JPH05505882A - 生体高分子用のｈｐｌｃ―光散乱法検出器 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 のＨＰＬＣ−法 技術分野 本発明は分子量が２ないし１０．０ＯＯｋダルトンの特に生体高分子、または他 の高分子物質の、標準的な光散乱法による特性検出と分析法に関する。さらに詳 しくは本発明は、例えば、液体クロマトグラフィーカラムの様な分離装置から得 られる粒子の分子量を測定するために設計された、標準的な低角光散乱検出器及 び多角の標準的な光散乱検出器の改良に関する。

技術背景 液体クロマトグラフィーカラムからか、または他の分離装置から溶出する粒子の 分子量は、その粒子の特性を知るためのクロマトグラムの分析、及びプロセスの 監視と制御の双方に関して大変有用な情報源である。例えば、生物学的なプロセ スによっていくつかの異なった興味あるタンパクが生成し、科学者が、疾病の治 療への利用でさらに研究するためや、診断の目的に用いたりするために、それら を分子量によって分離し同定することを考えてみるとよい、タンパク類を分子量 によって分離する液体クロマトグラフィーカラムはないが、粒子をその大きさに よって分けるカラムはある。しがしながら、粒子径は分子量の指標としては貧弱 である。その理由は自然の状態で存在する生体の球状タンパクと、同じそのタン パクが変性された場合では同一分子量であっても大きさがかなりに異なるからで ある０種々のタンパクの分離にあたって、それらが液体クロマトグラフィーカラ ムから溶出してきた時に、例えば、その大きさに基ずいて、クロマトグラフ中の 各ピークに相当するタンパクの分子量が解るとすれば、それは有益である。その 分子量の信号は、分離された各タンパクをそれぞれ別の容器に分配するためのコ レクターシステムを制御するために用いられ得る。

従来技術による検出器で液体クロマトグラフィーカラムの流出液を屈折率の差異 によって測定するものはあった。しかし、屈折率は分子量の指標としては適当で ない。

液体クロマトグラフィー（以後単にＬＣと記す）カラムから流出する粒子の分子 量を知る他の方法はクロマトグラムの分析である。ある場合には、紫外線検出器 （以後単にＵＶと記す）を用いて検出するクロマトグラム中のピークは、そのピ ークが如何なる粒子によってもたらされるかを解読することが出来ない、もし標 準的な光散乱法を他のクロマトグラムを起こすのに用いれば、その２つのクロマ トグラムを比較し得て、ＵＶクロマトグラム中の各ピークを構成する物質量の差 異は容易に測定することが出来るだろう。

従来技術では、分子量の測定は困難で、１９７０年に設計された標準的な光散乱 法の数学的処理に基ずく装置によっていたが、その光散乱法は生体高分子に入射 する光の波長λの１／４以下の大きさの小粒子に対して適応させられていなかっ た。詳しくは、分子量、レイリー（Ｒａｙｌｅｉｇｈ）散乱、散乱の原因になる 粒子の重量濃度、Ｐと呼ばれるサイズファクターと、第２ビリアル係数（生体タ ンパクの粒子がその性質に基ずいて排除する体積に関する係数）と呼ばれる他の 物理学的特性の間に数学的な関連がある。この第２ビリアル係数Ａは、もしそれ が大きければ、球状の生体タンパクがその周囲から他のタンパクを大きく排除し ていることを意味する。Ａが負であれば、それはこの生体タンパクは他のタンパ クと結合する傾向を有し、凝集することを意味している。さらに詳しくはこの関 係は、 Ｋは、　波長に関連する常数で、溶液の屈折率と溶液の屈折率の他の物質量での 経過時間による変化については、与えられたシステムについて経験的にめること が出来る。

Ｒは、　“特異的レーリー常数”または“特異的レーリー率７、 Ｍｗは、　散乱１１！Ｊ質の重量平均分子質量、Ｐ（θ）は、　式（１）を、粒 子間の多重散乱について補正するためのサイズパラメーター、 Ａ２とＡ、は、それぞれ第２、第３ビリアル係数であり、Ｃは、　散乱粒子（以 後、散乱物と記す）の重量濃度を示す。

この式で研究者にとって難しいものの一つは、式（１）のＰ因子である。詳しく は、Ｐは次式によって与えられる。

Ｐ（θ）−１は、サイズファクターの逆数、ｎは、　屈折率、 Ｒ９は、　散乱物の転回半径、 θは、　散乱光の角度、即ち入射光と散乱光の間の角度、 λ、は、　入射光の波長を、それぞれ示す。

分子量測定を可能にする装置の設計技術において、技術者には次の困難がある。

その理由は、散乱物の回転半径を篇単に測ることが出来ず、またそれに進歩が無 いためであって、サイズファクターＰは知ることが出来ないが、誤差の起きるこ とを無視することも出来ない。ただし散乱角が非常に小さく、（１）、　（２） 式におけるサイズファクターがほぼ１である時は可能である。そこで、はぼ１９ ７０年頃に発達した分子量測定装置は、散乱角が狭く、Ｐが無視できるものにつ いて設計されていた。事実、Ｒ，を測定することはできるが、そのためにはＲ（ レーリー散乱）を各々の複数の角θについて測定する必要がある。Ｍ、４（以後 、散乱物質の分子集団の平均重量、Ｗ、はしばしば単にＭ、と記す）とＲ１はこ れらの測定によって得ることが出来る。従来技術による他の装置のデザインはこ の手法を用いていた。それは狭い角度θではＲ９を知る必要が無いからである。

図１は、Ｒ９が知られている必要の無い狭角度の光散乱検出器（以後ＬＡＬと記 する）について、従来技術の実例を示している。アークかレーザーによって与え られる光Ｂ１０からの光は、光学装置１２によって液体の通過するセル（フロー セル）１６０入射窓１４に入射される。該フローセルは長い導入ガラス部分１８ 、液体クロマトグラフィーカラム２２から溶液として流出してくる散乱物が流れ る散乱部位２０、長い排出ガラス部分２４、排出窓２６、覆い２８及び散乱光測 定器３０とからなっている。

図１のＬＡＬ検出器には多くの改良可能の分野がある。第一に、この設計ではい くつかの理由で、ノイズに対する信号比が適切でない、光源１０はそれがアーク の場合、十分に平行な光線を与えず、また光線は光学装置１２で焦点が合わされ なければならない、光学装置を通って光が入射窓１４に入るとき、レンズ系と入 射窓が完全でないとそれらはなにがしかの入射光の散乱を起こし、それが検出器 ３０に補足されると、本来の光散乱ではない機械装置自体に起因する散乱光を受 けるので、ノイズになる。また、光がガラス１８を出て、散乱部位２０に入り再 びガラス２４に入るとき、ガラスの不完全さによって液体／ガラス界面、３２． ３４でさらに散乱が起こる。加えて光が出てくる２６の窓でも、ガラスの不完全 性によって散乱が起こる。全てのこれらの散乱光はノイズであってデータではな いので、それらを排除する手段が必要である。これらの手段の一つは、ガラス１ ８と２４を長くして入射窓１４、界面３２と３４で発生する光の散乱を十分に検 出器から遠ざけ、これらの場所で発生した散乱光を検出器から遠ざけることであ る。光の出口窓である２６の散乱光は覆い２８によっである程度検出器からマス クされる０図２は覆い２８の重要なマスク構造を示している。この覆いは中心に 不透明な部分３６を有していて、それはまっすぐにフローセルと散乱部位中に入 ってくる散乱していない入射光を遮り、検出器３０には入らないようにする働き がある。覆いはまた同心円状に不透明部分３８をもっていて、その不透明部分は 広角度の散乱光が検出器に入るのを防いでいる。斜線を施していない部分４０は 透明で低角度の散乱光を、元来の散乱物によるものもガラスの不完全性によるな ど他の原因によるものの区別無しに検出器に導く。

図１に示す装置の使用には面倒が多い、その理由は、フローセルは取り外して洗 浄することが出来ず、超音波洗浄などによらざるを得す、殆ど毎日、その種々の 光学的経路に出来る汚れを、余分な散乱を来さないように除いていなければなら ないからである。

さらに、散乱光を極小化しようとすると、光学装置Ｆ１２のアーク光を集束する ためのデザインが複雑で高価になる。レーザーを用いると、その光線は平行であ るために、光学装！のデザインの問題は軽減される。しかし、ある程度の散乱光 を排除するためにレーザービームを純粋にするためのいくつかの光学装置が必要 である。窓１４と２６及び界面３２と３４を可及的に完全なものにする問題はま た大変困難である。

図１の構造の他の問題は、比較的安価に得られるヘリューム−ネオンレーザ−の 様なレーザー光線の振動数が、スペクトルの赤色部の末端にかなりに接近してい るので、検出器３０の最高感度の得られる波長域とのマツチングが悪い点にある 。一般に、該検出器３０は光電子増倍管（以後、ＰＭＴと記する）であって、そ の感度は、スペクトルの青−縁部末ち散乱光が無い場合に好ましくない信号にな る）が低めであって、ノイズは低レベルになる。入射光の強さに比べると散乱光 の量は極めて少ないので、散乱光の検出器の設計に当たってはノイズに対する配 慮は極めて重要で、また、散乱光の強度を測定可能な範囲に保つために、６入射 光のレベルを強く保持することも大切である。さらに、散乱された光の量は、ｌ ／λ４に比例する。そこで短い波長λを持つ青色光は赤色光に比べて大きな散乱 が得られる。一般にヘリューム−ネオンレーザ−の発生するレーザー光の波長は ６３３ｎｍであり、アークランプからとった一般的な利用可能な光の波長は４６ ７ｎ−である、６３３’を４６７４で除すると３．４になるので、青みがかった アークからの光はＨｅ−Ｎｅのレーザー光よりも３．４倍も良（散乱する。そこ で青−緑色に適合させたＰＭＴを用いることが、大変好ましい、青−緑色末端の スペクトルをもち、高出力である光を出すレーザーは大変高価で大型である。従 って作られる装置は大型で、重量が大きく、高価なものになる。

さらに、レーザーには漣様のノイズがあり、ノイズは発信する光の強度をＯから ３〇七変調する。光源で起こる入射光の強度の変化は、散乱物の分子量や濃度に 起因しないにもかかわらず、散乱光の強度変化の形のノイズに翻訳されてしまう 。高速液体クロマトグラフィーは少なくとも３０分から９０分間で終了し、検出 器から出る普通のサンプルの信号は１秒に１同種度である。そこで、サンプルの 頻度と漣祿ノイズの頻度帯が似ているので、データに余計にノイズをもたらす傾 向がある。

最後に、液体クロマトグラフィーカラムの流出液の中に不可避的に存在する非常 に大型の粒子による、他のノイズの問題がある。これらの大型粒子はカラム充填 物の破片であろうから、関心外のものであるが、大きさの故に、とにかく大量の 散乱光を起こす０図３は小型の粒子の典型的な光散乱パターンを角度の関数とし て図示したもので、＠４は大型の粒子の典型的な光散乱パターンを図示したもの である。図３において入射光ベクトルＩ０は左から入り、散乱光ベクトルについ て、低角度から約９０度のものまでを、それぞれ、ベクトル■３゜とＩｓ９゜と じて表す、小型の粒子によって、９０度のところに散乱した光の強度は、低角度 のところに散乱した光の強度の約二分の−である。不幸にして、図４に示すとお り、大型の粒子から散乱される光の強度は非常に多様な形になる。

図４は大型の粒子からは９０度のところに大変少量の光しか散乱されないこと、 大部分の散乱光は低角度のところに進むことを示している。このことによって、 これらの大型の粒子は、相対的には少量であるものの、低角度の散乱光を検知す る検出器に対して大きなノイズをもたらすであろう。

従って、これらの標準的な光検出器と、フローセルの散乱部位に入って来る生体 タンパクや他の小型の物質の分子量を測定するシステムについて、新しいデザイ ンのニーズがあった。

発明の要約 本発明の示すところによる、アーク光源、好ましくは水銀アーク、フィルター、 フローセル、ＬＣカラム、ＵＶ検出器、広角度散乱光検出器、入射光検出器、Ｕ Ｖ検出器と散乱光検出器からの信号に基ずいて分子量を計算するコンピューター からなる測定装置、アークの光源からの光はフィルターを通じて単一振動数のも のになり、好ましくは被分析物による吸収や蛍光発生の無いもので、そのバンド では、該光源について、波長に対する発生強度の特性曲線と、検出器に関してそ の波長に対する効率の特性曲線が、共に最高になるかまたはその付近であること が好ましい、この単一波長の光は選択的に垂直方向のみに偏光させる。濾光され 偏光された光は次いで光学装置で適切に集束されて、フローセルの入射窓の境界 にアークの像を結ぶ、入射光検出器はフローセル入射窓の入射光強度を適切に検 知する。

試料からの生物学的タンパクを含むＬＣカラムからの流出液は散乱光検出器を付 したフローセルの散乱部位を通過する。

散乱光の測定は、３５°から１４５＠までのいかなる角度を用いて行ってもよい が、構造の容易さから９０°が適し、散乱光検出器によって、散乱光強度が測ら れる。

ＵＶ検出器はＬＣカラムの流出液を通す独自のフローセルを有する。ＵＶ検出器 はＬＣカラムからの流出液がそのフローセルを通過する時に、生物学的諸粒子（ または他の諸分子）によるＵＶ照射の吸収の程度を検知する。このＵＶ吸収のデ ータをめるには一般的に２８０ｎ閣の波長で行う、しかし、それはまたさらに短 波長の、例えば、２００　２１４ｎｓでも行われる。必ずしも全てのタンパクが ２８０ｎ論で吸光せず、殆ど全ての関心あるタンパクは２００−２１４ｎ−で吸 光するからである。２８０ｎｍにおける吸光はタンパクの濃度に特異的であって 、ＬＣ流出液中の散乱物の重量濃度を計算するために用いられ得る。この目的の ためには、例えば、屈折率検出器のように重量濃度に対して比例したデータか信 号を与えるものであればどの様な検出器でも用いることが出来る。この濃度検出 は散乱光検出器のためのフローセルの上流部分で行うこともできるし、またその 下流部分で行うこともできるが、その結果２つの検出器の間の通過時間による物 理的遅延が生ずるので、ＵＶ検出器からのデータは散乱光検出器からのデータと 時間的に対応させる必要があるだろう、ＵＶ検出器から出た重量濃度データを散 乱光の強度データに合わせることは、コンピューターによって可能で、ＬＣカラ ムから出て来る散乱物質の平均分子量Ｍ、４を補正して計算させることができる 。この計算は式（３）を用いてなされるが、この式は前記（１）式から導いた簡 略式である。

（３）　Ｉ、／Ｉ、＝Ｂ　＊　Ｃ＊　Ｍｗここで １、／１゜は、高角度の散乱光の３５°から１４５°の間の一定の角度での散乱 光の強度の、フローセル上への入射光の強度■。に対する比率（これは光源の強 度の変化によって起こるノイズを消去する）、 Ｃは、　重量濃度、 Ｍｗは、　流出した流れの中の散乱物質の重量平均分子量で、その部分について 重量濃度Ｃが測定されたもの、 Ｂは、　各々のシステムに固有の光学的常数で、それは経済的に重量平均分子量 が既知の種々のタイプの粒子によって測定するか、トルエンの様な散乱能が解っ ている溶液を用いて測定しておくものである。

本発明の示す、他の選択としての装置に２つの出力窓を持ったフローセルがある 。単一の光源を用いる。焦点調節光学装置、散乱光検出器は前述のものと同様な 構造をとることが出来る０重量濃度データはＵＶ検出器とモノクロメータ−（単 色光分光器）、フローセル中にある第二の出力窓と各検出器の前にある２個の別 々のフィルターを用いて測定される。

モノクロメータ−（波長合わせが可能で、調和振動も通過させるフィルター）は 、アーク光源からの光を分光してＵＶｌｌ１光測定に適した波長、普通は２８０ ｎｍ近辺（或はタンパクによっては２００　２１４ｎａ＋）に同調させ、第二の 波長を約５６０ｎｍのところで通過させるが、一方は必須なものであり他方は２ 倍の調和振動である。２８０ｎｗの波長は低強度で通過させる。全てのタンパク が２８Ｏｎ鵬で吸光しないのでモノクロメータ−は全てのタンパクが吸収を行う ２００−２１４ｎｍに同調させる必要が起こることもある。４００−４２８ｎ曽 の波長はまたよく散乱を起こす、レーザーに対してアークを用いることの他の利 点は、入射光の振動数の選択同調がより容易なことである。これらの波長はフロ ーセルに入り、入射したエネルギーの大部分は散乱されずにフローセル内を直進 する。直進したエネルギーは入射窓の反対側にある窓から出て、２８０ｎｍの光 取外の全ての波長を除去するフィルターを通過する。この光はＵＶＰＭＴによっ て検知され、結果の信号はデジタル化され入射光の強度から引き算されて重量濃 度の計算に用いられる。

入射光の一部は３５°から１４５°の間の高角度に散乱される。実用上好適な散 乱光の角度は約９０°で、それは５６０ｎ園のみを通過させるフィルターを付け た光路に導かれる。

この光は散乱光検出器によって測定される。入射光の強度はまたフローセルの入 射側で測定される。この入射光強度は散乱光強度との比率をめて、フローセルに 入って来る光の強度の変動によるノイズを排除するために用いられる。それはま た透過光の強度を標準化するために光源からの光の出力変動によって起こる如何 なるノイズをも排除するために用いられる。この標準化された散乱光強度と重量 濃度を用いて平均分子量が計算される。この装置を用いると、２つのフローセル と２つの光源を用いることで、各光源からの出力が同調せず別々に変動すること によってノイズの原因を作ることを避けることが出来る。

本発明の示す実施態様の一つは入射光を分光して、重量濃度の測定に適した第一 の波長のみを用い、また散乱光検出器の感度が最高になるバンド内で第二の波長 を用いることである。一般的に、光源用として個別の波長における発光強度と、 その検出器用の波長に対する出力の強度を調節する機能がある。入射光の波長は これらの２つの機能の結果が最高になるスペクトル範囲から選定されることが好 ましい、他の非常に小さい粒子の生物学的タンパクのサンプルは分離装置を通り 分離された粒子の流れは透明部分、好ましくはフローセルを通過する。その透明 部分またはフローセルを散乱されずに透過した重量濃度を測定するために適当な 波長の光の強度は、そこで既知の関係を用いて検出され、ついで重量濃度が計算 される。また、第二の波長の光の強度が３５°−１４５°の範囲にある高角度（ 構造上の便宜さから、好ましくは９０°）で測定される。フローセルに入射する 光の強度は、ノイズを消去する目的でフローセルの入射光側で測定される、そし て散乱光と透過光の強度が標準化される。散乱光の強度と重量濃度は、前記（３ ）式に示したように予めもとめた関係を用いて散乱光を起こす粒子の平均分子量 を計算するために用いられる。

本発明の示す他の方法は、λ／４以下の大きさの関心対象である小型の粒子を、 既存の何等かの方法、例えば、液体クロマトグラフィーや毛細管電気泳動などに よって分離し；分離された微粒子の流れ、を透明な領域、好ましくはフローセル を通過せしめ、該粒子の重量濃度を計算するために用いられる全ての特性を測定 して重量濃度を計算し；その流れを第二のフローセル内に導いて既知の波長λの 入射光をその流れに与える；その流れに入射された光の強度と、散乱光の強度を ３５°から１４５°の間の一定の角度で測定し；前記の式（３）と重量濃度と、 入射光の強度に対して標準化された散乱光の強度とを用いるか、或は、散乱光と 入射光の強度を別々の信号とし取り出すかまたは手計算でめることが出来る比率 としてめて、コンビエータ−中で平均分子量を計算する０重量濃度を計算するた めに、流れを透過する光のＵＶ吸収の測定には一波長を用いることが適している 。散乱光の測定には、（入射光強度に対して標準化された）相対散乱光強度と計 算された重量濃度を用いて重量平均分子量を計算するために、他の波長が適する であろう、この方法は、ノイズを持った２つの光源が用いられ、２つの異なった 光源から発生する光の強度が同調しないときに生ずる余分なノイズを排除する。

本発明を実施するための他の方法と装置は、予めその物質についである種の事実 が解っている大型の粒子について、前記の全ての測定を行うものである。それは 、平均分子量と回転半径の間の関係がハンドブックで調べられるか或は既知であ る場合である。この糧の表は多くある。もちろんその粒子について確実なことを 知る必要があり、特に、粒子の形状、大きさ、溶媒など、その表が準拠している 特徴について知る必要がある０表は普通、Ｍ、４をｄＲｇ”の形で与えている。

ここで、Ｘはある種の力でありｄは濃度因子で表に記載されている。ＲｇのＭｗ に対する関連式ばＭ。をＲｇｚの形で表して書き換えることが出来、そして式（ １５）において結果としてＲｇ！に置換される。この書き換えられた式（１５） は、Ｐ（θ）に関する式（１１）に代入され、光散乱能Ｒと重量平均分子量Ｍ。

との間の関係を表す２次方程式が得られる。ついで、この関係（書き換えられた 式（１１））を、標準化された散乱光強度１．／Ｉ。の測定値と、それが可能な らばビリアル係数を無視したもの、またはこれらの係数の測定値のいずれかを用 いて、Ｍ、について解く、このように、その粒子に対して十分な情報量が既知で あり、前もって適切な表と適切な特徴を選択することが出来るものであれば、如 何なる大きさの粒子に対してもこれを適用することが出来る。

もちろん、大型の粒子に対して式（１１）のビリアル係数項が無視できないなら ば、Ｍｌ、ｌを解くにあたって、それらを測定し式（１１）で使わなければなら ない。

図面の簡単な説明 図１は、標準的な既存技術の低角度散乱光検出機のブロックダイアグラム（ブロ ックに切った模式図）である。

図２は、図１中の覆い（マスク）２８の正面図である。

図３は、小型粒子についての角度による散乱光強度の関係図である。

図４は、大型粒子についての角度による散乱光強度の関係図である。

図５は、本発明による、平均分子量の計算が可能な高角度散乱光検出機のブロッ クダイアグラムの一例である。

図６は、フローセルの入射窓の正面図である。

図７は、図５における、散乱物の平均分子量を計算するためのコンピューターの 制御の標準的なフローチャートの一例である。

図８は、高角度散乱光検出機について、式（３）の中の光学的常数Ｂをどの様に して実験的にめるかを描いた、標準的な実験結果のグラフである。

図９は、本発明による装置の他の実例のブロックダイアグラムの一つで、いかに して重量濃度と散乱光検出機がフローセルを共有し得るかを示している。

図１０は、諸粒子の分離にキャピラリーゾーン電気泳動を用いた場合の具体例の 図の一つである。

図１１は、単一光源、単一フローセル、単一モノクロメータ−を用いた場合の具 体例の図の一つである。

図１２は、単一光源、単一フローセルで、２つのモノクロメータ−を用いた場合 の具体例の図の一つである。

図１３は、２つのフローセルと２つの光源を用いた場合の重量平均分子量の測定 のためのプロセスの一例を示す図である。

図１４は、単一光源、単一フローセルを用いて重量平均分子量を測定するための プロセスの一例を示す。

発明の開示 図５に、本発明の内容による具体例の一つがブロックダイアダラムで示されてい る０図５は、一連のシステムの中の単なる一例を示したものであるが、このシス テムは生物学的タンパクや他の散乱される光の波長よりかなりに小さい粒径を持 った粒子の平均分子量を計算することが出来る。標準的な適用例はＬＣクロマト グラムを分析するか、ＬＣ分離カラム５２の流出液出口５０に接続した分取装置 （図示していない）を制御して、分子量に従って流出して来る粒子をそれぞれ異 なった容器中に分取するものである。このシステムは液体クロマトグラフィーの 分野の他にも他の良い適用例を有する。

例えば、図５のシステムと、ここに開示する他の全ての具体化例も、静止した液 中にある微粒子の分子量を測ることが出来る。

図５において、ポンプ５４は種々の生物学的タンパクまたは他の似通った大きさ の粒子の混合物を含むサンプルを容器または他の給源５６から揚水する。該サン プルは液体クロマトグラフィーカラム５２を通って、例えば、大きさのような特 徴によって分離される。種々の大きさをもつ粒子は異なった時間に、溶媒の流れ の中に組み込まれたＬＣカラムから、出口５０に流出して来る。

何れの特定の時間に流出して来る種々のタンパクの平均分子量を計算するために 、溶媒の流れの中に存在するそれらのタンパクの重量濃度を知る必要がある。こ れは前記式（１）を解いて確かめられる。このためには、通常の紫外線吸収検知 器５日が流出液出口に連結されているが、しかしこれは、重量濃度を導くことの 出来る信号を発信することの可能な他の如何なるタイプの検出機であってもよい 、この種の他のタイプの検出機には屈折率計が含まれる。

標準的には、このＵＶ検出器５日は、その内部をタンパク類を含んだ溶液が流れ るフローセル、紫外線光源、入射するＵＶ強度の検出器、散乱されたＵＶ強度の 検出器と他のフィルター及び／またはバッフリング（ｇｊ４節装置）、ノイズに 対する信号量を増強する光学装置を含んでいる。フローセルは基本的にガラスま たは水晶体の中を通過する導管で、入射窓があり、そこから導管内を通過する液 体に光を照らすことが出来、また少なくとも一個の出口の窓があり、散乱または 透過した光を通すことが出来る。重量濃度を測定する方法は本発明にとって決定 的なものではなく、この測定が可能などの様な方法と装置も、本発明の実施の目 的にかなうであろう。

このＵＶ検出器５８はライン６０にアナログ信号を送るが、この信号は重量濃度 と同じかまたはそれに比例的である。この信号はアナログ−デジタル変換器６２ によってデジタル信号に変換され、集中プロセスユニット（ＣＰＵ）６４にイン プットされる。、ＵＶ検出器５８を出た溶液は、ついで導管６６を通りフローセ ル６８（上から見た図で示された）に入る。フローセルには標準的な高角度散乱 光検出器７０が付けられているが、このものの構造は蛍光測定器にしばしば見ら れる光検出器の構造とよ＜ａｍしている。検出器７０はフローセル装置一式から なるが、該フローセルは入射光■。を導くために光源７２と光学的に連結してお り、また散乱光検出器７４と連結していて、それによって入射光■。に対して直 角に散乱される光１１の強度を測定する。光源７２は水銀のアークランプで、例 えば、１００ワツトのオスラムＨＢＯ１００Ｗ／２アークランプが好ましい、該 光源は多くの異なった波長を発光するが、式（１）及び（２）の検討から、分子 量を数学的に導くために、既知の単一波長を用いるべき事を銘記するべきである 。２種の波長の何れもが適しているが、それらは、４３６．　ｉ　ｎ−の緑色光 か、５４６．１ｎ■の黄緑色である。これら２種の波長は散乱光検出器７４に対 して最大の感度と、暗電流ノイズが最少になるバンド内にある。この散乱光検出 器は青−縁領域に最適化された光電子増倍管（ＰＭＴ）であることが好ましい。

他の実施の選択肢として、光源はキセノンアークかタングステンランプまたはレ ーザーであっても良いだろうが、しかし水銀アークランプはその強度が高いため に適している。入射光強度■。が大きいほど、フローセル中を通過するタン）ｉ りにそれが当たると、高角度の散乱光の強度が高まる（この関係は、タンパクの 溶液中での重量濃度Ｃが大きいほど高まるのと同じである）、入射光のほんの一 部だけが散乱され、入射光の強度が大きいと散乱光強度も高まるので、ノイズに 対する信号の強度比が良好になる。さきに示唆した形式の水銀アークランプの出 力はほぼ２０ミリワツトであり、標準的なヘリニーム・ネオン（ＨｅＮｅ）レー ザーの６３３ｎａ＋の光の出力は２−３ミリワツトである。ＨｅＮｅレーザーの 波長は、ＰＭＴが検出器７４として用いられた場合に、最大の感度を示さない、 しかしながら、雪崩型の光ダイオードは、赤色の波長に敏感なので、これをＰＭ Ｔに代替することが出来る。キセノンのアークランプは水銀アークランプの出力 の僅か１／８の出力しかないので、キセノンランプの使用は最適ではない。

さらに、両アーク光源共にレーザー光源よりは適している。

その理由はレーザー光には漣様ノイズがありそれが発光された光に０−３０Ｈｚ の振動数で重なるからである。液体クロマトグラフィーのサンプリングの速度が 大体この範囲にあるので、同じ周波の所では望ましくないノイズになる。

光源７２の発光した光は単一の振動数の光のみにするためにフィルターに通さな ければならない、フィルター７６がこの機能を果たす、他の実施方法として、同 調の可能なフィルターで、例えば、モノクロメータ−などが使用可能であるが、 しかしこの稲の装置は必要以上に高価で大型である。青−緑色に最適化したＰＭ Ｔを検出器７４に用いるならば、青−縁領域で単一波長を得る高価でないフィル ターが適している。

濾光された光は次いで光学装置７８によってフローセルの入射窓８０に焦点を結 ぶ、一般に入射窓は方形をしていて、黒いガラスまたは黒にコーチングされたガ ラスに取り囲まれている０図６はフローセルの入射窓の立面図である。入射窓８ ０は少なくとも２面を黒いガラスまたは黒にコーチングされたガラス８２と８４ に取り囲まれている。光学装置７８アーク光の像を入射窓８０境界部分に結像し 、散乱光を最少限度にする。

測定対象のタンパク類か粒子８５は、導管６６からフローセルに入り散乱部位８ ６を通過する、散乱部位は入射窓８゜から入った入射光Ｉ０に曝される。

通常、光源からの入射光のごく僅かなものもＰＭＴ７４に入らないように、そし て散乱部位にあるタンパク！Ｉ８５からの散乱光を保護するために、大きな注意 を払わなければならない、このことは、バッフリングと注意深く調整された光学 経路（図示していない）あるいは光フアイバー経路（全ては通常蛍光検出機に用 いられる構造である）が散乱を避けるために必要であることを意味する。フロー セルの黒色のガラスの部分は空気とガラス、ガラスと液体の界面で散乱された光 が内部に反射し、フローセルを出て通常の方向にあるＰＭＴ７４の方向に進み、 バックグラウンドノイズ（被測定物質外の影響）になることを防止するために役 立つ、フローセルの黒色ガラスの部分は図５と６で斜線を施した部分として示さ れている。散乱を防止するために、光源７２から入射窓８０迄と、散乱光の出口 窓９０からＰＭＴ７４迄の光路に、光ファイバーによる導光が行われ得る。光フ ァイバーの光路を入射及び出口窓に固定するための方法には屈折率が同じに調節 されたセメントを用いて行うが、こうして光ファイバーの屈折率とフローセルの ガラスの屈折率が興なることによる光の屈折や及び／または散乱を最少化する。

散乱物であるタンパクＷ８５はそれらの分子量に基ずいて入射光１．を散乱する （標準的なレーリー散乱）、この光の一部は高角度に散乱されて出口窓９０から 散乱光■１として出て来る。この光はＰＴＭ７４によって検出され、その強度に 比例する出力信号が９４のラインに出される。加えて、散乱光検出器７０は入射 光の強度■。に比例した信号をライン９６に発信する。ある具体例では単に！、 ／１．に等しい信号のみを発信する。入射光の強度１．は、それが入射窓に入っ たことが“解る”ように、光学的に連結された検出器（図示していない）によっ て測定することが好ましい、このためにはビームスプリッタ−（光束分割器）（ 図示していない）を用いて、フィルターと入射窓の間の光路で入射光の一部を割 いて１．検出器（これも図示していない）に導（か、または他の種々の方法が有 り得る。■、の強度は光源からの光がフィルターから出た後で測定する方がよい 、と言うのはＩ。

は散乱物に達する真の入射光強度だけであって、光源から出る全ての波長の光の 強度であってはならないからである。他の具体例として、ＰＴＭを冷却するもの や、光子を計測するタイプのものであっても良い。

ライン９４の散乱光強度■２の信号とライン９６の入射光強度Ｉ０の信号はアナ ログ−デジタル変換器９８と１００によってデジタル信号に変換される。

そこでＣＰＵ６４は、ライン１０２の重量濃度データをライン１０４と１０６の １０と１．のデータと相関させて、散乱物の分子量を計算する。この相関関係ま たはデータの適合は、散乱物がＵＶ検出器５８中のフローセルからフローセル６ ８に移動するための時間的遅れを計算に入れて行われる。

一旦、データが適切に相関させられると、前記（３）式を用いて散乱物の平均分 子量が計算される。

式（３）は前記の式（１）を簡略化したもので、次によって導かれる。

サンプルを照らすために用いられる光の強度１０、散乱部位の経路の長さｌ、サ ンプル内を透過して来る光の量Ｉ、の間には次の関係がある （　３）　”　＝　Ｉ＋ｅ　ｅ−’５”ｙｌｌここで、 εは、吸光係数、 Ｃは、サンプルの濃度、 Ｔは、サンプルの濁度で、これは溶液の光散乱能の指標であり、 ｌは、散乱部位の経路の長さ 光の咬収が無いと、ｅ＝Ｑで、式（３）は次のようになる。

（４）　Ｉｓ　＝Ｉｏ　ｅ−７’ エネルギー保存則によって、 （５）　Ｉｔ−１，−Ｉ。

この式の意味は、溶液の中を通過した透過光の強度は、入射光の強度から散乱光 の強度を減じたものに等しいということである。

散乱された光の強度１．は、入射光の強度に比べて相対的に極めて小さいので、 （５）と（６）を結合させて、指数関数をティラー級数に展開し最初の２項だけ を残すと、次式が得られる。

１１、！。を測定し、（６）式を用いてサンプルの濁度を測定することが出来る 。この方法は濁度測定（Ｔｕｒｂｉｄｉｓｅｔｒｉｃ）と呼ばれている。もし、 散乱光強度が測定され式（７）が用いられれば、それは比濁測定（Ｎｅｐｈｅｌ ｏｓｅｔｒｉｃ）と呼ばれている。濁度測定では、２つのＮ、と１．の）大きな 数字め間の差をめる必要がある。比濁測定では、Ｉｏは大きく、１１は量的に少 ないが、しかし小さなバックグラウンド（被測定物質外の影響）に対して測定す ることが出来る。比濁測定は、従って、通常は２種の測定法の中でより高感度で 、正確であり、有用である０両者の測定方法とも標準的な光散乱の方法論の変法 である。

一般的に散乱強度光は全ての角度で測られるわけではない。

むしろ、ある一定の角度θに散乱された光の量を入射光Ｉ０に対する相対量で測 定される。Ｉｓとｉθには次の関係があ（７）　１．−Σｉ、θ 全角度 式（８）を使って式（７）を書き換えるとγθは、角度θにおける散乱光に対応 する部分濁度である。

光吸収に関するとアーの法則との類似で、次式が得られる。

Ｃは、重量濃度 γθ、、は、比濁度、或は特異的レーリー常数と称される。

比濁度は相互作用の断面である（ある種の相互作用の生ずる確率）０本発明を実 施するには、他の如何なる角度をも用いることが出来るにかかわらず、散乱光強 度は９０°で測定される。この角度における比濁度はＴ□で記される。

比濁度は、入射光との関連において、粒子の分子的な性質と関連させることが出 来る。

ここで、各記号の意味は前述の式（１）で述べたが、比濁度Ｔθ３．はＲ／Ｃ（ レーリー散乱を重量濃度で除したもの）に比例的である。

もし比濁度γも、が測定され既知であると、式（１１）を用いて、Ｍｗ、即ち散 乱物の重量平均分子量を導くことが出来る。散乱物の該重量平均分子量Ｍ、は、 次のように定義ずけられる。

Ｃ１は、１番目の溶液成分の重量濃度、Ｍ、は、溶液のｉ成分の量 重量濃度は、全濃度ｎ、の和に等しいから、分子量は式（１２）と（１３）はＭ 、が、溶液のより重い成分に対してより重みを持って測られる事を示しているの で、γσ、。

ちまたより重量の大きい粒子によって大きく影響される。

式（１２）における光学的常数には ここで、 ｎは、　その中に散乱物が分散している溶液の屈折率、ｄ　ｎ　／　ｄ　ｃは、 溶液の濃度の変化によって起こる屈折率の変化、 Ｎ、は、　アボガドロ数、 λ、は、　入射光の波長である。

Ｋがλ、の４乗に依存する関係は、粒子の大きさがλ、７４以下の時にのみ成り 立つ、大型の粒子に対しては、波長への依存性は散乱粒子の大きさの複雑な関数 になるが、しかし、一般に散乱物が大きいほど強度依存性が小さくなる。

Ｐ（θ）はサイズパラメーターで、これは従来技術の研究者を悩ませてきた。そ の大きさがλ、７４以下の小型の粒子に対しては Ｒ９は、　散乱物の回転半径でこれは一般に大きさに支配される。

もしいくつかの散乱角におけるＴρ３．と（１５）式が使えれば、はぼ球形の粒 子は： ここで、 Ｒは、　球の半径で、これは普通、水和した散乱物或は散乱物のストークス半径 と近似させられる。

散乱角度が小さいほど、散乱物の大きさに対するＰ（θ）の依存性は弱くなる。

そこで、θが小さいとｓｉｎθ／２はゼロに近いので、ＬＡＬ検出器のような低 角度フォトメーターは、粒子サイズについて強い濁度の依存性を示さない。

しかしながら重要な事には、散乱角θの大きさに関わらず、Ｐ（θ）は半径がλ 、７２０以下の散乱物に対してはほぼ１に等しい、可視光線（４８８ｎ■）の波 長λ、７２０以下の半径を持つタンパクは約２０Ｘ１０”ダルトンの質量を持つ （ｌダルトンは物質の１グラム分子量に等しい）、一般的に生物学的に重要なタ ンパクの中で最大のものは、１．Ｍで、ｌＸｌ０”ダルトンの分子量を持つ、こ の大きさ以上のタンパク類は、臨床的にも、治療や診断のためにも用いられない 、従って、生物学的に重要な全てのタンパク類に対して、Ｐ（θ）は全ての散乱 角についてほぼ１である（これらのタンパク類の大きさでは回転半径Ｒ，は極め て小さい故に）。

もし大型の粒子に対する高角度の散乱光の検出を行おうとするならば、ある種の 形状の粒子に関して知られているＭＷとＲｇの間の関係によってＰ（θ）−１の 近似を用いることが出来る０例えば、ランダムコイル高分子については次式があ る。

（１６）　Ｍ、はｄＲ９”に比例する ここで、 ｄは、　ランダムコイル高分子についての諸表を含むハンドブックから得られる 濃度ファクターである。

この様にして、もしランダムコイル高分子のみがフローセル中の高分子であるこ とが解っているならば、式（１５）のＲ９”をＭ、／ｄで代替し、書き換えられ た式（１５）を式（１１）中でＰ（θ）−１に代替して、Ｍｗをレーリー散乱係 数Ｒ或いはＴａ２．に関連させる２次方程式を得る。

球形のタンパク類に対しては、 （１７）　Ｍ、はｄＲｗ’に比例する。

この場合、 （１８）　１６π”ｎ”（Ｍ＋、ｌ）”’ｓｉｎ”θ／２は、式（１１）に代入 して解析的に解くことが出来る。

さらに、ある場合には式（１１）の中にビリアル係数を含んだいくつかの項を保 持することが好ましいだろう、これらは、濃度Ｃに対して注意深＜１．を測り、 またＡｔＣなどによって生ずる小さい変異を探すことで、測定することが出来る 。しかし大部分の場合これは不必要である。

前記の式（１１）は、粒子間の相互作用の強さを反映する係数を有する重量濃度 のべき級数である。最初の項の係数、Ａｔは第２ビリアル係数として知られてお り、散乱物の量に比例し、その中には他の粒子は含まれない、即ち専有的な量で ある。強い溶液に対してはＡ２は小さく正符号である。溶液の強度が弱まると、 Ａ２は減少しゼロになり、次いで粒子の相互関係が起こり始めると、即ち凝集が 始まると、負の数字になる。生理学的な緩衝液中（即ち、１０腫以上の塩濃度で 、ｐＨがほぼ７である）の大部分のタンパクについては、Ａ２はほぼＯで僅かに 負である。さらに、多くのタンパクの溶解度は比較的低いので、クロマトグラフ ィーの間により高次の項が顕著になるような濃度は現れない、この種の粒子また はプロロイキンＩＬ−２（タンパクと界面活性剤の混合物）の様なタンパクでは 、式（１１）の最初の項を含めておく必要がある。しかし、はとんどの生物学的 タンパクに対しては、式（１１）は次のように簡略化される。

（１９）　ｒ　’　＊ｐ−ＫＭｗ 式（１０）をＴｅ３．について置換して、式（１９）は前記式（２）の形に書き 換えられるが、式（２）はＣＰＵ６４によって散乱物の重量平均分子量を計算す るために用いられる。

Ｂの値は本発明の実行の仕方によっていちいち異なるが、トルエンの濁度は既知 であるので、トルエンを用いた比較法で較正し、簡単に測定することが出来る。

式（３）を計算する事の出来る全ての回路や装置は本発明の実施を満足するだろ う、実際、本発明を広（解釈すると、ＣＰＵ６４や他の計算用設備は無（でもよ い、それは、分子量Ｍ、は散乱光強度と濃度から簡単に手計算することが出来る からである。

図７には、フローセル６８中の散乱物の平均分子量Ｍ。を計算するために、図５ に示したＣＰＵ６４をｖＩｍする一般的なプログラムのフローチャートを示して いる。ＣＰＵの一般的なプログラムの一つは散乱光強度と濃度Ｃの信号を常にサ ンプリングしており、最も最近時のサンプルから得られるもの、または移動する サンプルの平均としてのデータから得られる平均分子量を計算し、結果を示す、 一般的に、分子量を計算するプログラムはサブルーチン（プログラム中で繰り返 し用いられる独立命令）であり、それは、内部時計が切れるまで主制御回路から 常に呼び出されているべきである。しかし、該プログラムは、各サンプルが通過 する時に作動する主要回路として構成してもよい。

サンプル周期はクロマトグラムデータを解くために必要な解、即ち、１分間以上 の間隔内に何個のピークが予想されるか、またピーク当り何個のサンプルが必要 かなど、によって決まる。それはまた、メモリーの量及び／またはＣＰＵがデー タ保存のために用いることが出来るハードディスクの保存容量によって決まる。

プロセスの最初の段階はブロック１３０に表記される。この段階では、ＣＰＵは Ａ／Ｄ変換器６２を作動させて、ライン６０のアナログ信号（重量濃度Ｃの信号 ）をライン１０２のデジタル信号に変換し、このデータは保存される。

次いで、１３２の段階では、該Ａ／Ｄの９８と１００が作動され、入射光Ｉ０と 散乱光■、のアナログ信号のデジタル信号への変換が行われ、このデータは保存 される。

１３４０段階は、散乱光１１の強度を入射光重。の強度に対して標準化するプロ セスを表す、このプロセスは本来Ｉ。

と■。を分け、■、に対してノイズとして翻訳されてしまうＩｏの強度の変動に よるノイズを消去するためのものである。

１３６の段階は、ＢおよびＣの結果で■１を分離し式（３）を用いて、散乱物の 平均分子量を計算するプロセスを表す。

１３８の段階では、１３６の段階で計算された結果が出され、表示のために用い られるし、また判断装置などを検索するために用いられる。

１４０の判断段階とその２つの分岐では、サンプリングの比率を調節するプロセ スを示している。

図８を説明すると、そこに既知の分子量に対する散乱光の強度が図示されており 、このものは特定の光学装置においてＢの値を実験的に定めるために有益である 。Ｂを定めるには、生物学的タンパクか他の微粒子であって平均分子量が既知で あるものを特定の濃度でフローセル内を通過させる。散乱光の強度を各々のタン パクに対してめ、次いでＩ　、　／　ｃとして既知の分子量のレベルの所にプロ ットする。この関係は図８において平均分子量が既知の２つのタンパク、ＩｇＧ とＩｇＭについて行われている。この結果による直線関係から特定の光学系のＢ の値が一義的にめられる。

図６のフローセルは一般に１０μｍの体積と１０腫の経路長をもち、例えば、Ｂ Ｋ７の様な高価でないガラス製でよい。

通常は、蛍光計に用いられるような高価な水晶型のフローセルは必要が無い、蛍 光計では２００−２８０ｎ−の様な短波長の光を蛍光の発光のために必要とする から、水晶を使う必要がある。ＢＫ７０タイプのガラスは普通、３２０ｎｗ以下 の波長の光を遮断するので、蛍光検出器には用いる事が出来ない。

フローセルの入射窓と出口窓の表面を屈折率が類似するＭ　ｇ　Ｆ　ｚか、反射 防止用の多重層誘電のコーチングを施すと、有意に、信号量を増加させバックグ ラウンドや不用の迷光を減らすことが出来る。空気とガラスの界面での屈折率を 合わせることによって、光の屈折を減らしそれが見かけの散乱光の原因になるこ とを防ぐ。

最も望ましい応用は、フローセル６８はいわゆる抱合せ構造で、内部のガラス／ 水またはガラス／溶媒の界面に反射防止コーチングを施したものである。この種 のフローセルは、２枚の平たいガラスの板の片面を反射防止効果のある化学物質 を蒸着させたものによって作られる０次いで２枚の板をシーリングスペーサーを それらの間に挟んで抱合せ既知の方法でセルに作り上げる。スペーサーには入り 口と出口の穴を開け、液体がセル内を通過する様にする。生体高分子のＨＰＬＣ で通常用いられる溶媒（例えば、水、アセトニトリル、メタノールなど）の大部 分は、はぼ似通った屈折率を持つので、この屈折率を合わせた材料の内部表面コ ーチングは、界面での光の散乱による迷光を大幅に減らすことが出来る。

それが入射窓の境界面に結像するならば、できるだけ大きいアーク光＃７２を用 いる方がよい、これを行わないと、迷光が増加し、そのためにバックグラウンド ノイズが大きくなって、検出器の感度を弱めてしまう問題につながる。

好ましい具体例として、フィルター７２（用いるならば、フィルター１４２も） は水銀線形干渉フィルターにした方が、モノクロメータ−を用いるより、構造が より安価で小型になる。加えて、該フィルター７６は１４４のダッシュで示す垂 直方向の偏光装置を取り付は得る。単に垂直方向の偏光のみが散乱し得る。水平 方向の光はレーリー散乱をしないので、フローセルに到達すると、迷光になって バックグラウンドノイズを増やす恐れがある。

例えば、Ｐ、Ｅ、ネルソンによって作られた標準的なＨＰＬＣデータシステムが 、式（３）の簡単な数学機能を入れて改造できる。また別に、さらに機能を加え たり別型として、複雑な式（１１）を加えて改造し、その性質が予め知られてい る大型の粒子に対して、データを集め保存して、重量平均分子量を計算させる事 もできる。

フローセルは極端に小さい体積である事がピークの形状を良好に保つために好ま しい、ＬＣカラムから非常に狭いピークが溶出し、微細管を通ってフローセルに 入ると、フローセルの散乱部位の体積が大きい場合には、該ピークは撹拌によっ て広がってしまう、散乱部位の体積を小さく保つことで、この広がりの問題を極 小化し得る。

図５の構造に示される機械類のいくつかの具体例として、散乱光の光路に第２の フィルターを用いる。これらの具体例は出口窓９０とＰＭＴ７４の間の光路にダ ッシュで書かれたフィルター１４２で表される。このフィルターはフィルター７ ６と同じ波長に同調させられ波長の異なる他の光が迷光になってＰＭＴに入るの を防止する。蛍光計では、フィルター７６は励起用の光の波長に合わされ、フィ ルター１４２は、発光された蛍光の異なった波長に合わされている点で、異なっ ている。新型の蛍光計では両方のフィルターが、同一波長に同調しないようにな っているものもある。

迷光をさらに減少させるために、ここに開示する実行法に集積空間フィルターの 使用がある。

図９に、本発明の知見による他の高角度散乱光検出器の具体例を示す０図９の例 は、重量濃度と散乱光強度の検出器が同一のフローセルを共用することが出来る 。ポンプ５４、サンプル保持器５６、ＬＣカラム５２、光源７２、ＰＭＴ７４、 光学装置７８、ＣＰＵ６４とＡ／Ｄ変換器９８，１００゜６２は全て、図５の具 体例で示したものと同様に作動し、機能的に同等な働きのある代替物である。

図９の実例は式（４）の理論の応用と、モノクロメータ−の同調する性質を利用 するために便利である。一般的に重量濃度は短波長の、例えば、２ＢＯｎｍ付近 の、ＵＶの吸光測定によって測定される。他方、散乱光の測定は通常、ＵＶ吸光 の測定波長のほぼ２倍の長さの波長によって行なわれる。この事で、光散乱ＰＭ Ｔは、その最も鋭敏な領域（波長５６０ｎ鐙付近）で作動する。これらの２つの 波長は、モノクロメータ−１５０を入射光のフィルターとして用いて、５６０ｎ ｍの光を通過するように同調させる事によって、同一の光源７２から得ることが 出来る。２８０ｎ腸は５６０ｎｓの第２の同調波長であり、この波長の光は同じ （モノクロメータ−を通過するからである。追加として偏光装置１５２を取り付 けて、波長が５６０ｎｗと２８０ｎ園の垂直振動光以外の光を除く。この光は、 光学装置７８によってビームスプリッタ−１５３を通過し、フローセル１５６の 入射窓１５４に焦点を結ぶ。該ビームスプリッタ−は入射光の一部をＰＭＴ　１ ５７に導き、ＰＭＴはフローセルに入射する光の強度！。の測定器として作用す る。

このフローセル１５６は普通フローセル６８と同一の構造と機能を有するが、出 口窓が後者の１個に対して２個ある点で異なる。第２の出口窓１５８は、フロー セル内の散乱部位の粒子によって散乱されない光が第２の出口窓１５８を通過す る位！に開けられている。この散乱されていない光は、以後、透過光■、として 表す。

透過光■、は、通常の干渉フィルターまたは他の高価でないフィルターによって 、散乱物によって吸収されない２８０ｎｓ＋の光だけを残す、濾光された光の強 度はＰＭＴ１６２によって検知され、Ａ／Ｄ変換器６２によってデジタル信号に 変換される。そこでＣＰＵ６４は、散乱物の重量濃度を式（４）を用いて計算す る。この仕事は図７に示した構成に極めて類似するソフトウェア−の制御によっ てなされるが、前者との相違は、こちらは透過光の強度１１と入射光の強度Ｉ０ に関するデータを集め保存する段階、次いで式（４）と吸光係数と経路の長さに ついて保存された常数を用いて、重量濃度Ｃを計算する段階を含む点である。こ の様に計算された重量濃度は保存され、図７に示すプロセスと同様にして、平均 分子量Ｍ＠を計算するのに用いられる。

９０＠またはその近辺の高角度で散乱された光は出口窓１６４を出てフィルター １６６で濾光される。フィルター１６６は５６０ｎ＊の波長以外の全ての波長の 光を除く０次いで、濾光された光はＰＭＴ７４によって検知され、得られた出力 信号はＡ／Ｄ変換器１００によってデジタルデータに変換される。

Ａ／Ｄ変換器９８は入射光の一部分を変換し、■。の強度データをＣＰＵ６４に 伝える。ＣＰＵはそのデータを用いて、透過光の強度Ｉｔと散乱光の強度１．の データを標準化する。

通常、式（４）はティラー級数に展開し、その第１項または第２項までについて 重量濃度を計算することで単純化することが出来るが、これは散乱光についての 指数係数の場合と同じである。他の具体例として、（４）式の指数は、１１゜Ｉ ｏと自然対数表を用いて評価することが出来る。同じ事が平均分子量を散乱光強 度に関連ずける指数間数でも行える。

式（３）の指数式の吸光係数εは、関心をもたれている全ての生物学的タンパク に対してかなり小さいので、無視することが出来る。

図９の具体例の利点は、それがフローセルを一つ省くことが出来、そしてＣＰＵ ６４にとって、別のフローセルから得られる散乱光のデータの発生時期の前か後 で、重量濃度用のフローセルからのデータを適合させる必要が無くなる事である ０図５に示される様な実行方法の２個のフローセルでは、同一の粒子から発生す るＣとＩｓのデータが異なった時間に出現する。それはＵＶ検出器５８のフロー セルを通過した粒子がフローセル６４に到達するまでに時間差があるからである 。この事はコンビエータ−６４に、同一粒子からのＣのデータとＩｓのデータを 、両者の発生時間が異なるに関わらず、適合させる事を要求する。この関連ずけ のプロセスは図７の１３６の段階に含まれている。

前記の透過光の強度Ｉｔを用いて重量濃度を見いだす方法と装置は、もしＬＣカ ラムから出て来る粒子に対する吸光係数が既知であれば作動し易い、吸光係数ε は分子に特有の性質で、その分子が重量当りでどれだけのＵＶ光線を吸収するか を示すもので、または粒子の形が全て一種類であって、異なったタイプの形状を とっていないかを示すものである。最も普通の場合では、ＬＣカラムから出て来 る粒子の種類と質量が未知であり、吸光係数を知ることが出来ない、この様な場 合には、重量濃度のデータは既存の屈折率計を用いて導く必要がある。屈折率計 は、次の特許出願の技術によると、グラジェント溶媒構成の場合でも用いること が出来る。それは、“安定したベースラインを持った基準流液体クロマトグラフ ィーシステム”の表題で、出願番号０７／４６３，７０１　、出願口９０．１． １１．　（特許）である、これは出願番号０７／４５６．０２１　、出願口８９ ．１２．２２　（特許）を分割したものであり、さらにそれは、出願番号０７／ １５５，５９２　、出願口８８．２．１２．　（放棄）の出願特許の延長上のも のであった。またこれらに対応する全ての外国出願特許に記載の技術が用いられ る。これらを参考としてここに記す。

全ての同一の粒子がＬＣカラムから流出する場合で、しかし、形状が異なり大き さも異なるので異なった時間に流出する場合に、種々のピークについて相対重量 濃度がＵＶ検出器や蛍光検出器によって、吸光係数が解らないままで、測定され る。これは吸光係数が全ての大きさの異なる粒子について同じなので、重量濃度 は同一の関数、式（４）（ここでεはどのピークについても同一）、によって透 過光の強度に比例する。この情報は異なったピークについて相対平均分子量をめ るために用いられるが、相対平均分子量はこの状態下でのクロマトグラムの翻訳 にとって分析上有用である。

本発明による方法は、図５．９，１０．１１．１２に示す具体的実施を含む。

図１０は本発明の他の具体例の一つで、この例では既知の毛細管電気泳動構造を 用いている０毛細管電気泳動は、電荷を持ったタンパク類または他の分子が電位 差の存在下で毛細管に沿って移動する現象で、それらの持つ電荷によって移動の 距離が異なる０分子やタンパクでより多く荷電されたものは、荷電の少ないもの より、より早く移動する０反対の電荷を持つ粒子は反対側に移動する。異なった 速度と方角に移動する事によって毛細管の長さの方向に分離が生じ、また毛細管 のある位置への到達時間が異なって来る。

図１Ｏの装置には第一の容器２００と第二の容器２０２があり、その間に多数の 毛細管を融合させた毛細管２０４があって開いた両端が浸されている。一般に該 毛細管の穴は内径が２５−ｔｏｏｌｊｍである。容器の双方２００と２０２は低 導電率の水溶媒が入っている。試料はどの様な方法で毛細管２０４中に入れられ てもよく、普通は毛細管２０４の一端を容器に浸すと、数マイクロリッターの試 料が毛細管の末端に入る。該毛細管に導電性の溶媒を既知の方法（特に示さず） で満たす。電極２０８と２１０を有する電位差源２０６を容器２００と２０２に 接続させ、直流電圧を容器２００の溶媒と容器２０２の溶媒の間に掛ける。

容器２００と２０２の間の電場は荷電された被分析物質（タンパク類か他の分子 Ｗｔ）は直ちに毛細管の穴に沿って異なった速度で移動を開始する。好ましい実 施方法は、前に述べたタイプのフローセル２１２を毛細管に接続し、移動するタ ンパクや他の分子の流れをフローセル２１２を通過させる事である。

該フローセル２１２は図９に示したタイプの装置と光学的に連結されている。こ の散乱光検出器装置は（図１０中には示していない）前に述べたのと同様に作動 して、タンパクや他の分子がフローセル２１２を通って移動する時にそれらの平 均分子量を計算する。

この毛細管電気泳動分離装置の他の具体例は、第二の７０−セル２１４（破線で 示す）を毛細管２０４に接続し、タンパク類を該フローセル内を通過させるもの である。フローセル２１４は、図５における標準ＵＶ検出器５８の一部分であり 、そしてフローセル２１２は光学的に図５に示した散乱光検出器装置に接続され ている（図１０には図示していない）。

この散乱光検出器の装置は前述の通り機能する。フローセル２１２に接続した散 乱光検出器装置で発生され、標準化された散乱光強度と、フローセル２１４に付 けられたＵＶ検出器で発生された重量濃度のデータは、前述の方法で平均分子量 の計算に用いられる。

流出する分子の平均分子量は、それら分子の電荷の量によって決まる到達時間と 連動させて、粒子の分析や同定に利用される。この種の分離技術はこのタイプの 散乱光分析に好適である。その理由は、ご（少量な容量で、被分析物が高濃度で あるので散乱光の強度が高まり、カラム上での（リアルタイムの）検出が、吸光 度の測定と高角度の散乱光測定配置の双方で容易に出来るからである。

透明な毛細管を用いるいくつかの具体例に、フローセル類はこれを省き、入射光 を直接毛細管上に照らすものがある。

この方式は毛細管そのものからくる散乱でバックグラウンドノイズが大きくなる が、それでも機能し得る。

図１１には、他の“２対ｌ”方式の装置の具体例を示す、即ち、一つの光源と一 つのフローセルを用いるものである。

この具体例では、光源２５０には、波長の範囲が少なくとも２００−３０Ｏｎ− から４００−６００ｎ厘の広いバンドのスペクトルを出すものが用いられる０発 生した光２５２をモノクロメータ−２５４で濾光して、ＵＶ吸収とレーリー散乱 の測定に適した波長の光のみを残す、これには２８０ｎ−と５６０ｎ−が好適で あるが、２５６の位置で、波長が２００−２１４ｎｍの間にあるものと４００− ４２８の間にあるものも使うことが出来る。部分的に銀メッキされた鏡が入射光 の一部を反射して入射光測定のために検出器２６０に送る。この検出器はＩｏの 信号をＣＰＵ２６２に発信する。フローセル２６４は２８０と５６０ｎｍの光の 大部分を透過してフィルター２６６に送る。このフィルターは５６０ｎｍの光を 遮断し、ＰＭＴ検出器は２８０ｎｍの光の強度を検出する。一定の高角度で散乱 された光はフィルター２７０で濾光され端に５６０ｎｍの光のみが残って、ＰＭ Ｔ２７２によって検出される。ＰＭＴ２７２は散乱光の強度を表す信号Ｉ８を発 信し、ＰＭ７２６８は重量濃度を表す信号Ｃを発信する。ＰＣＵ２７４はこれら の３個の信号、１．．１．とＣを処理して、前記と同様にして重量平均分子質量 を計算する。

図１２にはさらに複雑な“２対ｌ”方式の具体例を示す。

この具体例では、単一の広域のバンドを有する光源２８０が発光した光はビーム スプリッタ−２８２で２個のビームに分けられる。第一のビームは一つ目のモノ クロメータ−で濾光されて、単一波長のビーム２８６として出て来るが、この光 はフローセル２８日中の被散乱物によってＵＶ吸収を起こすのに好適な波長を持 つ、第二のビーム２９０は鏡２９２によって反射され第二のモノクロメータ−２ ９４に入る。第二のモノクロメータ−２９４は散乱に好適な波長の光のみを残し て他の全ての波長の光を濾光する。一般的にこの波長は青−緑色のスペクトルの 範囲内にあって、光源２８０と散乱光検出器２９６の間の関連特性を示すカーブ で結果が最大になる点か、またはその近辺の波長が選ばれる。この散乱光の波長 はビーム２８６の波長と調和振動するものである必要はない。

前述の関連カーブは、光源２８０からの種々異なった波長の光の強度と散乱光検 出器２９６の効率の間の関連を示すものである。

散乱光測定のために選ばれた波長の光は鏡２９８によって反射され、さらに部分 的に銀メッキされたｌ！３００によって、再びビーム２８６に乗せられる。

複合されたビーム３０２には、部分的に銀メッキされた鏡３０６によって反射さ れて、その一部が取り出され入射光■。

の検出器３０４に入る。入射光のビーム３０８は次いでフローセル２８８にかけ られる。そこで、散乱光と透過光が検知され、重量平均分子量が検出器３０４， ２９６，３１０からの信号によって、手計算か、電子装置によるかして計算され る。フィルター３１２と３１４は、それぞれ、専用の波長が検出器２９６と３１ ０に届くことを保証している。

図１２の具体例の利点は、単一の光源が用いられるために、２つの独立した光源 からの光の強度が同調せずにランダムに変化するために起こるノイズを避けるこ とが出来る事である。

加えて、２個のモノクロメータ−を使用することで、ＵＶと散乱光の波長が別個 に取り出され、重量濃度の測定のためのＵＶ吸収に適したもの、Ｍ、の測定のた めの光散乱に適したものが得られる点である。

図１３は本発明に関わる複数のフローセル方式の具体例のフローチャートである 。３５０の段階は入射光の発光であり、３５２の段階は、この光を先に述べたよ うに光散乱に好適な波長（この波長で光源に対する検出器の効率が最大になる） に濾光するか、同調させるプロセスを表す。この３５２の段階は、広いバンド幅 を持った光源、一定波長を通すフィルター、或は同調可能なレーザー、或はモノ クロメータ−を用いて行うことが出来る。３５４の段階は付加的なもので、入射 光を偏光装置を用いて垂直方向の偏光だけを通過させる。

３５６の段階は、入射光の強度Ｉ０を検出するプロセスを象徴する。この操作は 入射光がフローセルに入る前に行われることが好ましいが、しかし“２対１”方 式でない場合には、それはまた、散乱光検出器を付けたフローセルを通過した光 の強度を測定するものであってもよい。

３５８の段階は溶液中の粒子に光をあてる段階を表す、この操作はＬＣカラムの 出口に接続したフローセル、毛細管電気泳動装置に接続したフローセル、フロー セル中または他の透明容器中に静止した溶液（ここでは迷い光が散乱光検出器に 達することが実質的に防止されている限りにおいて）、或は単に透明の毛細管電 気泳動管を用いて、行うことが出来る。

３６００段階は溶液中の粒子の重量濃度を検出する既知のプロセスを示している 。このプロセスは光散乱用のフローセルの上流または下流に接続したＵＶ検出器 中の別途のフローセルによって行なわれる。ある場合には屈折率計か蛍光計も用 いることが出来る。

・３６４の段階では散乱光の強度Ｉ３は入射光の強度■。を分割して標準化され る。

最後に、重量平均分子質量Ｍ。が式（２）を用いて３６６の段階で計算される。

図１４について述べると、ここでは単一光源と単一フローセルを用いてＭｗを測 定する方法のフローチャートを示している、３７０の段階は光源に関するプロセ スで、その発光範囲が少なくともＵＶ吸収の測定に適したある波長と光散乱に適 したある波長を出すことの出来る広いバンド幅を持ったものを表している。レー ザーは単一波長光しか出さないので、普通はこれはアーク光源でなければならな い。

３７２の段階は光源から単に２つの波長の光を選んで通過させるための濾光また は同調のプロセスを示す、この事は、図１２に示したようにビームスプリンター と２個の別個の固定されたフィルターかモノクロメータ−によって行われるし、 または図９または１１に示したように１個のモノクロメータ−によっても行うこ とが出来る。１個のモノクロメータ−の場合は、２つの波長は互いに調和振動す るものでなければならない、しかし、この濾光または同調のなされた後は、２つ の波長のうち、一方はＵＶの吸光測定に適したものでなければならず、他方は散 乱光測定に適したものでなければならない、２つの振動数は個別に同調させ得る ものであることが好ましく、散乱光の振動数は光源の波長と出力強度の関連カー ブにおいては出力が、波長と散乱光検出器の効率との関連カーブでは効率が、共 に最大かまたはその付近になるような波長に同調させる事が好ましい。

次いで、入射光の強度Ｉ０が３７４の段階で不特定な方法で測定される。

３７６の段階は、対象にする粒子に２つの振動数の光が当てられ、前に図１３の 方法の中で３５８の段階で述べた不特定な方法でそれがなされることを示す。

３７８の段階は、溶液を透過してきた２波長の光から、１波長だけを濾光するプ ロセスを示す。排除された波長は散乱光測定に用いられるものである。普通、Ｐ ＭＴを用いて透過光の強度としてＵＶ吸収を測定するが、これは３８０の段階で 示される。この信号はＩｏを用いて標準化された後、粒子の重量濃度Ｃを計算す るために用いられる。

３８２の段階は、ある高角度に対して散乱された光から、ＵＶ吸光測定のために 用いられた波長の光ｒｔを排除する濾光操作を示す。

３９０の段階は、ある特定の高角度に散乱された光の強度Ｉｓを測定するもので あり、この操作は通常、９０度でＰＭＴを用いて行われる。

３９２は、Ｉｏを分割してＩ、を標準化し、Ｃと式（３）を用いてＭ−を計算す る段階である。

本発明はここに好適な例及び代替例として具体例が開示されたが、その技術内容 が本発明の意図と領域を超えない範囲でなされ得るものであれば、他の代替的な 具体化の方法もまたそれを用い得る。これらの代替的な具体化の方法は全て以下 に付記する請求の範囲に含まれる。

先行技術 Ｓ９０ Ｉ　Ｓ／Ｃ ＦＩＧ、　９ ＦＩＧ、１０ ＦＩＧ、１１ 要　約　書 標準的なレーリー散乱を用いた高角度光散乱検出器、高出力のアークランプ光源 を、瀘高して単一波長にしてフローセルに入射させる。該フローセル中に、ＨＰ ＬＣをその他の手段によって分離した、生物学的タンパク類の様な非常に小形の 粒子を含む溶液を流す、流出する粒子の重量濃度に関するデータをＵＶ検出器が 発信し、約９０度の角度における散乱光を取り出す散乱光検出器が散乱光の信号 を発信し、また入射光の強度が測定される０次いで、平均分子量が、散乱光と入 射光のデータ、重量濃度データと、サイズファクターＰとビリアル係数が無視さ れ単純化された数学的関係とを用いてコンピューター計夏される。

悶恣麺杏鱗央 、　ＰＣＴＡＩＳ　９１／（Ｍ２１１６

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．溶液中の粒子の分子量或は質量が測定できる信号を発生させる装置において 、以下の構成による：試料の粒子を、例えば、大きさ、分子量など、何らかの特 徴に基ずいて分離し、前記の分離された粒子を含む溶液の流れを排出する方法で あって； 光源； 前記の光源からの光を、該粒子の大きさより十分に長い既知の波長の単一光のみ に限定して、濾光するフィルター；前記流液を受け入れるためのフローセルであ って、前記フィルターからの光を受けて前記流液を照らすための入射窓を有し、 前記粒子からの散乱光をほぼ９０°の角度の位置で通過させる出口窓を有し、散 乱光は前記フローセルを通過するもの； 高角度の位置で前記出口窓から出て来る前記散乱光を受け入れる散乱光検出器で あって、長高の感度が得られるバンドを有し、そのものか流記散乱光の強度に比 例した電気信号が出される検出器； 前記フローセルに照射される前記フィルターからの光の少なくとも一部分を受け 入れ、その光の強度を測定し、その強度に比例した電気信号を発信する方法；そ して、前記溶液中の前記粒子の濃度を検出し、それに比例した信号を発信する方 法 を含むもの。 ２．粒子の大きさはλ．／４に等しいか或はそれ以下に限られ、λ．は前記フロ ーセルに入射する光の波長であり、さらに、散乱光と入射光の強度と重量濃度と に対して比例する前記電気信号を受け入れ、次に示す関係式を用いて、前記粒子 の平均分子量を計算するための計算手段を有する請求項１記載の装置。 Ｉｓ／Ｉｏ＝ＢＣＭｗ ここで、 Ｉｓ／Ｉｏは、３５°から１４５°の間の高角度での散乱光の強度の入射光の強 度に対する比率 Ｂは、経験的に測定される光学的常数で、それはどの光学系に対しても、実験に よって少なくとも分子量が既知の２種のタイプの粒子について散乱光の張度を測 定して定められるもの Ｃは、溶液中の粒子の重量濃度 Ｍｗは、重量平均分子質量 ３．前記フィルターは、前記散乱光検出器からの信号出力を最大にする様な範囲 にある一つの波長を除いて、他の全ての波長の光を除去するものである請求項１ 記載の装置。 ４．さらに、垂直方向の光以外の光が前記フローセルに達しない様に偏光装置を もうける請求項１記載の装置。 ５．前記フローセルはその中を前記粒子が流れる散乱部位を有し、その体積はお よそ１０マイクロリッターである請求項１記載の装置。 ６．前記散乱光検出器は光電子増倍管である請求項１記載の装置。 ７．前記光電子倍増管は青−緑色の波長に最適化されており、前記フィルターは スペクトルの青−緑色域にある一波長以外の全ての光を濾光して除去する請求項 ６記載の装置。 ８．前記光電子倍増管は冷却される請求項６記載の装置。 ９．前記光電子倍増管は光子計数方式である請求項６記載の装置。 １０．前記光源は水銀アークランプである請求項１記載の装置。 １１．前記光源はキセノンアークランプである請求項１記載の装置。 １２．前記光源はレーザーである請求項１記載の装置。 １３．前記レーザーは青−緑色の光を発する請求項１２記載の装置。 １４．液体クロマトグラフィーカラムから流出する生物学的タンパク類の分子量 を測定する装置であって、以下によって構成される： 水銀アークランプ光源は、波長に対して発光される光の強度が変化する特性値曲 線を有し； 体積がおよそ１０マイクロリッター程度の小容積のガラス製フローセルを有し、 フローセルは、前記カラムから流出する溶液の屈折率に対する前記ガラスの屈折 率に大略合致する屈折率を持った材料で被覆され、前記液体クロマトグラフィー カラムから出る液体と連絡し、また前記光源からの光が、生物学的タンパク類を 含む前記流路内にある液体を照らすための開口部としての照射窓を有し、前記生 物学的タンパク類によって散乱された散乱光が高角度の位置でフローセルから出 るための開口部としての出口窓を有し、前記入射窓及び出口窓は空気の屈折率に 対する前記ガラスの屈折率と大略合致する屈折率を持った材料で光学的に被覆さ れ；前記光源と前記入射窓との間にフィルターを介在させて選定された一波長の 光以外の全ての光を濾光して実質的に除去し； 前記光源の光を前記入射窓の上に焦点を合わせて結像させる事により散乱光を極 小化するための光学的手段を有し；光電子倍増管光検知器であって、出力信号の 強度に関連した特性値曲線を有し、その信号によって光の波長が検知されるもの を，前記生物学的タンパク類によって散乱された光が前記出口窓から出て来る位 置に配置し、該光検知器に前記散乱光の強度に比例する信号を発信させ、そして 、そこでは前記フィルターによって、前記アークランプと前記光電子倍増管の前 記特性値曲線が最大の値になるかまたはその近辺である一定波長以外の光を全て 濾光して除去し；前記液体クロマトグラフィーカラムから出る液体の流れと連絡 して濃度検知の手段があり、該検知器は前記生物学的タンパク類について前記生 物学的タンパク頬の重量濃度を検知し前記重量濃度に比例する信号を発信し；前 記散乱光強度と前記重量濃度に比例する前記信号を受けて、前記生物学的タンパ ク類の前記分子量を、次の関係式に基ずいて計算する手段を有する、 Ｉｓ／Ｉｏ＝ＣＢＭｗ ここで、 Ｍｗは、散乱光を起こす生物学的タンパク類の重量平均分子質量 Ｉｓ／Ｉｏは、散乱光の強度 Ｂは、経験的に測定される常数で、システムの光学的作業に支配され、少なくと も２種の分子量既知の異なった生物学的タンパクを前記液体クロマトグラフィー カラムに入れ、各々の分子量既知のものから得られる散乱光の強度を測定し、該 生物学的タンパクの既知の重量平均分子質量に対する結果として得られる（Ｉｓ ／Ｉｏ，Ｍｗ）を、直線相関としてプロットして求められる。 １５．溶液中の粒子の平均分子量を測定する方法であって、以下の構成による： 散乱光検出器に最大の信号を発信させる選択した第一の波長を持った入射光を発 信し； 前記入射光を前記粒子を含む溶液に導き；ＵＶ吸収の測定に適した第二の波長を 持った入射用の放射を起こし； 前記の第二の波長を持つ該入射用放射光を前記粒子を含む溶液に導き； 高角度での散乱光の強度を前記の第一の波長について測定し、また前記溶液に入 る入射光の強度を、前記の第一の波長について測定し； 前記溶液通過した透過光の強度を前記の第二の波長について測定し、前記溶液に 入る入射光の強度を前記の第二の波長について測定し； 前記粒子の重量濃度を、事前に求めた相関によって、前記の第二の波長に関する 該入射光強度と前記透過光強度の数値とを用いて計算し； 前記溶液中の前記粒子の重量平均分子量を、第一の波長において測定した前記入 射及び反射光の強度に関する数値と、前記粒子の重量濃度の計算値を用い、事前 に求められた重量平均分子量と散乱光の強度との相関関係を用いて計算する。 １６．溶液中の小形の粒子の平均分子量を測定する方法であって、以下の構成に よる： 溶媒中の前記粒子を分離し； 前記溶媒を前記粒子の重量濃度を測定することの出来る検出器を通過せしめ、前 記重量濃度を測定し、該重量濃度を表す信号を発信せしめ； 前記溶媒流をフローセル中を通過せしめ；一つの波長λを持つ光を前記フローセ ルを通過する前記溶媒の流れに照射し、ここでλは少なくとも前記粒子の大きさ の４倍以上の長さであり； 散乱光の強度を３５°から１４５°の間で選んだ一定の角度で測定し； 前記フローセルに入射する光の強度を測定し；前記散乱光強度を前記入射光強度 で除し；平均分子量を次の関係式によって計算するが、Ｉｓ／Ｉｏ＝ＢＣＭｗ Ｉｓ／Ｉｏは、選定された角度における散乱光の強度；Ｃは、前記溶媒中の前記 粒子の重量濃度；Ｍｗは、前記粒子の平均分子量； Ｂは、各々のシステムについて経験的に測定される常数で、トルエンを用いて該 システムを較正するか、または平均分子量が既知である少なくとも２つの粒子の サンプルについて相対的な散乱光の強度を測定して求める。 １７．前記粒子の分離の段階は、前記粒子を含む溶液を液体クロマトグラフィー カラム内を通過せしめる段階を含む請求項１６記載の方法。 １８．前記粒子の分離の段階は、前記粒子を含む溶液を毛細管電気泳動装置中で 分離する段階を含む請求項１６記載の方法。 １９．一つの波長の光を前記溶媒流に照らす段階は、アークランプを用いて発光 し、該出力光から一波長λのみを残して濾光し、その濾光された光を前記溶媒流 上に焦点を合わせる段階を含む請求項１６記載の方法。 ２０．散乱光の強度を測定する段階は、波長に対する感度特性曲線を有する光電 子倍増管を用いて散乱光を検出する段階、その段階では前記のアークランプは波 長に対する発光強度の出力特性曲線を有し、また前記出力光を濾光する前記段階 は、前記アークランプの特性曲線と前記光電子倍増管の特性曲線の結果が最大に なる波長か、またはその付近にある波長を除いて、その地の全ての光を実質的に 除く濾光の段階を含む請求項１９記載の方法。 ２１．それによって溶液中の粒子の平均分子量を計算される信号を発信する装置 であって、以下の構成による：溶液内の粒子に単一波長の光を照らす手段を有し ；前記粒子からの散乱光を３５°から１４５°迄の範囲で選定された角度で測定 する手段を有し、前記散乱光強度は前記粒子に入射する光の強度と対比させて測 定され、前記相対散乱光強度として表された信号を発信し；溶液中の前記粒子重 量濃度を測定し、その測定値を表す信号を発信する手段を有する。 ２２．前記の光を照らす手段は波長に対する発光強度の出力特性曲線を有する水 銀アークランプとフィルターを有し、また前記散乱光の強度を測定するための前 記手段として、波長に対する出力信号の強度の特性曲線を有する光電子倍増管を 含み、さらに前記フィルターは前記２種の特性面線の結果が最大になる波長か、 またはその付近にある波長を除いて、その他の全ての光を除去する請求項２１記 載の装置。 ２３．重量濃度と散乱光濃度を示す前記信号を受け入れ、重量平均分子量を次の 関係式を用いて計算するための手段を有する請求項２１記載の装置。 （１）ＫＣ／Ｒ＝（Ｉ／ＭｗＰ（θ））＋２ＡｚＣ＋３Ａ３Ｃ２ここで、 Ｋは、波長、溶液の屈折率と、溶液の屈折率の（他の因子中で）時間的変化に関 連する光学的常数であって、重量平均分子量が既知である少なくとも２つのタイ プの粒子を用いて較正することによって、選ばれたどのシステムについても経験 的に求めることが出来； Ｒは、特異的レーリー常数 Ｍｗは、散乱粒子の重量平均分子質量 Ｐ（θ）は、サイズファクター（形状変数）で粒子間の多重散乱についての関係 を補正するものＡ２とＡ３は、それぞれ、第二第三ビリアル係数であり、Ｃは、 散乱粒子の重量濃度であり、 さらに、ここで、 （２）Ｐ（θ）−１＝１＋（１６π■ｎ■Ｒ■■ｓｉｎ■θ／２／３λ．２）こ こで、 Ｐ（θ）−１は、サイズファクターの逆数、ｎは、屈折率、 Ｒ９は、散乱粒子の回転半径、 θは、入射光と散乱光の間の角度で、 λは、入射光の波長で、ここではＲ９はλ．／４以下の大きさの小形の粒子に対 しては実質的にゼロであり、この事は関心の対象になる殆ど全ての生体タンパク 類に適用される。 またここで、そのものに関して十分な情報があり、Ｒ９とＭｗとの関連が表示さ れている様な、さらに大型の粒子については、式（２）中のＲ９を置換してそれ と同等な値をもつＭｗの表現に変え、書き換えられた（２）式をＰ（θ）につい て式（１）に代入して、デジタルコンピューターを用いて自動的にＭｗの解を求 める。