CS258181B1 - Způsob přípravy nosičů a (mobilizovanými protilátkami pro imunochemická stanoveníZpůsob přípravy nosičů a (mobilizovanými protilátkami pro imunochemická stanovení - Google Patents

Abstract

Způsob přípravy nosičů s imobilizovanými protilátkami pro imunochemická stanovení na bázi skla v podobě hrubé drti, která se temperuje v rozmezí 400 až 900 °C po dobu 30 až 45 hodin, poté se vyluhuje roztokem anorganické kyseliny, případně alkalického hydroxidu, spočívá v tom, že se tímto způsobem upraví skio o složení 3 až 17 % hmot. oxidu alkalického kovu, například sodíku, draslíku a lithia samotného nebo v kombinaci, 15 až 37 % hmot. oxidu boritého, 55 až 75 % hmot. oxidu křemičitého a 0 až 6 S hmot. oxidu hlinitého popřípadě s obsahem 0,2 až 5 % hmot. oxidu fosforečného a 0,2 až 5 % hmot. fluoridu alkalického kovu, které se po vypláchnutí reakčních zplodin jemně umele ve formě vodné suspenze v korundovém planetovém mlýnu na velikost částic 3 až 30 /im, načež se aktivuje a na aktivovaný nosič se imobilizuje přidaná specifická protilátka přímou reakční s aktivovaným nosičem.

Description

Vynález se týká nosičů s imobilizovanými protilátkami pro imunoohemická stanovení a způsobu jejich přípravy.

Při imunochemických stanoveních různých anitgenů, imunogenů či haptenů jako jsou např. hormony, vitaminy, steroidy, alkaloidy, pesticidy, enzymy a jiné bílkoviny je prakticky nejdůležitějším krokem analytického postupu separece volného a imunochemickou interakcí vázaného ligandu. Imunochemická stanovení jsou přitom založena na soutěžení ligandu, většinou antigenu, jakožto analyzované látky přítomné ve vzorku s toutéž látkou značenou např. radionuklidem, fluoroforem nebo enzymem ve vazbě na ligát, jímž je nejčastěji specifická protilátka. Po separaci vázaného ligandu od nenavázaného se změřením radioaktivity, fluorescence či aktivity enzymu přímo určí koncentrace stanovované látky ve vzorku.

K separaci volného a vázaného ligandu se používá celá řada metod, např. adsorpce volného ligandu na vhodný adsorbent /silikagel, aktivní uhlí aj./, vysrážení ligátu s navázaným ligandem organickými rozpouštědly, anorganickými solemi, polyetylenglykolem apod.

Vzhledem k tomu, že vazba ligát-ligand je reverzibilní povahy, je u těchto metod nebezpečí porušení rovnováhy volný-vázaný ligand.

Značného zjednodušení separace volného a vázaného ligandu je možno dosáhnout tím, že se ligát imobilizuje na vhodný nosič. Nejjednodušší formou imobilizace je adsropce na stěny reakční nádobky. Vazebná bílkovina se nejčastěji adsorbuje na polystyrénové zkumavky nebo na mikrotítrační destičky z téhož materiálu. Adrorpční síly, které drží vazebnou bílkovinu na povrchu nosiče, jsou však poměrně slabé a imobilizace je proto mnohdy nedostatečná. Rovněž nízký titr vazebné bílkoviny může ještě dále zhoršit výsledný efekt. Z uvedených důvodů se vazebná bílkovina někdy zesítuje na povrchu nosiče různými bifunkčními činidly anebo ještě častěji se imobilizuje kovalentní vazbou přímo na aktivovaný nosič.

K imobillzaci ligátu kovalentní vazbou byla použita řada materiálů jako např. celulósa aktivovaná bromkyanem, polymery obsahující aktivní isothíokyanatové skupiny, částice vytvořené polymeraci polystyrénového latexu s glycidylmetakrylátem a styrenem, částice vytvořené polymeraci celulosy, akroleinů a oxidů železa a podobně.

K Imobilizaoi ligátů kovalentní vazbou bylo též použito skla aktivovaného gama-aminopropyltriethoxysilanem, hydroxysukcinimidem nebo solemi transitních kovů. U většiny používaných nosičů včetně kompaktního nebo porésního skla s imobilizovanými protilátkami je nutno inkubační směs během saturace míchat nebo třepat, což snižuje přednosti použití protilátek v imobilizované formě.

Tyto nevýhody odstraňuje způsob přípravy nosičů s imobilizovanými protilátkami pro imunochemická stanovení dle vynálezu spočívající v použití skla jednoduché soustavy na bázi 3 až 17 4 hmot. oxidu alkalického kovu, 15 až 37 % hmot. oxidu boritého, 55 až 75 % hmot. oxidu křemičitého a 6 % hmot. oxidu hlinitého, popřípadě s obsahem 0,2 až 5 % hmot. oxidu fosforečného a 0,2 až 5 % hmot. fluoridu alkalického kovu, které se v podobě hrubé drti temperuje v rozmezí 400 až 900 °C po dobu 30 až 45 hodin, poté se vyluhuje roztokem anorganické kyseliny, například kyseliny chlorovodíkové, případně i roztokem hydroxidu alkalického kovu, například hydroxidu sodného a po vypláchnutí reakčních zplodin se jemně umele ve formě vodné suspenze v korundovém planetovém mlýnu na velikost částic 3 až 30 >um, načež se aktivuje reakcí roztokem 5 až 50 % hmot. gama-aminopropyltrietoxysilanu v toluenu s následným působením roztoku 5 až 15 % hmot. glutaraldehydu nebo přímo reakcí s roztokem 5 až 15 % hmot. glutaraldehydu nebo působením solí tranzitních kovů, například chloridu titanitého, s jejich následnou hydrolýzou vodou na povrchu částic skla a na aktivovaný nocič se imobilizuje přidaná specifická protilátka přímou reakcí s aktivovaným nosičem.

Během působení minerální kyseliny popřípadě i alkalického hydroxidu dojde k vyloučení kysličníků alkalických kovů, kysličníku hlinitého, fosforečného a boritého. Získaný porésní skelet obsahuje 90 až 99 % hmot. oxidu křemičitého, 1 až 9 % hmot. oxidu boritého a další složky maximálně v desetinách 4 hmot.

Definovaný charakter povrchu je velmi výhodný pro následnou aktivaci a poté imobilizaci specifických protilátek a s ohledem na nízké sedimentační rychlosti daných velikostí částic jsou nosiče podle vynálezu zvláště vhodné pro aplikace při imunochemických analýzách. Tyto nosiče jsou chemicky velmi odolné vůči neutrálnímu a kyselému prostředí a dokonale stálé vůči působení všech organických látek.

Imobilizaci specifické protilátky na aktivované porézní sklo je dle vynálezu připraven nosič s navázanou protilátkou pro imunochemické stanovení, který dílcy své struktuře povrchu a velikosti částic zajištuje rychlé ustanoveni rovnováhy volného a vázaného ligandu, aniž by bylo nutno třepat nebo míchat inkubační směs. Ve srovnání s klasickými precipitačními technikami je oddělení konjugátu /odstředění nosiče s imobilizovanou protilátkou a na ni imunochemicky navázanými antigeny/ výrazně snažší a rychlejší.

Výhodou nosiče s imobilizovanou protilátkou dle vynálezu je kromě již uvedených vhodných sedimentačních vlastností snadnost jeho přípravy a s ohledem na používané suroviny i jeho snadná dostupnost. Nezanedbatelnou výhodou nosiče s imobilizovanou protilátkou je i jeho snadná pipetovatelnost a velmi dobrá stabilita, kdy je možno s ním provádět analýzy po dobu řady měsíců be2 signifikatní ztráty imunochemické aktivity imobilizované protilátky.

Vynález je dokumentován příklady, aniž by se jimi omezoval.

Příklad 1

Sklo chemického složení 6,9 % hmot. Νβ2θ, 25,7 % hmot. a 67,4 % hmot. SiOj se utaví běžným sklářským způsobem a v podobě hrubé drti se temperuje v kelímkové peci při 604 °C po dobu 45 hodin. Vytemperovaná drt se poté vyluhuje 4 % hmot. roztokem kyseliny chlorovodíkové při 70 °C. Po dokonalém promytí destilovanou vodou se vyluhovaná drt mele 6 hodin v korundovém planetovém mlýnku v prostředí destilované vody. Hmot. díl připraveného porézního skla o měrném povrchu 112 m /g se po vysušení zahřívá k refluxu s 10 obj. díly 20% /obj./ roztoku gama-aminopropyltriethoxysilanu v toluenu po dobu 24 hodin. Poté se modifikované porézní sklo promyje toluenem a vysuší.

Κ 1 hmot. dílu tohoto skla se přidá 5 obj. dílů 5 % hmot. roztoku glutaraldehydu a suspenze se třepe 2 hodiny při 37 °C. Po promytí aktivovaného porézního skla destilovanou vodou a 0,1 M fosfátovým pufrem při pH 7,4 se k 1 hmot, dílu vlhkého aktivovaného nosiče přidá 2,5 obj. dílů antiséra proti papainu. Po 16 hodinách stání za občasného protřepání se nosič s navázanou protilátkou odstředí, promyje 0,1 M fosfátovým pufrem pH 7,4 a po příslušném naředění se použije k imunochemickému stanovení papainu.

Přiklad 2

Jeden hmotnostní díl porézního skla o složeni 15,1 % hmot. KjO + Na₂0, 19,8 % hmot. SiOj, 1,1 % hmot. P₂°5» 0<6 * hmot. fluoridu a 0,3 % hmot. A1₂O₃ připraveného podle příkladu 1 se suspenduje v 5 obj. dílech 10 % hmot. roztoku glutaraldehydu. Suspenze se zahřívá na 37 °C po dobu 12 hodin za občasného protřepání. Aktivovaný nosič se poté odstředí, promyje 0,1 M fosfátovým pufrem 7,4 a opět odstředí. Κ 1 hmot. dílu vlhkého nosiče se přidá 2,5 obj. dílů antiséra proti tyroxinu. Po 16 hodinovém stání při 4 °C za občasného protřepání se nosič s navázanou protilátkou odstředí, promyje 0,1 M fosfátovým pufrem pH 7,4 a po příslušném naředění se použije k imunochemickému stanovení tyroxinu.

Příklad 3

K 20 obj. dílům 12,5 % hmot. chloridu titanitého v kyselině chlorovodíkové se přidá 1 hmot. díl porézního skla o složení 5,7 % hmot. Li₂O + ItajO, _{31(θ % hmot}, _{% hmot-}

S1O2 a 4,7 Al^O^ ° velikosti částic 5 až 15 připraveného podle příkladu 1. Po 20 minutách stání při 40 °C se směs odstředí a sediment se ponechá 6 hodin při 45 °C.

Poté se promyje vodou a opět usuší při 45 °C. Κ 1 hmot. dílu aktivovaného nosiče se přidají 3 obj. díly antiséra proti tyroxinu a směs se ponechá 16 hodin při 4 °c za občasného protřepání. Po odstředění a promytí 0,1 M fosfátovým pufrem pH 7,4 se nosič s navázanou protilátkou použije k imunochemickému stanovení tyroxinu v rozmezí 20 až 240 pmolů/ml.

Claims (4)

1. Způsob přípravy nosičů s imobilizovanými protilátkami pro imunochemická stanovení na bázi skla v podobě hrubé drti, která se temperuje v rozmezí 400 až 900 °C po dobu 30 až 45 hodin, poté se vyluhuje roztokem anorganické kyseliny, například kyseliny chlorovodíkové, případně i roztokem alkalického hydroxidu, například hydroxidu sodného, vyznačující se tím, že se tímto způsobem upraví sklo o složení 3 až 17 % hmot. oxidu alkalického kovu, například sodíku, draslíku a lithia samotného nebo v kombinaci, 15 až 37 % hmot. oxidu boritého, 55 až 75 % hmot. oxidu křemičitého a do 6 1 hmot. oxidu hlinitého popřípadě s obsahem 0,2 až ,5 % hmot. oxidu fosforečného a 0,2 až 5 % hmot. fluoridu alkalického kovu, které se po vypláchnutí reakčních zplodin jemně umele ve formě vodné suspenze v korundo vém planetovém mlýnu na velikost částic 3 až 30 yum, načež se aktivuje a na aktivovaný nosič se imobilizuje přidaná specifická protilátka přímou reakcí s aktivovaným nosičem.

2. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se jemně mleté sklo aktivuje roztokem 5 až 15 í hmot. glutaraldehydu.

3. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se jemně mleté sklo aktivuje roztokem

5 až 50 % hmot. gama-animipropyltriethoxysilanu a následně roztokem 5 až 15 % hmot. glutaraldehydu.

4. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se jemně mleté sklo aktivuje roztokem

10 až 20 % hmot. chloridu tranzitních kovů, například chloridu titanitého nebo zirkoničitého v koncentrované kyselině chlorovodíkové s následující hydrolýzou vodou.