JP3210036B2 - 生物学的懸濁液を低温調製し、乾燥安定化し、再水化するための方法及び装置 - Google Patents
生物学的懸濁液を低温調製し、乾燥安定化し、再水化するための方法及び装置Info
- Publication number
- JP3210036B2 JP3210036B2 JP23334091A JP23334091A JP3210036B2 JP 3210036 B2 JP3210036 B2 JP 3210036B2 JP 23334091 A JP23334091 A JP 23334091A JP 23334091 A JP23334091 A JP 23334091A JP 3210036 B2 JP3210036 B2 JP 3210036B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- solution
- drying
- sample
- ice
- temperature
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
- A01N1/02—Preservation of living parts
- A01N1/0205—Chemical aspects
- A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
- A01N1/0221—Freeze-process protecting agents, i.e. substances protecting cells from effects of the physical process, e.g. cryoprotectants, osmolarity regulators like oncotic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
- A01N1/02—Preservation of living parts
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
- A01N1/02—Preservation of living parts
- A01N1/0236—Mechanical aspects
- A01N1/0242—Apparatuses, i.e. devices used in the process of preservation of living parts, such as pumps, refrigeration devices or any other devices featuring moving parts and/or temperature controlling components
- A01N1/0252—Temperature controlling refrigerating apparatus, i.e. devices used to actively control the temperature of a designated internal volume, e.g. refrigerators, freeze-drying apparatus or liquid nitrogen baths
- A01N1/0257—Stationary or portable vessels generating cryogenic temperatures
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/14—Blood; Artificial blood
- A61K35/18—Erythrocytes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/125—Picornaviridae, e.g. calicivirus
- A61K39/13—Poliovirus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/04—Preserving or maintaining viable microorganisms
-
- F—MECHANICAL ENGINEERING; LIGHTING; HEATING; WEAPONS; BLASTING
- F25—REFRIGERATION OR COOLING; COMBINED HEATING AND REFRIGERATION SYSTEMS; HEAT PUMP SYSTEMS; MANUFACTURE OR STORAGE OF ICE; LIQUEFACTION SOLIDIFICATION OF GASES
- F25C—PRODUCING, WORKING OR HANDLING ICE
- F25C1/00—Producing ice
- F25C1/12—Producing ice by freezing water on cooled surfaces, e.g. to form slabs
- F25C1/14—Producing ice by freezing water on cooled surfaces, e.g. to form slabs to form thin sheets which are removed by scraping or wedging, e.g. in the form of flakes
- F25C1/142—Producing ice by freezing water on cooled surfaces, e.g. to form slabs to form thin sheets which are removed by scraping or wedging, e.g. in the form of flakes from the outer walls of cooled bodies
-
- F—MECHANICAL ENGINEERING; LIGHTING; HEATING; WEAPONS; BLASTING
- F26—DRYING
- F26B—DRYING SOLID MATERIALS OR OBJECTS BY REMOVING LIQUID THEREFROM
- F26B5/00—Drying solid materials or objects by processes not involving the application of heat
- F26B5/04—Drying solid materials or objects by processes not involving the application of heat by evaporation or sublimation of moisture under reduced pressure, e.g. in a vacuum
- F26B5/06—Drying solid materials or objects by processes not involving the application of heat by evaporation or sublimation of moisture under reduced pressure, e.g. in a vacuum the process involving freezing
- F26B5/065—Drying solid materials or objects by processes not involving the application of heat by evaporation or sublimation of moisture under reduced pressure, e.g. in a vacuum the process involving freezing the product to be freeze-dried being sprayed, dispersed or pulverised
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
- A61L2430/40—Preparation and treatment of biological tissue for implantation, e.g. decellularisation, cross-linking
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/32011—Picornaviridae
- C12N2770/32611—Poliovirus
- C12N2770/32634—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Mechanical Engineering (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Thermal Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Dentistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
- Sampling And Sample Adjustment (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Electron Sources, Ion Sources (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、後の使用のため乾燥状
態で長期保存するため、生物学的懸濁液を調製するため
の方法及び装置に関する。これらの方法により、生物学
的超微構造が保存工程中に有害な変化をすることを回避
する。更に詳細には、本発明は、処理前に懸濁液の状態
で提供される顕微鏡的生物学的試料の保存に関する。
態で長期保存するため、生物学的懸濁液を調製するため
の方法及び装置に関する。これらの方法により、生物学
的超微構造が保存工程中に有害な変化をすることを回避
する。更に詳細には、本発明は、処理前に懸濁液の状態
で提供される顕微鏡的生物学的試料の保存に関する。
【０００２】
【従来の技術】本発明の方法は、その好ましい形態にお
いて、生物学的物質を予防保護剤又は予防保護剤の組み
合わせで処理することによって低温溶液(cryosolution)
を調製する工程と、冷却工程と、失透又は再結晶を防ぐ
温度条件下で保存する工程と、制御された温度、真空、
及び凝結条件下で乾燥する工程とを含む。生物学的物質
は、所望であれば使用前に再水化することができる。
いて、生物学的物質を予防保護剤又は予防保護剤の組み
合わせで処理することによって低温溶液(cryosolution)
を調製する工程と、冷却工程と、失透又は再結晶を防ぐ
温度条件下で保存する工程と、制御された温度、真空、
及び凝結条件下で乾燥する工程とを含む。生物学的物質
は、所望であれば使用前に再水化することができる。
【０００３】科学者の間には生物学的物質を将来の使用
のために大気条件で保存するという望みが長い間あっ
た。例えば、過去３０年乃至４０年に亘って幾つかのグ
ループが赤血球の乾燥保存を試みてきた。赤血球を乾燥
し、これらを後で大気条件で再構成する可能性は、災害
時及び戦時中、及び遠隔地で利点を得るには遠いもので
あった。当該技術分野では、使用前に適当な緩衝溶液を
加えるだけで赤血球を再構成できるように、乾燥し粉に
した赤血球を殺菌容器内に貯蔵できれば大きな前進であ
った。
のために大気条件で保存するという望みが長い間あっ
た。例えば、過去３０年乃至４０年に亘って幾つかのグ
ループが赤血球の乾燥保存を試みてきた。赤血球を乾燥
し、これらを後で大気条件で再構成する可能性は、災害
時及び戦時中、及び遠隔地で利点を得るには遠いもので
あった。当該技術分野では、使用前に適当な緩衝溶液を
加えるだけで赤血球を再構成できるように、乾燥し粉に
した赤血球を殺菌容器内に貯蔵できれば大きな前進であ
った。
【０００４】同様に、培養した哺乳類の細胞を乾燥凍結
することが行われたが、成功しなかった。生物工学の出
現及び機能的に重要な細胞、例えば肝細胞及び膵島の確
認に伴って、大気条件下での長期間貯蔵方法は図り知れ
ない価値を持つに到った。治療で使用される抗体又は組
換え蛋白質のいずれかの多くの複雑な高分子化合物は凍
結又は凍結乾燥を受けると活性を減じてしまう。活性を
大きく失うことなく大気条件下で長期保存できるように
する方法の開発が治療の最終的な有効性にとって重要な
要素である。
することが行われたが、成功しなかった。生物工学の出
現及び機能的に重要な細胞、例えば肝細胞及び膵島の確
認に伴って、大気条件下での長期間貯蔵方法は図り知れ
ない価値を持つに到った。治療で使用される抗体又は組
換え蛋白質のいずれかの多くの複雑な高分子化合物は凍
結又は凍結乾燥を受けると活性を減じてしまう。活性を
大きく失うことなく大気条件下で長期保存できるように
する方法の開発が治療の最終的な有効性にとって重要な
要素である。
【０００５】更に、ウィルス性感染症の制御又は緩和す
る必要性が数十年に亘って医学上の主要な関心事であっ
た。基本的には、ウィルス性感染症の撲滅及び／又は制
御には種々の効力の高いワクチンの製造が必要とされ
る。純粋で効力のあるウィルス抗原又は免疫抗原の製造
は費用がかかるばかりか量的にも質的にも困難である。
これは、通常は、多くのウィルスが制御された細胞培養
環境下でも自己複製を非常に緩慢に行うためである。選
択したウィルスが試験管内でほとんど自己複製しない場
合には、特定のウィルス粒子の製造は、更に費用がかか
るばかりでなく更に有利でなくなり且つ有効でなくな
る。従って、ワクチン物質を製造したらこのワクチン物
質の活性を長時間に亘って失わないようにすることが重
要である。
る必要性が数十年に亘って医学上の主要な関心事であっ
た。基本的には、ウィルス性感染症の撲滅及び／又は制
御には種々の効力の高いワクチンの製造が必要とされ
る。純粋で効力のあるウィルス抗原又は免疫抗原の製造
は費用がかかるばかりか量的にも質的にも困難である。
これは、通常は、多くのウィルスが制御された細胞培養
環境下でも自己複製を非常に緩慢に行うためである。選
択したウィルスが試験管内でほとんど自己複製しない場
合には、特定のウィルス粒子の製造は、更に費用がかか
るばかりでなく更に有利でなくなり且つ有効でなくな
る。従って、ワクチン物質を製造したらこのワクチン物
質の活性を長時間に亘って失わないようにすることが重
要である。
【０００６】これらの例の全てに共通の一つの特徴は、
試料の最初の形体が懸濁液又はエマルジョンの形態の顕
微鏡的生物学的物質であるということである。ひとたび
有効な懸濁液を製造したら、この物質を保存し貯蔵する
ことが最も重要である。低温保存及び乾燥安定化の分野
は急速に進歩し、前進している。生物学的細胞の試料を
低温保存するための装置及び方法が記載されている１９
８９年９月１２日に発行された米国特許第4,865,871 号
を参考のため本願に組み込む。この方法は、試料のガラ
ス遷移温度範囲を上昇する低温予防保護剤(cryoprotect
ant)で生物学的細胞の試料を処理し、溶解不能の大きな
氷の結晶の形成を防止するため、組織試料を低温の温度
条件下で特定の速度でガラス化し、試料保持器内の減圧
され且つガラス化された組織を均衡化し、次いで、組織
の試料を取り巻く環境中に蒸発した水が実質的に検出さ
れなくなるまでエネルギを加えることによって、分子蒸
留で組織試料を脱水する。
試料の最初の形体が懸濁液又はエマルジョンの形態の顕
微鏡的生物学的物質であるということである。ひとたび
有効な懸濁液を製造したら、この物質を保存し貯蔵する
ことが最も重要である。低温保存及び乾燥安定化の分野
は急速に進歩し、前進している。生物学的細胞の試料を
低温保存するための装置及び方法が記載されている１９
８９年９月１２日に発行された米国特許第4,865,871 号
を参考のため本願に組み込む。この方法は、試料のガラ
ス遷移温度範囲を上昇する低温予防保護剤(cryoprotect
ant)で生物学的細胞の試料を処理し、溶解不能の大きな
氷の結晶の形成を防止するため、組織試料を低温の温度
条件下で特定の速度でガラス化し、試料保持器内の減圧
され且つガラス化された組織を均衡化し、次いで、組織
の試料を取り巻く環境中に蒸発した水が実質的に検出さ
れなくなるまでエネルギを加えることによって、分子蒸
留で組織試料を脱水する。
【０００７】低温保存の第１の重要な処理工程は、二つ
の重要な基準を満たすような方法で行わなければならな
い。第１に、冷却中に試料内で起こる多くの変化による
回復不能の損傷を生物学的物質に加えてはならない。こ
れらの変化には、氷の形成、利用できる容積容量の減少
による細胞間の融着、及び溶液及び水の分離による酸度
(pH)の変化及び塩又は溶液の濃度の変化による機械的損
傷が含まれる。第２に、冷却を加えた後の試料の状態
が、次に乾燥及び再構成を行うことのできるものでなけ
ればならない。これには、試料の大きさ、形成された氷
の形態、及び添加剤又は賦形剤の性質及び最終濃度のよ
うなパラメータが含まれる。
の重要な基準を満たすような方法で行わなければならな
い。第１に、冷却中に試料内で起こる多くの変化による
回復不能の損傷を生物学的物質に加えてはならない。こ
れらの変化には、氷の形成、利用できる容積容量の減少
による細胞間の融着、及び溶液及び水の分離による酸度
(pH)の変化及び塩又は溶液の濃度の変化による機械的損
傷が含まれる。第２に、冷却を加えた後の試料の状態
が、次に乾燥及び再構成を行うことのできるものでなけ
ればならない。これには、試料の大きさ、形成された氷
の形態、及び添加剤又は賦形剤の性質及び最終濃度のよ
うなパラメータが含まれる。
【０００８】これら２つの基準を満たす上で、低温保存
工程は、低温予防保護剤(CPA's)を使用して所定の冷却
速度について氷のない領域の容積を化学的に増加するこ
とによって冷凍中の変化を最小にすることと、冷却速度
自体との間の均衡をとる。幾つかの潜在的な組み合わせ
が可能であり、これらの組み合わせのうちの幾つかを以
下の表に概略に列挙する。
工程は、低温予防保護剤(CPA's)を使用して所定の冷却
速度について氷のない領域の容積を化学的に増加するこ
とによって冷凍中の変化を最小にすることと、冷却速度
自体との間の均衡をとる。幾つかの潜在的な組み合わせ
が可能であり、これらの組み合わせのうちの幾つかを以
下の表に概略に列挙する。
【０００９】 冷却態様 大体の冷却速度 最終ＣＰＡ濃度 超急速 300,000 oC/sec. ０ 急速 50,000-100,000 oC/sec. 低い 中間 500-2,500 oC/sec. 中程度 低速 1-20 oC/min. 高い 生物学的物質の低温調製及び凍結を行うための多くの工
程では、本来的に、人為的な結果が随伴的に起こり、試
料が収縮し、その結果としての試料に対する損傷及び試
料の性質の変化が起こる。試料のこれらの特徴の変化
は、人為的な結果等であろうとなかろうと制御されなけ
ればならないし最小にされなければならない。試料の変
化の受容し得る限度は、低温調製した物質の想像し得る
最終的な使用によって決まる。例えば、低速冷却を行う
と試料が露呈されるＣＰＡの最終濃度が非常に高くな
る。これは、方法の各工程で潜在的に有害な結果をもた
らす。これらには、冷却中の毒性、乾燥中の不適合性、
及び再水化中の厳しい浸透応力が含まれる。
程では、本来的に、人為的な結果が随伴的に起こり、試
料が収縮し、その結果としての試料に対する損傷及び試
料の性質の変化が起こる。試料のこれらの特徴の変化
は、人為的な結果等であろうとなかろうと制御されなけ
ればならないし最小にされなければならない。試料の変
化の受容し得る限度は、低温調製した物質の想像し得る
最終的な使用によって決まる。例えば、低速冷却を行う
と試料が露呈されるＣＰＡの最終濃度が非常に高くな
る。これは、方法の各工程で潜在的に有害な結果をもた
らす。これらには、冷却中の毒性、乾燥中の不適合性、
及び再水化中の厳しい浸透応力が含まれる。
【００１０】低温保存で遭遇する問題点のうちの一つ
は、生物学的物質の懸濁液を急速に冷却するための有効
で効率的な方法及び装置がないということである。幾つ
かの従来技術の方法では微細な液滴を作り出すのにエア
ガン又はエアブラシが使用され、これらの液滴は次いで
冷却される。しかしながら、これらの装置は細胞物質に
損傷を加える専断応力を生ぜしめる。更に、従来技術の
方法では、微細な液滴は液体凍結剤中に直接噴霧され
る。これは、凍結した微細な液滴を収集するのに問題が
あり、試料を潜在的に汚染する可能性がある。従って、
当該技術分野には、実際的で費用について効率的であり
且つ無菌の、生物学的物質の懸濁液を低温調製するため
の方法及び装置についての必要が存在する。
は、生物学的物質の懸濁液を急速に冷却するための有効
で効率的な方法及び装置がないということである。幾つ
かの従来技術の方法では微細な液滴を作り出すのにエア
ガン又はエアブラシが使用され、これらの液滴は次いで
冷却される。しかしながら、これらの装置は細胞物質に
損傷を加える専断応力を生ぜしめる。更に、従来技術の
方法では、微細な液滴は液体凍結剤中に直接噴霧され
る。これは、凍結した微細な液滴を収集するのに問題が
あり、試料を潜在的に汚染する可能性がある。従って、
当該技術分野には、実際的で費用について効率的であり
且つ無菌の、生物学的物質の懸濁液を低温調製するため
の方法及び装置についての必要が存在する。
【００１１】従来、生物学的試料を乾燥するために種々
の方法が使用されてきた。これらの方法には凍結乾燥法
及び分子蒸留乾燥法が含まれる。分子蒸留乾燥法で使用
される装置及び方法の例が米国特許第4,510,169 号、第
4,567,847 号、第4,676,070 号、第4,799,361 号、第4,
865,871 号、及び第4,964,280 号に開示されている。
の方法が使用されてきた。これらの方法には凍結乾燥法
及び分子蒸留乾燥法が含まれる。分子蒸留乾燥法で使用
される装置及び方法の例が米国特許第4,510,169 号、第
4,567,847 号、第4,676,070 号、第4,799,361 号、第4,
865,871 号、及び第4,964,280 号に開示されている。
【００１２】かくして、試料の超微構造の形態形質の顕
在的破裂、即ち破壊なしに生物学的試料を低温調製し乾
燥安定化する方法及び装置を提供することが当該技術分
野において重要な前進である。このような方法及び装置
は、試料を脱水することによって顕微鏡的生物学的試料
を低温安定化しなければならず、これらの試料では、水
分子は、不必要な人為的結果、及び結果としての超微構
造及び形態形質上の望ましからぬ損傷を水の除去の際に
生ぜしめることなく、所定の最適の氷相に維持される。
在的破裂、即ち破壊なしに生物学的試料を低温調製し乾
燥安定化する方法及び装置を提供することが当該技術分
野において重要な前進である。このような方法及び装置
は、試料を脱水することによって顕微鏡的生物学的試料
を低温安定化しなければならず、これらの試料では、水
分子は、不必要な人為的結果、及び結果としての超微構
造及び形態形質上の望ましからぬ損傷を水の除去の際に
生ぜしめることなく、所定の最適の氷相に維持される。
【００１３】
【課題を解決するための手段】本発明は、一般に懸濁液
の形態で調製される顕微鏡的生物学的物質を低温保存し
乾燥するための方法及び装置に関する。本明細書中で使
用されているように、懸濁液にはエマルジョンも含まれ
る。本発明の方法には生物学的物質の低温調製及び乾燥
安定化が含まれる。
の形態で調製される顕微鏡的生物学的物質を低温保存し
乾燥するための方法及び装置に関する。本明細書中で使
用されているように、懸濁液にはエマルジョンも含まれ
る。本発明の方法には生物学的物質の低温調製及び乾燥
安定化が含まれる。
【００１４】好ましい実施例では、先ず最初に、生物学
的物質の低温溶液を調製することによって低温調製が達
成され、この低温溶液には、適当な緩衝液、一つ又はそ
れ以上の低温予防保護剤及び／又は乾燥予防保護剤、及
び生物学的物質の懸濁液が含まれる。次いで、生物学的
物質の構造又は形態を損傷することなく、低温溶液中で
非晶相、立方晶相、及び六方晶相の氷を機能的に形成す
るようにこの低温溶液を冷却する。次いで、低温溶液は
乾燥されて種々の相の氷を除去し、約５％以下、好まし
くは約３％以下の残留水分を含む最終製品となる。
的物質の低温溶液を調製することによって低温調製が達
成され、この低温溶液には、適当な緩衝液、一つ又はそ
れ以上の低温予防保護剤及び／又は乾燥予防保護剤、及
び生物学的物質の懸濁液が含まれる。次いで、生物学的
物質の構造又は形態を損傷することなく、低温溶液中で
非晶相、立方晶相、及び六方晶相の氷を機能的に形成す
るようにこの低温溶液を冷却する。次いで、低温溶液は
乾燥されて種々の相の氷を除去し、約５％以下、好まし
くは約３％以下の残留水分を含む最終製品となる。
【００１５】試料は、予防保護剤即ち低温予防保護剤及
び乾燥安定剤で前処理され、氷の結晶の形成を最小にす
る冷却速度及び最終温度を受ける。本発明の方法は、ど
のような最終用途を考えようと適合可能であるというこ
とは理解すべきである。例えば、特定の状況では、超微
細構造的損傷の絶対最小量が許容されるが、他の用途で
は、最終用途は細胞の形態に敏感な用途であってはなら
ない。低温予防保護剤及び予め選択した乾燥パラメータ
を適切に選択することによって、懸濁状態の生物学的試
料のほとんど全てを適当な所望の最終用途のために低温
調製することができる。
び乾燥安定剤で前処理され、氷の結晶の形成を最小にす
る冷却速度及び最終温度を受ける。本発明の方法は、ど
のような最終用途を考えようと適合可能であるというこ
とは理解すべきである。例えば、特定の状況では、超微
細構造的損傷の絶対最小量が許容されるが、他の用途で
は、最終用途は細胞の形態に敏感な用途であってはなら
ない。低温予防保護剤及び予め選択した乾燥パラメータ
を適切に選択することによって、懸濁状態の生物学的試
料のほとんど全てを適当な所望の最終用途のために低温
調製することができる。
【００１６】機能的に有効な量の低温予防保護剤及び／
又は乾燥安定剤を試料に加えた後、化学的活性が本質的
に抑制される温度まで試料を冷却する。冷却は、生物学
物質内の液体分子の結晶構造が損傷を最小程度にしか引
き起こさないような方法で完了される。溶液の冷却は、
溶液を噴霧して直径が約２００μｍ以下のばらばらの液
滴を形成することによって行われる。次いで、これらの
微細な液滴は、低温液体で内部が約−１６０ oC 以下の
温度まで冷却された回転する低温表面上に噴霧される。
凍結した微細な液滴は、回転シリンダから収集器で機械
的に除去され、内部の凍結剤によって冷却され、次の乾
燥のため試料収集装置内に配置される。
又は乾燥安定剤を試料に加えた後、化学的活性が本質的
に抑制される温度まで試料を冷却する。冷却は、生物学
物質内の液体分子の結晶構造が損傷を最小程度にしか引
き起こさないような方法で完了される。溶液の冷却は、
溶液を噴霧して直径が約２００μｍ以下のばらばらの液
滴を形成することによって行われる。次いで、これらの
微細な液滴は、低温液体で内部が約−１６０ oC 以下の
温度まで冷却された回転する低温表面上に噴霧される。
凍結した微細な液滴は、回転シリンダから収集器で機械
的に除去され、内部の凍結剤によって冷却され、次の乾
燥のため試料収集装置内に配置される。
【００１７】凍結した微細な液滴の乾燥は、従来の凍結
乾燥器又は分子蒸留乾燥器を使用して行われる。これら
の装置は当該技術分野で周知であり、以下に詳細に論じ
る。従来の凍結乾燥を使用する場合には、方法の独特の
特徴は、微細な液滴の形体、及び低周波数の超音波を使
用した微細な液滴の形成中に損傷を受けないということ
に関する。凍結乾燥を約−７０ oC 以上の温度で行う場
合には試料内の水は六方晶氷として又は試料の氷のない
領域で低温予防保護剤と組み合わせてのいずれかで存在
する。乾燥の効率は、試料の微細液滴形体によって増大
される分子蒸留乾燥は、超微構造にほとんど損傷を加え
ることなく結晶流体を除去する温度及び圧力の条件下で
行われる。
乾燥器又は分子蒸留乾燥器を使用して行われる。これら
の装置は当該技術分野で周知であり、以下に詳細に論じ
る。従来の凍結乾燥を使用する場合には、方法の独特の
特徴は、微細な液滴の形体、及び低周波数の超音波を使
用した微細な液滴の形成中に損傷を受けないということ
に関する。凍結乾燥を約−７０ oC 以上の温度で行う場
合には試料内の水は六方晶氷として又は試料の氷のない
領域で低温予防保護剤と組み合わせてのいずれかで存在
する。乾燥の効率は、試料の微細液滴形体によって増大
される分子蒸留乾燥は、超微構造にほとんど損傷を加え
ることなく結晶流体を除去する温度及び圧力の条件下で
行われる。
【００１８】分子蒸留乾燥の関係では、本発明の方法と
関連した乾燥方法は移行相乾燥と呼ばれる。これは、一
つの相から他の相、例えば立方晶相から六方晶相への遷
移温度中に氷の結晶の形態の水が冷却された試料から除
去されるということを意味する。更に、本発明の好まし
い方法では、乾燥した生物学的溶液を生物学的に不活性
な容器内に乾燥不活性ガス環境で又は低圧で配置する。
このようにして、生物学的物質を低温調製でき、乾燥安
定化でき、そして生物学的に長期間に亘って保存でき
る。
関連した乾燥方法は移行相乾燥と呼ばれる。これは、一
つの相から他の相、例えば立方晶相から六方晶相への遷
移温度中に氷の結晶の形態の水が冷却された試料から除
去されるということを意味する。更に、本発明の好まし
い方法では、乾燥した生物学的溶液を生物学的に不活性
な容器内に乾燥不活性ガス環境で又は低圧で配置する。
このようにして、生物学的物質を低温調製でき、乾燥安
定化でき、そして生物学的に長期間に亘って保存でき
る。
【００１９】本発明は、多くの種々の種類の生物学的物
質を保存するのに使用できる。この方法が、赤血球細
胞、哺乳類の培養細胞、血小板、白血球、第VIII因子、
漿液、膵島、骨髄細胞、ウィルス、及びワクチンのよう
な物質を保存するのに使用できるということは理解され
よう。適当な物質は、分子物質、ウィルス物質、バクテ
リア物質、細胞物質、又は亜細胞物質のいずれかである
のがよい。
質を保存するのに使用できる。この方法が、赤血球細
胞、哺乳類の培養細胞、血小板、白血球、第VIII因子、
漿液、膵島、骨髄細胞、ウィルス、及びワクチンのよう
な物質を保存するのに使用できるということは理解され
よう。適当な物質は、分子物質、ウィルス物質、バクテ
リア物質、細胞物質、又は亜細胞物質のいずれかである
のがよい。
【００２０】かくして、本発明の目的は、望ましからぬ
人為結果の形成を制御し、最小にすると同時に生物学的
試料を保存し貯蔵することである。試料の完全な保存及
び貯蔵、試料の活性及び完全性を維持しなければならな
いということを強調することが重要である。本発明の方
法は、懸濁液として調製した、乾燥させた顕微鏡的性物
質を保存し貯蔵できるようにする低温安定化の成功を提
供する。本発明は、費用について効率的であり、貯蔵さ
れた試料が長期間に亘る貯蔵の後でも生物学的活性を維
持する。特定の所望の延長された期間は、調製される生
物学的物質及び所定の最終用途に左右される。有効な生
物学的物質の費用のかからない効果的な調製及び貯蔵が
生物工学の分野を前進するのに必要である。
人為結果の形成を制御し、最小にすると同時に生物学的
試料を保存し貯蔵することである。試料の完全な保存及
び貯蔵、試料の活性及び完全性を維持しなければならな
いということを強調することが重要である。本発明の方
法は、懸濁液として調製した、乾燥させた顕微鏡的性物
質を保存し貯蔵できるようにする低温安定化の成功を提
供する。本発明は、費用について効率的であり、貯蔵さ
れた試料が長期間に亘る貯蔵の後でも生物学的活性を維
持する。特定の所望の延長された期間は、調製される生
物学的物質及び所定の最終用途に左右される。有効な生
物学的物質の費用のかからない効果的な調製及び貯蔵が
生物工学の分野を前進するのに必要である。
【００２１】生物学的物質の試料の温度と試料内の流体
分子の結晶形体との間に直接的な相関作用があるという
ことが前提とされ且つ確認されている。この相互関係の
理解により、試料温度を制御することによって結晶構造
を制御し、及びかくして超微構造の損傷を制御する本発
明の方法の開発が容易になった。重要なこととしては、
液体分子の結晶形体が試料の形態及び機能に及ぼす損傷
に直接的な関係を持つ。
分子の結晶形体との間に直接的な相関作用があるという
ことが前提とされ且つ確認されている。この相互関係の
理解により、試料温度を制御することによって結晶構造
を制御し、及びかくして超微構造の損傷を制御する本発
明の方法の開発が容易になった。重要なこととしては、
液体分子の結晶形体が試料の形態及び機能に及ぼす損傷
に直接的な関係を持つ。
【００２２】本発明は、低温調製工程及び乾燥安定化工
程に亘って顕微鏡的生物学的物質を保存するための方法
及び装置を提供する。本発明の方法は、本発明の方法に
含まれる工程を概略に図示する図１を参照することによ
って最も良く理解されるであろう。好ましい実施例で
は、保存されるべき顕微鏡的生物学的物質を、最初に、
処方に従って低温溶液にする。低温溶液は、一般に、生
物学的物質、適当な緩衝液、及び一つ又はそれ以上の低
温予防保護剤及び／又は乾燥安定剤の懸濁液を含む。緩
衝液及び予防保護剤の種類及び量は変化させることがで
き、保存される特定の物質及びその所定の最終用途によ
って決定される。他の用途では、以下に詳細に説明する
ように、緩衝液及び予防保護剤の種々の濃度及び組み合
わせを使用することができる。
程に亘って顕微鏡的生物学的物質を保存するための方法
及び装置を提供する。本発明の方法は、本発明の方法に
含まれる工程を概略に図示する図１を参照することによ
って最も良く理解されるであろう。好ましい実施例で
は、保存されるべき顕微鏡的生物学的物質を、最初に、
処方に従って低温溶液にする。低温溶液は、一般に、生
物学的物質、適当な緩衝液、及び一つ又はそれ以上の低
温予防保護剤及び／又は乾燥安定剤の懸濁液を含む。緩
衝液及び予防保護剤の種類及び量は変化させることがで
き、保存される特定の物質及びその所定の最終用途によ
って決定される。他の用途では、以下に詳細に説明する
ように、緩衝液及び予防保護剤の種々の濃度及び組み合
わせを使用することができる。
【００２３】低温溶液を調製した後、冷却させる前に噴
霧しなければならない。好ましい実施例では、ワット数
の低い低周波数の超音波ネブライザを使用して微細な液
滴をつくる。好ましい実施例では、急速冷却のため、噴
霧した低温溶液を低温表面に差し向ける。噴霧した低温
溶液は、急速冷却前にかなりにゆっくりとした予備冷却
を受けないような状態で表面に差し向けられなければな
らない。
霧しなければならない。好ましい実施例では、ワット数
の低い低周波数の超音波ネブライザを使用して微細な液
滴をつくる。好ましい実施例では、急速冷却のため、噴
霧した低温溶液を低温表面に差し向ける。噴霧した低温
溶液は、急速冷却前にかなりにゆっくりとした予備冷却
を受けないような状態で表面に差し向けられなければな
らない。
【００２４】好ましい実施例では、連続的に補充した低
温表面を使用して、噴霧した低温溶液を急速冷却する。
液体凍結剤で内部が冷却された回転金属シリンダを有す
る。凍結した低温溶液を低温表面から除去し、適当な乾
燥装置へ移送できるように適当な収集装置内に配置す
る。凍結装置から乾燥器への輸送を含む全ての工程中、
凍結した低温溶液が凍結温度にとどまることが重要であ
る。更に、冷却を行うために装置内に導入された液体凍
結剤と低温溶液が接触することがないということが重要
である。収集装置内の凍結した低温溶液は乾燥器に直接
取り出すか或いは凍結温度で貯蔵されるのがよい。
温表面を使用して、噴霧した低温溶液を急速冷却する。
液体凍結剤で内部が冷却された回転金属シリンダを有す
る。凍結した低温溶液を低温表面から除去し、適当な乾
燥装置へ移送できるように適当な収集装置内に配置す
る。凍結装置から乾燥器への輸送を含む全ての工程中、
凍結した低温溶液が凍結温度にとどまることが重要であ
る。更に、冷却を行うために装置内に導入された液体凍
結剤と低温溶液が接触することがないということが重要
である。収集装置内の凍結した低温溶液は乾燥器に直接
取り出すか或いは凍結温度で貯蔵されるのがよい。
【００２５】好ましい実施例では、従来の凍結乾燥又は
分子蒸留乾燥器のいずれかによって行われる。適当な分
子蒸留乾燥器は、テキサス州ウッドランド(Woodlands)
の活細胞社(LifeCell Corp.)から得ることができ、これ
らの乾燥器は、米国特許第4,567,847 号、第4,799,361
号に開示されている。これらの特許を参考のため本願に
組み込む。
分子蒸留乾燥器のいずれかによって行われる。適当な分
子蒸留乾燥器は、テキサス州ウッドランド(Woodlands)
の活細胞社(LifeCell Corp.)から得ることができ、これ
らの乾燥器は、米国特許第4,567,847 号、第4,799,361
号に開示されている。これらの特許を参考のため本願に
組み込む。
【００２６】
【実施例】本発明を実施するのに使用される好ましい冷
却装置は、図２及び図３に示す新規な低温固定装置であ
る。今、図２及び図３を参照すると、高速低温固定装置
が全体的に１０で示されている。高速低温固定装置１０
は、ネブライザコラム１４内に位置決めされたネブライ
ザ１２を有する。低温表面１６が、ネブライザコラム１
４の出口に位置決めされ、ハウジング１８内に収容され
ている。収集器２０が、低温表面１６に隣接して位置決
めされ、凍結低温溶液を取出して、これを試料保持器２
２内に位置決めする。試料保持器２２は、凍結した低温
溶液を分子蒸留乾燥器又は貯蔵領域へ輸送するのに使用
でき、凍結した低温溶液は分子蒸留乾燥器で更に処理さ
れる。
却装置は、図２及び図３に示す新規な低温固定装置であ
る。今、図２及び図３を参照すると、高速低温固定装置
が全体的に１０で示されている。高速低温固定装置１０
は、ネブライザコラム１４内に位置決めされたネブライ
ザ１２を有する。低温表面１６が、ネブライザコラム１
４の出口に位置決めされ、ハウジング１８内に収容され
ている。収集器２０が、低温表面１６に隣接して位置決
めされ、凍結低温溶液を取出して、これを試料保持器２
２内に位置決めする。試料保持器２２は、凍結した低温
溶液を分子蒸留乾燥器又は貯蔵領域へ輸送するのに使用
でき、凍結した低温溶液は分子蒸留乾燥器で更に処理さ
れる。
【００２７】ネブライザ１２は、ソノテック(Sonotek)
から入手することのできる超音波噴霧ノズルのような、
低ワット数の、低周波数の超音波ネブライザ装置であ
る。ネブライザは、低温溶液とネブライザ構成部品との
接触を最小にするように低温溶液送出に関して変更して
ある。これは、通常流体導管を迂回させ、低温溶液を、
殺菌使い捨て導管２４を介してネブライザの先端にだけ
送出することによって達成された。このようにして、加
熱及び超音波に対する低温溶液の露出は最小にされた。
更に、この形体は、処理中、低温溶液の無菌状態を維持
するのに重要である。無菌状態は、エアガン、或いは、
スプレーを使用した従来技術の処理で直面した問題のう
ちの一つであった。導管２４は、低温溶液を入れる適当
な容器（図示せず）に連結されている。
から入手することのできる超音波噴霧ノズルのような、
低ワット数の、低周波数の超音波ネブライザ装置であ
る。ネブライザは、低温溶液とネブライザ構成部品との
接触を最小にするように低温溶液送出に関して変更して
ある。これは、通常流体導管を迂回させ、低温溶液を、
殺菌使い捨て導管２４を介してネブライザの先端にだけ
送出することによって達成された。このようにして、加
熱及び超音波に対する低温溶液の露出は最小にされた。
更に、この形体は、処理中、低温溶液の無菌状態を維持
するのに重要である。無菌状態は、エアガン、或いは、
スプレーを使用した従来技術の処理で直面した問題のう
ちの一つであった。導管２４は、低温溶液を入れる適当
な容器（図示せず）に連結されている。
【００２８】この独特なネブライザは、約２５μｍ乃至
２５０μｍ程度の直径の微細な液滴を作ることができ
る。約２５μｍ乃至２５０μｍ程度の直径は高速冷却に
適切である。最大冷却速度と短時間乾燥を達成するため
には、約２５μｍ乃至１００μｍの微細な液滴の直径が
好ましい。ネブライザを調節して、生物学的物質を著し
く損傷することなく、毎分５ml乃至１０mlの低温溶液の
流量を達成することができる。
２５０μｍ程度の直径の微細な液滴を作ることができ
る。約２５μｍ乃至２５０μｍ程度の直径は高速冷却に
適切である。最大冷却速度と短時間乾燥を達成するため
には、約２５μｍ乃至１００μｍの微細な液滴の直径が
好ましい。ネブライザを調節して、生物学的物質を著し
く損傷することなく、毎分５ml乃至１０mlの低温溶液の
流量を達成することができる。
【００２９】ネブライザ１２は、適当なブラケット２６
によってネブライザコラム１４内に取付けられる。室温
の乾燥ガス２８が、管３０を介してコラム１４の先端に
導入される。ネブライザ１２は、ガス２８が矢印３２で
示す真っ直ぐな流れでネブライザ１２を通って流れるこ
とができるような仕方で取付けられている。不活性ガス
２８の流れは、噴霧した試料が、低温表面１６の高速冷
却に先立って、ゆっくりな予備冷却工程を受けないよう
にするのを確保する。窒素、ヘリウム、酸素及びアルゴ
ンのような多くの異なるタイプのガスを利用することが
できる。ガスの流量は、ゆっくりな予備冷却を阻止する
ように調節されるべきであるが、乱流を生じさせるほ
ど、すなわち、低温表面をかなり温めるほどは高くな
い。
によってネブライザコラム１４内に取付けられる。室温
の乾燥ガス２８が、管３０を介してコラム１４の先端に
導入される。ネブライザ１２は、ガス２８が矢印３２で
示す真っ直ぐな流れでネブライザ１２を通って流れるこ
とができるような仕方で取付けられている。不活性ガス
２８の流れは、噴霧した試料が、低温表面１６の高速冷
却に先立って、ゆっくりな予備冷却工程を受けないよう
にするのを確保する。窒素、ヘリウム、酸素及びアルゴ
ンのような多くの異なるタイプのガスを利用することが
できる。ガスの流量は、ゆっくりな予備冷却を阻止する
ように調節されるべきであるが、乱流を生じさせるほ
ど、すなわち、低温表面をかなり温めるほどは高くな
い。
【００３０】顕微鏡的生物学的試料を含有する低温溶液
は、低温表面１６に急速に遭遇する微細な液滴として、
ネブライザ１２のノズル３４から放出される。好ましい
実施例では、低温表面１６は、回転鏡面仕上げされた金
属面を提供する高い熱伝導率の中空シリンダからなる。
この表面の熱容量は、内部凍結剤と共に、噴霧した試料
を液体凍結剤に接触させることなく急速に冷却すること
ができる、というものである。適当な駆動モータ３８及
び歯車機構４０が、低温表面１６を回転させるために使
用される。
は、低温表面１６に急速に遭遇する微細な液滴として、
ネブライザ１２のノズル３４から放出される。好ましい
実施例では、低温表面１６は、回転鏡面仕上げされた金
属面を提供する高い熱伝導率の中空シリンダからなる。
この表面の熱容量は、内部凍結剤と共に、噴霧した試料
を液体凍結剤に接触させることなく急速に冷却すること
ができる、というものである。適当な駆動モータ３８及
び歯車機構４０が、低温表面１６を回転させるために使
用される。
【００３１】回転速度は、低温表面の寸法及び低温溶液
の流速に応じる。好ましい実施例では、低温表面は、約
10.16cm （約４インチ）の直径、約5.08cm（約２イン
チ）の幅及び約30.48cm （約12インチ）の長さを有す
る。低温表面１６のシリンダは、内部的に、適当な連結
部を介してシリンダに導入される液体凍結剤で冷却され
る。これにより、低温溶液を、殺菌上の問題を引き起こ
す凍結剤と接触させることなく冷却させる。更に、試料
と液体凍結剤との間の熱流用導管として高い熱伝導率の
金属を使用することによって、通常、試料を取り囲み、
これを冷却用放熱器から隔離する液体凍結剤の加熱によ
る蒸気生成を避ける。これにより非常に早い冷却速度を
達成する。
の流速に応じる。好ましい実施例では、低温表面は、約
10.16cm （約４インチ）の直径、約5.08cm（約２イン
チ）の幅及び約30.48cm （約12インチ）の長さを有す
る。低温表面１６のシリンダは、内部的に、適当な連結
部を介してシリンダに導入される液体凍結剤で冷却され
る。これにより、低温溶液を、殺菌上の問題を引き起こ
す凍結剤と接触させることなく冷却させる。更に、試料
と液体凍結剤との間の熱流用導管として高い熱伝導率の
金属を使用することによって、通常、試料を取り囲み、
これを冷却用放熱器から隔離する液体凍結剤の加熱によ
る蒸気生成を避ける。これにより非常に早い冷却速度を
達成する。
【００３２】低温表面１６のシリンダは、低温固定装置
の永久部分であるような物質で作ることも、使い捨て外
形として設計することもできる。適当な物質には、銅、
アルミニウム及びクロム、或いは、ダイヤモンド被覆ア
ルミニウムが含まれる。低温表面１６上で凍結された微
細な液滴３６は、ポリエチレンテレフタレートのような
オートクレーブ処理可能な物質で作られた収集器２０に
よって取り除かれる。収集器２０は、低温表面１６から
凍結された微細な液滴を取り除くためのブレード４２を
有する。次いで、凍結された微細な液滴を適当な試料保
持器２２内に差し向ける。好ましい実施例では、試料保
持器２２は、試料壜４４及び壜保持器４６からなる。図
示した実施例では、壜保持器４６は、六つの試料壜を収
容するように設計されている。試料保持器は、低温固定
装置１０から取り去り、低温溶液を乾燥させるための分
子蒸留乾燥器内に設置することができるように設計され
ている。
の永久部分であるような物質で作ることも、使い捨て外
形として設計することもできる。適当な物質には、銅、
アルミニウム及びクロム、或いは、ダイヤモンド被覆ア
ルミニウムが含まれる。低温表面１６上で凍結された微
細な液滴３６は、ポリエチレンテレフタレートのような
オートクレーブ処理可能な物質で作られた収集器２０に
よって取り除かれる。収集器２０は、低温表面１６から
凍結された微細な液滴を取り除くためのブレード４２を
有する。次いで、凍結された微細な液滴を適当な試料保
持器２２内に差し向ける。好ましい実施例では、試料保
持器２２は、試料壜４４及び壜保持器４６からなる。図
示した実施例では、壜保持器４６は、六つの試料壜を収
容するように設計されている。試料保持器は、低温固定
装置１０から取り去り、低温溶液を乾燥させるための分
子蒸留乾燥器内に設置することができるように設計され
ている。
【００３３】別の好ましい実施例では、試料保持器２２
は、壜保持器４６と同様な予備冷却式移送キャリヤに収
容された収集袋からなる。収集袋は、15μｍの孔寸法を
有するポリテトラフルオルエチレン（ＰＴＦＥ）のよう
な適当な物質で作られる。これにより、試料を収集袋に
収容しながら、乾燥中、水蒸気を散逸させる。収集に続
いて、収集袋を密封して引き続く処理工程を通して試料
を収容する。
は、壜保持器４６と同様な予備冷却式移送キャリヤに収
容された収集袋からなる。収集袋は、15μｍの孔寸法を
有するポリテトラフルオルエチレン（ＰＴＦＥ）のよう
な適当な物質で作られる。これにより、試料を収集袋に
収容しながら、乾燥中、水蒸気を散逸させる。収集に続
いて、収集袋を密封して引き続く処理工程を通して試料
を収容する。
【００３４】本発明の原理では、適当な望ましい生物学
的試料を得ることが基本的な必要条件である。ウィル
ス、或いは、ワクチン試料、抗体、組換え蛋白質は、多
種の出所から市販されている。特定のタイプのウィル
ス、或いは、ワクチン試料、抗体、組換え蛋白質は、本
発明の方法では制限されていない。しかしながら、生物
学的試料の低温保存は、処理すべき試料が新鮮ならば価
値が高められる。
的試料を得ることが基本的な必要条件である。ウィル
ス、或いは、ワクチン試料、抗体、組換え蛋白質は、多
種の出所から市販されている。特定のタイプのウィル
ス、或いは、ワクチン試料、抗体、組換え蛋白質は、本
発明の方法では制限されていない。しかしながら、生物
学的試料の低温保存は、処理すべき試料が新鮮ならば価
値が高められる。
【００３５】人間の赤血球は、ドナーから新たに得ら
れ、適当な抗凝血剤容器に収集され、分離処理及び洗浄
処理を受ける。変形例として、標準的な血液銀行の供給
物からの赤血球は、収集から六日以内に使用するなら
ば、処理しても良い。生物学的試料の低温調製は、試料
を受取った後すぐに行われるのが好ましい。生物学的物
質は、在来の手段による、凍結及び解凍中、或いは、以
下の凍結乾燥中、一般的にかなりの質的低下を受ける。
従って、この出願で述べた方法によって処理するのに先
立っては、これらの工程を避けなければならない。
れ、適当な抗凝血剤容器に収集され、分離処理及び洗浄
処理を受ける。変形例として、標準的な血液銀行の供給
物からの赤血球は、収集から六日以内に使用するなら
ば、処理しても良い。生物学的試料の低温調製は、試料
を受取った後すぐに行われるのが好ましい。生物学的物
質は、在来の手段による、凍結及び解凍中、或いは、以
下の凍結乾燥中、一般的にかなりの質的低下を受ける。
従って、この出願で述べた方法によって処理するのに先
立っては、これらの工程を避けなければならない。
【００３６】生物学的試料を低温保存する初期工程に
は、冷却工程に先立って低温溶液を調製することが含ま
れる。低温溶液は、生物学的懸濁液と、適当な緩衝液
と、一つ、又は、二つ以上の低温予防保護剤及び／又は
乾燥予防保護剤とを含む。顕微鏡的生物学的試料はたい
てい懸濁液として得られる。入手可能な各懸濁液の正確
な成分は、本発明の構成要素とみなされない。各懸濁液
の詳細な組成は出所によって異なり、特定の成分はしば
しば特許情報を含むことがある。しかしながら、一般的
には、顕微鏡的生物学的懸濁液は、水の中の一定の割合
の生物学的物質とホスフェートを緩衝剤とする塩水、或
いは、塩水に変わる他の溶液との混合物を有する。この
溶液組成が低温保存処理に適合しないならば、生物学的
懸濁液を濃縮することによって、望ましくない成分をな
くすことができる。生物学的試料を、次いで、適合する
溶液に再度懸濁する。
は、冷却工程に先立って低温溶液を調製することが含ま
れる。低温溶液は、生物学的懸濁液と、適当な緩衝液
と、一つ、又は、二つ以上の低温予防保護剤及び／又は
乾燥予防保護剤とを含む。顕微鏡的生物学的試料はたい
てい懸濁液として得られる。入手可能な各懸濁液の正確
な成分は、本発明の構成要素とみなされない。各懸濁液
の詳細な組成は出所によって異なり、特定の成分はしば
しば特許情報を含むことがある。しかしながら、一般的
には、顕微鏡的生物学的懸濁液は、水の中の一定の割合
の生物学的物質とホスフェートを緩衝剤とする塩水、或
いは、塩水に変わる他の溶液との混合物を有する。この
溶液組成が低温保存処理に適合しないならば、生物学的
懸濁液を濃縮することによって、望ましくない成分をな
くすことができる。生物学的試料を、次いで、適合する
溶液に再度懸濁する。
【００３７】生物学的懸濁液に加えて、低温溶液は一般
的に適当な緩衝液を有する。これは、当業者に知られて
いる多くの異なる有機緩衝液のうちの一つを含む。発明
者は、トリス（２−アミノ−２−（ヒドロキシメチル）
−１，３−プロパンジオール）；ＭＥＳ（２−〔Ｎ−モ
ルホリノ〕エタンスルホン酸）；アンメジオール（２−
アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオール）；Ｍ
ＯＰＳ（３−〔Ｎ−モルホリノ〕プロパンスルホン
酸）；及びＰＩＰＥＳ（ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス
〔２−エタンスルホン酸〕及び１，４−ピペラジン−ジ
エタンスルホン酸）からなるグループから選択された有
機緩衝液を使用することを好む。
的に適当な緩衝液を有する。これは、当業者に知られて
いる多くの異なる有機緩衝液のうちの一つを含む。発明
者は、トリス（２−アミノ−２−（ヒドロキシメチル）
−１，３−プロパンジオール）；ＭＥＳ（２−〔Ｎ−モ
ルホリノ〕エタンスルホン酸）；アンメジオール（２−
アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオール）；Ｍ
ＯＰＳ（３−〔Ｎ−モルホリノ〕プロパンスルホン
酸）；及びＰＩＰＥＳ（ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス
〔２−エタンスルホン酸〕及び１，４−ピペラジン−ジ
エタンスルホン酸）からなるグループから選択された有
機緩衝液を使用することを好む。
【００３８】変形例として、一定の適用では、低塩緩衝
液、或いは、生理的緩衝液がより適当である。低塩緩衝
液は、現在、血液貯蔵に使用されている混合物、例え
ば、ＬＩＳＳ−８ｇのグリシン、２０mlの0.15Ｍ燐酸
緩衝液pH6.7 乃至8.4 及び1.8ｇの塩化ナトリウムを配
合して１０００ml、pH6.7 とした、ＬＩＳＰ−１６ｇ
のグリシン、２０mlの0.15Ｍ燐酸緩衝液pH6.7 乃至8.4
、1.8gの塩化ナトリウム、5.0gグルコース、0.06ｇの
塩化カルシウム及び0.1gのアデニンを配合して１０００
ml、pH6.7 とした、アドソール−0.9 ％塩化ナトリウ
ム、0.75％ マンニトール、2.2 ％ブドウ糖、及び0.02
2 ％アデニン；ＲＢＣ緩衝液−0.875 ％ブドウ糖、0.
9 ％塩化ナトリウム、0.214 ％マンニトール、0.008 ％
アデニン、0.255 ％クエン酸ナトリウム、0.029 ％クエ
ン酸及び0.022 ％第１燐酸ナトリウム；又は以下のよう
なその改変物緩衝液Ａ−pH7.4 の16ｍＭ燐酸緩衝液、
５ｍＭ塩化カリウム、４g/dlのＢＳＡ及びラクトース6.
9g/l、及び緩衝液Ｂ−ｐＨ7.4 の16ｍＭ燐酸緩衝液、
５ｍＭ塩化カリウム及びラクトース15g/l を有する。生
理的緩衝液は、種々のフスフェートを緩衝剤とする塩水
を有する。追加の重要な緩衝液は、成分としてマグネシ
ウムを含むものである。
液、或いは、生理的緩衝液がより適当である。低塩緩衝
液は、現在、血液貯蔵に使用されている混合物、例え
ば、ＬＩＳＳ−８ｇのグリシン、２０mlの0.15Ｍ燐酸
緩衝液pH6.7 乃至8.4 及び1.8ｇの塩化ナトリウムを配
合して１０００ml、pH6.7 とした、ＬＩＳＰ−１６ｇ
のグリシン、２０mlの0.15Ｍ燐酸緩衝液pH6.7 乃至8.4
、1.8gの塩化ナトリウム、5.0gグルコース、0.06ｇの
塩化カルシウム及び0.1gのアデニンを配合して１０００
ml、pH6.7 とした、アドソール−0.9 ％塩化ナトリウ
ム、0.75％ マンニトール、2.2 ％ブドウ糖、及び0.02
2 ％アデニン；ＲＢＣ緩衝液−0.875 ％ブドウ糖、0.
9 ％塩化ナトリウム、0.214 ％マンニトール、0.008 ％
アデニン、0.255 ％クエン酸ナトリウム、0.029 ％クエ
ン酸及び0.022 ％第１燐酸ナトリウム；又は以下のよう
なその改変物緩衝液Ａ−pH7.4 の16ｍＭ燐酸緩衝液、
５ｍＭ塩化カリウム、４g/dlのＢＳＡ及びラクトース6.
9g/l、及び緩衝液Ｂ−ｐＨ7.4 の16ｍＭ燐酸緩衝液、
５ｍＭ塩化カリウム及びラクトース15g/l を有する。生
理的緩衝液は、種々のフスフェートを緩衝剤とする塩水
を有する。追加の重要な緩衝液は、成分としてマグネシ
ウムを含むものである。
【００３９】低温溶液はまた、一般的には低温予防保護
剤を含有する。低温予防保護剤は、試料のガラス転移温
度範囲を高め、これによって、試料を凍結状態に安定さ
せる。この範囲を高めることによって、試料を高速で乾
燥させることができる。また、低温予防保護剤により、
大きな試料のガラス化を可能にする一定の冷却速度で氷
生成を減らす。低温予防保護剤なしの現在の超高速冷却
方法では、試料のガラス化は数μｍの深さ達成されるに
過ぎない。次いで、立方晶氷や六角晶氷を形成する。低
温予防保護剤及び冷却方法を適当に選択することによっ
て、数μｍの深さに対する適当なガラス化を達成するこ
とができる。
剤を含有する。低温予防保護剤は、試料のガラス転移温
度範囲を高め、これによって、試料を凍結状態に安定さ
せる。この範囲を高めることによって、試料を高速で乾
燥させることができる。また、低温予防保護剤により、
大きな試料のガラス化を可能にする一定の冷却速度で氷
生成を減らす。低温予防保護剤なしの現在の超高速冷却
方法では、試料のガラス化は数μｍの深さ達成されるに
過ぎない。次いで、立方晶氷や六角晶氷を形成する。低
温予防保護剤及び冷却方法を適当に選択することによっ
て、数μｍの深さに対する適当なガラス化を達成するこ
とができる。
【００４０】本発明には種々の低温予防保護剤を使用す
ることができる。これらには、ジメチルスルホキシド
（ＤＭＳＯ）、デキストラン、ショ糖、１，２−プロパ
ンジオール、グリセロール、ソルビトール、フラクトー
ス、トレハロース、ラフィノース、ヒドロキシエチルス
ターチ、プロピレングリコール、２−３ブタンジオー
ル、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、プロリン（或い
は、その他の蛋白質安定剤）、ヒト漿液アルブミン及び
これらの組合せが含まれる。適当な低温予防保護剤は、
凝固点を下げ、及び／又は、ガラス場の相を達成するの
に必要な冷却速度を下げる水を構成する。これらはま
た、ガラス状態のガラス転移温度範囲を高める。
ることができる。これらには、ジメチルスルホキシド
（ＤＭＳＯ）、デキストラン、ショ糖、１，２−プロパ
ンジオール、グリセロール、ソルビトール、フラクトー
ス、トレハロース、ラフィノース、ヒドロキシエチルス
ターチ、プロピレングリコール、２−３ブタンジオー
ル、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、プロリン（或い
は、その他の蛋白質安定剤）、ヒト漿液アルブミン及び
これらの組合せが含まれる。適当な低温予防保護剤は、
凝固点を下げ、及び／又は、ガラス場の相を達成するの
に必要な冷却速度を下げる水を構成する。これらはま
た、ガラス状態のガラス転移温度範囲を高める。
【００４１】低温溶液はまた、生物学的懸濁液を一つ、
或いは二つ以上の乾燥予防保護剤組成物に露出させるこ
とを含む。乾燥予防保護剤は、概念規定によって、試料
を乾燥状態に安定させる。いくつかの低温予防保護剤は
また乾燥予防保護剤として働く。或る組成物は夫々の活
性度の可変量を有し、例えば、トレハロースは主に乾燥
予防保護剤、弱低温予防保護剤であり、ショ糖は主に低
温予防保護剤、弱乾燥予防保護剤である。例えば、トレ
ハロースとポリヒドロキシル含水炭素は、乾燥されたと
きに、ウィルス試料やワクチン試料の蛋白質や核酸のよ
うな高分子に結合し、これを安定させ、これによって、
試料の結合性を予防保護する。本発明では、種々の乾燥
予防保護剤、例えば、ショ糖、ラフィノース、トレハロ
ース、亜鉛、プロリン（或いは、その他の蛋白質安定
剤）、ミリスチン酸（ワクチンの既知の熱安定剤）及び
これらの組合せを使用することができる。
或いは二つ以上の乾燥予防保護剤組成物に露出させるこ
とを含む。乾燥予防保護剤は、概念規定によって、試料
を乾燥状態に安定させる。いくつかの低温予防保護剤は
また乾燥予防保護剤として働く。或る組成物は夫々の活
性度の可変量を有し、例えば、トレハロースは主に乾燥
予防保護剤、弱低温予防保護剤であり、ショ糖は主に低
温予防保護剤、弱乾燥予防保護剤である。例えば、トレ
ハロースとポリヒドロキシル含水炭素は、乾燥されたと
きに、ウィルス試料やワクチン試料の蛋白質や核酸のよ
うな高分子に結合し、これを安定させ、これによって、
試料の結合性を予防保護する。本発明では、種々の乾燥
予防保護剤、例えば、ショ糖、ラフィノース、トレハロ
ース、亜鉛、プロリン（或いは、その他の蛋白質安定
剤）、ミリスチン酸（ワクチンの既知の熱安定剤）及び
これらの組合せを使用することができる。
【００４２】低温予防保護剤は、単独で、或いは、その
他の低温予防保護剤（例えば、乾燥予防保護剤）、若し
くは、添加剤との組合せで有効であることがわかった。
例えば、プロリンとソルビトール、トレハノースと塩化
亜鉛、ソルビトールとミリスチン酸、ソルビトールとト
レハノース、ヒト漿液アルブミンとトレハノース、ショ
糖とラフィノース、ヒト漿液アルブミンとソルビトール
である。
他の低温予防保護剤（例えば、乾燥予防保護剤）、若し
くは、添加剤との組合せで有効であることがわかった。
例えば、プロリンとソルビトール、トレハノースと塩化
亜鉛、ソルビトールとミリスチン酸、ソルビトールとト
レハノース、ヒト漿液アルブミンとトレハノース、ショ
糖とラフィノース、ヒト漿液アルブミンとソルビトール
である。
【００４３】低温予防保護剤を、高速冷却する前に、数
分乃至数時間生物学的試料に加えることができる。低温
保存は、一般的には、連続的な工程として行われる。発
明者は、電子顕微鏡検査のため生物学的試料を調製する
ための方法として、低温固定、超低温分子蒸留乾燥の開
発に没頭した。この対策を有効にするため、発明者は、
乾燥特性と凍結試料内に存在する氷相との関係を研究し
た。
分乃至数時間生物学的試料に加えることができる。低温
保存は、一般的には、連続的な工程として行われる。発
明者は、電子顕微鏡検査のため生物学的試料を調製する
ための方法として、低温固定、超低温分子蒸留乾燥の開
発に没頭した。この対策を有効にするため、発明者は、
乾燥特性と凍結試料内に存在する氷相との関係を研究し
た。
【００４４】純粋物理的、或いは、乾燥処理技術による
電子顕微鏡検査の試料調製は、特に、最終目的が超微構
造と生化学の両方の分析であるときには、理論的アピー
ルを有する。顕微鏡検査の初期から、細胞試料や組織試
料の凍結処理、真空乾燥処理、或いは、凍結乾燥(FD)処
理を洗練し、発展させるいくつかの試みが行われてき
た。
電子顕微鏡検査の試料調製は、特に、最終目的が超微構
造と生化学の両方の分析であるときには、理論的アピー
ルを有する。顕微鏡検査の初期から、細胞試料や組織試
料の凍結処理、真空乾燥処理、或いは、凍結乾燥(FD)処
理を洗練し、発展させるいくつかの試みが行われてき
た。
【００４５】概念上の利点及び進歩が行われたにもかか
わらず、電子顕微鏡検査の凍結乾燥は、なお、所定の、
広く適用可能な技術の状態を達成しなければならない。
これの幾つかの理由を説明する。第一に、超微構造保存
は、従来の化学、すなわち、湿式処理技術、或いは、凍
結置換のようなハイブリッド技術と比較したとき、しば
しば劣る。第二に、試料操作、温度制御、真空パラメー
タ及び最終処理プロトコルの多数の実際的な問題があ
る。第三に、そして、たぶん最も根本的に、−123 度Ｃ
以下の温度での乾燥は不可能、或いは、実際的ではない
ということである。これらの実際的で理論的な障害の結
果として、低温凍結乾燥の研究は散発的に報告されたに
すぎない。
わらず、電子顕微鏡検査の凍結乾燥は、なお、所定の、
広く適用可能な技術の状態を達成しなければならない。
これの幾つかの理由を説明する。第一に、超微構造保存
は、従来の化学、すなわち、湿式処理技術、或いは、凍
結置換のようなハイブリッド技術と比較したとき、しば
しば劣る。第二に、試料操作、温度制御、真空パラメー
タ及び最終処理プロトコルの多数の実際的な問題があ
る。第三に、そして、たぶん最も根本的に、−123 度Ｃ
以下の温度での乾燥は不可能、或いは、実際的ではない
ということである。これらの実際的で理論的な障害の結
果として、低温凍結乾燥の研究は散発的に報告されたに
すぎない。
【００４６】この理論的な障害は、速動性ガス理論及び
クヌーセンの式； ＪS ＝ＮＰS 〔Ｍ／（２πＱＴ）〕0.5 によって表される昇華速度を適用することから生ずる。
なお、上式において、ＪS は昇華速度、Ｎは蒸発係数、
ＰS は飽和蒸気圧、Ｑは普遍気体定数、Ｔは試料の絶対
温度、Ｍは水の分子量である。
クヌーセンの式； ＪS ＝ＮＰS 〔Ｍ／（２πＱＴ）〕0.5 によって表される昇華速度を適用することから生ずる。
なお、上式において、ＪS は昇華速度、Ｎは蒸発係数、
ＰS は飽和蒸気圧、Ｑは普遍気体定数、Ｔは試料の絶対
温度、Ｍは水の分子量である。
【００４７】クヌーセンの式は、理論上、理想的な乾燥
状態においては、昇華速度が試料内の水の飽和蒸気圧に
正比例し、試料の絶対温度に反比例することを示してい
る。試料の温度は明確に定められるが、飽和蒸気圧はよ
り複雑なパラメータである。従来この式の適用に際し
て、理論的に決定された飽和蒸気圧を使用してきた。し
かしながら、これらの理論的な蒸気圧は融解熱を含んで
おり、従って、六方晶氷にのみ適用可能である。これら
の理論値に基づいて計算すると、例えば、「厚さ１mmの
氷層が凍結乾燥によって完全に除去されるまで、１５０
oK では、３．５年かかる。従って、１７０ oK 以下の
温度で凍結乾燥させようとするのは非現実的である。」
という結論となる。
状態においては、昇華速度が試料内の水の飽和蒸気圧に
正比例し、試料の絶対温度に反比例することを示してい
る。試料の温度は明確に定められるが、飽和蒸気圧はよ
り複雑なパラメータである。従来この式の適用に際し
て、理論的に決定された飽和蒸気圧を使用してきた。し
かしながら、これらの理論的な蒸気圧は融解熱を含んで
おり、従って、六方晶氷にのみ適用可能である。これら
の理論値に基づいて計算すると、例えば、「厚さ１mmの
氷層が凍結乾燥によって完全に除去されるまで、１５０
oK では、３．５年かかる。従って、１７０ oK 以下の
温度で凍結乾燥させようとするのは非現実的である。」
という結論となる。
【００４８】しかしながら、六方晶氷以外の他の幾つか
の氷相は、冷却の態様に応じて、試料内で共存すること
ができる。これらの異なる相は、蒸留、高圧付加及び急
速冷却を含む幾つかの方法によって達成される。現在認
知されている主な氷相は、非晶質、立方晶、六方晶のも
のである。これらの氷相は異なる安定度を示し、このこ
とは飽和蒸気圧も異なることを示唆している。２つの相
が共存しうる温度の蒸留水については、非晶質氷の飽和
蒸気圧は立方晶氷の飽和蒸気圧よりも１〜２対数高いこ
とが測定されている。
の氷相は、冷却の態様に応じて、試料内で共存すること
ができる。これらの異なる相は、蒸留、高圧付加及び急
速冷却を含む幾つかの方法によって達成される。現在認
知されている主な氷相は、非晶質、立方晶、六方晶のも
のである。これらの氷相は異なる安定度を示し、このこ
とは飽和蒸気圧も異なることを示唆している。２つの相
が共存しうる温度の蒸留水については、非晶質氷の飽和
蒸気圧は立方晶氷の飽和蒸気圧よりも１〜２対数高いこ
とが測定されている。
【００４９】実験で測定されたこれらの飽和蒸気圧をク
ヌーセンの式に適用すると、１mmの非晶質氷に対して、
１５０ oK における乾燥時間が、3.5 年から0.035 年、
すなわち12.7日に減少する。生物学的試料の急冷技術が
この相のほぼ５μｍを達成するので、クヌーセンの式の
みに基づいた場合、この成分の乾燥時間は1.5 時間程度
であろう。それ故、実際の乾燥時間に関しては、極低温
での乾燥に対する理論的な障害を克服することができる
であろう。
ヌーセンの式に適用すると、１mmの非晶質氷に対して、
１５０ oK における乾燥時間が、3.5 年から0.035 年、
すなわち12.7日に減少する。生物学的試料の急冷技術が
この相のほぼ５μｍを達成するので、クヌーセンの式の
みに基づいた場合、この成分の乾燥時間は1.5 時間程度
であろう。それ故、実際の乾燥時間に関しては、極低温
での乾燥に対する理論的な障害を克服することができる
であろう。
【００５０】しかしながら、乾燥は静的工程ではなく、
速度に依存する工程である。異なる氷相の飽和蒸気圧に
加えて、温度増加に伴う一方の相から他方の相への遷移
速度も考慮しなければならない。電子顕微鏡的試料の調
製については、乾燥は、理想的にはこのような遷移又は
失透なしに生ずるであろう。これらの遷移の速度に関す
る情報は限られている。非晶質から立方晶への遷移は、
−１６０ oC 〜−１３０ oC の範囲の温度に強く依存
し、 ｔ＝２．０４×１０28×exp(−０．４６５Ｔ) で表される不可逆性プロセスとして発生することが分か
っている。
速度に依存する工程である。異なる氷相の飽和蒸気圧に
加えて、温度増加に伴う一方の相から他方の相への遷移
速度も考慮しなければならない。電子顕微鏡的試料の調
製については、乾燥は、理想的にはこのような遷移又は
失透なしに生ずるであろう。これらの遷移の速度に関す
る情報は限られている。非晶質から立方晶への遷移は、
−１６０ oC 〜−１３０ oC の範囲の温度に強く依存
し、 ｔ＝２．０４×１０28×exp(−０．４６５Ｔ) で表される不可逆性プロセスとして発生することが分か
っている。
【００５１】立方晶から六方晶への遷移は温度依存性が
小さく、−１２０oC 〜−６５ oCの範囲で生じ、 ｔ＝２．５８×１０12×exp(−０．１２６Ｔ) で表される。興味深いことには、試料の温度が毎分５ o
C の速度で増加したとき、非晶質から立方晶への遷移
は、−１３０ oC 付近で突然発生した。
小さく、−１２０oC 〜−６５ oCの範囲で生じ、 ｔ＝２．５８×１０12×exp(−０．１２６Ｔ) で表される。興味深いことには、試料の温度が毎分５ o
C の速度で増加したとき、非晶質から立方晶への遷移
は、−１３０ oC 付近で突然発生した。
【００５２】上述のデータに基づいて、遷移速度並びに
飽和蒸気圧は、特別な氷相を特定の温度で乾燥させるこ
とができる深さを決定する。−１６０ oC における非晶
質氷については、遷移時間は２０５日である。実験で決
定した飽和蒸気圧の外挿及びクヌーセンの式によれば、
これは２６μｍの乾燥を可能にする。−１４０ oC では
遷移時間は２８分であり、理想的な条件の下では、０．
８μｍの乾燥を可能にする。−１６０ oC 以下では、す
なわち、遷移の開始の前では、水分子の移行運動エネル
ギ、従って乾燥を殆ど予測することができない。
飽和蒸気圧は、特別な氷相を特定の温度で乾燥させるこ
とができる深さを決定する。−１６０ oC における非晶
質氷については、遷移時間は２０５日である。実験で決
定した飽和蒸気圧の外挿及びクヌーセンの式によれば、
これは２６μｍの乾燥を可能にする。−１４０ oC では
遷移時間は２８分であり、理想的な条件の下では、０．
８μｍの乾燥を可能にする。−１６０ oC 以下では、す
なわち、遷移の開始の前では、水分子の移行運動エネル
ギ、従って乾燥を殆ど予測することができない。
【００５３】これらの考慮に基づけば、遷移乾燥の仮
説、すなわち、多数の氷相を含む試料については、各相
をその遷移中に次々と乾燥することができるということ
を前提とすることができる。乾燥される各相の量は、乾
燥装置の効率、加熱速度及び乾燥シェルのインピーダン
スを含む多数のパラメータに左右されるのは明白であろ
う。低温保存 低温保存は、細胞内又は細胞周囲での凍結と関連した損
傷に抗して、細胞構造及び代謝の保存することである。
自然の低温保護は組織の適応代謝から生じ、細胞の構
造、組成及び代謝バランスを変化させて凍結の耐性を増
大させる。試験室の実験では、細胞の活性又は超微細構
造を冷却後に維持しようとするとき、２つの方法を利用
することができる。第１の方法は、試料を急速に冷却し
て、ガラス化された即ち氷の結晶のない組織流体をつく
ることである。第２の方法は、化学添加剤を添加して低
温保護することである。化学添加剤は、グリセロール、
プロリン、砂糖、アルコールのような自然の低温予防保
護剤から、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）のような
有機溶剤、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、デキスト
ラン、ヒドロキシルエチルスターチ（ＨＥＳ）のような
高分子重合体まである。
説、すなわち、多数の氷相を含む試料については、各相
をその遷移中に次々と乾燥することができるということ
を前提とすることができる。乾燥される各相の量は、乾
燥装置の効率、加熱速度及び乾燥シェルのインピーダン
スを含む多数のパラメータに左右されるのは明白であろ
う。低温保存 低温保存は、細胞内又は細胞周囲での凍結と関連した損
傷に抗して、細胞構造及び代謝の保存することである。
自然の低温保護は組織の適応代謝から生じ、細胞の構
造、組成及び代謝バランスを変化させて凍結の耐性を増
大させる。試験室の実験では、細胞の活性又は超微細構
造を冷却後に維持しようとするとき、２つの方法を利用
することができる。第１の方法は、試料を急速に冷却し
て、ガラス化された即ち氷の結晶のない組織流体をつく
ることである。第２の方法は、化学添加剤を添加して低
温保護することである。化学添加剤は、グリセロール、
プロリン、砂糖、アルコールのような自然の低温予防保
護剤から、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）のような
有機溶剤、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、デキスト
ラン、ヒドロキシルエチルスターチ（ＨＥＳ）のような
高分子重合体まである。
【００５４】細胞及び組織のガラス化は、試料を冷却す
ることのできる速度及び組織自体の断熱特性によって制
限される。物理的な制限のため、従来技術を使用する薄
い組織層しかガラス化できない。これは低温保護用の化
学添加剤の着想となり、構造的及び機能的な損傷を生じ
させることなしに、生物学的試料を冷却しこれを保存し
ようとするのに極めて適した冷却速度を調節する。
ることのできる速度及び組織自体の断熱特性によって制
限される。物理的な制限のため、従来技術を使用する薄
い組織層しかガラス化できない。これは低温保護用の化
学添加剤の着想となり、構造的及び機能的な損傷を生じ
させることなしに、生物学的試料を冷却しこれを保存し
ようとするのに極めて適した冷却速度を調節する。
【００５５】凍結による生物学的試料の損傷は、物理学
及び生物学の基本的な原理の支配を受ける。これらの原
則のうちの或るものは長らく知られているものである
が、中には最近知られたばかりのものもある。生物学的
試料での凍結損傷の仕組みについての本格的な研究は、
今世紀の第２四半世紀までは始まっていなかった。これ
らの早期の研究では、氷の結晶による物理的な損傷が凍
結損傷の基本的な原因であるという考えが支配的であっ
た。細胞の脱水の影響及び細胞外溶質の濃度と細胞の死
との相関作用が説明されてきた。凍結損傷の“２つの因
子”の仮説は、細胞の損傷が、細胞外氷による溶質の濃
度か、或いは機械的な損傷を引き起こす細胞内氷の形成
のいずれかの結果であると提案されていた。
及び生物学の基本的な原理の支配を受ける。これらの原
則のうちの或るものは長らく知られているものである
が、中には最近知られたばかりのものもある。生物学的
試料での凍結損傷の仕組みについての本格的な研究は、
今世紀の第２四半世紀までは始まっていなかった。これ
らの早期の研究では、氷の結晶による物理的な損傷が凍
結損傷の基本的な原因であるという考えが支配的であっ
た。細胞の脱水の影響及び細胞外溶質の濃度と細胞の死
との相関作用が説明されてきた。凍結損傷の“２つの因
子”の仮説は、細胞の損傷が、細胞外氷による溶質の濃
度か、或いは機械的な損傷を引き起こす細胞内氷の形成
のいずれかの結果であると提案されていた。
【００５６】グリセロール及び他の極性の小さな化合物
の作用は、細胞内で浸透し結合作用を及ぼすものとして
説明されてきた。浸透する成分の結合作用が液体状態の
水を０ oC 以下の温度に維持するのに応じて、増加した
容量の細胞溶液が維持される。これは、凍結しない細胞
溶液において毒性電解質の過剰な集中を阻止する。ま
た、同様な影響は外部溶液でも生ずる。これに関連し
て、結合作用は、氷の接触する溶液の凝固点を降下させ
る点において、外部溶質による作用と称する。十分な防
護成分が存在する場合には、塩分の濃度は、損傷作用が
細胞にとって耐えるのに十分なほど緩慢に温度が低くな
るまで、重要な損傷を生じさせない。
の作用は、細胞内で浸透し結合作用を及ぼすものとして
説明されてきた。浸透する成分の結合作用が液体状態の
水を０ oC 以下の温度に維持するのに応じて、増加した
容量の細胞溶液が維持される。これは、凍結しない細胞
溶液において毒性電解質の過剰な集中を阻止する。ま
た、同様な影響は外部溶液でも生ずる。これに関連し
て、結合作用は、氷の接触する溶液の凝固点を降下させ
る点において、外部溶質による作用と称する。十分な防
護成分が存在する場合には、塩分の濃度は、損傷作用が
細胞にとって耐えるのに十分なほど緩慢に温度が低くな
るまで、重要な損傷を生じさせない。
【００５７】浸透性のない低温予防保護剤は、ショ糖か
らＰＶＰ、ＨＥＳ及びデキストランのような大型の高分
子物質まで、寸法が変化する。浸透性のない物質が、上
述の結合機構での手段以外の手段で作用することが示唆
されてきた。大型の分子の役割は、浸透圧の作用による
脱水作用であると信じられている。浸透圧の差によって
大部分の水が細胞から引き出されるとき、自由度の低い
水は細胞内氷の結晶化に利用されるが、これはしばしば
致死因子として扱われる。
らＰＶＰ、ＨＥＳ及びデキストランのような大型の高分
子物質まで、寸法が変化する。浸透性のない物質が、上
述の結合機構での手段以外の手段で作用することが示唆
されてきた。大型の分子の役割は、浸透圧の作用による
脱水作用であると信じられている。浸透圧の差によって
大部分の水が細胞から引き出されるとき、自由度の低い
水は細胞内氷の結晶化に利用されるが、これはしばしば
致死因子として扱われる。
【００５８】低温保護成分が存在しているときの冷却速
度は、凍結損傷において非常に重要な因子である。通
常、緩慢な冷却は急速な冷却よりも好ましい。これは、
急速な冷却は細胞内で氷の形成を促すためである。これ
は、収容された細胞水が凍結する前に水が細胞から逃げ
るのには不十分な時間であるので、発生する。冷却速度
が緩慢な場合には、細胞外の氷がまず形成され、その結
果細胞が脱水され、低温予防保護剤の存在とともに、細
胞内の氷の形成を阻止する。
度は、凍結損傷において非常に重要な因子である。通
常、緩慢な冷却は急速な冷却よりも好ましい。これは、
急速な冷却は細胞内で氷の形成を促すためである。これ
は、収容された細胞水が凍結する前に水が細胞から逃げ
るのには不十分な時間であるので、発生する。冷却速度
が緩慢な場合には、細胞外の氷がまず形成され、その結
果細胞が脱水され、低温予防保護剤の存在とともに、細
胞内の氷の形成を阻止する。
【００５９】浸透する成分は、凍結プロセスにおいて細
胞から極く初期に水を過剰に輸送させないことによって
作用すると考えられており、浸透しない成分は、細胞の
周囲の溶液を希釈する結合効果の他に細胞の脱水効果を
有する。しかしながら、これらの記載のいずれも、本問
題を完全には説明していない。細胞が極く短時間グリセ
ロール又はＤＭＳＯに曝されたとき（その際、おそらく
殆ど浸透が生じないであろう）、細胞は依然として低温
保護を示した。０ oCで３０秒から２時間の間、ＤＭＳ
Ｏ、グリセロール又はショ糖に曝された赤血球細胞は、
同程度の低温保護を示した。
胞から極く初期に水を過剰に輸送させないことによって
作用すると考えられており、浸透しない成分は、細胞の
周囲の溶液を希釈する結合効果の他に細胞の脱水効果を
有する。しかしながら、これらの記載のいずれも、本問
題を完全には説明していない。細胞が極く短時間グリセ
ロール又はＤＭＳＯに曝されたとき（その際、おそらく
殆ど浸透が生じないであろう）、細胞は依然として低温
保護を示した。０ oCで３０秒から２時間の間、ＤＭＳ
Ｏ、グリセロール又はショ糖に曝された赤血球細胞は、
同程度の低温保護を示した。
【００６０】ＨＥＳやＰＶＰのような溶質は全く浸透せ
ず、水は、浸透しないショ糖よりも分子量の大きな成分
を抽出する。大きな分子量は、重量を基礎として考察す
ると、このような成分を浸透しにくくし、総括的にみて
効果的にする。しかし、濃縮された溶液では、成分の結
合作用は、濃度に対して単なる線形関係に基づいて表現
されるよりも、より大きなものであると見られていた。
ず、水は、浸透しないショ糖よりも分子量の大きな成分
を抽出する。大きな分子量は、重量を基礎として考察す
ると、このような成分を浸透しにくくし、総括的にみて
効果的にする。しかし、濃縮された溶液では、成分の結
合作用は、濃度に対して単なる線形関係に基づいて表現
されるよりも、より大きなものであると見られていた。
【００６１】低温保護性状は、(1) 凍結から生ずる塩分
濃度の増大によって変質しないように高分子量成分によ
る膜の被覆、(2) 溶質を可逆的に漏らして過剰な脱水を
避けるように膜の透水特性の変更、(3) 粘性の増大、か
くして水の移送速度の緩慢化、(4) 低温凍結及び乾燥の
際、漿液のリポ蛋白質の変質阻止、(5) 酵素の活性低
下、(6) 膜プロテインの安定、を含む多数の作用から生
ずる。
濃度の増大によって変質しないように高分子量成分によ
る膜の被覆、(2) 溶質を可逆的に漏らして過剰な脱水を
避けるように膜の透水特性の変更、(3) 粘性の増大、か
くして水の移送速度の緩慢化、(4) 低温凍結及び乾燥の
際、漿液のリポ蛋白質の変質阻止、(5) 酵素の活性低
下、(6) 膜プロテインの安定、を含む多数の作用から生
ずる。
【００６２】凍結自体以外の、凍結組織の損傷の根源
は、多くの低温予防保護剤の浸透及び毒性の影響であ
る。低温予防保護成分を混合物で使用したとき、ＤＭＳ
Ｏ及びグリセロールの混合物へのポリエチレングリコー
ル（ＰＥＧ）の添加によって説明されたように、他の低
温予防保護剤の毒性を打ち消す成分もある。本出願の発
明者は、 ＤＭＳＯ 0.5 Ｍ プロピレングリコール 0.5 Ｍ 2-3 ブタンジオール 0.25 Ｍ プロリン 1.0 Ｍ ラフィノース 2.5 ％（Ｗ／Ｖ） ＰＶＰ（平均分子量40,000） 15％（Ｗ／Ｖ） デキストラン（平均分子量40000 乃至70,000)15 ％（Ｗ
／Ｖ） の混合物からなるガラス化溶液（ＶＳ）を開発した。
は、多くの低温予防保護剤の浸透及び毒性の影響であ
る。低温予防保護成分を混合物で使用したとき、ＤＭＳ
Ｏ及びグリセロールの混合物へのポリエチレングリコー
ル（ＰＥＧ）の添加によって説明されたように、他の低
温予防保護剤の毒性を打ち消す成分もある。本出願の発
明者は、 ＤＭＳＯ 0.5 Ｍ プロピレングリコール 0.5 Ｍ 2-3 ブタンジオール 0.25 Ｍ プロリン 1.0 Ｍ ラフィノース 2.5 ％（Ｗ／Ｖ） ＰＶＰ（平均分子量40,000） 15％（Ｗ／Ｖ） デキストラン（平均分子量40000 乃至70,000)15 ％（Ｗ
／Ｖ） の混合物からなるガラス化溶液（ＶＳ）を開発した。
【００６３】この溶質の個々の成分の毒性を試験した。
上述の混合物では、毒性の効果は、同じ濃度の１つの成
分だけを使用したときよりも、小さかった。この結果得
られた溶液は細胞培養物に対して毒性がなく、液体窒素
に入れたとき、ガラス状で光学的に明瞭なままである
（即ち、目に見える氷の結晶が形成されない）。また、
以下のものを含む混合物からなるガラス化溶液（Ｖ
Ｓ1 ）も開発した。
上述の混合物では、毒性の効果は、同じ濃度の１つの成
分だけを使用したときよりも、小さかった。この結果得
られた溶液は細胞培養物に対して毒性がなく、液体窒素
に入れたとき、ガラス状で光学的に明瞭なままである
（即ち、目に見える氷の結晶が形成されない）。また、
以下のものを含む混合物からなるガラス化溶液（Ｖ
Ｓ1 ）も開発した。
【００６４】 ＤＭＳＯ 0.5 Ｍ プロピレングリコール 0.5 Ｍ 2-3 ブタンジオール 0.25 Ｍ ラフィノース 10％（Ｗ／Ｖ） トレハロース 6 ％（Ｗ／Ｖ） ショ糖 6 ％（Ｗ／Ｖ） ＰＶＰ（平均分子量40,000） 12％（Ｗ／Ｖ） デキストラン（平均分子量70,000）12％（Ｗ／Ｖ） さらに、 ＤＭＳＯ 0.5 Ｍ プロピレングリコール 0.5 Ｍ 2-3 ブタンジオール 0.25 Ｍ ラフィノース 2.5 ％（Ｗ／Ｖ） ショ糖 12％（Ｗ／Ｖ） ＰＶＰ（平均分子量40,000） 15％（Ｗ／Ｖ） デキストラン（平均分子量40000 乃至70,000）15％（Ｗ
／Ｖ） の混合物からなる別のガラス化溶液（ＶＳ2 ）も開発し
た。
／Ｖ） の混合物からなる別のガラス化溶液（ＶＳ2 ）も開発し
た。
【００６５】要約すると、成分の低温保護の性質に影響
を及ぼす因子は、(a) 化学的性質、(b) 毒性の相対的な
欠如、(c) 分子の大きさ及び浸透力、(d) 混合物中の他
の成分との相互作用、である。低温予防保護剤の物理化
学的な効果は、(a) 総括的な基準における物質及び細胞
質の平衡凝固点の降下、(b) 均一な氷の核形成温度の降
下、(c) 溶質の粘性及び温度拡散率の変化による、氷の
結晶成長速度の減少、(d) 浸透作用による細胞の脱水効
果、である。冷却パラメータ 本発明の生物学的懸濁液の低温調製のために、種々の冷
却工程を用い得ることに注目することが重要である。本
発明の好ましい実施例では、適切な氷晶配合物を得るの
に急速な冷却が重要であると考えられる。本発明の最も
好ましい実施例では、ガラス化の手順が用いられ、これ
は、生物試料におけるかなりの部分の非晶水の形成をも
たらす。後述するように、使用される冷却形態に関わら
ず、非晶相水、立方晶水結晶及び六方晶水結晶が最終生
成物に存在するものと確信される。冷却方法は、冷却さ
れた低温溶液に見出される氷晶型の分布に明らかに関与
している。乾燥パラメータ 分子蒸留乾燥による凍結生物試料の制御された乾燥の目
的は、乾燥工程中に生じる更なる機械的又は科学的損傷
なくして、試料から水を除去することにある。これに
は、適当な乾燥条件を用いることによって、２つの基礎
的な損傷の発生を回避する必要がある。第１は、より大
きく、より安定し、且つより破壊的な結晶への遷移なく
して、氷晶相から水を除去することである。第２は、固
体であるが、非結晶性の水又は水─溶質混合物から、こ
れら固相の融解又は結晶化なくして、水を除去すること
である。この第２の構成要素は、非晶質状態で存在する
水、共融混合物における溶質と一緒の水、或いは、水を
結合し、水を作る化合物と一緒の水に関するものであ
り、これ故、凍結工程中に水の結晶化を防止する。従っ
て、ガラス状の水は、超急速冷却した純水の如く、低エ
ネルギー且つ低安定性のものであり、或いは、中間速度
の冷却により低温調製物質で得られる水の如く、高エネ
ルギー且つ高安定性のものである。
を及ぼす因子は、(a) 化学的性質、(b) 毒性の相対的な
欠如、(c) 分子の大きさ及び浸透力、(d) 混合物中の他
の成分との相互作用、である。低温予防保護剤の物理化
学的な効果は、(a) 総括的な基準における物質及び細胞
質の平衡凝固点の降下、(b) 均一な氷の核形成温度の降
下、(c) 溶質の粘性及び温度拡散率の変化による、氷の
結晶成長速度の減少、(d) 浸透作用による細胞の脱水効
果、である。冷却パラメータ 本発明の生物学的懸濁液の低温調製のために、種々の冷
却工程を用い得ることに注目することが重要である。本
発明の好ましい実施例では、適切な氷晶配合物を得るの
に急速な冷却が重要であると考えられる。本発明の最も
好ましい実施例では、ガラス化の手順が用いられ、これ
は、生物試料におけるかなりの部分の非晶水の形成をも
たらす。後述するように、使用される冷却形態に関わら
ず、非晶相水、立方晶水結晶及び六方晶水結晶が最終生
成物に存在するものと確信される。冷却方法は、冷却さ
れた低温溶液に見出される氷晶型の分布に明らかに関与
している。乾燥パラメータ 分子蒸留乾燥による凍結生物試料の制御された乾燥の目
的は、乾燥工程中に生じる更なる機械的又は科学的損傷
なくして、試料から水を除去することにある。これに
は、適当な乾燥条件を用いることによって、２つの基礎
的な損傷の発生を回避する必要がある。第１は、より大
きく、より安定し、且つより破壊的な結晶への遷移なく
して、氷晶相から水を除去することである。第２は、固
体であるが、非結晶性の水又は水─溶質混合物から、こ
れら固相の融解又は結晶化なくして、水を除去すること
である。この第２の構成要素は、非晶質状態で存在する
水、共融混合物における溶質と一緒の水、或いは、水を
結合し、水を作る化合物と一緒の水に関するものであ
り、これ故、凍結工程中に水の結晶化を防止する。従っ
て、ガラス状の水は、超急速冷却した純水の如く、低エ
ネルギー且つ低安定性のものであり、或いは、中間速度
の冷却により低温調製物質で得られる水の如く、高エネ
ルギー且つ高安定性のものである。
【００６６】これらの事象が生じるのを避けるために制
御された乾燥に要求される特徴の多くは、重複してい
る。これは、水の各形態が、結晶状態にあろうと、低温
調製化合物に結合していようと、特定のエネルギー状態
を有することとなり、乾燥のための要求条件を決定する
のは、形状ではなく、このエネルギー状態であるという
ことに起因する。例えば、(1) 中間的な冷却速度で純水
によって得られる立方晶氷の試料や、(2) 水にグリセロ
ールを容積比で４５％混合することによって得られるガ
ラス状水を熟考されたい。第１の試料は結晶性のものと
なり、乾燥の目的は、六方晶氷への遷移なくして、この
状態から水を除去することにある。第２の試料は、非晶
質の固体であり、乾燥の目的は、引き続く沸騰でガラス
状物から液体への融解なくして、この相から水を除去す
ることにある。立方晶氷では、その遷移の開始は−１３
０ oC あり、遷移速度は温度により変わり、−１３０ o
C で非常に遅く、−９０ oC で非常に早い。４５％のグ
リセロール水では、ガラス遷移温度は−１２０ oC であ
り、融解の開始を示す。融解工程は、−１２０ oC で非
常に遅く、温度により変わり、−９０ oC で非常に早く
なる。
御された乾燥に要求される特徴の多くは、重複してい
る。これは、水の各形態が、結晶状態にあろうと、低温
調製化合物に結合していようと、特定のエネルギー状態
を有することとなり、乾燥のための要求条件を決定する
のは、形状ではなく、このエネルギー状態であるという
ことに起因する。例えば、(1) 中間的な冷却速度で純水
によって得られる立方晶氷の試料や、(2) 水にグリセロ
ールを容積比で４５％混合することによって得られるガ
ラス状水を熟考されたい。第１の試料は結晶性のものと
なり、乾燥の目的は、六方晶氷への遷移なくして、この
状態から水を除去することにある。第２の試料は、非晶
質の固体であり、乾燥の目的は、引き続く沸騰でガラス
状物から液体への融解なくして、この相から水を除去す
ることにある。立方晶氷では、その遷移の開始は−１３
０ oC あり、遷移速度は温度により変わり、−１３０ o
C で非常に遅く、−９０ oC で非常に早い。４５％のグ
リセロール水では、ガラス遷移温度は−１２０ oC であ
り、融解の開始を示す。融解工程は、−１２０ oC で非
常に遅く、温度により変わり、−９０ oC で非常に早く
なる。
【００６７】立方晶水から六方晶氷への遷移の開始以
前、或いは、４５％のグリセロール水のガラス遷移の前
には、これらの相における水の飽和蒸気圧が極めて低
く、乾燥は極めてゆっくりと生じるであろう。従って、
制御された乾燥の目的は、六方晶氷への顕著な遷移に必
要とされるものよりも短時間で、遷移中に立方晶氷相か
ら水を除去すること、また、液体への遷移中ではある
が、かなりの液体が形成するのに必要とされるものより
も短時間に、４５％のグリセロール水の相から水を除去
することにある。
前、或いは、４５％のグリセロール水のガラス遷移の前
には、これらの相における水の飽和蒸気圧が極めて低
く、乾燥は極めてゆっくりと生じるであろう。従って、
制御された乾燥の目的は、六方晶氷への顕著な遷移に必
要とされるものよりも短時間で、遷移中に立方晶氷相か
ら水を除去すること、また、液体への遷移中ではある
が、かなりの液体が形成するのに必要とされるものより
も短時間に、４５％のグリセロール水の相から水を除去
することにある。
【００６８】この議論は、立方晶又は六方晶の形態の結
晶性、或いは、非晶質の如く非結晶性であろうと、分子
に結合されていようと、また、低温予防保護剤、蛋白
質、含水炭素又は脂質であろうと、全ての形態の水に繰
り返し適用できる。この考え方を簡素化するために、凍
結した生物試料中の水を特定のエネルギー準位を有する
ものとして説明することができる。凍結した生物試料に
は、多数の限定されたエネルギー準位；Ｅ1 、Ｅ2 、Ｅ
3 ・・・Ｅn の水形態がある。調製のモード、試料の性
質、低温予防保護剤又は他の添加剤の使用、及び用いら
れる冷却速度は、これらの異なる水形態の相対比を決定
する。各エネルギー準位は、遷移又は融解の開始温度、
及び遷移又は融解速度の温度依存性を決定する。
晶性、或いは、非晶質の如く非結晶性であろうと、分子
に結合されていようと、また、低温予防保護剤、蛋白
質、含水炭素又は脂質であろうと、全ての形態の水に繰
り返し適用できる。この考え方を簡素化するために、凍
結した生物試料中の水を特定のエネルギー準位を有する
ものとして説明することができる。凍結した生物試料に
は、多数の限定されたエネルギー準位；Ｅ1 、Ｅ2 、Ｅ
3 ・・・Ｅn の水形態がある。調製のモード、試料の性
質、低温予防保護剤又は他の添加剤の使用、及び用いら
れる冷却速度は、これらの異なる水形態の相対比を決定
する。各エネルギー準位は、遷移又は融解の開始温度、
及び遷移又は融解速度の温度依存性を決定する。
【００６９】制御された乾燥工程は、遷移中に、遷移を
完了させるのに必要とされるものよりも短時間に、異な
る状態の水を各々、除去できなければならない。従っ
て、この乾燥モードは、幾つかの条件に適合することを
必要としている。先ず、試料は、試料の最も低い遷移温
度より高い昇温なくして、乾燥機に載荷されなければな
らない。もし昇温が生じたならば、明らかな遷移が生じ
ないように短時間に亘るものでなければならない。理想
的には、載荷は、純粋な超急速冷却された非晶水にとっ
て最も低い認識可能な１６０ oC の遷移よりもかなり低
温で、−１９０ oC の液化窒素の下でなされる。しかし
ながら、試料が主として立方晶氷、或いは、−１００ o
C 乃至−１３０ oC 程度のガラス遷移の低温予防保護剤
及び水の混合物である場合、閉回路の冷却装置が、遷移
の開始より低い試料温度の維持を十分に可能にするであ
ろう。
完了させるのに必要とされるものよりも短時間に、異な
る状態の水を各々、除去できなければならない。従っ
て、この乾燥モードは、幾つかの条件に適合することを
必要としている。先ず、試料は、試料の最も低い遷移温
度より高い昇温なくして、乾燥機に載荷されなければな
らない。もし昇温が生じたならば、明らかな遷移が生じ
ないように短時間に亘るものでなければならない。理想
的には、載荷は、純粋な超急速冷却された非晶水にとっ
て最も低い認識可能な１６０ oC の遷移よりもかなり低
温で、−１９０ oC の液化窒素の下でなされる。しかし
ながら、試料が主として立方晶氷、或いは、−１００ o
C 乃至−１３０ oC 程度のガラス遷移の低温予防保護剤
及び水の混合物である場合、閉回路の冷却装置が、遷移
の開始より低い試料温度の維持を十分に可能にするであ
ろう。
【００７０】試料は、一旦載荷されると、真空に曝さ
れ、凝縮器の表面域の直線上になければならない。これ
らの基準も又、試料に存する水の相の性質によって決定
される。以下の目的が達成されなければならない。特定
の相の乾燥中にチャンバ内の真空は、除去すべき相の水
の飽和蒸気圧と少なくとも平衡するか、或いは、該飽和
蒸気圧よりも低い水の分圧を形成しなければならない。
この飽和蒸気圧は、水の相の性質及びその温度により変
わる。これ故、−１６０ oC 乃至−１３０ oC の遷移範
囲における純粋な非晶水では、概略の飽和蒸気圧は夫
々、６×１０-12mb（−１６０ oC ）及び５×１０-7mb
（−１３０ oC ）である。この温度範囲（−１６０ oC
乃至−１３０ oC）における立方晶水への非晶質の遷移
時間は、５×１０5 分から５分まで変化するので、５×
１０-10mb 及び５×１０-8mbの真空を要する−１５０ o
C 乃至−１４０ oC 程度の温度に達するまで、乾燥は非
常に遅い。これは或る極限を示す。
れ、凝縮器の表面域の直線上になければならない。これ
らの基準も又、試料に存する水の相の性質によって決定
される。以下の目的が達成されなければならない。特定
の相の乾燥中にチャンバ内の真空は、除去すべき相の水
の飽和蒸気圧と少なくとも平衡するか、或いは、該飽和
蒸気圧よりも低い水の分圧を形成しなければならない。
この飽和蒸気圧は、水の相の性質及びその温度により変
わる。これ故、−１６０ oC 乃至−１３０ oC の遷移範
囲における純粋な非晶水では、概略の飽和蒸気圧は夫
々、６×１０-12mb（−１６０ oC ）及び５×１０-7mb
（−１３０ oC ）である。この温度範囲（−１６０ oC
乃至−１３０ oC）における立方晶水への非晶質の遷移
時間は、５×１０5 分から５分まで変化するので、５×
１０-10mb 及び５×１０-8mbの真空を要する−１５０ o
C 乃至−１４０ oC 程度の温度に達するまで、乾燥は非
常に遅い。これは或る極限を示す。
【００７１】立方晶氷では、飽和蒸気圧が非晶水よりも
或る程度（the order of one log)低いので、乾燥は−
１３０ oCの遷移開始より低い温度で殆ど生じないであ
ろう。遷移範囲（−１３０ oC 乃至−１００ oC ）で
は、立方晶氷の飽和蒸気圧は、略５×１０-8mb乃至９×
１０-5mbである。立方晶から六方晶への遷移時間は夫
々、７００分及び１０９分である。従って、飽和蒸気圧
は、乾燥のための真空の要求条件を決定するのであり、
これを全ての水の相の存在に適用し得る。重要なのは、
同一の真空の基準が全ての相に適応し得ず、相により変
わることを注意することである。
或る程度（the order of one log)低いので、乾燥は−
１３０ oCの遷移開始より低い温度で殆ど生じないであ
ろう。遷移範囲（−１３０ oC 乃至−１００ oC ）で
は、立方晶氷の飽和蒸気圧は、略５×１０-8mb乃至９×
１０-5mbである。立方晶から六方晶への遷移時間は夫
々、７００分及び１０９分である。従って、飽和蒸気圧
は、乾燥のための真空の要求条件を決定するのであり、
これを全ての水の相の存在に適用し得る。重要なのは、
同一の真空の基準が全ての相に適応し得ず、相により変
わることを注意することである。
【００７２】真空の第２の基準は、作られた平均自由行
程が試料と凝縮器表面との間の距離よりも大きいことで
ある。理想的には、これは１０倍大きい。凝縮器表面
は、乾燥中に凝縮器表面に凝縮した水の飽和蒸気圧が試
料中の水の相の飽和蒸気圧よりもかなり低いように、試
料から除去される水の相の遷移開始温度よりも低温でな
ければならない。理想的には、これは、大きさが３オー
ダ低いべきである。多数の水の相を含む試料では、凝縮
器表面の温度は、除去すべき最も不安定な氷相の遷移開
始より低く維持されなければならはない。理想的には、
凝縮器も又、試料域の線上にあるべきである。
程が試料と凝縮器表面との間の距離よりも大きいことで
ある。理想的には、これは１０倍大きい。凝縮器表面
は、乾燥中に凝縮器表面に凝縮した水の飽和蒸気圧が試
料中の水の相の飽和蒸気圧よりもかなり低いように、試
料から除去される水の相の遷移開始温度よりも低温でな
ければならない。理想的には、これは、大きさが３オー
ダ低いべきである。多数の水の相を含む試料では、凝縮
器表面の温度は、除去すべき最も不安定な氷相の遷移開
始より低く維持されなければならはない。理想的には、
凝縮器も又、試料域の線上にあるべきである。
【００７３】一旦試料が載荷され、真空及び凝縮器表面
に曝されると、試料と試料保持器は、水分子の移動度を
増大させ、これにより水分子を漏出させるように加熱さ
れなければならない。これは、水の多くの相又はエネル
ギー準位を含む試料を乾燥させる上で、重要な基準的構
成要素である。試料の温度を正確に知らねばならない。
温度制御及び試料の加熱速度を正確に制御しなければな
らない。これは、試料内の水の相の乾燥が連続的である
のを確保するのに必要である。
に曝されると、試料と試料保持器は、水分子の移動度を
増大させ、これにより水分子を漏出させるように加熱さ
れなければならない。これは、水の多くの相又はエネル
ギー準位を含む試料を乾燥させる上で、重要な基準的構
成要素である。試料の温度を正確に知らねばならない。
温度制御及び試料の加熱速度を正確に制御しなければな
らない。これは、試料内の水の相の乾燥が連続的である
のを確保するのに必要である。
【００７４】これ故、エネルギー準位Ｅ1 、Ｅ2 ・・・
Ｅn の多数の水の相を含む試料では（Ｅ1 は最小の安定
性である）、加熱は、Ｅ2 に遷移する前にＥ1 が除去さ
れ、Ｅ3 に遷移する前にＥ2 が除去される如くに、生じ
なければならない。これは、下式によって決定される昇
華が生じるように、非平衡の乾燥状態、及び連続速度の
加熱又は一定の温度レベルに保持することによる加熱を
必要とする。
Ｅn の多数の水の相を含む試料では（Ｅ1 は最小の安定
性である）、加熱は、Ｅ2 に遷移する前にＥ1 が除去さ
れ、Ｅ3 に遷移する前にＥ2 が除去される如くに、生じ
なければならない。これは、下式によって決定される昇
華が生じるように、非平衡の乾燥状態、及び連続速度の
加熱又は一定の温度レベルに保持することによる加熱を
必要とする。
【００７５】 Js：昇華速度（g cm-1 sec-1) N : 蒸発係数 Ps: 飽和蒸気圧 M : 水の分子量 Q : 普遍気体定数 T : 試料の絶対温度 これは、除去される特定の相のための遷移速度と一致す
る。例えば、立方晶への非晶質の遷移速度は、下式によ
る。
る。例えば、立方晶への非晶質の遷移速度は、下式によ
る。
【００７６】E ＝2.04×1028×exp(−0.465 T) 別の手段として、遷移の窓(window)がT1乃至T2であるな
らば、昇華速度及び遷移速度は、この間の温度とともに
変化する。この窓T1乃至T2の間の加熱速度は、特定の温
度における遷移を完了する以前に、昇華が試料の全寸に
亘り生じるようなものでなければならない。
らば、昇華速度及び遷移速度は、この間の温度とともに
変化する。この窓T1乃至T2の間の加熱速度は、特定の温
度における遷移を完了する以前に、昇華が試料の全寸に
亘り生じるようなものでなければならない。
【００７７】このようにして、制御された乾燥の目的、
即ち、特定の相の明らかな氷結晶の成長、形成又は融解
なくして、各相の特性に適した条件下における水の各相
の連続的な除去が達成される。一旦乾燥されると、試料
は、物理的又は機械的に凝縮器表面又は他の源の水から
隔絶され、真空下にあり、或いは、乾燥した不活性ガス
の下にある密封容器に貯蔵されなければならない。
即ち、特定の相の明らかな氷結晶の成長、形成又は融解
なくして、各相の特性に適した条件下における水の各相
の連続的な除去が達成される。一旦乾燥されると、試料
は、物理的又は機械的に凝縮器表面又は他の源の水から
隔絶され、真空下にあり、或いは、乾燥した不活性ガス
の下にある密封容器に貯蔵されなければならない。
【００７８】好ましい実施例では、試料は、氷晶の形成
が試料に損傷を生じさせ得る程度以下のものとなるよう
な適当な方法によって冷却される。試料は、一旦凍結さ
れると、最も不安定な氷形態の遷移温度以下で貯蔵され
る。非晶氷では、これは、−１６０ oC 以下であるのが
良い。次いで、試料は、試料保持器に載荷され、−１９
６ oC に予備冷却され、分子蒸留乾燥器に移される。更
に、乾燥チャンバが閉じられ、真空保持のために密封さ
れる。含水試料は、再結晶化を避けるために、全操作を
通じて最も不安定な氷形態の遷移温度以下になければな
らない。
が試料に損傷を生じさせ得る程度以下のものとなるよう
な適当な方法によって冷却される。試料は、一旦凍結さ
れると、最も不安定な氷形態の遷移温度以下で貯蔵され
る。非晶氷では、これは、−１６０ oC 以下であるのが
良い。次いで、試料は、試料保持器に載荷され、−１９
６ oC に予備冷却され、分子蒸留乾燥器に移される。更
に、乾燥チャンバが閉じられ、真空保持のために密封さ
れる。含水試料は、再結晶化を避けるために、全操作を
通じて最も不安定な氷形態の遷移温度以下になければな
らない。
【００７９】試料が載荷されると、チャンバの内部に高
真空（１０-8乃至１０-6mb）が作られる。試料は、チャ
ンバ内の平均自由行程よりも凝縮器表面（LN2 冷却チャ
ンバ壁）にかなり接近して置かれる。凝縮器の温度は、
常に試料の温度以下になければならない。非晶質試料で
は、凝縮器は−１９６ oC であるのが良い。次いで、試
料保持器は、プログラマブル・ヒータ・マイクロプロセ
ッサの熱電対ループにより加熱される。加熱プログラム
は、試料の性質により決定される。非晶質、立方晶及び
六方晶氷を含む試料のための典型的なプログラムは、−
１８０ oC から−１５０ oC まで１０ oC ／時間、−１
５０ oC から−７０ oC まで１ oC ／時間、そして、−
７０ oC から＋２０ oC まで１０ oC ／時間である。
真空（１０-8乃至１０-6mb）が作られる。試料は、チャ
ンバ内の平均自由行程よりも凝縮器表面（LN2 冷却チャ
ンバ壁）にかなり接近して置かれる。凝縮器の温度は、
常に試料の温度以下になければならない。非晶質試料で
は、凝縮器は−１９６ oC であるのが良い。次いで、試
料保持器は、プログラマブル・ヒータ・マイクロプロセ
ッサの熱電対ループにより加熱される。加熱プログラム
は、試料の性質により決定される。非晶質、立方晶及び
六方晶氷を含む試料のための典型的なプログラムは、−
１８０ oC から−１５０ oC まで１０ oC ／時間、−１
５０ oC から−７０ oC まで１ oC ／時間、そして、−
７０ oC から＋２０ oC まで１０ oC ／時間である。
【００８０】試料は、２０ oC に達すると、真空チャン
バ内で適当な容器内に密封され、引き続く貯蔵のために
取り出される。或る形態では、試料は、ガラス小壜内に
収容され、ブチルゴムの凍結乾燥ストッパで円の端が密
封される。なお、米国特許第4,865,871 号には、分子蒸
留乾燥器の作動がより詳細に説明されている。再構成 生物物質の凍結及び乾燥は、通常は高分子の立体配座を
安定させる結合力に大きな物理的応力を与える。溶液が
凍結するとき、電解質濃度の増大や、おそらくはpHの変
化が、この不安定化効果に寄与する。結果として、膜構
造の溶解を含む試料の改変、特定の酵素の不活性化、及
び蛋白質の変性が起きるかもしれない。
バ内で適当な容器内に密封され、引き続く貯蔵のために
取り出される。或る形態では、試料は、ガラス小壜内に
収容され、ブチルゴムの凍結乾燥ストッパで円の端が密
封される。なお、米国特許第4,865,871 号には、分子蒸
留乾燥器の作動がより詳細に説明されている。再構成 生物物質の凍結及び乾燥は、通常は高分子の立体配座を
安定させる結合力に大きな物理的応力を与える。溶液が
凍結するとき、電解質濃度の増大や、おそらくはpHの変
化が、この不安定化効果に寄与する。結果として、膜構
造の溶解を含む試料の改変、特定の酵素の不活性化、及
び蛋白質の変性が起きるかもしれない。
【００８１】乳酸脱水素酵素の研究により、凍結及び解
凍が、生物活性の変化に伴われるサブユニットへの四量
体酵素の解離を生じさせることが示された。解離は、イ
オン強度及びpHにより変わると分かった。Ｌアスパラギ
ナーゼの四次構造の調べる他の研究により、この酵素
が、凍結乾燥時に活性四量体から不活性単量体に解離す
ることが明らかにされた。この単量体状態は、高pH且つ
高イオン強度の緩衝液で乾燥した酵素を再構成すること
によって、安定化されると分かった。しかしながら、こ
の解離が、中性pH且つ低イオン強度での再構成に関し、
全くに可逆性であることが示された。他方、pHの効果
は、立体配座的に再会合させないようにするサブユニッ
トをもたらす三次元構造の変化を誘発する。
凍が、生物活性の変化に伴われるサブユニットへの四量
体酵素の解離を生じさせることが示された。解離は、イ
オン強度及びpHにより変わると分かった。Ｌアスパラギ
ナーゼの四次構造の調べる他の研究により、この酵素
が、凍結乾燥時に活性四量体から不活性単量体に解離す
ることが明らかにされた。この単量体状態は、高pH且つ
高イオン強度の緩衝液で乾燥した酵素を再構成すること
によって、安定化されると分かった。しかしながら、こ
の解離が、中性pH且つ低イオン強度での再構成に関し、
全くに可逆性であることが示された。他方、pHの効果
は、立体配座的に再会合させないようにするサブユニッ
トをもたらす三次元構造の変化を誘発する。
【００８２】これらの研究は、低温保存プロトコルに用
いられる形態のみならず、再構成溶液の最適なpH及びイ
オン強度の状態を決定することの重要性を提示した。こ
のようにして、最大限の活性及び安定性が得られる。蒸
気相の再水化の如き再構成、或いは、温度の他の変数も
又、凍結及び乾燥に後続する活性の保持にとって、重要
なものであろう。当業者は、再水化温度に依存するレク
チンに対する増殖性の応答における著しい相違、或い
は、試料が蒸気相によって再構成されるか否かを明らか
にしている。凍結乾燥されたリンパ球がドライアイスの
温度で再水化され、次いで温められたとき、レクチンに
対する改良された応答が注目された。この再構成の漸進
的方法は、突然の再水化によって誘発される浸透応力を
低減させた。貯蔵に関する考察 凍結した試料から水を昇華させることは、生物学的物質
の活性成分を保存するための優れた方法であった。しか
し、長期間安定して最適に活性を維持するためには、乾
燥工程と貯蔵条件を厳しく制御する必要がある。試料の
自由水、すなわち非結合水を除去した後、二次乾燥の工
程が続行し、該工程で構造的に結合した水が除去され
る。結合水は蛋白質の立体配座の維持に密接に関係す
る。従って、残留水分として知られる乾燥した試料内に
残存する水の量は、試料の生存と安定とに影響するの
で、乾燥工程において重要な変数である。
いられる形態のみならず、再構成溶液の最適なpH及びイ
オン強度の状態を決定することの重要性を提示した。こ
のようにして、最大限の活性及び安定性が得られる。蒸
気相の再水化の如き再構成、或いは、温度の他の変数も
又、凍結及び乾燥に後続する活性の保持にとって、重要
なものであろう。当業者は、再水化温度に依存するレク
チンに対する増殖性の応答における著しい相違、或い
は、試料が蒸気相によって再構成されるか否かを明らか
にしている。凍結乾燥されたリンパ球がドライアイスの
温度で再水化され、次いで温められたとき、レクチンに
対する改良された応答が注目された。この再構成の漸進
的方法は、突然の再水化によって誘発される浸透応力を
低減させた。貯蔵に関する考察 凍結した試料から水を昇華させることは、生物学的物質
の活性成分を保存するための優れた方法であった。しか
し、長期間安定して最適に活性を維持するためには、乾
燥工程と貯蔵条件を厳しく制御する必要がある。試料の
自由水、すなわち非結合水を除去した後、二次乾燥の工
程が続行し、該工程で構造的に結合した水が除去され
る。結合水は蛋白質の立体配座の維持に密接に関係す
る。従って、残留水分として知られる乾燥した試料内に
残存する水の量は、試料の生存と安定とに影響するの
で、乾燥工程において重要な変数である。
【００８３】残留水分は、“残留水のパーセント”とし
て表現され、原試料の単位重量（グラム）当たりの残留
水の重量（グラム）に等しい。氷の真空昇華により乾燥
された生物学的物質は、残留水の含有量が最適になるま
で乾燥された場合に安定性が増すことが一般に認められ
ている。不十分にまたは過度に乾燥された、すなわち最
適値を超える或いは最適値未満の水分含有量まで乾燥さ
れた物質は、劣化し易い。
て表現され、原試料の単位重量（グラム）当たりの残留
水の重量（グラム）に等しい。氷の真空昇華により乾燥
された生物学的物質は、残留水の含有量が最適になるま
で乾燥された場合に安定性が増すことが一般に認められ
ている。不十分にまたは過度に乾燥された、すなわち最
適値を超える或いは最適値未満の水分含有量まで乾燥さ
れた物質は、劣化し易い。
【００８４】個々の乾燥試料により最適の残留水分は異
なるが、水分の程度が次善であればある程度の安定が見
込まれる。試料を過度に乾燥させると、すなわち乾燥安
定装置を使わずに残留水分が１〜２％未満であると、一
般に構造化水のほぼ全てが除去され、蛋白質の露出した
親水性部位が酸化により飽和すなわち閉鎖される。この
酸化は劣化を引き起し、生物活性の対応する低下を引き
起こす。他方、残留水分が５％を超えることは、一般に
乾燥が不十分であることを意味し、該状態では充分な量
の“自由水”が試料内に残存し、該水分は蛋白質の配座
転移に寄与する。その結果、ポリペプチド連鎖が再配列
され、天然蛋白質の典型的な規則正しい配列からより乱
れた配列に移行する。これらの蛋白質の摂動は、乾燥製
品の長期安定性を低下させうる。
なるが、水分の程度が次善であればある程度の安定が見
込まれる。試料を過度に乾燥させると、すなわち乾燥安
定装置を使わずに残留水分が１〜２％未満であると、一
般に構造化水のほぼ全てが除去され、蛋白質の露出した
親水性部位が酸化により飽和すなわち閉鎖される。この
酸化は劣化を引き起し、生物活性の対応する低下を引き
起こす。他方、残留水分が５％を超えることは、一般に
乾燥が不十分であることを意味し、該状態では充分な量
の“自由水”が試料内に残存し、該水分は蛋白質の配座
転移に寄与する。その結果、ポリペプチド連鎖が再配列
され、天然蛋白質の典型的な規則正しい配列からより乱
れた配列に移行する。これらの蛋白質の摂動は、乾燥製
品の長期安定性を低下させうる。
【００８５】長期の貯蔵に成功するためには、残留水が
最適レベルになるまで試料を乾燥させる必要がある。生
物学的試料の不十分な乾燥とその結果については本稿で
示された。インフルエンザウィルスの懸濁液を真空中で
の水の昇華により乾燥した場合、残留水分が約1.7 ％で
安定性が最大になった。乾燥不足または過乾燥で水分含
有量が次善の場合には、ウィルスが劣化した。このこと
は、試料内の自由水または結合水の量の変化が蛋白質の
構造と活性に影響するということを示唆している。
最適レベルになるまで試料を乾燥させる必要がある。生
物学的試料の不十分な乾燥とその結果については本稿で
示された。インフルエンザウィルスの懸濁液を真空中で
の水の昇華により乾燥した場合、残留水分が約1.7 ％で
安定性が最大になった。乾燥不足または過乾燥で水分含
有量が次善の場合には、ウィルスが劣化した。このこと
は、試料内の自由水または結合水の量の変化が蛋白質の
構造と活性に影響するということを示唆している。
【００８６】試料の安定性を最大にし、乾燥薬剤または
試薬に対する法定要件を満たすためには、試料の乾燥に
引き続いて残留水の含有量を決定することが必須であ
る。残留水分を計測するのに幾つかの方法が利用でき
る。 1.重量（加熱法） 既知量の乾燥製品を加熱する。減少重量が水分含有量に
等しい。 2.化学分析法 本方法は、ピリジンと二酸化硫黄とメタノールとの混合
物中での水と自由沃度との反応に基づく。自由沃度が存
在すると、終了点が電量分析的に検知される。 H2O ＋
I2 ＋ SO2＋ ROH ＋ 3RN → 2RNHI＋RN＋HSO4R 3.ガスクロマトグラフ 各方法には限界がある。したがって、単一の水分決定法
に依存しないのが賢明である。むしろ、結果を有効あら
しめるためには複数の方法を採用すべきである。
試薬に対する法定要件を満たすためには、試料の乾燥に
引き続いて残留水の含有量を決定することが必須であ
る。残留水分を計測するのに幾つかの方法が利用でき
る。 1.重量（加熱法） 既知量の乾燥製品を加熱する。減少重量が水分含有量に
等しい。 2.化学分析法 本方法は、ピリジンと二酸化硫黄とメタノールとの混合
物中での水と自由沃度との反応に基づく。自由沃度が存
在すると、終了点が電量分析的に検知される。 H2O ＋
I2 ＋ SO2＋ ROH ＋ 3RN → 2RNHI＋RN＋HSO4R 3.ガスクロマトグラフ 各方法には限界がある。したがって、単一の水分決定法
に依存しないのが賢明である。むしろ、結果を有効あら
しめるためには複数の方法を採用すべきである。
【００８７】一旦最適の残留水分まで乾燥されても、真
空から取り出されると、吸湿性と酸素感受性の故に試料
は未だ不安定であると見做される。大気中での再水化か
ら試料を保護し、且つ酸素への暴露を最小にするための
対策を講ずべきである。このような保護は、試料の長期
安定性の維持のために必須である。本稿に示す証拠は、
貯蔵温度のみならず、ガスの条件、すなわち該条件のも
とで試料が密封されるガスの条件、が試料の長期安定性
に影響すること示している。インフルエンザウィルスの
最大安定性は、試料が低温（−20 oC ）のヘリウムガス
又は水素ガス中で貯蔵される時に得られることが、種々
のガスと貯蔵温度の比較研究により立証された。種々の
貯蔵温度で他のガスまたは真空中で密封すると、種々の
レベルの安定性が得られた。発明者は、酸素と試料との
接触を最も効果的に制限する条件が、蛋白質表面の露出
した親水性部位の酸化を低減させ、生物活性を顕著に改
善すると仮定する。妥当な貯蔵パラメータ、すなわち温
度とガスまたは真空中での密封とは、試料の長期安定性
を獲得するために重要である。保護剤 低温保存は、低温予防保護剤と最適冷却速度との組合せ
により達成される。必要な低温予防保護剤の濃度を最小
にしてその毒性を最小にし、かつ試料内に適正な氷相を
作るために必要な冷却速度をも最小にすることが肝要で
ある。
空から取り出されると、吸湿性と酸素感受性の故に試料
は未だ不安定であると見做される。大気中での再水化か
ら試料を保護し、且つ酸素への暴露を最小にするための
対策を講ずべきである。このような保護は、試料の長期
安定性の維持のために必須である。本稿に示す証拠は、
貯蔵温度のみならず、ガスの条件、すなわち該条件のも
とで試料が密封されるガスの条件、が試料の長期安定性
に影響すること示している。インフルエンザウィルスの
最大安定性は、試料が低温（−20 oC ）のヘリウムガス
又は水素ガス中で貯蔵される時に得られることが、種々
のガスと貯蔵温度の比較研究により立証された。種々の
貯蔵温度で他のガスまたは真空中で密封すると、種々の
レベルの安定性が得られた。発明者は、酸素と試料との
接触を最も効果的に制限する条件が、蛋白質表面の露出
した親水性部位の酸化を低減させ、生物活性を顕著に改
善すると仮定する。妥当な貯蔵パラメータ、すなわち温
度とガスまたは真空中での密封とは、試料の長期安定性
を獲得するために重要である。保護剤 低温保存は、低温予防保護剤と最適冷却速度との組合せ
により達成される。必要な低温予防保護剤の濃度を最小
にしてその毒性を最小にし、かつ試料内に適正な氷相を
作るために必要な冷却速度をも最小にすることが肝要で
ある。
【００８８】本発明の工程を開発する活動は、ウィル
ス、培養された細胞及び赤血球等の生物学的試料の低温
保存と乾燥安定化とに主として差し向けられてきたが、
本工程は前記に限定されない。本発明の方法に成功裏に
使用され、かつ冷却と乾燥とに引き続く生物活性の維持
を可能にした低温予防保護剤と乾燥予防保護剤の幾つか
を以下の例に示す。例１ 哺乳類の培養細胞の保存及び貯蔵 1. ＮＣＴＣ９２９の細胞を2.5 x 105 個／mlの割合で
ＬＩＳＰ中に再懸濁させた。 2. その後、超音波ネブライザ（25 kHz ノズル）を用
いて1.5 ワットで、毎分６mlの流速で細胞を噴霧し、直
径が約２００μｍの微細な液滴を作り、上述の装置を用
いて−１６０ oC 以下の温度まで冷却した。 3. 約２mlの細胞の部分標本（原液の体積で）を収集し
ガラス壜に入れ、分子蒸留乾燥器内で乾燥した。 4. 乾燥の後、ガラス壜を乾燥器内で真空下で密封し、
真空を乾燥窒素ガスで置換した。 5. ４ oC で３日間貯蔵した後、壜を大気環境のもとで
開封し、乾燥細胞を 250μl のガラス化溶液（ＶＳ）を
収容する細胞培養皿に移した。このガラス化溶液には以
下のものが含まれる。
ス、培養された細胞及び赤血球等の生物学的試料の低温
保存と乾燥安定化とに主として差し向けられてきたが、
本工程は前記に限定されない。本発明の方法に成功裏に
使用され、かつ冷却と乾燥とに引き続く生物活性の維持
を可能にした低温予防保護剤と乾燥予防保護剤の幾つか
を以下の例に示す。例１ 哺乳類の培養細胞の保存及び貯蔵 1. ＮＣＴＣ９２９の細胞を2.5 x 105 個／mlの割合で
ＬＩＳＰ中に再懸濁させた。 2. その後、超音波ネブライザ（25 kHz ノズル）を用
いて1.5 ワットで、毎分６mlの流速で細胞を噴霧し、直
径が約２００μｍの微細な液滴を作り、上述の装置を用
いて−１６０ oC 以下の温度まで冷却した。 3. 約２mlの細胞の部分標本（原液の体積で）を収集し
ガラス壜に入れ、分子蒸留乾燥器内で乾燥した。 4. 乾燥の後、ガラス壜を乾燥器内で真空下で密封し、
真空を乾燥窒素ガスで置換した。 5. ４ oC で３日間貯蔵した後、壜を大気環境のもとで
開封し、乾燥細胞を 250μl のガラス化溶液（ＶＳ）を
収容する細胞培養皿に移した。このガラス化溶液には以
下のものが含まれる。
【００８９】 ＤＭＳＯ 0.5 Ｍ プロピレングリコール 0.5 Ｍ 2-3 ブタンジオール 0.25 Ｍ ラフィノース 10％（Ｗ／Ｖ） トレハロース 6 ％（Ｗ／Ｖ） ショ糖 6 ％（Ｗ／Ｖ） ＰＶＰ（平均分子量40,000） 12％（Ｗ／Ｖ） デキストラン（平均分子量70,000）12％（Ｗ／Ｖ） 6. 前記ガラス化溶液を、通常の細胞培養液を添加し
て、１０分間隔で段階的に希釈した。培養液の各添加に
より、ガラス化溶液を以下の濃度に希釈した。
て、１０分間隔で段階的に希釈した。培養液の各添加に
より、ガラス化溶液を以下の濃度に希釈した。
【００９０】70％、50％、25％、12.5％、及び1.25％。 7. 最後の希釈後、培養皿を３７℃、５％ CO2の培養器
に移し、２週間静置した。 結果： 噴霧、急速冷凍、分子蒸留乾燥及び再水化を含
む全ての工程の後、培養細胞は、明瞭な細胞質と核と明
確な細胞器官とを備え、完全な電子顕微鏡的外観を示し
た。所定の細胞は、アクリダインオレンジとプロピジウ
ム沃化物とにより、トリパンブルー排除と蛍光グリーン
とを示した。１１のコロニーが再水化細胞から生長し
た。例２ 哺乳類の培養細胞の保存と貯蔵 1. ＮＣＴＣ９２９の細胞をＬＩＳＰと１％グリセロー
ルとの混合液中に2.5×105 個／mlの割合で再懸濁させ
た。その後細胞を室温で２０分培養し、氷上で２０分冷
却し、低温遠心分離器内でスピンダウンさせ（４ oC 、
５分、1000rpm )、吸引して上澄みを除去し、原容積に
なるまで低温（４℃）のＬＩＳＰ緩衝剤中に再懸濁させ
た。 2. その後、上述の改良ソノテック装置を用い、1.5 ワ
ットに設定された２５kHz ノズルを用いて、６ml／分
の流速で細胞懸濁液を噴霧した。 3. 噴霧した微細な液滴を、明細書中で述べた低温固定
装置内で氷結させた。 4. 氷結した微細な液滴収集し、−８０ oC のコンデン
サ表面を試料の近傍に置くように改造したビルチスベン
チトップ（bench top)冷凍乾燥器内で乾燥させた。 5. 乾燥細胞を真空中で密封し、乾燥器から下ろし、４
℃で３日間貯蔵した。 6. 乾燥した試料壜を室温にし、試料の半分を、以下の
各250 μｌ中で再水化した。
に移し、２週間静置した。 結果： 噴霧、急速冷凍、分子蒸留乾燥及び再水化を含
む全ての工程の後、培養細胞は、明瞭な細胞質と核と明
確な細胞器官とを備え、完全な電子顕微鏡的外観を示し
た。所定の細胞は、アクリダインオレンジとプロピジウ
ム沃化物とにより、トリパンブルー排除と蛍光グリーン
とを示した。１１のコロニーが再水化細胞から生長し
た。例２ 哺乳類の培養細胞の保存と貯蔵 1. ＮＣＴＣ９２９の細胞をＬＩＳＰと１％グリセロー
ルとの混合液中に2.5×105 個／mlの割合で再懸濁させ
た。その後細胞を室温で２０分培養し、氷上で２０分冷
却し、低温遠心分離器内でスピンダウンさせ（４ oC 、
５分、1000rpm )、吸引して上澄みを除去し、原容積に
なるまで低温（４℃）のＬＩＳＰ緩衝剤中に再懸濁させ
た。 2. その後、上述の改良ソノテック装置を用い、1.5 ワ
ットに設定された２５kHz ノズルを用いて、６ml／分
の流速で細胞懸濁液を噴霧した。 3. 噴霧した微細な液滴を、明細書中で述べた低温固定
装置内で氷結させた。 4. 氷結した微細な液滴収集し、−８０ oC のコンデン
サ表面を試料の近傍に置くように改造したビルチスベン
チトップ（bench top)冷凍乾燥器内で乾燥させた。 5. 乾燥細胞を真空中で密封し、乾燥器から下ろし、４
℃で３日間貯蔵した。 6. 乾燥した試料壜を室温にし、試料の半分を、以下の
各250 μｌ中で再水化した。
【００９１】ａ．0.2 Ｍトリス塩酸中にデキストランを
25％（分子量 480,000 )添加した溶液、pH8.3 ｂ. 0.2 M トリス塩酸中にマンニトルを飽和させた溶
液、pH8.3 7. その後細胞を、１０％の馬の漿液と標準的な組織培
養濃度のペニシリンとストレプトマイシンとを含むＮＣ
ＴＣ１３５培養液を用いて４段階で８倍に希釈した。 8. 懸濁液の半分をペトリ皿で培養する一方、他方の半
分をスピンダウンし、１０％の馬の漿液とペニシリンと
ストレプトマイシンとを含むＮＣＴＣ１３５培養液に再
懸濁させた後培養した。 9. ２週間後、コロニーの数を計数することによって、
細胞の生長を評価した。 10. 約2.5 ×105 個の細胞から、計１３のコロニーが発
生した。
25％（分子量 480,000 )添加した溶液、pH8.3 ｂ. 0.2 M トリス塩酸中にマンニトルを飽和させた溶
液、pH8.3 7. その後細胞を、１０％の馬の漿液と標準的な組織培
養濃度のペニシリンとストレプトマイシンとを含むＮＣ
ＴＣ１３５培養液を用いて４段階で８倍に希釈した。 8. 懸濁液の半分をペトリ皿で培養する一方、他方の半
分をスピンダウンし、１０％の馬の漿液とペニシリンと
ストレプトマイシンとを含むＮＣＴＣ１３５培養液に再
懸濁させた後培養した。 9. ２週間後、コロニーの数を計数することによって、
細胞の生長を評価した。 10. 約2.5 ×105 個の細胞から、計１３のコロニーが発
生した。
【００９２】ａ．試料から発生したコロニーの一つをデ
キストラン中で再水化しその後培 養した。 ｂ．試料から発生したコロニーの４つをデキストラン中
で再水化し、ＮＣＴＣ１３５培養液中に再懸濁させ、そ
の後培養した。 ｃ．試料から発生したコロニーの８つをマンニトール中
で再水化し、その後培養した。 ｄ．工程中に汚染したコロニーは無かった。例３ 哺乳類の培養細胞の保存及び貯蔵 1. ＮＣＴＣ９２９の細胞を2.5 ×105 個／ｍｌの割合
でＬＩＳＰと１％馬の漿液との混合液中に再懸濁させ
た。 2. その後、上述の改良ソノテック装置を用い、1.5 ワ
ットに設定された25 kHz ノズルを用いて、毎分６mlの
流速で細胞懸濁液を噴霧した。 3. 噴霧した微細な液滴を、明細書中で述べた低温固定
装置内で氷結させた。 4. 氷結した微細な液滴収集し、−８０ oC のコンデン
サ表面を試料の近傍に置くように改造したビルチスベン
チトップ（ Virtis bench top)冷凍乾燥器内で乾燥させ
た。 5. 乾燥細胞を真空中で密封し、乾燥器から下ろし、４
℃で３日間貯蔵した。 6. 乾燥した試料壜を室温にし、250 μl の、0.2 Ｍト
リス塩酸中に25％のデキストラン（分子量 480,000）を
添加しマンニトルを飽和させた溶液(pH8.3）中で再水化
した。 7. その後細胞を、１０％の馬の漿液と標準的な組織培
養濃度のペニシリンとストレプトマイシンとを含むＮＣ
ＴＣ１３５培養液を用いて４段階で８倍に希釈した。 8. 懸濁液の半分をペトリ皿で培養する一方、他方の半
分をスピンダウンし、ストレプトマイシンを含むＮＣＴ
Ｃ１３５培養液に再懸濁させた後培養した。 9. ２週間後、コロニーの数を計数することによって、
細胞の生長を評価した。 10. 約2.5 ×105 個の細胞から、計８０のコロニー、す
なわち各懸濁液から４０ のコロニー、が発生した。
キストラン中で再水化しその後培 養した。 ｂ．試料から発生したコロニーの４つをデキストラン中
で再水化し、ＮＣＴＣ１３５培養液中に再懸濁させ、そ
の後培養した。 ｃ．試料から発生したコロニーの８つをマンニトール中
で再水化し、その後培養した。 ｄ．工程中に汚染したコロニーは無かった。例３ 哺乳類の培養細胞の保存及び貯蔵 1. ＮＣＴＣ９２９の細胞を2.5 ×105 個／ｍｌの割合
でＬＩＳＰと１％馬の漿液との混合液中に再懸濁させ
た。 2. その後、上述の改良ソノテック装置を用い、1.5 ワ
ットに設定された25 kHz ノズルを用いて、毎分６mlの
流速で細胞懸濁液を噴霧した。 3. 噴霧した微細な液滴を、明細書中で述べた低温固定
装置内で氷結させた。 4. 氷結した微細な液滴収集し、−８０ oC のコンデン
サ表面を試料の近傍に置くように改造したビルチスベン
チトップ（ Virtis bench top)冷凍乾燥器内で乾燥させ
た。 5. 乾燥細胞を真空中で密封し、乾燥器から下ろし、４
℃で３日間貯蔵した。 6. 乾燥した試料壜を室温にし、250 μl の、0.2 Ｍト
リス塩酸中に25％のデキストラン（分子量 480,000）を
添加しマンニトルを飽和させた溶液(pH8.3）中で再水化
した。 7. その後細胞を、１０％の馬の漿液と標準的な組織培
養濃度のペニシリンとストレプトマイシンとを含むＮＣ
ＴＣ１３５培養液を用いて４段階で８倍に希釈した。 8. 懸濁液の半分をペトリ皿で培養する一方、他方の半
分をスピンダウンし、ストレプトマイシンを含むＮＣＴ
Ｃ１３５培養液に再懸濁させた後培養した。 9. ２週間後、コロニーの数を計数することによって、
細胞の生長を評価した。 10. 約2.5 ×105 個の細胞から、計８０のコロニー、す
なわち各懸濁液から４０ のコロニー、が発生した。
【００９３】例 ４ 人間の赤血球の保存と貯蔵 人間の新鮮な赤血球を静脈穿刺によって採取し、血液全
体に対して１：１０の割合のＡＣＤ抗凝血剤に収集し
た。次いで、２０００ｇの血液の試料を１０分間遠心分
離機にかけ、上澄みを除去した。
体に対して１：１０の割合のＡＣＤ抗凝血剤に収集し
た。次いで、２０００ｇの血液の試料を１０分間遠心分
離機にかけ、上澄みを除去した。
【００９４】次いで、パックした赤血球の試料を、2.2
％のブドウ糖、グルコース、0.9 ％の塩化ナトリウム、
0.75％のマンニトール及び0.027 ％のアデニンから成る
緩衝液（Adsol)を使用して、５〜10％の赤血球容積率ま
で希釈した。採取及び分離の後、以下の工程を採用し
て、赤血球の試料を保存及び貯蔵した。
％のブドウ糖、グルコース、0.9 ％の塩化ナトリウム、
0.75％のマンニトール及び0.027 ％のアデニンから成る
緩衝液（Adsol)を使用して、５〜10％の赤血球容積率ま
で希釈した。採取及び分離の後、以下の工程を採用し
て、赤血球の試料を保存及び貯蔵した。
【００９５】1. 赤血球の懸濁液を、以下のものから成
る３つの低温溶液として調製した。 a. 緩衝液だけに加えた細胞 b. １％のグリセロールを用いて、２２ oC の温度で前
処理した細胞20分間の培養に続いて、細胞を氷で４ oC
まで冷却した。細胞が４ oC の温度で平衡状態になった
とき、２０００ｇの細胞を、10分間、４ oC の温度で遠
心分離機にかけた。次いで、上澄みを除去し、１％のデ
キストラン（平均分子量40,000〜70,000）を含む緩衝液
から成る４°Ｃの溶液中で細胞を再び懸濁させて、５〜
10％の最終赤血球容積率にした。
る３つの低温溶液として調製した。 a. 緩衝液だけに加えた細胞 b. １％のグリセロールを用いて、２２ oC の温度で前
処理した細胞20分間の培養に続いて、細胞を氷で４ oC
まで冷却した。細胞が４ oC の温度で平衡状態になった
とき、２０００ｇの細胞を、10分間、４ oC の温度で遠
心分離機にかけた。次いで、上澄みを除去し、１％のデ
キストラン（平均分子量40,000〜70,000）を含む緩衝液
から成る４°Ｃの溶液中で細胞を再び懸濁させて、５〜
10％の最終赤血球容積率にした。
【００９６】c. 0.025 Ｍのジメチルスルホキシド、0.
025 Ｍのプロピレングリコール、0.0125Ｍの2,3-ブタン
ジオール、0.5 ％のラフィノース、0.3 ％のトレハロー
ス、0.3 ％のショ糖、0.6 ％のポリビニルピロリジン及
び0.6 ％のデキストランから成る５％のガラス化溶液
（20：１に希釈した前記ＶＳ1 ）で処理した細胞 2. 次いで、前述した超音波ネブライザを1.5 〜2.5 ワ
ット及び25〜60Hzで使用して、低温溶液を毎分６mlの流
量で噴霧した。
025 Ｍのプロピレングリコール、0.0125Ｍの2,3-ブタン
ジオール、0.5 ％のラフィノース、0.3 ％のトレハロー
ス、0.3 ％のショ糖、0.6 ％のポリビニルピロリジン及
び0.6 ％のデキストランから成る５％のガラス化溶液
（20：１に希釈した前記ＶＳ1 ）で処理した細胞 2. 次いで、前述した超音波ネブライザを1.5 〜2.5 ワ
ット及び25〜60Hzで使用して、低温溶液を毎分６mlの流
量で噴霧した。
【００９７】3. 前述した内部冷却低温表面を使用し
て、噴霧した低温溶液を、液体凍結剤と接触させること
なく、すばやく凍結した。 4. 次いで、凍結した試料を収集して、−１６０ oC 以
下の温度で貯蔵した。 5. 次いで、米国特許第 4,865,871に記載された方法を
採用した分子蒸留乾燥法によって、赤血球の試料を乾燥
した。
て、噴霧した低温溶液を、液体凍結剤と接触させること
なく、すばやく凍結した。 4. 次いで、凍結した試料を収集して、−１６０ oC 以
下の温度で貯蔵した。 5. 次いで、米国特許第 4,865,871に記載された方法を
採用した分子蒸留乾燥法によって、赤血球の試料を乾燥
した。
【００９８】6. 赤血球の試料を、２週間、真空下で貯
蔵した。 7. 次いで、赤血球の試料を、次のいずれかを加えるこ
とによって、再び水和させた。 a. Adsol 緩衝液 b. 40％のデキストランを含む緩衝液（緩衝液を６段階
で加えて、５％のデキストランまで段階的に希釈され
る）。次いで、2000ｇの赤血球の試料を10分間、遠心分
離機にかけ、そして緩衝液中で再び懸濁させた。
蔵した。 7. 次いで、赤血球の試料を、次のいずれかを加えるこ
とによって、再び水和させた。 a. Adsol 緩衝液 b. 40％のデキストランを含む緩衝液（緩衝液を６段階
で加えて、５％のデキストランまで段階的に希釈され
る）。次いで、2000ｇの赤血球の試料を10分間、遠心分
離機にかけ、そして緩衝液中で再び懸濁させた。
【００９９】8. 次いで、相対照顕微鏡検査法によっ
て、赤血球の試料を評価した。 9. 貯蔵及び分析評価の後、種々のプロトコルの有効性
を、以下の結果で評価した。 低温溶液 Adsol 再水化 Adsol 形態 90％の小細胞、10％の幽霊細胞 低温溶液 Adsol 再水化 40％デキストラン 形態 100 ％の中細胞 低温溶液 ５％ＶＳ1 再水化 Adsol 形態 20％の小細胞、80％の幽霊細胞 低温溶液 ５％ＶＳ1 再水化 40％デキストラン 形態 20％の小細胞、30％の中細胞、40％の中細
胞、10％の幽霊細胞 低温溶液 １％細胞内グリセロール、１％細胞内デキス
トラン 再水化 Adsol 形態 50％の小細胞、45％の中細胞、５％の幽霊細
胞 低温溶液 １％細胞内グリセロール、１％細胞内デキス
トラン 再水化 40％デキストラン 形態 ５％の小細胞、95％の中細胞例 ５ 経口小児麻痺ワクチン（ＯＰＶ）の保存と貯蔵 経口小児麻痺ワクチン（ＯＰＶ）は、生きている弱毒化
された小児麻痺ウイルスの３つの血清型から成る。これ
は、重い小児麻痺病の予防と治療のために一般に使用さ
れる２つのワクチンのうちの１つである。生きている弱
毒化された小児麻痺ウイルスを採取し分離する方法は、
ウイルス学の分野の当業者に知られている。
て、赤血球の試料を評価した。 9. 貯蔵及び分析評価の後、種々のプロトコルの有効性
を、以下の結果で評価した。 低温溶液 Adsol 再水化 Adsol 形態 90％の小細胞、10％の幽霊細胞 低温溶液 Adsol 再水化 40％デキストラン 形態 100 ％の中細胞 低温溶液 ５％ＶＳ1 再水化 Adsol 形態 20％の小細胞、80％の幽霊細胞 低温溶液 ５％ＶＳ1 再水化 40％デキストラン 形態 20％の小細胞、30％の中細胞、40％の中細
胞、10％の幽霊細胞 低温溶液 １％細胞内グリセロール、１％細胞内デキス
トラン 再水化 Adsol 形態 50％の小細胞、45％の中細胞、５％の幽霊細
胞 低温溶液 １％細胞内グリセロール、１％細胞内デキス
トラン 再水化 40％デキストラン 形態 ５％の小細胞、95％の中細胞例 ５ 経口小児麻痺ワクチン（ＯＰＶ）の保存と貯蔵 経口小児麻痺ワクチン（ＯＰＶ）は、生きている弱毒化
された小児麻痺ウイルスの３つの血清型から成る。これ
は、重い小児麻痺病の予防と治療のために一般に使用さ
れる２つのワクチンのうちの１つである。生きている弱
毒化された小児麻痺ウイルスを採取し分離する方法は、
ウイルス学の分野の当業者に知られている。
【０１００】本発明の有効性は、以下の実験によって立
証された。 1. 経口小児麻痺ワクチン（ＯＰＶ）の三価試料を製造
業者から入手して、−８０ oC の温度で貯蔵した。 2. 処理の直前に、37 oC の水槽の中で試料を溶かし
た。次いで、攪拌セル装置を用い、限外濾過によって、
試料から塩分を除去した。
証された。 1. 経口小児麻痺ワクチン（ＯＰＶ）の三価試料を製造
業者から入手して、−８０ oC の温度で貯蔵した。 2. 処理の直前に、37 oC の水槽の中で試料を溶かし
た。次いで、攪拌セル装置を用い、限外濾過によって、
試料から塩分を除去した。
【０１０１】3. 次いで、塩分を除去したＯＰＶの試料
を、低温溶液を形成するように完全に懸濁するまで、以
下の溶液中で懸濁させ、30分間、室温で培養した。 a. １ＭのＭＥＳ緩衝液、 pＨ 8.5 b. １Ｍのトリス緩衝液、 pＨ 8.5 c. ２５０ｍＭのトレハロールを含む１Ｍのトリス緩衝
液、 pＨ8.5 4. 培養の後、前述した噴霧装置を用いて、低温溶液を
すばやく凍結した。低温溶液の各々について、 500μl
の噴霧した試料を、低温に維持された凍結乾燥用の小壜
（５cc）の中に収集した。ブチルラバー製の凍結乾燥ス
トッパを小壜の 口に取り付けた。
を、低温溶液を形成するように完全に懸濁するまで、以
下の溶液中で懸濁させ、30分間、室温で培養した。 a. １ＭのＭＥＳ緩衝液、 pＨ 8.5 b. １Ｍのトリス緩衝液、 pＨ 8.5 c. ２５０ｍＭのトレハロールを含む１Ｍのトリス緩衝
液、 pＨ8.5 4. 培養の後、前述した噴霧装置を用いて、低温溶液を
すばやく凍結した。低温溶液の各々について、 500μl
の噴霧した試料を、低温に維持された凍結乾燥用の小壜
（５cc）の中に収集した。ブチルラバー製の凍結乾燥ス
トッパを小壜の 口に取り付けた。
【０１０２】5. 次いで、噴霧した試料を、液体窒素で
冷却した試料保持器に入れ、分子蒸留乾燥器に装填し
て、分子蒸留乾燥器で乾燥した。 6. 20 oC に達したとき、小壜を真空下の乾燥器内に密
封した。 7. 乾燥した試料を、乾燥器から取り出して、分析前に
約２週間、室温で貯蔵した。
冷却した試料保持器に入れ、分子蒸留乾燥器に装填し
て、分子蒸留乾燥器で乾燥した。 6. 20 oC に達したとき、小壜を真空下の乾燥器内に密
封した。 7. 乾燥した試料を、乾燥器から取り出して、分析前に
約２週間、室温で貯蔵した。
【０１０３】8. 分析時、凍結乾燥ストッパからの注入
によって５００mlの蒸留水を加えて、ＯＰＶの 試料
を液状に戻した。 9. 標準的な方法を用い、ＯＰＶの試料を、各血清型の
ウイルス滴定量について分析した。 10. 分析評価の後、ウイルス活性に関する有効性を評価
し、ＴＣＤ50として表した。
によって５００mlの蒸留水を加えて、ＯＰＶの 試料
を液状に戻した。 9. 標準的な方法を用い、ＯＰＶの試料を、各血清型の
ウイルス滴定量について分析した。 10. 分析評価の後、ウイルス活性に関する有効性を評価
し、ＴＣＤ50として表した。
【０１０４】 低温溶液 血清型１ 血清型２ 血清型３ ＭＥＳ緩衝液 4.45 4.45 4.45 トリス緩衝液 5.41 4.94 6.08 250mＭのトレハロール を含むトリス緩衝液 4.87 4.60 4.59 対 照 7.02 6.18 7.13 本発明の実施に使用する装置の好ましい実施例を詳細に
説明したが、低温調製装置を設計する者には、最終用途
に適した種々の実施例が明らかであると理解すべきであ
る。本発明の装置の説明は、本発明の限定を意図するも
のではなく、好ましい実施例の単なる例示である。
説明したが、低温調製装置を設計する者には、最終用途
に適した種々の実施例が明らかであると理解すべきであ
る。本発明の装置の説明は、本発明の限定を意図するも
のではなく、好ましい実施例の単なる例示である。
【０１０５】資料の保存及び貯蔵のための組成及び方法
を、好ましい実施例によって説明したが、本発明の概
念、精神及び範囲を逸脱することなく、本明細書で説明
した組成、方法や方法の一連の工程に変更及び修正を加
えることができることは、当業者には明らかである。特
に、本明細書で説明した薬剤を、同一の又は同様の結果
を達成するような、化学的にも生理学的にも関連する一
定の薬剤で置き換えることができることは明らかであ
る。提示した例は、懸濁液中の顕微鏡的生物学的物質を
保存し且つ貯蔵する方法を説明している。当業者に明ら
かな置換及び修正は、特許請求の範囲によって定められ
る本発明の精神、範囲及び概念の中にあるものである。
を、好ましい実施例によって説明したが、本発明の概
念、精神及び範囲を逸脱することなく、本明細書で説明
した組成、方法や方法の一連の工程に変更及び修正を加
えることができることは、当業者には明らかである。特
に、本明細書で説明した薬剤を、同一の又は同様の結果
を達成するような、化学的にも生理学的にも関連する一
定の薬剤で置き換えることができることは明らかであ
る。提示した例は、懸濁液中の顕微鏡的生物学的物質を
保存し且つ貯蔵する方法を説明している。当業者に明ら
かな置換及び修正は、特許請求の範囲によって定められ
る本発明の精神、範囲及び概念の中にあるものである。
【図１】本発明の方法の概略フローダイアグラムであ
る。
る。
【図２】本発明の一部を構成する急速低温固定装置の斜
視図である。
視図である。
【図３】図２に示す装置の一部の３−３線に沿った断面
図である。
図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 アブヒジット ナグ アメリカ合衆国 テキサス州 77095 ヒューストン プラム レイク ドライ ヴ 8654 (72)発明者 ケン ビー ニコルス アメリカ合衆国 テキサス州 77062 ヒューストン ラ カバナ 16106 (72)発明者 カーメン ピウノ アメリカ合衆国 テキサス州 77381 ザ ウッドランズ グローリー バウア ー ９ (72)発明者 ディヴィッド ピー ロス アメリカ合衆国 テキサス州 77081 ヒューストン サン ガブリエル 19735 (56)参考文献 特開 平２−69200（ＪＰ，Ａ) 特開 平２−25401（ＪＰ，Ａ) 特開 平２−117601（ＪＰ，Ａ) 特公 昭58−7606（ＪＰ，Ｂ２) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 1/28 A01N 1/02
Claims (33)
- 【請求項１】 （ａ）緩衝液と生物学的物質とからな
る、生物学的物質の懸濁液の低温溶液を準備し、 （ｂ）前記低温溶液を微細な液滴を達成するように噴霧
し、 （ｃ）生物学的物質に対する損傷を最小にするように、
前記低温溶液中に六方晶氷を形成しまたは形成すること
なく、非晶質の氷及び又は立方晶氷を形成する速度で前
記低温溶液を冷却し、 （ｄ）前記低温溶液を、保存と再水化の両方に最適であ
る最終溶液残留水分含有量まで乾燥する、 顕微鏡的生物学的物質の懸濁液の保存方法。 - 【請求項２】 前記低温溶液は低温予防保護剤を更に有
する、請求項１に記載の保存方法。 - 【請求項３】 前記低温溶液は乾燥予防保護剤を更に有
する、請求項１に記載の保存方法。 - 【請求項４】 前記乾燥した低温溶液の残留水含有量を
実質的に増すことなく、前記乾燥した低温溶液を容器で
密閉する、請求項１に記載の保存方法。 - 【請求項５】 前記密閉は、低圧下で或いは乾燥不活性
ガスの存在のもとになされる、請求項４に記載の保存方
法。 - 【請求項６】 前記緩衝液は、２−アミノ−２−ヒドロ
キシメチル−1,3 −プロパンジオール；２−〔Ｎ−モル
ホリノ〕エタンスルホン酸；２−アミノ−２メチル−1,
3 −プロパンジオール；３−〔Ｎ−モルホリノ〕プロパ
ンスルホン酸；ピペラジン−Ｎ−Ｎ' −ビス〔２−エタ
ンスルホン酸〕；1,4 −ピペラジン−ジエタンスルホン
酸及びその組合せからなる群から選ばれる、請求項１に
記載の保存方法。 - 【請求項７】 前記緩衝液は、(1) ８g のグリシン、pH
6.7 〜8.4 で0.15Ｍの燐酸緩衝液２０ml及び1.8gの塩化
ナトリウムで１０００mlに作られたpH6.7 の混合液；
(2)１６g のグリシン、２０mlの0.15Ｍの燐酸緩衝液pH
6.7 〜8.4 、1.8gの塩化ナトリウム、5.0gのグルコー
ス、0.06g の塩化カルシウム及び及び0.1gのアデニンで
１０００mlに作られたpH6.7 の混合液；(3)0.9％の塩化
ナトリウム、0.75％のマンニトール、2.2 ％のブドウ糖
及び0.027 ％のアデニンを含有する溶液; (4)0.875％の
ブドウ糖、0.9 ％の塩化ナトリウム、0.214 ％のマンニ
トール、0.008 ％のアデニン、0.2555％のクエン酸ナト
リウム、0.029 ％のクエン酸及び0.022 ％の一塩基燐酸
ナトリウムを含有する溶液； (5)pH7.4 で１６ｍＭの燐
酸緩衝液、5 ｍＭの塩化カリウム、４g/dlのＢＳＡ、及
び6.9g/lのラクトース; (6)pH7.4で１６ｍＭの燐酸緩衝
液、5 ｍＭの塩化カリウム、及び１５g/l のラクトー
ス、からなる群から選ばれた低塩緩衝混合液である、請
求項１に記載の保存方法。 - 【請求項８】 前記低温予防保護剤は、ジメチルスルホ
キシド、２−３ブタンジオール、ポリビニルピロリド
ン、プロピレングリコール、1,2 プロパンジオール、グ
リセロール、フラクトース、トレハロース、ラフイノー
ス、ヒドロキシエチルスターチ、デキストラン、ショ
糖、ソルビトール、プロリン、人の漿液アブミン及びそ
の組合せ、からなる群から選ばれる、請求項２に記載の
保存方法。 - 【請求項９】 前記低温予防保護剤は、 (1) 0.5 ＭのＤＭＳＯ、0.5 Ｍのプロピレングリコー
ル、0.25Ｍの２，３ブタンジオール、1.0 Ｍのプロリ
ン、2.5 ％のラフイノース、１５％のＰＶＰ（平均分子
量４００００）及び１５％のデキストラン( 平均分子量
４００００〜７００００）の混合液からなるガラス化溶
液； (2) 0.5 ＭのＤＭＳＯ、0.5 Ｍのプロピレングリコー
ル、0.25Ｍの２，３ブタンジオール、1 0 ％のラフイノ
ース、6 ％のトレハロース、6 ％のショ糖、１２％のＰ
ＶＰ（平均分子量４０００0)及び１２％のデキストラン
( 平均分子量 4００００〜７００００）の混合液からな
るガラス化溶液; 及び (3) 0.5 ＭのＤＭＳＯ、0.5 Ｍのプロピレングリコー
ル、0.25Ｍの２，３ブタンジオール、2.5 ％のラフイノ
ース、１２％のショ糖、１５％のＰＶＰ（平均分子量４
００００）及び１５％のデキストラン（平均分子量４０
０００〜７００００）の混合液からなるガラス化溶液、 からなる群から選ばれる、請求項８に記載の保存方法。 - 【請求項１０】 前記乾燥予防保護剤は、ショ糖、ラフ
イノース、トレハロース、亜鉛、プロリン、ミリスチン
酸、スペルミン及びその組合せからなる群から選ばれ
る、請求項３に記載の保存方法。 - 【請求項１１】 前記乾燥は凍結乾燥からなる、請求項
１に記載の保存方法。 - 【請求項１２】 前記乾燥は分子蒸留乾燥からなる、請
求項１に記載の保存方法。 - 【請求項１３】 前記顕微鏡的生物学的物質は赤血球か
らなる、請求項１に記載の保存方法。 - 【請求項１４】 前記顕微鏡的生物学的物質は哺乳類の
培養細胞からなる、請求項１に記載の保存方法。 - 【請求項１５】 前記顕微鏡的生物学的物質は血小板か
らなる、請求項１に記載の保存方法。 - 【請求項１６】 前記顕微鏡的生物学的物質は白血球か
らなる、請求項１に記載の保存方法。 - 【請求項１７】 前記顕微鏡的生物学的物質は因子VIII
からなる、請求項１に記載の保存方法。 - 【請求項１８】 前記顕微鏡的生物学的物質は精液から
なる、請求項１に記載の保存方法。 - 【請求項１９】 前記顕微鏡的生物学的物質は膵島から
なる、請求項１に記載の保存方法。 - 【請求項２０】 前記顕微鏡的生物学的物質は骨髄細胞
からなる、請求項１に記載の保存方法。 - 【請求項２１】 前記顕微鏡的生物学的物質はウイルス
からなる、請求項１に記載の保存方法。 - 【請求項２２】 前記顕微鏡的生物学的物質はワクチン
からなる、請求項１に記載の保存方法。 - 【請求項２３】 前記冷却は、前記微細な液滴を低温表
面に噴霧することからなる請求項１に記載の保存方法。 - 【請求項２４】 乾燥した低温溶液を再水化することを
更にゆうする、請求項１に記載の保存方法。 - 【請求項２５】 （ａ）緩衝液と低温予防保護剤と生物
学的物質とからなる、顕微鏡的生物学的物質の低温溶液
を準備し、 （ｂ）前記低温溶液を噴霧して直径約２００μｍ以下の
液滴を形成し、 （ｃ）前記液滴を急速に冷却して非晶質氷、立方晶氷及
び六方晶氷を形成し、 （ｄ）前記急速に冷却した低温溶液を遷移的に乾燥して
前記非晶質氷、立方晶氷及び六方晶氷を除去し、約５％
以下の最終溶液残留水分含有量まで前記乾燥を行う、顕
微鏡的生物学的物質の懸濁液の保存方法。 - 【請求項２６】 前記乾燥した低温溶液の残留水含有量
を実質的に増すことなく、前記乾燥した低温溶液を容器
で密閉することをさらに有する、請求項２３に記載の保
存方法。 - 【請求項２７】 前記密閉は、約10-6mb乃至10-1mbの低
圧で乾燥不活性ガス雰囲気中で行われる、請求項２４に
記載の保存方法。 - 【請求項２８】 乾燥した低温溶液を再水化することを
更に有する、請求項２３に記載の保存方法。 - 【請求項２９】 前記遷移乾燥は、氷の次の相の遷移温
度に達する前に前記氷の各相を引き続いて取り除くよう
に、前記溶液の加熱速度を制御することによつて達成さ
れる、請求項２３に記載の保存方法。 - 【請求項３０】 (a) 顕微鏡的生物学的物質の懸濁液の
微細な液滴を作るための噴霧器; (b) 微細な液滴を急速に冷却するための内部冷却式低温
表面; (c) 微細な液滴を低温表面から取り出すための収集器; (d) 冷却した微細な液滴を受け入れるための試料保持
器、 からなる、顕微鏡的生物学的物質の懸濁液の急速低温固
定装置。 - 【請求項３１】 噴霧器は低周波の超音波噴霧器からな
る、請求項３０に記載の顕微鏡的生物学的物質の懸濁液
の急速低温固定装置。 - 【請求項３２】 低温表面は鏡面仕上げを有する回転シ
リンダーからなる、請求項３０に記載の顕微鏡的生物学
的物質の懸濁液の急速低温固定装置。 - 【請求項３３】 収集器は、凍結した微細な液滴を低温
表面から取り出すブレードを有する収集器からなる、請
求項３０に記載の顕微鏡的生物学的物質の懸濁液の急速
低温固定装置。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US58158490A | 1990-09-12 | 1990-09-12 | |
| US581584 | 1990-09-12 | ||
| US70950491A | 1991-06-03 | 1991-06-03 | |
| US709504 | 1991-06-03 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05126696A JPH05126696A (ja) | 1993-05-21 |
| JP3210036B2 true JP3210036B2 (ja) | 2001-09-17 |
Family
ID=27078363
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP23334091A Expired - Lifetime JP3210036B2 (ja) | 1990-09-12 | 1991-09-12 | 生物学的懸濁液を低温調製し、乾燥安定化し、再水化するための方法及び装置 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US5364756A (ja) |
| EP (1) | EP0475409B1 (ja) |
| JP (1) | JP3210036B2 (ja) |
| AT (1) | ATE164981T1 (ja) |
| AU (2) | AU650045B2 (ja) |
| CA (1) | CA2051092C (ja) |
| DE (1) | DE69129253T2 (ja) |
| ES (1) | ES2114868T3 (ja) |
Families Citing this family (203)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5958670A (en) * | 1988-05-18 | 1999-09-28 | Cobe Laboratories, Inc. | Method of freezing cells and cell-like materials |
| US5045446A (en) * | 1988-08-26 | 1991-09-03 | Cryopharm Corporation | Lyophilization of cells |
| AU650045B2 (en) * | 1990-09-12 | 1994-06-09 | Lifecell Corporation | Method and apparatus for cryopreparation dry stabilization and rehydration of biological suspensions |
| CA2075928A1 (en) * | 1991-01-11 | 1992-07-12 | Roger W. Hackett | Method of detecting circulating antibody types using dried or lyophilized cells or cell-like material |
| US5192312A (en) * | 1991-03-05 | 1993-03-09 | Colorado State University Research Foundation | Treated tissue for implantation and methods of treatment and use |
| IT1250360B (it) * | 1991-12-11 | 1995-04-07 | Apparecchiatura di liofilizzazione a flusso continuo. | |
| EP0624190A4 (en) * | 1992-01-21 | 1995-04-19 | Cryopharm Corp | METHOD FOR FREEZING CELLS AND MATERIALS SIMILAR TO CELLS. |
| EP0668013B1 (en) * | 1994-02-22 | 2005-04-20 | Nippon Telegraph And Telephone Corporation | Freeze-dried blood cells, stem cells and platelets and manufacturing method for the same |
| US20030113273A1 (en) * | 1996-06-17 | 2003-06-19 | Patton John S. | Methods and compositions for pulmonary delivery of insulin |
| US6290991B1 (en) | 1994-12-02 | 2001-09-18 | Quandrant Holdings Cambridge Limited | Solid dose delivery vehicle and methods of making same |
| DE4438232A1 (de) * | 1994-10-26 | 1996-05-02 | Guenter Prof Dr Fuhr | Kryokonservierung und Tieftemperaturbearbeitung von biologischen Zellen |
| CA2146098A1 (en) * | 1995-01-12 | 1996-07-13 | Ray V. Rajotte | Bulk cryopreservation of biological materials and uses for cryopreserved and encapsulated biological materials |
| GB9501040D0 (en) | 1995-01-19 | 1995-03-08 | Quadrant Holdings Cambridge | Dried composition |
| US7253262B2 (en) | 1995-01-19 | 2007-08-07 | Quandrant Drug Delivery Limited | Dried blood factor composition comprising trehalose |
| US7244824B2 (en) | 1995-01-19 | 2007-07-17 | Quadrant Drug Delivery Limited | Dried blood factor composition comprising trehalose |
| US5580714A (en) * | 1995-03-08 | 1996-12-03 | Celox Laboratories, Inc. | Cryopreservation solution |
| US6964771B1 (en) * | 1995-06-07 | 2005-11-15 | Elan Drug Delivery Limited | Method for stably incorporating substances within dry, foamed glass matrices |
| IL120202A (en) * | 1996-03-07 | 2001-03-19 | Akzo Nobel Nv | Container with freeze-dried vaccine components |
| AU3214597A (en) * | 1996-05-29 | 1998-01-05 | Universal Preservation Technologies, Inc. | Long-term shelf preservation by vitrification |
| US5750330A (en) * | 1996-06-19 | 1998-05-12 | Litron Laboratories | Method and composition for lyophilizing red blood cells |
| US5741680A (en) * | 1996-09-03 | 1998-04-21 | Cera Products, Inc. | Buffer composition base and method of formulation for oral vaccine delivery |
| IL128855A0 (en) * | 1996-09-06 | 2000-01-31 | Universal Preservation Technologies Inc | Vitrification solutions for shelf preservation of cells tissues organs and organisms |
| US6468782B1 (en) * | 1996-12-05 | 2002-10-22 | Quadrant Healthcare (Uk) Limited | Methods of preserving prokaryotic cells and compositions obtained thereby |
| DE19654266A1 (de) * | 1996-12-23 | 1998-06-25 | Albrecht Prof Dr Wendel | Untersuchungsverfahren mit biologischem System |
| US6221997B1 (en) | 1997-04-28 | 2001-04-24 | Kimberly Ann Woodhouse | Biodegradable polyurethanes |
| US6094923A (en) * | 1997-05-12 | 2000-08-01 | Rada; David C. | Tissue freezing apparatus |
| US6565885B1 (en) | 1997-09-29 | 2003-05-20 | Inhale Therapeutic Systems, Inc. | Methods of spray drying pharmaceutical compositions |
| US20060165606A1 (en) | 1997-09-29 | 2006-07-27 | Nektar Therapeutics | Pulmonary delivery particles comprising water insoluble or crystalline active agents |
| GB2330516A (en) * | 1997-10-22 | 1999-04-28 | Elizabeth Acton | Cryopreservation of cell suspensions |
| WO1999035255A2 (en) * | 1998-01-12 | 1999-07-15 | Betagene, Inc. | Compositions and methods for regulated secretion from neuroendocrine cell lines |
| ATE316757T1 (de) * | 1998-05-26 | 2006-02-15 | Lifecell Corp | Cryokonservierung menschlicher roter blutzellen |
| US6381967B1 (en) * | 1998-06-17 | 2002-05-07 | Randall H Craig | Cryogenic freezing of liquids |
| US6485959B1 (en) | 1998-10-07 | 2002-11-26 | Cedars Sinai Medical Center | Cell preconditioning and cryopresevation medium |
| US20030049840A1 (en) * | 1998-10-07 | 2003-03-13 | Demetriou Achilles A. | Cell preconditioning and cryopreservation medium |
| US6140123A (en) * | 1998-10-07 | 2000-10-31 | Cedars-Sinai Medical Center | Method for conditioning and cryopreserving cells |
| US6759050B1 (en) * | 1998-12-03 | 2004-07-06 | Avigen, Inc. | Excipients for use in adeno-associated virus pharmaceutical formulations, and pharmaceutical formulations made therewith |
| US6225289B1 (en) | 1998-12-10 | 2001-05-01 | Genvec, Inc. | Methods and compositions for preserving adenoviral vectors |
| DE60035260T2 (de) | 1999-02-22 | 2007-10-18 | The University Of Connecticut, Farmington | Neue albuminfreie faktor viii formulierungen |
| US6303355B1 (en) | 1999-03-22 | 2001-10-16 | Duke University | Method of culturing, cryopreserving and encapsulating pancreatic islet cells |
| US6365385B1 (en) | 1999-03-22 | 2002-04-02 | Duke University | Methods of culturing and encapsulating pancreatic islet cells |
| DE19921236C2 (de) * | 1999-05-07 | 2003-10-30 | Evotec Ag | Verfahren und Vorrichtung zur Probenaufnahme an Kryosubstraten |
| GB9916790D0 (en) * | 1999-07-16 | 1999-09-22 | Health Lab Service Board | Storage of microorganisms,cells and tissue |
| WO2001020999A1 (en) * | 1999-09-23 | 2001-03-29 | Trimedyne, Inc. | Materials and methods for inducing angiogenesis and the repair of mammalian tissue |
| US6869757B2 (en) * | 2000-07-31 | 2005-03-22 | 21St Century Medicine, Inc. | Advantageous carrier solution for vitrifiable concentrations of cryoprotectants, and compatible cryoprotectant mixtures |
| SE9904433D0 (sv) * | 1999-12-03 | 1999-12-03 | Wiigh Maesak Susanne | Omhändertagande av avlidna |
| US7112576B1 (en) | 1999-12-10 | 2006-09-26 | Regents Of The University Of Minnesota | Compositions and methods for cryopreservation of peripheral blood lymphocytes |
| US6982172B2 (en) | 2000-01-04 | 2006-01-03 | University Of Connecticut | Oocyte vitrification technique |
| WO2001067859A2 (en) * | 2000-03-14 | 2001-09-20 | Alnis Biosciences, Inc. | Cryoprotective system |
| US6652583B2 (en) * | 2000-04-07 | 2003-11-25 | Rhode Island Hospital | Cardiac valve replacement |
| EP1274301B1 (en) * | 2000-04-17 | 2004-11-24 | Organ Recovery Systems, Inc. | Novel warming method of cryopreserved specimens |
| GB2361709A (en) * | 2000-04-26 | 2001-10-31 | Moorlodge Biotech Ventures Ltd | Vessel for transporting micro organisms |
| US7442388B2 (en) | 2000-05-10 | 2008-10-28 | Weers Jeffry G | Phospholipid-based powders for drug delivery |
| US7871598B1 (en) | 2000-05-10 | 2011-01-18 | Novartis Ag | Stable metal ion-lipid powdered pharmaceutical compositions for drug delivery and methods of use |
| US8404217B2 (en) | 2000-05-10 | 2013-03-26 | Novartis Ag | Formulation for pulmonary administration of antifungal agents, and associated methods of manufacture and use |
| WO2001087325A1 (en) | 2000-05-12 | 2001-11-22 | Northwest Biotherapeutics, Inc. | Method to increase class i presentation of exogenous antigens by human dendritic cells |
| WO2002014480A2 (en) * | 2000-08-16 | 2002-02-21 | Duke University | Decellularized tissue engineered constructs and tissues |
| PT1340062E (pt) * | 2000-12-07 | 2013-01-25 | Fraunhofer Ges Forschung | Método e dispositivo de armazenamento criogénico |
| DE60233788D1 (de) * | 2001-05-09 | 2009-11-05 | Bayer Pharmaceuticals Corp | Kryokonservierungstaschenkonstruktion für säugerzellinien |
| CN1306029C (zh) * | 2001-07-02 | 2007-03-21 | 旭化成制药株式会社 | 稳定碱性磷酸酶的方法 |
| WO2003020874A2 (en) * | 2001-09-06 | 2003-03-13 | I.M.T Interface Multigrad Technology Ltd. | Improved method for freezing viable cells |
| AU2002331847A1 (en) * | 2001-09-14 | 2003-04-01 | Invitrogen Corporation | Composition for stabilizing biological materials |
| CA2468958C (en) | 2001-12-19 | 2012-07-03 | Nektar Therapeutics | Pulmonary delivery of aminoglycosides |
| AU2003230955A1 (en) * | 2002-05-01 | 2003-11-17 | Cryoglass Llc | Cryopreservation system for liquid substances |
| US7659111B2 (en) * | 2002-06-27 | 2010-02-09 | Core Dynamics Limited | Method for freezing viable cells |
| DE10237125A1 (de) * | 2002-08-13 | 2004-03-11 | Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. | Kryokonservierung mit einem gas- oder dampfförmigen Kühlmedium |
| KR100476790B1 (ko) * | 2002-09-13 | 2005-03-16 | 주식회사 제넨메드 | 세포 저장 용액과 이를 이용한 동물 세포의 동결 및 저장방법 |
| BR0314751A (pt) * | 2002-09-27 | 2005-07-26 | Powderject Res Ltd | Partìculas adequadas para suprimento a partir de um dispositivo de suprimento, receptáculo de dosagem para um dispositivo de suprimento, dispositivo de suprimento mediado por partìcula, processo para a preparação de partìculas adequadas para suprimento a partir de um dispositivo de suprimento, e, métodos de imunização por ácido nucleico e de terapia genética |
| US7176022B2 (en) * | 2002-12-20 | 2007-02-13 | Cell Genesys, Inc. | Directly injectable formulations which provide enhanced cryoprotection of cell products |
| EP1589948A1 (en) * | 2003-01-15 | 2005-11-02 | Dow Global Technologies Inc. | Drug particles obtained by freezing onto a cold surface |
| WO2004096113A2 (en) * | 2003-04-28 | 2004-11-11 | Medical Instill Technologies, Inc. | Container with valve assembly for filling and dispensing substances, and apparatus and method for filling |
| US7294455B2 (en) | 2003-05-16 | 2007-11-13 | The University Of North Carolina At Chapel Hill | Fixed-dried platelets cross-linked to protein |
| DE10328869A1 (de) | 2003-06-26 | 2005-01-20 | Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. | Probenaufnahmeeinrichtung und Verfahren zu deren Herstellung |
| US20050048648A1 (en) * | 2003-08-29 | 2005-03-03 | Ye Fang | Compositions & methods for reformulating biological membranes for arrays |
| US20070077237A1 (en) * | 2003-10-09 | 2007-04-05 | Udi Damari | Method for freezing, thawing and transplantation of viable cartilage |
| US7935478B2 (en) * | 2004-02-02 | 2011-05-03 | Core Dynamics Limited | Biological material and methods and solutions for preservation thereof |
| EP1711214A1 (en) * | 2004-02-02 | 2006-10-18 | Interface Multigrad Technology (IMT) Ltd. | Device for directional cooling of biological matter |
| US20050191282A1 (en) * | 2004-03-01 | 2005-09-01 | Opara Emmanuel C. | Method of cryopreserving pancreatic islet cells |
| US20070185585A1 (en) * | 2004-03-09 | 2007-08-09 | Brat Bracy | Implant Scaffold Combined With Autologous Tissue, Allogenic Tissue, Cultured Tissue, or combinations Thereof |
| AU2005221083A1 (en) * | 2004-03-09 | 2005-09-22 | Osteobiologics, Inc. | Implant scaffold combined with autologous or allogenic tissue |
| US7205145B2 (en) * | 2004-03-24 | 2007-04-17 | Zefon International, Inc. | Gas-borne matter collection device |
| US20050266415A1 (en) * | 2004-05-28 | 2005-12-01 | Zefon International, Inc. | Method for sampling gas-borne matter |
| ATE460947T1 (de) * | 2004-06-07 | 2010-04-15 | Core Dynamics Ltd | Verfahren zur sterilisation von biologischen präparaten |
| EP1765385A4 (en) * | 2004-06-16 | 2008-08-27 | Smart Drug Systems Inc | IMPORTS COMPOSITION WITH DELAYED RELEASE |
| US8037696B2 (en) * | 2004-08-12 | 2011-10-18 | Core Dynamics Limited | Method and apparatus for freezing or thawing of a biological material |
| US7293426B2 (en) * | 2004-10-05 | 2007-11-13 | Washington University | Apparatus for freezing a biological sample |
| GB0502661D0 (en) * | 2005-02-09 | 2005-03-16 | Stabilitech Ltd | A desiccated product |
| EP1850661A2 (en) * | 2005-02-22 | 2007-11-07 | Interface Multigrad Technology (IMT) Ltd. | Preserved viable cartilage, method for its preservation, and system and devices used therefor |
| US20100112543A1 (en) * | 2005-03-16 | 2010-05-06 | Manh-Dan Ngo | Processing soft tissue, methods and compositions related thereto |
| CA2602100A1 (en) * | 2005-03-16 | 2006-09-28 | Musculoskeletal Transplant Foundation | Soft tissue processing |
| US7637029B2 (en) * | 2005-07-08 | 2009-12-29 | Tokyo Electron Limited | Vapor drying method, apparatus and recording medium for use in the method |
| US8198085B2 (en) * | 2005-08-03 | 2012-06-12 | Core Dynamics Limited | Somatic cells for use in cell therapy |
| MX2008002023A (es) * | 2005-08-11 | 2008-04-08 | Harvard College | Metodos y composiciones para secar formas celulares. |
| JP4519037B2 (ja) * | 2005-08-31 | 2010-08-04 | 東京エレクトロン株式会社 | 加熱装置及び塗布、現像装置 |
| EP1929289B1 (en) * | 2005-09-26 | 2018-02-21 | Lifecell Corporation | Dry platelet composition |
| EP1798504A1 (en) * | 2005-12-19 | 2007-06-20 | Koninklijke Philips Electronics N.V. | Method of making dried particles |
| US7958650B2 (en) * | 2006-01-23 | 2011-06-14 | Turatti S.R.L. | Apparatus for drying foodstuffs |
| US7966746B2 (en) * | 2006-04-24 | 2011-06-28 | Medical Instill Technologies, LLC | Needle penetrable and laser resealable lyophilization method |
| ES2672630T3 (es) * | 2006-06-12 | 2018-06-15 | The Jackson Laboratory | Medios crioprotectores de esperma |
| JP4762835B2 (ja) | 2006-09-07 | 2011-08-31 | 東京エレクトロン株式会社 | 基板処理方法、基板処理装置、プログラムおよびプログラム記録媒体 |
| WO2008040022A2 (en) * | 2006-09-28 | 2008-04-03 | Cornell Research Foundation, Inc. | Systems for increased cooling and thawing rates of protein solutions and cells for optimized cryopreservation and recovery |
| US7926368B2 (en) * | 2006-11-01 | 2011-04-19 | Zefon International, Inc. | Humidity-controlled gas-borne matter collection device |
| WO2009009620A2 (en) | 2007-07-10 | 2009-01-15 | Lifecell Corporation | Acellular tissue matrix compositions for tissue repair |
| DE502007005679D1 (de) * | 2007-08-03 | 2010-12-30 | Micronas Gmbh | Kit und Vorrichtung zum Erzeugen einer Chemolumineszenzstrahlung |
| US20090081785A1 (en) | 2007-09-24 | 2009-03-26 | Hememics Biotechnologies, Inc. | Desiccated Biologics And Methods Of Preparing The Same |
| US8735054B1 (en) | 2008-01-04 | 2014-05-27 | Lifecell Corporation | Acellular tissue matrix preservation solution |
| JP2011511623A (ja) * | 2008-01-17 | 2011-04-14 | ヴァンス プロダクツ インコーポレイテッド | ガラス化のための急冷装置 |
| US20090202978A1 (en) * | 2008-02-13 | 2009-08-13 | Ginadi Shaham | Method and apparatus for freezing of a biological material |
| EP2589392B1 (en) | 2008-03-05 | 2016-11-30 | Sanofi Pasteur | Process for stabilizing an adjuvant containing vaccine composition |
| US8871434B2 (en) * | 2008-03-21 | 2014-10-28 | Fenwal, Inc. | Red blood cell storage medium for extended storage |
| US8968992B2 (en) * | 2008-03-21 | 2015-03-03 | Fenwal, Inc. | Red blood cell storage medium for extended storage |
| WO2009126099A1 (en) * | 2008-04-10 | 2009-10-15 | Denator Aktiebolag | Device for storing a biological sample and for preparing the biological sample |
| US9259511B2 (en) | 2008-06-06 | 2016-02-16 | Lifecell Corporation | Elastase treatment of tissue matrices |
| WO2010019753A2 (en) | 2008-08-14 | 2010-02-18 | Kci Licensing, Inc. | Tissue scaffolds |
| KR20200011604A (ko) * | 2008-08-20 | 2020-02-03 | 안트로제네시스 코포레이션 | 개선된 세포 조성물 및 그의 제조 방법 |
| NZ593190A (en) | 2008-11-07 | 2013-01-25 | Baxter Int | Factor viii formulations |
| WO2010059789A2 (en) * | 2008-11-20 | 2010-05-27 | Lifecell Corporation | Method for treatment and prevention of parastomal hernias |
| US8333803B2 (en) | 2008-11-21 | 2012-12-18 | Lifecell Corporation | Reinforced biologic material |
| US8469779B1 (en) | 2009-01-02 | 2013-06-25 | Lifecell Corporation | Method for debristling animal skin |
| US9150318B1 (en) | 2009-01-02 | 2015-10-06 | Lifecell Corporation | Method for sterilizing an acellular tissue matrix |
| US10328103B2 (en) | 2009-01-03 | 2019-06-25 | Ray C. Wasielewski | Medical treatment composition comprising mammalian dental pulp stem cells |
| CN102348948B (zh) * | 2009-03-11 | 2014-12-10 | 鲍利葛股份公司 | 干燥微纤维化纤维素的方法 |
| EP2236520A1 (en) * | 2009-03-31 | 2010-10-06 | Leukocare Ag | Stabilizing composition for immobilized biomolecules |
| WO2011049709A1 (en) | 2009-10-23 | 2011-04-28 | Fenwal, Inc. | Methods and systems for providing red blood cell products with reduced plasma |
| DK3564357T3 (da) | 2010-02-01 | 2022-06-20 | Rebiotix Inc | Bakterieterapi mod clostridium difficile colitis |
| EP2547760A4 (en) | 2010-02-17 | 2014-01-01 | Hememics Biotechnologies Inc | CONSERVATION SOLUTIONS FOR BIOLOGICAL AGENTS AND METHODS RELATING THERETO |
| CA2786228C (en) * | 2010-02-19 | 2018-02-06 | Lifecell Corporation | Abdominal wall treatment devices |
| JP5960120B2 (ja) | 2010-03-31 | 2016-08-02 | スタビリテック リミテッド | ウイルス粒子の安定化 |
| EP2552478B1 (en) | 2010-03-31 | 2016-12-21 | Stabilitech Ltd. | Excipients for stabilising viral particles |
| GB2499480A (en) | 2010-03-31 | 2013-08-21 | Stabilitech Ltd | Method for preserving alum adjuvants and alum-adjuvanted vaccines |
| CN101983562B (zh) * | 2010-05-26 | 2013-04-17 | 赛业（广州）生物科技有限公司 | 一种非程序细胞冻存液 |
| CA2804592C (en) | 2010-07-08 | 2019-10-29 | Lifecell Corporation | Method for shaping tissue matrices |
| SG187250A1 (en) | 2010-08-13 | 2013-03-28 | Advanced Bionutrition Corp | Dry storage stabilizing composition for biological materials |
| ES2788749T3 (es) | 2010-08-26 | 2020-10-22 | Lifecell Corp | Métodos pasivos para mallas biológicas antimicrobianas |
| WO2012098358A1 (en) * | 2011-01-20 | 2012-07-26 | Biopharma Technology Ltd | Freeze drying method |
| GB201101002D0 (en) * | 2011-01-20 | 2011-03-09 | Biopharma Technology Ltd | Freeze drying method |
| JP6103648B2 (ja) * | 2011-02-07 | 2017-03-29 | リッチ テクノロジーズ ホールディング カンパニー リミテッド ライアビリティー カンパニー | 細胞の保存及び細胞培養のための方法 |
| US8637067B1 (en) | 2011-03-10 | 2014-01-28 | Lifecell Corporation | Elastic tissue matrix derived hydrogel |
| EP2696908B1 (en) | 2011-04-14 | 2015-03-11 | Lifecell Corporation | Regenerative materials |
| KR102068071B1 (ko) | 2011-04-28 | 2020-01-20 | 라이프셀 코포레이션 | 조직 생성물의 효소처리방법 |
| US9238793B2 (en) | 2011-04-28 | 2016-01-19 | Lifecell Corporation | Method for enzymatic treatment of tissue products |
| US10207025B2 (en) | 2011-04-28 | 2019-02-19 | Lifecell Corporation | Method for enzymatic treatment of tissue products |
| EP2714111B1 (en) | 2011-05-31 | 2021-03-17 | LifeCell Corporation | Adipose tissue matrices |
| US9089523B2 (en) | 2011-07-28 | 2015-07-28 | Lifecell Corporation | Natural tissue scaffolds as tissue fillers |
| HUE035774T2 (en) | 2011-08-12 | 2018-05-28 | Merial Inc | Biological substances, in particular vaccines, preserved by vacuum |
| EP2578974A1 (en) | 2011-10-05 | 2013-04-10 | Sanofi Pasteur Sa | Process line for the production of freeze-dried particles |
| GB201117233D0 (en) | 2011-10-05 | 2011-11-16 | Stabilitech Ltd | Stabilisation of polypeptides |
| ES2784156T3 (es) | 2011-11-10 | 2020-09-22 | Lifecell Corp | Método para la eliminación del espacio a través de la aproximación de tejidos |
| BR112014014975B1 (pt) | 2011-12-20 | 2019-06-25 | Lifecell Corporation | Produto de tecido, e método para produzir uma composição de tecido |
| ES2864104T3 (es) | 2011-12-20 | 2021-10-13 | Lifecell Corp | Productos tisulares laminados |
| AU2013212592B2 (en) | 2012-01-24 | 2016-06-30 | Lifecell Corporation | Elongated tissue matrices |
| US8884248B2 (en) | 2012-02-13 | 2014-11-11 | Fei Company | Forming a vitrified sample for electron microscopy |
| EP2626885A1 (en) * | 2012-02-13 | 2013-08-14 | FEI Company | Forming a vitrified sample for an electron microscopy |
| ES2716993T3 (es) | 2012-03-08 | 2019-06-18 | Lifecell Corp | Matrices de colágeno y tejido activadas por enzimas |
| JP6078838B2 (ja) * | 2012-03-31 | 2017-02-15 | 学校法人早稲田大学 | 生体組織の処理方法及び保存用生体組織の製造方法 |
| EP2841116A1 (en) | 2012-04-24 | 2015-03-04 | Lifecell Corporation | Flowable tissue matrices |
| BR112014026088B1 (pt) | 2012-04-24 | 2019-11-05 | Lifecell Corp | produto de tratamento de tecidos |
| US10363343B2 (en) | 2012-07-05 | 2019-07-30 | Lifecell Corporation | Tissue-based drain manifolds |
| ES2836892T3 (es) | 2012-07-06 | 2021-06-28 | Lifecell Corp | Matriz muscular descelularizada |
| BR112015000547B1 (pt) | 2012-07-13 | 2020-11-10 | Lifecell Corporation | método para tratar tecido |
| US8904664B2 (en) | 2012-08-15 | 2014-12-09 | Mimedx Group, Inc. | Dehydration device and methods for drying biological materials |
| AU2013323747B2 (en) | 2012-09-26 | 2017-02-02 | Lifecell Corporation | Processed adipose tissue |
| US20140193456A1 (en) * | 2013-01-09 | 2014-07-10 | Hristem Mitkov Dyanov | Method for Drying-Conservation of Natural Substances |
| US10206977B1 (en) | 2013-01-18 | 2019-02-19 | Mimedx Group, Inc. | Isolated placental stem cell recruiting factors |
| JP6545102B2 (ja) | 2013-01-18 | 2019-07-17 | ミメディクス グループ インコーポレイテッド | 心病態を治療する方法 |
| EP3659633A1 (en) | 2013-02-06 | 2020-06-03 | LifeCell Corporation | Methods for localized modification of tissue products |
| EP4234011A3 (en) | 2013-06-05 | 2023-09-20 | Rebiotix, Inc. | Microbiota restoration therapy (mrt), compositions and methods of manufacture |
| KR101883813B1 (ko) | 2013-10-29 | 2018-07-31 | 스쿨 주리디칼 퍼슨 키타사토 인스티튜트 | 세포 또는 조직의 유리화 동결보존용 도구 |
| AU2014341866B2 (en) | 2013-11-04 | 2018-07-05 | Lifecell Corporation | Methods of removing alpha-galactose |
| EP3094336A4 (en) | 2014-01-17 | 2018-02-14 | MIMEDX Group Inc. | Method for inducing angiogenesis |
| JP6338869B2 (ja) * | 2014-01-28 | 2018-06-06 | 国立研究開発法人産業技術総合研究所 | 粒径分布計測方法 |
| GB201406569D0 (en) | 2014-04-11 | 2014-05-28 | Stabilitech Ltd | Vaccine compositions |
| KR101690670B1 (ko) * | 2015-10-14 | 2016-12-28 | 강원대학교산학협력단 | 미스트 분사 및 급냉식 원자간력 현미경용 시편 처리장치 |
| AU2016366404A1 (en) | 2015-12-11 | 2018-06-14 | Lifecell Corporation | Methods and systems for stiffening of tissue for improved processing |
| EP3413943A1 (en) | 2016-02-11 | 2018-12-19 | LifeCell Corporation | Methods for stabilizing collagen-containing tissue products against enzymatic degradation |
| EP3416483A4 (en) | 2016-02-19 | 2019-09-11 | Regents of the University of Minnesota | CRYOPROTEKING COMPOSITIONS AND METHODS |
| WO2017184721A1 (en) | 2016-04-19 | 2017-10-26 | Regents Of The University Of Minnesota | Cryopreservation compositions and methods involving nanowarming |
| US10792394B2 (en) | 2016-06-03 | 2020-10-06 | Lifecell Corporation | Methods for localized modification of tissue products |
| JP6760614B2 (ja) * | 2016-07-29 | 2020-09-23 | 国立研究開発法人産業技術総合研究所 | 微細粒子の分散固定方法 |
| RU2627844C1 (ru) * | 2016-10-24 | 2017-08-14 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Ниармедик Плюс" | Способ получения суспензионной формы измельченного децеллюляризованного внеклеточного матрикса |
| US11246308B2 (en) * | 2016-12-20 | 2022-02-15 | Tissue Testing Technologies Llc | Ice-free preservation of large volume tissue samples for viable, functional tissue banking |
| EP3558405A1 (en) | 2016-12-22 | 2019-10-30 | LifeCell Corporation | Devices and methods for tissue cryomilling |
| JP6823300B2 (ja) * | 2017-01-20 | 2021-02-03 | 日本電子株式会社 | 試料作製装置 |
| WO2018140854A1 (en) | 2017-01-30 | 2018-08-02 | Lifecell Corporation | Tissue matrix materials and enzymatic adhesives |
| WO2018140855A1 (en) | 2017-01-30 | 2018-08-02 | Lifecell Corporation | Devices including muscle matrix and methods of production and use |
| JP6942191B2 (ja) | 2017-01-30 | 2021-09-29 | ライフセル コーポレーションＬｉｆｅＣｅｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ | トランスグルタミナーゼ処理製品 |
| GB2562241B (en) | 2017-05-08 | 2022-04-06 | Stabilitech Biopharma Ltd | Vaccine compositions |
| GB201716729D0 (en) * | 2017-10-12 | 2017-11-29 | Asymptote Ltd | Cryopreservation method and apparatus |
| CN111201046B (zh) | 2017-10-18 | 2022-06-28 | 生命细胞公司 | 脂肪组织产品以及产生方法 |
| US11123375B2 (en) | 2017-10-18 | 2021-09-21 | Lifecell Corporation | Methods of treating tissue voids following removal of implantable infusion ports using adipose tissue products |
| US11246994B2 (en) | 2017-10-19 | 2022-02-15 | Lifecell Corporation | Methods for introduction of flowable acellular tissue matrix products into a hand |
| ES2960617T3 (es) | 2017-10-19 | 2024-03-05 | Lifecell Corp | Productos de matriz de tejido acelular fluida y métodos de producción |
| DE102018100844A1 (de) | 2018-01-16 | 2019-07-18 | Gottfried Wilhelm Leibniz Universität Hannover | Verfahren zum Einfrieren einer biologische Zellen und/oder Gewebe enthaltenden Probenflüssigkeit |
| EP3886879A4 (en) | 2018-11-30 | 2022-12-07 | Cellphire Inc. | PLATES AS DELIVERY AGENTS |
| WO2020113101A1 (en) | 2018-11-30 | 2020-06-04 | Cellphire, Inc. | Platelets loaded with anti-cancer agents |
| WO2020176498A1 (en) * | 2019-02-28 | 2020-09-03 | Regents Of The University Of Minnesota | High throughput system for production and vitrification of biomaterials in cryoprotectant droplets |
| US10770265B1 (en) * | 2019-03-21 | 2020-09-08 | Neptune Fluid Flow Systems LLC | System and method for preparing cryo-em grids |
| CA3138529A1 (en) | 2019-05-03 | 2020-11-12 | Cellphire, Inc. | Materials and methods for producing blood products |
| US11633521B2 (en) | 2019-05-30 | 2023-04-25 | Lifecell Corporation | Biologic breast implant |
| US20210308185A1 (en) | 2020-02-04 | 2021-10-07 | Cellphire, Inc. | Methods of treating acquired hemophilia with anti-fibrinolytic loaded platelets |
| CA3150936A1 (en) | 2019-08-16 | 2021-02-25 | Cellphire, Inc. | Thrombosomes as an antiplatelet agent reversal agent |
| CN112325524B (zh) * | 2020-11-04 | 2021-11-12 | 中华全国供销合作总社济南果品研究院 | 流态冰冰晶制取装置 |
| CN113713174B (zh) * | 2021-08-18 | 2023-05-23 | 青岛大学 | 人工血管的制备方法及人工血管 |
| JP7367240B1 (ja) * | 2022-05-19 | 2023-10-23 | 株式会社神鋼環境ソリューション | 粒子製造装置および凍結粒子の製造方法 |
Family Cites Families (33)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB351132A (en) * | 1929-04-08 | 1931-06-25 | Boris Pavlovitsch Tsitovitsch | Improvements in and relating to the freezing of colloidal liquids |
| US3228838A (en) * | 1959-04-23 | 1966-01-11 | Union Carbide Corp | Preservation of biological substances |
| US3309777A (en) * | 1963-08-30 | 1967-03-21 | Robert S Hutton | Process for making uniformly constituted finely divided particulate material |
| FR1522286A (fr) * | 1967-02-16 | 1968-04-26 | Air Liquide | Procédé et appareil de congélation pour produits sous forme liquide |
| US3721725A (en) * | 1970-08-14 | 1973-03-20 | Du Pont | Process for preparing powder blends |
| US3892876A (en) * | 1971-11-30 | 1975-07-01 | Leiner & Sons Wales Limited P | Process of preparing freeze-dried gelatin |
| US3765189A (en) * | 1972-02-17 | 1973-10-16 | Air Liquide | Method and apparatus for deep-freezing |
| GB1482785A (en) * | 1974-10-30 | 1977-08-17 | Du Pont | Method of preparing a homogeneous lyophilised composition |
| FR2337878A1 (fr) * | 1976-01-09 | 1977-08-05 | Anvar | Procede et appareil pour realiser des cryo-fractures |
| US4205132A (en) * | 1978-07-17 | 1980-05-27 | Microlife Technics, Inc. | Lyophilization of bacteria |
| US4229544A (en) * | 1978-08-08 | 1980-10-21 | Payfer Laboratories Inc. | Living organism packaging |
| US4329787A (en) * | 1980-01-04 | 1982-05-18 | Newton William A | Droplet exploding and freezing apparatus and method |
| US4559298A (en) * | 1982-11-23 | 1985-12-17 | American National Red Cross | Cryopreservation of biological materials in a non-frozen or vitreous state |
| US5024830A (en) * | 1983-08-23 | 1991-06-18 | The Board Of Regents, The University Of Texas | Method for cryopreparing biological tissue for ultrastructural analysis |
| US4799361A (en) * | 1983-08-23 | 1989-01-24 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Method for cryopreparing biological tissue for ultrastructural analysis |
| US4567847A (en) * | 1983-08-23 | 1986-02-04 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Apparatus and method for cryopreparing biological tissue for ultrastructural analysis |
| US4865871A (en) * | 1983-08-23 | 1989-09-12 | Board Of Regents The University Of Texas System | Method for cryopreparing biological tissue |
| US4688387A (en) * | 1985-11-12 | 1987-08-25 | Vital Force, Inc. | Method for preservation and storage of viable biological materials at cryogenic temperatures |
| US4707998A (en) * | 1986-12-03 | 1987-11-24 | The Board Of Regents, The University Of Texas | Apparatus and method for ultrarapid cooling of biological samples |
| US4807442A (en) * | 1986-12-03 | 1989-02-28 | Board Of Regents The University Of Texas System | Cryo-slamming apparatus and method for ultrarapid cooling of biological samples |
| US4980277A (en) * | 1987-10-16 | 1990-12-25 | Cultor Ltd. | Cryoprotectant solution and method |
| GB8802142D0 (en) * | 1988-02-01 | 1988-03-02 | Air Prod & Chem | Method of freezing liquid & pasty products & freezer for carrying out said method |
| US5045446A (en) * | 1988-08-26 | 1991-09-03 | Cryopharm Corporation | Lyophilization of cells |
| US5153004A (en) * | 1989-06-02 | 1992-10-06 | Cryopharm Corporation | Freezing and thawing of erythrocytes |
| US5171661A (en) * | 1988-05-18 | 1992-12-15 | Cryopharm Corporation | Medium for lyophilization of erythrocytes |
| US5178884A (en) * | 1988-05-18 | 1993-01-12 | Cryopharm Corporation | Lyophilized and reconstituted red blood cell compositions |
| US4874690A (en) * | 1988-08-26 | 1989-10-17 | Cryopharm Corporation | Lyophilization of red blood cells |
| US4964280A (en) * | 1989-08-17 | 1990-10-23 | Board Of Regents | Method and apparatus for cryopreparing biological tissue |
| WO1991018504A1 (en) * | 1990-05-25 | 1991-12-12 | Cryopharm Corporation | Process for lyophilizing cells, cell-like materials and platelets in a mixture of biocompatible amphipathic polymers |
| ATE158922T1 (de) * | 1990-08-06 | 1997-10-15 | Paul Kateman | Verfahren und einrichtung zum herstellen und spenden von luftigen produkten |
| US5336616A (en) * | 1990-09-12 | 1994-08-09 | Lifecell Corporation | Method for processing and preserving collagen-based tissues for transplantation |
| AU650045B2 (en) * | 1990-09-12 | 1994-06-09 | Lifecell Corporation | Method and apparatus for cryopreparation dry stabilization and rehydration of biological suspensions |
| IT1250360B (it) * | 1991-12-11 | 1995-04-07 | Apparecchiatura di liofilizzazione a flusso continuo. |
-
1991
- 1991-09-10 AU AU83797/91A patent/AU650045B2/en not_active Expired
- 1991-09-10 CA CA002051092A patent/CA2051092C/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-09-12 AT AT91115480T patent/ATE164981T1/de not_active IP Right Cessation
- 1991-09-12 DE DE69129253T patent/DE69129253T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1991-09-12 ES ES91115480T patent/ES2114868T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1991-09-12 JP JP23334091A patent/JP3210036B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1991-09-12 EP EP91115480A patent/EP0475409B1/en not_active Expired - Lifetime
-
1993
- 1993-02-16 US US08/018,357 patent/US5364756A/en not_active Expired - Lifetime
-
1994
- 1994-07-13 AU AU67405/94A patent/AU677845B2/en not_active Expired
-
1996
- 1996-11-14 US US08/752,740 patent/US5780295A/en not_active Expired - Lifetime
-
1998
- 1998-07-13 US US09/114,433 patent/US6194136B1/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU650045B2 (en) | 1994-06-09 |
| CA2051092A1 (en) | 1992-03-13 |
| AU8379791A (en) | 1992-03-19 |
| US5364756A (en) | 1994-11-15 |
| EP0475409B1 (en) | 1998-04-15 |
| DE69129253D1 (de) | 1998-05-20 |
| US5780295A (en) | 1998-07-14 |
| JPH05126696A (ja) | 1993-05-21 |
| AU677845B2 (en) | 1997-05-08 |
| EP0475409A3 (en) | 1993-09-01 |
| AU6740594A (en) | 1994-09-22 |
| CA2051092C (en) | 2002-07-23 |
| EP0475409A2 (en) | 1992-03-18 |
| ATE164981T1 (de) | 1998-05-15 |
| DE69129253T2 (de) | 1998-12-17 |
| US6194136B1 (en) | 2001-02-27 |
| ES2114868T3 (es) | 1998-06-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP3210036B2 (ja) | 生物学的懸濁液を低温調製し、乾燥安定化し、再水化するための方法及び装置 | |
| JP5307801B2 (ja) | 凍結乾燥フォームによる生物活性材料の防腐 | |
| AU2005249530B2 (en) | Preservation by vaporization | |
| US6872357B1 (en) | Formulation of preservation mixtures containing sensitive biologicals to be stabilized for ambient temperature storage by drying | |
| AU2001268057B2 (en) | Preservation and storage medium for biological materials | |
| JP4902103B2 (ja) | 凍結乾燥フォームによる生物活性材料の保存 | |
| KR100777349B1 (ko) | 민감한 생물학적 물질의 보존방법 | |
| SCHACHAR et al. | Investigations of low-temperature storage of articular cartilage for transplantation. | |
| US8628960B2 (en) | Desiccated biologics and methods of preparing the same | |
| AU2001268057A1 (en) | Preservation and storage medium for biological materials | |
| US7659111B2 (en) | Method for freezing viable cells | |
| EP1428008B1 (en) | Improved method for freezing viable cells | |
| US20140193456A1 (en) | Method for Drying-Conservation of Natural Substances | |
| BR112020000592A2 (pt) | método para conservar materiais biológicos |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080713 Year of fee payment: 7 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090713 Year of fee payment: 8 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100713 Year of fee payment: 9 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100713 Year of fee payment: 9 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110713 Year of fee payment: 10 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110713 Year of fee payment: 10 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120713 Year of fee payment: 11 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term | ||
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120713 Year of fee payment: 11 |