製 この目的には、市販のビニルアセテート／エチレンコ
ポリマー分散液（Vinnapas−Dispersion EP400 ;Wacker
Chemie Danmark A/S,Denmark）を使用した。この製品
は約55％（重量／重量）の乾燥物質含有量および約1.06
g/cm³の比重を有し、主要エマルジョン粒子サイズは0.8
μｍ（20℃）である；ポリビニルアルコールをエマルジ
ョン安定剤として配合する。

この分散液を、室温で充分に攪拌することによって、
新しく蒸留した水（100mgコポリマー/ml水）でさらに稀
釈した。

c.結合剤／粉砕ガラスファイバー分散液の調製 上記のとおりに調製された結合剤分散液12.5mlを、粉
砕ガラスファイバー懸濁液1000mlに加え、混合物を攪拌
した。

生成する結合剤／粉砕ガラスファイバー分散液600ml
を、1000mlガラスビーカーに移した。

d.微量滴定板における固定 蠕動ポンプを使用し、結合剤／粉砕ガラスファイバー
分散液50μｌを、ポリスチレン製微量滴定板のウェルの
それぞれに移した。

５個の微量滴定板に充填した後に、これらの滴定板
を、直ちにオーブン（温度:95±２℃）に入れ、一夜に
わたり乾燥させた。

e.コーティング分散液の調製 例1.dに従い調製された滴定板には、所望により、も
う１枚のコーティングを施すことができる。この目的に
は、市販のポリビニルアルコール（W25/190、Wacker Ch
emie Danmark A/S）の10％（重量／容積）の原液を使用
し、この原液60μｌを10ml蒸留水中に分散させる。

f.微量滴定板の被覆 上記のとおりにして調製されたコーティング分散液50
μｌを、結合剤／粉砕ガラスファイバー集塊状物が1.d
に従い固定されている、微量滴定板のウェルのそれぞれ
に施用する。

この微量滴定板に次いで、固定処理に関して上記した
とおりに、一夜にわたり乾燥させる。

例２ アレルゲンとその予備インキュベーション 例2.1 ガラスファイバー被覆滴定板に対する吸入型アレルゲ
ンの被覆 例１に記載のとおりにして調製された滴定板を使用し
た。下記の溶液を調製した： 人間血清アルブミン原液：人間血清アルブミン（SIGM
A製）0.3mg/蒸留水100ml; 人間血清アルブミン検査用稀釈液（HSA）：人間血清
アルブミン原液180μｌを蒸留水100mlで稀釈した（この
溶液は、冷蔵庫内で貯蔵する）； ヒスタミン原液（100mg/l）：ヒスタミン100mgを蒸留
水で１にした； ヒスタミン検査用溶液（WHS）（5mg/l）：原液250μ
ｌを蒸留水で5mlにまで稀釈した。

抗−IgE含有ウェル用には、Behringwerke.Germanyか
ら供給されている抗−IgE標準物質（以下で、AISと記す
る）（400,000単位/ml）を使用した。

微量滴定板ウェルには、次の記号を付けた： 横列:A−Ｈ、縦列:1−12。各ウェルには、投入用具か
ら、以下に概述したとおりにして調製される溶液25μｌ
を分配して、充填した。

一例として、滴定板には、次のとおりに投入すること
ができる。

ヒスタミン標準 ウェルA1: 210μl WHS＋20790μl HSA＝50ng/ml ウェルB1:5600μl A1の溶液＋ 1400μl HSA＝40ng/ml ウェルC1:4200μl A1の溶液＋ 2800μl HSA＝30ng/ml ウェルD1:2800μl A1の溶液＋ 4200μl HSA＝20ng/ml ウェルE1:1400μl A1の溶液＋ 5600μl HSA＝10ng/ml ウェルF1: 0μl A1の溶液＋ 7000μl HSA＝ 0ng/ml ウェルG1: 0μl A1の溶液＋ 7000μl HSA＝ 0ng/ml ウェルH1:1400μl A1の溶液＋ 5600μl HSA＝10ng/ml ウェルA2:2800μl A1の溶液＋ 4200μl HSA＝20ng/ml ウェルB2:4200μl A1の溶液＋ 2800μl HSA＝30ng/ml ウェルC2:5600μl A1の溶液＋ 1400μl HSA＝40ng/ml ウェルD2: 210μl A1の溶液＋20790μl HSA＝50ng/ml 抗−IgE標準： ウエル E2: 225μl AIS＋ 11250μl HSA ウエル F2:660μl E2の溶液 ＋ 3150μl HSA ウエル G2:112μl E2の溶液 ＋ 4388μl HSA ウエル H2:112μl E2の溶液 ＋ 4388μl HSA ウエル A3:112μl E2の溶液 ＋ 4388μl HSA 吸入型アレルゲン標準：縦列３〜12（ウェルA3を除
く）。（Pharmacia,Swedenにより供給されている、吸入
型アレルゲンエキス：カンバ、芝およびヨモギに関して
は、100,000BU/ml、その他の全部に関しては、10,000BU
/ml）。

縦列3:カンバ［ベツラ ベルコーサ（Betula verrucos
a）］ 縦列4:芝［フェレウム プラテンス（Phleum Pratens
e）］ 縦列5:ヨモギ［アンボロシア アルテミシホリア（Ambr
osia artemisifolia）］ 縦列6:ウマのフケ 縦列7:イヌのフケ 縦列8:ネコのフケ 縦列9:コナダニ［デルマトファゴイデス プテロニシヌ
ス（Dermatophagoides pteronyssinus）］ 縦列10:コナダニ［デルマトファゴイデス ファリナエ
（Dermatophagoides farinae）］ 縦列11:カビ菌［アルテルナリア テヌイス（Alternari
a tenuis）］ 縦列12:カビ菌［カルドスポリウム ヘルバルム（Clado
sporium herbarum）］ 横列Ａおよび横列Ｂ（カンバの場合のウェルA3を除
く）： カンバ、芝およびヨモギの場合:80μｌアレルゲンエ
キス＋7920μlHSA; その他の全部のアレルゲンの場合:800μｌアレルゲン
エキス＋7200μlHSA; 横列C:840 μl AおよびＢの溶液＋2160 μl HSA 横列D:240 μl AおよびＢの溶液＋2760 μl HSA 横列E:110.5μl AおよびＢの溶液＋4399 μl HSA 横列F:870 μl AおよびＢの溶液＋2130 μl HSA 横列G:234 μl AおよびＢの溶液＋2766 μl HSA 横列H: 67.5μl AおよびＢの溶液＋2932.5μl HSA ウェルを充填した後に、この滴定板をオーブン中で37
℃において、一夜にわたり乾燥させた。

これらの滴定板を次いで、下記のとおりに試験した： 各バッチからの10個の滴定板をそれぞれの、縦列１お
よび２内のヒスタミン標準を、螢光測定（後記する）に
より検査し、同一バッチからの３個の滴定板のウェルの
全部をまた、螢光測定により検査した。既知であり、充
分に特徴が確認されているアレルゲンを含有する、３人
の献血者から採血した血液試料を、吸入型アレルゲンの
標準の試験に使用した。

例2.2 ガラスファイバー被覆滴定板の食物アレルゲン被覆 例１に記載のとおりにして調製された滴定板（60個の
滴定板）を使用した。食物アレルゲンエキス以外は、例
2.1に記載の溶液と同一の溶液を使用した。

微量滴定板のウェルには、例2.1に記載のとおりに記
号を付ける。各ウェルに、以下に概述するようにして調
製された溶液25μｌを、投入用具から分配して充填し
た。

ヒスタミン標準： 例2.1と同一。

抗−IgE標準 例2.1と同一。

食物アレルゲン標準：縦列３〜12（ウェルA3を除く）。

（ALK,Denmarkにより供給されている食物アレルゲン
エキス：鶏卵の場合:1:100（重量／容積）；その他全部
の場合:1:20（重量／容積）。

縦列3 : 牛乳 縦列4 : 鶏卵 縦列5 : ライ麦粉 縦列6 : 小麦粉 縦列7 : オートミール 縦列8 : 豚肉 縦列9 : 牛肉 縦列10: タラ肉 縦列11: 大豆 縦列12: グリーンピース 横列 Ａおよび横列 Ｂ（牛乳の場合のウェルA3を除
く）： 300μｌアレルゲンエキス ＋ 2700μl HSA 横列 C: 679μl かおよびＢの溶液＋1750μl HSA 横列 D: 637μl Cの溶液＋1770μl HSA 横列 E: 154μl Cの溶液＋1750μl HSA 横列 F: 154μl Dの溶液＋1750μl HSA 横列 G: 707μl Fの溶液＋1750μl HSA 横列 H: 735μl Gの溶液＋1750μl HSA これらの滴定板を例2.1に記載のとおりに、乾燥さ
せ、そして試験した。例1.fに従い調製されるコーティ
ングを有する滴定板もまた、同様に予備インキュベート
することができる。

ヒスタミン放出の検査 例３ a.試料源 各患者から、静脈穿刺によって血液を採取し、適当な
抗凝血剤、好ましくはヘパリン（たとえば、ナトリウム
またはカリウムヘパリネートとして使用する）を含有す
る、適当なプラスティックまたはガラスの管（たとえ
ば、“Venoject"管）内に集めた。このヘパリンは、た
とえば血液5mlを集める場合には、３単位ヘパリン/ml血
液になるように、30単位ヘパリン/ml溶液0.5mlの量で使
用する。一般に、5mlの試料を集めるが、１個の滴定板
で全部のアレルゲンに対するアレルギーを試験する場合
には、2.5mlの試料でも充分である。１種のアレルゲン
に対するアレルギーを試験するためには、1mlほどの少
量の血液でも充分である。

血液試料は通常、20〜25℃で保存する（さらに高い温
度では、試料の早すぎる変性および劣化が生じ、また低
くすぎる温度では、沈殿が生じる）。試料は通常、普通
郵便として郵送でき、好ましくは試料を入手してから24
時間以内に検査する。しかしながら、入手して48時間後
でもまだ、充分の検査を行なうことができる。

b.検査に使用する溶液および滴定板の調製 例2.1および例3.2に記載のとおりに調製された滴定板
を使用した。

下記の溶液を調製した： 人間血清アルブミン（HSA）検査用稀釈液：例2.1に記
載のとおり； ヒスタミン検査用溶液（WHS）（5mg/l）：例2.1に記
載のとおり； PIPES緩衝液:PIPES 3.02g〔ピペラジン−N,N′−ビス
（２−エタンスルホン酸）〕、酢酸ナトリウム 19.05g
および酢酸カリウム0.49g、1M TRIS溶液20〜21ml〔トリ
ス（ヒドロキシメチル）アミノメタン〕（最終pH7.4を
得る）、1M CaCl₂ 600μｌおよび1M MgCl₂ 1100μｌを
蒸留水で１にする。この原液は、冷蔵庫内で保存す
る。

検査用緩衝液:PIPES緩衝液に、下記の成分を、使用の
直前に加えた：グルコース（1g/PEPES溶液１）、HSA
（1.6ml/PIPES緩衝液１）およびヘパリン溶液（LEO、
ヘパリン酸ナトリウム、5000IU/ml;3ml/PIPES緩衝液１
）（このヘパリン溶液は、冷蔵庫内に保存した）； 中間処理用ヒスタミン−緩衝剤溶液（IHBS）（100ng/
ml）:WHS100μｌを検査用緩衝液で5mlに稀釈する； ブランクヒスタミン−緩衝剤溶液（HBS）（10ng/m
l）：中間処理用ヒスタミン−緩衝剤溶液5mlを、検査用
緩衝液45mlで稀釈する； 洗剤／酵素溶液：“Biotrinon"5mg（Bie ＆ Berntse
n,Denmark）を、蒸留水10mlに溶解する； OPT溶液:o−フタルジアルデヒド5mg〔分析用品質、Fl
uka製〕を、メタノール500μｌに溶解し、この溶液を、
0.05M NaOHで10mlに稀釈する；最終pH:12.56; 0.59％過塩素酸;pH1.16。

各ウェルに、HBS25μｌを導入した、すなわち0.25ng
ヒスタミン／ウェルにする（“Easy Dispenser"を使用
する）。次いで、この滴定板および血液試料を38℃のオ
ーブン中に1/2時間入れた。

各ウェルに、次いで血液25μｌをピペットで加え（Ep
pendorph ピペットを使用する）、次いでこの滴定板に
おおいをし、38℃で１時間、インキュベートした。次い
で、免疫−洗浄（immuno−wasker）装置内において、脱
イオン水で５回、洗浄した。

各ウェルに、洗浄／酵素溶液50μｌをピペットで加え
（Volac分配装置を使用）、次いでこの滴定板におおい
をして、38℃で1/2時間インキュベートした。

滴定板は次いで、前記のとおりに、５回洗浄した。

各ウェルに、OPT溶液75μｌを加え（“Easy Dispense
r"を使用）、その後、この滴定板を室温で10分間放置し
た。

各ウェルに、次いで過塩素酸溶液75μｌを加え（“Ea
sy Dispenser"を使用）、この滴定板を室温において５
分間、暗所に放置した。

Perkin Elmer螢光測定器を使用し、各ウェルの螢光強
度を455nmで測定した。患者試料から得られたヒスタミ
ン濃度を、標準ヒスタミン曲線および抗−IgE含有ウェ
ルから得られた数値と相関させた。種々のアレルゲンに
よって、発生されたヒスタミンの放出量を計算し、その
量を、たとえば次の４群に分けた：陰性反応、弱い陽性
反応、中程度の陽性反応および強い陽性反応。

ミツバチおよびスズメバチの毒アレルゲンに対するアレ
ルギーの検査 例４ 例1.dに記載のとおりにして調製された滴定板を使用
した。これらのアレルゲンを用いて検査するためには、
滴定板を38℃で１時間インキュベートする（例３と同様
に）直前に、相当するウェル中に、ヒスタミン標準、抗
−IgE標準およびアレルゲン標準を導入した。下記の溶
液を使用した： 中間処理用ヒスタミン−緩衝剤溶液（IHBS）（100ng/
ml）： 例３と同一。

検査用緩衝液：例３と同一。

抗−IgE標準（AIS）：例2.1および2.2と同一。

微量滴定板のウェルには、例2.1の記載と同一の記号
を付けた。各ウェルに、以下に概述するとおりに調製さ
れた溶液25μｌを、投入用具からの分配によって充填し
た。

ヒスタミン標準： ウエル A1,B1,C1,A2,B2,C2:5000μl IHBS＋5000μｌ検
査用緩衝液 ウエル D1,D2:800μl A1−C2の溶液＋200μｌ検査用緩
衝液 ウエル E1,E2:600μl A1−C2の溶液＋400μｌ検査用緩
衝液 ウエル F1,F2:400μl A1−C2の溶液＋600μｌ検査用緩
衝液 ウエル G1,G2:200μl A1−C2の溶液＋800μｌ検査用緩
衝液 ウエル H1,H2:1000μｌ検査用緩衝液 抗−IgE標準： ウエル A3,B3,A4,B4:61μl AIS＋3000μｌ検査用緩衝
液 ウエル C3,C4:425μl A3−B4の溶液＋1500μｌ検査用
緩衝液 ウエル D3,D4: 79μl A3−B4の溶液＋1500μｌ検査用
緩衝液 ウエル E3,E4:375μl D3,D4の溶液＋1500μｌ検査用緩
衝液 ウエル F3,F4: 69μl D3,D4の溶液＋1500μｌ検査用緩
衝液 ウエル G3,G4: 79μl E3,E4の溶液＋1500μｌ検査用緩
衝液 ウエル H3,H4:379μl E3,E4の溶液＋1500μｌ検査用緩
衝液 ミツバチ／ススメバチ毒アレルゲン標準：縦列５およ
び6:ミツバチ毒アレルゲン；縦列７および8:スズメバチ
毒アレルゲン。

供給されているエキス〔Pharmacia,Denmark（100μl/
mg）〕のアレルギー強度は、変化していたので、新し
い、製品のアレルゲンエキスの最高稀釈濃度（ウェルＡ
およびＢで使用）を、非アレルギー性試験対象からの血
液に対して試験することによって、確定した。前記と同
様に、以下に概述されているとおりに調製された溶液の
25μｌづつを、相当するウェルに加えた。代表的データ
を以下に示す： ウェル A,B:5μl アレルゲンエキス＋995μｌ検査用緩
衝液 ウェル C:97μl A,Bの溶液＋250μｌ検査用緩衝液 ウェル D:91μl Cの溶液＋250μｌ検査用緩衝液 ウェル E:22μl Cの溶液＋250μｌ検査用緩衝液 ウェル F:22μl Dの溶液＋250μｌ検査用緩衝液 ウェル G:101μl Fの溶液＋250μｌ検査用緩衝液 ウェル H:105μl Gの溶液＋250μｌ検査用緩衝液 この調製された滴定板と血液試料とを、次いで38℃で
1/2時間インキュベートし、その後、各ウェルに血液25
μｌを加え、次いで例３に記載のとおりに、検査を行な
った。

例５ 全血に加えたヒスタミンの測定 コーティングを有していない微量滴定板、すなわち例
1.dに従い調製された滴定板および例1.fに記載のコーテ
ィングを有する滴定板に、いずれの方法によっても予め
処理されていない、ヘパリン含有全血25μｌを加えた。

各ウェルに、50ngヒスタミン/mlを含有しているか、
または含有していない検査用Pipes緩衝液25μｌを加え
て、それぞれ、試料とブランクとを作り、次いでこれら
の滴定板を、38℃のオーブン中で、0.5時間、インキュ
ベートした。ヒスタミンに係る検査を、例３に記載のと
おりに、螢光測定によって行なった。

表３に、コーティングを有する滴定板とコーティング
を有していない滴定板に関して、４回の実験（1,2,3お
よび４）の平均値および標準偏差値を示す。これらの数
値は、20の試料および20のブランクのヒスタミン濃度
を、それぞれ螢光単位で示すものである。また、両方の
滴定板に係る累計平均値および平均値の標準誤差も示
す。

コーティングを有する滴定板におけるブランクの螢光
（162±10螢光単位）が、コーティングを有していない
滴定板（233±22）に比較して、有意に、すなわち44
％、減少されていることが判る。

また、正味の数値（Net）（193±16）が、コーティン
グを有していない滴定板に比較して、有意に、すなわち
64％、増大されている。

この比較例は、アレルギー反応の結果として、全血中
に存在するヒスタミンの検出のシミュレーションであ
り、本発明の利点を明白に示している。

例６ 全血中および洗浄血液中におけるアレルギー反応により
放出されたヒスタミンの測定 ヒスタミン放出試験において、洗浄血液または全血の
どちらをも使用できる可能性を説明するために、米国特
許No.4,550,085の例２に従い、血液を洗浄した。

１人の患者から得た、全血および洗浄血液について、
例1.dおよび２に従い調製された、アレルゲン被覆滴定
板を使用し、ヒスタミン放出に係り試験した。

表４に、測定されたヒスタミン放出値（ngヒスタミン
/ml血液）を示す。全血または洗浄血液中におけるアレ
ルギー反応によって放出されるヒスタミンを、本発明に
よる方法によって測定することができることは明らかで
ある。

さらにまた、全血と洗浄血液とは、一般に、一致した
アレルギー反応を示した。陽性反応に係る検出限界は15
ngヒスタミン/ml血液であると理解される。

ヒスタミン放出に対する温度の影響に係る試験 例7.1 一つの実験において、17人の患者からの血液試料を、
それぞれ２部分に分け、そのそれぞれについて、例４の
記載に基本的に従い、検査を行なった。ただし、各１組
の試料のうちの一つは、アレルゲンおよび（または）抗
−IgEとの接触を確立する前に、37℃で0.5時間、予備加
熱し、そして他の一つは、室温（約20〜23℃）に保持し
た。17のうちの12の試料で、約20°％のヒスタミン放出
の増加が見い出された。残りの試料の数値は、変化が無
いか、または僅かにだけ改善されていた。

例7.2 抗−IgEに対して適度の応答を示す患者から得た血液
試料を４等分した。評価の前に、これらの試料をそれぞ
れ、20℃、37℃、38℃および39℃で0.5時間、インキュ
ベートした。各試料の25μｌを次いで、抗−IgEを含有
するガラスファイバー被覆微量滴定板ウェル（例2.1と
同様に調製された４個の滴定板）に移した（抗−IgE
は、例2.1および2.2に記載の方法と同一の方法で、滴定
板に配合した）。これらの滴定板を次いで、各試料のイ
ンキュベーションに使用した温度と同一の温度で、１時
間インキュベートした。

滴定板にまた配合されたヒスタミン標準（例３参照）
と比較して、ヒスタミン放出量を螢光測定によって測定
した。この結果は、38℃が最適温度であることを示し、
38℃で得られたヒスタミン放出量は、37℃におけるより
も10％大きい。この結果を図６に示す。

例８ 極性ポリマーの効果 血液成分により生じる、検査に対する干渉を減少させ
ることに関する、極性ポリマーの効果を示すために、下
記の簡単な実験を行なった。

直径7mmのディスク状のホワットマンGF/Bガラスファ
イバーフィルターシート192個を、シートから打ち出
し、図１（後記）に示されている型式の、２個の微量滴
定板のウェルの底部に導入した。例１に記載のとおりに
調製した、結合剤分散液50μｌを、これらの滴定板のう
ちの１個の各ウェルに導入し、他の滴定板の各ウェルに
は、蒸留水50μｌを導入した。両種の滴定板を次いで、
例1.dに記載のとおりに乾燥させた。両種の滴定板のウ
ェルの全部に、次いでバックグラウンドヒスタミン緩衝
液25μｌおよび全血25μｌを導入し、これらの滴定板を
次いで、例３に記載のとおりに、オーブン中で38℃にお
いて、１時間インキュベートした。

これらの滴定板を次いで、例３に記載のとおりに、洗
剤／酵素溶液で処理し、次に脱イオン水で洗浄した。そ
の直後に、結合剤を含有していない滴定板内のガラスフ
ァイバーディスクが、他の滴定板内のガラスファイバー
ディスクに比較して、格別に血液の色を保有しているこ
とが、裸眼で明らかになる。このことは、結合剤の存在
の下では、全血中に存在する、少なくとも若干のヘモグ
ロビン担持成分のガラスファイバーに対する結合可能性
が、結合剤の不存在下のファイバーの場合の結合可能性
に比較して、明らかに減じられることを示している。

例９ アレルゲンに対するコーティングの作用 例５に記載のコーティングを有する滴定板とコーティ
ングを有していない滴定板とに、例２に記載のとおり
に、アレルゲンを付与し、多種アレルギー性の患者から
得た血液を用いて比較した。

表５は、有意のヒスタミン放出、すなわち≧15ngヒス
タミン/ml全血のヒスタミン放出が、両種に滴定板にお
ける同様のアレルゲンの同一アレルゲン濃度で得られて
いることから、このコーティングがアレルゲンに対して
有害な作用を及ぼさないことを示している。

例10 アレルゲン被覆ガラス微量滴定板の貯蔵されていた滴定
板と新しく調製された滴定板との比較 被覆されているビニルアセテート／エチレンコポリマ
ーを有するガラスマイクロファイバー滴定板に対するア
レルゲン被覆を、例1.dおよび例２に従って行ない、
「ドライ アレルゲン」を得た。

コポリマー被覆ガラスマイクロファイバー滴定板にま
た、新しく稀釈したアレルゲンをピペットで加える処理
を、例２に従い行ない、「ウェット アレルゲン」を得
た。

これらの２種のアレルゲン被覆ガラスマイクロファイ
バー滴定板を使用し、２人のアレルギー性患者から得た
血液を用いて、例３に従い検査を行なった。

表６および表７は、「ドライ アレルゲン」と「ウェ
ット アレルゲン」との比較結果、および両方の患者に
対する同様のアレルゲンに関して、両種のアレルゲン試
料で、同一アレルゲン濃度において、有意のヒスタミン
放出、すなわち≧15ngヒスタミン/ml全血のヒスタミン
放出が見い出されたことを示している。

すなわち、アレルゲン被覆ガラスマイクロファイバー
滴定板において、アレルゲンは、アレルギー反応を誘発
するそれらの能力を保有する。

例11 種類の異なるガラスに対するヒスタミンの結合 種類の異なるガラスに対するヒスタミンの結合をカラ
ムクロマトグラフィによって評価した。

方法： 1.ガラス200mgを、リン酸塩緩衝液とともに、カラム
（内径＝1cm）に充填した。使用したガラスおよびそれ
らの組成は、表Ｉに示す。

2.これらのカラムを、リン酸塩緩衝液で15分間洗浄し
た。流速は50ml/分であった。この流速は、実験全体を
通して使用した。

3.リン酸塩緩衝液中のヒスタミン溶液（2mg/ml）を、20
分間、カラムにポンプで通した。

4.次いで、カラムをリン酸塩緩衝液で約15分間、洗浄し
た。

5.ガラスに結合したヒスタミンを、0.59％HClO₄で評価
した。

この酸溶液は、カラムに10分間、ポンプで通した。流
入物をリン酸塩緩衝液から酸溶液に変えた時点から、溶
出液を採取した。２分間毎に新しい試料を採取し、５種
の試料を得た。

6.これらの試料を、例3bに記載の方法により、ｏ−フタ
ルジアルデヒドを用いて、ヒスタミンに関して評価し
た。

これらの結果を、表８に示す。

これらの結果から、ホワットマンGF/Bガラスファイ
バーに加えて、種々の種類のガラスをヒスタミン結合性
物質として使用できることは明らかである。

例12 ポリマーに係るHansen溶解パラメーターの函数として
の、ポリマー被覆マイクロファイバーに対するヒスタミ
ン結合性の実験 ヒスタミンに係る溶解パラメーターは、グループ関与
法（上記参考文献Ａ参照）に従い、Charles A.Hansen法
によって計算し、次のとおりであった： δ_D＝17.3 δ_P＝7.5 δ_H＝12.2 種々のポリマーに係る溶解パラメーターは、Charles
M.Hansenの指示に従い、実験により測定した。

下記の結果が得られた： 上記ポリマーが例1a〜ｆに記載のとおりにして被覆さ
れているガラスマイクロファイバーに対するヒスタミン
の結合性は、対照として、Vinnapas EP400（例1.d参
照）を用いて評価した。

Hansenパラメーターにもとずく理論と一致して、RED
＞１を有するSBRラテックスは、ガラスマイクロファイ
バーに対するヒスタミンの結合を阻害した。

これらの結果を下記の表９に示す： 上記の結果は、その溶解パラメーター範囲がヒスタミ
ンの溶解パラメーター位置を包含している、アクリレー
トポリマーが、対照におよびまた、表３に示されている
コーティングを有する滴定板に関して報告されている結
果に、匹敵し、さらに対照より優れてさえいる、ヒスタ
ミン結合をもたらすことを、明らかに示している。

これらの結果は、Hansenパラメーター理論が、本発明
に従って使用するための、使用できる結合剤の選択に適
用することができることを確証している。

Claims (13)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】試料中のヒスタミンの測定方法であって、
   試料中の干渉成分に対するその親和性を減じるために処
   理されたヒスタミン結合性物質であってそのヒスタミン
   結合能力は実質的に保留されているように処理されたヒ
   スタミン結合性物質を含有するヒスタミン結合材料と試
   料とを、この試料中のヒスタミンの少なくとも一部分
   が、このヒスタミン結合材料に結合する時間にわたって
   接触させ、次いでヒスタミンの結合量にもとづき、試料
   中のヒスタミンの量を測定することよりなる測定方法。
2. 【請求項２】ヒスタミン結合性物質の干渉成分に対する
   親和性を減じるためのその処理が、極性有機ポリマーに
   よる処理である、請求項１に記載の方法。
3. 【請求項３】極性有機ポリマーが、酸素原子または窒素
   原子などのヘテロ原子を含有するポリマーよりなる、請
   求項２に記載の方法。
4. 【請求項４】極性有機ポリマーが、ポリビニルアセテー
   ト、ビニルアセテート／エチレンコポリマーおよびポリ
   ビニルアルコールよりなる群から選ばれるポリマーより
   なる、請求項３に記載の方法。
5. 【請求項５】極性有機ポリマーが、ビニルアセテート／
   エチレンコポリマーとポリビニルアルコールとの組合せ
   よりなる、請求項４に記載の方法。
6. 【請求項６】試料をまた、ヒスタミン結合材料に対して
   感受性の細胞からヒスタミン放出を誘発させることがで
   きる作用剤を含有しており、この細胞が、上記試料中に
   存在するものである、請求項１に記載の方法。
7. 【請求項７】ヒスタミン放出誘発作用剤がアレルゲンで
   ある、請求項６に記載の方法。
8. 【請求項８】ヒスタミン結合材料は、分離している個体
   の形態のヒスタミン結合性物質が結合剤によって一緒に
   保持されている集塊状物であり、血液試料を上記集塊状
   物と接触された後に、この血液試料を取り除き、次いで
   この集塊状物を、残存する血液成分の除去を促進する作
   用剤を含有する媒質で洗浄し、この洗浄後に、この集塊
   状物を完全のまま残す、請求項１に記載の方法。
9. 【請求項９】全血または実質的な全血である試料中のヒ
   スタミンの測定方法であって、全血試料または実質的な
   全血試料を、（ａ）分離している個体の形態のヒスタミ
   ン結合性物質および（ｂ）これらの形態のヒスタミン結
   合性物質個体を集塊状にする結合剤よりなる集塊状物と
   含有し、 試料中のヒスタミンの少なくとも一部分を、ヒスタミン
   結合性物質に結合させ、次いで、 ヒスタミンの結合量にもとづき、試料中のヒスタミンの
   量を測定する ことよりなる測定方法であり、 上記（ａ）及び（ｂ）におけるヒスタミン結合性物質
   は、試料中の干渉成分に対するその親和性を減じるため
   に処理されたヒスタミン結合性物質であってそのヒスタ
   ミン結合能力は実質的に保留されているように処理され
   たヒスタミン結合性物質である、 上記測定方法。
10. 【請求項１０】結合剤が極性有機ポリマーよりなる、請
    求項９に記載の方法。
11. 【請求項１１】極性有機ポリマーが酸素原子または窒素
    原子などのヘテロ原子を含有するポリマーよりなる、請
    求項10に記載の方法。
12. 【請求項１２】極性有機ポリマーが、ポリビニルアセテ
    ート、ビニルアセテート／エチレンコポリマーおよびポ
    リビニルアルコールよりなる群から選ばれる、請求項10
    に記載の方法。
13. 【請求項１３】極性有機ポリマーが、ビニルアセテート
    ／エチレンコポリマーとポリビニルアルコールとの組合
    せよりなる、請求項10に記載の方法。