JP3253614B2 - 生体高分子用のｈｐｌｃ―光散乱法検出器 - Google Patents
生体高分子用のｈｐｌｃ―光散乱法検出器Info
- Publication number
- JP3253614B2 JP3253614B2 JP50188792A JP50188792A JP3253614B2 JP 3253614 B2 JP3253614 B2 JP 3253614B2 JP 50188792 A JP50188792 A JP 50188792A JP 50188792 A JP50188792 A JP 50188792A JP 3253614 B2 JP3253614 B2 JP 3253614B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- light
- particles
- intensity
- scattered light
- wavelength
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 238000000149 argon plasma sintering Methods 0.000 title abstract description 19
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 title abstract description 5
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims abstract description 165
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 65
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 65
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 53
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 claims description 29
- 239000011521 glass Substances 0.000 claims description 26
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims description 21
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 claims description 19
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 18
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 17
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 claims description 13
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 13
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 claims description 13
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 12
- QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N mercury Chemical compound [Hg] QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 229910052753 mercury Inorganic materials 0.000 claims description 10
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 8
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 claims description 8
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 claims description 7
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 6
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 5
- 229910052724 xenon Inorganic materials 0.000 claims description 5
- FHNFHKCVQCLJFQ-UHFFFAOYSA-N xenon atom Chemical compound [Xe] FHNFHKCVQCLJFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 claims description 4
- 230000005855 radiation Effects 0.000 claims description 2
- 238000007599 discharging Methods 0.000 claims 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims 2
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 claims 2
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 claims 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 claims 1
- 230000005611 electricity Effects 0.000 claims 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 claims 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 claims 1
- 230000001678 irradiating effect Effects 0.000 claims 1
- 238000012886 linear function Methods 0.000 claims 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 abstract description 10
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 abstract 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 21
- 230000008569 process Effects 0.000 description 18
- 230000006870 function Effects 0.000 description 12
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 9
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 8
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 8
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 description 5
- 238000013461 design Methods 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 4
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 3
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 230000031700 light absorption Effects 0.000 description 3
- 239000013307 optical fiber Substances 0.000 description 3
- 206010036618 Premenstrual syndrome Diseases 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 229910052754 neon Inorganic materials 0.000 description 2
- GKAOGPIIYCISHV-UHFFFAOYSA-N neon atom Chemical compound [Ne] GKAOGPIIYCISHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000010355 oscillation Effects 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 239000010453 quartz Substances 0.000 description 2
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N silicon dioxide Inorganic materials O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 2
- 230000001360 synchronised effect Effects 0.000 description 2
- 238000004879 turbidimetry Methods 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101100244390 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) PMT7 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000011481 absorbance measurement Methods 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 238000005054 agglomeration Methods 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 108700025316 aldesleukin Proteins 0.000 description 1
- 239000006117 anti-reflective coating Substances 0.000 description 1
- 230000003667 anti-reflective effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000003125 aqueous solvent Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 235000013405 beer Nutrition 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 238000005515 capillary zone electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000004568 cement Substances 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000012733 comparative method Methods 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 238000013500 data storage Methods 0.000 description 1
- 238000000151 deposition Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 230000005684 electric field Effects 0.000 description 1
- 238000004134 energy conservation Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 239000010419 fine particle Substances 0.000 description 1
- 239000005357 flat glass Substances 0.000 description 1
- -1 for example Substances 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 102000034238 globular proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005896 globular proteins Proteins 0.000 description 1
- 229910052734 helium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001307 helium Substances 0.000 description 1
- SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N helium atom Chemical compound [He] SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CPBQJMYROZQQJC-UHFFFAOYSA-N helium neon Chemical compound [He].[Ne] CPBQJMYROZQQJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 238000007620 mathematical function Methods 0.000 description 1
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 238000004848 nephelometry Methods 0.000 description 1
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 1
- 239000011860 particles by size Substances 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 1
- 239000012798 spherical particle Substances 0.000 description 1
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 1
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- WFKWXMTUELFFGS-UHFFFAOYSA-N tungsten Chemical compound [W] WFKWXMTUELFFGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052721 tungsten Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010937 tungsten Substances 0.000 description 1
- 238000004506 ultrasonic cleaning Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
- G01N15/02—Investigating particle size or size distribution
- G01N15/0205—Investigating particle size or size distribution by optical means
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/62—Detectors specially adapted therefor
- G01N30/74—Optical detectors
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
- G01N15/04—Investigating sedimentation of particle suspensions
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
- G01N21/47—Scattering, i.e. diffuse reflection
- G01N2021/4704—Angular selective
- G01N2021/4726—Detecting scatter at 90°
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
- G01N21/47—Scattering, i.e. diffuse reflection
- G01N21/49—Scattering, i.e. diffuse reflection within a body or fluid
- G01N21/53—Scattering, i.e. diffuse reflection within a body or fluid within a flowing fluid, e.g. smoke
- G01N21/532—Scattering, i.e. diffuse reflection within a body or fluid within a flowing fluid, e.g. smoke with measurement of scattering and transmission
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
- Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10T436/25—Chemistry: analytical and immunological testing including sample preparation
- Y10T436/25375—Liberation or purification of sample or separation of material from a sample [e.g., filtering, centrifuging, etc.]
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Pathology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By Optical Means (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Materials For Medical Uses (AREA)
- Measurement Of The Respiration, Hearing Ability, Form, And Blood Characteristics Of Living Organisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は分子量が２ないし10,000kダルトンの特に生
体高分子、または他の高分子物質の、標準的な光散乱法
による特性検出と分析法に関する。さらに詳しくは本発
明は、例えば、液体クロマトグラフィーカラムの様な分
離装置から得られる粒子の分子量を測定するために設計
された、標準的な低角光散乱検出器及び多角の標準的な
光散乱検出器の改良に関する。
体高分子、または他の高分子物質の、標準的な光散乱法
による特性検出と分析法に関する。さらに詳しくは本発
明は、例えば、液体クロマトグラフィーカラムの様な分
離装置から得られる粒子の分子量を測定するために設計
された、標準的な低角光散乱検出器及び多角の標準的な
光散乱検出器の改良に関する。
技術背景 液体クロマトグラフィーカラムからか、または他の分
離装置から溶出する粒子の分子量は、その粒子の特性を
知るためのクロマトグラムの分析、及びプロセスの監視
と制御の双方に関して大変有用な情報源である。例え
ば、生物学的なプロセスによっていくつかの異なった興
味あるタンパクが生成し、科学者が、疾病の治療への利
用でさらに研究するためや、診断の目的に用いたりする
ために、それらを分子量によって分離し同定することを
考えてみるとよい。タンパク類を分子量によって分離す
る液体クロマトグラフィーカラムはないが、粒子をその
大きさによって分けるカラムはある。しかしながら、粒
子径は分子量の指標としては貧弱である。その理由は自
然の状態で存在する生体の球状タンパクと、同じそのタ
ンパクが変性された場合では同一分子量であっても大き
さがかなりに異なるからである。種々のタンパクの分離
にあたって、それらが液体クロマトグラフィーカラムか
ら溶出してきた時に、例えば、その大きさに基ずいて、
クロマトグラフ中の各ピークに相当するタンパクの分子
量が解るとすれば、それは有益である。その分子量の信
号は、分離された各タンパクをそれぞれ別の容器に分配
するためのコレクターシステムを制御するために用いら
れ得る。
離装置から溶出する粒子の分子量は、その粒子の特性を
知るためのクロマトグラムの分析、及びプロセスの監視
と制御の双方に関して大変有用な情報源である。例え
ば、生物学的なプロセスによっていくつかの異なった興
味あるタンパクが生成し、科学者が、疾病の治療への利
用でさらに研究するためや、診断の目的に用いたりする
ために、それらを分子量によって分離し同定することを
考えてみるとよい。タンパク類を分子量によって分離す
る液体クロマトグラフィーカラムはないが、粒子をその
大きさによって分けるカラムはある。しかしながら、粒
子径は分子量の指標としては貧弱である。その理由は自
然の状態で存在する生体の球状タンパクと、同じそのタ
ンパクが変性された場合では同一分子量であっても大き
さがかなりに異なるからである。種々のタンパクの分離
にあたって、それらが液体クロマトグラフィーカラムか
ら溶出してきた時に、例えば、その大きさに基ずいて、
クロマトグラフ中の各ピークに相当するタンパクの分子
量が解るとすれば、それは有益である。その分子量の信
号は、分離された各タンパクをそれぞれ別の容器に分配
するためのコレクターシステムを制御するために用いら
れ得る。
従来技術による検出器で液体クロマトグラフィーカラ
ムの流出液を屈折率の差異によって測定するものはあっ
た。しかし、屈折率は分子量の指標としては適当でな
い。
ムの流出液を屈折率の差異によって測定するものはあっ
た。しかし、屈折率は分子量の指標としては適当でな
い。
液体クロマトグラフィー（以後単にLCと記す）カラム
から流出する粒子の分子量を知る他の方法はクロマトグ
ラムの分析である。ある場合には、紫外線検出器（以後
単にUVと記す）を用いて検出するクロマトグラム中のピ
ークは、そのピークが如何なる粒子によってもたらされ
るかを解読することが出来ない。もし標準的な光散乱法
を他のクロマトグラムを起こすのに用いれば、その２つ
のクロマトグラムを比較し得て、UVクロマトグラム中の
各ピークを構成する物質間の差異は容易に測定すること
が出来るだろう。
から流出する粒子の分子量を知る他の方法はクロマトグ
ラムの分析である。ある場合には、紫外線検出器（以後
単にUVと記す）を用いて検出するクロマトグラム中のピ
ークは、そのピークが如何なる粒子によってもたらされ
るかを解読することが出来ない。もし標準的な光散乱法
を他のクロマトグラムを起こすのに用いれば、その２つ
のクロマトグラムを比較し得て、UVクロマトグラム中の
各ピークを構成する物質間の差異は容易に測定すること
が出来るだろう。
従来技術では、分子量の測定は困難で、1970年に設計
された標準的な光散乱法の数学的処理に基ずく装置によ
っていたが、その光散乱法は生体高分子に入射する光の
波長λの1/4以下の大きさの小粒子に対して適応させら
れていなかった。詳しくは、分子量、レイリー（Raylei
gh）散乱、散乱の原因になる粒子の重量濃度、Ｐと呼ば
れるサイズファクターと、第２ビリアル係数（生体タン
パクの粒子がその性質に基ずいて排除する体積に関する
係数）と呼ばれる他の物理学的特性の間に数学的な関連
がある。この第２ビリアル係数Ａは、もしそれが大きけ
れば、球状の生体タンパクがその周囲から他のタンパク
を大きく排除していることを意味する。Ａが負であれ
ば、それはこの生体タンパクは他のタンパクと結合する
傾向を有し、凝集することを意味している。さらに詳し
くはこの関係は、 ここで Ｋは、波長に関連する常数で、溶液の屈折率と溶液の屈
折率の他の物質間での経過時間による変化については、
与えられたシステムについて経験的に求めることが出来
る。
された標準的な光散乱法の数学的処理に基ずく装置によ
っていたが、その光散乱法は生体高分子に入射する光の
波長λの1/4以下の大きさの小粒子に対して適応させら
れていなかった。詳しくは、分子量、レイリー（Raylei
gh）散乱、散乱の原因になる粒子の重量濃度、Ｐと呼ば
れるサイズファクターと、第２ビリアル係数（生体タン
パクの粒子がその性質に基ずいて排除する体積に関する
係数）と呼ばれる他の物理学的特性の間に数学的な関連
がある。この第２ビリアル係数Ａは、もしそれが大きけ
れば、球状の生体タンパクがその周囲から他のタンパク
を大きく排除していることを意味する。Ａが負であれ
ば、それはこの生体タンパクは他のタンパクと結合する
傾向を有し、凝集することを意味している。さらに詳し
くはこの関係は、 ここで Ｋは、波長に関連する常数で、溶液の屈折率と溶液の屈
折率の他の物質間での経過時間による変化については、
与えられたシステムについて経験的に求めることが出来
る。
Ｒは、“特異的レーリー常数”または“特異的レーリー
率”、 Mwは、散乱物質の重量平均分子質量、 Ｐ（θ）は、式（１）を、粒子間の多重散乱について補
正するためのサイズパラメーター、 A2とA3は、それぞれ第２、第３ビリアル係数であり、 Ｃは、散乱粒子（以後、散乱物と記す）の重量濃度を示
す。
率”、 Mwは、散乱物質の重量平均分子質量、 Ｐ（θ）は、式（１）を、粒子間の多重散乱について補
正するためのサイズパラメーター、 A2とA3は、それぞれ第２、第３ビリアル係数であり、 Ｃは、散乱粒子（以後、散乱物と記す）の重量濃度を示
す。
この式で研究者にとって難しいものの一つは、式
（１）のＰ因子である。詳しくは、Ｐは次式によって与
えられる。
（１）のＰ因子である。詳しくは、Ｐは次式によって与
えられる。
ここで、 Ｐ（θ）-1は、サイズファクターの逆数、 ｎは、屈折率、 R9は、散乱物の転回半径、 θは、散乱光の角度、即ち入射光と散乱光の間の角度、 λ．は、入射光の波長を、それぞれ示す。
分子量測定を可能にする装置の設計技術において、技
術者には次の困難がある。その理由は、散乱物の回転半
径を簡単に測ることが出来ず、またそれに進歩が無いた
めであって、サイズファクターＰを知ることが出来ない
が、誤差の起きることを無視することも出来ない。ただ
し散乱角が非常に小さく、（１），（２）式におけるサ
イズファクターがほぼ１である時は可能である。そこ
で、ほぼ1970年頃に発達した分子量測定装置は、散乱角
が狭く、Ｐが無視できるものについて設計されていた。
事実、R9を測定することはできるが、そのためにはＲ
（レーリー散乱）を各々の複数の角θについて測定する
必要がある。ｗ（以後、散乱物質の分子集団の平均重
量、ｗはしばしば単にMwと記す）とR9はこれらの測定
によって得ることが出来る。従来技術による他の装置の
デザインはこの手法を用いていた。それは狭い角度θで
はR9を知る必要が無いからである。
術者には次の困難がある。その理由は、散乱物の回転半
径を簡単に測ることが出来ず、またそれに進歩が無いた
めであって、サイズファクターＰを知ることが出来ない
が、誤差の起きることを無視することも出来ない。ただ
し散乱角が非常に小さく、（１），（２）式におけるサ
イズファクターがほぼ１である時は可能である。そこ
で、ほぼ1970年頃に発達した分子量測定装置は、散乱角
が狭く、Ｐが無視できるものについて設計されていた。
事実、R9を測定することはできるが、そのためにはＲ
（レーリー散乱）を各々の複数の角θについて測定する
必要がある。ｗ（以後、散乱物質の分子集団の平均重
量、ｗはしばしば単にMwと記す）とR9はこれらの測定
によって得ることが出来る。従来技術による他の装置の
デザインはこの手法を用いていた。それは狭い角度θで
はR9を知る必要が無いからである。
図１は、R9が知られている必要の無い狭角度の光散乱
検出器（以後LALと記する）について、従来技術の実例
を示している。アークかレーザーによって与えられる光
源10からの光は、光学装置12によって液体の通過するセ
ル（フローセル）16の入射窓14に入射される。該フロー
セルは長い導入ガラス部分18、液体クロマトグラフィー
カラム22から溶液として流出してくる散乱物が流れる散
乱部位20、長い排出ガラス部分24、排出窓26、覆い28及
び散乱光測定器30とからなっている。
検出器（以後LALと記する）について、従来技術の実例
を示している。アークかレーザーによって与えられる光
源10からの光は、光学装置12によって液体の通過するセ
ル（フローセル）16の入射窓14に入射される。該フロー
セルは長い導入ガラス部分18、液体クロマトグラフィー
カラム22から溶液として流出してくる散乱物が流れる散
乱部位20、長い排出ガラス部分24、排出窓26、覆い28及
び散乱光測定器30とからなっている。
図１のLAL検出器には多くの改良可能の分野がある。
第一に、この設計ではいくつかの理由で、ノイズに対す
る信号比が適切でない。光源10はそれがアークの場合、
十分に平行な光線を与えず、また光線は光学装置12で焦
点が合わされなければならない。光学装置を通って光が
入射窓14に入るとき、レンズ系と入射窓が完全でないと
それらはなにがしかの入射光の散乱を起こし、それが検
出器30に補足されると、本来の光散乱ではない機械装置
自体に起因する散乱光を受けるので、ノイズになる。ま
た、光がガラス18を出て、散乱部位20に入り再びガラス
24に入るとき、ガラスの不完全さによって液体／ガラス
界面、32,34でさらに散乱が起こる。加えて光が出てく
る26の窓でも、ガラスの不完全性によって散乱が起こ
る。全てのこれらの散乱光はノイズであってデータでは
ないので、それらを排除する手段が必要である。これら
の手段の一つは、ガラス18と24を長くして入射窓14、界
面32と34で発生する光の散乱を十分に検出器から遠ざ
け、これらの場所で発生した散乱光を検出器から遠ざけ
ることである。光の出口窓である26の散乱光は覆い28に
よってある程度検出器からマスクされる。図２は覆い28
の重要なマスク構造を示している。この覆いは中心に不
透明な部分36を有していて、それはまっすぐにフローセ
ルと散乱部位中に入ってくる散乱していない入射光を遮
り、検出器30には入らないようにする働きがある。覆い
はまた同心円状に不透明部分38をもっていて、その不透
明部分は広角度の散乱光が検出器に入るのを防いでい
る。斜線を施していない部分40は透明で低角度の散乱光
を、元来の散乱物によるものもガラスの不完全性による
など他の原因によるものの区別無しに検出器に導く。
第一に、この設計ではいくつかの理由で、ノイズに対す
る信号比が適切でない。光源10はそれがアークの場合、
十分に平行な光線を与えず、また光線は光学装置12で焦
点が合わされなければならない。光学装置を通って光が
入射窓14に入るとき、レンズ系と入射窓が完全でないと
それらはなにがしかの入射光の散乱を起こし、それが検
出器30に補足されると、本来の光散乱ではない機械装置
自体に起因する散乱光を受けるので、ノイズになる。ま
た、光がガラス18を出て、散乱部位20に入り再びガラス
24に入るとき、ガラスの不完全さによって液体／ガラス
界面、32,34でさらに散乱が起こる。加えて光が出てく
る26の窓でも、ガラスの不完全性によって散乱が起こ
る。全てのこれらの散乱光はノイズであってデータでは
ないので、それらを排除する手段が必要である。これら
の手段の一つは、ガラス18と24を長くして入射窓14、界
面32と34で発生する光の散乱を十分に検出器から遠ざ
け、これらの場所で発生した散乱光を検出器から遠ざけ
ることである。光の出口窓である26の散乱光は覆い28に
よってある程度検出器からマスクされる。図２は覆い28
の重要なマスク構造を示している。この覆いは中心に不
透明な部分36を有していて、それはまっすぐにフローセ
ルと散乱部位中に入ってくる散乱していない入射光を遮
り、検出器30には入らないようにする働きがある。覆い
はまた同心円状に不透明部分38をもっていて、その不透
明部分は広角度の散乱光が検出器に入るのを防いでい
る。斜線を施していない部分40は透明で低角度の散乱光
を、元来の散乱物によるものもガラスの不完全性による
など他の原因によるものの区別無しに検出器に導く。
図１に示す装置の使用には面倒が多い。その理由は、
フローセルは取り外して洗浄することが出来ず、超音波
洗浄などによらざるを得ず、殆ど毎日、その種々の光学
的経路に出来る汚れを、余分な散乱を来さないように除
いていなければならないからである。
フローセルは取り外して洗浄することが出来ず、超音波
洗浄などによらざるを得ず、殆ど毎日、その種々の光学
的経路に出来る汚れを、余分な散乱を来さないように除
いていなければならないからである。
さらに、散乱光を極小化しようとすると、光学装置12
のアーク光を集束するためのデザインが複雑で高価にな
る。レーザーを用いると、その光線は平行であるため
に、光学装置のデザインの問題は軽減される。しかし、
ある程度の散乱光を排除するためにレーザービームを純
粋にするためのいくつかの光学装置が必要である。窓14
と26及び界面32と34を可及的に完全なものにする問題は
また大変困難である。
のアーク光を集束するためのデザインが複雑で高価にな
る。レーザーを用いると、その光線は平行であるため
に、光学装置のデザインの問題は軽減される。しかし、
ある程度の散乱光を排除するためにレーザービームを純
粋にするためのいくつかの光学装置が必要である。窓14
と26及び界面32と34を可及的に完全なものにする問題は
また大変困難である。
図１の構造の他の問題は、比較的安価に得られるヘリ
ューム−ネオンレーザーの様なレーザー光線の振動数
が、スペクトルの赤色部の末端にかなりに接近している
ので、検出器30の最高感度の得られる波長域とのマッチ
ングが悪い点にある。一般に、該検出器30は光電子倍増
管（以後、PMTと記する）であって、その感度は、スペ
クトルの青−緑部末端では赤色部の末端よりも３倍も効
率がよい。スペクトルの青−緑部末端について最適化し
たPMTはまた、暗電流（即ち散乱光が無い場合に好まし
くない信号になる）が低めであって、ノイズは低レベル
になる。入射光の強さに比べると散乱光の量は極めて少
ないので、散乱光の検出器の設計に当たってはノイズに
対する配慮は極めて重要で、また、散乱光の強度を確定
可能な範囲に保つために、入射光のレベルを強く保持す
ることも大切である。さらに、散乱された光の量は、1/
λ４に比例する。そこで短い波長λを持つ青色光は赤色
光に比べて大きな散乱が得られる。一般にヘリューム−
ネオンレーザーの発生するレーザー光の波長は633nmで
あり、アークランプからとった一般的な利用可能な光の
波長は467nmである。6334を4674で除すると3.4になるの
で、青みがかったアークからの光はHe−Neのレーザー光
よりも3.4倍も良く散乱する。そこで青−緑色に適合さ
せたPMTを用いることが、大変好ましい。青−緑色末端
のスペクトルをもち、高出力である光を出すレーザーは
大変高価で大型である。従って作られる装置は大型で、
重量が大きく、高価なものになる。
ューム−ネオンレーザーの様なレーザー光線の振動数
が、スペクトルの赤色部の末端にかなりに接近している
ので、検出器30の最高感度の得られる波長域とのマッチ
ングが悪い点にある。一般に、該検出器30は光電子倍増
管（以後、PMTと記する）であって、その感度は、スペ
クトルの青−緑部末端では赤色部の末端よりも３倍も効
率がよい。スペクトルの青−緑部末端について最適化し
たPMTはまた、暗電流（即ち散乱光が無い場合に好まし
くない信号になる）が低めであって、ノイズは低レベル
になる。入射光の強さに比べると散乱光の量は極めて少
ないので、散乱光の検出器の設計に当たってはノイズに
対する配慮は極めて重要で、また、散乱光の強度を確定
可能な範囲に保つために、入射光のレベルを強く保持す
ることも大切である。さらに、散乱された光の量は、1/
λ４に比例する。そこで短い波長λを持つ青色光は赤色
光に比べて大きな散乱が得られる。一般にヘリューム−
ネオンレーザーの発生するレーザー光の波長は633nmで
あり、アークランプからとった一般的な利用可能な光の
波長は467nmである。6334を4674で除すると3.4になるの
で、青みがかったアークからの光はHe−Neのレーザー光
よりも3.4倍も良く散乱する。そこで青−緑色に適合さ
せたPMTを用いることが、大変好ましい。青−緑色末端
のスペクトルをもち、高出力である光を出すレーザーは
大変高価で大型である。従って作られる装置は大型で、
重量が大きく、高価なものになる。
さらに、レーザーには漣様のノイズがあり、ノイズは
発信する光の強度を０から30Hz変調する。光源で起こる
入射光の強度の変化は、散乱物の分子量や濃度に起因し
ないにもかかわらず、散乱光の強度変化の形のノイズに
翻訳されてしまう。高速液体クロマトグラフィーは少な
くとも30分から90分間で終了し、検出器から出る普通の
サンプルの信号は１秒に１回程度である。そこで、サン
プルの頻度と漣様ノイズの頻度帯が似ているので、デー
タに余計にノイズをもたらす傾向がある。
発信する光の強度を０から30Hz変調する。光源で起こる
入射光の強度の変化は、散乱物の分子量や濃度に起因し
ないにもかかわらず、散乱光の強度変化の形のノイズに
翻訳されてしまう。高速液体クロマトグラフィーは少な
くとも30分から90分間で終了し、検出器から出る普通の
サンプルの信号は１秒に１回程度である。そこで、サン
プルの頻度と漣様ノイズの頻度帯が似ているので、デー
タに余計にノイズをもたらす傾向がある。
最後に、液体クロマトグラフィーカラムの流出液の中
に不可避的に存在する非常に大型の粒子による、他のノ
イズの問題がある。これらの大型粒子はカラム充填物の
破片であろうから、関心外のものであるが、大きさの故
に、とにかく大量の散乱光を起こす。図３は小型の粒子
の典型的な光散乱パターンを角度の関数として図示した
もので、図４は大型の粒子の典型的な光散乱パターンを
図示したものである。図３において入射光ベクトルI0は
左から入り、散乱光ベクトルについて、低角度から約90
度のものまでを、それぞれ、ベクトルIs0とIs90として
表す。小型の粒子によって、90度のところに散乱した光
の強度は、低角度のところに散乱した光の強度の約二分
の一である。不幸にして、図４に示すとおり、大型の粒
子から散乱される光の強度は非常に多様な形になる。図
４は大型の粒子からは90度のところに大変少量の光しか
散乱されないこと、大部分の散乱光は低角度のところに
進むことを示している。このことによって、これらの大
型の粒子は、相対的には少量であるものの、低角度の散
乱光を検知する検出器に対して大きなノイズをもたらす
であろう。
に不可避的に存在する非常に大型の粒子による、他のノ
イズの問題がある。これらの大型粒子はカラム充填物の
破片であろうから、関心外のものであるが、大きさの故
に、とにかく大量の散乱光を起こす。図３は小型の粒子
の典型的な光散乱パターンを角度の関数として図示した
もので、図４は大型の粒子の典型的な光散乱パターンを
図示したものである。図３において入射光ベクトルI0は
左から入り、散乱光ベクトルについて、低角度から約90
度のものまでを、それぞれ、ベクトルIs0とIs90として
表す。小型の粒子によって、90度のところに散乱した光
の強度は、低角度のところに散乱した光の強度の約二分
の一である。不幸にして、図４に示すとおり、大型の粒
子から散乱される光の強度は非常に多様な形になる。図
４は大型の粒子からは90度のところに大変少量の光しか
散乱されないこと、大部分の散乱光は低角度のところに
進むことを示している。このことによって、これらの大
型の粒子は、相対的には少量であるものの、低角度の散
乱光を検知する検出器に対して大きなノイズをもたらす
であろう。
従って、これらの標準的な光検出器と、フローセルの
散乱部位に入って来る生体タンパクや他の小型の物質の
分子量を測定するシステムについて、新しいデザインの
ニーズがあった。
散乱部位に入って来る生体タンパクや他の小型の物質の
分子量を測定するシステムについて、新しいデザインの
ニーズがあった。
発明の要約 本発明の示すところによる、アーク光源、好ましくは
水銀アーク、フィルター、フローセル、LCカラム、UV検
出器、広角度散乱光検出器、入射光検出器、UV検出器と
散乱光検出器からの信号に基ずいて分子量を計算するコ
ンピューターからなる測定装置、アークの光源からの光
はフィルターを通じて単一振動数のものになり、好まし
くは被分析物による吸収や蛍光発生の無いもので、その
バンドでは、該光源について、波長に対する発生強度の
特性曲線と、検出器に関してその波長に対する効率の特
性曲線が、共に最高になるかまたはその付近であること
が好ましい。この単一波長の光は選択的に垂直方向のみ
に偏光させる。濾光され偏光された光は次いで光学装置
で適切に集束されて、フローセルの入射窓の境界にアー
クの像を結ぶ。入射光検出器はフローセル入射窓の入射
光強度を適切に検知する。
水銀アーク、フィルター、フローセル、LCカラム、UV検
出器、広角度散乱光検出器、入射光検出器、UV検出器と
散乱光検出器からの信号に基ずいて分子量を計算するコ
ンピューターからなる測定装置、アークの光源からの光
はフィルターを通じて単一振動数のものになり、好まし
くは被分析物による吸収や蛍光発生の無いもので、その
バンドでは、該光源について、波長に対する発生強度の
特性曲線と、検出器に関してその波長に対する効率の特
性曲線が、共に最高になるかまたはその付近であること
が好ましい。この単一波長の光は選択的に垂直方向のみ
に偏光させる。濾光され偏光された光は次いで光学装置
で適切に集束されて、フローセルの入射窓の境界にアー
クの像を結ぶ。入射光検出器はフローセル入射窓の入射
光強度を適切に検知する。
試料からの生物学的タンパクを含むLCカラムからの流
出液は散乱光検出器を付したフローセルの散乱部位を通
過する。散乱光の測定は、35゜から145゜までのいかな
る角度を用いて行ってもよいが、構造の容易さから90゜
が適し、散乱光検出器によって、散乱光強度が測られ
る。
出液は散乱光検出器を付したフローセルの散乱部位を通
過する。散乱光の測定は、35゜から145゜までのいかな
る角度を用いて行ってもよいが、構造の容易さから90゜
が適し、散乱光検出器によって、散乱光強度が測られ
る。
UV検出器はLCカラムの流出液を通す独自のフローセル
を有する。UV検出器はLCカラムからの流出液がそのフロ
ーセルを通過する時に、生物学的諸粒子（または他の諸
分子）によるUV照射の吸収の程度を検知する。このUV吸
収のデータを求めるには一般的に280nmの波長で行う。
しかし、それはまたさらに短波長の、例えば、200−214
nmでも行われる。必ずしも全てのタンパクが280nmで吸
光せず、殆ど全ての関心あるタンパクは200−214nmで吸
光するからである。280nmにおける吸光はタンパクの濃
度に特異的であって、LC流出液中の散乱物の重量濃度を
計算するために用いられ得る。この目的のためには、例
えば、屈折率検出器のように重量濃度に対して比例した
データか信号を与えるものであればどの様な検出器でも
用いることが出来る。この濃度検出は散乱光検出器のた
めのフローセルの上流部分で行うこともできるし、また
その下流部分で行うこともできるが、その結果２つの検
出器の間の通過時間による物理的遅延が生ずるので、UV
検出器からのデータは散乱光検出器からのデータと時間
的に対応させる必要があるだろう。UV検出器から出た重
量濃度データを散乱光の強度データに合わせることは、
コンピューターによって可能で、LCカラムから出て来る
散乱物質の平均分子量Mwを補正して計算させることがで
きる。この計算は式（３）を用いてなされるが、この式
は前記（１）式から導いた簡略式である。
を有する。UV検出器はLCカラムからの流出液がそのフロ
ーセルを通過する時に、生物学的諸粒子（または他の諸
分子）によるUV照射の吸収の程度を検知する。このUV吸
収のデータを求めるには一般的に280nmの波長で行う。
しかし、それはまたさらに短波長の、例えば、200−214
nmでも行われる。必ずしも全てのタンパクが280nmで吸
光せず、殆ど全ての関心あるタンパクは200−214nmで吸
光するからである。280nmにおける吸光はタンパクの濃
度に特異的であって、LC流出液中の散乱物の重量濃度を
計算するために用いられ得る。この目的のためには、例
えば、屈折率検出器のように重量濃度に対して比例した
データか信号を与えるものであればどの様な検出器でも
用いることが出来る。この濃度検出は散乱光検出器のた
めのフローセルの上流部分で行うこともできるし、また
その下流部分で行うこともできるが、その結果２つの検
出器の間の通過時間による物理的遅延が生ずるので、UV
検出器からのデータは散乱光検出器からのデータと時間
的に対応させる必要があるだろう。UV検出器から出た重
量濃度データを散乱光の強度データに合わせることは、
コンピューターによって可能で、LCカラムから出て来る
散乱物質の平均分子量Mwを補正して計算させることがで
きる。この計算は式（３）を用いてなされるが、この式
は前記（１）式から導いた簡略式である。
（３） Is/Io＝Ｂ＊Ｃ＊Mw ここで Is/Ioは、高角度の散乱光の35゜から145゜の間の一定の
角度での散乱光の強度の、フローセル上への入射光の強
度Ioに対する比率（これは光源の強度の変化によって起
こるノイズを消去する）、 Ｃは、重量濃度、 Mwは、流出した流れの中の散乱物質の重量平均分子量
で、その部分について重量濃度Ｃが測定されたもの、 Ｂは、各々のシステムに固有の光学的常数で、それは経
済的に重量平均分子量が既知の種々のタイプの粒子によ
って測定するか、トルエンの様な散乱能が解っている溶
液を用いて測定しておくものである。
角度での散乱光の強度の、フローセル上への入射光の強
度Ioに対する比率（これは光源の強度の変化によって起
こるノイズを消去する）、 Ｃは、重量濃度、 Mwは、流出した流れの中の散乱物質の重量平均分子量
で、その部分について重量濃度Ｃが測定されたもの、 Ｂは、各々のシステムに固有の光学的常数で、それは経
済的に重量平均分子量が既知の種々のタイプの粒子によ
って測定するか、トルエンの様な散乱能が解っている溶
液を用いて測定しておくものである。
本発明の示す、他の選択としての装置に２つの出力窓
を持ったフローセルがある。単一の光源を用いる。焦点
調節光学装置、散乱光検出器は前述のものと同様な構造
をとることが出来る。重量濃度データはUV検出器とモノ
クロメーター（単色光分光器）、フローセル中にある第
二の出力窓と各検出器の前にある２個の別々のフィルタ
ーを用いて測定される。モノクロメーター（波長合わせ
が可能で、調和振動も通過させるフィルター）は、アー
ク光源からの光を分光してUV吸光測定に適した波長、普
通は280nm近辺（或はタンパクによっては200−214nm）
に同期させ、第二の波長を約560nmのところで通過させ
るが、一方は必須なものであり他方は２倍の調和振動で
ある。280nmの波長は低強度で通過させる。全てのタン
パクが280nmで吸光しないのでモノクロメーターは全て
のタンパクが吸収を行う200−214nmに同調させる必要が
起こることもある。400−428nmの波長はまたよく散乱を
起こす。レーザーに対してアークを用いることの他の利
点は、入射光の振動数の選択同調がより容易なことであ
る。これらの波長はフローセルに入り、入射したエネル
ギーの大部分は散乱されずにフローセル内を直進する。
直進したエネルギーは入射窓の反対側にある窓から出
て、280nmの光以外の全ての波長を除去するフィルター
を通過する。この光はUVPMTによって検知され、結果の
信号はデジタル化され入射光の強度から引き算されて重
量濃度の計算に用いられる。
を持ったフローセルがある。単一の光源を用いる。焦点
調節光学装置、散乱光検出器は前述のものと同様な構造
をとることが出来る。重量濃度データはUV検出器とモノ
クロメーター（単色光分光器）、フローセル中にある第
二の出力窓と各検出器の前にある２個の別々のフィルタ
ーを用いて測定される。モノクロメーター（波長合わせ
が可能で、調和振動も通過させるフィルター）は、アー
ク光源からの光を分光してUV吸光測定に適した波長、普
通は280nm近辺（或はタンパクによっては200−214nm）
に同期させ、第二の波長を約560nmのところで通過させ
るが、一方は必須なものであり他方は２倍の調和振動で
ある。280nmの波長は低強度で通過させる。全てのタン
パクが280nmで吸光しないのでモノクロメーターは全て
のタンパクが吸収を行う200−214nmに同調させる必要が
起こることもある。400−428nmの波長はまたよく散乱を
起こす。レーザーに対してアークを用いることの他の利
点は、入射光の振動数の選択同調がより容易なことであ
る。これらの波長はフローセルに入り、入射したエネル
ギーの大部分は散乱されずにフローセル内を直進する。
直進したエネルギーは入射窓の反対側にある窓から出
て、280nmの光以外の全ての波長を除去するフィルター
を通過する。この光はUVPMTによって検知され、結果の
信号はデジタル化され入射光の強度から引き算されて重
量濃度の計算に用いられる。
入射光の一部は35゜から145゜の間の高角度に散乱さ
れる。実用上好適な散乱光の角度は約90゜で、それは56
0nmのみを通過させるフィルターを付けた光路に導かれ
る。この光は散乱光検出器によって測定される。入射光
の強度はまたフローセルの入射側で測定される。この入
射光強度は散乱光強度との比率を求めて、フローセルに
入って来る光の強度の変動によるノイズを排除するため
に用いられる。それはまた透過光の強度を標準化するた
めに光源からの光の出力変動によって起こる如何なるノ
イズをも排除するために用いられる。この標準化された
散乱光強度と重量濃度を用いて平均分子量が計算され
る。この装置を用いると、２つのフローセルと２つの光
源を用いることで、各光源からの出力が同調せず別々に
変動することによってノイズの原因を作ることを避ける
ことが出来る。
れる。実用上好適な散乱光の角度は約90゜で、それは56
0nmのみを通過させるフィルターを付けた光路に導かれ
る。この光は散乱光検出器によって測定される。入射光
の強度はまたフローセルの入射側で測定される。この入
射光強度は散乱光強度との比率を求めて、フローセルに
入って来る光の強度の変動によるノイズを排除するため
に用いられる。それはまた透過光の強度を標準化するた
めに光源からの光の出力変動によって起こる如何なるノ
イズをも排除するために用いられる。この標準化された
散乱光強度と重量濃度を用いて平均分子量が計算され
る。この装置を用いると、２つのフローセルと２つの光
源を用いることで、各光源からの出力が同調せず別々に
変動することによってノイズの原因を作ることを避ける
ことが出来る。
本発明の示す実施態様の一つは入射光を分光して、重
量濃度の測定に適した第一の波長のみを用い、また散乱
光検出器の感度が最高になるバンド内で第二の波長を用
いることである。一般的に、光源用として個別の波長に
おける発光強度と、その検出器用の波長に対する出力の
強度を調節する機能がある。入射光の波長はこれらの２
つの機能の結果が最高になるスペクトル範囲から選定さ
れることが好ましい。他の非常に小さい粒子の生物学的
タンパクのサンプルは分離装置を通り分離された粒子の
流れは透明部分、好ましくはフローセルを通過する。そ
の透明部分またはフローセルを散乱されずに透過した重
量濃度を測定するために適当な波長の光の強度は、そこ
で既知の関係を用いて検出され、ついで重量濃度が計算
される。また、第二の波長の光の強度が35゜−145゜の
範囲にある高角度（構造上の便宜さから、好ましくは90
゜）で測定される。フローセルに入射する光の強度は、
ノイズを消去する目的でフローセルの入射光側で測定さ
れる、そして散乱光と透過光の強度が標準化される。散
乱光の強度と重量濃度は、前記（３）式に示したように
予めもとめた関係を用いて散乱光を起こす粒子の平均分
子量を計算するために用いられる。
量濃度の測定に適した第一の波長のみを用い、また散乱
光検出器の感度が最高になるバンド内で第二の波長を用
いることである。一般的に、光源用として個別の波長に
おける発光強度と、その検出器用の波長に対する出力の
強度を調節する機能がある。入射光の波長はこれらの２
つの機能の結果が最高になるスペクトル範囲から選定さ
れることが好ましい。他の非常に小さい粒子の生物学的
タンパクのサンプルは分離装置を通り分離された粒子の
流れは透明部分、好ましくはフローセルを通過する。そ
の透明部分またはフローセルを散乱されずに透過した重
量濃度を測定するために適当な波長の光の強度は、そこ
で既知の関係を用いて検出され、ついで重量濃度が計算
される。また、第二の波長の光の強度が35゜−145゜の
範囲にある高角度（構造上の便宜さから、好ましくは90
゜）で測定される。フローセルに入射する光の強度は、
ノイズを消去する目的でフローセルの入射光側で測定さ
れる、そして散乱光と透過光の強度が標準化される。散
乱光の強度と重量濃度は、前記（３）式に示したように
予めもとめた関係を用いて散乱光を起こす粒子の平均分
子量を計算するために用いられる。
本発明の示す他の方法は、λ/4以下の大きさの関心対
象である小型の粒子を、既存の何等かの方法、例えば、
液体クロマトグラフィーや毛細管電気泳動などによって
分離し；分離された微粒子の流れを透明な領域、好まし
くはフローセルを通過せしめ、該粒子の重量濃度を計算
するために用いられる全ての特性を測定して重量濃度を
計算し；その流れを第二のフローセル内に導いて既知の
波長λの入射光をその流れに与える；その流れに入射さ
れた光の強度と、散乱光の強度を35゜から145゜の間の
一定の角度で測定し；前記の式（３）と重量濃度と、入
射光の強度に対して標準化された散乱光の強度とを用い
るか、或は、散乱光と入射光の強度を別々の信号とし取
り出すかまたは手計算で求めることが出来る比率として
求めて、コンピューター中で平均分子量を計算する。重
量濃度を計算するために、流れを透過する光のUV吸収の
測定には一波長を用いることが適している。散乱光の測
定には、（入射光強度に対して標準化された）相対散乱
光強度と計算された重量濃度を用いて重量平均分子量を
計算するために、他の波長が適するであろう。この方法
は、ノイズを持った２つの光源が用いられ、２つの異な
った光源から発生する光の強度が同調しないときに生ず
る余分なノイズを排除する。
象である小型の粒子を、既存の何等かの方法、例えば、
液体クロマトグラフィーや毛細管電気泳動などによって
分離し；分離された微粒子の流れを透明な領域、好まし
くはフローセルを通過せしめ、該粒子の重量濃度を計算
するために用いられる全ての特性を測定して重量濃度を
計算し；その流れを第二のフローセル内に導いて既知の
波長λの入射光をその流れに与える；その流れに入射さ
れた光の強度と、散乱光の強度を35゜から145゜の間の
一定の角度で測定し；前記の式（３）と重量濃度と、入
射光の強度に対して標準化された散乱光の強度とを用い
るか、或は、散乱光と入射光の強度を別々の信号とし取
り出すかまたは手計算で求めることが出来る比率として
求めて、コンピューター中で平均分子量を計算する。重
量濃度を計算するために、流れを透過する光のUV吸収の
測定には一波長を用いることが適している。散乱光の測
定には、（入射光強度に対して標準化された）相対散乱
光強度と計算された重量濃度を用いて重量平均分子量を
計算するために、他の波長が適するであろう。この方法
は、ノイズを持った２つの光源が用いられ、２つの異な
った光源から発生する光の強度が同調しないときに生ず
る余分なノイズを排除する。
本発明を実施するための他の方法と装置は、予めその
物質についてある種の事実が解っている大型の粒子につ
いて、前記の全ての測定を行うものである。それは、平
均分子量と回転半径の間の関係がバンドブックで調べら
れるか或は既知である場合である。この種の表は多くあ
る。もちろんその粒子について確実なことを知る必要が
あり、特に、粒子の形状、大きさ、溶媒など、その表が
準拠している特徴について知る必要がある。表は普通、
MwをdRgxの形で与えている。ここで、ｘはある種の力で
ありｄは濃度因子で表に記載されている。RgのMwに対す
る関連式はMwをRg2の形で表して書き換えることが出
来、そして式（15）において結果としてRg2に置換され
る。この書き換えられた式（15）は、Ｐ（θ）に関する
式（11）に代入され、光散乱能Ｒと重量平均分子量Mwと
の間の関係を表す２次方程式が得られる。ついで、この
関係（書き換えられた式（11））を、標準化された散乱
光強度Is/Ioの測定値と、それが可能ならばビリアル係
数を無視したもの、またはこれらの係数の測定値のいず
れかを用いて、Mwについて解く。このように、その粒子
に対して十分な情報量が既知であり、前もって適切な表
と適切な特徴を選択することが出来るものであれば、如
何なる大きさの粒子に対してもこれを適用することが出
来る。もちろん、大型の粒子に対して式（11）のビリア
ル係数項目が無視できないならば、Mwを解くにあたっ
て、それらを測定し式（11）で使わなければならない。
物質についてある種の事実が解っている大型の粒子につ
いて、前記の全ての測定を行うものである。それは、平
均分子量と回転半径の間の関係がバンドブックで調べら
れるか或は既知である場合である。この種の表は多くあ
る。もちろんその粒子について確実なことを知る必要が
あり、特に、粒子の形状、大きさ、溶媒など、その表が
準拠している特徴について知る必要がある。表は普通、
MwをdRgxの形で与えている。ここで、ｘはある種の力で
ありｄは濃度因子で表に記載されている。RgのMwに対す
る関連式はMwをRg2の形で表して書き換えることが出
来、そして式（15）において結果としてRg2に置換され
る。この書き換えられた式（15）は、Ｐ（θ）に関する
式（11）に代入され、光散乱能Ｒと重量平均分子量Mwと
の間の関係を表す２次方程式が得られる。ついで、この
関係（書き換えられた式（11））を、標準化された散乱
光強度Is/Ioの測定値と、それが可能ならばビリアル係
数を無視したもの、またはこれらの係数の測定値のいず
れかを用いて、Mwについて解く。このように、その粒子
に対して十分な情報量が既知であり、前もって適切な表
と適切な特徴を選択することが出来るものであれば、如
何なる大きさの粒子に対してもこれを適用することが出
来る。もちろん、大型の粒子に対して式（11）のビリア
ル係数項目が無視できないならば、Mwを解くにあたっ
て、それらを測定し式（11）で使わなければならない。
図面の簡単な説明 図１は、標準的な既存技術の低角度散乱光検出器のブ
ロックダイアグラム（ブロックに切った模式図）であ
る。
ロックダイアグラム（ブロックに切った模式図）であ
る。
図２は、図１中の覆い（マスク）28の正面図である。
図３は、小型粒子についての角度による散乱光強度の
関係図である。
関係図である。
図４は、大型粒子についての角度による散乱光強度の
関係図である。
関係図である。
図５は、本発明による、平均分子量の計算が可能な高
角度散乱光検出機のブロックダイアグラムの一例であ
る。
角度散乱光検出機のブロックダイアグラムの一例であ
る。
図６は、フローセルの入射窓の正面図である。
図７は、図５における、散乱物の平均分子量を計算す
るためのコンピューターの制御の標準的なフローチャー
トの一例である。
るためのコンピューターの制御の標準的なフローチャー
トの一例である。
図８は、高角度散乱光検出機について、式（３）の中
の光学的常数Ｂをどの様にして実験的に求めるかを描い
た、標準的な実験結果のグラフである。
の光学的常数Ｂをどの様にして実験的に求めるかを描い
た、標準的な実験結果のグラフである。
図９は、本発明による装置の他の実例のブロックダイ
アグラムの一つで、いかにして重量濃度と散乱光検出機
がフローセルを共有し得るかを示している。
アグラムの一つで、いかにして重量濃度と散乱光検出機
がフローセルを共有し得るかを示している。
図10は、諸粒子の分離にキャピラリーゾーン電気泳動
を用いた場合の具体例の図の一つである。
を用いた場合の具体例の図の一つである。
図11は、単一光源、単一フローセル、単一モノクロメ
ーターを用いた場合の具体例の図の一つである。
ーターを用いた場合の具体例の図の一つである。
図12は、単一光源、単一フローセルで、２つのモノク
ロメーターを用いた場合の具体例の図の一つである。
ロメーターを用いた場合の具体例の図の一つである。
図13は、２つのフローセルと２つの光源を用いた場合
の重量平均分子量の測定のためのプロセスの一例を示す
図である。
の重量平均分子量の測定のためのプロセスの一例を示す
図である。
図14は、単一光源、単一フローセルを用いて重量平均
分子量を測定するためのプロセスの一例を示す。
分子量を測定するためのプロセスの一例を示す。
発明の開示 図５に、本発明の内容による具体例の一つがブロック
ダイアグラムで示されている。図５は、一連のシステム
の中の単なる一例を示したものであるが、このシステム
は生物学的タンパクや他の散乱される光の波長よりかな
りに小さい粒径を持った粒子の平均分子量を計算するこ
とが出来る。標準的な適用例はLCクロマトグラムを分析
するか、LC分離カラム52の流出液出口50に接続した分取
装置（図示していない）を制御して、分子量に従って流
出して来る粒子をそれぞれ異なった容器中に分取するも
のである。このシステムは液体クロマトグラフィーの分
野の他にも他の良い適用例を有する。例えば、図５のシ
ステムと、ここに開示する他の全ての具体化例も、静止
した液中にある微粒子の分子量を測ることが出来る。
ダイアグラムで示されている。図５は、一連のシステム
の中の単なる一例を示したものであるが、このシステム
は生物学的タンパクや他の散乱される光の波長よりかな
りに小さい粒径を持った粒子の平均分子量を計算するこ
とが出来る。標準的な適用例はLCクロマトグラムを分析
するか、LC分離カラム52の流出液出口50に接続した分取
装置（図示していない）を制御して、分子量に従って流
出して来る粒子をそれぞれ異なった容器中に分取するも
のである。このシステムは液体クロマトグラフィーの分
野の他にも他の良い適用例を有する。例えば、図５のシ
ステムと、ここに開示する他の全ての具体化例も、静止
した液中にある微粒子の分子量を測ることが出来る。
図５において、ポンプ54は種々の生物学的タンパクま
たは他の似通った大きさの粒子の混合物を含むサンプル
を容器または他の給源56から揚水する。該サンプルは液
体クロマトグラフィーカラム52を通って、例えば、大き
さのような特徴によって分離される。種々の大きさをも
つ粒子は異なった時間に、溶媒の流れの中に組み込まれ
たLCカラムから、出口50に流出して来る。
たは他の似通った大きさの粒子の混合物を含むサンプル
を容器または他の給源56から揚水する。該サンプルは液
体クロマトグラフィーカラム52を通って、例えば、大き
さのような特徴によって分離される。種々の大きさをも
つ粒子は異なった時間に、溶媒の流れの中に組み込まれ
たLCカラムから、出口50に流出して来る。
何れの特定の時間に流出して来る種々のタンパクの平
均分子量を計算するために、溶媒の流れを中に存在する
それらのタンパクの重量濃度を知る必要がある。これは
前記式（１）を解いて確かめられる。このためには、通
常の紫外線吸収検知器58が流出液出口に連結されている
が、しかしこれは、重量濃度を導くことの出来る信号を
発信することの可能な他の如何なるタイプの検出機であ
ってもよい。この種の他のタイプの検出機には屈折率計
が含まれる。
均分子量を計算するために、溶媒の流れを中に存在する
それらのタンパクの重量濃度を知る必要がある。これは
前記式（１）を解いて確かめられる。このためには、通
常の紫外線吸収検知器58が流出液出口に連結されている
が、しかしこれは、重量濃度を導くことの出来る信号を
発信することの可能な他の如何なるタイプの検出機であ
ってもよい。この種の他のタイプの検出機には屈折率計
が含まれる。
標準的には、このUV検出器58は、その内部をタンパク
類を含んだ溶液が流れるフローセル、紫外線光源、入射
するUV強度の検出器、散乱されたUV強度の検出器と他の
フィルター及び／またはバッフリング（調節装置）、ノ
イズに対する信号量を増強する光学装置を含んでいる。
フローセルは基本的にガラスまたは水晶体の中を通過す
る導管で、入射窓があり、そこから導管内を通過する液
体に光を照らすことが出来、また少なくとも一個の出口
の窓があり、散乱または透過した光を通すことが出来
る。重量濃度を測定する方法は本発明にとって決定的な
ものではなく、この測定が可能などの様な方法と装置
も、本発明の実施の目的にかなうであろう。
類を含んだ溶液が流れるフローセル、紫外線光源、入射
するUV強度の検出器、散乱されたUV強度の検出器と他の
フィルター及び／またはバッフリング（調節装置）、ノ
イズに対する信号量を増強する光学装置を含んでいる。
フローセルは基本的にガラスまたは水晶体の中を通過す
る導管で、入射窓があり、そこから導管内を通過する液
体に光を照らすことが出来、また少なくとも一個の出口
の窓があり、散乱または透過した光を通すことが出来
る。重量濃度を測定する方法は本発明にとって決定的な
ものではなく、この測定が可能などの様な方法と装置
も、本発明の実施の目的にかなうであろう。
このUV検出器58はライン60にアナログ信号を送るが、
この信号は重量濃度と同じかまたはそれに比例的であ
る。この信号はアナログ−デジタル変換器62によってデ
ジタル信号に変換され、集中プロセスユニット（CPU）6
4にインプットされる。。UV検出器58を出た溶液は、つ
いで導管66を通りフローセル68（上から見た図で示され
た）に入る。フローセルには標準的な高角度散乱光検出
器70が付けられているが、このものの構造は蛍光測定器
にしばしば見られる光検出器の構造とよく類似してい
る。検出器70はフローセル装置一式からなるが、該フロ
ーセルは入射光Ioを導くために光源72と光学的に連結し
ており、また散乱光検出器74と連結していて、それによ
って入射光Ioに対して直角に散乱される光Isの強度を測
定する。光源72は水銀のアークランプで、例えば、100
ワットのオスラムHBO 100W/2アークランプが好まし
い。該光源は多くの異なった波長を発光するが、式
（１）及び（２）の検討から、分子量を数学的に導くた
めに、既知の単一波長を用いるべき事を銘記するべきで
ある。２種の波長の何れもが適しているが、それらは、
436.1nmの緑色光か、546.1nmの黄緑色である。これら２
種の波長は散乱光検出器74に対して最大の感度と、暗電
流ノイズが最少になるバンド内にある。この散乱光検出
器は青−緑領域に最適化された光電子増倍管（PMT）で
あることが好ましい。
この信号は重量濃度と同じかまたはそれに比例的であ
る。この信号はアナログ−デジタル変換器62によってデ
ジタル信号に変換され、集中プロセスユニット（CPU）6
4にインプットされる。。UV検出器58を出た溶液は、つ
いで導管66を通りフローセル68（上から見た図で示され
た）に入る。フローセルには標準的な高角度散乱光検出
器70が付けられているが、このものの構造は蛍光測定器
にしばしば見られる光検出器の構造とよく類似してい
る。検出器70はフローセル装置一式からなるが、該フロ
ーセルは入射光Ioを導くために光源72と光学的に連結し
ており、また散乱光検出器74と連結していて、それによ
って入射光Ioに対して直角に散乱される光Isの強度を測
定する。光源72は水銀のアークランプで、例えば、100
ワットのオスラムHBO 100W/2アークランプが好まし
い。該光源は多くの異なった波長を発光するが、式
（１）及び（２）の検討から、分子量を数学的に導くた
めに、既知の単一波長を用いるべき事を銘記するべきで
ある。２種の波長の何れもが適しているが、それらは、
436.1nmの緑色光か、546.1nmの黄緑色である。これら２
種の波長は散乱光検出器74に対して最大の感度と、暗電
流ノイズが最少になるバンド内にある。この散乱光検出
器は青−緑領域に最適化された光電子増倍管（PMT）で
あることが好ましい。
他の実施の選択肢として、光源はキセノンアークかタ
ングステンランプまたはレーザーであっても良いだろう
が、しかし水銀アークランプはその強度が高いために適
している。入射光強度Ioが大きいほど、フローセル中を
通過するタンパクにそれが当たると、高角度の散乱光の
強度が高まる（この関係は、タンパクの溶液中での重量
濃度Ｃが大きいほど高まるのと同じである）。入射光の
ほんの一部だけが散乱され、入射光の強度が大きいと散
乱光強度も高まるので、ノイズに対する信号の強度比が
良好になる。さきに示唆した形式の水銀アークランプの
出力はほぼ20ミリワットであり、標準的なヘリューム・
ネオン（HeNe）レーザーの633nmの光の出力は２−３ミ
リワットである。HeNeレーザーの波長は、PMTが検出器7
4として用いられた場合に、最大の感度を示さない。し
かしながら、雪崩型の光ダイオードは、赤色の波長に敏
感なので、これをPMTに代替することが出来る。キセノ
ンのアークランプは水銀アークランプの出力の僅か1/8
の出力しかないので、キセノンランプの使用は最適では
ない。
ングステンランプまたはレーザーであっても良いだろう
が、しかし水銀アークランプはその強度が高いために適
している。入射光強度Ioが大きいほど、フローセル中を
通過するタンパクにそれが当たると、高角度の散乱光の
強度が高まる（この関係は、タンパクの溶液中での重量
濃度Ｃが大きいほど高まるのと同じである）。入射光の
ほんの一部だけが散乱され、入射光の強度が大きいと散
乱光強度も高まるので、ノイズに対する信号の強度比が
良好になる。さきに示唆した形式の水銀アークランプの
出力はほぼ20ミリワットであり、標準的なヘリューム・
ネオン（HeNe）レーザーの633nmの光の出力は２−３ミ
リワットである。HeNeレーザーの波長は、PMTが検出器7
4として用いられた場合に、最大の感度を示さない。し
かしながら、雪崩型の光ダイオードは、赤色の波長に敏
感なので、これをPMTに代替することが出来る。キセノ
ンのアークランプは水銀アークランプの出力の僅か1/8
の出力しかないので、キセノンランプの使用は最適では
ない。
さらに、両アーク光源共にレーザー光源よりは適して
いる。その理由はレーザー光には漣様ノイズがありそれ
が発光された光に０−30Hzの振動数で重なるからであ
る。液体クロマトグラフィーのサンプリングの速度が大
体この範囲にあるので、同じ周波の所では望ましくない
ノイズになる。
いる。その理由はレーザー光には漣様ノイズがありそれ
が発光された光に０−30Hzの振動数で重なるからであ
る。液体クロマトグラフィーのサンプリングの速度が大
体この範囲にあるので、同じ周波の所では望ましくない
ノイズになる。
光源72の発光した光は単一の振動数の光のみにするた
めにフィルターに通さなければならない。フィルター76
がこの機能を果たす。他の実施方法として、同調の可能
なフィルターで、例えば、モノクロメーターなどが使用
可能であるが、しかしこの種の装置は必要以上に高価で
大型である。青−緑色に最適化したPMTを検出器74に用
いるならば、青−緑領域で単一波長を得る高価でないフ
ィルターが適している。
めにフィルターに通さなければならない。フィルター76
がこの機能を果たす。他の実施方法として、同調の可能
なフィルターで、例えば、モノクロメーターなどが使用
可能であるが、しかしこの種の装置は必要以上に高価で
大型である。青−緑色に最適化したPMTを検出器74に用
いるならば、青−緑領域で単一波長を得る高価でないフ
ィルターが適している。
濾光された光は次いで光学装置78によってフローセル
の入射窓80に焦点を結ぶ。一般に入射窓は方形をしてい
て、黒いガラスまたは黒いコーチングされたガラスに取
り囲まれている。図６はフローセルの入射窓の立面図で
ある。入射窓80は少なくとも２面を黒いガラスまたは黒
にコーチングされたガラス82と84に取り囲まれている。
光学装置78アーク光の像を入射窓80境界部分に結像し、
散乱光を最少限度にする。
の入射窓80に焦点を結ぶ。一般に入射窓は方形をしてい
て、黒いガラスまたは黒いコーチングされたガラスに取
り囲まれている。図６はフローセルの入射窓の立面図で
ある。入射窓80は少なくとも２面を黒いガラスまたは黒
にコーチングされたガラス82と84に取り囲まれている。
光学装置78アーク光の像を入射窓80境界部分に結像し、
散乱光を最少限度にする。
測定対象のタンパク類か粒子85は、導管66からフロー
セルに入り散乱部位86を通過する、散乱部位は入射窓80
から入った入射光Ioに曝される。
セルに入り散乱部位86を通過する、散乱部位は入射窓80
から入った入射光Ioに曝される。
通常、光源からの入射光のごく僅かなものもPMT74に
入らないように、そして散乱部位にあるタンパク類85か
らの散乱光を保護するために、大きな注意を払わなけれ
ばならない。このことは、バッフリングと注意深く調整
された光学経路（図示していない）あるいは光ファイバ
ー経路（全ては通常蛍光検出機に用いられる構造であ
る）が散乱を避けるために必要であることを意味する。
フローセルの黒色のガラスの部分は空気とガラス、ガラ
スと液体の界面で散乱された光が内部に反射し、フロー
セルを出て通常の方向にあるPMT74の方向に進み、バッ
クグラウンドノイズ（被測定物質外の影響）になること
を防止するために役立つ。フローセルの黒色ガラスの部
分は図５と６で斜線を施した部分として示されている。
散乱を防止するために、光源72から入射窓80迄と、散乱
光の出口窓90からPMT74迄の光路に、光ファイバーによ
る導光が行われ得る。光ファイバーの光路を入射及び出
口窓に固定するための方法には屈折率が同じに調節され
たセメントを用いて行うが、こうして光ファイバーの屈
折率とフローセルのガラスの屈折率が異なることによる
光の屈折や及び／または散乱を最少化する。
入らないように、そして散乱部位にあるタンパク類85か
らの散乱光を保護するために、大きな注意を払わなけれ
ばならない。このことは、バッフリングと注意深く調整
された光学経路（図示していない）あるいは光ファイバ
ー経路（全ては通常蛍光検出機に用いられる構造であ
る）が散乱を避けるために必要であることを意味する。
フローセルの黒色のガラスの部分は空気とガラス、ガラ
スと液体の界面で散乱された光が内部に反射し、フロー
セルを出て通常の方向にあるPMT74の方向に進み、バッ
クグラウンドノイズ（被測定物質外の影響）になること
を防止するために役立つ。フローセルの黒色ガラスの部
分は図５と６で斜線を施した部分として示されている。
散乱を防止するために、光源72から入射窓80迄と、散乱
光の出口窓90からPMT74迄の光路に、光ファイバーによ
る導光が行われ得る。光ファイバーの光路を入射及び出
口窓に固定するための方法には屈折率が同じに調節され
たセメントを用いて行うが、こうして光ファイバーの屈
折率とフローセルのガラスの屈折率が異なることによる
光の屈折や及び／または散乱を最少化する。
散乱物であるタンパク類85はそれらの分子量に基ずい
て入射光Ioを散乱する（標準的なレーリー散乱）。この
光の一部は高角度に散乱されて出口窓90から散乱光Isと
して出て来る。この光はPMT74によって検出され、その
強度に比例する出力信号が94のラインに出される。加え
て、散乱光検出器70は入射光の強度Ioに比例した信号を
ライン96に発信する。ある具体例では単にIs/Ioに等し
い信号のみを発信する。入射光の強度Ioは、それが入射
窓に入ったことが“解る”ように、光学的に連結された
検出器（図示していない）によって測定することが好ま
しい。このためにはビームスプリッター（光束分割器）
（図示していない）を用いて、フィルターと入射窓の間
の光路で入射光の一部を割いてIo検出器（これも図示し
ていない）に導くか、または他の種々の方法が有り得
る。Ioの強度は光源からの光がフィルターから出た後で
測定する方がよい。と言うのはIoは散乱物に達する真の
入射光強度だけであって、光源から出る全ての波長の光
の強度であってはならないからである。他の具体例とし
て、PMTの冷却するものや、光子を計測するタイプのも
のであっても良い。
て入射光Ioを散乱する（標準的なレーリー散乱）。この
光の一部は高角度に散乱されて出口窓90から散乱光Isと
して出て来る。この光はPMT74によって検出され、その
強度に比例する出力信号が94のラインに出される。加え
て、散乱光検出器70は入射光の強度Ioに比例した信号を
ライン96に発信する。ある具体例では単にIs/Ioに等し
い信号のみを発信する。入射光の強度Ioは、それが入射
窓に入ったことが“解る”ように、光学的に連結された
検出器（図示していない）によって測定することが好ま
しい。このためにはビームスプリッター（光束分割器）
（図示していない）を用いて、フィルターと入射窓の間
の光路で入射光の一部を割いてIo検出器（これも図示し
ていない）に導くか、または他の種々の方法が有り得
る。Ioの強度は光源からの光がフィルターから出た後で
測定する方がよい。と言うのはIoは散乱物に達する真の
入射光強度だけであって、光源から出る全ての波長の光
の強度であってはならないからである。他の具体例とし
て、PMTの冷却するものや、光子を計測するタイプのも
のであっても良い。
ライン94の散乱光強度Isの信号とライン96の入射光強
度Ioの信号はアナログ−デジタル変換器98と100によっ
てデジタル信号に変換される。
度Ioの信号はアナログ−デジタル変換器98と100によっ
てデジタル信号に変換される。
そこでCPU64は、ライン102の重量濃度データをライン
104と106のIoとIsのデータと相関させて、散乱物の分子
量を計算する。この相関関係またはデータの適合は、散
乱物がUV検出器58中のフローセルからフローセル68に移
動するための時間的遅れを計算に入れて行われる。一
旦、データが適切に相関させられると、前記（３）式を
用いて散乱物の平均分子量が計算される。
104と106のIoとIsのデータと相関させて、散乱物の分子
量を計算する。この相関関係またはデータの適合は、散
乱物がUV検出器58中のフローセルからフローセル68に移
動するための時間的遅れを計算に入れて行われる。一
旦、データが適切に相関させられると、前記（３）式を
用いて散乱物の平均分子量が計算される。
式（３）は前記の式（１）を簡略化したもので、次に
よって導かれる。
よって導かれる。
サンプルを照らすために用いられる光の強度Io、散乱
部位の経路の長さ１、サンプル内を透過して来る光の量
Itの間には次の関係がある。
部位の経路の長さ１、サンプル内を透過して来る光の量
Itの間には次の関係がある。
（３） It＝Ioe-(εc+γ)1 ここで、 εは、吸光係数、 ｃは、サンプルの濃度、 γは、サンプルの濁度で、これは溶液の光散乱能の指標
であり、 １は、散乱部位の経路の長さ である。
であり、 １は、散乱部位の経路の長さ である。
光の吸収が無いと、ε＝０で、式（３）は次のように
なる。
なる。
（４） It＝Ioe-γ１ エネルギー保存則によって、 （５） It＝Io−Is この式の意味は、溶液の中を通過した透過光の強度
は、入射光の強度から散乱光の強度を減じたものに等し
いということである。
は、入射光の強度から散乱光の強度を減じたものに等し
いということである。
散乱された光の強度Isは、入射光の強度に比べて相対
的に極めて小さいので、（５）と（６）を結合させて、
指数関数をテイラー級数に展開し最初の２項だけを残す
と、次式が得られる。
的に極めて小さいので、（５）と（６）を結合させて、
指数関数をテイラー級数に展開し最初の２項だけを残す
と、次式が得られる。
（６） Is/Io＝γ１ Is,Ioを測定し、（６）式を用いてサンプルの濁度を測
定することが出来る。この方法は濁度測定（Turbidimet
ric）と呼ばれている。もし、散乱光強度が測定され式
（７）が用いられれば、それは比濁測定（Nephelometri
c）と呼ばれている。濁度測定では、２つの（ItとI
oの）大きな数字の間の差を求める必要がある。比濁測
定では、Ioは大きく、Isは量的に少ないが、しかし小さ
なバックグラウンド（被測定物質外の影響）に対して測
定することが出来る。比濁測定は、従って、通常は２種
の測定法の中でより高感度で、正確であり、有用であ
る。両者の測定方法とも標準的な光散乱の方法論の変法
である。
定することが出来る。この方法は濁度測定（Turbidimet
ric）と呼ばれている。もし、散乱光強度が測定され式
（７）が用いられれば、それは比濁測定（Nephelometri
c）と呼ばれている。濁度測定では、２つの（ItとI
oの）大きな数字の間の差を求める必要がある。比濁測
定では、Ioは大きく、Isは量的に少ないが、しかし小さ
なバックグラウンド（被測定物質外の影響）に対して測
定することが出来る。比濁測定は、従って、通常は２種
の測定法の中でより高感度で、正確であり、有用であ
る。両者の測定方法とも標準的な光散乱の方法論の変法
である。
一般的に散乱強度光は全ての角度で測られるわけでは
ない。むしろ、ある一定の角度θに散乱された光の量を
入射光Ioに対する相対量で測定される。Isとｉθには次
の関係がある （７） Is＝Σis θ 全角度 式（８）を使って式（７）を書き換えると ここで、 γθは、角度θにおける散乱光に対応する部分濁度であ
る。
ない。むしろ、ある一定の角度θに散乱された光の量を
入射光Ioに対する相対量で測定される。Isとｉθには次
の関係がある （７） Is＝Σis θ 全角度 式（８）を使って式（７）を書き換えると ここで、 γθは、角度θにおける散乱光に対応する部分濁度であ
る。
光吸収に関するビアーの法則との類似で、次式が得ら
れる。
れる。
ここで、 ｃは、重量濃度 γθ spは、比濁度、或は特異的レーリー常数と称され
る。
る。
比濁度は相互作用の断面である（ある種の相互作用の
生ずる確立）。本発明を実施するには、他の如何なる角
度をも用いることが出来るにかかわらず、散乱光強度は
90゜で測定される。この角度における比濁度はγspで記
される。
生ずる確立）。本発明を実施するには、他の如何なる角
度をも用いることが出来るにかかわらず、散乱光強度は
90゜で測定される。この角度における比濁度はγspで記
される。
比濁度は、入射光との関連において、粒子の分子的な
性質と関連させることが出来る。
性質と関連させることが出来る。
ここで、各記号の意味は前述の式（１）で述べたが、比
濁度γθ spはR/C（レーリー散乱を重量濃度で除したも
の）に比例的である。
濁度γθ spはR/C（レーリー散乱を重量濃度で除したも
の）に比例的である。
もし比濁度γθ spが測定され既知であると、式（11）
を用いて、Mw、即ち散乱物の重量平均分子量を導くこと
が出来る。散乱物の該重量平均分子量Mwは、次のように
定義ずけられる。
を用いて、Mw、即ち散乱物の重量平均分子量を導くこと
が出来る。散乱物の該重量平均分子量Mwは、次のように
定義ずけられる。
ここで、 Ciは、ｉ番目の溶液成分の重量濃度、 Miは、溶液のｉ成分の量 重量濃度は、全濃度niの和に等しいから、分子量は 式（12）と（13）はMwが、溶液のより重い成分に対し
てより重みを持って測られる事を示しているので、γθ
spもまたより重量の大きい粒子によって大きく影響され
る。
てより重みを持って測られる事を示しているので、γθ
spもまたより重量の大きい粒子によって大きく影響され
る。
式（12）における光学的常数Ｋは ここで、 ｎは、その中に散乱物が分散している溶液の屈折率、 dn/dcは、溶液の濃度の変化によって起こる屈折率の変
化、 Nsは、アボガドロ数、 λ．は、入射光の波長である。
化、 Nsは、アボガドロ数、 λ．は、入射光の波長である。
Ｋがλ．の４乗に依存する関係は、粒子の大きさが
λ./4以下の時にのみ成り立つ。大型の粒子に対して
は、波長への依存性は散乱粒子の大きさの複雑な関数に
なるが、しかし、一般に散乱物が大きいほど強度依存性
が小さくなる。
λ./4以下の時にのみ成り立つ。大型の粒子に対して
は、波長への依存性は散乱粒子の大きさの複雑な関数に
なるが、しかし、一般に散乱物が大きいほど強度依存性
が小さくなる。
Ｐ（θ）はサイズパラメーターで、これは従来技術の
研究者を悩ませてきた。その大きさがλ./4以下の小型
の粒子に対しては ここで、 R9は、散乱物の回転半径でこれは一般に大きさに支配さ
れる。
研究者を悩ませてきた。その大きさがλ./4以下の小型
の粒子に対しては ここで、 R9は、散乱物の回転半径でこれは一般に大きさに支配さ
れる。
もしいくつかの散乱角におけるγθ spと（15）式が使
えれば、ほぼ球形の粒子は： ここで、 Ｒは、球の半径で、これは普通、水和した散乱物或は散
乱物のストークス半径と近似させられる。
えれば、ほぼ球形の粒子は： ここで、 Ｒは、球の半径で、これは普通、水和した散乱物或は散
乱物のストークス半径と近似させられる。
散乱角度が小さいほど、散乱物の大きさに対するＰ
（θ）の依存性は弱くなる。そこで、θが小さいとsin
θ/2はゼロに近いので、LAL検出器のような低角度フォ
トメーターは、粒子サイズについて強い濁度の依存性を
示さない。
（θ）の依存性は弱くなる。そこで、θが小さいとsin
θ/2はゼロに近いので、LAL検出器のような低角度フォ
トメーターは、粒子サイズについて強い濁度の依存性を
示さない。
しかしながら重量な事には、散乱角θの大きさに関わ
らず、Ｐ（θ）は半径がλ./20以下の散乱物に対しては
ほぼ１に等しい。可視光線（488nm）の波長λ./20以下
の半径を持つタンパクは約20×166ダルトンの質量を持
つ（１ダルトンは物質の１グラム分子量に等しい）。一
般的に生物学的に重要なタンパクの中で最大のものは、
I9Μで、１×106ダルトンの分子量を持つ。この大きさ
以上のタンパク類は、臨床的にも、治療や診断のために
も用いられない。従って、生物学的に重要な全てのタン
パク類に対して、Ｐ（θ）は全ての散乱角についてほぼ
１である（これらのタンパク類の大きさでは回転半径R9
は極めて小さい故に）。
らず、Ｐ（θ）は半径がλ./20以下の散乱物に対しては
ほぼ１に等しい。可視光線（488nm）の波長λ./20以下
の半径を持つタンパクは約20×166ダルトンの質量を持
つ（１ダルトンは物質の１グラム分子量に等しい）。一
般的に生物学的に重要なタンパクの中で最大のものは、
I9Μで、１×106ダルトンの分子量を持つ。この大きさ
以上のタンパク類は、臨床的にも、治療や診断のために
も用いられない。従って、生物学的に重要な全てのタン
パク類に対して、Ｐ（θ）は全ての散乱角についてほぼ
１である（これらのタンパク類の大きさでは回転半径R9
は極めて小さい故に）。
もし大型の粒子に対する高角度の散乱光の検出を行お
うとするならば、ある種の形状の粒子に関して知られて
いるＭWとRgの間の関係によってＰ（θ）-1の近似を用
いることが出来る。例えば、ランダムコイル高分子につ
いては次式がある。
うとするならば、ある種の形状の粒子に関して知られて
いるＭWとRgの間の関係によってＰ（θ）-1の近似を用
いることが出来る。例えば、ランダムコイル高分子につ
いては次式がある。
（16） MwはdR9 2に比例する ここで、 ｄは、ランダムコイル高分子についての諸表を含むハン
ドブックから得られる濃度ファクターである。
ドブックから得られる濃度ファクターである。
この様にして、もしランダムコイル高分子のみがフロ
ーセル中の高分子であることが解っているならば、式
（15）のR9 2をMw/dで代替し、書き換えられた式（15）
を式（11）中でＰ（θ）-1に代替して、Mwをレーリー散
乱係数Ｒ或いはγθ spに関連させる２次方程式を得る。
ーセル中の高分子であることが解っているならば、式
（15）のR9 2をMw/dで代替し、書き換えられた式（15）
を式（11）中でＰ（θ）-1に代替して、Mwをレーリー散
乱係数Ｒ或いはγθ spに関連させる２次方程式を得る。
球形のタンパク類に対しては、 （17） MwはdR9 3に比例する。
この場合、 は、式（11）に代入して解析的に解くことが出来る。
さらに、ある場合には式（11）の中にビリアル係数を
含んでいくつかの項を保持することが好ましいだろう。
これらは、濃度Ｃに対して注意深くIsを測り、またA2C
などによって生ずる小さい変異を探すことで、測定する
ことが出来る。しかし大部分の場合これは不必要であ
る。
含んでいくつかの項を保持することが好ましいだろう。
これらは、濃度Ｃに対して注意深くIsを測り、またA2C
などによって生ずる小さい変異を探すことで、測定する
ことが出来る。しかし大部分の場合これは不必要であ
る。
前記の式（11）は、粒子間の相互作用の強さを反映す
る係数を有する重量濃度のべき級数である。最初の項の
係数、A2は第２ビリアル係数として知られており、散乱
物の量に比例し、その中には他の粒子は含まれない、即
ち専有的な量である。強い溶液に対してはA2は小さく正
符号である。溶液の強度が弱まると、A2は減少しゼロに
なり、次いで粒子の相互関係が起こり始めると、即ち凝
集が始まると、負の数字になる。生理学的な緩衝液中
（即ち、10mm以上の塩濃度で、pHがほぼ７である）の大
部分のタンパクについては、A2はほぼ０で僅かに負であ
る。さらに、多くのタンパクの溶解度は比較的低いの
で、クロマトグラフィーの間により高次の項が顕著にな
るような濃度は現れない。この種の粒子またはプロロイ
キンIL−２（タンパクと界面活性剤の混合物）の様なタ
ンパクでは、式（11）の最初の項を含めておく必要があ
る。しかし、ほとんどの生物学的タンパクに対しては、
式（11）は次のように簡略化される。
る係数を有する重量濃度のべき級数である。最初の項の
係数、A2は第２ビリアル係数として知られており、散乱
物の量に比例し、その中には他の粒子は含まれない、即
ち専有的な量である。強い溶液に対してはA2は小さく正
符号である。溶液の強度が弱まると、A2は減少しゼロに
なり、次いで粒子の相互関係が起こり始めると、即ち凝
集が始まると、負の数字になる。生理学的な緩衝液中
（即ち、10mm以上の塩濃度で、pHがほぼ７である）の大
部分のタンパクについては、A2はほぼ０で僅かに負であ
る。さらに、多くのタンパクの溶解度は比較的低いの
で、クロマトグラフィーの間により高次の項が顕著にな
るような濃度は現れない。この種の粒子またはプロロイ
キンIL−２（タンパクと界面活性剤の混合物）の様なタ
ンパクでは、式（11）の最初の項を含めておく必要があ
る。しかし、ほとんどの生物学的タンパクに対しては、
式（11）は次のように簡略化される。
（19）γθ sp＝KMw 式（10）をγθ spについて置換して、式（19）は前記
式（２）の形に書き換えられるが、式（２）はCPU64に
よって散乱物の重量平均分子量を計算するために用いら
れる。
式（２）の形に書き換えられるが、式（２）はCPU64に
よって散乱物の重量平均分子量を計算するために用いら
れる。
Ｂの値は本発明の実行の仕方によっていちいち異なる
が、トルエンの濁度は既知であるので、トルエンを用い
た比較法で較正し、簡単に測定することが出来る。
が、トルエンの濁度は既知であるので、トルエンを用い
た比較法で較正し、簡単に測定することが出来る。
式（３）を計算する事の出来る全ての回路や装置は本
発明の実施を満足するだろう。実際、本発明を広く解釈
すると、CPU64や他の計算用設備は無くてもよい。それ
は、分子量Mwは散乱光強度と濃度から簡単に手計算する
ことが出来るからである。
発明の実施を満足するだろう。実際、本発明を広く解釈
すると、CPU64や他の計算用設備は無くてもよい。それ
は、分子量Mwは散乱光強度と濃度から簡単に手計算する
ことが出来るからである。
図７には、フローセル68中の散乱物の平均分子量Mwを
計算するために、図５に示したCPU64を制御する一般的
なプログラムのフローチャートを示している。CPUの一
般的なプログラムの一つは散乱光強度と濃度Ｃの信号を
常にサンプリングしており、最も最近時のサンプルから
得られるもの、または移動するサンプルの平均としての
データから得られる平均分子量を計算し、結果を示す。
一般的に、分子量を計算するプログラムはサブルーチン
（プログラム中で繰り返し用いられる独立命令）であ
り、それは、内部時計が切れるまで主制御回路から常に
呼び出されているべきである。しかし、該プログラム
は、各サンプルが通過する時に作動する主要回路として
構成してもよい。
計算するために、図５に示したCPU64を制御する一般的
なプログラムのフローチャートを示している。CPUの一
般的なプログラムの一つは散乱光強度と濃度Ｃの信号を
常にサンプリングしており、最も最近時のサンプルから
得られるもの、または移動するサンプルの平均としての
データから得られる平均分子量を計算し、結果を示す。
一般的に、分子量を計算するプログラムはサブルーチン
（プログラム中で繰り返し用いられる独立命令）であ
り、それは、内部時計が切れるまで主制御回路から常に
呼び出されているべきである。しかし、該プログラム
は、各サンプルが通過する時に作動する主要回路として
構成してもよい。
サンプル周期はクロマトグラムデータを解くために必
要な解、即ち、１分間以上の間隔内に何個のピークが予
想されるか、またピーク当り何個のサンプルが必要かな
ど、によって決まる。それはまた、メモリーの量及び／
またはCPUがデータ保存のために用いることが出来るハ
ードディスクの保存容量によって決まる。
要な解、即ち、１分間以上の間隔内に何個のピークが予
想されるか、またピーク当り何個のサンプルが必要かな
ど、によって決まる。それはまた、メモリーの量及び／
またはCPUがデータ保存のために用いることが出来るハ
ードディスクの保存容量によって決まる。
プロセスの最初の段階はブロック130に表記される。
この段階では、CPUはA/D変換器62を作動させて、ライン
60のアナログ信号（重量濃度Ｃの信号）をライン102の
デジタル信号に変換し、このデータは保存される。
この段階では、CPUはA/D変換器62を作動させて、ライン
60のアナログ信号（重量濃度Ｃの信号）をライン102の
デジタル信号に変換し、このデータは保存される。
次いで、132の段階では、該A/Dの98と100が作動さ
れ、入射光Ioと散乱光Isのアナログ信号のデジタル信号
への変換が行われ、このデータは保存される。
れ、入射光Ioと散乱光Isのアナログ信号のデジタル信号
への変換が行われ、このデータは保存される。
134の段階は、散乱光Isの強度を入射光Ioの強度に対
して標準化するプロセスを表す。このプロセスは本体Is
とIoを分け、Isに対してノイズとして翻訳されてしまう
Ioの強度の変動によるノイズを消去するためのものであ
る。
して標準化するプロセスを表す。このプロセスは本体Is
とIoを分け、Isに対してノイズとして翻訳されてしまう
Ioの強度の変動によるノイズを消去するためのものであ
る。
136の段階は、ＢおよびＣの結果でIsを分離し式
（３）を用いて、散乱物の平均分子量を計算するプロセ
スを表す。
（３）を用いて、散乱物の平均分子量を計算するプロセ
スを表す。
138の段階は、136の段階で計算された結果が出され、
表示のために用いられるし、また判断装置などを検索す
るために用いられる。
表示のために用いられるし、また判断装置などを検索す
るために用いられる。
140の判断段階とその２つの分岐では、サンプリング
の比率を調節するプロセスを示している。
の比率を調節するプロセスを示している。
図８を説明すると、そこに既知の分子量に対する散乱
光の強度が図示されており、このものは特定の光学装置
においてＢの値を実験的に定めるために有益である。Ｂ
を定めるには、生物学的タンパクか他の微粒子であって
平均分子量が既知であるものを特定の濃度でフローセル
内を通過させる。散乱光の強度を各々のタンパクに対し
て求め、次いでIs/cとして既知の分子量のレベルの所に
プロットする。この関係は図８において平均分子量が既
知の２つのタンパク、IgGとIgMについて行われている。
この結果による直線関係から特定の光学系のＢの値が一
義的に求められる。
光の強度が図示されており、このものは特定の光学装置
においてＢの値を実験的に定めるために有益である。Ｂ
を定めるには、生物学的タンパクか他の微粒子であって
平均分子量が既知であるものを特定の濃度でフローセル
内を通過させる。散乱光の強度を各々のタンパクに対し
て求め、次いでIs/cとして既知の分子量のレベルの所に
プロットする。この関係は図８において平均分子量が既
知の２つのタンパク、IgGとIgMについて行われている。
この結果による直線関係から特定の光学系のＢの値が一
義的に求められる。
図６のフローセルは一般に10μｌの体積と10mmの経路
長をもち、例えば、BK7の様な高価でないガラス製でよ
い。通常は、蛍光計に用いられるような高価な水晶製の
フローセルは必要が無い。蛍光計では200−280nmの様な
短波長の光を蛍光の発光のために必要とするから、水晶
を使う必要がある。BK7のタイプのガラスは普通、320nm
以下の波長の光を遮断するので、蛍光検出器には用いる
事が出来ない。
長をもち、例えば、BK7の様な高価でないガラス製でよ
い。通常は、蛍光計に用いられるような高価な水晶製の
フローセルは必要が無い。蛍光計では200−280nmの様な
短波長の光を蛍光の発光のために必要とするから、水晶
を使う必要がある。BK7のタイプのガラスは普通、320nm
以下の波長の光を遮断するので、蛍光検出器には用いる
事が出来ない。
フローセルの入射窓と出口窓の表面を屈折率が類似す
るMgF2か、反射防止用の多重層誘電のコーチングを施す
と、有意に、信号量を増加させバックグラウンドや不用
の迷光を減らすことが出来る。空気とガラスの界面での
屈折率を合わせることによって、光の屈折を減らしそれ
が見かけの散乱光の原因になることを防ぐ。
るMgF2か、反射防止用の多重層誘電のコーチングを施す
と、有意に、信号量を増加させバックグラウンドや不用
の迷光を減らすことが出来る。空気とガラスの界面での
屈折率を合わせることによって、光の屈折を減らしそれ
が見かけの散乱光の原因になることを防ぐ。
最も望ましい応用は、フローセル68はいわゆる抱合せ
構造で、内部のガラス／水またはガラス／溶媒の界面に
反射防止コーチングを施したものである。この種のフロ
ーセルは、２枚の平たいガラスの板の片面を反射防止効
果のある化学物質を蒸着させたものによって作られる。
次いで２枚の板をシーリングスペーサーをそれらの間に
挟んで抱合せ既知の方法でセルに作り上げる。スペーサ
ーには入り口と出口の穴を開け、液体がセル内を通過す
る様にする。生体高分子のHPLCで通常用いられる溶媒
（例えば、水、アセトニトリル、メタノールなど）の大
部分は、ほぼ似通った屈折率を持つので、この屈折率を
合わせた材料の内部表面コーチングは、界面での光の散
乱による迷光を大幅に減らことが出来る。
構造で、内部のガラス／水またはガラス／溶媒の界面に
反射防止コーチングを施したものである。この種のフロ
ーセルは、２枚の平たいガラスの板の片面を反射防止効
果のある化学物質を蒸着させたものによって作られる。
次いで２枚の板をシーリングスペーサーをそれらの間に
挟んで抱合せ既知の方法でセルに作り上げる。スペーサ
ーには入り口と出口の穴を開け、液体がセル内を通過す
る様にする。生体高分子のHPLCで通常用いられる溶媒
（例えば、水、アセトニトリル、メタノールなど）の大
部分は、ほぼ似通った屈折率を持つので、この屈折率を
合わせた材料の内部表面コーチングは、界面での光の散
乱による迷光を大幅に減らことが出来る。
それが入射窓の境界面に結像するならば、できるだけ
大きいアーク光源72を用いる方がよい。これを行わない
と、迷光が増加し、そのためにバックグラウンドノイズ
が大きくなって、検出器の感度を弱めてしまう問題につ
ながる。
大きいアーク光源72を用いる方がよい。これを行わない
と、迷光が増加し、そのためにバックグラウンドノイズ
が大きくなって、検出器の感度を弱めてしまう問題につ
ながる。
好ましい具体例として、フィルター72（用いるなら
ば、フィルター142も）は水銀線形干渉フィルターにし
た方が、モノクロメーターを用いるより、構造がより安
価で小型になる。加えて、該フィルター76は144のダッ
シュで示す垂直方向の偏光装置を取り付け得る。単に垂
直方向の偏光のみが散乱し得る。水平方向の光はレーリ
ー散乱をしないので、フローセルに到達すると、迷光に
なってバックグラウンドノイズを増やす恐れがある。
ば、フィルター142も）は水銀線形干渉フィルターにし
た方が、モノクロメーターを用いるより、構造がより安
価で小型になる。加えて、該フィルター76は144のダッ
シュで示す垂直方向の偏光装置を取り付け得る。単に垂
直方向の偏光のみが散乱し得る。水平方向の光はレーリ
ー散乱をしないので、フローセルに到達すると、迷光に
なってバックグラウンドノイズを増やす恐れがある。
例えば、P.E.ネルソンによって作られた標準的なHPLC
データシステムが、式（３）の簡単な数学機能を入れて
改造できる。また別に、さらに機能を加えたり別型とし
て、複雑な式（11）を加えて改造し、その性質が予め知
られている大型の粒子に対して、データを集め保存し
て、重量平均分子量を計算させる事もできる。
データシステムが、式（３）の簡単な数学機能を入れて
改造できる。また別に、さらに機能を加えたり別型とし
て、複雑な式（11）を加えて改造し、その性質が予め知
られている大型の粒子に対して、データを集め保存し
て、重量平均分子量を計算させる事もできる。
フローセルは極端に小さい体積である事がピークの形
状を良好に保つために好ましい。LCカラムから非常に狭
いピークが溶出し、微細管を通ってフローセルに入る
と、フローセルの散乱部位の体積が大きい場合には、該
ピークは撹拌によって広がってしまう。散乱部位の体積
を小さく保つことで、この広がりの問題を極小化し得
る。
状を良好に保つために好ましい。LCカラムから非常に狭
いピークが溶出し、微細管を通ってフローセルに入る
と、フローセルの散乱部位の体積が大きい場合には、該
ピークは撹拌によって広がってしまう。散乱部位の体積
を小さく保つことで、この広がりの問題を極小化し得
る。
図５の構造に示される機械類のいくつかの具体例とし
て、散乱光の光路に第２のフィルターを用いる。これら
の具体例は出口窓90とPMT74の間の光路にダッシュで書
かれたフィルター142で表される。このフィルターはフ
ィルター76と同じ波長に同調させられ波長の異なる他の
光が迷光になってPMTに入るのを防止する。蛍光計で
は、フィルター76は励起用の光の波長に合わされ、フィ
ルター142は、発光された蛍光の異なった波長に合わさ
れている点で、異なっている。新型の蛍光計では両方の
フィルターが、同一波長に同調しないようになっている
ものもある。
て、散乱光の光路に第２のフィルターを用いる。これら
の具体例は出口窓90とPMT74の間の光路にダッシュで書
かれたフィルター142で表される。このフィルターはフ
ィルター76と同じ波長に同調させられ波長の異なる他の
光が迷光になってPMTに入るのを防止する。蛍光計で
は、フィルター76は励起用の光の波長に合わされ、フィ
ルター142は、発光された蛍光の異なった波長に合わさ
れている点で、異なっている。新型の蛍光計では両方の
フィルターが、同一波長に同調しないようになっている
ものもある。
迷光をさらに減少させるために、ここに開示する実行
法に集積空間フィルターの使用がある。
法に集積空間フィルターの使用がある。
図９に、本発明の知見による他の高角度散乱光検出器
の具体例を示す。図９の例は、重量濃度と散乱光強度の
検出器が同一のフローセルを共用することが出来る。ポ
ンプ54、サンプル保持器56、LCカラム52、光源72、PMT7
4、光学装置78、CPU64とA/D変換器98,100,62は全て、図
５の具体例で示したものと同様に作動し、機能的に同等
な働きのある代替物である。
の具体例を示す。図９の例は、重量濃度と散乱光強度の
検出器が同一のフローセルを共用することが出来る。ポ
ンプ54、サンプル保持器56、LCカラム52、光源72、PMT7
4、光学装置78、CPU64とA/D変換器98,100,62は全て、図
５の具体例で示したものと同様に作動し、機能的に同等
な働きのある代替物である。
図９の実例は式（４）の理論の応用と、モノクロメー
ターの同調する性質を利用するために便利である。一般
的に重量濃度は短波長の、例えば、280nm付近の、UVの
吸光測定によって測定される。他方、散乱光の測定は通
常、UV吸光の測定波長のほぼ２倍の長さの波長によって
行なわれる。この事で、光散乱PMTは、その最も鋭敏な
領域（波長560nm付近）で作動する。これらの２つの波
長は、モノクロメーター150を入射光のフィルターとし
て用いて、560nmの光を通過するように同調させる事に
よって、同一の光源72から得ることが出来る。280nmは5
60nmの第２の同調波長であり、この波長の光は同じくモ
ノクロメーターを通過するからである。追加として偏光
装置152を取り付けて、波長が560nmと280nmの垂直振動
光以外の光を除く。この光は、光学装置78によってビー
ムスプリッター153を通過し、フローセル156の入射窓15
4に焦点を結ぶ。該ビームスプリッターは入射光の一部
をPMT157に導き、PMTはフローセルに入射する光の強度I
oの測定器として作用する。
ターの同調する性質を利用するために便利である。一般
的に重量濃度は短波長の、例えば、280nm付近の、UVの
吸光測定によって測定される。他方、散乱光の測定は通
常、UV吸光の測定波長のほぼ２倍の長さの波長によって
行なわれる。この事で、光散乱PMTは、その最も鋭敏な
領域（波長560nm付近）で作動する。これらの２つの波
長は、モノクロメーター150を入射光のフィルターとし
て用いて、560nmの光を通過するように同調させる事に
よって、同一の光源72から得ることが出来る。280nmは5
60nmの第２の同調波長であり、この波長の光は同じくモ
ノクロメーターを通過するからである。追加として偏光
装置152を取り付けて、波長が560nmと280nmの垂直振動
光以外の光を除く。この光は、光学装置78によってビー
ムスプリッター153を通過し、フローセル156の入射窓15
4に焦点を結ぶ。該ビームスプリッターは入射光の一部
をPMT157に導き、PMTはフローセルに入射する光の強度I
oの測定器として作用する。
このフローセル156は普通フローセル68と同一の構造
と機能を有するが、出口窓が後者の１個に対して２個あ
る点で異なる。第２の出口窓158は、フローセル内の散
乱部位の粒子によって散乱されない光が第２の出口窓15
8を通過する位置に開けられている。この散乱されてい
ない光は、以後、透過光Itとして表す。
と機能を有するが、出口窓が後者の１個に対して２個あ
る点で異なる。第２の出口窓158は、フローセル内の散
乱部位の粒子によって散乱されない光が第２の出口窓15
8を通過する位置に開けられている。この散乱されてい
ない光は、以後、透過光Itとして表す。
透過光Itは、通常の干渉フィルターまたは他の高価で
ないフィルターによって、散乱物によって吸収されない
280nmの光だけを残す。濾光された光の強度はPMT162に
よって検知され、A/D変換器62によってデジタル信号に
変換される。そこでCPU64は、散乱物の重量濃度を式
（４）を用いて計算する。この仕事は図７に示した構成
に極めて類似するソフトウェアーの制御によってなされ
るが、前者との相違は、こちらは透過光の強度Itと入射
光の強度Ioに関するデータを集め保存する段階、次いで
式（４）と吸光係数と経路の長さについて保存された常
数を用いて、重量濃度Ｃを計算する段階を含む点であ
る。この様に計算された重量濃度は保存され、図７に示
すプロセスと同様にして、平均分子量Mwを計算するのに
用いられる。
ないフィルターによって、散乱物によって吸収されない
280nmの光だけを残す。濾光された光の強度はPMT162に
よって検知され、A/D変換器62によってデジタル信号に
変換される。そこでCPU64は、散乱物の重量濃度を式
（４）を用いて計算する。この仕事は図７に示した構成
に極めて類似するソフトウェアーの制御によってなされ
るが、前者との相違は、こちらは透過光の強度Itと入射
光の強度Ioに関するデータを集め保存する段階、次いで
式（４）と吸光係数と経路の長さについて保存された常
数を用いて、重量濃度Ｃを計算する段階を含む点であ
る。この様に計算された重量濃度は保存され、図７に示
すプロセスと同様にして、平均分子量Mwを計算するのに
用いられる。
90゜またはその近辺の高角度で散乱された光は出口窓
164を出てフィルター166で濾光される。フィルター166
は560nmの波長以外の全ての波長の光を除く。次いで、
濾光された光はPMT74によって検知され、得られた出力
信号はA/D変換器100によってデジタルデータに変換され
る。
164を出てフィルター166で濾光される。フィルター166
は560nmの波長以外の全ての波長の光を除く。次いで、
濾光された光はPMT74によって検知され、得られた出力
信号はA/D変換器100によってデジタルデータに変換され
る。
A/D変換器98は入射光の一部分を変換し、Ioの強度デ
ータをCPU64に伝える。CPUはそのデータを用いて、透過
光の強度Itと散乱光の強度Isのデータを標準化する。
ータをCPU64に伝える。CPUはそのデータを用いて、透過
光の強度Itと散乱光の強度Isのデータを標準化する。
通常、式（４）はテイラー級数に展開し、その第１項
または第２項までについて重量濃度を計算することで単
純化することが出来るが、これは散乱光についての指数
係数の場合と同じである。他の具体例として、（４）式
の指令は、It,Ioと自然対数表を用いて評価することが
出来る。同じ事が平均分子量を散乱光強度に関連ずける
指数関数でも行える。
または第２項までについて重量濃度を計算することで単
純化することが出来るが、これは散乱光についての指数
係数の場合と同じである。他の具体例として、（４）式
の指令は、It,Ioと自然対数表を用いて評価することが
出来る。同じ事が平均分子量を散乱光強度に関連ずける
指数関数でも行える。
式（３）の指数式の吸光係数εは、関心をもたれてい
る全ての生物学的タンパクに対してかなり小さいので、
無視することが出来る。
る全ての生物学的タンパクに対してかなり小さいので、
無視することが出来る。
図９の具体例の利点は、それがフローセルを一つ省く
ことが出来、そしてCPU64にとって、別のフローセルか
ら得られる散乱光のデータの発生時期の前か後で、重量
濃度用のフローセルからのデータを適合させる必要が無
くなる事である。図５に示される様な実行方法の２個の
フローセルでは、同一の粒子から発生するＣとIsのデー
タが異なった時間に出現する。それはUV検出器58のフロ
ーセルを通過した粒子がフローセル64に到達するまでに
時間差があるからである。この事はコンピューター64
に、同一粒子からのＣのデータとIsのデータを、両者の
発生時間が異なるに関わらず、適合させる異を要求す
る。この関連ずけのプロセスは図７の136の段階に含ま
れている。
ことが出来、そしてCPU64にとって、別のフローセルか
ら得られる散乱光のデータの発生時期の前か後で、重量
濃度用のフローセルからのデータを適合させる必要が無
くなる事である。図５に示される様な実行方法の２個の
フローセルでは、同一の粒子から発生するＣとIsのデー
タが異なった時間に出現する。それはUV検出器58のフロ
ーセルを通過した粒子がフローセル64に到達するまでに
時間差があるからである。この事はコンピューター64
に、同一粒子からのＣのデータとIsのデータを、両者の
発生時間が異なるに関わらず、適合させる異を要求す
る。この関連ずけのプロセスは図７の136の段階に含ま
れている。
前記の透過光の強度Itを用いて重量濃度を見いだす方
法と装置は、もしLCカラムから出て来る粒子に対する吸
光係数が既知であれば作動し易い。吸光係数εは分子に
特有の性質で、その分子が重量当りでどれだけのUV光線
を吸収するかを示すもので、または粒子の形が全て一種
類であって、異なったタイプの形状をとっていないかを
示すものである。最も普通の場合でも、LCカラムから出
て来る粒子の種類と質量が未知であり、吸光係数を知る
ことが出来ない。この様な場合には、重量濃度のデータ
は既存の屈折率計を用いて導く必要がある。屈折率計
は、次の特許出願の技術によると、グラジエント溶媒構
成の場合でも用いることが出来る。それは、“安定した
ベースラインを持った基準流液体クロマトグラフィーシ
ステム”の表題で、出願番号07/463,701、出願日90.1.1
1（特許）である。これは出願番号07/456.021、出願日8
9.12.22（特許）を分割したものであり、さらにそれ
は、出願番号07/155,592、出願日88.2.12（放棄）の出
願特許の延長上のものであった。またこれらに対応する
全ての外国出願特許に記載の技術が用いられる。これら
を参考としてここに記す。
法と装置は、もしLCカラムから出て来る粒子に対する吸
光係数が既知であれば作動し易い。吸光係数εは分子に
特有の性質で、その分子が重量当りでどれだけのUV光線
を吸収するかを示すもので、または粒子の形が全て一種
類であって、異なったタイプの形状をとっていないかを
示すものである。最も普通の場合でも、LCカラムから出
て来る粒子の種類と質量が未知であり、吸光係数を知る
ことが出来ない。この様な場合には、重量濃度のデータ
は既存の屈折率計を用いて導く必要がある。屈折率計
は、次の特許出願の技術によると、グラジエント溶媒構
成の場合でも用いることが出来る。それは、“安定した
ベースラインを持った基準流液体クロマトグラフィーシ
ステム”の表題で、出願番号07/463,701、出願日90.1.1
1（特許）である。これは出願番号07/456.021、出願日8
9.12.22（特許）を分割したものであり、さらにそれ
は、出願番号07/155,592、出願日88.2.12（放棄）の出
願特許の延長上のものであった。またこれらに対応する
全ての外国出願特許に記載の技術が用いられる。これら
を参考としてここに記す。
全ての同一粒子がLCカラムから流出する場合で、しか
し、形状が異なり大きさも異なるので異なった時間に流
出する場合に、種々のピークについて相対重量濃度がUV
検出器や蛍光検出器によって、吸光係数が解らないまま
で、測定される。これは吸光係数が全ての大きさの異な
る粒子について同じなので、重量濃度は同一の関数、式
（４）（ここでεはどのピークについても同一）、によ
って透過光の強度に比例する。この情報は異なったピー
クについて相対平均分子量を求めるために用いられる
が、相対平均分子量はこの状態下でのクロマトグラムの
翻訳にとって分析上有用である。
し、形状が異なり大きさも異なるので異なった時間に流
出する場合に、種々のピークについて相対重量濃度がUV
検出器や蛍光検出器によって、吸光係数が解らないまま
で、測定される。これは吸光係数が全ての大きさの異な
る粒子について同じなので、重量濃度は同一の関数、式
（４）（ここでεはどのピークについても同一）、によ
って透過光の強度に比例する。この情報は異なったピー
クについて相対平均分子量を求めるために用いられる
が、相対平均分子量はこの状態下でのクロマトグラムの
翻訳にとって分析上有用である。
本発明による方法は、図5,9,10,11,12に示す具体的実
施を含む。
施を含む。
図10は本発明の他の具体例の一つで、この例では既知
の毛細管電気泳動構造を用いている。毛細管電気泳動
は、電荷を持ったタンパク類または他の分子が電位差の
存在下で毛細管に沿って移動する現象で、それらの持つ
電荷によって移動の距離が異なる。分子やタンパクでよ
り多く荷電されたものは、荷電の少ないものより、より
早く移動する。反対の電荷を持つ粒子は反対側に移動す
る。異なった速度と方角に移動する事によって毛細管の
長さの方向に分離が生じ、また毛細管のある位置への到
達時間が異なって来る。
の毛細管電気泳動構造を用いている。毛細管電気泳動
は、電荷を持ったタンパク類または他の分子が電位差の
存在下で毛細管に沿って移動する現象で、それらの持つ
電荷によって移動の距離が異なる。分子やタンパクでよ
り多く荷電されたものは、荷電の少ないものより、より
早く移動する。反対の電荷を持つ粒子は反対側に移動す
る。異なった速度と方角に移動する事によって毛細管の
長さの方向に分離が生じ、また毛細管のある位置への到
達時間が異なって来る。
図10の装置には第一の容器200と第二の容器202があ
り、その間に多数の毛細管を融合させて毛細管204があ
って開いた両端が浸されている。一般に該毛細管の穴は
内径が25−100μｍである。容器の双方200と202は低導
電率の水溶媒が入っている。試料はどの様な方法で毛細
管204中に入れられてもよく、普通は毛細管204の一端を
容器に浸すと、数マイクロリッターの試料が毛細管の末
端に入る。該毛細管に導電性の溶媒を既知の方法（特に
示さず）で満たす。電極208と210を有する電位差源206
を容器200と202に接続させ、直流電圧を容器200の溶媒
と容器202の溶媒の間に掛ける。
り、その間に多数の毛細管を融合させて毛細管204があ
って開いた両端が浸されている。一般に該毛細管の穴は
内径が25−100μｍである。容器の双方200と202は低導
電率の水溶媒が入っている。試料はどの様な方法で毛細
管204中に入れられてもよく、普通は毛細管204の一端を
容器に浸すと、数マイクロリッターの試料が毛細管の末
端に入る。該毛細管に導電性の溶媒を既知の方法（特に
示さず）で満たす。電極208と210を有する電位差源206
を容器200と202に接続させ、直流電圧を容器200の溶媒
と容器202の溶媒の間に掛ける。
容器200と202の間の電場は荷電された被分析物質（タ
ンパク類か他の分子類）は直ちに毛細管の穴に沿って異
なった速度で移動を開始する。好ましい実施方法は、前
に述べたタイプのフローセル212を毛細管に接続し、移
動するタンパクや他の分子の流れをフローセル212を通
過させる事である。
ンパク類か他の分子類）は直ちに毛細管の穴に沿って異
なった速度で移動を開始する。好ましい実施方法は、前
に述べたタイプのフローセル212を毛細管に接続し、移
動するタンパクや他の分子の流れをフローセル212を通
過させる事である。
該フローセル212は図９に示したタイプの装置と光学
的に連結されている。この散乱光検出器装置は（図10中
には示していない）前に述べたのと同様に作動して、タ
ンパクや他の分子がフローセル212を通って移動する時
にそれらの平均分子量を計算する。
的に連結されている。この散乱光検出器装置は（図10中
には示していない）前に述べたのと同様に作動して、タ
ンパクや他の分子がフローセル212を通って移動する時
にそれらの平均分子量を計算する。
この毛細管電気泳動分離装置の他の具体例は、第二の
フローセル214（破線で示す）を毛細管204に接続し、タ
ンパク類を該フローセル内を通過させるものである。フ
ローセル214は、図５における標準UV検出器58の一部分
であり、そしてフローセル212は光学的に図５に示した
散乱光検出器装置に接続されている（図10には図示して
いない）。この散乱光検出器の装置は前宛の通り機能す
る。フローセル212に接続した散乱光検出器装置で発生
され、標準掛された散乱光強度と、フローセル214に付
けられたUV検出器で発生された重量濃度のデータは、前
述の方法で平均分子量の計算に用いられる。
フローセル214（破線で示す）を毛細管204に接続し、タ
ンパク類を該フローセル内を通過させるものである。フ
ローセル214は、図５における標準UV検出器58の一部分
であり、そしてフローセル212は光学的に図５に示した
散乱光検出器装置に接続されている（図10には図示して
いない）。この散乱光検出器の装置は前宛の通り機能す
る。フローセル212に接続した散乱光検出器装置で発生
され、標準掛された散乱光強度と、フローセル214に付
けられたUV検出器で発生された重量濃度のデータは、前
述の方法で平均分子量の計算に用いられる。
流出する分子の平均分子量は、それら分子の電荷の量
によって決まる到達時間と連動させて、粒子の分析や同
等に利用される。この種の分離技術はこのタイプの散乱
光分析に好適である。その理由は、ごく少量な容量で、
被分析物が高濃度であるので散乱光の強度が高まり、カ
ラム上での（リアルタイムの）検出が、吸光度の測定と
高角度の散乱光測定配置の双方で容易に出来るからであ
る。
によって決まる到達時間と連動させて、粒子の分析や同
等に利用される。この種の分離技術はこのタイプの散乱
光分析に好適である。その理由は、ごく少量な容量で、
被分析物が高濃度であるので散乱光の強度が高まり、カ
ラム上での（リアルタイムの）検出が、吸光度の測定と
高角度の散乱光測定配置の双方で容易に出来るからであ
る。
透明な毛細管を用いるいくつかの具体例に、フローセ
ル類はこれを省き、入射光を直接毛細管上に照らすもの
がある。この方式は毛細管そのものからくる散乱でバッ
クグラウンドノイズが大きくなるが、それでも機能し得
る。
ル類はこれを省き、入射光を直接毛細管上に照らすもの
がある。この方式は毛細管そのものからくる散乱でバッ
クグラウンドノイズが大きくなるが、それでも機能し得
る。
図11には、他の“２対1"方式の装置の具体例を示す、
即ち、一つの光源と一つのフローセルを用いるものであ
る。この具体例では、光源250には、波長の範囲が少な
くとも200−300nmから400−600nmの広いバンドのスペク
トルを出すものが用いられる。発生した光252をモノク
ロメーター254で濾光して、UV吸収とレーリー散乱の測
定に適した波長の光のみを残す。これには280nmと560nm
が好適であるが、256の位置で、波長が200−214nmの間
にあるものと400−428の間にあるものも使うことが出来
る。部分的に銀メッキされた鏡が入射光の一部を反射し
て入射光測定のために検出器260に送る。この検出器はI
oの信号をCPU262に発信する。フローセル264は280と560
nmの光の大部分を透過してフィルター266に送る。この
フィルターは560nmの光を遮断し、PMT検出器は280nmの
光の強度を検出する。一定の高角度で散乱された光はフ
ィルター270で濾光され端に560nmの光のみが残って、PM
T272によって検出される。PMT272は散乱光の強度を表す
信号Isを発信し、PMT268は重量濃度を表す信号Ｃを発信
する。PCU274はこれらの３個の信号、Io,IsとＣを処理
して、前記と同様にして重量平均分子質量を計算する。
即ち、一つの光源と一つのフローセルを用いるものであ
る。この具体例では、光源250には、波長の範囲が少な
くとも200−300nmから400−600nmの広いバンドのスペク
トルを出すものが用いられる。発生した光252をモノク
ロメーター254で濾光して、UV吸収とレーリー散乱の測
定に適した波長の光のみを残す。これには280nmと560nm
が好適であるが、256の位置で、波長が200−214nmの間
にあるものと400−428の間にあるものも使うことが出来
る。部分的に銀メッキされた鏡が入射光の一部を反射し
て入射光測定のために検出器260に送る。この検出器はI
oの信号をCPU262に発信する。フローセル264は280と560
nmの光の大部分を透過してフィルター266に送る。この
フィルターは560nmの光を遮断し、PMT検出器は280nmの
光の強度を検出する。一定の高角度で散乱された光はフ
ィルター270で濾光され端に560nmの光のみが残って、PM
T272によって検出される。PMT272は散乱光の強度を表す
信号Isを発信し、PMT268は重量濃度を表す信号Ｃを発信
する。PCU274はこれらの３個の信号、Io,IsとＣを処理
して、前記と同様にして重量平均分子質量を計算する。
図12にはさらに複雑な“２対1"方式の具体例を示す。
この具体例では、単一の広域のバンドを有する光源280
が発光した光はビームスプリッター282で２個のビーム
に分けられる。第一のビームは一つ目のモノクロメータ
ーで濾光されて、単一波長のビーム286として出て来る
が、この光はフローセル288中の被散乱物によってUV吸
収を起こすのに好適な波長を持つ。第二のビーム290は
鏡292によって反射され第二のモノクロメーター294に入
る。第二のモノクロメーター294は散乱に好適な波長の
光のみを残して他の全ての波長の光を濾光する。一般的
にこの波長は青−緑色のスペクトルの範囲内にあって、
光源280と散乱光検出器296の間の関連特性を示すカーブ
で結果が最大になる点か、またはその近辺の波長が選ば
れる。この散乱光の波長はビーム286の波長と調和振動
するものである必要はない。前述の関連カーブは、光源
280からの種々異なった波長の光の強度と散乱光検出器2
96の効率の間の関連を示すものである。
この具体例では、単一の広域のバンドを有する光源280
が発光した光はビームスプリッター282で２個のビーム
に分けられる。第一のビームは一つ目のモノクロメータ
ーで濾光されて、単一波長のビーム286として出て来る
が、この光はフローセル288中の被散乱物によってUV吸
収を起こすのに好適な波長を持つ。第二のビーム290は
鏡292によって反射され第二のモノクロメーター294に入
る。第二のモノクロメーター294は散乱に好適な波長の
光のみを残して他の全ての波長の光を濾光する。一般的
にこの波長は青−緑色のスペクトルの範囲内にあって、
光源280と散乱光検出器296の間の関連特性を示すカーブ
で結果が最大になる点か、またはその近辺の波長が選ば
れる。この散乱光の波長はビーム286の波長と調和振動
するものである必要はない。前述の関連カーブは、光源
280からの種々異なった波長の光の強度と散乱光検出器2
96の効率の間の関連を示すものである。
散乱光測定のために選ばれた波長の光は鏡298によっ
て反射され、さらに部分的に銀メッキされた鏡300によ
って、再びビーム286に乗せられる。
て反射され、さらに部分的に銀メッキされた鏡300によ
って、再びビーム286に乗せられる。
複合されたビーム302には、部分的に銀メッキされた
鏡306によって反射されて、その一部が取り出され入射
光Ioの検出器304に入る。入射光のビーム308は次いでフ
ローセル288にかけられる。そこで、散乱光と透過光が
検知され、重量平均分子量が検出器304,296,310からの
信号によって、手計算か、電子装置によるかして計算さ
れる。フィルター312と314は、それぞれ、専用の波長が
検出器296と310に届くことを保証している。
鏡306によって反射されて、その一部が取り出され入射
光Ioの検出器304に入る。入射光のビーム308は次いでフ
ローセル288にかけられる。そこで、散乱光と透過光が
検知され、重量平均分子量が検出器304,296,310からの
信号によって、手計算か、電子装置によるかして計算さ
れる。フィルター312と314は、それぞれ、専用の波長が
検出器296と310に届くことを保証している。
図12の具体例の利点は、単一の光源が用いられるため
に、２つの独立した光源からの光の強度が同調せずにラ
ンダムに変化するために起こるノイズを避けることが出
来る事である。加えて、２個のモノクロメーターを使用
することで、UVと散乱光の波長が別個に取り出され、重
量濃度の測定のためのUV吸収に適したもの、Mwの測定の
ための光散乱に適したものが得られる点である。
に、２つの独立した光源からの光の強度が同調せずにラ
ンダムに変化するために起こるノイズを避けることが出
来る事である。加えて、２個のモノクロメーターを使用
することで、UVと散乱光の波長が別個に取り出され、重
量濃度の測定のためのUV吸収に適したもの、Mwの測定の
ための光散乱に適したものが得られる点である。
図13は本発明に関わる複数のフローセル方式の具体例
のフローチャートである。350の段階は入射光の発光で
あり、352の段階は、この光を先に述べたように光散乱
に好適な波長（この波長で光源に対する検出器の効率が
最大になる）に濾光するか、同調させるプロセスを表
す。この352の段階は、広いバンド幅を持った光源、一
定波長を通すフィルター、或は同調可能なレーザー、或
はモノクロメーターを用いて行うことが出来る。354の
段階は付加的なもので、入射光を偏光装置を用いて垂直
方向の偏光だけを通過させる。
のフローチャートである。350の段階は入射光の発光で
あり、352の段階は、この光を先に述べたように光散乱
に好適な波長（この波長で光源に対する検出器の効率が
最大になる）に濾光するか、同調させるプロセスを表
す。この352の段階は、広いバンド幅を持った光源、一
定波長を通すフィルター、或は同調可能なレーザー、或
はモノクロメーターを用いて行うことが出来る。354の
段階は付加的なもので、入射光を偏光装置を用いて垂直
方向の偏光だけを通過させる。
356の段階は、入射光の強度Ioを検出するプロセスを
象徴する。この操作は入射光がフローセルに入る前に行
われることが好ましいが、しかし“２対1"方式でない場
合には、それはまた、散乱光検出器を付けたフローセル
を通過した光の強度を測定するものであってもよい。
象徴する。この操作は入射光がフローセルに入る前に行
われることが好ましいが、しかし“２対1"方式でない場
合には、それはまた、散乱光検出器を付けたフローセル
を通過した光の強度を測定するものであってもよい。
358の段階は溶液中の粒子に光をあてる段階を表す。
この操作はLCカラムの出口に接続したフローセル、毛細
管電気泳動装置に接続したフローセル、フローセル中ま
たは他の透明容器中に静止した溶液（ここでは迷い光が
散乱光検出器に達することが実質的に防止されている限
りにおいて）、或は単に透明の毛細管電気泳動管を用い
て、行うことが出来る。
この操作はLCカラムの出口に接続したフローセル、毛細
管電気泳動装置に接続したフローセル、フローセル中ま
たは他の透明容器中に静止した溶液（ここでは迷い光が
散乱光検出器に達することが実質的に防止されている限
りにおいて）、或は単に透明の毛細管電気泳動管を用い
て、行うことが出来る。
360の段階は溶液中の粒子の重量濃度を検出する既知
のプロセスを示している。このプロセスは光散乱用のフ
ローセルの上流または下流に接続したUV検出器中の別途
のフローセルによって行なわれる。ある場合には屈折率
計か蛍光計も用いることが出来る。
のプロセスを示している。このプロセスは光散乱用のフ
ローセルの上流または下流に接続したUV検出器中の別途
のフローセルによって行なわれる。ある場合には屈折率
計か蛍光計も用いることが出来る。
364の段階では散乱光の強度Isは入射光の強度Ioを分
割して標準化される。
割して標準化される。
最後に、重量平均分子質量Mwが式（２）を用いて366
の段階で計算される。
の段階で計算される。
図14について述べると、ここでは単一光源と単一フロ
ーセルを用いてMwを測定する方法のフローチャートを示
している。370の段階は光源に関するプロセスで、その
発光範囲が少なくともUV吸収の測定に適したある波長と
光散乱に適したある波長を出すことの出来る広いバンド
幅を持ったものを表している。レーザーは単一波長光し
か出さないので、普通はこれはアーク光源でなければな
らない。
ーセルを用いてMwを測定する方法のフローチャートを示
している。370の段階は光源に関するプロセスで、その
発光範囲が少なくともUV吸収の測定に適したある波長と
光散乱に適したある波長を出すことの出来る広いバンド
幅を持ったものを表している。レーザーは単一波長光し
か出さないので、普通はこれはアーク光源でなければな
らない。
372の段階は光源から単に２つの波長の光を選んで通
過させるための濾光または同調のプロセスを示す。この
事は、図12に示したようにビームスプリッターと２個の
別個の固定されたフィルターかモノクロメーターによっ
て行われるし、または図９または11に示したように１個
のモノクロメーターによっても行うことが出来る。１個
のモノクロメーターの場合は、２つの波長は互いに調和
振動するものでなければならない。しかし、この濾光ま
たは同調のなされた後は、２つの波長のうち、一方はUV
の吸光測定に適したものでなければならず、他方は散乱
光測定に適したものでなければならない。２つの振動数
は個別に同調させ得るものであることが好ましく、散乱
光の振動数は光源の波長と出力強度の関連カーブにおい
ては出力が、波長と散乱光検出器の効率との関連カーブ
では効率が、共に最大かまたはその付近になるような波
長に同調させる事が好ましい。
過させるための濾光または同調のプロセスを示す。この
事は、図12に示したようにビームスプリッターと２個の
別個の固定されたフィルターかモノクロメーターによっ
て行われるし、または図９または11に示したように１個
のモノクロメーターによっても行うことが出来る。１個
のモノクロメーターの場合は、２つの波長は互いに調和
振動するものでなければならない。しかし、この濾光ま
たは同調のなされた後は、２つの波長のうち、一方はUV
の吸光測定に適したものでなければならず、他方は散乱
光測定に適したものでなければならない。２つの振動数
は個別に同調させ得るものであることが好ましく、散乱
光の振動数は光源の波長と出力強度の関連カーブにおい
ては出力が、波長と散乱光検出器の効率との関連カーブ
では効率が、共に最大かまたはその付近になるような波
長に同調させる事が好ましい。
次いで、入射光の強度Ioが374の段階で不特定な方法
で測定される。
で測定される。
376の段階は、対象にする粒子に２つの振動数の光が
当てられ、前に図13の方法の中で358の段階で述べた不
特定な方法でそれがなされることを示す。
当てられ、前に図13の方法の中で358の段階で述べた不
特定な方法でそれがなされることを示す。
378の段階は、溶液を透過してきた２波長の光から、
１波長だけを濾光するプロセスを示す。排除された波長
は散乱光測定に用いられるものである。普通、PMTを用
いて透過光の強度としてUV吸収を測定するが、これは38
0の段階で示される。この信号はIoを用いて標準化され
た後、粒子の重量濃度Ｃを計算するために用いられる。
１波長だけを濾光するプロセスを示す。排除された波長
は散乱光測定に用いられるものである。普通、PMTを用
いて透過光の強度としてUV吸収を測定するが、これは38
0の段階で示される。この信号はIoを用いて標準化され
た後、粒子の重量濃度Ｃを計算するために用いられる。
382の段階は、ある高角度に対して散乱された光か
ら、UV吸光測定のために用いられた波長の光Itを排除す
る濾光操作を示す。
ら、UV吸光測定のために用いられた波長の光Itを排除す
る濾光操作を示す。
390の段階は、ある特定の高角度に散乱された光の強
度Isを測定するものであり、この操作は通常、90度でPM
Tを用いて行われる。
度Isを測定するものであり、この操作は通常、90度でPM
Tを用いて行われる。
392は、Ioを分割してIsを標準化し、Ｃと式（３）を
用いてＭWを計算する段階である。
用いてＭWを計算する段階である。
本発明はここに好適な例及び代替例として具体例が開
示されたが、その技術内容が本発明の意図と領域を超え
ない範囲でなされ得るものであれば、他の代替的な具体
化の方法もまたそれを用い得る。これらの代替的な具体
化の方法は全て以下に付記する請求の範囲に含まれる。
示されたが、その技術内容が本発明の意図と領域を超え
ない範囲でなされ得るものであれば、他の代替的な具体
化の方法もまたそれを用い得る。これらの代替的な具体
化の方法は全て以下に付記する請求の範囲に含まれる。
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/68 Ｇ０１Ｎ 27/26 ３３１Ｂ (72)発明者 キュニコ，ロバート エル. アメリカ合衆国，カリフォルニア 94547，ハーキュルス，ビーチナット ドライブ 280 (72)発明者 クニタニ，マイケル ジー. アメリカ合衆国，カリフォルニア 94903，サン ラファエル，バレージョ ウェイ 56 (56)参考文献 特開 平１−213547（ＪＰ，Ａ) 特開 平２−173550（ＪＰ，Ａ) Ｃ．ＪＡＣＫＳＯＮ ＥＴ ＡＬ，" ＣＨＡＲＡＣＴＥＲＩＺＡＴＩＯＮ Ｏ Ｆ ＢＩＯＰＯＬＹＭＥＲ ＵＳ Ｉ．ＫＲＵＬＬ ＥＴ ＡＬ，”ＢＩ ＯＰＯＬＹＭＥＲ ＤＥＴＥＲＭＩＮＡ ＴＩＯＮＳ”，ＴＲＥＤＳ ＩＮ (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 15/14 G01N 21/49 G01N 21/64 G01N 27/447 G01N 30/74 G01N 33/68 ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ)
Claims (34)
- 【請求項１】溶液中の粒子の分子量或は質量が測定でき
る信号を発生させる装置において、以下の構成： 試料の粒子を分離し、前記の分離された粒子を含む溶液
の流れを排出する手段； 光源； 前記の光源から光を、該粒子の大きさより十分に長い既
知の波長の単一光のみに限定して、濾光するフィルタ
ー； 前記流液を受け入れるためのフローセルであって、前記
フィルターからの光を受けて前記流液を照らすための入
射窓を有し、前記粒子からの散乱光をほぼ90゜の高角度
の位置で散乱光が通過する出口窓を有するもの； 高角度の位置で前記出口窓から出て来る前記散乱光を受
け入れる散乱光検出器であって、最高の感度が得られる
バンドを有し、そこで前記散乱光の強度に比例した電気
信号が出される検出器； 前記フローセルに入射する前記フィルターからの光の少
なくとも一部分を受け入れ、その光の強度を測定し、そ
の強度に比例した電気信号を発信する手段； 前記溶液中の前記粒子の濃度を検出し、それに比例した
信号を発信する手段；及び 散乱光と入射光の強度と重量濃度とに対して比例する前
記電気信号を受け入れ、次に示す関係式： Is/Io＝BCMw ここで、 Is/Ioは、35゜から145゜の間の高角度での散乱光の強度
の入射光の強度に対する比率 Ｂは、経験的に測定される光学的常数で、それはどの光
学系に対しても、少なくとも分子量が既知の２種のタイ
プの粒子について散乱光の強度を測定して定められてい
るもの Ｃは、溶液中の粒子の重量濃度及び Mwは、重量平均分子質量 を用いて、前記粒子の平均分子量を計算するための計算
手段 を含む、溶液中の粒子の分子量或は質量が測定できる信
号を発生させる装置。 - 【請求項２】粒子の大きさはλo/4に等しいか或はそれ
以下に限られ、λｏは前記流液に入射する光の波長であ
る請求項１記載の装置。 - 【請求項３】前記フィルターは、前記散乱光検出器から
の信号出力を最大にする様な範囲にある一つの波長を除
いて、他の全ての波長の光を濾光して除去するものであ
る請求項１記載の装置。 - 【請求項４】さらに、垂直方向に偏光以外の全ての光が
前記フローセルに達しないように偏光装置をもうける請
求項１記載の装置。 - 【請求項５】前記フローセルはその中を前記粒子が流れ
る散乱部位を有し、その体積はおよそ10マイクロリッタ
ーである請求項１記載の装置。 - 【請求項６】溶液中の粒子の分子量或は質量が測定でき
る信号を発生させる装置において、以下の構成： 定められた基準に基づいて試料の粒子を分離し、前記の
分離された粒子を含む溶液の流れを排出する手段； 光源； 前記の光源から光を、該粒子の大きさより十分に長い既
知の波長の単一光のみに限定して、濾光するフィルタ
ー； 前記流液を受け入れるためのフローセルであって、前記
フィルターからの光を受けて前記流液を照らすための入
射窓を有し、前記粒子からの散乱光をほぼ90゜の高角度
の位置で散乱光が通過する出口窓を有するもの； 高角度の位置で前記出口窓から出て来る前記散乱光を受
け入れる散乱光検出器であって、最高の感度が得られる
バンドを有し、そのものから前記散乱光の強度に比例し
た電気信号が出される検出器； 前記フローセルに入射する前記フィルターからの光の少
なくとも一部分を受け入れ、その光の強度を測定し、そ
の強度に比例した電気信号を発信し、前記光源からの光
を受け入れる手段； そして、前記溶液中の前記粒子の濃度を検出し、それに
比例した信号を発信する手段 を含み、その際、前記散乱光検出器は光電子倍増管であ
り、前記光電子倍増管は青−緑色の波長に最適化されて
おり、前記フィルターはスペクトルの青−緑色域にある
一波長以外の全ての波長の光を濾光して除外する、溶液
中の粒子の分子量或は質量が測定できる信号を発生させ
る装置。 - 【請求項７】前記光電子倍増管は冷却される請求項６記
載の装置。 - 【請求項８】前記光電子倍増管は光子計数方式である請
求項６記載の装置。 - 【請求項９】溶液中の粒子の分子量或は質量が測定でき
る信号を発生させる装置であって、以下の構成： 定められた基準に基づいて試料の粒子を分離し、前記の
分離された粒子を含む溶液の流れを排出する手段； 光源； 前記の光源から光を、該粒子の大きさより十分に長い既
知の波長の単一光のみに限定して、濾光するフィルタ
ー； 前記流液を受け入れるためのフローセルであって、前記
フィルターからの光を受けて前記流液を照らすための入
射窓を有し、前記粒子からの散乱光をほぼ90゜の高角度
の位置で散乱光が通過する出口窓を有するもの； 高角度の位置で前記出口窓から出て来る前記散乱光を受
け入れる散乱光検出器であって、最高の感度が得られる
バンドを有し、そのものから前記散乱光の強度に比例し
た電気信号が出される検出器； 前記フローセルに入射する前記フィルターからの光の少
なくとも一部分を受け入れ、その光の強度を測定し、そ
の強度に比例した電気信号を発信し、前記光源からの光
を受け入れる手段； そして、前記溶液中の前記粒子の濃度を検出し、それに
比例した信号を発信する手段 を含み、その際、前記光源は水銀アークランプである、
溶液中の粒子の分子量或は質量が測定できる信号を発生
させる装置。 - 【請求項１０】溶液中の粒子の分子量或は質量が測定で
きる信号を発生させる装置であって、以下の構成： 定められた基準に基づいて試料の粒子を分離し、前記の
分離された粒子を含む溶液の流れを排出する手段； 光源； 前記の光源から光を、該粒子の大きさより十分に長い既
知の波長の単一光のみに限定して、濾光するフィルタ
ー； 前記流液を受け入れるためのフローセルであって、前記
フィルターからの光を受けて前記流液を照らすための入
射窓を有し、前記粒子からの散乱光をほぼ90゜の高角度
の位置で散乱光が通過する出口窓を有するもの； 高角度の位置で前記出口窓から出て来る前記散乱光を受
け入れる散乱光検出器であって、最高の感度が得られる
バンドを有し、そのものから前記散乱光の強度に比例し
た電気信号が出される検出器； 前記フローセルに入射する前記フィルターからの光の少
なくとも一部分を受け入れ、その光の強度を測定し、そ
の強度に比例した電気信号を発信し、前記光源からの光
を受け入れる手段； そして、前記溶液中の前記粒子の濃度を検出し、それに
比例した信号を発信する手段 を含み、その際、前記光源はキセノンアークランプであ
る、溶液中の粒子の分子量或は質量が測定できる信号を
発生させる装置。 - 【請求項１１】溶液中の粒子の分子量或は質量が測定で
きる信号を発生させる装置であって、以下の構成： 定められた基準に基づいて試料の粒子を分離し、前記の
分離された粒子を含む溶液の流れを排出する手段； 光源； 前記の光源から光を、該粒子の大きさより十分に長い既
知の波長の単一光のみに限定して、濾光するフィルタ
ー； 前記流液を受け入れるためのフローセルであって、前記
フィルターからの光を受けて前記流液を照らすための入
射窓を有し、前記粒子からの散乱光をほぼ90゜の高角度
の位置で散乱光が通過する出口窓を有するもの； 高角度の位置で前記出口窓から出て来る前記散乱光を受
け入れる散乱光検出器であって、最高の感度が得られる
バンドを有し、そのものから前記散乱光の強度に比例し
た電気信号が出される検出器； 前記フローセルに入射する前記フィルターからの光の少
なくとも一部分を受け入れ、その光の強度を測定し、そ
の強度に比例した電気信号を発信し、前記光源からの光
を受け入れる手段； そして、前記溶液中の前記粒子の濃度を検出し、それに
比例した信号を発信する手段 を含み、その際、前記光源は青−緑色の光を発するレー
ザーである、溶液中の粒子の分子量或は質量が測定でき
る信号を発生させる装置。 - 【請求項１２】液体クロマトグラフィーカラムから流出
する生物学的タンパク類の分子量を測定する装置であっ
て、以下の構成： 水銀アークランプ光源は、波長に対して発光される光の
強度が変化する特性値曲線を有し； 体積がおよそ10マイクロリッター程度の小容積の流路を
有するガラス製フローセルを有し、フローセルは、前記
カラムから流出する溶媒の屈折率に対する前記ガラスの
屈折率の大略合致する屈折率を持った材料で被覆され、
前記液体クロマトグラフィーカラムから出る液体と連絡
し、また前記光源からの光が、生物学的タンパク類を含
む前記流路内を流れる液体を照らすための開口部として
の入射窓を有し、前記生物学的タンパク類によって散乱
された散乱光が高角度の位置でフローセルから出るため
の開口部としての出口窓を有し、前記入射窓及び出口窓
は空気の屈折率に対する前記ガラスの屈折率と大略合致
する屈折率を持った材料で光学的に被覆され； 前記光源と前記入射窓との間にフィルターを介在させて
選定された一波長の光以外の全ての光を濾光して実質的
に除去し； 前記光源の光を前記入射窓の上に焦点を合わせて結像さ
せる事により散乱光を極小化するための光学的手段を有
し； 光電子倍増管光検出器であって、出力信号の強度に関連
した特性値曲線を有し、その信号によって光の波長が検
知されるものを、前記生物学的タンパク類によって散乱
された光が前記出口窓から出て来る位置に配置し、該光
検出器に前記散乱光の強度に比例する信号を発信させ、
そして、そこでは前記フィルターによって、前記アーク
ランプと前記光電子倍増管の前記特性値曲線の積が最大
の値になるかまたはその近辺である一定波長以外の光を
全て濾光して除去し； 前記液体クロマトグラフィーカラムから出る液体の流れ
と連絡する濃度検知の手段があり、該検知器は前記生物
学的タンパク類について前記生物学的タンパク類の重量
濃度を検知し前記重量濃度に比例する信号を発信し； 前記散乱光強度と前記重量濃度に比例する前記信号を受
けて、前記生物学的タンパク類の前記分子量を、次の関
係式： Is/Io＝Ｃ Ｂ Mw ここで、 Mwは、散乱光を起こす生物学的タンパク類の重量平均分
子質量 Is/Ioは、散乱光の強度 Ｂは、経験的に測定される常数で、システムの光学的性
能に支配され、少なくとも２種の分子量既知の異なった
生物学的タンパク類を前記液体クロマトグラフィーカラ
ムに入れ、各々の分子量既知のものから得られる散乱光
の強度を測定し、該生物学的タンパクの既知の重量平均
分子質量に対する積として得られる（Is/Io、Mw）を、
一次関数としてプロットして求められる に基づいて計算する手段を有する を特徴とする、生物学的タンパク類の分子量を測定する
装置。 - 【請求項１３】溶液中の粒子の平均分子量を測定する方
法であって、以下の構成による： 散乱光検出器に最大の信号を発信させる選択した第一の
波長を持った入射光を発信し； 前記入射光を前記粒子を含む溶液に導き； UV吸収の測定に適した第二の波長を持った入射用の放射
を起こし； 前記の第二の波長を持つ該入射用放射光を前記粒子を含
む溶液に導き； 高角度での散乱光の強度を前記の第一の波長について測
定し、また前記溶液に入る入射光の強度を、前記の第一
の波長について測定し； 前記溶液を通過した透過光の強度を前記の第二の波長に
ついて測定し、前記溶液に入る入射光の強度を前記の第
二の波長について測定し； 前記粒子の重量濃度を、事前に求めた関係式によって、
前記の第二の波長に関する該入射光強度と前記透過光強
度の数値とを用いて計算し； 前記溶液中の前記粒子の重量平均分子量を、次の関係
式： Is/Io＝Ｂ Ｃ Mw ここで、 Is/Ioは、選定された角度における散乱光の強度； Ｃは、前記溶媒流中の前記粒子の重量濃度； Mwは、前記粒子の平均分子質量； Ｂは、各々のシステムについて経験的に決定される常数
で、トルエンを用いて該システムを較正するか、または
平均分子量が既知である少なくとも２つの粒子の試料に
ついて相対的な散乱光の強度を測定して求める よって計算する、 ことを特徴とする、溶液中の粒子の平均分子量を測定す
る方法。 - 【請求項１４】溶液中の小形の粒子の平均分子量を測定
する方法であって、以下の構成による： 溶媒流中の前記粒子を分離し； 前記溶媒流を前記粒子の重量濃度を測定することの出来
る検出器を通過せしめ、前記重量濃度を測定し、該重量
濃度を表す信号を発信せしめ； 前記溶媒流をフローセル中に通過せしめ； 一つの波長λを持つ光を前記フローセルを通過する前記
溶媒の流れに照射し、ここでλは少なくとも前記粒子の
大きさの４倍以上の長さであり； 散乱光の強度を35゜から145゜の間で選んだ一定の角度
で測定し； 前記フローセルに入射する光の強度を測定し； 前記散乱光強度を前記入射光強度で除し； 平均分子量を次の関係式によって計算するが、 Is/Io＝Ｂ Ｃ Mw Is/Ioは、選定された角度における散乱光の強度； Ｃは、前記溶媒流中の前記粒子の重量濃度； Mwは、前記粒子の平均分子量； Ｂは、各々のシステムについて経験的に決定される常数
で、トルエンを用いて該システムを較正するか、または
平均分子量が既知である少なくとも２つの粒子の試料に
ついて相対的な散乱光の強度を測定して求める、 ことを特徴とする、溶液中の小形の粒子の平均分子量を
測定する方法。 - 【請求項１５】前記粒子の分離の段階は、前記粒子を含
む溶液を液体クロマトグラフィーカラム内を通過せしめ
る段階を含む請求項14記載の方法。 - 【請求項１６】前記粒子の分離の段階は、前記粒子を毛
細管電気泳動装置中で分離する段階を含む請求項14記載
の方法。 - 【請求項１７】一つの波長の光を前記溶媒流に照らす段
階は、アークランプを用いて発光し、該出力光から一波
長λのみを残して濾光し、その濾光された光を前記溶媒
流上に焦点を合わせる段階を含む請求項14記載の方法。 - 【請求項１８】散乱光の強度を測定する段階は、波長に
対する感度特性曲線を有する光電子倍増管を用いて散乱
光を検出する段階、その段階では前記のアークランプは
波長に対する発光強度の出力特性曲線を有し、また前記
出力光を濾光する前記段階は、前記アークランプの特性
曲線と前記光電子倍増管の特性曲線の積が最大になる波
長か、またはその付近にある波長を除いて、その他の全
ての光を実質的に除く濾光の段階を含む請求項17記載の
方法。 - 【請求項１９】溶液中の粒子の平均分子量が計算される
信号を発信する装置であって、以下の構成： 溶液中の粒子に単一波長の光を照らす手段を有し； 前記粒子からの散乱光の強度を35゜から145゜迄の範囲
で選択された角度で測定する手段を有し、前記散乱光強
度は前記粒子に入射する光の強度と対比させて測定さ
れ、前記相対散乱光強度として表された信号を発信し； 溶液中の前記粒子重量濃度を測定し、その測定値を表す
信号を発信する手段を含み、その際、前記の光を照らす
手段は波長に対する発光強度の出力特性曲線を有する水
銀アークランプとフィルターを有し、また前記散乱光の
強度を測定するための前記手段として、波長に対する出
力信号の強度の特性曲線を有する光電子倍増管を含み、
さらに前記フィルターは前記２種の特性曲線の積が最大
になる波長か、またはその付近にある波長を除いて、そ
の他の全ての光を除去する、溶液中の粒子の平均分子量
を計算される信号を発信する装置。 - 【請求項２０】重量濃度と相対散乱光強度を示す前記信
号を受け入れるための計算手段及び、次の関係式： ここで、 Ｋは、波長、溶液の屈折率と、溶液の屈折率の（他の因
子中で）時間的変化に関連する光学的常数であって、重
量平均分子量が既知である少なくとも２つのタイプの粒
子を用いて該システムを較正することによって、選ばれ
たどのシステムについても経験的に求めることが出来； Ｒは、特異的レーリー常数 Mwは、散乱粒子の重量平均分子質量 Ｐ（θ）は、サイズファクター（形状変数）で粒子間の
多重散乱の効果についての関係を補正するもの A2とA3は、それぞれ、第二及び第三ビリアル係数であ
り、 Ｃは、散乱粒子の重量濃度であり、 さらに、ここで、 ここで、 Ｐ（θ）-1は、サイズファクターの逆数、 ｎは、屈折率、 Rgは、散乱粒子の回転半径、 θは、入射光と散乱光の間の散乱角で、 λは、入射光の波長で、ここではRgはλo/4以下の大き
さの小形の粒子に対しては実質的にゼロであり、この事
は関心の対象になる殆ど全ての生体タンパク類に適用さ
れ、またここで、そのものに関して十分な情報があり、
RgとMwとの関連が表示されている様な、さらに大型の粒
子については、式（２）中のRgを置換してそれと同等な
値をもつMwの表現に変え、書き換えられた（２）式をＰ
（θ）について式（１）に代入して、デジタルコンピュ
ーターを用いて自動的にMwの解を求めることによりMwを
計算する を用いて前記粒子の重量平均分子量を計算するための手
段を有する請求項19記載の装置。 - 【請求項２１】溶液中の粒子の平均分子量が計算される
信号を発信する装置であって、以下の構成による： 溶液中の粒子に単一波長の光を照らす手段を有し； 前記粒子からの散乱光を35゜から145゜迄の範囲で選択
された角度で測定する手段を有し、前記散乱光強度は前
記粒子に入射する光の強度と対比させて測定され、前記
相対散乱光強度として表された信号を発信し； 溶液中の前記粒子の重量濃度を測定し、その測定値を表
す信号を発信する手段を有し； 重量濃度と相対散乱光強度を示す前記信号を受け入れる
ための計算手段及び次の関係式： ここで、 Ｋは、波長、溶液の屈折率と、溶液の屈折率の（他の因
子中で）時間的変化に関連する光学的常数であって、重
量平均分子量が既知である少なくとも２つのタイプの粒
子を用いて該システムを較正することによって、選ばれ
たどのシステムについても経験的に求めることが出来； Ｒは、特異的レーリー常数 Mwは、散乱粒子の重量平均分子質量 Ｐ（θ）は、サイズファクター（形状変数）で粒子間の
多重散乱の効果についての関係を補正するもの A2とA3は、それぞれ、第二及び第三ビリアル係数であ
り、 Ｃは、散乱粒子の重量濃度であり、 さらに、ここで、 ここで、 Ｐ（θ）-1は、サイズファクターの逆数、 ｎは、屈折率、 Rgは、散乱粒子の回転半径、 θは、入射光と散乱光の間の散乱角で、 λは、入射光の波長で、ここではRgはλo/4以下の大き
さの小形の粒子に対しては実質的にゼロであり、この事
は関心の対象になる殆ど全ての生体タンパク類に適用さ
れ、またここで、そのものに関して十分な情報があり、
RgとMwとの関連が表示されている様な、さらに大型の粒
子については、式（２）中のRgを置換してそれと同等な
値をもつMwの表現に変え、書き換えられた（２）式をＰ
（θ）について式（１）に代入して、デジタルコンピュ
ーターを用いて自動的にMwの解を求めることによりMwを
計算する により、前記粒子の重量平均分子量を計算するための手
段を有する ことを特徴とする、溶液中の粒子の平均分子量が計算さ
れる信号を発信する装置。 - 【請求項２２】液体クロマトグラフィーから溶出される
溶液の流れ中の粒子の分子量或は質量が測定できる信号
を発生させる装置において、以下の構成： 光源； 前記の光源から光を、該粒子の大きさより十分に長い既
知の波長の単一光のみに限定して、濾光するフィルタ
ー； 前記流液を受け入れるためのフローセルであって、前記
フィルターからの光を受けて前記流液を照らすための入
射窓を有し、前記粒子からの散乱光をほぼ90゜の高角度
の位置で散乱光が通過する出口窓を有するもの； 高角度の位置で前記出口窓から出て来る前記散乱光を受
け入れる散乱光検出器であって、最高の感度が得られる
バンドを有し、そこから前記散乱光の強度に比例した電
気信号が出される検出器； 前記フローセルに入射する前記フィルターからの光の少
なくとも一部分を受け入れ、その光の強度を測定し、そ
の強度に比例した電気信号を発信し、前記光源からの光
を受け入れる手段； 前記溶液中に前記粒子の濃度を検出し、それに比例した
信号を発信する手段、及び 散乱光と入射光の強度と重量濃度とに対して比例する前
記電気信号を受け入れ、次に示す関係式： Is/Io＝BCMw ここで、 Is/Ioは、35゜から145゜の間の高角度での散乱光の強度
の入射光の強度に対する比率 Ｂは、経験的に測定される定められた光学的常数で、そ
れはどの光学系に対しても、実験によって分子量が既知
の少なくとも２種のタイプの粒子について散乱光の強度
を測定して定められているもの Ｃは、溶液中の粒子の重量濃度 Mwは、重量平均分子質量 を用いて、前記粒子の平均分子量を計算するための計算
手段 を含む、溶液中の粒子の分子量或は質量が測定できる信
号を発生させる装置。 - 【請求項２３】粒子の大きさはλo/4に等しいか或はそ
れ以下に限られ、λｏは前記フローセルに入射する光の
波長である請求項22記載の装置。 - 【請求項２４】前記フィルターは、前記散乱光検出器か
らの信号出力を最大にする様な範囲にある一つの波長を
除いて、他の全ての波長の光を濾光して除去するもので
ある請求項22記載の装置。 - 【請求項２５】さらに、垂直方向に偏光以外の全ての光
が前記フローセルに達しないように偏光装置をもうける
請求項22記載の装置。 - 【請求項２６】前記フローセルはその中を前記粒子が流
れる散乱部位を有し、その体積はおよそ10マイクロリッ
ターである請求項22記載の装置。 - 【請求項２７】前記散乱光検出器は光電子倍増管である
請求項22記載の装置。 - 【請求項２８】前記光電子倍増管は青−緑色の波長に最
適化されており、前記フィルターはスペクトルの青−緑
色域にある一波長以外の全ての波長の光を濾光して除外
する請求項27記載の装置。 - 【請求項２９】前記光電子倍増管は冷却される請求項27
記載の装置。 - 【請求項３０】前記光電子倍増管は光子計数方式である
請求項27記載の装置。 - 【請求項３１】前記光源は水銀アークランプである請求
項22記載の装置。 - 【請求項３２】前記光源はキセノンアークランプである
請求項22記載の装置。 - 【請求項３３】前記光源はレーザーである請求項22記載
の装置。 - 【請求項３４】前記レーザーは青−緑色の光を発する請
求項33記載の装置。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US601,840 | 1990-10-23 | ||
| US07/601,840 US5269937A (en) | 1990-10-23 | 1990-10-23 | HPLC light scattering detector for biopolymers |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05505882A JPH05505882A (ja) | 1993-08-26 |
| JP3253614B2 true JP3253614B2 (ja) | 2002-02-04 |
Family
ID=24408976
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP50188792A Expired - Lifetime JP3253614B2 (ja) | 1990-10-23 | 1991-10-23 | 生体高分子用のｈｐｌｃ―光散乱法検出器 |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5269937A (ja) |
| EP (1) | EP0505564B1 (ja) |
| JP (1) | JP3253614B2 (ja) |
| AT (1) | ATE147161T1 (ja) |
| CA (1) | CA2072004C (ja) |
| DE (2) | DE69123957T2 (ja) |
| ES (1) | ES2038572T1 (ja) |
| GR (1) | GR930300025T1 (ja) |
| WO (1) | WO1992007244A1 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2003515159A (ja) * | 1999-09-29 | 2003-04-22 | マウンテン ビュー ファーマシューティカルズ，インコーポレイテッド | 光散乱によるウイルスの定量検出方法 |
| JP2013250203A (ja) * | 2012-06-01 | 2013-12-12 | Denso Corp | 液体成分センサ |
Families Citing this family (43)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5994056A (en) | 1991-05-02 | 1999-11-30 | Roche Molecular Systems, Inc. | Homogeneous methods for nucleic acid amplification and detection |
| US5844685A (en) * | 1996-07-30 | 1998-12-01 | Bayer Corporation | Reference laser beam sampling apparatus |
| FR2773880B1 (fr) * | 1998-01-19 | 2000-03-17 | Cilas | Dispositif pour determiner la repartition granulometrique d'un melange de particules |
| EP1102059B1 (en) * | 1999-11-18 | 2005-10-05 | Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. | Method and apparatus for measuring a scattered light |
| GB2383127B (en) * | 2001-12-12 | 2004-10-20 | Proimmune Ltd | Device and method for investigating analytes in liquid suspension or solution |
| GB2390893A (en) * | 2002-07-15 | 2004-01-21 | Pcme Ltd | Method and apparatus for monitoring particles in a stack |
| WO2005019419A2 (en) * | 2003-07-31 | 2005-03-03 | Singulex, Inc. | Co-detection of single polypeptide and polynucleotide molecules |
| US20080021674A1 (en) * | 2003-09-30 | 2008-01-24 | Robert Puskas | Methods for Enhancing the Analysis of Particle Detection |
| PL1756547T3 (pl) * | 2004-03-01 | 2014-11-28 | Partec Gmbh | Urządzenie do pomiaru światła, jakie jest emitowane przez mikroskopowe małe cząstki lub komórki biologiczne |
| US8685711B2 (en) | 2004-09-28 | 2014-04-01 | Singulex, Inc. | Methods and compositions for highly sensitive detection of molecules |
| JP2008514955A (ja) * | 2004-09-28 | 2008-05-08 | シンギュレックス・インコーポレイテッド | サンプル分析システムおよび方法 |
| US9040305B2 (en) * | 2004-09-28 | 2015-05-26 | Singulex, Inc. | Method of analysis for determining a specific protein in blood samples using fluorescence spectrometry |
| US7572640B2 (en) * | 2004-09-28 | 2009-08-11 | Singulex, Inc. | Method for highly sensitive detection of single protein molecules labeled with fluorescent moieties |
| GB2422897A (en) | 2005-02-02 | 2006-08-09 | Pcme Ltd | A monitor for monitoring particles flowing in a stack |
| US7630076B2 (en) * | 2005-07-26 | 2009-12-08 | University Of Connecticut | Dual-detector systems and methods having utility in biomolecular measurements |
| US7923238B2 (en) * | 2006-02-10 | 2011-04-12 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Multi-channel electroporation system |
| ES2550004T3 (es) | 2006-04-04 | 2015-11-03 | Singulex, Inc. | Sistema de alta sensibilidad y métodos de análisis de la troponina |
| US7838250B1 (en) | 2006-04-04 | 2010-11-23 | Singulex, Inc. | Highly sensitive system and methods for analysis of troponin |
| US20070291265A1 (en) * | 2006-04-13 | 2007-12-20 | Mississippi State University | Optical apparatus for simultaneously measuring the scattering and concentration of signals of macromolecules in a flow cell |
| US7750605B2 (en) | 2006-09-21 | 2010-07-06 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Controlling an electrical signal sent to a sample load using a pulse modulated resistance |
| US7576549B2 (en) * | 2006-09-21 | 2009-08-18 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Methods for measuring sample resistance in electroporation |
| US7593101B2 (en) * | 2007-04-10 | 2009-09-22 | Schlumberger Technology Corporation | High-pressure cross-polar microscopy cells having adjustable fluid passage and methods of use |
| WO2009025898A2 (en) * | 2007-05-24 | 2009-02-26 | The Research Foundation Of The State University Of New York | Dual detector capillary waveguide biosensor and method for use thereof |
| US8208144B2 (en) * | 2007-07-17 | 2012-06-26 | Hach Company | Spatial frequency optical measurement instrument and method |
| EP2232271B1 (en) | 2007-12-19 | 2019-09-11 | Singulex, Inc. | Scanning analyzer for single molecule detection and methods of use |
| WO2009126380A2 (en) * | 2008-03-05 | 2009-10-15 | Singulex, Inc. | Methods and compositions for highly sensitive detection of molecules |
| GB2464183A (en) * | 2008-09-19 | 2010-04-14 | Singulex Inc | Sandwich assay |
| US8450069B2 (en) * | 2009-06-08 | 2013-05-28 | Singulex, Inc. | Highly sensitive biomarker panels |
| US8195405B2 (en) * | 2009-06-30 | 2012-06-05 | Wyatt Technology Corporation | Method for characterizing reversible association of macromolecules at high concentration |
| US20110301053A1 (en) | 2010-05-06 | 2011-12-08 | Singulex, Inc. | Methods for Diagnosing, Staging, Predicting Risk for Developing and Identifying Treatment Responders for Rheumatoid Arthritis |
| US9001319B2 (en) | 2012-05-04 | 2015-04-07 | Ecolab Usa Inc. | Self-cleaning optical sensor |
| US10132736B2 (en) | 2012-05-24 | 2018-11-20 | Abbvie Inc. | Methods for inspection of protein particles in a liquid beneficial agent |
| WO2014097724A1 (ja) * | 2012-12-21 | 2014-06-26 | ソニー株式会社 | 粒子検出装置及び粒子検出方法 |
| GB201304631D0 (en) * | 2013-03-14 | 2013-05-01 | Malvern Instr Ltd | Monomer detection in protein separation |
| JP6191477B2 (ja) * | 2014-01-24 | 2017-09-06 | 株式会社島津製作所 | 粒子径測定装置及び粒子径測定方法 |
| DE102014007355B3 (de) * | 2014-05-19 | 2015-08-20 | Particle Metrix Gmbh | Verfahren der Partikel Tracking Aalyse mit Hilfe von Streulicht (PTA) und eine Vorrichtung zur Erfassung und Charakterisierung von Partikeln in Flüssigkeiten aller Art in der Größenordnung von Nanometern |
| US20150355147A1 (en) | 2014-06-06 | 2015-12-10 | Biogénesis Bagó Uruguay S.A. | High throughput quantification and characterization of foot and mouth disease virus and products thereof |
| US9470625B1 (en) * | 2015-05-28 | 2016-10-18 | National Chung Cheng University | Method of examining purity of dendrimers |
| US11119079B2 (en) * | 2017-08-17 | 2021-09-14 | Daylight Solutions, Inc. | Liquid chromatography analyzer system with on-line analysis of eluting fractions |
| CN111448448A (zh) * | 2017-12-11 | 2020-07-24 | 马尔文帕纳科 | 通过尺寸排阻色谱法确定颗粒尺寸分布 |
| WO2020090581A1 (ja) | 2018-10-30 | 2020-05-07 | アルプスアルパイン株式会社 | 流路プレート、分析装置及び分析方法 |
| US11965900B2 (en) * | 2018-11-09 | 2024-04-23 | Wyatt Technology, Llc | Indicating a status of an analytical instrument on a screen of the analytical instrument |
| CN113916730B (zh) * | 2021-12-13 | 2022-10-28 | 济南微纳颗粒仪器股份有限公司 | 一种纳米级粒度检测装置 |
Family Cites Families (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US2794502A (en) * | 1956-02-14 | 1957-06-04 | Andrew J Toti | Vertical slat blind |
| JPS456225Y1 (ja) * | 1965-01-30 | 1970-03-27 | ||
| JPS54109494A (en) * | 1978-02-16 | 1979-08-28 | Teikoku Hormone Mfg Co Ltd | Method of measuring antigennantibody reaction |
| DE2918342A1 (de) * | 1979-05-07 | 1980-11-20 | Behringwerke Ag | Latex-reagenz |
| EP0088760A1 (en) * | 1981-04-13 | 1983-09-21 | AUSTRALIAN NUCLEAR SCIENCE & TECHNOLOGY ORGANISATION | Measuring the concentration of gaseous hydrogen fluoride |
| NO156917C (no) * | 1985-07-16 | 1987-12-16 | Harald B Steen | Anordning for maaling av biologiske cellers lysspredning i vaeskestroemsfotometere. |
| US4796995A (en) * | 1985-12-23 | 1989-01-10 | The United States Department Of Energy | Optically active biological particle distinguishing apparatus |
| US4732202A (en) * | 1986-04-18 | 1988-03-22 | Hunter Douglas Inc. | Vertical louvre blind traveller |
| GB8621426D0 (en) * | 1986-09-05 | 1986-10-15 | Health Lab Service Board | Particle analysis |
| SE463118B (sv) * | 1988-02-26 | 1990-10-08 | Btg Kaelle Inventing Ab | Foerfarande och anordning foer bestaemning av koncentrationen av ett aemne som aer bundet till partiklar i ett stroemmande medium |
| US4934811A (en) * | 1988-04-01 | 1990-06-19 | Syntex (U.S.A.) Inc. | Apparatus and method for detection of fluorescence or light scatter |
-
1990
- 1990-10-23 US US07/601,840 patent/US5269937A/en not_active Expired - Lifetime
-
1991
- 1991-10-23 ES ES199192900681T patent/ES2038572T1/es active Pending
- 1991-10-23 CA CA002072004A patent/CA2072004C/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-10-23 DE DE69123957T patent/DE69123957T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1991-10-23 JP JP50188792A patent/JP3253614B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1991-10-23 DE DE199292900681T patent/DE505564T1/de active Pending
- 1991-10-23 EP EP92900681A patent/EP0505564B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-10-23 WO PCT/US1991/008286 patent/WO1992007244A1/en active IP Right Grant
- 1991-10-23 AT AT92900681T patent/ATE147161T1/de not_active IP Right Cessation
-
1993
- 1993-05-24 GR GR930300025T patent/GR930300025T1/el unknown
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Ｃ．ＪＡＣＫＳＯＮ ＥＴ ＡＬ，"ＣＨＡＲＡＣＴＥＲＩＺＡＴＩＯＮ ＯＦ ＢＩＯＰＯＬＹＭＥＲ ＵＳ |
| Ｉ．ＫＲＵＬＬ ＥＴ ＡＬ，"ＢＩＯＰＯＬＹＭＥＲ ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＴＩＯＮＳ"，ＴＲＥＤＳ ＩＮ |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2003515159A (ja) * | 1999-09-29 | 2003-04-22 | マウンテン ビュー ファーマシューティカルズ，インコーポレイテッド | 光散乱によるウイルスの定量検出方法 |
| JP2013250203A (ja) * | 2012-06-01 | 2013-12-12 | Denso Corp | 液体成分センサ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH05505882A (ja) | 1993-08-26 |
| EP0505564B1 (en) | 1997-01-02 |
| DE505564T1 (de) | 1993-05-19 |
| WO1992007244A1 (en) | 1992-04-30 |
| DE69123957D1 (de) | 1997-02-13 |
| ATE147161T1 (de) | 1997-01-15 |
| US5269937A (en) | 1993-12-14 |
| CA2072004A1 (en) | 1992-04-24 |
| GR930300025T1 (en) | 1993-05-24 |
| ES2038572T1 (es) | 1993-08-01 |
| CA2072004C (en) | 2000-04-04 |
| DE69123957T2 (de) | 1997-04-30 |
| EP0505564A1 (en) | 1992-09-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP3253614B2 (ja) | 生体高分子用のｈｐｌｃ―光散乱法検出器 | |
| US5250186A (en) | HPLC light scattering detector for biopolymers | |
| US5481113A (en) | Apparatus and method for measuring concentrations of components with light scattering | |
| JP3049254B2 (ja) | ２種類の光源を備えた光学式粒子分析装置 | |
| JP4791625B2 (ja) | 分光光度・比濁検出ユニット | |
| CN100545631C (zh) | 基于表面等离子波的多功能光吸收、散射与发射光谱仪 | |
| US4945250A (en) | Optical read head for immunoassay instrument | |
| EP0967954B1 (en) | APPARATUS FOR determining the concentration of INTERFERENTS IN PLASMA | |
| EP1418419A2 (en) | A high efficiency fluorescence flow cell | |
| JPH05240774A (ja) | 光学セル及び光学検出装置とこれを用いる試料分離検出装置 | |
| JP2000009638A (ja) | 反射率および透過率による分光分析装置および方法並びに分光計用のプロ―ブ | |
| NO750639L (ja) | ||
| RU2223479C2 (ru) | Способ и устройство для анализа изотопсодержащих молекул по спектру поглощения | |
| JPH03503454A (ja) | 免疫試験法のための光学式読取装置 | |
| US6265151B1 (en) | Apparatus and method for infectious disease detection | |
| JPS626142A (ja) | 吸光度，濁り、螢光性、比濁測定用のフオトメ−タ | |
| KR20070012413A (ko) | 샘플 중 지질 입자 분포를 측정하기 위한 광학적 방법 및시스템 | |
| JP3325937B2 (ja) | 原子吸収分光法における吸収補正装置および方法 | |
| WO2005100955A1 (en) | Method and apparatus for determining the absorption of weakly absorbing and/or scattering liquid samples | |
| Mach et al. | Determining the identity and purity of recombinant proteins by UV absorption spectroscopy | |
| Brown et al. | Interfacing a fiber-optic probe to a diode array UV-visible spectrophotometer for drug dissolution tests | |
| JPH10253529A (ja) | 液体クロマトグラフ装置用センサー | |
| JPH0843390A (ja) | 免疫測定方法及びその装置 | |
| FR2627286A1 (fr) | Procede et appareil pour l'examen d'un echantillon en immunologie | |
| CN113075133B (zh) | 一种基于光微流激光的粒子增强型免疫比浊蛋白质分析仪 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| R370 | Written measure of declining of transfer procedure |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R370 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20081122 Year of fee payment: 7 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20091122 Year of fee payment: 8 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20091122 Year of fee payment: 8 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20101122 Year of fee payment: 9 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20111122 Year of fee payment: 10 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |