JP2730671B2

JP2730671B2 - ポリ−β−ヒドロキシ酪酸を生産するシアノバクテリア

Info

Publication number: JP2730671B2
Application number: JP7318634A
Authority: JP
Inventors: 正人三宅; 泰男浅田
Original assignee: Agency of Industrial Science and Technology
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date: 1995-11-13
Filing date: 1995-11-13
Publication date: 1998-03-25
Anticipated expiration: 2015-11-13
Also published as: JPH09131175A

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ポリ−β−ヒドロ
キシ酪酸生産能を有するシアノバクテリアシネココッ
カス・エスピー（Synechococcus sp. ）、シアノバクテ
リアを用いたポリ−β−ヒドロキシ酪酸の生産方法及び
炭酸ガスのリサイクル方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ポリ−β−ヒドロキシ酪酸は、微生物が
生産するバイオポリマーの一種であり、微生物により分
解可能な熱可塑性樹脂として、医薬類、農薬類、医療材
料、工業材料等の多方面での利用が期待される物質であ
る。炭酸ガスからポリ−β−ヒドロキシ酪酸を製造する
方法については、水素細菌の炭酸固定能を利用する方
法、及び遺伝子組換え植物又は遺伝子組換えシアノバク
テリアを利用する方法が知られている。

【０００３】しかし、前者の場合、同時に高価な水素を
必要とするため経済的に有用ではなく、さらにその安全
対策にコストや手間がかかるという欠点があった。ま
た、後者では、ポリ−β−ヒドロキシ酪酸の生産性が低
いという問題点があった。一方、炭酸ガスリサイクルの
技術は未だ確立されてはいないが、接触水素化法（荒川
裕則、ケミカルエンジニアリング、1990年）により、メ
タノール、エタノール等のアルコール類からエタン、ベ
ンゼン等の炭化水素を含む化学品の合成が試みられてい
る。その他、人工光合成、電気化学、有機合成、直接分
解等による有機物へのリサイクルが試みられている。い
ずれの場合にも、収率を上げるために炭酸ガスの濃縮精
製過程を必要とする。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、ポリ−β−
ヒドロキシ酪酸生産能を有するシアノバクテリアシネ
ココッカス・エスピー、シアノバクテリアを用いたポリ
−β−ヒドロキシ酪酸の生産方法及び炭酸ガスのリサイ
クル方法を提供することを目的とする。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題に
基づいて鋭意研究を行った結果、自然界から細胞乾重量
の30％以上のポリ−β−ヒドロキシ酪酸を炭酸ガスから
光を用いて合成し、蓄積するシアノバクテリアシネコ
コッカス・エスピー（Synechococcus sp. ）ＭＡ株を見
い出し、本発明を完成させた。

【０００６】すなわち、本発明は、ポリ−β−ヒドロキ
シ酪酸生産能を有するシアノバクテリアシネココッカ
ス・エスピーＭＡ株である。さらに、本発明は、シネコ
コッカス属に属し、ポリ−β−ヒドロキシ酪酸生産能を
有するシアノバクテリアを培養し、得られる培養物から
ポリ−β−ヒドロキシ酪酸を採取することを特徴とする
ポリ−β−ヒドロキシ酪酸の生産方法である。

【０００７】さらに、本発明は、シネココッカス属に属
し、ポリ−β−ヒドロキシ酪酸生産能を有するシアノバ
クテリアを培養し、得られる培養物からポリ−β−ヒド
ロキシ酪酸を採取することを特徴とする炭酸ガスのリサ
イクル方法である。以下、本発明を詳細に説明する。本
発明は、自然界から分離され、ポリ−β−ヒドロキシ酪
酸（以下「ＰＨＢ」という）生産能を有するシアノバク
テリア、シアノバクテリアを用いたＰＨＢの生産方法及
び炭酸ガスのリサイクル方法である。

【０００８】まず、本発明のシアノバクテリアシネコ
コッカス・エスピーＭＡ株（以下「本株」という）の藻
類学的特徴について説明する。 (1) 本株の選抜手段日本各地の温泉から採集してきたシアノバクテリア塊を
ＢＧ11培地中、光照射下、50℃で培養した。増殖できた
シアノバクテリアは平板塗抹法により単菌分離した。次
に、純粋培養された各細胞を窒素源を欠いたＢＧ11培地
に移植し、上記条件で２週間培養した。ＰＨＢを特異的
に染色する色素であるNile blue A で遠心集菌された各
細胞を染色し、ＰＨＢの有無を判別した。Nile blue A
によって特によく染色されたシアノバクテリアの中から
本株を選抜した。

【０００９】(2) 本株の藻類学的性質Ａ．形態的性質細胞は、やや円筒形で直径２〜４μm である。疑似糸状性、単細胞性シアノバクテリアである（図
１）Ｂ．含有色素クロロフィルａ、フィコシアニンを有する。

【００１０】Ｃ．生理学的性質光合成能：あり（酸素発生型）窒素固定能：なしビタミン要求性：不明生育ｐＨ域：５付近〜10付近の範囲である。至適ｐ
Ｈは７〜10である。生育温度域：40〜60℃の範囲であり好熱性である。生育塩濃度域：淡水性Ｄ．生殖様式無性生殖、２分裂（条件によっては不均等分裂が見られ
る。分裂面は分裂方向に対し垂直）。

【００１１】(3) 本株の属及び種の決定本株は、クロロフィルａ、フィコシアニンを有し、酸素
発生型の光合成を行う原核生物であることからシアノバ
クテリア類に属する。細胞の形態が疑似糸状性の単細胞
であること、及び窒素固定能をもたないことから、本株
をシネココッカス・エスピー（Synechococcus sp. ）Ｍ
Ａ株と命名した。なお、本株は工業技術院生命工学工業
技術研究所に、FERM P-15099として寄託されている。

【００１２】(4) 本株の生産するＰＨＢの性質本株の生産するＰＨＢは、クロロホルムに溶解し、ヘキ
サンやアセトンなどに不溶性である。プロトン−ＮＭＲ
解析（図２参照）、ガスクロマトグラフィーの結果、本
株の生産するＰＨＢはホモポリマーであることがわかっ
た。次に、本株を用いたＰＨＢの生産方法について説明
する。

【００１３】上記ＰＨＢは、本株を培養し、得られる培
養物からＰＨＢを採取することにより得ることができ
る。ここで、「培養物」とは、培養懸濁液、培養藻類若
しくはその破砕物又は培養上清液のいずれをも意味する
ものである。本発明に用いる培養液は、シアノバクテリ
ア類の培養に通常使用されているものでよく、各種栄養
塩、ビタミン、微量金属塩等を含む培地が用いられる。
例えば、本株を、硝酸ナトリウムのような窒素源を含む
無機培地、例えばＢＧ11培地（実施例１の表１参照）中
で培養する。培養温度は45〜55℃が好ましい。

【００１４】また、培養には、光及び炭酸ガスが必要で
ある。光を与える場合は、１キロルックス以上、好まし
くは本株の光合成が光飽和領域（具体的には５〜10キロ
ルックス）にあるような光照射条件にする。この場合、
連続光照射、明暗サイクルをつけた光条件によることは
ない。炭酸ガスを与える場合は、空気中の炭酸ガス濃度
以上の炭酸ガス濃度、例えば0.03％以上の濃度、好まし
くは２〜５％の濃度条件で行う。ここで、本発明におい
て使用する炭酸ガスには、産業活動又は日常生活から発
生する炭酸ガスも含まれる。例えば、化学プラント、発
電所、廃物処理などの産業活動から発生する炭酸ガス、
又は衣、食、住等の日常生活から発生する炭酸ガスを分
離回収し、必要に応じて空気と混合して炭酸ガス源とす
る。あるいは、シアノバクテリアの生育に影響のない範
囲で発生ガスを直接本発明の炭酸ガス源とする。炭酸ガ
スの分離回収技術としては、例えば物理、化学吸収法、
吸着法、膜分離法、蒸留法等が挙げられるが、シアノバ
クテリアは自身で炭酸ガスを細胞内に濃縮する性質があ
るため、必ずしも炭酸ガスを分離回収して炭酸ガス源と
する必要はない。空気を直接利用することも可能であ
る。

【００１５】また、培養時間は、３〜５日である。上記
培養によって増殖した細胞を、窒素源を含まない無機培
地、例えば前記ＢＧ11培地から窒素源を除いた培地に移
植後、前記温度、培養時間、光及び炭酸ガス濃度の条件
でさらに培養する。その結果、細胞内顆粒としてＰＨＢ
が蓄積される。なお、ＰＨＢの蓄積量は培養時間に依存
して増加する。ＰＨＢは、培養によって得られた培養菌
体をクロロホルムで抽出後、ヘキサン中に展開すること
により分離精製することができる。そして、得られたＰ
ＨＢについては、ガスクロマトグラフィー等により純度
分析を行うことができる。

【００１６】

【発明の実施の形態】以下、実施例により本発明をさら
に具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例に限
定されない。〔実施例１〕表１に示す組成のＢＧ11培地１リットルに
本株の種菌100 mlを加え、５キロルックスの光照射下、
２％の炭酸ガスを吹き込みながら50℃で４日間培養し
た。

【００１７】表１ＢＧ11培地組成（１L あたり) ────────────────────────────────── 硝酸ナトリウム 1.5 g 燐酸水素二カリウム 0.03g 硫酸マグネシウム 0.075g 塩化カルシウム 0.036g クエン酸 0.006g クエン酸鉄アンモニウム 0.006g エチレンジアミン四酢酸ナトリウム 0.001g 炭酸ナトリウム 0.02g ビタミンＢ12 0.000001g Ａ５溶液 1 ml ほう酸 2.86g 硫酸マンガン 2.50g 硫酸銅 0.222g モリブデン酸ナトリウム 0.021g 濃硫酸 1 滴蒸留水 1 L ──────────────────────────────────

【００１８】培養後得られた細胞を、窒素源を含まない
１L のＢＧ11培地（硝酸ナトリウムを含まないもの；ｐ
Ｈ８）に移植し、５キロルックス、50℃の条件でさらに
８日間、２％炭酸ガスを通気しながら培養した。その結
果、乾燥重量２ｇの菌体が得られ、その中に最大0.6gの
ＰＨＢが細胞内顆粒として蓄積された。

【００１９】得られた培養物からＰＨＢの精製を行っ
た。すなわち、60℃で乾燥した培養物２ｇを100 mlのク
ロロホルムに入れ、90℃で一昼夜抽出を行った。抽出液
をエバポレーターで10mlまで濃縮後、ヘキサン１リット
ル中に展開した。このときＰＨＢが白沈として得られ
た。この白沈をブフナーロートで回収し、乾燥させた。

【００２０】〔比較例１〕本株の代わりにＰＨＢ生産能
を有する遺伝子組換えシアノバクテリアpAER1-1（遺伝
子組換えシアノバクテリアpAER1-1 は、工業技術院生命
工学工業技術研究所に、FERM P-14469として寄託されて
いる) を１L のBG11培地に植菌し、実施例１と同じ条件
で培養した。次に、得られた増殖した細胞を１L の窒素
源を含まないＢＧ11培地に移植し、さらに14日間培養し
た。

【００２１】実施例１と同様に精製を行った結果、乾燥
重量１ｇの菌体が得られ、0.09ｇのＰＨＢが菌体内に蓄
積された。実施例１の結果は、比較例１の結果よりも本
株の単位時間当たりの生産性が60倍も高いことを示すも
のである。

【００２２】

【発明の効果】本発明により、ＰＨＢ生産能を有するシ
アノバクテリアシネココッカス・エスピーＭＡ株が提
供され、また、効率的にＰＨＢが得られる。

【図面の簡単な説明】

【図１】シネココッカス・エスピーの電子顕微鏡写真で
ある（生物の形態）。

【図２】ＮＭＲの結果を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 7/62 Ｃ１２Ｒ 1:01）

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】ポリ−β−ヒドロキシ酪酸生産能を有す
るシアノバクテリアシネココッカス・エスピーＭＡ株。
【請求項２】シネココッカス属に属し、ポリ−β−ヒ
ドロキシ酪酸生産能を有するシアノバクテリアを培養
し、得られる培養物からポリ−β−ヒドロキシ酪酸を採
取することを特徴とするポリ−β−ヒドロキシ酪酸の生
産方法。
【請求項３】シネココッカス属に属し、ポリ−β−ヒ
ドロキシ酪酸生産能を有するシアノバクテリアを培養
し、得られる培養物からポリ−β−ヒドロキシ酪酸を採
取することを特徴とする炭酸ガスのリサイクル方法。