JP2981445B2 - アレルギー診断用手段 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、試料、特に全血中
に存在するヒスタミンを測定するための方法および試験
セットを提供する。この方法は、或る種の物質に対する
ヒスタミンの選択的結合にもとづいており、特定のアレ
ルゲンに関連するアレルギーの診断に有用である。

【０００２】

【従来の技術】アレルギー患者の環境または食物中に存
在する、どのアレルゲンがアレルギー反応を生じさせる
かを知ることはアレルギー患者にとって必須である。従
って、患者に関連するアレルゲンを固定するための、精
密で、正確な容易に利用でき、しかも安価な方法の開発
が強く求められている。インビボ反応をまねた方法に
は、次の方法が包含される：患者から得た或る種の細胞
を、重要であると考えられるアレルゲンにさらし、この
細胞からヒスタミン放出を誘発し、引続いて放出された
ヒスタミンの量を測定することによって、アレルゲン性
を評価することができることは知られている。この原則
にもとづく方法は、米国特許4,550,085 に記載されてい
る。この特許の一般的態様に関して、この特許には、液
体中のヒスタミンの検出または測定方法が記載されてお
り、この方法は、ガラスマイクロファイバーと体液との
間の量的比率を、このマイクファイバーに結合されるヒ
スタミンの量を検出または測定できるような比率にし
て、担体上に配置されているガラスマイクロファイバー
と体液試料とを接触させ、次いでヒスタミンの結合量を
記録もしくは測定する方法である。

【０００３】特に、アレルギー反応によって体液中に放
出される可能性があるヒスタミンの検出方法が記載され
ており、この方法では、体液を試験アレルゲンと接触さ
せ、ファイバーに結合された、放出された可能性のある
ヒスタミンを直接に、または競合的に記録する。上記特
許の実施例に従えば、問題のアレルゲンと接触させる細
胞相は、特別に調製された血液細胞懸濁液、すなわち白
血球に富むように調製された細胞懸濁液である。この懸
濁液を調製するためには、血液を患者から採取し、赤血
球を沈降させる。得られた白血球に富む血漿層を別の容
器に注意深く移し、緩衝液中に懸濁し、次いで遠心処理
し、血漿の大部分から白血球を単離する。得られた上澄
液を除去し、ペレット状白血球を緩衝液中に再懸濁す
る。この工程をさらに反復し、好塩基球に特に富んでい
る細胞懸濁液を生成させる。

【０００４】従って、担体上に配置されているガラスマ
イクロファイバーと接触させる試料は、全血ではなく、
数回の中間処理を施された血液試料である。審査中の米
国分割特許出願Ser.No.791,722は、特に米国特許第4,55
0,085 号の方法に従うヒスタミン検出に使用するための
分析剤に関するものであり、この分析剤は、担体上に固
定されている個別のガラスマイクロファイバーよりな
り、この分析剤は、少なくとも１種の試験アレルゲンを
可塑的に沈着させてさらに含有しており、アレルギー反
応によって体液中に放出される可能性があるヒスタミン
を検出もしくは測定する用途に適している。米国特許4,
550,085 と同一の優先権出願ＤＫ2982/81 にもとづい
て、国際特許出願ＷＯ83/00229が出願されている。米国
特許およびその分割出願に対する、この国際特許出願の
唯一の基本的差違は、ここに直接的ヒスタミン測定を行
なうための手段として、微量滴定板を用いる好適態様を
示す例がさらに提示されていることにある。この国際特
許出願にもとづき、多くの特許、たとえばＥＰ特許No.8
2,862 、ＦＩ特許No.74,818 およびＡＵ特許No.563,306
が得られている。上記の一族の特許による方法は、その
実現のための多くの物品を提供している。Agents and A
ctions、１４巻、3/4(1984年) 、４１４〜４１６頁に
は、出願ＷＯ83/02229に従うヒスタミン試験方法がさら
に明らかにされている。種々の洗浄工程中におけるマイ
クロファイバーの損失を回避するために、粉砕したガラ
スマイクロファイバーを、微量滴定板の底部に、水溶性
接着剤とともに固定している。

【０００５】Allergy 、４２巻（1987年) 、３６６〜３
７３頁では、ＷＯ83/00229による方法を使用し、慣用の
ヒスタミン放出検定法、( たとえば皮膚刺傷試験および
気管支反応誘発試験) とこのマイクロファイバーにもと
づくヒスタミン分析法とが比較されている。この方法で
は、全血細胞がマイクロファイバー中に保護されるのを
避けるために、血液試料を、Pips- ＡＭＣ緩衝液を用い
て洗浄することが報告されている。ヒスタミンの放射線
酵素検定法の研究中に、ガラス表面によるヒスタミンの
吸着現象を制限する技術をうるために、この現象が研究
された〔Verburg およびHenry によるAgents and Actio
ns、１４巻，５１６、（1984年) 、６３３〜６３６
頁〕。リン酸カリウム緩衝液はヒスタミン結合を完全に
防止すること、牛血清アルブミンは吸着を阻止するこ
と、しかしTris- 緩衝液(pH7. 8)およびＫ₂ ＥＤＴＡは
吸着を制限することが報告された。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】ＦＲ特許No.1,443,167
およびC.A.６６巻（1967年) ４６４２頁によって、ファ
イバーに結合剤、たとえばデンプンペーストまたはPhOH
-HCHO-樹脂を付与し、次いで溶剤を蒸発させ、樹脂を重
合させることによって、凝集物の形態の鉱物ファイバ
ー、すなわちロックウール、スラブウール、ガラスウー
ルを凝集物の形態にすることにより、その機械的特性お
よび水分に対する良好な耐性が改善されることが知られ
ている。しかしながら、このような凝集物を分析の目的
に使用することに関しては、何ら開示されていない。上
記従来技術、特にＤＫ出願No.2982 ／81にもとづく一族
の特許を引用して、ここに組入れる。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明は、全血の白血球
によって放出されるヒスタミンの測定方法を提供する。
この方法は、全血を直接に使用することを可能にし、初
期の単離／洗浄工程を必要としない方法である。いくつ
かの理由で、全血を直接に使用できる、すなわちヒスタ
ミン放出誘発剤およびヒスタミン結合性物質を含有する
容器と血液とを直接に接触させることができることは、
明らかに有利である：種々の分別工程を省略することに
よって、検定の精度および正確度が増大される：時間を
消費する血液分別が避けられ、従って総検査時間が格別
に減少される：遠心処理用装置の必要性が排除される：
分別工程中における試料物質の汚染の危険が排除され
る：遠心処理および洗浄処理中における細胞のヒスタミ
ン放出能に係る人為的変化の誘発の危険性が排除され
る：血液試料中に存在するいずれかの病原体、たとえば
感染性病原体および（または) 毒性体と接触する、操作
者の危険性が最低にされる：異なる患者からの試料との
取り間違いの危険性が減じられる：検査に必要な血液の
量が減じられる。

【０００８】全血試料を検査することに係るこれらの理
由に加えて、特別に処理された白血球試料を使用して、
アレルゲン度(allergenicity) を直接に検査することが
できる。全血が、ヒスタミン結合検査を干渉しうる種々
の成分、特にアルブミン、フイブリノーゲンおよびヘモ
グロビンなどのタンパク質を含有することは認められて
いる。本発明者は、干渉性成分、たとえばヘモグロビン
に対するヒスタミン結合性物質の親和性を減じるが、そ
のヒスタミン結合能は実質的に保留されているように、
処理されているヒスタミン結合性無機質物質を試料と接
触させることによって、この問題を克服した。

【０００９】試料を、ヒスタミン結合性物質とともにイ
ンキュベートした後に、これらの２種の成分を分離し、
次いで結合したヒスタミンに対して有意に作用を及ぼす
ことなく、干渉性成分を除去する作用剤で、このヒスタ
ミン結合性物質を洗浄すると好ましい。ヒスタミン結合
性物質が顆粒、フレーク、ファイバーなどの形態で利用
できる場合には、これらの分離している個体を、適当な
結合剤により、集塊状形態にすると好ましく、生成する
集塊状物は、厳しい洗浄工程に良好に耐えられる。従っ
て、もう一つの好適態様においては、意図する検査に、
ヒスタミン結合性物質として、このような集塊状物、好
ましくは、干渉成分に対するその親和性を減少させる処
理が施されている集塊状物を使用する。更に本発明は、
ヒスタミンの量を測定するための多数のウェルを有する
プレートに、少なくとも２種類の濃度のヒスタミン標準
用ウェル部分と複数種類のアレルゲンを適宜希釈したウ
ェルのラインを構成せしめてなるヒスタミン測定用プレ
ートを提供する。要約すると、本発明は次の利点を有す
る。： １．ファイバー被覆した担体の製造時間を減じることが
できる。 ２．ファイバーは担体に、さらに堅固に固定される。 ３．バックグラウンド蛍光が減じられる。 ４．ヒスタミン結合が驚くほど改良される。 ５．蛍光検出に係る標準偏差値が減少される。 ６．試験を全血血漿、細胞懸濁液または生検物質に対し
て行なうことができ、その用途が改善される。 本発明のさらに別の態様を、以下の記載および請求の範
囲に記載する。

【００１０】

【発明の実施の形態】本発明は特に、人間または動物か
ら得られる試料中のヒスタミンの測定に関するものであ
る。特に、本発明は、体液中のヒスタミンの測定に関す
るものである。体液の重要な例には、ヒスタミン含有細
胞および（または) ヒスタミンを放出する細胞を含む、
血液およびその他の種々の体液がある。このような液体
およびその他の体液は、タンパク質成分を含有してお
り、これらのタンパク質成分は、ヒスタミン結合性物質
に付着する傾向および（または)ヒスタミン結合性物質
に対するヒスタミンの効果的な結合を干渉する傾向を有
する。これらの干渉成分は、体液試料に存在する液相中
に、または細胞中に存在することができる。このような
生物学的成分が、ヒスタミン結合性物質、特にヒスタミ
ン結合性無機物質に対して、高度の親和性を有する場合
には、これらは相もしくは物理−化学的障壁を形成する
傾向を有し、ヒスタミンがヒスタミン結合性物質と適度
に結合することを妨害し、そして( または) これらの成
分は、ヒスタミン結合性物質に対する結合に関して、ヒ
スタミンと競合することがある。従って、このような成
分の干渉に対抗する作用剤および方法を使用することが
重要である。本発明は、このための解決手段を提供す
る。

【００１１】ヒスタミン以外であって、表面に強力に付
着する生物学的成分の結合が、減じられ、しかもヒスタ
ミン結合が、不当に悪化されないような方法で、ヒスタ
ミン結合性物質表面を変性する。ヒスタミン結合性物質
の変性は特別の関連性を有する。「全血または実質的な
全血」の用語が、しばしば使用されている。「実質的な
全血」の用語は、患者からの血液試料中に元から存在す
る赤血球の全部または相当な部分を保有する血液試料を
表わす用語である。全血は、患者から採取した全血また
は遠心処理あるいはその他の労力を要する血液分別処理
による分別などの処理とは異なる、稀釈によるなどの僅
かな変化を施された全血であることができる。

【００１２】血液は、各対象から静脈穿刺によって採取
することができ、適当な容器、たとえばプラスティック
またはガラスの管( たとえば、「 Venoject」 管) に集め
る。この容器には、血液を集める前に、適当な抗凝血剤
を存在させると好ましい。この抗凝血剤は、好ましくは
対象の細胞からのヒスタミン放出を実質的に干渉しな
い、たとえばこの放出または検査方法に含まれる反応に
対して必須である成分を干渉しない、抗凝血剤である。
ヘパリン、たとえばナトリウムまたはカリウムヘパリネ
ートの形態のヘパリンは好適な抗凝血剤である。代表的
には、血液５mlを集める場合には、３０μヘパリン／ml
溶液０. ５mlを使用し、３μヘパリン／ml血液を得る。
通常、５mlの血液が集められるが、数種のアレルゲンに
対するアレルギーを試験するためには、２〜３mlの試料
で充分であり、たとえば９６個のウェルを有する板の場
合には、２. ５mlを使用する。１種だけのアレルゲンに
対するアレルギーを試験する場合には、試料およびブラ
ンクを含めて、１mlほどの少量の血液でも充分である。

【００１３】本明細書において、「無機質ヒスタミン結
合性物質」の用語は、ヒスタミンを結合させることがで
き、かつまた無機質の特性もしくは主として無機質の特
性を有する物質のいずれをも意味する。このような無機
質物質の例は、以下に詳細に示すが、少割合で有機残基
を含有しうる、実験室製造ガラス型のものを包含し、こ
れらも本発明において、無機質物質と考える。本発明に
関連して使用されている「測定」の用語は、通常、濃度
の測定を表わすものとして使用されているが、或る場合
には、質的同定を表わすためにも使用する。ヒスタミン
の測定は、必要な感受性を有する適当な測定方法、たと
えばラベル付きヒスタミンの使用を包含する競合測定あ
るいは、たとえばスペクトル光度測定による直接測定な
どのいずれの方法によっても行なうことができる。本発
明による方法の好適態様において使用されるヒスタミン
の測定方法の例には、一例として、蛍光測定法がある。
この方法は、蛍光環構造の実質的な定量的形成をともな
う、ヒスタミンと発蛍光団、たとえばオルトーフタルジ
アルデヒドとのカップリングにもとづく方法であり、こ
の蛍光環構造が測定される蛍光強度に関連することがで
きる。この評価方法の基本原則は、Hoppe-Seylerによる
Z.Physiol.Chem、３５３、９１１〜９２０頁、1972年に
記載されている。

【００１４】本明細書に記載の好適態様においては、ヒ
スタミンを、高pH（＞１０) でヒスタミン結合性物質か
ら放出させる。この高いpHはまた、遊離されたヒスタミ
ンとオルトーフタルジアルデヒド（ＯＰＴ) との間の充
分の反応に必要である。過塩素酸を次いで加え、ヒスタ
ミンとＯＰＴとの間で生成された蛍光反応生成物の適度
の溶解性を確保するのに要する低い数値にまで、pHを減
少させる。「集塊状物」(conglomerate)の用語は、ヒス
タミン結合性物質と結合剤との物理的複合体のいずれを
も意味するものとする。ヒスタミン結合性物質は、比較
的顕微鏡的寸法の個体(body)または複数個の個体(bodie
s)の形態であることができる：これはまた、さらに小さ
い顕微鏡的寸法であってもよく、適当にはファイバーの
形態である。本発明に係るファイバーは、一般に、少な
くとも４：１の長さ：直径比を有する。

【００１５】個体形態のヒスタミン結合性物質がファイ
バーの形態である場合には、これらのファイバーは、マ
イクロファイバーの形態、たとえば長いファイバーの粉
砕によって形成されるマイクロファイバーの形態で使用
すると有利である。このようなマイクロファイバーの長
さは、好ましくは0.5 〜１００（あるいは２００でさえ
ある) μｍであり、さらに好ましくは１〜５０μｍ、特
に１〜２５μｍ、さらに特に２〜２０μｍである。その
径は、好ましくは0.１〜１０μｍ、さらに好ましくは0.
２〜５μｍ、特に0.３〜２μｍである。従って、この集
塊状物は、ヒスタミン結合性物質のフラグメント、たと
えばフレーク、シート状片または数ミリメーターより大
きいか、または数ミリメーターに等しい寸法のかたまり
よりなることができ、これらは全体的に、または部分的
に結合剤でおおわれている。その他の極端な場合には、
この集塊状物は、マイクロファイバーに係り上記したも
ののような寸法を有する顕微鏡的大きさの個体の形態の
ヒスタミン結合性物質よりなり、これらの顕微鏡的大き
さの個体が結合剤によって一緒に結合されて全体に結合
しているか、またはかたまりを形成しているものであ
る。このかたまり、または全体的に結合しているもの
は、たとえば粗い球状形態あるいはさらに、不規則な形
態であることができ、この場合の顕微鏡的大きさの個体
はそれぞれ、全体的にまたは部分的に結合剤によりおお
われていてもよく、あるいはいなくてもよい。これはま
た、本発明の好ましい態様において、この集塊状物が固
定される担体の形状によって指定される形態に適する形
であることもできる。本発明の好ましい態様において
は、担体はポリスチレン製血中のウェルの底部であり、
この場合には、集塊状物は、図１（後記) に図示されて
いる形状に適合する形態を有する。

【００１６】個体のヒスタミン結合性物質はまた、粉末
または多孔質粒子を含むその他の粒子の形態であること
もできる：これらはまた、たとえば実質的に連続してい
る個体、たとえばシート（あるいは、たとえばウェルの
側面および／または底部) のうちの多孔質および（また
は) 繊維状、あるいは別様に細分化されている領域（大
きい表面積を得るため) であることもでき、この場合に
は、この領域は、たとえば成型によりあるいは機械的、
熱的、電気的および（または) 化学的にでこぼこにする
処理、たとえばエッチングにより、あるいは大きい表面
積を有する部分を有する領域を得るのに適する、その他
の手段により、調製される。本発明に係り、「担体」の
用語は、集塊状物を適当に固定することができる、適当
な支持要素のいずれをも意味し、たとえば容器もしくは
入れ物、あるいは微細容器もしくは微細な入れ物、ある
いは管または集塊状物を検査の目的に対して適当に固定
することができる、いずれかその他の種類の固形支持体
を包含する。一例として、担体は、個体状ガラスを支持
することができるフィルターを有する微小なカラムの形
態であることもでき、この場合には、個体状ガラスをそ
れぞれ、ヒスタミン含有試料と接触させることができ、
次いで相当する試薬または媒質で溶出することができ
る。

【００１７】しかしながら、また、その他の種類の担体
もしくは支持体を使用することもでき、たとえばそれら
自体は液体の収容能力を有していないが、液体中に浸漬
することができる形態の物体、たとえば固形もしくは中
空のビーズのようなビーズ、あるいは試料中に浸漬して
用いられる小さい寸法の種々の形態の物体であることも
できる。担体は好ましくは、測定中に一般的な反応条件
の下に、実質的に不活性である物質、たとえばポリスチ
レンなどの熱可塑性合成樹脂よりなる。無機質ヒスタミ
ン結合性物質は、実質的に無定形または実質的に結晶形
の構造であることができる。二酸化ケイ素を基材とする
物質すなわちかなりの割合または主要割合で二酸化ケイ
素を含有する物質、あるいはかなりの割合または主要割
合が二酸化ケイ素よりなる物質から製造または形成され
た物質は、非常に適することができる。このような物質
は、たとえば二酸化ケイ素を基材とするガラス物質また
は石英であることができる。本明細書で使用されている
ものとして、「ガラス物質」の用語は、全体的に、また
は部分的に二酸化ケイ素を基材としており、実質的に無
定形の構造を有し、そして極めて高い粘度を有する物質
を意味する。

【００１８】本発明において使用することができる重要
な種類のガラスの例には、下記のガラスが包含される：
無定形の融合した二酸化ケイ素よりなる、二酸化ケイ素
ガラス：代表的に、シリカ（約75％) 、ソーダ灰（約20
％) および石灰（約５％) の融合した均質混合物よりな
る、ソーダ石灰型ガラス：通常、酸化ホウ素( 多くの場
合に、約５％) をさらに含有するソーダー石灰型ガラス
である、ホウケイ酸ガラス。ホワットマン(Whatman) Ｇ
Ｆ／Ｂガラスファイバーシート（後記する) のガラス物
質は、代表的なホウケイ酸ガラスの例である。特定の物
性に係る要件に適合するように調製された、多くのタイ
プのソーダー石灰型ガラスはまた、或る種の金属酸化
物、たとえばマグネシウム、バリウム、鉛、アエン、ア
ルミニウム、リチウムまたはセリウムの酸化物をさらに
配合することによって製造される。米国特許4,550,085
には、ホワットマンＧＦ／Ｂの名前で市販されているガ
ラスマイクロファイバーフィルターシートから調製され
たガラスマイクロファイバーを、ヒスタミンの選択的結
合に使用することに関する利点が記載されている。この
製造会社の製品情報によれば、これらのファイバーを形
成しているホウケイ酸ガラスは、次表（表１) に示すこ
とができるように、比較的高い酸化ホウ素含有量を有す
るホウケイ酸ガラスである。この表１は、このガラスの
代表的組成を、ヒスタミン結合性に関して試験した（後
記する) その他のガラス物質とともに示すものである。

【００１９】

【表１】

【００２０】本発明による方法で使用するのに充分のレ
ベルでヒスタミンを選択的に結合するガラス物質は、ホ
ウケイ酸型ガラス、たとえば純粋な二酸化ケイ素ガラス
に限られるものではなく、成分として酸化カルシウムを
含有していない、ソーダー石灰型のガラスに類似する組
成の多くの実験室で製造されるガラスおよび成分とし
て、金属アルコキシドまたは非金属アルコキシドを基材
の一部として製造される多くの実験室で製造されるガラ
スはいずれも、有用なヒスタミン結合性を示すものと見
倣される。結晶二酸化ケイ素を基材とする物質の例に
は、石英、すなわち純粋な結晶ＳｉＯ₂ があり、これは
ヒスタミン結合性を有することが、本出願人によって見
い出された。

【００２１】米国特許4,550,085 、その一族の特許およ
び本発明の記載にもとづいて、当業者は、ここには特に
あげられていないその他のタイプの物質のヒスタミン結
合性を測定することができるであろう。しかしながら、
ホワットマンＧＦ／Ｂガラスマイクロファイバーは、市
場から容易に入手でき、かつまた複製することができる
という観点から、現時点では、本発明による方法で使用
するためのガラスマイクロファイバーの調製における原
材料として好適である。ホワットマンＧＦ／Ｂガラスフ
ァイバーフィルターシートからのガラスマイクロファイ
バーの好適な製造方法は、例１（後記する) に詳細に記
載する。

【００２２】本発明に係り、「結合剤」の用語は、別の
物質を表面付着により相互に結合させることができる物
質のいずれをも意味するものとする。混乱をさけるため
に、米国特許4,550,085 およびその一族の特許におい
て、「ヒスタミン結合性物質」を示すものとして、「結
合剤」の用語が使用されていたことに留意すべきであ
る。これに対して、本発明に係り使用されている結合剤
の有利な配合は、本発明以前には実現されていなかった
ことであることは勿論のことである。当然のこととし
て、本発明に係り使用される結合剤は、ヒスタミン結合
性物質の適当な集塊状物形成をもたらすが、同時に、こ
れらの個体にヒスタミン含有液体を充分に接触させる結
合剤であるべきである。化学的観点から、結合剤は、こ
れらが測定結果に有害に作用しないように選択しなけれ
ばならない。結合剤は、適当には、合成有機ポリマーで
ある結合剤であることができ、通常水を含有する試料と
接触している間に、その場で集塊状物を結合させ、その
結合状態を保有するものであるべきものとして、これら
のポリマーは実質的に水不溶性であると好ましい。しか
しながら、たとえば水性分散液から適用される結合剤
は、これらが一度適用されたならば、実質的に水不溶性
を保持するかぎり、本発明の目的に完全に適している。

【００２３】適当な結合剤の例としては、ポリビニルア
セテートなどのポリビニルエステル類またはビニルアセ
テート／エチレンコポリマーなどのコポリマーをあげる
ことができ、これらは場合により、ポリビニルアルコー
ルと組合せて使用することができる。以下の説明から明
らかなように、後者の種類の結合剤は、相互集塊状物形
成および集塊状物と担体との間の両方に対する付着物質
としてのそれらの結合能とともに、試料中のタンパク質
などの体液成分からの、存在する可能性のある干渉を減
じるという点で、干渉減少剤として、驚くほどの利点を
示す。結合剤の使用量は、結合剤およびヒスタミン結合
性個体の特性に依存する。結合剤の適当範囲は、ヒスタ
ミン結合性物質にもとづいて計算して、約０. １〜約２
０％結合剤固体重量、特に約２〜約１０％、好ましくは
約４〜約８％であると認められる。

【００２４】本発明の特別の、重要な態様に従う場合に
は、ヒスタミン結合性物質は、被験試料、特に体液試料
（特に、赤血球または赤血球成分／フラクション、ある
いは、類似の干渉特性を有する成分、たとえばタンパク
質成分などがかなりの量で存在している全血または実質
的な全血、あるいはその他の体液の試料) 中の干渉成分
に対する親和性を減少させるように処理されているが、
そのガラスのヒスタミン結合能は、実質的に保留されて
いる無機質物質である。いずれの特定の仮説にも束縛さ
れないが、この干渉成分に対する無機質物質の親和性の
減少メカニズムは、この物質の表面の極性および( また
は) 表面張力の減少と組合されており、これによって、
干渉成分に対する無機質物質の接着力が減じられる現象
であるということができるものと信じられる。理解され
るように、タンパク質、たとえばヘモグロビンに対する
接着力が減じられている無機質物質はまた、本発明の方
法において、格別に有利であり、これは通常、このよう
な物質が体液試料中のその他の干渉成分に対しても実質
的に減少された接着力を示すからである（これは、本発
明に関連するかなりの場合において、ヘモグロビンが代
表的な干渉成分であると考えられるからである) 。

【００２５】従って、干渉成分に対するその接着力を減
少させるための、無機質物質の処理の有効性の尺度は、
通常、処理された物質のヘモグロビン類またはヘモグロ
ビン類媒体あるいは別の関連グロビン類（たとえば、ミ
オグロビンなど）に対する挙動を推定することによっ
て、得ることができる：適度のヒスタミン結合性を保有
する状態におけるヘモグロビンまたはヘモグロビン類媒
体あるいはその他のグロビン類に対する接着力の減少
は、本発明の一般的目的に対する、処理された無機質ヒ
スタミン結合性物質の有用性を増大する。本明細書にお
いて、「処理」の用語が使用されているが、干渉成分の
無機質ヒスタミン結合性物質に対する減少された親和性
はまた、無機質物質の製造中に、この干渉を減少する物
質、たとえば極性減少物質を配合することによっても得
ることができるものと理解されるべきである：本明細書
および請求の範囲において、この可能性は、「処理され
た」、または「処理」あるいは「調製」の用語に含まれ
るものとする。

【００２６】「干渉成分に対する親和性」の用語は、干
渉成分が固体相と液体相との間に分布して、これらがヒ
スタミン結合を干渉することを意味する。この干渉成分
の親和性は物理的および化学的な性質のものであること
ができ、固体相と液体相との、それぞれの極性に関し
て、あるいは前記したように、非極性物質の場合には、
表面張力に関して、表すことができる。ヒスタミン結合
性無機質物質（以下の説明において、ガラスをその例と
して用いる) の表面の極性および( または) 表面張力の
減少は、極性有機ポリマーまたは極性有機ポリマーの混
合物による処理によって得ることができる。この処理に
よって、中でも極性誘引力がヘモグロビンおよびその他
のタンパク質系巨大分子、ならびに血液または生物学的
体液中にその他の成分をガラスに結合させる傾向がある
場合に、ガラス表面を極性が低い方向に変え、これらの
物質に対する誘引力または接着力を低下させる効果が得
られる。２相間の界面を可塑的に分離するために必要な
力、すなわち接着力は、次式で表わすことができる：

【００２７】

【式１】γ＝γＡ＋γＢ−γＡＢ

【００２８】この式において、γＡは相Ａの表面張力で
あり、γＢは相Ｂの表面張力であり、そしてγＡＢは２
相間の界面張力である。すなわち、たとえばＡがガラス
表面であり、そしてＢがタンパク質分子である場合に
は、γＡおよびγＢは、両方ともに高い数値を有し、他
方、γＡＢは比較的低い数値を有する。従って、高い接
着力γが生じる。ガラス表面を変性することによって、
γＡがさらに低く、γＢがその数値を保有し、そしてγ
ＡＢが同一であるか、またはさらに高くてもよい、変性
ガラス表面を得ることにより、さらに低い接着力γを得
ることができる。

【００２９】この原則を使用することによって、ヒスタ
ミンの結合に対して、ヘモグロビンなどの高度に接着性
の血液中の巨大分子の結合が減じられる。このような変
性ガラスに対するヒスタミン結合に関して、変性ガラス
表面およびヒスタミンに対する表面張力の関与の合計は
非変性ガラスの場合よりも低下させることができるが、
他方で、生じる接着力γを未処理ガラスの接着力と充分
に、実質的に等しくすることができるように、界面張力
γＡＢが低下される。従って、本発明の目的に対して施
される、無機質ヒスタミン結合性物質の処理は、この物
質の表面の極性または表面張力を適当に低下させるが、
ガラスの測定するヒスタミンの結合剤能を保留させる処
理剤を用いることによって達成することができる。この
目的に必要な処理剤は、たとえばいわゆる溶解パラメー
ターが極性ヒスタミン分子に近似しており、ヒスタミン
結合表面に対するヒスタミンの接近に関して障壁作用を
示さない、極性ポリマー、すなわち特に、酸素または窒
素などのヘテロ原子を含有するポリマーである。このよ
うなヘテロ原子含有基の例には、ヒドロキシ基、カルボ
キシ基、エステル基、カルボニル基、エーテル基および
酸素または窒素などのヘテロ原子を含有するヘテロ環状
基がある。適当なポリマーに係り、特定の広い制限はな
いが、これらのポリマーは、ガラス表面上に均一に分布
させることができないほどの高い分子量を有するべきで
はないことに留意しなければならない。ポリマーは、液
状分散液または溶液から、いずれか適当な方法で適用す
ることができ、あるいはその場でモノマーから重合させ
ることできる。ポリマーはホモポリマーに制限されず、
適当には、また或る場合には有利に、コポリマーあるい
はポリマーの混合物、あるいはポリマーとコポリマーと
の混合物であることができる。全ての場合に、決定的特
徴は、ポリマーがガラス表面の実質的なヒスタミン結合
能を保留させながら、ガラス表面に対して極性または表
面張力を低下させる能力を有することである。

【００３０】ポリマーあるいはコポリマー、またはポリ
マーおよび( または) コポリマーの混合物の、本発明の
目的に対する適当性は、既知の方法で行なわれる初期的
試験、たとえば接触角度の測定および溶解パラメーター
の試験によって、決めることができる。大部分の場合に
実用される試験項目は、生成する処理ガラス表面が、未
処理ガラス表面と比較して、必要なヒスタミン結合能を
保留しながら、潜在的に干渉性の試料成分に対して減じ
られた親和性を有することにある。使用される溶解パラ
メーターは、適当には、「Hand book of Solubility Pa
rameters and other Cohesion Parameters 」.A.F.M．
Barton, CAC Press (1983年) ( 以下で参考文献Ａと記
す) に記載のパラメーターであることができ、この文献
の記載を関連記載として、ここに組入れる。Charles
Ｍ.Hansen によって開発された、３次元溶解パラメータ
ー理論は有用なモデルであり、この理論は、溶剤または
溶剤混合物の重合体を溶解させる能力の予想に有用であ
る。このモデルで用いられる３種の溶解パラメーター
は、「分散」、「極性」および「水素結合」と称される
パラメーター( それぞれ、δ_D ，δ_P ，およびδ_H ）で
ある。

【００３１】ヒスタミンの溶解パラメーターは、参考文
献Ａ、６. ８章に記載されているようなグループ関与(g
roup-contribution)法を用いて計算することができ、あ
るいは経験的に決定することができる。結合剤の溶解パ
ラメーターはまた、グループ−関与法( 参考文献Ａ.14.
５章参照) により、または経験的に決定することがで
き、あるいはまた、データ作成により決定することがで
きる( たとえば、参考文献Ａ.14.3 章参照) 。本発明の
場合に、これは、干渉減少剤としての結合剤の溶解パラ
メーターがヒスタミンの溶解パラメーターと近似してい
るべきであることを意味する。Hansenの３次元等位系に
おけるヒスタミンの溶解パラメーターは、結合剤の溶解
パラメーター範囲内に含まれる。ヒスタミン溶解パラメ
ーターの位置が結合剤の溶解パラメーター範囲に包含さ
れていない場合には、このような結合剤はヒスタミンに
対する障壁として作用し、これによって、ヒスタミン結
合物質に対するヒスタミンの接近が妨げられる。好まし
くは、ヒスタミンは結合剤中で自由に溶解する。

【００３２】本発明に係り用いられるものとして、好適
な結合剤は、上記物性を示すことに加えて、また試料中
の干渉成分、たとえばタンパク質またはその他の生物学
的巨大分子の接着を実質的に防止するのに充分に低い表
面張力を示すべきである。関連する表面張力データは、
たとえば「Polymer Interface and Adhesion」、Ｓ.Wu.
Marcel Dekker. New York and Basel(1982年) に見い
出すことができ、この記載をここに引用し、関連記載と
して組入れる。ポリビニルアルコールで安定化されてい
るビニルアセテート／エチレンコポリマーの水性懸濁液
または分散液は、干渉減少剤として、集塊状物表面の処
理に、およびガラスファイバーを相互に付着させて、集
塊状物を形成するために、かつまた、本発明のもう一つ
の態様に関連して、この集塊状物を支持体に固定するた
めに、優れたポリマーであることが見い出された。従っ
て、現時点では、このような懸濁液または分散液を使用
すると好ましく、以下の例で例示する。前記Hansenの理
論を本発明によるヒスタミン結合性物質と結合剤との好
ましい組合せに適用した場合には、この理論は、３次元
等位系におけるヒスタミンの溶解パラメーターの位置が
使用タイプのビニルアセテートを基材とするコポリマー
の溶解パラメーター範囲に包含されることが確実に予想
される。換言すれば、ヒスタミンは、ヒスタミン結合性
物質上に存在するこのような結合剤の層を通過して、自
由に移動できるものと予想される。好ましくは、その溶
解パラメーター範囲がヒスタミンの溶解パラメーター範
囲を含む処理剤によって、ヒスタミン結合性物質を処理
する。

【００３３】この処理に使用するポリマーの量は、使用
される特定の無機質物質および特定のポリマーに適合す
るものでなけらばならない。干渉の減少（表面変性) 効
果および結合剤付着効果の両方を得るために、同一のポ
リマーまたはポリマー混合物を使用する場合には、この
量は、表面変性だけを目的とする場合よりも、一般に多
い。しかしながら、僅かな程度の表面変性が得られる条
件から、無機質ヒスタミン結合性物質の集塊状物が得ら
れる条件までの種々の量を使用することができ、試料中
のヒスタミン以外の成分の干渉の減少が主要理由である
場合のポリマーの量は、ヒスタミン結合表面またはその
近隣における、変化された空間的／立体的状態にさらに
関連することがある。結合剤を用いて、ガラスマイクロ
ファイバーが、板のウェルに固定されている本発明の好
ましい態様によって、これらのファイバーがウェルに機
械的に固定されており、かつまた望ましくない血液成分
の除去に必要な洗浄処理を確実に実施できる利点が得ら
れる。

【００３４】本発明のもう一つの態様において、全血試
料中のヒスタミンの測定方法はさらに、当該作用剤に対
して感受性の細胞からのヒスタミン放出を誘発すること
ができる作用剤を存在させることを包含しており、この
場合には、この作用剤は、試料がこの作用剤と集塊状物
との両方に接触するように存在させる。このような作用
剤は、アレルゲン、すなわち或る対象においてアレルギ
ー反応を生じさせる抗原であることができる。重要で、
関連性を有するアレルゲンの例には、通常、空気中に存
在し、従って吸入されうるアレルゲン、たとえばカン
バ、芝およびヨモギの花粉中のアレルゲン、ウマ、イヌ
またはネコのフケ中のアレルゲン、ダニ、アレルゲンお
よびカビアレルゲンがある。食物および食品中に存在す
ることができ、従って摂取することができるアレルゲン
には、牛乳、鶏卵、ライムギ粉、小麦粉、オートミー
ル、豚肉、牛肉、タラ肉、大豆およびグリーンピースの
アレルゲンが含まれる。細胞からのヒスタミン放出を誘
発することができる重要な作用剤は、抗−ＩgＥであ
る。

【００３５】集塊状物として、同一区画内にアレルゲン
を配合すると、明らかに有利であり、これはこの試験セ
ットの使用者がアレルゲンエキスを入手し、そして添加
する必要がないからである。貯蔵寿命および取り扱い上
の観点から、アレルゲンは、集塊状物と一緒に、実質的
に乾燥状態で存在させると、特に有利である。本発明の
試験セットの好ましい態様( 後記する) においては、微
量測定板のウェルの形態の担体に、乾燥させ、標準化し
たアレルゲンエキスを、集塊状物とともに存在させる。
本発明のさらにもう一つの態様において、当該作用剤に
対して感受性のある細胞からのヒスタミン放出を誘発す
ることができる作用剤が、集塊状物と一緒に存在してい
る、全血試料中のヒスタミンの測定方法はまた、このよ
うなヒスタミン放出誘発作用剤に対して感受性の細胞か
らのヒスタミンの放出を増強することができる作用剤を
含有することを含んでいる。この場合には、ヒスタミン
放出−増強作用剤は、集塊状物およびヒスタミン放出誘
発作用剤とともに存在させる。本発明によって開示され
た方法のうちの好適態様で用いられる方法、すなわち蛍
光測定法などの測定方法を使用する場合には、中程度の
バックグラウンド濃度のヒスタミンを存在させることが
有利であると考えられ、これによって、ヒスタミンによ
る蛍光のベースラインレベルが、細胞からのヒスタミン
の最低放出レベルの測定の不確実性を格別に減少させる
結果が得られる。

【００３６】本発明のもう一つの態様は、非特異的に結
合した血液成分の脱離または分解を促進する作用剤を含
有する媒質を使用する特別の洗浄処理の使用を包含して
いる。これによって、検査に全血を容易に使用すること
ができるようになる。このような作用剤は、使用される
媒質中における表面張力に影響を及ぼす作用剤、好まし
くは界面活性剤(surfactants) 、特に洗剤よりなる群か
ら選択することができる。洗剤は、アニオン性、カチオ
ン性、双イオン性またはイオン性の洗剤であることがで
き、好ましくは非イオン性洗剤である。適当な洗剤の例
を以下に示す。

【００３７】洗剤 アニオン性洗剤 アルキルスルフェート塩、たとえばラウリル硫酸ナトリ
ウム、ラウリル硫酸トリエタノールアンモニウム、セチ
ル硫酸トリエタノールアンモニウムおよびオレイル硫酸
トリエタノールアンモニウム：アルキルスルホネート
塩、たとえば"Hostapur SAF-60" 〔これは、CH₃ CH(R)S
O₃ ^- Na⁺ タイプの化合物であり、Ｒ＝長鎖状アルキルで
ある〕：アルキルベンゼンスルホネート塩、たとえばナ
トリウムドデシルベンゼンスルホネート。カチオン性洗剤 ：四級アンモニウム塩、たとえばセチル
トリメチルアンモニウムブロマイドおよび" ベンザルコ
ニウムクロライド" 〔これは、一般式C₆H₅CH₂N (CH₃)
₂(R)⁺ Cl^-（式中、Ｒ＝Ｃ₃ 〜Ｃ₁₈アルキル) で示され
るアルキルジメチルベンジルアンモニウムクロライドの
混合物である〕。双イオン性洗剤 ："Sulfobetaines" 、"Lysolecithi
n"、"Empigen BB"、"Zwittergent 3-12"および "Zwitte
rgent 3-14" 。非イオン性洗剤 ：アルキルフェニルポリオキシエチレ
ン、"Berol 09"などのノニルフェニルポリオキシエチレ
ン類および"Triton X-100"、"Triton X-102"、"Triton
X-114"、および"Triton X-165"などのp-tert- オクチル
フェニルポリオキシエチレン類を包含する：ポリオキシ
エチレンアルコール類、たとえば"Brij 35" 、"Brij 3
8" 、"Lipal9LA" 、"Lipocol C-20"、"Lauromacrogol 4
00" および"Cetomacrogol 1000" 、ポリオキシエチレン
ソルビトールエステル類、たとえば"Tween 80"。

【００３８】所望により、異なる洗剤の混合物を使用す
ることもできる。１種または２種以上の干渉成分の構造
を、それらのヒスタミン結合性物質からの脱離が促進さ
れるように変える酵素はまた、適当な作用剤であること
ができる。このような酵素は、たとえばタンパク質様の
血液成分をさらに小さい断片に分解するタンパク質分解
酵素であることができる。市販されている「広いスペク
トル」を有するタンパク質分解酵素の例には、" Alcala
se" 、"Esperase"、"Savinase"、"Maxatase"および"Rap
idase"がある。

【００３９】別の態様では、洗剤／酵素組合せ作用剤を
使用することができる。この種の適当な組合せには、"B
iotrinon"(Bic & Berntsen製、Denmark)があり、これ
は、非イオン性洗剤"Berol 09 " とプロテアーゼ"Alcal
ase"とを含有する（後記参照)。本発明の方法に供する
試料は、生検試料であることができる。生検材料は、当
該材料がヒスタミンを放出することのできる細胞を含有
しているかぎり、動物または人間から得られる材料のい
ずれでもあることができる。生検材料は、呼吸器系、特
に気管支器管系の組織の一部分および肺組織：胃腸器
官：腹腔または胸腔からの材料：あるいは病理学的組織
から得ることができる。内視鏡検査、たとえば胃、十二
指腸および（または) 空腸／回腸などの胃腸器官の内視
鏡検査において得られる生検材料も、しばしば使用され
る。さらにまた、気管支鏡検査により得られる細胞を検
査することもできる。生検材料は、適当な条件の下に保
持しなければならない。すなわち適当な媒質中に保持し
なければならない。代表的な細胞分散液は、生検材料を
小片に切り、これらの小片を、たとえばコラゲナーゼを
含有する媒質中に入れ、引続いて、インキュベートし
て、細胞を分散して含有する調製物を得ることによって
得られる。ヒスタミン放出性細胞に富む調製物の例に
は、肥満細胞および（または) 好塩基球の調製物があ
る。人間の腸の肥満細胞に対する、本発明の方法の適用
可能性は、Nolte 等によるAgents and Actions, ２６巻
３／４（1989年) に示されており、ここに引用して組入
れる。

【００４０】本発明のもう一つの態様は、ヒスタミン含
有細胞から、ヒスタミン放出を誘発することができる作
用剤を固定または定量するための方法および試験セット
に関するものである。この方法は、該当作用剤と接触す
ると、媒質中にヒスタミンを放出することができる細胞
とともに、この作用剤を媒質中でインキュベートし、こ
の媒質を、(a) ヒスタミンを結合することができる物質
および(b) 結合剤よりなる集塊状物と接触させ、試料中
のヒスタミンの少なくとも一部分をこのヒスタミン結合
性物質に結合させ、結合したヒスタミンの量に基づい
て、試料中のヒスタミンの量を測定し、この結合ヒスタ
ミンの量を、既知量の当該作用剤から得た標準値に対比
し、次いでこの作用剤を固定または定量することよりな
る方法である。この目的に有用な市販の試験セットは、
たとえば図１に例示されているようなカセットである。
ただし、この図１における試験セットのウェルはアレル
ゲンを含有していない。

【００４１】本発明のこれらの態様を使用する標準化さ
れている方法は、広範囲のアレルゲンの簡単で、再現性
を有する標準化方法を提供する。これは、これらの方法
が、“インビボアレルギー反応のミニチュア”と称する
ことができる方法にもとづいているからである。

【００４２】図１は、上方表面１２から下方に向って伸
びているウェル１１を有する微量滴定型の部品１０を示
す透視画面である。ウェル１１はそれぞれ、その底部
に、図２に関して詳細に説明するようなヒスタミン結合
性個体よりなる、固定されている集塊状物を有する。図
２は、図１に示されているウェル１１のうちの１個の横
断面を示している。ウェルの底部の集塊状物１３は、２
〜２０μｍの長さと０．３〜２μｍの厚さとを有し、ビ
ニルアセテート／エチレンコポリマーのような結合剤に
よって結合されている、ガラスマイクロファィバーのよ
うなヒスタミン結合性物質の個体よりなる。この結合剤
はその水性懸濁液から適用される。１４は、集塊状物の
主要部分の上部に形成されることがしばしば見い出され
る結合剤のミニスカス（miniscus）を示し、そして１５
は、集塊状物の上方表面を示す。このファイバー集塊状
物は、この集塊状物中のマイクロファイバーのサイズお
よびサイズ−分布などの多くの因子、ならびに本明細書
に説明され、例示されているような、集塊状物の生成方
法によって決定されるファイバー濃度（あるいは別様に
は、有孔度）を有する。このファイバー集塊状物の製造
は、たとえば例１ａ〜ｄに記載する。

【００４３】図３〜４には、ウェル１１の底部における
集塊状物の製造方法の工程が例示されている。図３にお
いて、前記されており、例１に例示されている、ビニル
アセテート／エチレンコポリマー結合剤の分散液のよう
な、結合剤とガラスマイクロファイバーとを含有する懸
濁液が、分配器具１６からウェル１１に適用されてい
る。この懸濁液は、代表的に、例１に記載の水性懸濁液
である。結合剤の分散微小粒子とファイバーとの両方の
存在は、数字３１および３３によって、示されている。
図４は、図３において適用された分散液を蒸発させ、図
２に関連して説明されているものに相当する構造が得ら
れた後の、状態を示すものである。図５は、アレルゲン
の水性溶液のような、ヒスタミン放出誘発作用剤の液状
供給物３０（溶液）をウェル中に導入する例を示すもの
である。この水性溶液３０の導入の後に、水を蒸発させ
ると、その上方面１５がヒスタミン放出誘発作用剤と組
合されている集塊状物１３を含有するウェルが得られ
る。このように、ヒスタミン放出誘発作用剤を、蒸発さ
れる液体から適用する場合には、このウェル内の集塊状
物と組合される、アレルゲンのようなヒスタミン放出誘
発作用剤の配置様相は、種々の因子、たとえばアレルゲ
ンの化学的特徴、アレルゲンの分子サイズなどに依存す
るが、いずれの場合にも、ヒスタミン放出誘発作用剤
は、試料がアレルゲンと接触し、その後で、あるいは実
質的に同時に、集塊状物と接触するように、集塊状物と
組合せるべきである。しかしながら、本発明のこの態様
の主要特徴は、試料がアレルゲンおよび集塊状物と接触
する、正確な時間的順序にあるのではなく、放出された
ヒスタミンを示す、或る量のヒスタミンが、集塊状物中
のヒスタミン結合性物質に結合され、これによって本発
明の方法によって、この結合した量のヒスタミンを測定
できるような方法で、アレルゲンを試料導入の前に、ウ
ェル中に存在させ、試料中の細胞からのヒスタミン放出
を誘発できる（これは試料とアレルゲンとの反応によ
る）ことにあるものと理解されるべきである。

【００４４】図６は、例６．１で説明する。図７は、本
発明の方法に有用な試験セットの別の態様を示すもので
ある、この試験セットは、内容物（その全体を１７で示
す）を有する容器よりなる。この容器は、固定もしくは
収容されているヒスタミン結合性物質を充填して含有す
るカラムのような、円柱形状容器１８であることができ
る。適当な材料、たとえばポリスチレンから形成されて
いる容器カラム１８内には、床または層１９の形態のヒ
スタミン結合性物質の個体、特に二酸化ケイ素を基材と
する物質、特にガラス物質から製造されている粒子また
はファイバーが、底部フィルターおよび場合により、頂
上部フィルター２１によって、固定もしくは収容され
て、配置されている。

【００４５】別の態様として、ヒスタミン結合性個体、
特にガラス物質から製造されているファイバー（たとえ
ば、マイクロファイバー）または粒子（たとえば、粉
末）の形態のヒスタミン結合性個体を、結合剤およびこ
れらの個体からなる集塊状物の形態で存在させることも
できる。特定の態様において、層１９は、それら自体は
ヒスタミン結合能を有していないか、または実質的に有
していないが、ヒスタミン結合性物質の粉末またはファ
イバーのような粒子の支持体として作用するファイバー
よりなる層を表わすこともでき、この場合には、ヒスタ
ミン結合能を有していないか、または実質的に有してい
ない、上記ファイバーにより構成されているファイバー
塊状物内に、ヒスタミン結合性物質が分布するようにす
る。この態様では、それら自体が、この層を通る試料液
にとって最適ではないような幾何学的特徴を有し、そし
て（または）充分のフィルター効果または分布作用を有
していない、ヒスタミン結合性物質も、支持体として作
用するファイバーと組合せた場合には、有用であること
がある。

【００４６】層１９の頂上部に存在する任意のフィルタ
ー２１は、層１９の境界をさらに定めるものとしての役
目を果し、体液または体組織の試料が、誘発作用剤、た
とえばアレルゲンにさらされた後に、ヒスタミン結合性
物質と接触されるように、たとえばその頂上部に誘発作
用剤を備えていてもよい。図８に示されている態様で
は、層１９は、１種の個体からなるか、あるいは上記し
たような２種または３種以上の個体の複合体よりなり、
この層１９は、所望により、結合剤が、存在する粒子ま
たはファイバーを集塊状物に形成している、１つまたは
２つ以上の集塊状物の形態であることもできる。

【００４７】層１９に関して説明されている複合体はま
た、図２に関連して示され、説明した、ウェル内に配置
される層１３でも有用でありうるものと理解される。す
なわち、図２の層１３はまた、たとえばヒスタミン結合
性物質の個体（この個体は所望により、結合剤によりフ
ァイバー物質と集塊状物を形成していてもよい）のため
の支持体および（または）分配体として働く、“不活性
ファイバー”よりなることもできる。このような複合体
層を沈降によって調製する場合には、粉末状粒子などの
粒子の沈降速度は、ファイバーの沈降速度に適応させな
ければならず、これによって、ファイバー塊中における
粒子の所望の分布を得るべきであり、そして（あるい
は）ファイバー層が先ず形成され、そこに粉末および場
合により、追加のファイバーが配置されるように、粉末
より先に、ファイバーを沈降させるべきである。この結
果として、ファイバー塊中におけるヒスタミン結合性個
体の実質的に均一な分布を得ることができ、あるいはヒ
スタミン結合性個体をファイバー塊中の実質的に１つま
たは２つ以上の層として配置することができる。容器１
７は、使用される特定の方法に応じて、数ミリリッター
の容積を収容することができ、たとえば数ミリメーター
の直径を有する管であることができ、あるいは容器１７
は、毛細管であることもできる。

【００４８】

【実施例】

例１ガラスファイバー被覆を有する微量滴定板の調製 ａ．ガラスファイバー懸濁液の調製 ホワットマンＧＦ／Ｂガラスマイクロファイバーフィル
ターシート（５ｇ）を、２cm×２cmの断片に切り、ボー
ルミル内で粉砕し、粉砕ガラスマイクロファイバーを得
た。この粉砕ガラスファイバー２４ｇ（上記の処理を全
部で５回行なって得られたもの）を、１ｌ褐色ガラスビ
ン中で、室温において、新しく蒸留した水１０００ml中
に懸濁した。この懸濁液を１分間、充分に攪拌し、次い
で直ちに、２個の１０００mlガラスビーカーに移した
（それぞれ、500 ml：各ビーカーの液体の高さは８cmで
ある）。粉砕ファイバーを次いで、室温で２分間沈降さ
せ、その後、上澄液を、注意深くデカンテーションする
ことによって、清潔な１ｌ褐色ガラスビンに移した。こ
の上澄液は、約２μｍ〜約２０μｍの寸法の粉砕ファイ
バーを含有する。

【００４９】ｂ．結合剤分散液の調製 この目的には、市販のビニルアセテート/ エチレンコポ
リマー分散液(Vinnapas-Dispersion EP400：Wacker Che
mie Danmark A/S. Denmark）を使用した。この製品は約
５５％（重量／重量）の乾燥物質含有量および約１．０
６ｇ／cm² の比重を有し、主要エマルジョン粒子サイズ
は０．８μｍ（２０℃）である：ポリビニルアルコール
をエマルジョン安定剤として配合する。この分散液を、
室温で充分に攪拌することによって、新しく蒸留した水
(100mgコポリマー／ml水）でさらに稀釈した。

【００５０】ｃ．結合剤／粉砕ガラスファイバー分散液
の調製 上記のとおりに調製された結合剤分散液１２．５mlを、
粉砕ガラスファイバー懸濁液１０００mlに加え、混合物
を攪拌した。生成する結合剤／粉砕ガラスファイバー分
散液６００mlを、１０００mlガラスビーカーに移した。

【００５１】ｄ．微量滴定板における固定 蠕動ポンプを使用し、結合剤／粉砕ガラスファイバー分
散液５０μｌを、ポリスチレン製微量滴定板のウェルの
それぞれに移した。５個の微量滴定板に充填した後に、
これらの滴定板を、直ちにオーブン（温度：９５±２
℃）に入れ、一夜にわたり乾燥させた。 ｅ．コーティング分散液の調製 例１．ｄに従い調製された滴定板には、所望により、も
う一枚のコーティングを施すことができる。この目的に
は、市販のポリビニルアルコール（Ｗ25／190、Wacker
Chemie Danmark A/S)の１０％（重量／容積）の原液を
使用し、この原液６０μｌを１０ml蒸留水中に分散させ
る。

【００５２】ｆ．微量滴定板の被覆 上記のとおりにして調製されたコーティング分散液５０
μｌを、結合剤／粉砕ガラスファイバー集塊状物が１．
ｄに従い固定されている、微量滴定板のウェルのそれぞ
れに施用する。この微量滴定板を次いで、固定処理に関
して上記したとおりに、一夜にわたり乾燥させる。

【００５３】例２アレルゲンとの予備インキュベーション 例２．１ ガラスファイバー被覆滴定板に対する吸入型アレルゲン
の被覆 例１に記載のとおりにして調製された滴定板を使用し
た。下記の溶液を調製した。 人間血清アルブミン原液：人間血清アルブミン(SIGMA
製）０．３mg／蒸留水１００ml： 人間血清アルブミン検査用稀釈液（ＨＳＡ）：人間血清
アルブミン原液１８０μｌを蒸留水１００mlで稀釈した
（この溶液は、冷蔵庫内で貯蔵する）： ヒスタミン原液（100 mg／ｌ）：ヒスタミン１００mgを
蒸留水で１ｌにした： ヒスタミン検査用溶液（ＷＨＳ）（５mg／ｌ）：原液２
５０μｌを蒸留水で５mlにまで稀釈した。

【００５４】抗−ＩｇＥ含有ウェル用には、Behringwer
ke．Germany から供給されている抗−ＩｇＥ標準物質
（以下で、ＡＩＳと記する）（400,000 単位／ml）を使
用した。微量滴定板ウェルには、次の記号を付けた。 横列：Ａ−Ｈ、縦列：１−１２。各ウェルには、投入用
具から、以下に既述したとおりにして調製される溶液２
５μｌを分配して、充填した。一例として、滴定板に
は、次のとおりに投入することができる。

【００５５】 ヒスタミン標準と濃度 ウェル A1 ： 210 μｌWHS ＋20790 μｌHSA ＝50ng／ml ウェル B1 ：5600μｌA1の溶液＋ 1400 μｌHSA ＝40ng／ml ウェル C1 ：4200μｌA1の溶液＋ 2800 μｌHSA ＝30ng／ml ウェル D1 ：2800μｌA1の溶液＋ 4200 μｌHSA ＝20ng／ml ウェル E1 ：1400μｌA1の溶液＋ 5600 μｌHSA ＝10ng／ml ウェル F1 ： 0μｌA1の溶液＋ 7000 μｌHSA ＝ 0ng／ml ウェル G1 ： 0μｌA1の溶液＋ 7000 μｌHSA ＝ 0ng／ml ウェル H1 ：1400μｌA1の溶液＋ 5600 μｌHSA ＝10ng／ml ウェル A2 ：2800μｌA1の溶液＋ 4200 μｌHSA ＝20ng／ml ウェル B2 ：4200μｌA1の溶液＋ 2800 μｌHSA ＝30ng／ml ウェル C2 ：5600μｌA1の溶液＋ 1400 μｌHSA ＝40ng／ml ウェル D2 ： 210μｌA1の溶液＋20790 μｌHSA ＝50ng／ml

【００５６】抗−ＩｇＥ標準： ウェル E2 ： 225μｌ AIS＋11250 μｌHSA ウェル F2 ：600 μｌ E2の溶液＋ 3150 μｌHSA ウェル G2 ：112 μｌ E2の溶液＋ 4388 μｌHSA ウェル H2 ：112 μｌ E2の溶液＋ 4388 μｌHSA ウェル A3 ：112 μｌ E2の溶液＋ 4388 μｌHSA 吸入型アレルゲン標準：縦列３〜１２( ウェルＡ３を除
く) 。(Pharmacia,Sweden により供給されている、吸入
型アレルゲンエキス：カンバ、芝およびヨモギに関して
は、100,000 ＢＵ／ml、その他の全部に関しては、10,0
00ＢＵ/ml)。

【００５７】縦列３：カンバ〔ベツラ ベルコーサ（Be
tula verrucosa) 〕 縦列４：芝〔フェレウム プラテンス（Phleum Pratens
e) 〕 縦列５：ヨモギ〔アンボロシア アルテミシホリア（Am
brosia artemisifolia) 〕 縦列６：ウマのフケ 縦列７：イヌのフケ 縦列８：ネコのフケ 縦列９：コナダニ〔デルマトファゴイデス プテロニシ
ヌス（Dermatophagoides pteronyssinus) 〕 縦列10：コナダニ〔デルマトファゴイデス ファリナエ
（Dermatophagoides farinae) 〕 縦列11：カビ菌〔アルテルナリア テヌイス (Alternar
ia tenuis)〕 縦列12：カビ菌〔カルドスポリウム ヘルバルム (Cald
osporium herbarum)〕 横列Ａおよび横列Ｂ（カンバの場合のウェルＡ３を除
く）： カンバ、芝およびヨモギの場合：80μｌアレルゲンエキ
ス＋7920μｌHSA ： その他の全部のアレルゲンの場合：800 μｌアレルゲン
エキス＋7200μｌHSA: 横列Ｃ：840 μｌＡおよびＢの溶液＋2160 μｌHSA 横列Ｄ：240 μｌＡおよびＢの溶液＋2760 μｌHSA 横列Ｅ：101.5 μｌＡおよびＢの溶液＋4399 μｌHSA 横列Ｆ：870 μｌＡおよびＢの溶液＋2130 μｌHSA 横列Ｇ：234 μｌＡおよびＢの溶液＋2766 μｌHSA 横列Ｈ： 67.5 μｌＡおよびＢの溶液＋2932.5μｌHSA

【００５８】ウェルを充填した後に、この滴定板をオー
ブン中で３７℃において、一夜にわたり乾燥させた。こ
れらの滴定板を次いで、下記のとおりに試験した：各バ
ッチからの１０個の滴定板のそれぞれの、縦列１および
２内のヒスタミン標準を、蛍光測定（後記する）により
検査し、同一バッチからの３個の滴定板のウェルの全部
をまた、蛍光測定により検査した。既知であり、充分に
特徴が確認されているアレルゲンを含有する、３人の献
血者から採血した血液試料を、吸入型アレルゲン標準の
試験に使用した。

【００５９】例２．２ ガラスファイバー被覆滴定板の食物アレルゲン被覆 例１に記載のとおりにして調製された滴定板（６０個の
滴定板）を使用した。食物アレルゲンエキス以外は、例
２．１に記載の溶液と同一の溶液を使用した。微量滴定
板のウェルには、例２．１に記載のとおりに記号を付け
る。各ウェルに、以下に既述するようにして調製された
溶液２５μｌを、投入用具から分配して充填した。

【００６０】ヒスタミン標準：例２．１と同一。 抗−ＩｇＥ標準 例２．１と同一。 食物アレルゲン標準：縦列３〜１２（ウェルＡ３を除
く）。（ALK.Denmark により供給されている食物アレル
ゲンエキス：鶏卵の場合；１：１００（重量／容積）： その他全部の場合；１：２０（重量／容積）。 縦列３：牛乳 縦列４：鶏卵 縦列５：ライ麦粉 縦列６：小麦粉 縦列７：オートミール 縦列８：豚肉 縦列９：牛肉 縦列10：タラ肉 縦列11：大豆 縦列12：グリーンピース 横列Ａおよび横列Ｂ（牛乳の場合のウェルＡ３を除く)
：３００μｌアレルゲンエキス＋2700μｌHSA 横列Ｃ：679 μｌＡおよびＢの溶液＋1750μｌHSA 横列Ｄ：637 μｌＣの溶液＋1750μｌHSA 横列Ｅ：154 μｌＣの溶液＋1750μｌHSA 横列Ｆ：154 μｌＤの溶液＋1750μｌHSA 横列Ｇ：707 μｌＦの溶液＋1750μｌHSA 横列Ｈ：735 μｌＧの溶液＋1750μｌHSA これらの滴定板を例２．１に記載のとおりに、乾燥さ
せ、そして試験した。例１．ｆに従い調製されるコーテ
ィングを有する滴定板もまた、同様に予備インキュベー
トすることができる。

【００６１】ヒスタミン放出の検査 例３ ａ．試料源 各患者から、静脈穿刺によって血液を採取し、適当な抗
凝血剤、好ましくはヘパリン（たとえば、ナトリウムま
たはカリウムヘパリネートとして使用する）を含有す
る、適当なプラスティックまたはガラスの管（たとえ
ば、“Venoject”管）内に集めた。このヘパリンは、た
とえば、血液５mlを集める場合には、３単位ヘパリン／
ml血液になるように、３０単位ヘパリン／ml溶液０．５
mlの量で使用する。一般に、５mlの試料を集めるが、１
個の滴定板で全部のアレルゲンに対するアレルギーを試
験する場合には、２５mlの試料でも充分である。１種の
アレルゲンに対するアレルギーを試験するためには、１
mlほどの少量の血液でも充分である。血液試料は通常、
２０〜２５℃で保存する（さらに高い温度では、試料の
早すぎる変性および劣化が生じ、また低すぎる温度で
は、沈殿が生じる）。試料は通常、普通郵便として郵送
でき、好ましくは試料を入手してから２４時間以内に検
査する。しかしながら、入手して４８時間後でもまだ、
充分の検査を行なうことができる。

【００６２】ｂ．検査に使用する溶液および滴定板の調
製 例２．１および例３．２に記載のとおりに調製された滴
定板を使用した。下記の溶液を調製した： 人間血清アルブミン（ＨＳＡ）検査用稀釈液：例２．１
に記載のとおり： ヒスタミン検査用溶液（ＷＨＳ）（５ml／ｌ）：例２．
１に記載のとおり： ＰＩＰＥＳ緩衝液：ＰＩＰＥＳ ３．０２ｇ〔ピペラジ
ン−Ｎ、Ｎ´−ビス（２−エタンスルホン酸）〕、酢酸
ナトリウム１９．０５ｇおよび酢酸カリウム０．４９
ｇ、１Ｍ ＴＲＩＳ溶液２０〜２１ml〔トリス（ヒドロ
キシメチル）アミノメタン〕( 最終pH７．４を得る）、
１Ｍ CaCl₂ ６００μｌおよび１Ｍ MgCl₂１１００μｌ
を蒸留水で１ｌにする。この原液は、冷蔵庫内で保存す
る。 検査用緩衝液：ＰＩＰＥＳ緩衝液に、下記の成分を、使
用の直前に加えた：グルコース（１ｇ／ＰＥＰＥＳ溶液
１ｌ）、ＨＳＡ（１．６ml／ＰＩＰＥＳ緩衝液1 ｌ）お
よびヘパリン溶液（ＬＥＯ、ヘパリン酸ナトリウム、50
00ＩＵ／ml：３ml／ＰＩＰＥＳ緩衝液１ｌ）（このヘパ
リン溶液は、冷蔵庫中に保存した）：中間処理用ヒスタ
ミン−緩衝剤溶液（ＩＨＢＳ)(100ng ／ml：ＷＨＳ100
μｌ）を検査用緩衝剤で５mlに稀釈する。

【００６３】ブランクヒスタミン−緩衝剤溶液（ＨＢ
Ｓ）（10ng／ml）：中間処理用ヒスタミン−緩衝剤溶液
５mlを、検査用緩衝液４５mlで稀釈する。 洗剤／酵素溶液：“Biotrinon ”５mg（Bie & Berntsen
Denmark）を、蒸留水１０mlに溶解する： ＯＰＴ溶液：Ｏ−フタルジアルデヒド５mg〔分析用品
質、Fluka 製〕を、メタノール５００μｌに溶解し、こ
の溶液を、０．０５Ｍ NaOHで１０mlに稀釈する： 最終pH：１２．５６ ０．５９％過塩素酸：pH１．１６。 各ウェルに、ＨＢＳ２５μｌを導入した、すなわち０．
２５ngヒスタミン／ウェルにする（“Easy Dispenser”
を使用する）。次いで、この滴定板および血液試料を３
８℃のオーブン中に1/2 時間入れた。各ウェルに、次い
で血液２５μｌをピペットで加え（Eppendorph ピペッ
トを使用する）、次いでこの滴定板におおいをし、３８
℃で１時間、インキュベートした。次いで、免疫−洗浄
（immuno-wasker ）装置内において、脱イオン水で５
回、洗浄した。各ウェルに、洗剤／酵素溶液５０μｌを
ピペットで加え（Volac 分配装置を使用）、次いでこの
滴定板におおいをして、３８℃で1/2 時間インキュベー
トした。滴定板は次いで、前記のとおりに、５回洗浄し
た。

【００６４】各ウェルに、ＯＰＴ溶液７５μｌを加え
（“Easy Dispenser”を使用）、その後、この滴定板を
室温で１０分間放置した。各ウェルに、次いで過塩素酸
溶液７５μｌを加え（“Easy Dispenser”を使用）、こ
の滴定板を室温において５分間、暗所に放置した。Perk
in Elmer 蛍光測定器を使用し、各ウェルの蛍光強度を
４５５nmで測定した。患者試料から得られたヒスタミン
濃度を、標準ヒスタミン曲線および抗−ＩｇＥ含有ウェ
ルから得られた数値と相関させた。種々のアレルゲンに
よって、発生されたヒスタミンの放出量を計算し、その
量を、たとえば次の４群に分けた：陰性反応、弱い陽性
反応、中程度の陽性反応および強い陽性反応。

【００６５】ミツバチおよびスズメバチの毒アレルゲン
に対するアレルギーの検査 例４ 例１．ｄに記載のとおりにして調製された滴定板を使用
した。これらのアレルゲンを用いて検査するためには、
滴定板を３８℃で１時間インキュベートする（例３と同
様に）直前に、相当するウェル中に、ヒスタミン標準、
抗−ＩｇＥ標準およびアレルゲン標準を導入した。下記
の溶液を使用した： 中間処理用ヒスタミン−緩衝剤溶液（ＩＨＢＳ）（100n
g ／ml）：例３と同一。 検査用緩衝液：例３と同一。 抗−ＩｇＥ標準（ＡＩＳ）：例２．１および２．２と同
一。 微量滴定板のウェルには、例２．１の記載と同一の記号
を付けた。各ウェルに、以下に既述するとおりに調製さ
れた溶液２５μｌを、投入用具からの分配によって充填
した。

【００６６】ヒスタミン標準： ウェル A1,B1,C1,A2,B2,C2：5000μｌ ＩＨＢＳ＋5000
μｌ検査用緩衝液 ウェル D1,D2： 800μｌA1−C2の溶液＋200 μｌ検査用
緩衝液 ウェル E1,E2： 600μｌA1−C2の溶液＋400 μｌ検査用
緩衝液 ウェル F1,F2： 400μｌA1−C2の溶液＋600 μｌ検査用
緩衝液 ウェル G1,G2： 200μｌA1−C2の溶液＋800 μｌ検査用
緩衝液 ウェル H1,H2：1000μｌ検査用緩衝液

【００６７】抗−ＩｇＥ標準： ウェル A3,B3,A4,B4： 61 μｌＡＩＳ＋3000μｌ検査用
緩衝液 ウェル C3,C4：425 μｌA3−B4の溶液＋1500μｌ検査用
緩衝液 ウェル D3,D4： 79 μｌA3−B4の溶液＋1500μｌ検査用
緩衝液 ウェル E3,E4：375 μｌD3−D4の溶液＋1500μｌ検査用
緩衝液 ウェル F3,F4： 69 μｌD3−D4の溶液＋1500μｌ検査用
緩衝液 ウェル G3,G4： 79 μｌE3−E4の溶液＋1500μｌ検査用
緩衝液 ウェル H3,H4：379 μｌG3−G4の溶液＋1500μｌ検査用
緩衝液

【００６８】ミツバチ／スズメバチ毒アレルゲン標準：
縦列５および６：ミツバチ毒アレルゲン：縦列７および
８：スズメバチ毒アレルゲン。供給されているエキス
〔Pharmacia,Denmark （100 μｌ／mg）〕のアレルギー
強度は、変化していたので、新しい、製品のアレルゲン
エキスの最高稀釈濃度（ウェルＡおよびＢで使用）を、
非アレルギー性試験対象からの血液に対して試験するこ
とによって、確定した。前記と同様に、以下に既述され
ているとおりに調製された溶液の２５μｌづつを、相当
するウェルに加えた。代表的データを以下に示す：

【００６９】ウェル A,B： 5 μｌ アレルゲンエキス
＋995 μｌ検査用緩衝液 ウェル C ： 97 μｌ A,Bの溶液＋250 μｌ検査用緩
衝液 ウェル D ： 91 μｌ Cの溶液＋250 μｌ検査用緩
衝液 ウェル E ： 22 μｌ Cの溶液＋250 μｌ検査用緩
衝液 ウェル F ： 22 μｌ Dの溶液＋250 μｌ検査用緩
衝液 ウェル G ：101 μｌ Fの溶液＋250 μｌ検査用緩
衝液 ウェル H ：105 μｌ Gの溶液＋250 μｌ検査用緩
衝液 この調製された滴定板と血液試料とを、次いで３８℃で
1/2時間インキュベートし、その後、各ウェルに血液２
５μ を加え、次いで例３に記載のとおりに、検査を行
なった。

【００７０】例５全血に加えたヒスタミンの測定 コーティングを有していない微量滴定板、すなわち例
１．ｄに従い調製された滴定板および例１．ｆに記載の
コーティングを有する滴定板に、いずれの方法によって
も予め処理されていない、ヘパリン含有全血２５μｌを
加えた。各ウェルに、５０ngヒスタミン／mlを含有して
いるか、または含有していない検査用Ｐｉｐｅｓ緩衝液
２５μｌを加えて、それぞれ、試料とブランクとを作
り、次いでこれらの滴定板を、３８℃のオーブン中で、
０．５時間、インキュベートした。ヒスタミンに係る検
査を、例３に記載のとおりに、蛍光測定によって行なっ
た。

【００７１】表３に、コーティングを有する滴定板とコ
ーティングを有していない滴定板に関して、４回の実験
（１，２，３および４）の平均値および標準偏差値を示
す。これらの数値は、２０の試料および２０のブランク
のヒスタミン濃度を、それぞれ蛍光単位で示すものであ
る。また、両方の滴定板に係る累計平均値および平均値
の標準誤差も示す。コーティングを有する滴定板におけ
るブランクの蛍光（162 ±10蛍光単位）が、コーティン
グを有していない滴定板（233 ±22）に比較して、有意
に、すなわち４４％、減少されていることが判る。ま
た、正味の数値（Net ）（193 ±16）が、コーティング
を有していない滴定板に比較して、有意に、すなわち６
４％、増大されている。この比較例は、アレルギー反応
の結果として、全血中に存在するヒスタミンの検出のシ
ミュレーションであり、本発明の利点を明白に示してい
る。

【００７２】

【表２】

【００７３】例６全血中および洗浄血液中におけるアレルギー反応により
放出されたヒスタミンの測定 ヒスタミン放出試験において、洗浄血液または全血のど
ちらをも使用できる可能性を説明するために、米国特許
No.4,550,085の例２に従い、血液を洗浄した。一人の患
者から得た、全血および洗浄血液について、例１．ｄお
よび２に従い調製された、アレルゲン被覆滴定板を使用
し、ヒスタミン放出に係り試験した。表４に、測定され
たヒスタミン放出値（ngヒスタミン／ml血液）を示す。
全血または洗浄血液中におけるアレルギー反応によって
放出されるヒスタミンを、本発明による方法によって測
定することができることは明らかである。さらにまた、
全血と洗浄血液とは、一般に、一致したアレルギー反応
を示した。陽性反応に係る検出限界は１５ngヒスタミン
／ml血液であると理解される。

【００７４】

【表３】

【００７５】ヒスタミン放出に対する温度の影響の係る
試験 例７．１ 一つの実験において、１７人の患者からの血液試料を、
それぞれ２部分に分け、そのそれぞれについて、例４の
記載に従い、検査を行なった。ただし、各１組の試料の
うちの一つは、アレルゲンおよび（または）抗−ＩｇＥ
との接触を確立する前に、３７℃で０．５時間、予備加
熱し、そして他の一つは、室温（約２０〜２３℃）に保
持した。１７のうちの１２の試料で、約２０°％のヒス
タミン放出の増加が見い出された。残りの試料の数値
は、変化が無いか、または僅かにだけ改善されていた。

【００７６】例７．２ 抗−ＩｇＥに対して適度の応答を示す患者から得た血液
試料を４等分した。評価の前に、これらの試料をそれぞ
れ、２０℃、３７℃、３８℃および３９℃で０．５時
間、インキュベートした。各試料の２５μｌを次いで、
抗−ＩｇＥを含有するガラスファイバー被覆微量滴定板
ウェル（例２．１と同様に調製された４個の滴定板）に
移した（抗−ＩｇＥは、例２．１および２．２に記載の
方法と同一の方法で、滴定板に配合した）。これらの滴
定板を次いで、各試料のインキュベーションに使用した
温度と同一の温度で、１時間インキュベートした。滴定
板にまた配合されたヒスタミン標準（例３参照）と比較
して、ヒスタミン放出量を蛍光測定によって測定した。
この結果は３８℃が最適温度であることを示し、３８℃
で得られたヒスタミン放出量は、３７℃におけるよりも
１０％大きい。この結果を図６に示す。

【００７７】例８極性ポリマーの効果 血液成分により生じる、検査に対する干渉を減少させる
ことに関する、極性ポリマーの効果を示すために、下記
の簡単な実験を行なった。直径７mmのディスク状のホワ
ットマンＧＦ／Ｂガラスファイバーフィルターシート１
９２個を、シートから打ち出し、図１（後記）に示され
ている型式の、２個の微量滴定板のウェルの底部に導入
した。例１に記載のとおりに調製した、結合剤分散液５
０μｌを、これらの滴定板のうちの１個の各ウェルに導
入し、他の滴定板の各ウェルには、蒸留水５０μｌを導
入した。両種の滴定板を次いで、例１．ｄに記載のとお
りに乾燥させた。両種の滴定板のウェルの全部に、次い
でバックグラウンドヒスタミン緩衝液２５μｌおよび全
血２５μｌを導入し、これらの滴定板を次いで、例３に
記載のとおりに、オーブン中で３８℃において、１時間
インキュベートした。これらの滴定板を次いで、例３に
記載のとおりに、洗剤／酵素溶液で処理し、次に脱イオ
ン水で洗浄した。その直後に、結合剤を含有していない
滴定板内のガラスファイバーディスクが、他の滴定板内
のガラスファイバーディスクに比較して、格別に血液の
色を保有していることが、裸眼で明らかになる。このこ
とは、結合剤の存在の下では、全血中に存在する、少な
くとも若干のヘモグロビン担持成分のガラスファイバー
に対する結合可能性が、結合剤の不存在下のファイバー
の場合の結合可能性に比較して、明らかに減じられるこ
とを示している。

【００７８】例９アレルゲンに対するコーティングの作用 例５に記載のコーティングを有する滴定板とコーティン
グを有していない滴定板とに、例２に記載のとおりに、
アレルゲンを付与し、多種アレルギー性の患者から得た
血液を用いて比較した。表５は、有意のヒスタミン放
出、すなわち≧１５ngヒスタミン／ml全血のヒスタミン
放出が、両種の滴定板における同様のアレルゲンの同一
アレルゲン濃度で得られていることから、このコーティ
ングがアレルゲンに対して有害な作用を及ぼさないこと
を示している。

【００７９】

【表４】

【００８０】例１０アレルゲン被覆ガラス微量滴定板の貯蔵されていた滴定
板と新しく調製された滴定板との比較 被覆されているビニルアセテート／エチレンコポリマー
を有するガラスマイクロファイバー滴定板に対するアレ
ルゲン被覆を、例１．ｄおよび例２に従って行ない、
「ドライ アレルゲン」を得た。コポリマー被覆ガラス
マイクロファイバー滴定板にまた、新しく稀釈したアレ
ルゲンをピペットで加える処理を、例２に従い行ない、
「ウェット アレルゲン」を得た。これらの２種のアレ
ルゲン被覆ガラスマイクロファイバー滴定板を使用し、
２人のアレルギー性患者から得た血液を用いて、例３に
従い検査を行なった。表６および表７は、「ドライ ア
レルゲン」と「ウェット アレルゲン」との比較結果、
および両方の患者に対する同様のアレルゲンに関して、
両種のアレルゲン試料で、同一アレルゲン濃度におい
て、有意のヒスタミン放出、すなわち≧１５ngヒスタミ
ン／ml全血のヒスタミン放出が見い出されたことを示し
ている。すなわち、アレルゲン被覆ガラスマイクロファ
イバー滴定板において、アレルゲンは、アレルギー反応
を誘発するそれらの能力を保有する。

【００８１】

【表５】

【００８２】

【表６】

【００８３】例１１種類の異なるガラスに対するヒスタミンの結合 種類の異なるガラスに対するヒスタミンの結合をカラム
クロマトグラフィによって評価した。 方法 １．ガラス２００mgを、リン酸塩緩衝液とともに、カラ
ム（内径＝１cm）に充填した。使用したガラスおよびそ
れらの組成は、表１に示す。 ２．これらのカラムを、リン酸塩緩衝液で１５分間洗浄
した。流速は５０ml／分であった。この流速は、実験全
体を通して使用した。 ３．リン酸塩緩衝液中のヒスタミン溶液（２mg／ml）
を、２０分間、カラムにポンプで通した。 ４．次いで、カラムをリン酸塩緩衝液で約１５分間、洗
浄した。 ５．ガラスに結合したヒスタミンを、０．５９％HclO₄
で評価した。この酸溶液は、カラムに１０分間、ポンプ
で通した。流入物をリン酸塩緩衝液から酸溶液に変えた
時点から、溶出液を採取した。２分間毎に新しい試料を
採取し、５種の試料を得た。 ６．これらの試料を、例３ｂに記載の方法により、Ｏ−
フタルジアルデヒドを用いて、ヒスタミンに関して評価
した。 これらの結果を、表７に示す。

【００８４】

【表７】

【００８５】これらの結果から、ホワットマン^TMＧＦ／
Ｂガラスファイバーに加えて、種々の種類のガラスをヒ
スタミン結合性物質として使用できることは明らかであ
る。 例１２ポリマーに係るHansen溶解パラメーターの函数として
の、ポリマー被覆マイクロファイバーに対するヒスタミ
ン結合性の実験 ヒスタミンに係る溶解パラメーターは、グループ関与法
（上記参考文献Ａ参照）に従い、Charles M.Hansen法に
よって計算し、次のとおりであった： δ_D ＝１７．３ δ_P ＝７．５ δ_H ＝１
２．２ 種々のポリマーに係る溶解パラメーターは、Charles M.
Hansenの指示に従い、実験により測定した。

【００８６】下記の結果が得られた： エチレン／ビニルアセテート dist コポリマーラテックス δ_D δ_P δ_H R ヒスタミン RED ^* Vinnapas EP 400 17.2 10.6 7.2 9.6 5.89 0.613 SRB-ラテックス ^****Dow460 20.3 9.6 3.9 8.7 10. 4 1.195 アクリルラテックス： Rhoplex N580^** 16.2 7.6 10.2 10.6 2.97 0.281 Rhoplex 1031^** 19.3 10.7 6.7 12.4 7.97 0.642 Polysar PL6779^*** 19.3 14.1 3.9 14.8 11.33 0.766 ^* 相対エネルギー差（Relative Energy Distance）（Hansenの命名）、ＲＥＤ：

【００８７】

【式２】

【００８８】Δδ値は、ヒスタミンのδ値とポリマーの
δ値との差を表わす。Ｒは、ポリマーに係る溶解パラメ
ーター範囲の半径である。ＲＥＤ＜１の場合には、ヒス
タミンパラメーター範囲が、ポリマー溶解パラメーター
範囲に包含されている。ＲＥＤ＞１の場合には、ヒスタ
ミンはこの範囲外である。^** Rohm＆Hass供給、データは入手できない。^*** Polysar Nederland B.V.供給。供給会社によれば、
これは、ミルク状白色液体の形態の、変性アクリル系エ
ステルコポリマーであり、０．０９PanS. の粘度、1060
kg／cmの比重、１００℃の沸点および濃縮形態でpH５．
１を有する。^**** Dow Chemical供給のスチレン／ブタジエン／ゴムラ
テックス。 上記ポリマーが例１ａ〜ｆに記載のとおりにして被覆さ
れているガラスマイクロファイバーに対するヒスタミン
の結合性は、対照として、Vinnapas EP400（例１．ｄ参
照）を用いて評価した。Hansenパラメーターにもとずく
理論と一致して、RED ＞１を有するＳＢＲラテックス
は、ガラスマイクロファイバーに対するヒスタミンの結
合を阻害した。これらの結果を下記の表９に示す。

【００８９】 表９：アクリレート被覆ガラスマイクロファイバー上におけるヒスタミン測定値 （蛍光単位による） Rhoplex Rhoplex Polysar 対照^** N580 N1031 PL6779 試料^* ４８９ ５２６ ４０６ ５１９ ブランク ２０３ ２１５ ２１７ ２２８ Ｎｅｔ ２８６ ３１１ ２７９ ２８７^* 試料中のヒスタミン濃度は、１２５ng／mlであった。^** 非被覆マイクロファイバー滴定板は、例１．ｄに従い調製した。 上記の結果は、その溶解パラメーター範囲がヒスタミン
の溶解パラメーター位置を包含している、アクリレート
ポリマーが、対照におよびまた、表３に示されているコ
ーティングを有する滴定板に関して報告されている結果
に、匹敵し、さらに対照より優れてさえいる、ヒスタミ
ン結合をもたらすことを、明らかに示している。これら
の結果は、Hansenパラメーター理論が、本発明に従って
使用するための、使用できる結合剤の選択に適用するこ
とができることを確証している。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、ヒスタミン結合性ガラスファイバーを
その中に含有するへこみ（ウェル）を有するトレイの形
態の、本発明に係る試験セットを示す図解式図面であ
る。

【図２】図２は、図１に示されているウェルのうちの１
個を示す拡大断面図である。

【図３】図３は、トレイの調製および処理の過程の工程
を示すものである。

【図４】図４は、トレイの調製および処理の過程の工程
を示すものである。

【図５】図５は、トレイの調製および処理の過程の工程
を示すものである。

【図６】図６は、全血試料中に放出されたヒスタミンの
量(ng ヒスタミン／試料として測定) の温度による変化
を抗−ＩｇＥの温度の函数として示すグラフである：温
度：２０℃、３７℃、３８℃および３９℃。

【図７】図７は、カラムの形態の試験セットを示す図解
式図面である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) G01N 33/50

Claims (8)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ヒスタミン検査用の合成物品であって、
   (a)ヒスタミンを結合させることができる、分離してい
   る個体の形態の複数個の個体および(b)これらの個体を
   集塊状にする結合剤よりなる集塊状物を含む合成物品で
   あって、 上記(a)及び(b)における個体は、タンパク質に対する親
   和性を減じるために処理された物質であってそのヒスタ
   ミン結合能は実質的に保留されているように処理された
   物質である、 上記合成物品。
2. 【請求項２】 上記物質がガラス物質よりなる、請求項
   １の物品。
3. 【請求項３】 上記分離している個体が、ガラスファイ
   バーである、請求項２の物品。
4. 【請求項４】 結合剤が極性有機ポリマーよりなる、請
   求項３の物品。
5. 【請求項５】 極性有機ポリマーが、ポリビニルアセテ
   ート、ビニルアセテート／エチレンコポリマーおよびポ
   リビニルアルコールよりなる群から選ばれる、請求項４
   の物品。
6. 【請求項６】 (a)複数個の分離している個体の形態の
   ヒスタミン結合性物質とこのような個体を集塊状にする
   結合剤からなる集塊状物であって、該ヒスタミン結合性
   物質は、タンパク質に対する親和性を減じるために処理
   された物質であってそのヒスタミン結合能は実質的に保
   留されているように処理された物質である、集塊状物お
   よび(b)細胞からのヒスタミン放出を誘発する作用剤よ
   りなり、この集塊状物と接触させる細胞を、この作用剤
   とも接触させる形態のヒスタミン検査用の合成物品。
7. 【請求項７】 ヒスタミン放出誘発作用剤がアレルゲン
   である、請求項６の物品。
8. 【請求項８】 ヒスタミン放出誘発作用剤が、抗−Ｉｇ
   Ｅである、請求項６の物品。