JP2955395B2 - 抗真菌性物質Ｍｅｒ−ＷＦ５０２７及びその製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は新規な抗真菌性物質に関し、さら
に詳しくは、下記式

【０００２】

【化２】

【０００３】で示される抗真菌性物質Ｍｅｒ‐ＷＦ５０
２７及びその塩並びにその製造法に関する。

【０００４】抗真菌性物質として、従来、アンホテリシ
ンＢ、グリセオフルビン、ポリオキシン、バリダマイシ
ン等の物質が知られているが、これら既知の抗真菌性物
質は毒性、薬効、薬剤耐性等において未だ充分であると
は言えない。

【０００５】本発明者らは今回、神奈川県平塚市の土壌
から分離したアスペルギルス属に属する或る種の菌株が
抗真菌活性を有し、しかも毒性の低い上記式（Ｉ）また
は（ＩＩ）で示される新規な抗真菌性物質Ｍｅｒ‐ＷＦ
５０２７を生産することを見い出し本発明を完成するに
至った。

【０００６】上記式（Ｉ）の化合物と式（ＩＩ）の化合
物とは互に互変異性体であり、本発明の抗真菌性物質Ｍ
ｅｒ‐ＷＦ５０２７は遊離体の溶液状態では、式（Ｉ）
の化合物と式（ＩＩ）の化合物のほぼ１：１（モル比）
の混合物として存在しうる。本発明の抗真菌性物質Ｍｅ
ｒ‐ＷＦ５０２７及びその塩は、例えば、アスペルギル
ス属に属する抗真菌性物質Ｍｅｒ‐ＷＦ５０２７生産菌
を培地で培養し、培養物から抗真菌性物質Ｍｅｒ‐ＷＦ
５０２７をその塩の形で採取し、そして必要に応じて該
塩を遊離の抗真菌性物質Ｍｅｒ‐ＷＦ５０２７または他
の塩に変えることにより製造することができる。

【０００７】上記抗真菌性物質Ｍｅｒ‐ＷＦ５０２７生
産菌としては、例えば、本発明者らが神奈川県平塚市の
土壌から分離したアスペルギルス・エスピーＭe １２０
７（Ａspergillus sp．Ｍe １２０７）を挙げることが
できる。この菌の菌学的性質は次のとおりである。

【０００８】（１）各種培地における生育形態 培養はすべて２６℃で実施し、寒天平板培地での生育形
態を観察した。

【０００９】ａ）ツアペック寒天培地 生育は大変速く、ビロード状に生育するが、成熟すると
中心部が綿毛状となり多くの分生子柄を生じ、その先端
に分生子を着生する。コロニー表面の色調は初期、うす
黄色〜にぶ黄色であるが、成熟するとにぶ黄緑色〜暗い
黄緑色となる。コロニー裏面の色はうす黄色〜にぶ黄色
である。無色の浸出液滴が認められ、菌核の形成はな
い。閉子器（子のう胞子形成器官）の形成は認められな
い。

【００１０】ｂ）麦芽エキス寒天培地 生育は大変速く、ビロード状に生育したコロニーは成熟
すると中心部が綿毛状に丈の高い分生子柄を生じ、多く
の分生子を着生する。コロニー表面の色は黄緑色〜にぶ
黄緑色を呈し、成熟するとにぶ黄緑色〜暗黄緑色とな
る。無色の浸出液滴が認められ、菌核及び閉子器の形成
は認められない。

【００１１】（２）形態的性状 ツアペック寒天培地での培養で、分生子柄の長さは２.
０〜２.５mmに達することもあり、その先端に分生子を
着生する。分生子柄の表面は粗面で多くの小突起を持
ち、先端部は球形〜長球形の頂のうがあり、その外側に
梗子を（５.０×８.５μ〜３.０×５.０μ）を付ける。
分生子（３.０〜４.５μ×４.０〜５.０μ）は梗子の先
端から発生し、放射状に広がり多くの分生子の連鎖を形
成する。成熟した頂頭の分生子魂は断裂して数個の放散
カラム状となる。

【００１２】以上の性状から、本菌はアスペルギルス
（Ａspergillus）属の菌であり、その形態からレーパー
とフェネルの「ザ・ジーナス・アスペルギルス」（１９
６５）（Ｒeper＆Ｆennell“ＴheＧenus Ａspergillu
s”）を参考に検討したところ麹菌類の一種と判定さ
れ、それに村上英也らの「麹学」日本醸造協会（１９８
６）も参考にして調査したが、種を特定することはでき
なかった。従って、本菌をアスペルギルス・エスピーＭ
e１２０７（Ａspergillus sp．Ｍe１２０７）と命名
し、平成２年１１月９日工業技術院微生物工業研究所に
寄託し、微工研菌寄第１１８４８号（ＦＥＲＭ Ｐ-１
１８４８）なる番号が付された。

【００１３】しかし、抗真菌性物質Ｍｅｒ‐ＷＦ５０２
７生産菌は上記アスペルギルス・エスピーＭe１２０７
に限られるものではなく、例えば、次のようにして見つ
けることができる他の生産菌も同様に使用することがで
きる。

【００１４】キャンディダ・アルビカンスを検定菌とす
るバイオアッセイ寒天平板とバチルス・ズブチルスを検
定板とするバイオアッセイ寒天平板とを用い、穿孔法に
て土壌分離菌の培養濾液を検定し、前者の寒天平板に阻
止円を与え、更に後者の寒天平板において阻止円がほと
んど見えない培養濾液を与える土壌分離菌を検索する。
次に土壌分離菌の上記活性を有する培養濾液をミリポア
フィルター（ＤＩＳＭＩＣ-２５cs；日本ミリポア・リ
ミテッド）で濾過し、高速液体クロマトグラフィーによ
り抗真菌性物質Ｍｅｒ‐ＷＦ５０２７の標準サンプルと
同一保持時間に検出され、また上記培養濾液をセップパ
ック（日本ミリポア・リミテッド）に吸着し、そのメタ
ノール溶出液を薄層クロマトグラフィーで展開後、キャ
ンディダ・アルビカンスを検定菌とするバイオートグラ
フィーで検出することができれば、その菌は本発明の方
法に用いることができる抗真菌性物質Ｍｅｒ‐ＷＦ５０
２７生産菌であるということができる。

【００１５】抗真菌性物質Ｍｅｒ‐ＷＦ５０２７の培養
のための培地としては、特に制限はなく、従来からかび
の培養に際して通常使用されている培地を用いることが
できるが、例えば炭水化物、窒素源、無機塩などの同化
できる栄養源を含む培地を使用することができる。例え
ばぶどう糖、グリセリン、麦芽糖、しょ糖、糖蜜、デキ
ストリン、澱粉などの炭水化物や大豆油、落花生油、ラ
ードなどの油脂、脂肪類のごとき炭素源；ペプトン、肉
エキス、大豆粉、綿実粉、乾燥酵母、コーンスチープリ
カー、酵母エキス、脱脂乳、カゼイン、硝酸ナトリウ
ム、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウムなどの窒素
源；燐酸２カリウム、食塩、炭酸カルシウム、硫酸マグ
ネシウムなどの無機塩を含む培地が使用でき、必要によ
り微量金属例えばコバルト、マンガンなどを添加するこ
とができる。栄養源としては、その他、抗真菌性物質Ｍ
ｅｒ‐ＷＦ５０２７生産菌が利用して抗真菌性物質Ｍｅ
ｒ‐ＷＦ５０２７を生産するものであれば、いずれも使
用でき、公知のかびの培養材料はいずれも使用できる。
また、加熱殺菌時及び培養中における発泡を抑えるた
め、シリコン、植物油などの消泡剤を添加することもで
きる。

【００１６】かかる培地での該生産菌の培養は、通常、
約２０〜約３７℃の温度でpＨ４〜８において通気撹拌
下に好気的に行なうことができる。培養時間は大体４８
〜１００時間程度とすることができる。

【００１７】かくして、培養物中に蓄積された抗真菌性
物質Ｍｅｒ‐ＷＦ５０２７は水溶性であり、主として菌
体外に存在するので、有利には、培養後、濾過、遠心分
離、抽出などのそれ自体既知の分離法によって菌体を除
去し、その濾液、上澄液、抽出液などにより回収するこ
とができる。

【００１８】回収はそれ自体既知の種々の方法で行うこ
とができ、とくに弱酸型抗生物質の回収のためにしばし
ば利用される方法が有利に適用される。例えば、低pＨ
における酢酸エチル、ｎ-ブタノールでの溶媒抽出及び
その溶媒層から高pＨ水層への転溶；塩化ザルコニウ
ム、硫酸水素テトラブチルアンモニウム等の脂溶性第四
級アンモニウム塩またはニッソー・クラウン・エーテル
・ジシクロヘキシル-１８-クラウン-６、同-１５-クラ
ウン-５［日本曹達（株）製］などのクラウン化合物の
存在下、中性pＨにおける塩化メチレン、クロロホルム
等での溶媒抽出及びその溶媒層からのヨウ化ナトリウ
ム、ヨウ化カリ等を含有する中性水層への転溶；活性
炭、アンバーライトＸＡＤ（ローム・アンド・ハース社
製）、ダイアイオンＨＰ-２０（三菱化成社製）等によ
る吸着とメタノール水、アセトン水等に溶出；ダウエッ
クス １×２（ダウエックス社製）、ＱＡＥ-セフアデ
ックスＡ-２５（ファルマシア社製）のイオン交換樹脂
による吸着及び溶出；セフアデックスＧ-１０（ファル
マシア社製）バイオ・ゲルＰ-２（バイオ・ラッド社
製）等によるゲル濾過；セルローズ、アビセルＳＦ（ア
メリカン・ビスコース社製）ＤＥＡＥセルローズ ワッ
トマンＤＥ-３２（ワットマン社製）、ＤＥＡＥ-セファ
デックスＡ-２５（ファルマシア社製）、シリカゲル、
アルミナ、等によるカラム法または薄層クロマトグラフ
ィー；アセトンなどの有機溶剤添加による強制沈澱法；
凍結乾燥法、などをそれぞれ単独であるいは適宜組合
せ、さらには場合によっては反復使用することによって
分離、精製することができる。

【００１９】これにより、本発明の抗真菌性物質Ｍｅｒ
‐ＷＦ５０２７は、その分離、精製の方法に応じて一般
に前記式（Ｉ）の化合物の塩の形で得られる。しかし
て、該塩は、例えば、水性媒体中で塩酸、硫酸、酢酸、
リン酸等の酸で処理すること、またはＥＤＴＡなどのキ
レート剤による処理、弱酸性イオン交換処理などにより
遊離の抗真菌性物質Ｍｅｒ‐ＷＦ５０２７に変えること
ができ、また、この遊離の抗真菌性物質Ｍｅｒ‐ＷＦ５
０２７は常法に従い例えば、水溶液中での各種塩基によ
る中和；イオン交換樹脂に吸着後望まれる塩、塩基での
溶出；低pＨでの有機溶媒抽出後、その溶媒層の望まれ
る塩基による高pＨ化後水への転溶等の処理をすること
により塩に変えることができる。かかる塩の例として
は、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、マグネシ
ウム塩、アルミニウム塩などの金属塩；アンモニウム
塩；トリメチルアンモニウム塩などの置換アンモニウム
塩；ベンザチン塩、プロカイン塩などの有機塩基による
塩などが含まれる。

【００２０】本発明により提供される抗真菌性物質Ｍｅ
ｒ‐ＷＦ５０２７及びその塩は、下記第１表に示す寒天
培地希釈法によるin vitro試験結果から明らかなとお
り、抗菌活性を示す。

【００２１】

【表１】

【００２２】また、本発明の抗真菌性物質Ｍｅｒ‐ＷＦ
５０２７及びその塩は毒性が低く、例えばＭｅｒ‐ＷＦ
５０２７ナトリウム塩のマウスに対する急性毒性は静脈
投与でＬＤ₅₀値が５００mg／kg以上であった。

【００２３】以上述べたとおり、本発明のＭｅｒ‐ＷＦ
５０２７物質は優れた抗真菌活性を有しており且つ毒性
が低く、抗菌剤として医薬、動物薬、農薬等の分野で使
用することが期待される。また、医薬、農薬等の製造中
間体としても利用することができる。 次に実施例によ
り本発明をさらに具体的に説明する。

【００２４】

【実施例１】 アスペルギルス・エスピーＭe１２０７
（ＦＥＲＭ Ｐ-１１８４８）の斜面培地（ポテトデキ
ストロース寒天培地）から一白金耳を５０mlの種培地
（ジャガイモデンプン２％、グルコース１％、大豆粉２
％、リン酸１カリウム０.１％、硫酸マグネシウム０.０
５％、pＨ無調整）を入れた５００ml容の三角フラスコ
に接種し、２８℃で３日振盪培養して種培養液を得た。
この種培養液の１００mlを生産培地（ジャガイモ汁：ジ
ャガイモ２００g／Lの煮だし汁、ジャガイモデンプン２
０g／L）５Lを含む１０L容ジャーファーメンター（５
基）に接種した。２８℃、８８時間通気撹拌培養（通気
量５L／min.，撹拌３００r.p.m.）を行なった。培養終
了後、約２５Lの培養液を濾過し、培養濾液２３Lを得
た。

【００２５】この濾液をダイアイオンＨＰ-２０（三菱
化成工業製）を充填したカラム（８×６０cm）に付し、
３Lのイオン交換水で洗浄後、５０％アセトン水５Lで溶
出し、３００mlずつ分画した。溶出画分中のＭｅｒ‐Ｗ
Ｆ５０２７物質をペーパーディスク法による抗菌活性測
定（検定菌キャンディダ・アルビカンス）で検出した。
フラクション３〜７を集め、約１／２に濃縮し、含まれ
るアセトンを除去した。これ以降の操作は特に断わらな
いかぎり、１０℃の低温下で行なった。次に、上記濃縮
全量（約１L）をＱＡＥ-セファデックスカラム（ファル
マシア社製；Ａ-２５、Ｃl型、３.５×６０cm）に付し
た。４００mlのイオン交換水で洗浄後、塩化ナトリウム
濃度０〜０.５Ｍのグラディエント溶出を行なった（全
量４L）。２０gずつ分画し、分画中のＭｅｒ‐ＷＦ５０
２７物質を上記と同様にして検出した。フラクション３
７〜６３を集め（約４００ml）、ダイアイオンＣＨＰ-
２０カラム（三菱化成工業製、２.５×６０cm）に付し
た。５０％アセトン水で溶出し、８gずつ画分した。フ
ラクション２３〜３０を集め、減圧濃縮によりアセトン
を除去後、凍結乾燥し、約２００mgの凍結乾燥標品を得
た。この標品を２mlの水に溶解し、バイオゲルＰ-２カ
ラム（バイオラッドラボラトリー社製、１.２×９０c
m）に付した。イオン交換水で展開し、３gずつ分画し
た。活性フラクション中のＭｅｒ‐ＷＦ５０２７物質は
その特有紫外部吸収（λ_MAX２８４nm）により検出し
た。フラクション１６〜２１を集め（約２０ml）、再度
ＱＡＥ-セファデックスカラム（１.１×３０cm）に付し
た。塩化ナトリウム濃度０〜０.４Ｍ（全量約４００m
l）のグラディエント溶出を行ない、５gずつ分画し、活
性フラクション４１〜４７を集めた（約３５ml）。これ
を再びダイアイオンＣＨＰ-２０カラム（１.１×３０c
m）に付し、アセトン０〜２０％（全量約４００ml）で
グラディエント溶出した。活性フラクションを集め、ア
セトン除去後凍結乾燥し、白色凍結乾燥標品（Ｎａ塩）
１００mgを得た。

【００２６】かくして得られる抗真菌性物質Ｍｅｒ‐Ｗ
Ｆ５０２７のナトリウム塩［前記式（Ｉ）の化合物のナ
トリウム塩］は以下に示す理化学的性質を有する。

【００２７】 （１）色及び形状：白色粉末 （２）分子式：Ｃ₁₆Ｈ₂₅Ｏ₅Ｎａ （３）マススペクトル（FAB-MS）：Positive；m／z343（M＋2Na-H）⁺、 321（M＋Na）⁺、299（M＋H）⁺ Negative；m／z297（M−H）^- 21 （４）比旋光度：［α］ ＝＋122.23゜（c 0.74、H₂O） D H₂O （５）紫外部吸収スペクトル 図５：λ （nm）＝283.8（ε16200） MAX （６）赤外部吸収スペクトル（KBr）図６ 主要な吸収ピーク（cm^-1）：3470、2815、2690、1575、1490、1430、 1415、1310、1190、1080、1045、960、865、 715、620 （７）¹H−NMRスペクトル（400MHz、DMSO−d6）図７ δTMS（ppm）：0.86（t,3H）、1.26（brs,8H）、1.45（m,3H）、 1.68（dd,1H）、2.00（m,1H）、2.05−2.18（m,3H）、 3.13（td,1H）、3.66（dd，1H）、3.72（brs,1H）、 4.58（brs,1H）、4.96（dd,1H）、7.38（brd,1H） （８）¹³C−NMRスペクトル（100MHz、DMSO-d6）図８ δTMS（ppm）：189.48s、189.00s、107.95s、81.80d、72.02d、70.11d、 69.31d、39.72t、35.00t、31.38t、29.99t、29.17t、 28.77t、26.02t、22.07t、13.97q δTMS＝39.50ppmに定めたヘキサ‐ジューテロ‐ジメチルスルホキシドの 中心ピークを内部標準として用いて化学シフトをTMS＝0.00ppm（δTMS） に関連させた。 （９）溶解性：水、ジメチルスルホキシド、メタノールに溶ける。酢酸エチル、 アセトンにほとんど溶けない。クロロホルムに溶けない。

【００２８】（１０）Ｒf値：シリカゲル薄層クロマト
グラフィー（メルク社製）で クロロホルム／メタノール（5：1） 0.38 酢酸エチル／メタノール（2：1） 0.66であった。

【００２９】

【実施例２】実施例１で得られたＭｅｒ‐ＷＦ５０２７
物質Ｎａ塩２２.４mgを水４mlに溶解後、酢酸-ｎ-ブチ
ル４mlを加えて氷冷下で撹拌した。これに１Ｎ ＨＣl
１４０μlを加え、１５分間撹拌した。室温にて静置後
分液して得た水層についてさらに酢酸-ｎ-ブチルで２回
抽出した。先の酢酸-ｎ-ブチル層と合わせて無水硫酸ナ
トリウムで乾燥し、これを濾過した。濾液を減圧濃縮
し、白色粉末のＭｅｒ‐ＷＦ５０２７物質遊離体２１.
３mgを得た。

【００３０】この遊離体の理化学的性質を以下に示す。

【００３１】 （１）色及び形状：白色粉末 （２）分子式：Ｃ₁₆Ｈ₂₆Ｏ₅ （３）融点：84−86℃ MeOH （４）紫外部吸収スペクトル 図１：λ （nm）＝271.4（br）（ε9700） MAX （５）赤外部吸収スペクトル（KBr）図２ 主要な吸収ピーク（cm^-1）：3420、2925、2850、1720、1620、1360、 1285、1080、955、865、600 （６）¹H−NMRスペクトル（400MHz、CDCl₃）図３ δTMS（ppm）：0.89（t,3H）、1.21−1.55（m,8H）、1.55−1.81 （m,4H）、1.86（dd,1/2H）、1.90（dd,1/2H)、2.33 （m,1H）、2.41−2.57（m,1H)、2.59-2.68（m,2H）、 3.64（td,1/2H)、3.81（brs,1/2H）、3.87（brs,1/2H）、 3.95-4.06（m,3/2H）、4.31（dd,1/2H）、4.34（t,1/2H） 、5.17（dd,1/2H）、5.23（ddd,1/2H）、10.51 （brs,1/2H）、11.21（s,1/2H） （７）¹³C−NMRスペクトル（100MHz、CDCl₃）図４ δTMS（ppm）：197.50s、197.16s、175.29s、174.61s、111.54s、 110.57s、84.16d、83.98d、77.65d、74.73d、72.00d、 71.69d、70.96d、 44.07d、42.47t、31.71t、29.33t、 29.22t、28.84t、28.40t、28.27t、28.18t、27.96t、 26.32t、26.23t、22.57t、14.03q 信号の多重性に関するデータはDEPT試験によって
得た。

【００３２】（８）溶解性：酢酸エチル、クロロホル
ム、アセトン、メタノール、ピリジンに溶ける。トルエ
ンにやや溶ける。水に溶けない。

【００３３】

【実施例３】実施例１で得られたＭｅｒ‐ＷＦ５０２７
物質Ｎａ塩１mgを水１５μlに溶解後、０.１Ｎ ＨＣl
１１０μlを加え、５℃で２時間静置して結晶を析出さ
せた。結晶を瀘取、水洗後、減圧乾燥して無色針状晶
０.２mgを得た。融点１０１〜１０５℃。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１はＭｅｒ‐ＷＦ５０２７物質遊離体のメタ
ノール中での紫外部吸収スペクトルを示す。

【図２】図２はＭｅｒ‐ＷＦ５０２７物質遊離体の臭化
カリウム錠での赤外吸収スペクトルを示す。

【図３】図３はＭｅｒ‐ＷＦ５０２７物質遊離体の重ク
ロロホルム中での４００ＭＨz¹ＨＮＭＲスペクトルを示
す。

【図４】図４はＭｅｒ‐ＷＦ５０２７物質遊離体の重ク
ロロホルム中での１００ＭＨz¹³ＣＮＭＲスペクトルを
示す。

【図５】図５はＭｅｒ‐ＷＦ５０２７物質Ｎａ塩の水中
での紫外部吸収スペクトルを示す。

【図６】図６はＭｅｒ‐ＷＦ５０２７物質Ｎａ塩の臭化
カリウム錠での赤外部吸収スペクトルを示す。

【図７】図７はＭｅｒ‐ＷＦ５０２７物質Ｎａ塩の重Ｄ
ＭＳＯ中での４００ＭＨz ¹ＨＮＭＲスペクトルを示
す。

【図８】図８はＭｅｒ‐ＷＦ５０２７物質Ｎａ塩の重Ｄ
ＭＳＯ中での１００ＭＨz ¹³ＣＮＭＲスペクトルを示
す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:66） (72)発明者 千葉 裕之 神奈川県大和市深見西４−７−26オギハ イツ102号 (72)発明者 熊本 俊彦 神奈川県藤沢市鵠沼桜が岡１−９−12 (72)発明者 刀根 弘 神奈川県横浜市金沢区並木３−７−４− 1003 (72)発明者 岡本 六郎 神奈川県藤沢市花の木２−18 (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C12P 17/04 C07D 307/20 ＣＡ（ＳＴＮ)

Claims (2)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 式 【化１】 で示される抗真菌性物質Ｍｅｒ‐ＷＦ５０２７及びその
   塩。
2. 【請求項２】 アスペルギルス属に属する抗真菌性物質
   Ｍｅｒ−ＷＦ５０２７生産菌を培地で培養し、培養物か
   ら抗真菌性物質Ｍｅｒ−ＷＦ５０２７をその塩の形で採
   取し、そして必要に応じて該塩を遊離の抗真菌性物質Ｍ
   ｅｒ−ＷＦ５０２７または他の塩に変えることを特徴と
   する請求項１記載の抗真菌性物質Ｍｅｒ−ＷＦ５０２７
   またはその塩の製造法。