JPH0843390A - 免疫測定方法及びその装置 - Google Patents
免疫測定方法及びその装置Info
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- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
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- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 免疫複合体の吸収測定により、螢光イムノア
ッセイや発光イムノアッセイより手軽に免疫物質を定性
又はさらに定量までもできるようにする。 【構成】 全反射セル２はその少なくとも１つの面が全
反射プリズム４となっている。全反射セル２に金コロイ
ドに抗体が吸着された金コロイド標識抗体６を含む混合
液８を入れておき、それにその抗体と抗原抗体反応を起
こす抗原１０を含む試料混合液１２を添加して金コロイ
ド標識免疫複合体１４を生成させる。入射光学系１６か
ら全反射プリズム４に対し全反射が起こる入射角θで測
定光を入射させ、全反射プリズム４からの出射光を測定
光学系１８で受光することにより、金コロイド標識免疫
複合体１４による吸収を測定して試料混合液１２中の抗
原１０の定性及び定量を行なう。
ッセイや発光イムノアッセイより手軽に免疫物質を定性
又はさらに定量までもできるようにする。 【構成】 全反射セル２はその少なくとも１つの面が全
反射プリズム４となっている。全反射セル２に金コロイ
ドに抗体が吸着された金コロイド標識抗体６を含む混合
液８を入れておき、それにその抗体と抗原抗体反応を起
こす抗原１０を含む試料混合液１２を添加して金コロイ
ド標識免疫複合体１４を生成させる。入射光学系１６か
ら全反射プリズム４に対し全反射が起こる入射角θで測
定光を入射させ、全反射プリズム４からの出射光を測定
光学系１８で受光することにより、金コロイド標識免疫
複合体１４による吸収を測定して試料混合液１２中の抗
原１０の定性及び定量を行なう。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は臨床検査、生化学試料計
測、医薬品の品質管理などの分野において、測定対象物
質を免疫学的方法により分析する方法と装置に関するも
のである。
測、医薬品の品質管理などの分野において、測定対象物
質を免疫学的方法により分析する方法と装置に関するも
のである。
【０００２】
【従来の技術】抗原抗体反応を用いた免疫学的分析方法
には螢光イムノアッセイや発光イムノアッセイがある。
それらの方法では抗体に対し、螢光物質や化学発光性物
質で標識した抗原と、測定対象物質である抗原を競合し
て反応させ、抗原抗体反応による分子複合体である免疫
複合体を生成させ、その標識からの螢光や発光を測定す
ることによって目的対象物質の定量分析を行なってい
る。
には螢光イムノアッセイや発光イムノアッセイがある。
それらの方法では抗体に対し、螢光物質や化学発光性物
質で標識した抗原と、測定対象物質である抗原を競合し
て反応させ、抗原抗体反応による分子複合体である免疫
複合体を生成させ、その標識からの螢光や発光を測定す
ることによって目的対象物質の定量分析を行なってい
る。
【０００３】螢光や発光を利用しない光学的測定方法と
しては、抗体又は抗原に測定対象物質の抗原又は抗体を
添加し、抗原抗体反応によって生成した免疫複合体によ
る光の吸収や散乱を測定することによって定量分析する
方法が知られている。光散乱現象を用いた定量分析法に
はタービディメトリー（比濁法）とネフェロメトリー
（比朧法）があり、前者は吸収と散乱によって減衰した
透過光を測定するのに対し、後者は散乱光強度を測定す
る。光散乱による方法は、測定される粒子の大きさに応
じてレーリー（Rayleigh）散乱又はミー（Mie）散乱を
測定する。
しては、抗体又は抗原に測定対象物質の抗原又は抗体を
添加し、抗原抗体反応によって生成した免疫複合体によ
る光の吸収や散乱を測定することによって定量分析する
方法が知られている。光散乱現象を用いた定量分析法に
はタービディメトリー（比濁法）とネフェロメトリー
（比朧法）があり、前者は吸収と散乱によって減衰した
透過光を測定するのに対し、後者は散乱光強度を測定す
る。光散乱による方法は、測定される粒子の大きさに応
じてレーリー（Rayleigh）散乱又はミー（Mie）散乱を
測定する。
【０００４】全反射セルを用いた免疫測定装置として螢
光イムノアッセイに属する螢光免疫測定装置が提案され
ている（特開平５−２０３５７４号公報参照）。その螢
光免疫測定では、全反射プリズムの表面に抗体を固定し
ておき、その抗体に試料中の抗原を抗原抗体反応により
結合させ、さらにその抗原に螢光物質で標識された抗体
を抗原抗体反応により結合させる。その後、螢光物質で
標識された未反応の抗体を除去するＢ／Ｆ分離を行なっ
た後、全反射プリズムに励起光を入射させて全反射プリ
ズム表面に拘束されている抗原抗体免疫複合体を標識し
ている螢光物質を励起し、その螢光物質から発生する螢
光を測定する。
光イムノアッセイに属する螢光免疫測定装置が提案され
ている（特開平５−２０３５７４号公報参照）。その螢
光免疫測定では、全反射プリズムの表面に抗体を固定し
ておき、その抗体に試料中の抗原を抗原抗体反応により
結合させ、さらにその抗原に螢光物質で標識された抗体
を抗原抗体反応により結合させる。その後、螢光物質で
標識された未反応の抗体を除去するＢ／Ｆ分離を行なっ
た後、全反射プリズムに励起光を入射させて全反射プリ
ズム表面に拘束されている抗原抗体免疫複合体を標識し
ている螢光物質を励起し、その螢光物質から発生する螢
光を測定する。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】光散乱を利用した方法
は均一系（ホモジニアス）イムノアッセイであるので、
Ｂ／Ｆ分離操作や洗浄操作が不要で、簡便な方法であ
る。しかし、レーリー散乱やミー散乱を利用した方法は
低濃度物質では検出感度や測定精度が低いという問題が
ある。
は均一系（ホモジニアス）イムノアッセイであるので、
Ｂ／Ｆ分離操作や洗浄操作が不要で、簡便な方法であ
る。しかし、レーリー散乱やミー散乱を利用した方法は
低濃度物質では検出感度や測定精度が低いという問題が
ある。
【０００６】螢光イムノアッセイや発光イムノアッセイ
では抗原又は抗体を螢光物質や化学発光性物質で標識化
するための煩わしい化学処理操作が必要である。また、
殆どが不均一系（ヘテロジニアス）イムノアッセイであ
る。不均一系イムノアッセイでは抗原抗体反応をした免
疫複合体（Ｂ）と、抗原抗体反応をしなかった抗原や抗
体（Ｆ）とを分離するＢ／Ｆ分離操作と洗浄操作が必須
であり、分析操作の工数が多くなる。
では抗原又は抗体を螢光物質や化学発光性物質で標識化
するための煩わしい化学処理操作が必要である。また、
殆どが不均一系（ヘテロジニアス）イムノアッセイであ
る。不均一系イムノアッセイでは抗原抗体反応をした免
疫複合体（Ｂ）と、抗原抗体反応をしなかった抗原や抗
体（Ｆ）とを分離するＢ／Ｆ分離操作と洗浄操作が必須
であり、分析操作の工数が多くなる。
【０００７】本発明者らは免疫複合体の吸収測定により
免疫複合体の定性分析と定量分析を行なうことを目的と
して研究を進めた結果、免疫複合体自体では測定に適す
る感度をもつ吸収は得られないが、免疫複合体を貴金属
コロイド粒子に吸着させた状態にすると免疫複合体の吸
収が良好な感度をもって測定しうることを見出した。本
発明は免疫複合体の吸収測定により、螢光イムノアッセ
イや発光イムノアッセイより手軽に免疫物質を定性又は
さらに定量までもできるようにすることを目的とするも
のである。
免疫複合体の定性分析と定量分析を行なうことを目的と
して研究を進めた結果、免疫複合体自体では測定に適す
る感度をもつ吸収は得られないが、免疫複合体を貴金属
コロイド粒子に吸着させた状態にすると免疫複合体の吸
収が良好な感度をもって測定しうることを見出した。本
発明は免疫複合体の吸収測定により、螢光イムノアッセ
イや発光イムノアッセイより手軽に免疫物質を定性又は
さらに定量までもできるようにすることを目的とするも
のである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明では貴金属コロイ
ド粒子により標識された抗体又は抗原を用意し、それに
試料を添加して試料中に含まれる抗原又は抗体と標識さ
れた抗体又は抗原とを反応させて貴金属コロイド標識免
疫複合体を形成させるとともに、少なくとも１つの面が
全反射プリズムになっているセルにおいてその全反射プ
リズムに可視から赤外の間の波長の測定光を入射させて
全反射させ、その全反射プリズムと貴金属コロイド標識
免疫複合体を含む試料混合液との界面で生じる測定光の
吸収を測定することにより、試料中の抗原又は抗体の定
性又はさらに定量を行なう。貴金属コロイドとしては
金、銀、銅などのコロイドを用いることができ、その粒
径は５〜５０ｎｍが適当である。
ド粒子により標識された抗体又は抗原を用意し、それに
試料を添加して試料中に含まれる抗原又は抗体と標識さ
れた抗体又は抗原とを反応させて貴金属コロイド標識免
疫複合体を形成させるとともに、少なくとも１つの面が
全反射プリズムになっているセルにおいてその全反射プ
リズムに可視から赤外の間の波長の測定光を入射させて
全反射させ、その全反射プリズムと貴金属コロイド標識
免疫複合体を含む試料混合液との界面で生じる測定光の
吸収を測定することにより、試料中の抗原又は抗体の定
性又はさらに定量を行なう。貴金属コロイドとしては
金、銀、銅などのコロイドを用いることができ、その粒
径は５〜５０ｎｍが適当である。
【０００９】本発明では貴金属コロイド標識免疫複合体
を貴金属コロイドに標識された抗体又は抗原や試料中の
抗原又は抗体で未反応のものから分離しなくても測定光
による吸収測定を行なうことができ、ホモジーニアスイ
ムノアッセイ分析を実現することができる。
を貴金属コロイドに標識された抗体又は抗原や試料中の
抗原又は抗体で未反応のものから分離しなくても測定光
による吸収測定を行なうことができ、ホモジーニアスイ
ムノアッセイ分析を実現することができる。
【００１０】本発明の免疫測定装置は上記の方法を実現
するためのものであり、貴金属コロイドで標識された免
疫複合体を含む試料混合液が入る空間を形成する壁面の
少なくとも１つがその試料混合液の屈折率より大きい屈
折率をもつ材質からなる全反射プリズムとなっている全
反射セルと、その全反射プリズムに可視から赤外の間の
波長の測定光を全反射が起こる入射角で入射させる入射
光学系と、その全反射プリズムからの出射光を受光し、
吸光度を測定する測定光学系とを備えている。
するためのものであり、貴金属コロイドで標識された免
疫複合体を含む試料混合液が入る空間を形成する壁面の
少なくとも１つがその試料混合液の屈折率より大きい屈
折率をもつ材質からなる全反射プリズムとなっている全
反射セルと、その全反射プリズムに可視から赤外の間の
波長の測定光を全反射が起こる入射角で入射させる入射
光学系と、その全反射プリズムからの出射光を受光し、
吸光度を測定する測定光学系とを備えている。
【００１１】全反射セルの形式としては、そのセル内で
抗原抗体反応を起こさせて貴金属コロイド標識免疫複合
体を生成させたり、または他の容器で抗原抗体反応を起
こさせて貴金属コロイド標識免疫複合体を生成させた後
にその貴金属コロイド標識免疫複合体を含む試料混合液
を入れるための１つの開口のみを有するセルや、液流入
口と液流出口を有し、貴金属コロイド標識免疫複合体が
形成された後の試料混合液が流されるフローセルとする
ことができる。
抗原抗体反応を起こさせて貴金属コロイド標識免疫複合
体を生成させたり、または他の容器で抗原抗体反応を起
こさせて貴金属コロイド標識免疫複合体を生成させた後
にその貴金属コロイド標識免疫複合体を含む試料混合液
を入れるための１つの開口のみを有するセルや、液流入
口と液流出口を有し、貴金属コロイド標識免疫複合体が
形成された後の試料混合液が流されるフローセルとする
ことができる。
【００１２】入射光学系に含まれる光源としては、連続
した波長の光を発生する光源、又は単一波長光を発生す
るレーザ装置などの単波長光源を用いることができる。
光源が連続波長光を発生するものである場合は入射光学
系又は測定光学系に分光装置を含めることが必要になる
が、スペクトル測定を行なうことができる。また、光源
が単波長光源の場合には分光装置は不要になり、光源の
単波長のみでの吸収測定がなされる。
した波長の光を発生する光源、又は単一波長光を発生す
るレーザ装置などの単波長光源を用いることができる。
光源が連続波長光を発生するものである場合は入射光学
系又は測定光学系に分光装置を含めることが必要になる
が、スペクトル測定を行なうことができる。また、光源
が単波長光源の場合には分光装置は不要になり、光源の
単波長のみでの吸収測定がなされる。
【００１３】図１は本発明の一態様を概略的に表わした
ものである。全反射セル２の少なくとも１つの面が全反
射プリズム４となっている。その全反射セル２に貴金属
コロイドの一例としての金コロイドに抗体が吸着された
金コロイド標識抗体６を含む混合液８を入れておき、そ
れにその抗体と抗原抗体反応を起こす抗原１０を含む試
料混合液１２を添加すると、全反射セル２の混合液中で
は抗体６と抗原１０が抗原抗体反応を起こして金コロイ
ド標識免疫複合体１４を生成する。入射光学系１６から
全反射プリズム４に対し全反射が起こる入射角θで測定
光を入射させると、測定光は全反射プリズム４中を全反
射しながら透過し、その際全反射プリズム４と混合液８
の界面で測定光が混合液側にわずかにしみ出し、混合液
８での金コロイド標識免疫複合体１４による吸収を受け
る。全反射プリズム４からの出射光を測定光学系１８で
受光し、その吸光度を測定することによって、試料混合
液１２中の抗原１０の定性及び定量を行なうことができ
る。
ものである。全反射セル２の少なくとも１つの面が全反
射プリズム４となっている。その全反射セル２に貴金属
コロイドの一例としての金コロイドに抗体が吸着された
金コロイド標識抗体６を含む混合液８を入れておき、そ
れにその抗体と抗原抗体反応を起こす抗原１０を含む試
料混合液１２を添加すると、全反射セル２の混合液中で
は抗体６と抗原１０が抗原抗体反応を起こして金コロイ
ド標識免疫複合体１４を生成する。入射光学系１６から
全反射プリズム４に対し全反射が起こる入射角θで測定
光を入射させると、測定光は全反射プリズム４中を全反
射しながら透過し、その際全反射プリズム４と混合液８
の界面で測定光が混合液側にわずかにしみ出し、混合液
８での金コロイド標識免疫複合体１４による吸収を受け
る。全反射プリズム４からの出射光を測定光学系１８で
受光し、その吸光度を測定することによって、試料混合
液１２中の抗原１０の定性及び定量を行なうことができ
る。
【００１４】全反射セル２中の混合液８に貴金属コロイ
ドで標識された抗体又は抗原のみが存在する場合には測
定に適する感度をもつ吸収はみられず、また免疫複合体
であっても貴金属コロイドで標識されていない場合にも
測定に適する感度をもつ吸収はみられない。貴金属コロ
イドで標識された免疫複合体が存在する場合にのみ、特
定の波長で、測定に適する感度をもつ吸収がみられる。
この点に本発明の特徴があり、これによりホモジーニア
スイムノアッセイ分析が可能になる。
ドで標識された抗体又は抗原のみが存在する場合には測
定に適する感度をもつ吸収はみられず、また免疫複合体
であっても貴金属コロイドで標識されていない場合にも
測定に適する感度をもつ吸収はみられない。貴金属コロ
イドで標識された免疫複合体が存在する場合にのみ、特
定の波長で、測定に適する感度をもつ吸収がみられる。
この点に本発明の特徴があり、これによりホモジーニア
スイムノアッセイ分析が可能になる。
【００１５】免疫複合体を含む試料混合液の屈折率をｎ
2とし、全反射プリズムの屈折率をｎ1（ｎ2＜ｎ1）とし
たとき、全反射が起こる臨界角θｃは、 θｃ＝sin-1(ｎ2／ｎ1) により表わされる。入射光学系から全反射プリズムに測
定光を入射させるときの、全反射プリズムと試料混合液
との界面への入射角θ（図１参照）は、 θ＞θｃ の条件に設定される。
2とし、全反射プリズムの屈折率をｎ1（ｎ2＜ｎ1）とし
たとき、全反射が起こる臨界角θｃは、 θｃ＝sin-1(ｎ2／ｎ1) により表わされる。入射光学系から全反射プリズムに測
定光を入射させるときの、全反射プリズムと試料混合液
との界面への入射角θ（図１参照）は、 θ＞θｃ の条件に設定される。
【００１６】ホモジーニアスイムノアッセイ分析を行な
うときには、吸収測定がなされる試料混合液は、貴金属
コロイド標識抗体（又は抗原）、貴金属コロイド標識免
疫複合体、反応していない抗原（又は抗体）及び生体高
分子などを含む混合液である。
うときには、吸収測定がなされる試料混合液は、貴金属
コロイド標識抗体（又は抗原）、貴金属コロイド標識免
疫複合体、反応していない抗原（又は抗体）及び生体高
分子などを含む混合液である。
【００１７】全反射プリズムの材質としては、ＺｎＳ
ｅ、Ｇｅ、Ｓｉ、Ａｌ2Ｏ3又はＭｇＯなどを用いること
ができる。全反射プリズムのみがそのような材質であっ
てもよく、その全反射プリズムを含む全反射セルの壁面
全体がそのような材質で構成されていてもよい。測定光
は可視、近赤外、中赤外及び遠赤外の間の領域におい
て、適当な領域の連続した波長光を含むものや、単波長
の光である。そのような領域の波長を発生する光源とし
ては、蛍光ランプ、キセノンランプ、黒体放射源、気体
レーザ、固体レーザ、半導体レーザなどを用いることが
できる。
ｅ、Ｇｅ、Ｓｉ、Ａｌ2Ｏ3又はＭｇＯなどを用いること
ができる。全反射プリズムのみがそのような材質であっ
てもよく、その全反射プリズムを含む全反射セルの壁面
全体がそのような材質で構成されていてもよい。測定光
は可視、近赤外、中赤外及び遠赤外の間の領域におい
て、適当な領域の連続した波長光を含むものや、単波長
の光である。そのような領域の波長を発生する光源とし
ては、蛍光ランプ、キセノンランプ、黒体放射源、気体
レーザ、固体レーザ、半導体レーザなどを用いることが
できる。
【００１８】全反射プリズムにおける吸収は、吸光度Ａ
で表わすと、 Ａ＝Ｎ・α・ｄｅ・logｅ と表わされる。Ｎは全反射プリズムにおける全反射回
数、αは試料混合液の吸収係数、ｄｅは１回の全反射に
おいて測定光が試料混合液中にしみ出す光路長である。
で表わすと、 Ａ＝Ｎ・α・ｄｅ・logｅ と表わされる。Ｎは全反射プリズムにおける全反射回
数、αは試料混合液の吸収係数、ｄｅは１回の全反射に
おいて測定光が試料混合液中にしみ出す光路長である。
【００１９】
【実施例】図２は一実施例の測定装置を概略的に表わし
たものである。入射光学系１６は測定光を発生する光源
１６ａとビーム調整光学系１６ｂを含んでいる。ビーム
調整光学系１６ｂは光源１６ａからの光を平行光とする
光学系、測定光２０ｓと対照光２０ｒに分離するビーム
スプリッタ、及び測定光２０ｓを全反射セル２での全反
射プリズムに全反射が起こる入射角で入射させる光学系
を含んでいる。測定光２０ｓの光路上には、全反射セル
２の全反射プリズム内を全反射して透過してきた測定光
の光束を調整する光学系２２と、その光学系２２により
調整された測定光を受光して分光する分光装置２３が配
置されており、分光された測定光が検出部２６に導かれ
て検出される。一方、測定光の変動を補正するための対
照光２０ｒの光路上には対照光２０ｒの光束を調整する
光学系２４が配置されており、調整された対照光２０ｒ
が検出部２６に導かれて検出される。検出部２６は測定
光２０ｓが全反射プリズムを透過し分光装置２３を経て
分光されたものを、光源強度を表す対照光２０ｒの強度
により補正して吸光度を算出するように構成されてい
る。２８は分光装置２３での分光動作を制御し、検出部
２６での検出出力をデータ処理演算装置３０へ送るコン
トローラ装置である。３２はデータ処理演算装置３０で
の処理演算結果を出力する記録計やＣＲＴなどの出力装
置である。
たものである。入射光学系１６は測定光を発生する光源
１６ａとビーム調整光学系１６ｂを含んでいる。ビーム
調整光学系１６ｂは光源１６ａからの光を平行光とする
光学系、測定光２０ｓと対照光２０ｒに分離するビーム
スプリッタ、及び測定光２０ｓを全反射セル２での全反
射プリズムに全反射が起こる入射角で入射させる光学系
を含んでいる。測定光２０ｓの光路上には、全反射セル
２の全反射プリズム内を全反射して透過してきた測定光
の光束を調整する光学系２２と、その光学系２２により
調整された測定光を受光して分光する分光装置２３が配
置されており、分光された測定光が検出部２６に導かれ
て検出される。一方、測定光の変動を補正するための対
照光２０ｒの光路上には対照光２０ｒの光束を調整する
光学系２４が配置されており、調整された対照光２０ｒ
が検出部２６に導かれて検出される。検出部２６は測定
光２０ｓが全反射プリズムを透過し分光装置２３を経て
分光されたものを、光源強度を表す対照光２０ｒの強度
により補正して吸光度を算出するように構成されてい
る。２８は分光装置２３での分光動作を制御し、検出部
２６での検出出力をデータ処理演算装置３０へ送るコン
トローラ装置である。３２はデータ処理演算装置３０で
の処理演算結果を出力する記録計やＣＲＴなどの出力装
置である。
【００２０】光源１６ａとして赤外光源を用い、分光装
置２３としてＦＴＩＲ（フーリエ変換型赤外分光光度
計）などを用いることができる。光源１６ａとして単波
長の光を発生する単波長光源を用いる場合には分光装置
２３及びその分光動作を制御するコントローラ装置２８
は不要になる。
置２３としてＦＴＩＲ（フーリエ変換型赤外分光光度
計）などを用いることができる。光源１６ａとして単波
長の光を発生する単波長光源を用いる場合には分光装置
２３及びその分光動作を制御するコントローラ装置２８
は不要になる。
【００２１】いま、図１に示されるようなセル２を用
い、図２の測定装置で分光装置２３としてＦＴＩＲを用
い、セル２の全反射プリズム４としてＺｎＳｅ光学結晶
を用い、貴金属コロイド標識抗体６として粒径が３０ｎ
ｍの金コロイドに吸着された Anti-Mouse IgG（BioCell
社（米）の製品）を用い、その抗体を含む混合液の溶媒
として０.０１ＭのTWEEN21とＰＢＳとの混合液（ｐＨ
７.６５）を使用した。１回の測定時間を２分間とし、
その間に１０回検出を行なってその検出結果を積算し
た。分光装置での分光範囲は８００〜３２００ｃｍ
-1で、分解能は２ｃｍ-1であった。
い、図２の測定装置で分光装置２３としてＦＴＩＲを用
い、セル２の全反射プリズム４としてＺｎＳｅ光学結晶
を用い、貴金属コロイド標識抗体６として粒径が３０ｎ
ｍの金コロイドに吸着された Anti-Mouse IgG（BioCell
社（米）の製品）を用い、その抗体を含む混合液の溶媒
として０.０１ＭのTWEEN21とＰＢＳとの混合液（ｐＨ
７.６５）を使用した。１回の測定時間を２分間とし、
その間に１０回検出を行なってその検出結果を積算し
た。分光装置での分光範囲は８００〜３２００ｃｍ
-1で、分解能は２ｃｍ-1であった。
【００２２】その測定結果の全反射分光スペクトルを図
３と図４に示す。図３におけるスペクトルは上記の３
０ｎｍ金コロイド標識 Anti-Mouse IgG のみを含む混合
液のスペクトルである。大きな吸収は水の吸収であり、
それ以外に特徴的な吸収はみられない。また図４におけ
るスペクトルは、濃度２ｍｇ／ｍｌで貴金属コロイド
で標識されていないＩｇＧ免疫複合体のみを含む混合液
のスペクトルである。そのスペクトルでも水の吸収以
外には特徴的な吸収はみられない。それに対し、図３及
び図４におけるスペクトルは、上記の３０ｎｍ金コロ
イド標識 Anti-Mouse IgG 抗体７.５μｇ／ｍｌと Mous
e IgG 抗原６２.５μｇ／ｍｌとの反応により生成した
金コロイド標識免疫複合体を含む混合液のスペクトルで
あり、水の吸収以外に特徴的な吸収が見られる。
３と図４に示す。図３におけるスペクトルは上記の３
０ｎｍ金コロイド標識 Anti-Mouse IgG のみを含む混合
液のスペクトルである。大きな吸収は水の吸収であり、
それ以外に特徴的な吸収はみられない。また図４におけ
るスペクトルは、濃度２ｍｇ／ｍｌで貴金属コロイド
で標識されていないＩｇＧ免疫複合体のみを含む混合液
のスペクトルである。そのスペクトルでも水の吸収以
外には特徴的な吸収はみられない。それに対し、図３及
び図４におけるスペクトルは、上記の３０ｎｍ金コロ
イド標識 Anti-Mouse IgG 抗体７.５μｇ／ｍｌと Mous
e IgG 抗原６２.５μｇ／ｍｌとの反応により生成した
金コロイド標識免疫複合体を含む混合液のスペクトルで
あり、水の吸収以外に特徴的な吸収が見られる。
【００２３】その吸収を明らかに示すために、図３のス
ペクトルからスペクトルをバックグラウンドとして
引いたものを図５に示す。このスペクトルは３０ｎｍ金
コロイド標識 Anti-Mouse IgG 抗体７.５μｇ／ｍｌと
Mouse IgG 抗原６２.５μｇ／ｍｌとの反応により生成
した金コロイド標識免疫複合体の全反射吸収分光差スペ
クトルである。このスペクトルには２９００ｃｍ-1付近
の２８８８ｃｍ-1と２９４２ｃｍ-1、及び９００ｃｍ-1
付近から１５００ｃｍ-1の間の９９３ｃｍ-1，１０４３
ｃｍ-1及び１１１２ｃｍ-1に特徴的な吸収バンドが現れ
ており、これはＩｇＧ免疫複合体の内部振動による吸収
である。
ペクトルからスペクトルをバックグラウンドとして
引いたものを図５に示す。このスペクトルは３０ｎｍ金
コロイド標識 Anti-Mouse IgG 抗体７.５μｇ／ｍｌと
Mouse IgG 抗原６２.５μｇ／ｍｌとの反応により生成
した金コロイド標識免疫複合体の全反射吸収分光差スペ
クトルである。このスペクトルには２９００ｃｍ-1付近
の２８８８ｃｍ-1と２９４２ｃｍ-1、及び９００ｃｍ-1
付近から１５００ｃｍ-1の間の９９３ｃｍ-1，１０４３
ｃｍ-1及び１１１２ｃｍ-1に特徴的な吸収バンドが現れ
ており、これはＩｇＧ免疫複合体の内部振動による吸収
である。
【００２４】３０ｎｍ金コロイド標識 Anti-Mouse IgG
抗体７.５μｇ／ｍｌに対し、それと反応させる Mouse
IgG 抗原の濃度を変えた場合の、２９４２.５ｃｍ-1、
２８８１.１ｃｍ-1、１１１２.４ｃｍ-1、１０４３.３
ｃｍ-1及び９９３.８ｃｍ-1のそれぞれの波数での吸光
度の濃度依存性を図６から図１０にそれぞれ示す。横軸
はＩｇＧ濃度を表わし、縦軸は吸光度を表わしている。
いずれもＩｇＧの高濃度領域では飽和しているが、低濃
度領域では直線関係があり、本発明の方法により定量分
析が可能であることを示している。
抗体７.５μｇ／ｍｌに対し、それと反応させる Mouse
IgG 抗原の濃度を変えた場合の、２９４２.５ｃｍ-1、
２８８１.１ｃｍ-1、１１１２.４ｃｍ-1、１０４３.３
ｃｍ-1及び９９３.８ｃｍ-1のそれぞれの波数での吸光
度の濃度依存性を図６から図１０にそれぞれ示す。横軸
はＩｇＧ濃度を表わし、縦軸は吸光度を表わしている。
いずれもＩｇＧの高濃度領域では飽和しているが、低濃
度領域では直線関係があり、本発明の方法により定量分
析が可能であることを示している。
【００２５】図１１は１つの開口のみをもつ全反射セル
の例を表わしたものである。（Ａ）は図１に示されたセ
ル２であり、その底面が全反射プリズム４となっている
ものである。（Ｂ）は側面が全反射プリズム４となって
いるセル４０であり、（Ｂ）の左側は正面断面図を表わ
し、右側は上面図を表わしている。測定光２０ｓは水平
面内でプリズム４に入射させる。
の例を表わしたものである。（Ａ）は図１に示されたセ
ル２であり、その底面が全反射プリズム４となっている
ものである。（Ｂ）は側面が全反射プリズム４となって
いるセル４０であり、（Ｂ）の左側は正面断面図を表わ
し、右側は上面図を表わしている。測定光２０ｓは水平
面内でプリズム４に入射させる。
【００２６】図１２は他の形状のセルを表わしたもので
あり、いずれも左側は斜視図、右側は正面断面図であ
る。図１２（Ａ）は片面型の使い捨て式セルであり、試
料混合液が毛管現象で吸い上げられる程度に狭い隙間４
２が設けられており、その隙間４２に沿って全反射プリ
ズム４が形成されている。１５はその隙間に吸い上げら
れた試料混合液を表わしている。図１２（Ｂ）は両面型
全反射フローセルの例であり、試料混合液が流れる空間
を挾んで上下面に全反射プリズム４と４’が形成されて
いる。４４はセルへの試料混合液流入口、４６はセルの
試料混合液流出口である。
あり、いずれも左側は斜視図、右側は正面断面図であ
る。図１２（Ａ）は片面型の使い捨て式セルであり、試
料混合液が毛管現象で吸い上げられる程度に狭い隙間４
２が設けられており、その隙間４２に沿って全反射プリ
ズム４が形成されている。１５はその隙間に吸い上げら
れた試料混合液を表わしている。図１２（Ｂ）は両面型
全反射フローセルの例であり、試料混合液が流れる空間
を挾んで上下面に全反射プリズム４と４’が形成されて
いる。４４はセルへの試料混合液流入口、４６はセルの
試料混合液流出口である。
【００２７】図１２（Ｃ）は円柱面型全反射フローセル
の例であり、円柱状の全反射プリズム４の側面を取り囲
むようにセルが形成されており、試料混合液１５は全反
射プリズム４の円柱面に沿って流される。図１２（Ｄ）
は両面型全反射フローセルの他の例であり、全反射プリ
ズム４の対向する２つの平面の一方の平面に沿って試料
混合液１５が流入口４４から流出口４６へ流れるセル
と、他方の平面に沿って試料混合液１５が流入口４４’
から流出口４６’へ流れるセルが形成されている。図１
２（Ｅ）は片面型全反射フローセルの例であり、試料混
合液１５が流れる空間を形成する１つの面が全反射プリ
ズム４となっている。
の例であり、円柱状の全反射プリズム４の側面を取り囲
むようにセルが形成されており、試料混合液１５は全反
射プリズム４の円柱面に沿って流される。図１２（Ｄ）
は両面型全反射フローセルの他の例であり、全反射プリ
ズム４の対向する２つの平面の一方の平面に沿って試料
混合液１５が流入口４４から流出口４６へ流れるセル
と、他方の平面に沿って試料混合液１５が流入口４４’
から流出口４６’へ流れるセルが形成されている。図１
２（Ｅ）は片面型全反射フローセルの例であり、試料混
合液１５が流れる空間を形成する１つの面が全反射プリ
ズム４となっている。
【００２８】
【発明の効果】本発明では全反射セルを用いて試料混合
液中の貴金属コロイド標識免疫複合体による吸収を測定
するようにした。免疫物質の吸収は貴金属コロイドで標
識された状態の免疫複合体のみでしか測定に適する感度
の吸収は測定されず、貴金属コロイドで標識された抗体
又は抗原のみ、又は免疫複合体であっても貴金属コロイ
ドで標識されていない状態では測定に適する感度をもつ
吸収がみられないので、Ｂ／Ｆ分離を行なわなくても全
反射測定による吸収により免疫物質の定性及び定量を行
なうことができ、しかも簡単な操作、簡単な測定装置に
より免疫測定を行なうことができるようになる。
液中の貴金属コロイド標識免疫複合体による吸収を測定
するようにした。免疫物質の吸収は貴金属コロイドで標
識された状態の免疫複合体のみでしか測定に適する感度
の吸収は測定されず、貴金属コロイドで標識された抗体
又は抗原のみ、又は免疫複合体であっても貴金属コロイ
ドで標識されていない状態では測定に適する感度をもつ
吸収がみられないので、Ｂ／Ｆ分離を行なわなくても全
反射測定による吸収により免疫物質の定性及び定量を行
なうことができ、しかも簡単な操作、簡単な測定装置に
より免疫測定を行なうことができるようになる。
【図１】本発明の一態様を概略的に示す図である。
【図２】一実施例の測定装置を示すブロック図である。
【図３】本発明における金コロイド標識免疫複合体のス
ペクトルと金コロイド標識抗体のスペクトルを示す図で
ある。
ペクトルと金コロイド標識抗体のスペクトルを示す図で
ある。
【図４】本発明における金コロイド標識免疫複合体のス
ペクトルと貴金属コロイドで標識されていない免疫複合
体のスペクトルを示す図である。
ペクトルと貴金属コロイドで標識されていない免疫複合
体のスペクトルを示す図である。
【図５】図３のスペクトルを基にした本発明における金
コロイド標識免疫複合体の全反射吸収分光差スペクトル
を示す図である。
コロイド標識免疫複合体の全反射吸収分光差スペクトル
を示す図である。
【図６】本発明の免疫測定方法における抗体ＩｇＧ濃度
に対する２９４２.５ｃｍ-1での吸光度の濃度依存性を
示す図である。
に対する２９４２.５ｃｍ-1での吸光度の濃度依存性を
示す図である。
【図７】本発明の免疫測定方法における抗体ＩｇＧ濃度
に対する２８８８.１ｃｍ-1での吸光度の濃度依存性を
示す図である。
に対する２８８８.１ｃｍ-1での吸光度の濃度依存性を
示す図である。
【図８】本発明の免疫測定方法における抗体ＩｇＧ濃度
に対する１１１２.４ｃｍ-1での吸光度の濃度依存性を
示す図である。
に対する１１１２.４ｃｍ-1での吸光度の濃度依存性を
示す図である。
【図９】本発明の免疫測定方法における抗体ＩｇＧ濃度
に対する１０４３.３ｃｍ-1での吸光度の濃度依存性を
示す図である。
に対する１０４３.３ｃｍ-1での吸光度の濃度依存性を
示す図である。
【図１０】本発明の免疫測定方法における抗体ＩｇＧ濃
度に対する９９３.８ｃｍ-1での吸光度の濃度依存性を
示す図である。
度に対する９９３.８ｃｍ-1での吸光度の濃度依存性を
示す図である。
【図１１】１つの開口のみをもつ全反射セルの例を示す
図であり、（Ａ）は一例の正面断面図、（Ｂ）の左の図
は他の例の正面断面図、右の図はその平面図である。
図であり、（Ａ）は一例の正面断面図、（Ｂ）の左の図
は他の例の正面断面図、右の図はその平面図である。
【図１２】（Ａ）は使い捨て型全反射セルの例を示す
図、（Ｂ）から（Ｅ）はそれぞれ全反射フローセルの例
を示す図であり、それぞれ左側の図は斜視図、右側の図
は正面断面図である。
図、（Ｂ）から（Ｅ）はそれぞれ全反射フローセルの例
を示す図であり、それぞれ左側の図は斜視図、右側の図
は正面断面図である。
２ 全反射セル ４ 全反射プリズム ６ 貴金属コロイド標識抗体 １０ 抗原 １４ 貴金属コロイド標識免疫複合体 １６ 入射光学系 １８ 測定光学系 ２３ 分光装置
Claims (8)
- 【請求項１】 貴金属コロイド粒子により標識された抗
体又は抗原を用意し、それに試料を添加して試料中に含
まれる抗原又は抗体と前記抗体又は抗原とを反応させて
貴金属コロイド標識免疫複合体を形成させるとともに、 少なくとも１つの面が全反射プリズムになっているセル
においてその全反射プリズムに可視から赤外の間の波長
の測定光を入射させて全反射させ、その全反射プリズム
と前記標識免疫複合体を含む試料混合液との界面で生じ
る測定光の吸収を測定することを特徴とする免疫分析方
法。 - 【請求項２】 貴金属コロイドにより標識された抗体又
は抗原と反応した試料中の抗原又は抗体と、反応しなか
った抗原又は抗体とを分離せずに測定光による吸収測定
を行なうホモジーニアスイムノアッセイ分析である請求
項１に記載の免疫測定方法。 - 【請求項３】 貴金属コロイドが金、銀又は銅のコロイ
ドである請求項１又は２に記載の免疫測定方法。 - 【請求項４】 貴金属コロイドで標識された免疫複合体
を含む試料混合液が入る空間を形成する壁面の少なくと
も１つがその試料混合液の屈折率より大きい屈折率をも
つ材質からなる全反射プリズムとなっている全反射セル
と、 その全反射プリズムに可視から赤外の間の波長の測定光
を全反射が起こる入射角で入射させる入射光学系と、 その全反射プリズムからの出射光を受光し、吸光度を測
定する測定光学系とを備えたことを特徴とする免疫測定
装置。 - 【請求項５】 全反射セルは１つの開口のみを有するセ
ルである請求項４に記載の免疫測定装置。 - 【請求項６】 全反射セルは液流入口と液流出口を有
し、貴金属コロイドで標識された免疫複合体が形成され
た後の試料混合液が流されるフローセルである請求項４
に記載の免疫測定装置。 - 【請求項７】 入射光学系は連続した波長の光を発生す
る光源を含んでおり、入射光学系又は測定光学系には分
光装置を含んでスペクトル測定がなされる請求項４に記
載の免疫測定装置。 - 【請求項８】 入射光学系は単一波長光を発生する単波
長光源を含んでおり、入射光学系及び測定光学系には分
光装置を含んでおらず、光源の単波長のみでの吸収測定
がなされる請求項４に記載の免疫測定装置。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP20274094A JP3436982B2 (ja) | 1994-08-03 | 1994-08-03 | 免疫測定方法及びその装置 |
| EP96101211A EP0786665B1 (en) | 1994-08-03 | 1996-01-29 | Method and apparatus for immune analysis |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP20274094A JP3436982B2 (ja) | 1994-08-03 | 1994-08-03 | 免疫測定方法及びその装置 |
| US08/592,522 US5750410A (en) | 1994-08-26 | 1996-01-26 | Method of and apparatus for immune analysis |
| EP96101211A EP0786665B1 (en) | 1994-08-03 | 1996-01-29 | Method and apparatus for immune analysis |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0843390A true JPH0843390A (ja) | 1996-02-16 |
| JP3436982B2 JP3436982B2 (ja) | 2003-08-18 |
Family
ID=27237241
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP20274094A Expired - Fee Related JP3436982B2 (ja) | 1994-08-03 | 1994-08-03 | 免疫測定方法及びその装置 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0786665B1 (ja) |
| JP (1) | JP3436982B2 (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0786665A1 (en) * | 1994-08-03 | 1997-07-30 | Kyoto Dai-ichi Kagaku Co., Ltd. | Method and apparatus for immune analysis |
| JP2009515142A (ja) * | 2005-09-15 | 2009-04-09 | 財団法人北海道科学技術総合振興センター | 抗原を検出するための表面プラズモン共鳴バイオセンサシステ及び抗原の存在を検出するための方法 |
| JP2011505572A (ja) * | 2007-12-04 | 2011-02-24 | コーニンクレッカ フィリップス エレクトロニクス エヌ ヴィ | 標識粒子を用いた流体内分子測定方法 |
| JP2019060891A (ja) * | 2013-05-31 | 2019-04-18 | 積水メディカル株式会社 | 免疫凝集測定法 |
| JP2022503975A (ja) * | 2018-09-30 | 2022-01-12 | アジレント・テクノロジーズ・インク | 減衰全反射分光測定のための較正システム |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2009131535A1 (en) | 2008-04-23 | 2009-10-29 | Oesterlund Lars | Optical sensor unit for evanescence wave spectroscopy |
| WO2013001431A1 (en) | 2011-06-30 | 2013-01-03 | Koninklijke Philips Electronics N.V. | Multiple examinations of a sample |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4208185A (en) * | 1976-08-16 | 1980-06-17 | Mitsubishi Chemical Industries Limited | Method and apparatus for the measurement of antigens and antibodies |
| JP2591750B2 (ja) * | 1986-06-26 | 1997-03-19 | オ−ソ・ダイアグノステイツク・システムズ・インコ−ポレ−テツド | 免疫分析システム |
| FR2691546B1 (fr) * | 1992-05-19 | 1997-08-29 | Leroy Olivier | Traceurs particulaires directs, utilisation pour la mesure et le dosage d'anticorps et d'antigene. |
| JPH07146295A (ja) * | 1993-11-19 | 1995-06-06 | Kyoto Daiichi Kagaku:Kk | ラマン分光測定による免疫分析方法及び装置 |
| JP3436982B2 (ja) * | 1994-08-03 | 2003-08-18 | アークレイ株式会社 | 免疫測定方法及びその装置 |
| EP0714024B1 (en) * | 1994-11-25 | 2002-01-30 | Kyoto Dai-ichi Kagaku Co., Ltd. | Method of and apparatus for determining hydrogen peroxide |
-
1994
- 1994-08-03 JP JP20274094A patent/JP3436982B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1996
- 1996-01-29 EP EP96101211A patent/EP0786665B1/en not_active Expired - Lifetime
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0786665A1 (en) * | 1994-08-03 | 1997-07-30 | Kyoto Dai-ichi Kagaku Co., Ltd. | Method and apparatus for immune analysis |
| JP2009515142A (ja) * | 2005-09-15 | 2009-04-09 | 財団法人北海道科学技術総合振興センター | 抗原を検出するための表面プラズモン共鳴バイオセンサシステ及び抗原の存在を検出するための方法 |
| JP2011505572A (ja) * | 2007-12-04 | 2011-02-24 | コーニンクレッカ フィリップス エレクトロニクス エヌ ヴィ | 標識粒子を用いた流体内分子測定方法 |
| JP2019060891A (ja) * | 2013-05-31 | 2019-04-18 | 積水メディカル株式会社 | 免疫凝集測定法 |
| JP2022503975A (ja) * | 2018-09-30 | 2022-01-12 | アジレント・テクノロジーズ・インク | 減衰全反射分光測定のための較正システム |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3436982B2 (ja) | 2003-08-18 |
| EP0786665A1 (en) | 1997-07-30 |
| EP0786665B1 (en) | 2004-06-16 |
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