JP2024079818A - コレステリルエステル蓄積症の処置のための方法及び組成物 - Google Patents

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Abstract

【課題】欠損ＬＡＬタンパク質発現を有する対象又はコレステリルエステル蓄積症を有する対象のような処置を必要とする対象を処置するための方法及び組成物を提供する。【解決手段】コレステリルエステル蓄積症（ＣＥＳＤ）の処置を必要とする対象において、対象の細胞による標的タンパク質又は機能性ＲＮＡの発現を調節することによってそれを処置する。【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
[0001]本願は、２０１８年５月４日出願の米国仮出願第６２／６６７，２０５号の利益を主張するものであり、その全体を本願明細書に援用する。
[0002]コレステリルエステル蓄積症（ＣＥＳＤ）（時には、リソソーム酸リパーゼ（ＬＡＬ）欠損症とも称される）は、機能性ＬＡＬ酵素の欠損により引き起こされる常染色体劣性慢性肝疾患である。ＣＥＳＤは、希少であるが重篤な疾患であり、身体が十分なＬＡＬを産生しないときに発生する。ＬＡＬ酵素（コレステリルエステルヒドロラーゼとも称される）は脂肪物質を分解する酵素であり、コレステリルエステル及びトリグリセリドの代謝に必須である。ＬＩＰＡ遺伝子の点変異は、酵素活性が欠損した短鎖型タンパク質の産生をもたらし、臓器及び組織におけるコレステリルエステルの蓄積を引き起こす。低減されたＬＡＬ酵素活性は、典型的には肝臓、脾臓、腸、血管壁、及び他の重要な臓器を含めた様々な組織に脂肪物質の大量堆積をもたらす。その結果、ＣＥＳＤは典型的に、有意な罹患率及び死亡率に関連し、乳幼児期から成人期の個人に影響を与える可能性がある。
[0003]本開示の１つの態様によると、コレステリルエステル蓄積症（ＣＥＳＤ）の処置を必要とする対象において、対象の細胞による標的タンパク質又は機能性ＲＮＡの発現を調節することによってそれを処置する方法であって、細胞はスキップ可能なエクソン含有プレｍＲＮＡ（ＳＥＣプレｍＲＮＡ）を有し、ＳＥＣプレｍＲＮＡは、スキップ可能なエクソン、スキップ可能なエクソンの５’スプライス部位に隣接するイントロン、及びスキップ可能なエクソンの３’スプライス部位に隣接するイントロンを含み、ＳＥＣプレｍＲＮＡは標的タンパク質又は機能性ＲＮＡをコードし、前記方法は、対象の細胞を、標的タンパク質又は機能性ＲＮＡをコードするＳＥＣプレｍＲＮＡの標的化部分に相補的なアンチセンスオリゴマー（ＡＳＯ）と接触させ、それにより、スキップ可能なエクソンが、標的タンパク質又は機能性ＲＮＡをコードするＳＥＣプレｍＲＮＡからプロセシングされたｍＲＮＡに保持され、それにより、対象の細胞において、標的タンパク質又は機能性ＲＮＡをコードするｍＲＮＡのレベルを調節し、そして標的タンパク質又は機能性ＲＮＡの発現を調節する、ことを含む方法が、本明細書に提供される。
[0004]本開示の１つの態様によると、スキップ可能なエクソン含有プレｍＲＮＡ（ＳＥＣプレｍＲＮＡ）を有する細胞による、リソソーム酸リパーゼ（ＬＡＬ）である標的タンパク質の発現を調節する方法であって、ＳＥＣプレｍＲＮＡは、スキップ可能なエクソン、スキップ可能なエクソンの５’スプライス部位に隣接するイントロン、及びスキップ可能なエクソンの３’スプライス部位に隣接するイントロンを含み、ＳＥＣプレｍＲＮＡはＬＡＬタンパク質をコードし、前記方法は、細胞を、ＬＡＬタンパク質をコードするＳＥＣプレｍＲＮＡの標的化部分に相補的なアンチセンスオリゴマー（ＡＳＯ）と接触させ、それにより、スキップ可能なエクソンが、ＬＡＬタンパク質をコードするＳＥＣプレｍＲＮＡからプロセシングされたｍＲＮＡに保持され、それにより、細胞において、ＬＡＬタンパク質をコードするｍＲＮＡのレベルを調節し、そしてＬＡＬタンパク質の発現を調節する、ことを含む方法が、本明細書に提供される。
[0005]一部の実施形態では、標的タンパク質又は標的タンパク質をコードするｍＲＮＡの発現又はレベルを調節することは、標的タンパク質又は標的タンパク質をコードするｍＲＮＡの発現又はレベルを増加させる。一部の実施形態では、ＬＡＬタンパク質又はＬＡ
Ｌタンパク質をコードするｍＲＮＡの発現又はレベルを調節することは、ＬＡＬタンパク質又はＬＡＬタンパク質をコードするｍＲＮＡの発現又はレベルを増加させる。一部の実施形態では、標的タンパク質はＬＡＬである。一部の実施形態では、細胞は、ＬＡＬタンパク質の量又は活性の欠損により引き起こされる病態を有する対象内にあるか又は対象由来のものである。一部の実施形態では、５’スプライス部位に隣接するイントロンの＋１～＋６及びスキップ可能なエクソンの－３ｅ～－１ｅにある９個のヌクレオチドのうちの少なくとも１個のヌクレオチドは、少なくとも１個の変異を含む。一部の実施形態では、変異は置換である。一部の実施形態では、変異は－１ｅにある。一部の実施形態では、変異はｃ．８９４Ｇ＞Ａである。一部の実施形態では、標的タンパク質の量の欠損は、常染色体劣性遺伝により引き起こされる。一部の実施形態では、対象は、機能性標的タンパク質をコードする第１の対立遺伝子及び（ａ）機能性標的タンパク質をコードする第２の対立遺伝子を有し、アンチセンスオリゴマーは、第１若しくは第２の対立遺伝子から転写されたＳＥＣプレｍＲＮＡの標的化部分に結合するか、又は前記第１の対立遺伝子及び（ｂ）第２の対立遺伝子を有し、アンチセンスオリゴマーは、第１の対立遺伝子から転写されたＳＥＣプレｍＲＮＡの標的化部分に結合する。一部の実施形態では、対象は、標的タンパク質の量又は機能の欠損によってもたらされる障害によって引き起こされる病態を有し、対象は、第１の変異を含む第１の対立遺伝子であって、第１の変異により、標的タンパク質が野生型対立遺伝子からの産生と比較して低減されたレベルで産生されるか、標的タンパク質が同等の野生型タンパク質と比較して低減された機能を有する形態で産生されるか、又は標的タンパク質が産生されない、第１の対立遺伝子、及び第２の変異を含む第２対立遺伝子であって、第２の変異により、標的タンパク質が野生型対立遺伝子からの産生と比較して低減されたレベルで産生されるか、標的タンパク質が同等の野生型タンパク質と比較して低減された機能を有する形態で産生されるか、又は標的タンパク質が産生されない、第２対立遺伝子を有し、第１及び第２の変異は同一か又は異なっている。一部の実施形態では、標的タンパク質は、同等の野生型タンパク質と比較して低減された機能を有する形態で産生される。一部の実施形態では、標的タンパク質は、同等の野生型タンパク質と比較して完全に機能性の形態で産生される。一部の実施形態では、ＳＥＣプレｍＲＮＡの標的化部分は、スキップ可能なエクソン内のスキップ可能なエクソンの５’スプライス部位に対して－４ｅからスキップ可能なエクソンの３’スプライス部位に対して＋２ｅまでの領域内にある。一部の実施形態では、ＳＥＣプレｍＲＮＡの標的化部分は、スキップ可能なエクソンの５’スプライス部位に隣接するイントロンの＋６～＋５００の領域内、又はスキップ可能なエクソンの３’スプライス部位に隣接するイントロンの－１６～－５００の領域内にある。一部の実施形態では、ＳＥＣプレｍＲＮＡの標的化部分は、スキップ可能なエクソンの５’スプライス部位に対して－４ｅ～－５００ｅの領域内、スキップ可能なエクソンの５’スプライス部位に対して＋６～＋５００の領域内、スキップ可能なエクソンの３’スプライス部位に対して－１６～－５００の領域内、又はスキップ可能なエクソンの３’スプライス部位に対して＋２ｅ～＋５００ｅの領域内にある。一部の実施形態では、ＳＥＣプレｍＲＮＡは、配列番号１又はその相補配列のいずれか１つに少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、又は１００％の配列同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、ＳＥＣプレｍＲＮＡは、配列番号１又はその相補配列に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、又は１００％の配列同一性を有する遺伝子配列によりコードされる。一部の実施形態では、ＳＥＣプレｍＲＮＡの標的化部分は、配列番号２～４又はそれらの相補配列の少なくとも８個の連続した核酸を含む領域に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、又は１００％の配列同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、ＡＳＯは、配列番号５～６３又はそれらの相補配列のいずれか１つに少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、又は１００％の同一性がある配列を含む。一部の実施形態では、ＳＥＣプレｍＲＮＡの標的化部分は、スキップ可能なエクソンの５’スプライス部位に対して－４ｅからスキップ可能なエクソンの３’スプライス部位に対して＋２ｅまでの領域内にあり、スキップ可能なエクソンはエクソン８である。一部の実施形態では、ＡＳＯは、配列番号５４～６３又はそれ
らの相補配列のいずれか１つに少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、又は１００％の同一性がある配列を含む。一部の実施形態では、ＳＥＣプレｍＲＮＡの標的化部分は、スキップ可能なエクソンの５’スプライス部位に対して＋６～＋５００の領域内にあり、スキップ可能なエクソンはエクソン８である。一部の実施形態では、ＡＳＯは、配列番号５～３８又はそれらの相補配列のいずれか１つに少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、又は１００％の同一性がある配列を含む。一部の実施形態では、ＳＥＣプレｍＲＮＡの標的化部分は、スキップ可能なエクソンの３’スプライス部位に対して－１６～－５００の領域内にあり、スキップ可能なエクソンはエクソン８である。一部の実施形態では、ＡＳＯは、配列番号３９～５３又はそれらの相補配列のいずれか１つに少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、又は１００％の同一性がある配列を含む。一部の実施形態では、ＳＥＣプレｍＲＮＡは、全長プレｍＲＮＡの部分的にスプライシングされたプレｍＲＮＡであるか、又は野生型プレｍＲＮＡの部分的にスプライシングされたプレｍＲＮＡである。一部の実施形態では、標的タンパク質又は機能性ＲＮＡをコードするｍＲＮＡは、全長成熟ｍＲＮＡ又は野生型成熟ｍＲＮＡである。一部の実施形態では、産生される標的タンパク質は、全長タンパク質若しくは野生型タンパク質、又はそれらの組合せである。
[0006]一部の実施形態では、アンチセンスオリゴマーと接触させた細胞内で産生される標的タンパク質又は機能性ＲＮＡをコードするｍＲＮＡの総量は、対照細胞内で産生される標的タンパク質又は機能性ＲＮＡをコードするｍＲＮＡの総量と比較して、約１．１～約１０倍、約１．５～約１０倍、約２～約１０倍、約３～約１０倍、約４～約１０倍、約１．１～約５倍、約１．１～約６倍、約１．１～約７倍、約１．１～約８倍、約１．１～約９倍、約２～約５倍、約２～約６倍、約２～約７倍、約２～約８倍、約２～約９倍、約３～約６倍、約３～約７倍、約３～約８倍、約３～約９倍、約４～約７倍、約４～約８倍、約４～約９倍、少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、又は少なくとも約１０倍増加する。
[0007]一部の実施形態では、アンチセンスオリゴマーと接触させた細胞内で産生される標的タンパク質又は機能性ＲＮＡをコードするｍＲＮＡの総量は、対照細胞内で産生される標的タンパク質又は機能性ＲＮＡをコードするｍＲＮＡの総量と比較して、約２０％～約３００％、約５０％～約３００％、約１００％～約３００％、約１５０％～約３００％、約２０％～約５０％、約２０％～約１００％、約２０％～約１５０％、約２０％～約２００％、約２０％～約２５０％、約５０％～約１００％、約５０％～約１５０％、約５０％～約２００％、約５０％～約２５０％、約１００％～約１５０％、約１００％～約２００％、約１００％～約２５０％、約１５０％～約２００％、約１５０％～約２５０％、約２００％～約２５０％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約５０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１５０％、少なくとも約２００％、少なくとも約２５０％、又は少なくとも約３００％増加する。
[0008]一部の実施形態では、アンチセンスオリゴマーと接触させた細胞により産生される標的タンパクの総量は、対照細胞により産生される標的タンパク質の総量と比較して、約１．１～約１０倍、約１．５～約１０倍、約２～約１０倍、約３～約１０倍、約４～約１０倍、約１．１～約５倍、約１．１～約６倍、約１．１～約７倍、約１．１～約８倍、約１．１～約９倍、約２～約５倍、約２～約６倍、約２～約７倍、約２～約８倍、約２～約９倍、約３～約６倍、約３～約７倍、約３～約８倍、約３～約９倍、約４～約７倍、約４～約８倍、約４～約９倍、少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、又は少なくとも約１０倍増加する。
[0009]一部の実施形態では、アンチセンスオリゴマーと接触させた細胞により産生される標的タンパク質の総量は、対照細胞により産生される標的タンパク質の総量と比較して、約２０％～約３００％、約５０％～約３００％、約１００％～約３００％、約１５０％～約３００％、約２０％～約５０％、約２０％～約１００％、約２０％～約１５０％、約２０％～約２００％、約２０％～約２５０％、約５０％～約１００％、約５０％～約１５０％、約５０％～約２００％、約５０％～約２５０％、約１００％～約１５０％、約１００％～約２００％、約１００％～約２５０％、約１５０％～約２００％、約１５０％～約２５０％、約２００％～約２５０％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約５０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１５０％、少なくとも約２００％、少なくとも約２５０％、又は少なくとも約３００％増加する。
[0010]一部の実施形態では、アンチセンスオリゴマーは、ホスホロチオエート連結又はホスホロジアミデート連結を含む骨格修飾を含む。一部の実施形態では、アンチセンスオリゴマーは、ホスホロジアミデートモルホリノ、ロックド核酸、ペプチド核酸、２’－Ｏ－メチル、２’－フルオロ、又は２’－Ｏ－メトキシエチル部分を含む。一部の実施形態では、アンチセンスオリゴマーは、少なくとも１個の修飾糖部分を含む。一部の実施形態では、各糖部分は修飾糖部分である。
[0011]一部の実施形態では、アンチセンスオリゴマーは、８～５０個の核酸塩基、８～４０個の核酸塩基、８～３５個の核酸塩基、８～３０個の核酸塩基、８～２５個の核酸塩基、８～２０個の核酸塩基、８～１５個の核酸塩基、９～５０個の核酸塩基、９～４０個の核酸塩基、９～３５個の核酸塩基、９～３０個の核酸塩基、９～２５個の核酸塩基、９～２０個の核酸塩基、９～１５個の核酸塩基、１０～５０個の核酸塩基、１０～４０個の核酸塩基、１０～３５個の核酸塩基、１０～３０個の核酸塩基、１０～２５個の核酸塩基、１０～２０個の核酸塩基、１０～１５個の核酸塩基、１１～５０個の核酸塩基、１１～４０個の核酸塩基、１１～３５個の核酸塩基、１１～３０個の核酸塩基、１１～２５個の核酸塩基、１１～２０個の核酸塩基、１１～１５個の核酸塩基、１２～５０個の核酸塩基、１２～４０個の核酸塩基、１２～３５個の核酸塩基、１２～３０個の核酸塩基、１２～２５個の核酸塩基、１２～２０個の核酸塩基、又は１２～１５個の核酸塩基から成る。
[0012]一部の実施形態では、アンチセンスオリゴマーは、タンパク質をコードするＳＥＣプレｍＲＮＡの標的化部分に少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の相補性がある。一部の実施形態では、方法は、ＬＩＰＡタンパク質発現を評価することを更に含む。一部の実施形態では、ＣＥＳＤが処置され、アンチセンスオリゴマーはＬＩＰＡ ＳＥＣプレｍＲＮＡの標的化部分に結合し、標的化部分は配列番号２～４又はそれらの相補配列の少なくとも８個の連続した核酸を含む。一部の実施形態では、対象はヒトである。一部の実施態様では、対象は非ヒト動物である。一部の実施形態では、対象は、胎児、胚、又は小児である。一部の実施形態では、細胞をｅｘ ｖｉｖｏで接触させる。一部の実施形態では、アンチセンスオリゴマーは、対象への髄腔内注射、脳室内注射、腹腔内注射、筋肉内注射、皮下注射、又は静脈内注射により投与される。
[0013]一部の実施形態では、イントロンの－１５～－１及び３’スプライス部位に隣接するスキップ可能なエクソンの＋１ｅにある１６個のヌクレオチドは、対応する野生型配列と同一であり、イントロンはイントロン７であり、スキップ可能なエクソンはエクソン８である。
[0014]本開示の別の態様によると、本明細書に提供される方法のいずれか１つに使用されるアンチセンスオリゴマーが本明細書に提供される。
[0015]本開示の別の態様によると、配列番号５～６３又はそれらの相補配列のいずれか
１つに少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、又は１００％の配列同一性を有する配列を含むアンチセンスオリゴマーが、本明細書に提供される。
[0016]本開示の別の態様によると、アンチセンスオリゴマーと、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、又は担体とを含む医薬組成物が、本明細書に提供される。
[0017]請求項５２に記載の医薬組成物を、髄腔内注射、脳室内注射、腹腔内注射、筋肉内注射、皮下注射、又は静脈内注射で投与することにより、処置を必要とする対象を処置する方法。
[0018]本開示の別の態様によると、欠損タンパク質又は欠損機能性ＲＮＡに関連するコレステリルエステル蓄積症（ＣＥＳＤ）を処置する必要がある対象においてそれを処置するための、細胞による標的タンパク質又は機能性ＲＮＡの発現を調節する方法に使用するためのアンチセンスオリゴマーを含む組成物であって、欠損タンパク質又は欠損機能性ＲＮＡは対象において量又は活性が欠損しており、アンチセンスオリゴマーは、標的タンパク質又は機能性ＲＮＡをコードするスキップ可能なエクソン含有プレｍＲＮＡ（ＳＥＣプレｍＲＮＡ）からのエクソンの除去を低減させ、標的タンパク質は欠損タンパク質であり、機能性ＲＮＡは欠損ＲＮＡであり、ＳＥＣプレｍＲＮＡは、スキップ可能なエクソン、スキップ可能なエクソンの５’スプライス部位に隣接するイントロン、及びスキップ可能なエクソンの３’スプライス部位に隣接するイントロンを含み、スキップ可能なエクソンは、標的タンパク質又は機能性ＲＮＡをコードするＳＥＣプレｍＲＮＡからプロセシングされたｍＲＮＡに保持され、それにより、対象において標的タンパク質又は機能性ＲＮＡの産生又は活性を調節する組成物が本明細書に提供される。リソソーム酸リパーゼ（ＬＡＬ）タンパク質に関連する病態を処置する必要がある対象においてそれを処置する方法に使用するためのアンチセンスオリゴマーを含む組成物であって、前記方法は対象の細胞によるＬＡＬタンパク質の発現を調節することを含み、細胞は、スキップ可能なエクソン、スキップ可能なエクソンの５’スプライス部位に隣接するイントロン、スキップ可能なエクソンの３’スプライス部位に隣接するイントロンを含むスキップ可能なエクソン含有プレｍＲＮＡ（ＳＥＣプレｍＲＮＡ）を有し、ＳＥＣプレｍＲＮＡはＬＡＬタンパク質をコードし、前記方法は、細胞をアンチセンスオリゴマーと接触させ、それにより、スキップ可能なエクソンが、ＬＡＬタンパク質をコードするＳＥＣプレｍＲＮＡ転写産物からプロセシングされたｍＲＮＡに保持され、それにより、対象の細胞において、ＬＡＬタンパク質をコードするｍＲＮＡのレベルを調節し、そしてＬＡＬタンパク質の発現を調節する組成物も本明細書に提供される。
[0019]一部の実施形態では、標的タンパク質又は標的タンパク質をコードするｍＲＮＡの活性、発現、及び／又は産生を調節することは、標的タンパク質又は標的タンパク質をコードするｍＲＮＡの活性、発現、及び／又は産生を増加させる。一部の実施形態では、ＬＡＬタンパク質又はＬＡＬタンパク質をコードするｍＲＮＡの活性、発現、及び／又は産生を調節することは、ＬＡＬタンパク質又はＬＡＬタンパク質をコードするｍＲＮＡの活性、発現、及び／又は産生を増加させる。一部の実施形態では、標的タンパク質はＬＡＬである。一部の実施形態では、病態は疾患又は障害である。一部の実施形態では、疾患又は障害はＣＥＳＤである。一部の実施形態では、標的タンパク質及びＳＥＣプレｍＲＮＡは、ＬＩＰＡ遺伝子によりコードされる。一部の実施形態では、ＡＳＯは、スキップ可能なエクソン内のスキップ可能なエクソンの５’スプライス部位に対して－４ｅからスキップ可能なエクソンの３’スプライス部位に対して＋２ｅまでの領域内にあるＳＥＣプレｍＲＮＡの部分を標的にする。一部の実施形態では、アンチセンスオリゴマーは、スキップ可能なエクソン内の、スキップ可能なエクソンの５’スプライス部位に対して＋６～＋５００の領域内、又はスキップ可能なエクソンの前記３’スプライス部位に対して－１６～－５００までの領域内にあるＳＥＣプレｍＲＮＡの部分を標的にする。一部の実施形態では、アンチセンスオリゴマーは、スキップ可能なエクソンの５’スプライス部位の約１
００ヌクレオチド下流からスキップ可能なエクソンの３’スプライス部位の約１００ヌクレオチド上流までの領域内にあるＳＥＣプレｍＲＮＡの部分を標的にする。一部の実施形態では、ＳＥＣプレｍＲＮＡの標的化部分は、スキップ可能なエクソンの５’スプライス部位に隣接するイントロンの＋６～＋５００の領域内、又はスキップ可能なエクソンの３’スプライス部位に隣接するエクソンの－１６～－５００の領域内にある。一部の実施形態では、ＳＥＣプレｍＲＮＡの標的化部分は、スキップ可能なエクソンの５’スプライス部位に対して－４ｅ～－５００ｅの領域内、スキップ可能なエクソンの５’スプライス部位に対して＋６～＋５００の領域内、スキップ可能なエクソンの３’スプライス部位に対して－１６～－５００の領域内、又はスキップ可能なエクソンの３’スプライス部位に対して＋２ｅ～＋５００ｅの領域内にある。一部の実施形態では、標的タンパク質はＬＡＬである。一部の実施形態では、ＳＥＣプレｍＲＮＡは、配列番号１又はその相補配列のいずれか１つに少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、又は１００％の配列同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、ＳＥＣプレｍＲＮＡは、配列番号１又はその相補配列に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、又は１００％の配列同一性を有する遺伝子配列によりコードされる。一部の実施形態では、ＳＥＣプレｍＲＮＡの標的化部分は、配列番号２～４又はそれらの相補配列の少なくとも８個の連続した核酸を含む領域に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、又は１００％の配列同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、ＡＳＯは、配列番号５～６３又はそれらの相補配列のいずれか１つに少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、又は１００％の同一性がある配列を含む。一部の実施形態では、ＳＥＣプレｍＲＮＡの標的化部分は、スキップ可能なエクソンの５’スプライス部位に対して－４ｅからスキップ可能なエクソンの３’スプライス部位に対して＋２ｅまでの領域内にあり、スキップ可能なエクソンはエクソン８である。一部の実施形態では、ＡＳＯは、配列番号５４～６３又はそれらの相補配列のいずれか１つに少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、又は１００％の同一性がある配列を含む。一部の実施形態では、ＳＥＣプレｍＲＮＡの標的化部分は、スキップ可能なエクソンの３’スプライス部位に対して－１６～－５００の領域内にあり、スキップ可能なエクソンはエクソン８である。一部の実施形態では、ＡＳＯは、配列番号５～３８又はそれらの相補配列のいずれか１つに少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、又は１００％の同一性がある配列を含む。一部の実施形態では、ＳＥＣプレｍＲＮＡの標的化部分は、スキップ可能なエクソンの５’スプライス部位に対して＋６～＋５００の領域内にあり、スキップ可能なエクソンはエクソン８である。一部の実施形態では、ＡＳＯは、配列番号３９～５３又はそれらの相補配列のいずれか１つに少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、又は１００％の同一性がある配列を含む。一部の実施形態では、ＳＥＣプレｍＲＮＡは、全長プレｍＲＮＡ又は野生型プレｍＲＮＡの部分的スプライシングにより産生される。一部の実施形態では、標的タンパク質又は機能性ＲＮＡをコードするｍＲＮＡは、全長成熟ｍＲＮＡ又は野生型成熟ｍＲＮＡである。一部の実施形態では、産生される標的タンパク質は、全長タンパク質若しくは野生型タンパク質である。一部の実施形態では、アンチセンスオリゴマーは、ホスホロチオエート連結又はホスホロジアミデート連結を含む骨格修飾を含む。一部の実施形態では、前記アンチセンスオリゴマーは、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。一部の実施形態では、アンチセンスオリゴマーは、ホスホロジアミデートモルホリノ、ロックド核酸、ペプチド核酸、２’－Ｏ－メチル、２’－フルオロ、又は２’－Ｏ－メトキシエチル部分を含む。一部の実施形態では、アンチセンスオリゴマーは、少なくとも１個の修飾糖部分を含む。一部の実施形態では、各糖部分は修飾糖部分である。一部の実施形態では、アンチセンスオリゴマーは、８～５０個の核酸塩基、８～４０個の核酸塩基、８～３５個の核酸塩基、８～３０個の核酸塩基、８～２５個の核酸塩基、８～２０個の核酸塩基、８～１５個の核酸塩基、９～５０個の核酸塩基、９～４０個の核酸塩基、９～３５個の核酸塩基、９～３０個の核酸塩基、９～２５個の核酸塩基、９～２０個の核酸塩基、９～１５個の核酸塩基、１０～５０個の核酸塩基、１０～４０個の核酸塩基、１０～３５個の核酸塩基、１０～３０個の核酸塩基、１０～２５個の核酸塩基、１０
～２０個の核酸塩基、１０～１５個の核酸塩基、１１～５０個の核酸塩基、１１～４０個の核酸塩基、１１～３５個の核酸塩基、１１～３０個の核酸塩基、１１～２５個の核酸塩基、１１～２０個の核酸塩基、１１～１５個の核酸塩基、１２～５０個の核酸塩基、１２～４０個の核酸塩基、１２～３５個の核酸塩基、１２～３０個の核酸塩基、１２～２５個の核酸塩基、１２～２０個の核酸塩基、又は１２～１５個の核酸塩基から成る。
[0020]請求項５４～８６に記載のいずれかの組成物のアンチセンスオリゴマーと、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、又は担体とを含む医薬組成物も本明細書に提供される。
[0021]本開示の別の態様によると、請求項８７に記載の医薬組成物を、髄腔内注射、脳室内注射、腹腔内注射、筋肉内注射、皮下注射、又は静脈内注射で投与することにより処置を必要とする対象を処置する方法が本明細書に提供される。
[0022]本開示の別の態様によると、ＬＩＰＡ ｍＲＮＡ転写産物の標的配列にハイブリダイズするアンチセンスオリゴマーと、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、又は担体とを含む医薬組成物であって、ＬＩＰＡ ｍＲＮＡ転写産物はスキップされるエクソンを含み、アンチセンスオリゴマーはＬＩＰＡ ｍＲＮＡ転写産物のスキップされるエクソンの保持を誘導する、医薬組成物が本明細書に提供される。一部の実施形態では、ＬＩＰＡ ｍＲＮＡ転写産物は、ＬＩＰＡ ＳＥＣプレｍＲＮＡ転写産物である。一部の実施形態では、ＬＩＰＡ ＳＥＣプレｍＲＮＡ転写産物の標的化部分は、スキップ可能なエクソン内のスキップ可能なエクソンの５’スプライス部位に対して－４ｅからスキップ可能なエクソンの３’スプライス部位に対して＋２ｅまでの領域内にある。一部の実施形態では、ＬＩＰＡ ＳＥＣプレｍＲＮＡ転写産物は、配列番号１又はその相補配列のいずれか１つに少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する遺伝子配列によりコードされる。一部の実施形態では、ＬＩＰＡ ＳＥＣプレｍＲＮＡ転写産物は、配列番号１又はその相補配列のいずれか１つに少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、アンチセンスオリゴマーは、ホスホロチオエート連結又はホスホロジアミデート連結を含む骨格修飾を含む。一部の実施形態では、前記アンチセンスオリゴマーは、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。一部の実施形態では、アンチセンスオリゴマーは、ホスホロジアミデートモルホリノ、ロックド核酸、ペプチド核酸、２’－Ｏ－メチル、２’－フルオロ、又は２’－Ｏ－メトキシエチル部分を含む。一部の実施形態では、アンチセンスオリゴマーは、少なくとも１個の修飾糖部分を含む。一部の実施形態では、アンチセンスオリゴマーは、８～５０個の核酸塩基、８～４０個の核酸塩基、８～３５個の核酸塩基、８～３０個の核酸塩基、８～２５個の核酸塩基、８～２０個の核酸塩基、８～１５個の核酸塩基、９～５０個の核酸塩基、９～４０個の核酸塩基、９～３５個の核酸塩基、９～３０個の核酸塩基、９～２５個の核酸塩基、９～２０個の核酸塩基、９～１５個の核酸塩基、１０～５０個の核酸塩基、１０～４０個の核酸塩基、１０～３５個の核酸塩基、１０～３０個の核酸塩基、１０～２５個の核酸塩基、１０～２０個の核酸塩基、１０～１５個の核酸塩基、１１～５０個の核酸塩基、１１～４０個の核酸塩基、１１～３５個の核酸塩基、１１～３０個の核酸塩基、１１～２５個の核酸塩基、１１～２０個の核酸塩基、１１～１５個の核酸塩基、１２～５０個の核酸塩基、１２～４０個の核酸塩基、１２～３５個の核酸塩基、１２～３０個の核酸塩基、１２～２５個の核酸塩基、１２～２０個の核酸塩基、又は１２～１５個の核酸塩基を含む。一部の実施形態では、アンチセンスオリゴマーは、ＬＩＰＡ ＳＥＣプレｍＲＮＡ転写産物の標的化部分に少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の相補性がある。一部の実施形態では、ＬＩＰＡ ＳＥＣプレｍＲＮＡ転写産物の標的化部分は、配列番号２～４又はそれらの相補配列から選択される配列内にある。
[0023]一部の実施形態では、アンチセンスオリゴマーは、配列番号５～６３又はそれら
の相補配列のいずれか１つに少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性があるヌクレオチド配列を含む。
[0024]一部の実施形態では、アンチセンスオリゴマーは、配列番号５～６３又はそれらの相補配列から選択されるヌクレオチド配列を含む。
[0025]一部の実施形態では、医薬組成物は、髄腔内注射、脳室内注射、腹腔内注射、筋肉内注射、皮下注射、又は静脈内注射用に処方される。
[0026]本開示の更に別の態様によると、ＬＡＬタンパク質の量又は活性の欠損により引き起こされる病態を有する対象を処置する方法であって、配列番号５～６３又はそれらの相補配列のいずれか１つに少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むアンチセンスオリゴマーを対象に投与することを含む方法が本明細書に提供される。一部の実施形態では、対象はヒトである。
援用
[0027]本明細書に記述されている全ての出版物、特許、及び特許出願は、あたかもそれぞれ個別の出版物、特許、又は特許出願が、特定的及び個別に援用されているかのように示されるのと同じ程度に、本明細書に援用される。
[0028]図１は、ＬＩＰＡプレｍＲＮＡの略図である。エクソン８のスキッピングをもたらし、最終的にコレステリルエステル蓄積症（ＣＥＳＤ）をもたらすＬＩＰＡ変異ｃ．８９４Ｇ＞Ａが描写されている。野生型及びＬＩＰＡ変異によって生じる変異体スプライスｍＲＮＡ転写産物の略図も描写されている。示されているように、ＣＥＳＤ変異は、約９５％のｍＲＮＡ転写産物を、非機能性ＬＡＬタンパク質をもたらす短鎖型形態で生じ、機能性ＬＡＬタンパク質をもたらす機能性（全長）ｍＲＮＡを僅か３～５％しか生じない。 [0029]図２は、ＬＩＰＡのｃ．８９４Ｇ＞Ａ変異を有するＣＥＳＤ患者の線維芽細胞においてエクソン８のスキッピングが確認されたことを示す、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）の例を描写する図である。対象及びＣＥＳＤ患者の線維芽細胞を使用し、エクソン７及びエクソン９にプライマーを使用するＲＴ－ＰＣＲ分析は、ｃ．８９４Ｇ＞Ａ変異により引き起こされたエクソン８のスキッピングに対応するバンドの存在を確認した。産物の同一性は、配列決定により確認した。 [0030]図３は、例示的なＬＩＰＡイントロン８の５’スプライス部位領域のアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）ウォークを描写する図である。ホスホロチオエート（ＰＳ）骨格を有する２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－ＭＯＥ）ＡＳＯを使用して、５’スプライス部位の下流にある配列を標的にするＬＩＰＡイントロン８の５’スプライス部位領域に実施されたＡＳＯウォークのグラフ表示が示されている。ＡＳＯは、＋６位から＋１１位までは一度に１ヌクレオチドシフトし、その後、一度に５ヌクレオチドシフトすることによってこの領域を網羅するように設計した。 [0031]図４Ａは、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）により評価したＬＩＰＡイントロン８の５’スプライス部位領域のＡＳＯウォークを描写する図である。代表的なＰＡＧＥは、ｃ．８９４Ｇ＞Ａ変異を有するＣＥＳＤ患者の線維芽細胞において、未処理（ｕｎｔ）、ｍｏｃｋ処理（Ｍｏｃｋ１、Ｍｏｃｋ２、エレクトロポレーションにて）、又は本明細書の実施例及び図３に記載されているように、イントロン８の５’スプライス部位領域を標的にする２’－ＭＯＥ ＡＳＯにより１２０ｎＭの濃度でエレクトロポレーションにて処理された、ＬＩＰＡのＳＹＢＲ－Ｓａｆｅ染色ＲＴ－ＰＣＲ産物を示す。エクソン８含有（全長、上側バンド）及びエクソン８スキッピング（下側バンド）に対応する２つの産物を定量化した。 [0032]図４Ｂは、図４Ａのデータから、全長（エクソン８含有）％をプロットしたグラフである。黒線は、未処理（Ｕｎｔ）に関して変化がないことを示している。 [0033]図５Ａは、ＣＥＳＤ患者の線維芽細胞における、選択されたＡＳＯの例示的な用量依存性効果を描写する図である。ｃ．８９４Ｇ＞Ａ変異を有するＣＥＳＤ患者の線維芽細胞において、ｍｏｃｋ処理（Ｍｏｃｋ、エレクトロポレーションにて）、又はイントロン８を標的にするＡ－３３３４（＋９）若しくはＡ－３３４７（＋６６）の２’－ＭＯＥ ＡＳＯにより３０ｎＭ、６０ｎＭ、１２０ｎＭ、２４０ｎＭ、及び４８０ｎＭの濃度でエレクトロポレーションにて処理された、ＬＩＰＡのＳＹＢＲ－Ｓａｆｅ染色ＲＴ－ＰＣＲ産物を示す代表的なＰＡＧＥが示されている。エクソン８含有（全長、上側バンド）及びエクソン８スキッピング（下側バンド）に対応する２つの産物を定量化した。 [0034]図５Ｂは、図５Ａのデータから、全長（エクソン８含有）％をプロットしたグラフである。黒線は、ｍｏｃｋに関して変化がないことを示している。 [0035]図５Ｃは、ＣＥＳＤ患者の線維芽細胞における、選択されたＡＳＯの例示的な用量依存性効果を描写する図である。ｃ．８９４Ｇ＞Ａ変異を有するＣＥＳＤ患者の線維芽細胞において、ｍｏｃｋ処理（Ｍｏｃｋ）、又はイントロン８を標的にするＡ－３３３４（＋９）若しくはＡ－３３４７（＋６６）の２’－ＭＯＥ ＡＳＯにより２４０ｎＭ、７２０ｎＭ、及び２１６０ｎＭの濃度でエレクトロポレーションにて処理された、ＬＩＰＡのＳＹＢＲ－Ｓａｆｅ染色ＲＴ－ＰＣＲ産物を示す代表的なＰＡＧＥが示されている。エクソン８含有（全長、上側バンド）及びエクソン８スキッピング（下側バンド）に対応する２つの産物を定量化した。 [0036]図５Ｄは、図５Ｃのデータから、全長（エクソン８含有）％をプロットしたグラフである。黒線は、ｍｏｃｋに関して変化がないことを示している。 [0037]図６Ａは、ＣＥＳＤ患者の線維芽細胞における、選択されたＡＳＯの例示的な用量依存性効果を描写する図である。ｃ．８９４Ｇ＞Ａ変異を有するＣＥＳＤ患者の線維芽細胞において、ｍｏｃｋ処理（Ｍｏｃｋ）、又はイントロン８を標的にするＡ－３３３４（＋９）の２’－ＭＯＥ ＡＳＯにより１μＭ、５μＭ、及び２０μＭの濃度で自由取り込み（free-uptake）にて処理された、ＬＩＰＡのＳＹＢＲ－Ｓａｆｅ染色ＲＴ－ＰＣＲ産物を示す代表的なＰＡＧＥが示されている。エクソン８含有（全長、上側バンド）及びエクソン８スキッピング（下側バンド）に対応する２つの産物を定量化した。 [0038]図６Ｂは、図６Ａのデータから、全長（エクソン８含有）％をプロットしたグラフである。黒線は、ｍｏｃｋに関して変化がないことを示している。 [0039]図７Ａは、ＣＥＳＤ患者の線維芽細胞における、選択されたＡＳＯの例示的な用量依存性効果を描写する図である。ｃ．８９４Ｇ＞Ａ変異を有するＣＥＳＤ患者の線維芽細胞において、ｍｏｃｋ処理細胞（－）、又はイントロン８を標的にするＡ－３３３４（＋９）の２’－ＭＯＥ ＡＳＯにより０．１２５μＭ、０．５μＭ、及び２μＭの濃度でエレクトロポレーションにて処理された細胞からのリソソーム酸リパーゼ（ＬＡＬ）タンパク質を示す代表的なドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）が示されている。グリコシル化全長タンパク質に対応する産物を定量化し、ポンソーＳ染色ブロットに正規化した。 [0040]図７Ｂは、図７Ａのデータから、ｍｏｃｋと比較したグリコシル化全長タンパク質の変化倍率をプロットしたグラフである。 [0041]図８は、ｍｏｃｋ処理（ＣＥＳＤ対照）、又はイントロン８を標的にするＡ－３３３４（＋９）２’－ＭＯＥ ＡＯＳにより０．１２５μＭ、０．５μＭ、及び２μＭの濃度でエレクトロポレーションにて処理された、ｃ．８９４Ｇ＞Ａ変異を有するＣＥＳＤ患者の線維芽細胞からのタンパク質抽出物について、０分～６０分まで５分間隔で測定したＬＡＬ活性の動態をプロットしたグラフである。野生型線維芽細胞からのタンパク質抽出物（野生型対照）を比較のために含める。タンパク質１μｇあたりの相対蛍光単位（ＲＦＵ）がプロットされている。 [0042]図９Ａは、ＣＥＳＤ患者の線維芽細胞のイントロン８の＋９領域を標的にする、長さの異なる選択されたＡＳＯの例示的な用量依存性効果を描写する図である。ｃ．８９４Ｇ＞Ａ変異を有するＣＥＳＤ患者の線維芽細胞において、ｍｏｃｋ処理（対照）、又はイントロン８を標的にするＡ－３３３４（＋９）、Ａ－３６８０（＋９（１７））、Ａ－３６８１（＋９（１６））、Ａ－３６８２（＋１０（１７））、Ａ－３６８３（＋１０（１６））、Ａ－３６８４（＋１１（１６））の２’－ＭＯＥ ＡＳＯにより０．１２５μＭ、０．５μＭ、及び２μＭの濃度でエレクトロポレーションにて処理された、ＬＩＰＡのＳＹＢＲ－Ｓａｆｅ染色ＲＴ－ＰＣＲ産物を示す代表的なＰＡＧＥが示されている。エクソン８含有（全長、上側バンド）及びエクソン８スキッピング（下側バンド）に対応する２つの産物を定量化した。 [0043]図９Ｂは、図９Ａのデータから、全長（エクソン８含有）％をプロットしたグラフである。 [0044]図１０は、ｍｏｃｋ処理（対照）、又はイントロン８を標的にするＡ－３３３４（＋９）、Ａ－３６８０（＋９（１７））、Ａ－３６８１（＋９（１６））、Ａ－３６８２（＋１０（１７））、Ａ－３６８３（＋１０（１６））、Ａ－３６８４（＋１１（１６））の２’－ＭＯＥ ＡＯＳにより０．１２５μＭ、０．５μＭ、及び２μＭの濃度でエレクトロポレーションにて処理された、ｃ．８９４Ｇ＞Ａ変異を有するＣＥＳＤ患者の線維芽細胞からのタンパク質抽出物について、３０分～６０分まで測定したＬＡＬ活性の変化（曲線の傾斜）をプロットしたグラフである。タンパク質１μｇあたり１分ごとのＲＦＵの変化がプロットされている。
発明の詳細な説明
[0045]本記載のある特定の詳細が、様々な実施形態の十分な理解を提供するために記載される。しかし、当業者は、これらの詳細がなくても本開示が実施され得ることを理解する。他の場合では、実施形態の記載を不必要に不明瞭にすることを避けるために、周知の構造が詳細に示されていないか又は記載されていない。文脈から必要とされない限り、明細書及びその後の特許請求の範囲の全体にわたって、語「含む（comprise）」、並びにその変形、例えば「含む（comprises）」及び「含む（comprising）」は、開放的で包括的
な意味であり、すなわち、「含まれるが、限定されない（including, but not limited to）」と解釈されるべきである。更に、本明細書に提供されている見出しは、利便さのた
めだけであり、主張される開示の範囲又は意を解説するものではない。
[0046]本明細書及び添付の特許請求の範囲に使用される場合、単形「a」「an」及び「the」には、内容から明示されない限り、複数の対象が含まれる。用語「又は」は、内容から明示されない限り、「及び／又は」が含まれる意味において一般に用いられることにも留意するべきである。
[0047]特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術及び科学用語は、本開示が属する当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものに類似するか又は同等の方法及び物質を、本開示の実施又は試験に使用することができるが、適切な方法及び物質が下記に記載される。
コレステリルエステル蓄積症及びＬＩＰＡ遺伝子
[0048]コレステリルエステル蓄積症（ＣＥＳＤ）は、機能性リソソーム酸リパーゼ（ＬＡＬＤ）酵素欠損により引き起こされる常染色体劣性慢性肝疾患である。ＬＡＬ酵素は、コレステリルエステルの代謝に必須であり、程度は低いがトリグリセリドの代謝にも必須である。ＬＡＬ活性の欠損は、主に、臓器及び組織、特に肝臓、脾臓、及びマクロファージへのコレステリルエステルの蓄積を生じる。この疾患は、多くの臓器における高コレステロール血症、高トリグリセリド血症、ＨＤＬ欠損症、及び異常な脂質沈着を特徴とする。肝臓では、脂肪肝により、及び小結節性肝硬変をもたらし得る線維症により引き起こされる肝腫大を生じる。患者の平均余命は、多くの場合に３０歳未満である。ＣＥＳＤの発症は、小児期又は青年期に典型的に起こるが、症状は成人期まで検出されないことがあり、女性及び男性にほぼ等しく蔓延している。
[0049]ＬＡＬタンパク質をコードするＬＩＰＡ遺伝子における変異は、ＣＥＳＤの基礎的な原因である。ＬＩＰＡ遺伝子変異が残存活性のない酵素を生じるか又は酵素を全く生じないウォルマン病とは異なり、ＣＥＳＤを引き起こす変異は、一部の酵素活性を保持するＬＡＬをコードする。ＣＥＳＤ患者の培養皮膚線維芽細胞におけるＬＡＬ活性についての以前の研究は、生じたｍＲＮＡからの７２塩基対（ｂｐ）のインフレーム欠失をもたらす、エクソン８の５’スプライス部位の－１位にＧ→Ａ変異（Ｅ８ＳＪＭ、エクソン８のスプライスジャンクション変異、ｃ．８９４Ｇ＞Ａ）を確認した。次いで、この７２ｂｐ欠失は全長エクソン８に対応することが示された。Ｇ→Ａ変異は、ＬＩＰＡプレｍＲＮＡの異常なスプライシング及びエクソン８の異常なスキッピングを引き起こす。ｍＲＮＡからのエクソン８の欠失は、ＬＡＬタンパク質のアミノ酸２５４～２７７のコドンの損失を生じる。短くなったタンパク質は残存ＬＡＬ活性を有さないが、正常にスプライシングされたＬＩＰＡの２％～５％がホモ接合体担体に存在するので、Ｅ８ＳＪＭはウォルマン病を引き起こさない。現在までに記載されているＣＥＳＤ患者の大多数は、Ｅ８ＳＪＭキャリアである。
[0050]本開示は、ＬＩＰＡのｃ．８９４Ｇ＞Ａ変異により引き起こされる異常なスプライシングを調節して、機能性タンパク質をコードする成熟ｍＲＮＡの産生を増加させ、したがって翻訳される機能性ＬＡＬタンパク質を増加させる組成物及び方法を提供する。これらの組成物及び方法は、エクソンの含有及びＬＩＰＡプレｍＲＮＡの構成的スプライシングを促進させることができるアンチセンスオリゴマー（ＡＳＯ）を含む。様々な実施形態では、本開示の方法の使用により機能性ＬＡＬタンパク質を増加させて、ＬＡＬタンパク質欠損により引き起こされる病態を処置することができる。一部の実施形態では、病態はＣＥＳＤである。
[0051]一部の実施形態では、本発明の方法を使用して、病態の処置を必要とする対象において、機能性ＬＡＬタンパク質産生を増加させる。一部の実施形態では、対象は、ＬＡＬが野生型と比べて必ずしも欠損している必要はないが、いずれにしてもＬＡＬの増加が病態を軽減させる病態を有する。一部の実施形態では、ＣＥＳＤは、常染色体劣性遺伝により引き起こされる。
スプライシング
[0052]介在配列又はイントロンは、１次転写産物、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、及び多数のタンパク質間の複雑な相互作用を調整するスプライセオソームと称される大型で高度に動的なＲＮＡタンパク質複合体により除去される。スプライセオソームは、各イントロン上で順序づけて特別に集合し、Ｕ１ ｓｎＲＮＡによる５’スプライス部位（５’ｓｓ）の認識から、又は分岐点配列（ＢＰＳ）へのＵ２ ｓｎＲＮＡの結合を容易にするＵ２補助因子（Ｕ２ＡＦ）の３’スプライス部位（３’ｓｓ）領域への結合を伴う３’ｓｓの認識から出発する。Ｕ２ＡＦは、Ｕ２ＡＦ２をコードする６５ｋＤサブユニット（Ｕ２ＡＦ６５）及びＵ２ＡＦ１をコードする３５ｋＤサブユニット（Ｕ２ＡＦ３５）から構成される安定したヘテロ二量体であり、Ｕ２ＡＦ６５はポリピリミジン配列（ＰＰＴ）に結合し、Ｕ２ＡＦ３５は３’ｓｓで高度に保存されたＡＧジヌクレオチドと相互作用してＵ２ＡＦ６５の結合を安定化させる。ＢＰＳ／ＰＰＴ単位及び３’ｓｓ／５’ｓｓに加えて、正確なスプライシングには、イントロン又はエクソン・スプライシングエンハンサー又はサイレンサーとしても知られている、スプライス部位認識を活性化又は抑制する補助配列又は構造が必要である。これらのエレメントは、高等真核生物のゲノムにおいて、同じ配列を有するが真正部位を１桁上回る膨大な過剰量の潜在的又は偽性部位の中から、真のスプライス部位を認識させることを可能にする。これらは多くの場合に調節機能を有するが、活性化又は抑制の正確な機構は十分に理解されていない。
[0053]スプライシングが生ずるかどうかの決定は、決定論的プロセスというよりむしろ
確率論的プロセスとして典型的にモデル化することができ、最も確定されたスプライシングシグナルでさえときには不正確にスプライスし得る。しかし、通常の条件下では、プレｍＲＮＡスプライシングは、驚くほど高い正確さで進行する。このことは、隣接するシス作用性の補助的なエクソン及びイントロン・スプライシング調節配列（ＥＳＲ又はＩＳＲ）の活性が部分的には原因であり得る。典型的には、これらの機能性エレメントは、スプライシングを刺激又は阻害する能力に基づいて、それぞれ、エクソン若しくはイントロンのスプライシングエンハンサー（ＥＳＥ若しくはＩＳＥ）又はサイレンサー（ＥＳＳ若しくはＩＳＳ）に分類される。一部の補助的なシス作用性エレメントが、スプライセオソーム会合の動態、例えば、Ｕ１ ｓｎＲＮＰと５’ｓｓとの複合体の配置に影響を及ぼすことにより作用し得ることを示唆する証拠が現在存在しているが、多数のエレメントがトランス作用性ＲＮＡ結合タンパク質（ＲＢＰ）と協調的に機能する可能性が高いと思われる。例えば、ＲＢＰのセリン及びアルギニンリッチのファミリー（ＳＲタンパク質）は、エクソンを確定するのに主要な役割を果たすタンパク質の保存ファミリーである。ＳＲタンパク質は、プレスプライセオソームの構成成分を隣接スプライス部位に動員することにより、又は近傍のＥＳＳの効果に拮抗することにより、エクソン認識を促進させる。ＥＳＳ及びＩＳＳの抑制効果は、ヘテロ核リボヌクレオタンパク質（ｈｎＲＮＰ）ファミリーのメンバーにより媒介され、コアスプライシング因子の動員を隣接スプライス部位へ変更することができる。スプライシング調節における役割に加えて、サイレンサーエレメントは偽性エクソンの抑制に役割を果たすことが示唆されており、偽性エクソンは、エクソンの典型的な間隔を有するが、機能性オープンリーディングフレームを有さないデコイイントロン・スプライス部位のセットである。ＩＳＥ、ＩＳＳ、ＥＳＥ、及びＥＳＳは、関連するトランス作用性ＲＢＰと協調して、ｍＲＮＡが、いつ、どこで、どのように前駆体から組み立てられるかを特定するスプライシング制御のセットの重要な構成成分を表す。
[0054]エクソン－イントロンの境界を作る配列は、ヒト遺伝子内で高頻度に発生し得る様々な強度の縮重シグナルである。マルチエクソン遺伝子では、スプライス部位の異なる対が多くの異なる組合せで一緒に連結して、単一遺伝子から多様な転写産物アレイを作り出すことができる。これは選択的プレｍＲＮＡスプライシングと一般的に呼ばれる。選択的スプライシングにより産生される大部分のｍＲＮＡアイソフォームは、核から排出され、機能性ポリペプチドに翻訳されるが、単一遺伝子からの異なるｍＲＮＡアイソフォームは、翻訳効率に著しいばらつきがあり得る。エクソンジャンクション複合体の少なくとも５０ｂｐ上流に未熟終止コドン（ＰＣＴ）を有するそれらのｍＲＮＡアイソフォームは、ナンセンス変異依存ｍＲＮＡ分解（ＮＭＤ）経路による分解の標的になる可能性がある。伝統的（ＢＰＳ／ＰＰＴ／３’ｓｓ／５’ｓｓ）及び補助的スプライシングモチーフにおける変異は、エクソンスキッピング、又は潜在性（若しくは偽性）エクソン含有、又はスプライス部位活性化などの異常なプライシングを引き起こし、ヒトの罹患及び死亡に有意に寄与し得る。異常及び選択的スプライシングパターンは、エクソン及びイントロンにおける天然のＤＮＡバリアントに影響を受けることがある。
[0055]ＥＳＥは非常に多く見られ、全てではないが、構成的エクソンを含めた大部分のエクソンに存在し得る。一部のエクソンは、豊富なＥＳＥを有することがあり、したがって、点変異に対して抵抗性があるが、ある特定の場合（例えば、ＬＩＰＡのエクソン８）では、単一点変異が重要なＥＳＥを破壊し、部分的又は完全に不適切なエクソンスキッピングを生じることがある。
標的転写産物
[0056]一部の実施形態では、本開示の方法は、ＬＩＰＡ遺伝子から転写されたスキップ可能なエクソン含有プレｍＲＮＡ（ＳＥＣプレｍＲＮＡ）の存在を利用する。機能性成熟ＬＩＰＡ ｍＲＮＡを産生することが確認されたＬＩＰＡ ＳＥＣプレｍＲＮＡ転写産物のスプライシングは、エクソン含有及びＬＩＰＡ ＳＥＣプレｍＲＮＡの構成的スプライ
シングを促進させるＡＳＯなどの治療剤を使用して誘導することができる。一部の実施形態では、得られた機能性成熟ＬＩＰＡ ｍＲＮＡは正常に翻訳され、それにより、患者の細胞において機能性ＬＡＬタンパク質の量が増加し、ＣＥＳＤの症状を緩和することができる。
[0057]様々な実施形態では、本開示は、ＬＩＰＡ ＳＥＣプレｍＲＮＡを標的にして、スプライシング又はタンパク質発現のレベルを調節することができる治療剤を提供する。治療剤は、小分子、ポリヌクレオチド、又はポリペプチドであり得る。一部の実施形態では、治療剤はＡＳＯである。ＬＩＰＡ ＳＥＣプレｍＲＮＡの様々な領域又は配列が、ＡＳＯなどの治療剤により標的にされ得る。一部の実施形態では、ＡＳＯは、ＬＩＰＡ遺伝子から転写されたＬＩＰＡ ＳＥＣプレｍＲＮＡを標的にする。一部の実施形態では、ＡＳＯは、スキップ可能なエクソンを含有するＬＩＰＡ遺伝子から転写されたＬＩＰＡ ＳＥＣプレｍＲＮＡを標的にする。一部の実施形態では、スキップ可能なエクソンは、ＬＩＰＡ ＳＥＣプレｍＲＮＡ転写産物のエクソン８である。一部の実施形態では、スキップ可能なエクソンは、異常なスプライシングによってＬＩＰＡ ＳＥＣプレｍＲＮＡ転写産物から切り出される。一部の実施形態では、異常なスプライシングは、ＬＩＰＡ遺伝子における変異によって引き起こされる。一部の実施形態では、変異は、エクソン８スプライスドナーの－１位でのＧ→Ａ変異（Ｅ８ＳＪＭ、エクソン８スプライスジャンクション変異、ｃ．８９４Ｇ＞Ａ）である。一部の実施形態では、ＡＳＯは、ＬＩＰＡ ＳＥＣプレｍＲＮＡ転写産物のスキップ可能なエクソン内の配列を標的にする。一部の実施形態では、スキップ可能なエクソンは、ＬＩＰＡ ＳＥＣプレｍＲＮＡ転写産物のエクソン８である。一部の実施形態では、ＡＳＯは、ＬＩＰＡ ＳＥＣプレｍＲＮＡ転写産物のエクソン８内の配列を標的にする。一部の実施形態では、ＡＳＯは、ＬＩＰＡ ＳＥＣプレｍＲＮＡ転写産物のエクソン８の５’スプライス部位から上流（又は５’）までのエクソン配列を標的にする。一部の実施形態では、ＡＳＯは、ＬＩＰＡ プレｍＲＮＡ転写産物のエクソン８の３’スプライス部位から下流（又は３’）までのエクソン配列を標的にする。一部の実施形態では、ＡＳＯは、ＬＩＰＡ ＳＥＣプレｍＲＮＡ転写産物のスキップ可能なエクソンの３’スプライス部位に隣接するイントロン内の配列を標的にする。一部の実施形態では、ＡＳＯは、ＬＩＰＡ ＳＥＣプレｍＲＮＡ転写産物のイントロン７内の配列を標的にする。一部の実施形態では、ＡＳＯは、ＬＩＰＡ ＳＥＣプレｍＲＮＡ転写産物のイントロン７の３’スプライス部位から上流（又は５’）までのイントロン配列を標的にする。一部の実施形態では、ＡＳＯは、ＬＩＰＡ プレｍＲＮＡ転写産物のイントロン７の５’スプライス部位から下流（又は３’）までのイントロン配列を標的にする。一部の実施形態では、ＡＳＯは、ＬＩＰＡ ＳＥＣプレｍＲＮＡ転写産物のスキップ可能なエクソンの５’スプライス部位に隣接するイントロン内の配列を標的にする。一部の実施形態では、ＡＳＯは、ＬＩＰＡ ＳＥＣプレｍＲＮＡ転写産物のイントロン８内の配列を標的にする。一部の実施形態では、ＡＳＯは、ＬＩＰＡ ＳＥＣプレｍＲＮＡ転写産物のイントロン８の３’スプライス部位から上流（又は５’）までのイントロン配列を標的にする。一部の実施形態では、ＡＳＯは、ＬＩＰＡ プレｍＲＮＡ転写産物のイントロン８の５’スプライス部位から下流（又は３’）までのイントロン配列を標的にする。一部の実施形態では、ＡＳＯは、ＬＩＰＡ ＳＥＣプレｍＲＮＡ転写産物のエクソン－イントロン境界を含む配列を標的にする。一部の実施形態では、エクソンはスキップ可能なエクソンである。エクソン－イントロン境界は、エクソン配列とイントロン配列の接合部を表すことができる。一部の実施形態では、イントロン配列は、スキップ可能なエクソンの５’末端又は３’末端に隣接することができる。一部の実施形態では、ＡＳＯは、ＬＩＰＡ ＳＥＣプレｍＲＮＡ転写産物のエクソン８－イントロン８境界を含む配列を標的にする。一部の実施形態では、ＡＳＯは、ＬＩＰＡ ＳＥＣプレｍＲＮＡ転写産物のイントロ７－エクソン８境界を含む配列を標的にする。一部の実施形態では、ＡＳＯは、イントロンの一部分及びエクソンの一部分の両方を含む配列を標的にする。
[0058]一部の実施形態では、ＡＳＯは、ＬＩＰＡ ＳＥＣプレｍＲＮＡ転写産物のスキップ可能なエクソンの３’スプライス部位から約４～約３００ヌクレオチド上流（又は５’）までの配列を標的にする。一部の実施形態では、ＡＳＯは、ＬＩＰＡ ＳＥＣプレｍＲＮＡ転写産物のスキップ可能なエクソンの３’スプライス部位から約１～約２０ヌクレオチド、約２０～約５０ヌクレオチド、約５０～約１００ヌクレオチド、約１００～約１５０ヌクレオチド、約１５０～約２００ヌクレオチド、約２００～約２５０ヌクレオチド、又は約２５０～約３００ヌクレオチド上流（又は５’）までの配列を標的にする。一部の実施形態では、ＡＳＯは、ＬＩＰＡ ＳＥＣプレｍＲＮＡ転写産物のスキップ可能なエクソンの３’スプライス部位から３００個を超えるヌクレオチド上流までの配列を標的にすることができる。一部の実施形態では、ＡＳＯは、ＬＩＰＡ ＳＥＣプレｍＲＮＡ転写産物のスキップ可能なエクソンの３’スプライス部位から約４～約３００ヌクレオチド下流まで（又は３’）の配列を標的にする。一部の実施形態では、ＡＳＯは、ＬＩＰＡ ＳＥＣプレｍＲＮＡ転写産物のスキップ可能なエクソンの３’スプライス部位から約１～約２０ヌクレオチド、約２０～約５０ヌクレオチド、約５０～約１００ヌクレオチド、約１００～約１５０ヌクレオチド、約１５０～約２００ヌクレオチド、約２００～約２５０ヌクレオチド、又は約２５０～約３００ヌクレオチド下流まで（又は３’）の配列を標的にする。一部の実施形態では、ＡＳＯは、ＬＩＰＡ ＳＥＣプレｍＲＮＡ転写産物のスキップ可能なエクソンの３’スプライス部位から３００個を超えるヌクレオチド下流までの配列を標的にすることができる。一部の実施形態では、ＡＳＯは、ＬＩＰＡ ＳＥＣプレｍＲＮＡ転写産物のスキップ可能なエクソンの５’スプライス部位から約４～約３００ヌクレオチド下流（又は３’）までの配列を標的にする。一部の実施形態では、ＡＳＯは、ＬＩＰＡ ＳＥＣプレｍＲＮＡ転写産物のスキップ可能なエクソンの５’スプライス部位から約１～約２０ヌクレオチド、約２０～約５０ヌクレオチド、約５０～約１００ヌクレオチド、約１００～約１５０ヌクレオチド、約１５０～約２００ヌクレオチド、約２００～約２５０ヌクレオチド、又は約２５０～約３００ヌクレオチド下流までの配列を標的にする。一部の実施形態では、ＡＳＯは、ＬＩＰＡ ＳＥＣプレｍＲＮＡ転写産物のスキップ可能なエクソンの５’スプライス部位から３００個を超えるヌクレオチド下流までの配列を標的にする。一部の実施形態では、ＡＳＯは、ＬＩＰＡ ＳＥＣプレｍＲＮＡ転写産物のスキップ可能なエクソンの５’スプライス部位から約４～約３００ヌクレオチド上流（又は５’）までの配列を標的にする。一部の実施形態では、ＡＳＯは、ＬＩＰＡ ＳＥＣプレｍＲＮＡ転写産物のスキップ可能なエクソンの５’スプライス部位から約１～約２０ヌクレオチド、約２０～約５０ヌクレオチド、約５０～約１００ヌクレオチド、約１００～約１５０ヌクレオチド、約１５０～約２００ヌクレオチド、約２００～約２５０ヌクレオチド、又は約２５０～約３００ヌクレオチド上流までの配列を標的にする。一部の実施形態では、ＡＳＯは、ＬＩＰＡ ＳＥＣプレｍＲＮＡ転写産物のスキップ可能なエクソンの５’スプライス部位から３００個を超えるヌクレオチド上流までの配列を標的にする。
[0059]本明細書の実施例に記載されているように、ＬＩＰＡ遺伝子（配列番号１）をエクソンスキッピング事象について分析したところ、ＳＥＣプレｍＲＮＡからプロセシングされたｍＲＮＡからのエクソン８の除去が観察された。一部の実施形態では、本明細書に開示のＡＳＯは、ＬＩＰＡゲノム配列から転写されたＳＥＣプレｍＲＮＡを標的にする。一部の実施形態では、ＡＳＯは、スキップ可能なエクソンを含むＬＩＰＡゲノム配列からのＳＥＣプレｍＲＮＡ転写産物を標的にする。一部の実施形態では、スキップ可能なエクソンはエクソン８である。一部の実施形態では、ＡＳＯは、エクソン８を含むＬＩＰＡゲノム配列からのＳＥＣプレｍＲＮＡ転写産物を標的にする。一部の実施形態では、ＡＳＯは、スキップ可能なエクソンの３’スプライス部位に隣接するイントロン及びスキップ可能なエクソンの５’スプライス部位に隣接するイントロンを含むＬＩＰＡゲノム配列からのＳＥＣプレｍＲＮＡ転写産物を標的にする。一部の実施形態では、スキップ可能なエクソンの３’スプライス部位に隣接するイントロンはイントロン７であり、スキップ可能なエクソンの５’スプライス部位に隣接するイントロンはイントロン８である。一部の実施
形態では、ＡＳＯは、イントロン７，エクソン８、及びイントロン８を含むＬＩＰＡゲノム配列からのＳＥＣプレｍＲＮＡ転写産物を標的にする。一部の実施形態では、ＡＳＯは、配列番号１のＳＥＣプレｍＲＮＡ転写産物を標的にする。一部の実施形態では、ＡＳＯは、エクソン８を含む配列番号１のＳＥＣプレｍＲＮＡ転写産物を標的にする。一部の実施形態では、ＡＳＯは、イントロン７を含む配列番号１のＳＥＣプレｍＲＮＡ転写産物を標的にする。一部の実施形態では、ＡＳＯは、イントロン８を含む配列番号１のＳＥＣプレｍＲＮＡ転写産物を標的にする。一部の実施形態では、ＡＳＯは、イントロン７、エクソン８、及びイントロン８を含む配列番号１のＳＥＣプレｍＲＮＡ転写産物を標的にする。一部の実施形態では、本明細書に開示のＡＳＯは、ＬＩＰＡ ＳＥＣプレｍＲＮＡ配列（配列番号１）を標的にする。一部の実施形態では、ＡＳＯは、スキップ可能なエクソンを含むＬＩＰＡ ＳＥＣプレｍＲＮＡ配列を標的にする。一部の実施形態では、ＡＳＯは、エクソン８を含むＬＩＰＡ ＳＥＣプレｍＲＮＡ配列（配列番号４）を標的にする。一部の実施形態では、ＡＳＯは、スキップ可能なエクソンの３’スプライス部位に隣接するイントロンを含むＬＩＰＡ ＳＥＣプレｍＲＮＡ配列を標的にする。一部の実施形態では、ＡＳＯは、イントロン７を含むＬＩＰＡ ＳＥＣプレｍＲＮＡ配列（配列番号３）を標的にする。一部の実施形態では、ＡＳＯは、スキップ可能なエクソンの５’スプライス部位に隣接するイントロンを含むＬＩＰＡ ＳＥＣプレｍＲＮＡ配列を標的にする。一部の実施形態では、ＡＳＯは、イントロン８を含むＬＩＰＡ ＳＥＣプレｍＲＮＡ配列（配列番号２）を標的にする。一部の実施形態では、ＡＳＯは、配列番号２～４のいずれか１つのＬＩＰＡ ＳＥＣプレｍＲＮＡ配列を標的にする。一部の実施形態では、ＡＳＯは、配列番号５～６３のいずれか１つの配列を有する。
[0060]一部の実施形態では、ＬＩＰＡ ＳＥＣプレｍＲＮＡ転写産物は、配列番号１又はその相補配列に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する遺伝子配列にコードされる。一部の実施形態では、ＬＩＰＡ ＳＥＣプレｍＲＮＡ転写産物は、配列番号１又はその相補配列のいずれか１つに少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する配列を含む。
[0061]一部の実施形態では、ＬＩＰＡ ＳＥＣプレｍＲＮＡの標的化部分は、配列番号２～４又はそれらの相補配列の少なくとも８個の連続した核酸を含む領域に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、又は１００％の配列同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、ＡＳＯは、配列番号５～６５又はそれらの相補配列のいずれか１つに少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、又は１００％の同一性がある配列を含む。
[0062]一部の実施形態では、ＡＳＯは、スキップ可能なエクソンを含むＬＩＰＡ ＳＥＣプレｍＲＮＡのエクソン８を標的にする。一部の実施形態では、ＡＳＯは、エクソン８の３’スプライス部位の約２ヌクレオチド下流（又は３’）からエクソン８の５’スプライス部位の約４ヌクレオチド上流（又は５’）までの配列を標的にする。一部の実施形態では、ＡＳＯは、配列番号５４～６３又はそれらの相補配列のいずれか１つの配列を有する。
[0063]一部の実施形態では、ＡＳＯは、スキップ可能なエクソンを含むＬＩＰＡ ＳＥＣプレｍＲＮＡのイントロン７を標的にする。一部の実施形態では、ＡＳＯは、イントロン７の３’スプライス部位から約４～約３００ヌクレオチド上流（又は５’）までの配列を標的にする。一部の実施形態では、ＡＳＯは、イントロン７の３’スプライス部位から約１６～約１００ヌクレオチド上流（又は５’）までの配列を標的にする。一部の実施形態では、ＡＳＯは、イントロン７の５’スプライス部位から約４～約３００ヌクレオチド下流（又は３’）までの配列を標的にする。一部の実施形態では、ＡＳＯは、配列番号３
９～５３又はそれらの相補配列のいずれか１つの配列を有する。
[0064]一部の実施形態では、ＡＳＯは、スキップ可能なエクソンを含むＬＩＰＡ ＳＥＣプレｍＲＮＡのイントロン８を標的にする。一部の実施形態では、ＡＳＯは、イントロン８の３’スプライス部位から約４～約３００ヌクレオチド上流（又は５’）までの配列を標的にする。一部の実施形態では、ＡＳＯは、イントロン８の５’スプライス部位から約４～約３００ヌクレオチド下流（又は３’）までの配列を標的にする。一部の実施形態では、ＡＳＯは、イントロン８の５’スプライス部位から６～約１００ヌクレオチド下流（又は５’）までの配列を標的にする。一部の実施形態では、ＡＳＯは、配列番号５～３８又はそれらの相補配列のいずれか１つの配列を有する。
[0065]一部の実施形態では、ＬＩＰＡ ＳＥＣプレｍＲＮＡの標的化部分は、イントロン１、２、３、４、５、６、７、８、又は９である。一部の実施形態では、ＬＩＰＡ ＳＥＣプレｍＲＮＡの標的化部分は、エクソン１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０である。一部の実施形態では、ＳＥＣプレｍＲＮＡの標的化部分へのＡＳＯのハイブリダイゼーションは、エクソン８の含有を生じ、次いでＬＡＬタンパク質産生を増加させる。一部の実施形態では、ＬＩＰＡ ＳＥＣプレｍＲＮＡの標的化部分は、エクソン８である。一部の実施形態では、ＬＩＰＡ ＳＥＣプレｍＲＮＡの標的化部分は、イントロン７である。一部の実施形態では、ＬＩＰＡ ＳＥＣプレｍＲＮＡの標的化部分は、イントロン８である。
ＬＡＬタンパク質
[0066]これも上に記載されているが、ＣＥＳＤにおける最も一般的なＬＩＰＡ変異は、エクソン８に発生する（例えば、Ｅ８ＳＪＭ、エクソン８スプライスジャンクション変異、ｃ．８９４Ｇ＞Ａ）。一部の実施形態では、ｃ．８９４Ｇ＞Ａ変異は、両方の対立遺伝子に発生する。一部の実施形態では、ｃ．８９４Ｇ＞Ａ変異は、２つの対立遺伝子うちの１つに発生する。一部の実施形態では、追加の変異は、２つの対立遺伝子うちの１つに発生する。一部の実施形態では、更なる変異は、ｃ．８９４Ｇ＞Ａ変異と同じ対立遺伝子に発生する。他の実施形態では、更なる変異はトランス変異である。
[0067]一部の実施形態では、本明細書に記載の方法は、機能性ＬＡＬタンパク質の産生を増加させるために使用される。本明細書に使用される場合、用語「機能性」は、処置される疾患又は病態、例えばＣＥＳＤの任意の１以上の症状を排除するために必要なＬＡＬタンパク質の活性又は機能の量を表す。一部の実施形態では、本方法は、部分的に機能性のＬＡＬタンパク質の産生を増加させるために使用される。本明細書に使用される場合、用語「部分的に機能性」は、疾患又は病態、例えばＣＥＳＤの任意の１以上の症状を排除又は予防するために必要な活性又は機能の任意の量よりも少ないＬＡＬタンパク質の活性又は機能の任意の量を表す。一部の実施形態では、部分的に機能性のタンパク質又はＲＮＡは、完全に機能性のタンパク質又はＲＮＡと比べて、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％少ない活性を有する。
[0068]一部の実施形態では、本方法は、ＬＡＬタンパク質をコードするＳＥＣプレｍＲＮＡを有する対象の細胞によるＬＡＬタンパク質の発現を増加させる方法であり、対象は、ＬＡＬタンパク質の量又は活性の欠損により引き起こされるＣＥＳＤを有し、ＬＡＬタンパク質の量の欠損は、常染色体劣性遺伝により引き起こされる。そのような実施形態では、対象は、ｃ．９８４Ｇ＞Ａ変異を有する第１の対立遺伝子、及びＬＡＬタンパク質が産生されない第２の対立遺伝子を有する。別のそのような実施形態では、対象は、ｃ．９８４Ｇ＞Ａ変異を有する第１の対立遺伝子、及び非機能性ＬＡＬタンパク質をコードする
第２の対立遺伝子を有する。別のそのような実施形態では、対象は、ｃ．９８４Ｇ＞Ａ変異を有する第１の対立遺伝子、及び部分的に機能性のＬＡＬタンパク質をコードする第２の対立遺伝子を有する。別のそのような実施形態では、対象は、ｃ．９８４Ｇ＞Ａ変異を有する第１の対立遺伝子、及びｃ．９８４Ｇ＞Ａ変異を有する第２の対立遺伝子を有する。これらの実施形態のいずれかにおいて、アンチセンスオリゴマーは、ｃ．９８４Ｇ＞Ａ変異を有する対立遺伝子から転写されたＳＥＣプレｍＲＮＡの標的化部分に結合し、それにより、プレｍＲＮＡからのスキップ可能なエクソンのエクソンスキッピングを防止し、対象の細胞において機能性ＬＡＬタンパク質をコードする成熟ｍＲＮＡのレベルを増加させ、ＬＡＬタンパク質の発現を増加させる。
[0069]関連する実施形態では、本方法は、ＡＳＯを使用して機能性タンパク質又は機能性ＲＮＡの発現を増加させる方法である。一部の実施形態では、ＡＳＯは、ＬＡＬタンパク質をコードするＳＥＣプレｍＲＮＡを有する対象の細胞においてＬＩＰＡタンパク質の発現を増加させるために使用され、対象は、ＬＡＬタンパク質の量又は機能に欠損を有する、例えばＣＥＳＤを有する。
[0070]一部の実施形態では、疾患又は病態の原因となるタンパク質をコードするＳＥＣプレｍＲＮＡ転写産物は、本明細書に記載のＡＳＯにより標的にされる。一部の実施形態では、疾患の原因とならないタンパク質をコードするＳＥＣプレｍＲＮＡ転写産物が、ＡＳＯにより標的にされる。例えば、特定の経路において第１のタンパク質の変異又は欠損の結果として生じる疾患は、第２のタンパク質をコードするプレｍＲＮＡを含有するＮＩＥを標的にすることにより改善され、それにより、第２のタンパク質の産生を増加させ得る。一部の実施形態では、第２のタンパク質の機能は、第１のタンパク質の変異又は欠損（疾患又は病態の原因である）を代償することができる。
[0071]一部の実施形態では、対象は、
（ａ）ＬＡＬタンパク質が、野生型対立遺伝子からの産生と比較して低減されたレベルで産生される、ｃ．９８４Ｇ＞Ａ変異を有する第１の変異対立遺伝子、及び
（ｂ）
（ｉ）ＬＡＬタンパク質が、ｃ．９８４Ｇ＞Ａ変異に起因して、野生型対立遺伝子からの産生と比較して低減されたレベルで産生される、
（ｉｉ）ＬＡＬタンパク質が、野生型対立遺伝子からの産生と比較して低減されたレベルで産生される、
（ｉｉｉ）ＬＡＬタンパク質が、同等の野生型タンパク質と比較して低減された機能を有する形態で産生される、又は
（ｉｖ）ＬＡＬタンパク質が産生されない、
第２の変異対立遺伝子、
を有し、
ＳＥＣプレｍＲＮＡは、ｃ．９８４Ｇ＞Ａ変異を有する第１の対立遺伝子及び／又は第２の対立遺伝子から転写される。これらの実施形態では、ＡＳＯは、第１の対立遺伝子又は第２の対立遺伝子から転写されるＳＥＣプレｍＲＮＡの標的化部分に結合し、それにより、ＳＥＣプレｍＲＮからＡのエクソン含有を促進させ、ＬＡＬタンパク質をコードする全長ｍＲＮＡのレベルの増加及び対象の細胞における標的タンパク質又は機能性ＲＮＡの発現の増加を引き起こす。これらの実施形態では、ＳＥＣプレｍＲＮＡからのエクソン含有の結果として発現レベルが増加した標的タンパク質又は機能性ＲＮＡは、同等の野生型タンパク質（完全に機能性）と比較して完全に機能性である。
[0072]一部の実施形態では、細胞を、ＬＩＰＡ ＳＥＣプレｍＲＮＡ転写産物の標的化部分と相補的なＡＳＯと接触させることにより、産生されるＬＡＬタンパク質の量は、ＡＳＯの非存在下／処理の非存在下で細胞により産生されるタンパク質の量と比較して、少
なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、８０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、又は１０００％増加する。一部の実施形態では、アンチセンスオリゴマーを接触させた細胞により産生されるＬＡＬタンパク質の総量は、対照化合物により産生される標的タンパク質の量と比較して、約２０％～約３００％、約５０％～約３００％、約１００％～約３００％、約１５０％～約３００％、約２０％～約５０％、約２０％～約１００％、約２０％～約１５０％、約２０％～約２００％、約２０％～約２５０％、約５０％～約１００％、約５０％～約１５０％、約５０％～約２００％、約５０％～約２５０％、約１００％～約１５０％、約１００％～約２００％、約１００％～約２５０％、約１５０％～約２００％、約１５０％～約２５０％、約２００％～約２５０％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約５０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１５０％、少なくとも約２００％、少なくとも約２５０％、又は少なくとも約３００％増加する。一部の実施形態では、アンチセンスオリゴマーを接触させた細胞により産生されるＬＡＬタンパクの総量は、対照化合物により産生される標的タンパク質の量と比較して、約１．１～約１０倍、約１．５～約１０倍、約２～約１０倍、約３～約１０倍、約４～約１０倍、約１．１～約５倍、約１．１～約６倍、約１．１～約７倍、約１．１～約８倍、約１．１～約９倍、約２～約５倍、約２～約６倍、約２～約７倍、約２～約８倍、約２～約９倍、約３～約６倍、約３～約７倍、約３～約８倍、約３～約９倍、約４～約７倍、約４～約８倍、約４～約９倍、少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、又は少なくとも約１０倍増加する。対照化合物は、例えば、プレｍＲＮＡの標的化部分に相補的でないオリゴヌクレオチドであり得る。
[0073]一部の実施形態では、ＬＡＬタンパク質をコードするｍＲＮＡのレベルは、対照細胞において、例えば、アンチセンスオリゴマーで処理されていない細胞、又はＬＩＰＡ
ＳＥＣプレｍＲＮＡの標的化部分に結合しないアンチセンスオリゴマーで処理された細胞において産生されるＬＡＬタンパク質をコードするｍＲＮＡの量と比較して、１．１～１０倍増加する。
[0074]一部の実施形態では、ＬＡＬタンパク質をコードするｍＲＮＡのレベルは、対照細胞において、例えば、アンチセンスオリゴマーで処理されていない細胞、又はＬＩＰＡ
ＳＥＣプレｍＲＮＡの標的化部分に結合しないアンチセンスオリゴマーで処理された細胞において産生されるＬＡＬタンパク質をコードするｍＲＮＡの量と比較して、１．１～１０倍増加する。
[0075]本発明の一部の実施形態では、対象はＬＩＰＡに変異を有することがある。ミスセンスバリアント、ナンセンスバリアント、１塩基及び２塩基の挿入及び欠失、複合挿入／欠失、並びにスプライス部位バリアントを含めた様々な病原性バリアントが、ＬＡＬ欠損を引き起こすことが報告されている。ＣＥＳＤを生じる最も一般的な病原性バリアントであるｃ．８９４Ｇ＞ａは、５’スプライス部位に関連するエクソン８の－１ｅにおいてＧからＡへの転移を伴い、正常なドナースプライスコンセンサス配列を破壊する。典型的には、これは選択的スプライシングを生じ、次いでエクソン８のスキッピングを生じる。この病原性バリアントの存在下では、およそ２％～５％の転写産物が正確にスプライスされ、酵素活性の残存を可能にする。ＬＡＬの触媒活性部位は、アミノ酸残基Ｓｅｒ１５３、Ａｓｐ３２４、及びＨｉｓ３５３から構成される。活性部位のセリンは、β鎖をαヘリックスに接続させるリパーゼコンセンサス配列の一部であり、これは求核性屈曲（nucleophilic elbow）として知られており、適切に方向づけされた複合体における求核剤、ヒスチジン、及びエステル炭素の相互作用を容易にする。疾患は、短鎖型タンパク質又は立体配座の変更若しくは活性の低減を有するタンパク質を生成するＬＩＰＡ病原性バリアントにより引き起こされる、ＬＡＬの機能喪失により生ずる
[0076]一部の実施形態では、当該技術分野に公知であり上に記載された任意のＬＩＰＡ変異を有する対象は、本明細書に記載の方法及び組成物を使用して処置することができる。一部の実施形態では、変異は任意のＬＩＰＡイントロン又はエクソンにある。一部の実施形態では、変異はＬＩＰＡエクソン８にある。
エクソンスキッピング
[0077]本明細書に使用される場合、「スキップ可能なエクソン含有」又は「ＳＥＣプレｍＲＮＡ」は、少なくとも１個のスキップ可能なエクソンを含有するプレｍＲＮＡ転写産物である。ＳＥＣプレｍＲＮＡの選択的又は異常なスプライシングは、成熟ｍＲＮＡ転写産物において少なくとも１個のスキップ可能なエクソンのスキッピングを生じることがある。用語「成熟ｍＲＮＡ」及び「完全にスプライシングされたｍＲＮＡ」は、完全にプロセシングされたｍＲＮＡを記載するために、本明細書において交換可能に使用される。少なくとも１個のスキップ可能なエクソンのスキッピングは、非生産的ｍＲＮＡを生じることがある。成熟ｍＲＮＡは、異常なタンパク質発現をもたらすこともある。
[0078]エクソンスキッピングの程度は、エクソンスキッピングの％、例えば、所定のエクソンがスキップされている転写産物の百分率として表すことができる。簡潔には、エクソンスキッピングの％は、エクソンスキッピングを有するＲＮＡ転写産物の量の平均とエクソン含有ＲＮＡ転写産物の量の平均との合計に対する、エクソンがスキップしたＲＮＡ転写産物の量の百分率として計算することができる。
[0079]一部の実施形態では、スキップされたエクソンは、ＲＮＡ転写産物からの少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、又は少なくとも約５０％の除去の決定に基づいて、スキップされたエクソンとして確認されるエクソンである。一部の実施形態では、スキップされたエクソンは、ＲＮＡ転写産物からの少なくとも約５％～約１００％、約５％～約９５％、約５％～約９０％、約５％～約８５％、約５％～約８０％、約５％～約７５％、約５％～約７０％、約５％～約６５％、約５％～約６０％、約５％～約５５％、約５％～約５０％、約５％～約４５％、約５％～約４０％、約５％～約３５％、約５％～約３０％、約５％～約２５％、約５％～約２０％、約５％～約１５％、約１０％～約１００％、約１０％～約９５％、約１０％～約９０％、約１０％～約８５％、約１０％～約８０％、約１０％～約７５％、約１０％～約７０％、約１０％～約６５％、約１０％～約６０％、約１０％～約５５％、約１０％～約５０％、約１０％～約４５％、約１０％～約４０％、約１０％～約３５％、約１０％～約３０％、約１０％～約２５％、約１０％～約２０％、約１５％～約１００％、約１５％～約９５％、約１５％～約９０％、約１５％～約８５％、約１５％～約８０％、約１５％～約７５％、約１５％～約７０％、約１５％～約６５％、約１５％～約６０％、約１５％～約５５％、約１５％～約５０％、約１５％～約４５％、約１５％～約４０％、約１５％～約３５％、約１５％～約３０％、約１５％～約２５％、約２０％～約１００％、約２０％～約９５％、約２０％～約９０％、約２０％～約８５％、約２０％～約８０％、約２０％～約７５％、約２０％～約７０％、約２０％～約６５％、約２０％～約６０％、約２０％～約５５％、約２０％～約５０％、約２０％～約４５％、約２０％～約４０％、約２０％～約３５％、約２０％～約３０％、約２５％～約１００％、約２５％～約９５％、約２５％～約９０％、約２５％～約８５％、約２５％～約８０％、約２５％～約７５％、約２５％～約７０％、約２５％～約６５％、約２５％～約６０％、約２５％～約５５％、約２５％～約５０％、約２５％～約４５％、約２５％～約４０％、又は約２５％～約３５％の除去の決定に基づいて、スキップされたエクソンとして確認されるエクソンである。ＥＮＣＯＤＥデータ（例えば、Tilgner, et al., 2012, “Deep sequencing of subcellular RNA fractions shows splicing to be predominantly co-transcriptional in the
human genome but inefficient for lncRNAs,” Genome Research 22(9): 1616-25を参
照）を使用して、エクソンスキッピングの確認を補助することができる。
[0080]一部の実施形態では、細胞を、ＬＩＰＡプレｍＲＮＡ転写産物の標的化部分と相補的なＡＳＯと接触させることにより、ＡＳＯの非存在下／処理の非存在下で細胞により産生されるタンパク質の量と比較して、産生されるＬＡＬタンパク質の量が少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、８０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、又は１０００％増加する。一部の実施形態では、アンチセンスオリゴマーと接触させた細胞により産生されるＬＡＬタンパク質の総量は、対照化合物により産生される標的タンパク質の量と比較して、約２０％～約３００％、約５０％～約３００％、約１００％～約３００％、約１５０％～約３００％、約２０％～約５０％、約２０％～約１００％、約２０％～約１５０％、約２０％～約２００％、約２０％～約２５０％、約５０％～約１００％、約５０％～約１５０％、約５０％～約２００％、約５０％～約２５０％、約１００％～約１５０％、約１００％～約２００％、約１００％～約２５０％、約１５０％～約２００％、約１５０％～約２５０％、約２００％～約２５０％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約５０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１５０％、少なくとも約２００％、少なくとも約２５０％、又は少なくとも約３００％増加する。一部の実施形態では、アンチセンスオリゴマーと接触させた細胞により産生されるＬＡＬタンパクの総量は、対照化合物により産生される標的タンパク質の量と比較して、約１．１～約１０倍、約１．５～約１０倍、約２～約１０倍、約３～約１０倍、約４～約１０倍、約１．１～約５倍、約１．１～約６倍、約１．１～約７倍、約１．１～約８倍、約１．１～約９倍、約２～約５倍、約２～約６倍、約２～約７倍、約２～約８倍、約２～約９倍、約３～約６倍、約３～約７倍、約３～約８倍、約３～約９倍、約４～約７倍、約４～約８倍、約４～約９倍、少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、又は少なくとも約１０倍増加する。対照化合物は、例えば、プレｍＲＮＡの標的化部分に相補的でないオリゴヌクレオチドであり得る。
[0081]一部の実施形態では、細胞を、ＬＩＰＡプレｍＲＮＡ転写産物の標的化部分と相補的なＡＳＯと接触させることにより、標的タンパク質をコードする成熟ｍＲＮＡを含めたＬＡＬをコードするｍＲＮＡの量が増加する。一部の実施形態では、ＬＡＬタンパク質をコードするｍＲＮＡ又はＬＡＬタンパク質をコードする成熟ｍＲＮＡの量は、ＡＳＯの非存在下／処理の非存在下で細胞により産生されるタンパク質の量と比較して、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、８０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、又は１０００％増加する。一部の実施形態では、アンチセンスオリゴマーと接触させた細胞内で産生されるＬＡＬタンパク質をコードするｍＲＮＡ又はＬＡＬタンパク質をコードする成熟ｍＲＮＡの総量は、未処理細胞において、例えば、未処理細胞又は対照化合物により処理される細胞において産生される成熟ＲＮＡの量と比較して、約２０％～約３００％、約５０％～約３００％、約１００％～約３００％、約１５０％～約３００％、約２０％～約５０％、約２０％～約１００％、約２０％～約１５０％、約２０％～約２００％、約２０％～約２５０％、約５０％～約１００％、約５０％～約１５０％、約５０％～約２００％、約５０％～約２５０％、約１００％～約１５０％、約１００％～約２００％、約１００％～約２５０％、約１５０％～約２００％、約１５０％～約２５０％、約２００％～約２５０％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約５０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１５０％、少なくとも約２００％、少なくとも約２５０％、又は少なくとも約３００％増加する。一部の実施形態では、アンチセンスオリゴマーと接触させた細胞内で産生されるＬＡＬタンパク質をコードするｍＲＮＡ又はＬＡＬタンパク質をコードする成熟ｍＲＮＡの総量は、未処理細胞において、例えば、未処理細胞又は対照化合物により処理される細胞において産生される成熟ＲＮＡの量と比較して、約１．１～約１０倍、約１．５～約１０倍、約２～約１
０倍、約３～約１０倍、約４～約１０倍、約１．１～約５倍、約１．１～約６倍、約１．１～約７倍、約１．１～約８倍、約１．１～約９倍、約２～約５倍、約２～約６倍、約２～約７倍、約２～約８倍、約２～約９倍、約３～約６倍、約３～約７倍、約３～約８倍、約３～約９倍、約４～約７倍、約４～約８倍、約４～約９倍、少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、又は少なくとも約１０倍増加する。対照化合物は、例えば、ＬＩＰＡ ＳＥＣプレｍＲＮＡの標的化部分に相補的でないオリゴヌクレオチドであり得る。
治療剤
[0082]本開示の様々な実施形態では、治療剤を含む組成物及び方法が、ＬＡＬのタンパク質の発現レベルを調節するために提供される。一部の実施形態では、ＬＩＰＡプレｍＲＮＡの選択的スプライシングを調節する組成物及び方法が本明細書に提供される。一部の実施形態では、ＬＩＰＡプレｍＲＮＡのスプライシングにおけるエクソンスキッピングを防止する、例えば、ＬＩＰＡプレｍＲＮＡのスプライシングの際にエクソンのスキッピングを防止する組成物及び方法が本明細書に提供される。
[0083]本明細書に開示の治療剤は、エクソンスキッピング抑制剤であり得る。一部の実施形態では、治療剤はポリ核酸ポリマーを含んでもよい。
[0084]本開示の１つの態様によると、機能性ＬＡＬタンパク質欠損に関連する病態を処置又は予防する方法が本明細書に提供され、この方法は、エクソンスキッピング抑制剤を対象に投与して、機能性ＬＡＬタンパク質のレベルを増加させることを含み、この薬剤は、プレｍＲＮＡ転写産物のある領域に結合して成熟転写産物におけるエクソンのスキッピングを減少させる。例えば、機能性ＬＡＬタンパク質欠損に関連する病態を処置又は予防する方法が本明細書に提供され、この方法は、エクソンスキッピング抑制剤を対象に投与して、機能性ＬＡＬタンパク質のレベルを増加させることを含み、この薬剤は、プレｍＲＮＡ転写産物のエクソン又はイントロンのある領域に（例えば、ヒトＬＩＰＡ遺伝子のエクソン８、イントロン７、又はイントロン８）に結合する。
[0085]成熟ｍＲＮＡにおけるエクソンスキッピングの低減に言及する場合、低減は、完全なもの、例えば１００％であっても、部分的なものであってもよい。低減は、臨床的に有意なものであり得る。低減／修正は、処置を受けていない対象におけるエクソンスキッピングのレベルと比べたもの、又は同様の対象の集団におけるエクソンスキッピングの量と比べたものであり得る。低減／修正は、平均的対象又は処置前の対象と比べて、少なくとも１０％少ないエクソンスキッピングであり得る。低減は、平均的対象又は処置前の対象と比べて、少なくとも２０％少ないエクソンスキッピングであり得る。低減は、平均的対象又は処置前の対象と比べて、少なくとも４０％少ないエクソンスキッピングであり得る。低減は、平均的対象又は処置前の対象と比べて、少なくとも５０％少ないエクソンスキッピングであり得る。低減は、平均的対象又は処置前の対象と比べて、少なくとも６０％少ないエクソンスキッピングであり得る。低減は、平均的対象又は処置前の対象と比べて、少なくとも８０％少ないエクソンスキッピングであり得る。低減は、平均的対象又は処置前の対象と比べて、少なくとも９０％少ないエクソンスキッピングであり得る。
[0086]機能性ＬＡＬタンパク質の増加に言及する場合、増加は臨床的に有意なものであり得る。増加は、処置を受けていない対象における機能性ＬＡＬタンパク質のレベルと比べたもの、又は同様の対象の集団における機能性ＬＡＬタンパク質の量と比べたものであり得る。増加は、平均的対象又は処置前の対象と比べて、少なくとも１０％多い機能性ＬＡＬタンパク質であり得る。増加は、平均的対象又は処置前の対象と比べて、少なくとも２０％多い機能性ＬＡＬタンパク質であり得る。増加は、平均的対象又は処置前の対象と比べて、少なくとも４０％多い機能性ＬＡＬタンパク質であり得る。増加は、平均的対象
又は処置前の対象と比べて、少なくとも５０％多い機能性ＬＡＬタンパク質であり得る。増加は、平均的対象又は処置前の対象と比べて、少なくとも８０％多い機能性ＬＡＬタンパク質であり得る。増加は、平均的対象又は処置前の対象と比べて、少なくとも１００％多い機能性ＬＡＬタンパク質であり得る。増加は、平均的対象又は処置前の対象と比べて、少なくとも２００％多い機能性ＬＡＬタンパク質であり得る。増加は、平均的対象又は処置前の対象と比べて、少なくとも５００％多い機能性ＬＡＬタンパク質であり得る。
[0087]エクソンスキッピング抑制剤がポリ核酸ポリマーを含む実施形態では、ポリ核酸ポリマーの長さは約５０ヌクレオチドであり得る。ポリ核酸ポリマーの長さは約４５ヌクレオチドであり得る。ポリ核酸ポリマーの長さは約４０ヌクレオチドであり得る。ポリ核酸ポリマーの長さは約３５ヌクレオチドであり得る。ポリ核酸ポリマーの長さは約３０ヌクレオチドであり得る。ポリ核酸ポリマーの長さは約２４ヌクレオチドであり得る。ポリ核酸ポリマーの長さは約２５ヌクレオチドであり得る。ポリ核酸ポリマーの長さは約２０ヌクレオチドであり得る。ポリ核酸ポリマーの長さは約１９ヌクレオチドであり得る。ポリ核酸ポリマーの長さは約１８ヌクレオチドであり得る。ポリ核酸ポリマーの長さは約１７ヌクレオチドであり得る。ポリ核酸ポリマーの長さは約１６ヌクレオチドであり得る。ポリ核酸ポリマーの長さは約１５ヌクレオチドであり得る。ポリ核酸ポリマーの長さは約１４ヌクレオチドであり得る。ポリ核酸ポリマーの長さは約１３ヌクレオチドであり得る。ポリ核酸ポリマーの長さは約１２ヌクレオチドであり得る。ポリ核酸ポリマーの長さは約１１ヌクレオチドであり得る。ポリ核酸ポリマーの長さは約１０ヌクレオチドであり得る。ポリ核酸ポリマーの長さは約１０～約５０ヌクレオチドであり得る。ポリ核酸ポリマーの長さは約１０～約４５ヌクレオチドであり得る。ポリ核酸ポリマーの長さは約１０～約４０ヌクレオチドであり得る。ポリ核酸ポリマーの長さは約１０～約３５ヌクレオチドであり得る。ポリ核酸ポリマーの長さは約１０～約３０ヌクレオチドであり得る。ポリ核酸ポリマーの長さは約１０～約２５ヌクレオチドであり得る。ポリ核酸ポリマーの長さは約１０～約２０ヌクレオチドであり得る。ポリ核酸ポリマーの長さは約１５～約２５ヌクレオチドであり得る。ポリ核酸ポリマーの長さは約１５～約３０ヌクレオチドであり得る。ポリ核酸ポリマーの長さは約１２～約３０ヌクレオチドであり得る。
[0088]ポリ核酸ポリマーの配列は、ｍＲＮＡ転写産物、例えば、部分的にプロセシングされたｍＲＮＡ転写産物の標的配列に少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は９９．５％の相補性があり得る。ポリ核酸ポリマーの配列は、プレｍＲＮＡ転写産物の標的配列に１００％の相補性があり得る。
[0089]ポリ核酸ポリマーの配列は、プレｍＲＮＡ転写産物の標的配列に対して４個以下のミスマッチを有することができる。ポリ核酸ポリマーの配列は、プレｍＲＮＡ転写産物の標的配列に対して３個以下のミスマッチを有することができる。ポリ核酸ポリマーの配列は、プレｍＲＮＡ転写産物の標的配列に対して２個以下のミスマッチを有することができる。ポリ核酸ポリマーの配列は、プレｍＲＮＡ転写産物の標的配列に対して１個以下のミスマッチを有することができる。ポリ核酸ポリマーの配列は、プレｍＲＮＡ転写産物の標的配列に対してミスマッチを有さないことがある。
[0090]一部の実施形態では、ポリ核酸ポリマーは、プレｍＲＮＡ転写産物の標的配列に特異的にハイブリダイズすることができる。例えば、ポリ核酸ポリマーは、プレｍＲＮＡ転写産物の標的配列に９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、又は１００％の配列相補性を有することができる。ハイブリダイゼーションは、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下であり得る。
[0091]ポリ核酸ポリマーは、配列番号５～６３から成る群より選択される配列に、少な
くとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は９９．５％の配列同一性を有することができる。ポリ核酸ポリマーは、配列番号５～６３から成る群より選択される配列に１００％配列同一性の配列を有することができる。
[0092]ポリ核酸ポリマー配列に言及する場合、当業者は、標的配列にハイブリダイズする能力、又は置換が標的配列内にある場合は標的配列として認識される能力を維持するような、１個以上の置換が配列において許容され得ること、場合により２個の置換が許容され得ることを理解する。配列同一性への参照は、標準／デフォルトパラメーターを使用するＢＬＡＳＴ配列アラインメントにより決定することができる。例えば、配列は９９％の同一性を有し、依然として本開示による機能を有することができる。他の実施形態では、配列は９８％の同一性を有し、依然として本開示による機能を有することができる。別の実施形態では、配列は９５％の同一性を有し、依然として本開示による機能を有することができる。別の実施形態では、配列は９０％の同一性を有し、依然として本開示による機能を有することができる。
アンチセンスオリゴマー
[0093]ＬＩＰＡ ＳＥＣプレｍＲＮＡの標的化部分に結合することによりエクソンスキッピングを防止するアンチセンスオリゴマーを含む組成物が本明細書に提供される。本明細書に使用される場合、用語「ＡＳＯ」及び「アンチセンスオリゴマー」は、交換可能に使用され、ワトソンクリック塩基対形成又はゆらぎ塩基対形成（Ｇ－Ｕ）により、標的核酸（例えば、ＬＩＰＡ ＳＥＣプレｍＲＮＡ）配列にハイブリダイズする核酸塩基を含むポリヌクレオチドなどのオリゴマーを表す。ＡＳＯは、標的配列に対して正確な配列相補性又は近相補性（例えば、標的配列に結合して、スプライス部位でのスプライシングを増強するのに十分な相補性）を有することができる。ＡＳＯは、標的核酸（例えば、プレｍＲＮＡ転写産物の標的化部分）に結合（ハイブリダイズ）し、生理学的条件下でハイブリダイズしたままであるように設計される。典型的には、目的の（標的化）核酸配列以外の部位にハイブリダイズする場合は、標的核酸ではない限定された数の配列（標的核酸以外の数個の部位）にハイブリダイズする。ＡＳＯの設計は、ＡＳＯが他の部位に結合し、「的外れの」効果を引き起こす可能性が制限されるように、プレｍＲＮＡ転写産物の標的化部分の核酸配列、又はゲノム若しくは細胞内プレｍＲＮＡ若しくはトランスクリプトームの他の位置にある十分に類似した核酸配列の発生を考慮に入れることができる。当該技術分野において、例えば、本明細書に援用される、ＷＯ２０１５／０３５０９１として公開されたＰＣＴ出願であるＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０５４１５１、表題“Ｒｅｄｕｃｉｎｇ
Ｎｏｎｓｅｎｓｅ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ ｍＲＮＡ Ｄｅｃａｙ，”において公知の任意のアンチセンスオリゴマーを使用して、本明細書に記載の方法を実施することができる。
[0094]一部の実施形態では、ＡＳＯは、標的核酸又はＲＩＣプレｍＲＮＡの標的化部分に「特異的にハイブリダイズする」か又は「特異的」である。典型的には、そのようなハイブリダイゼーションは、３７℃より実質的に高いＴｍ、好ましくは少なくとも５０℃、典型的には６０℃～およそ９０℃で生ずる。そのようなハイブリダイゼーションは、好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件に相当する。Ｔｍは、所定のイオン強度及びｐＨにおいて、５０％の標的配列が相補的オリゴヌクレオチドとハイブリダイズする温度である。
[0095]オリゴヌクレオチドなどのオリゴマーは、２個の１本鎖ポリヌクレオチド間の逆平行立体配置においてハイブリダイゼーションが生ずるときは互いに「相補的」である。２本鎖ポリヌクレオチドは、第１のポリヌクレオチドの一方の鎖と第２のポリヌクレオチドの一方の鎖との間にハイブリダイゼーションが起こり得る場合に、別のポリヌクレオチドと「相補的」であり得る。相補性（１個のポリヌクレオチドが別のポリヌクレオチドと
相補的である程度）は、一般に受け入れられている塩基対形成規則に従って互いに水素結合を形成すると予測される、互いに異なる向きの鎖にある塩基の割合（例えば百分率）に関して定量化可能である。アンチセンスオリゴマー（ＡＳＯ）の配列がハイブリダイズするには、標的核酸の配列と１００％相補性である必要はない。ある特定の実施形態では、ＡＳＯは、標的にする標的核酸配列内の標的領域に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列相補性を含むことができる。例えば、オリゴマー化合物の２０個の核酸塩基のうち１８個が標的領域と相補性があり、したがって特異的にハイブリダイズするＡＳＯは、９０％の相補性を表す。この例では、残りの非相補的核酸塩基は一緒にクラスターになっていても相補的核酸塩基に散在していてもよく、互いに連続している必要も相補的核酸塩基に近接している必要もない。ＡＳＯと標的核酸の領域との相補性％は、ＢＬＡＳＴプログラム（basic local alignment search tools）及び当該技術分野に公知のＰｏｗｅｒＢＬＡＳＴプログラム（Altschul, et al., J. Mol. Biol., 1990, 215, 403-410; Zhang and Madden, Genome Res., 1997, 7, 649-656）を使用して日常的に決定することができる。
[0096]ＡＳＯは、標的配列において全ての核酸塩基とハイブリダイズする必要はなく、ハイブリダイズする核酸塩基は連続していてもしていなくてもよい。ＡＳＯは、介在又は隣接セグメントがハイブリダイゼーション事象に関与しないように、プレｍＲＮＡ転写産物の１以上のセグメントにハイブリダイズすることができる（例えば、ループ構造又はヘアピン構造が形成され得る）。ある特定の実施形態では、ＡＳＯは、標的プレｍＲＮＡ転写産物の非連続核酸塩基とハイブリダイズする。例えば、ＡＳＯは、ＡＳＯがハイブリダイズしない１個以上の核酸塩基によって隔てられた、プレｍＲＮＡ転写産物中の核酸塩基にハイブリダイズすることができる。
[0097]本明細書に記載のＡＳＯは、ＳＥＣプレｍＲＮＡの標的部分に存在する核酸塩基に相補的である核酸塩基を含む。ＡＳＯという用語は、標的ｍＲＮＡ上の相補的な核酸塩基とハイブリダイズ可能な核酸塩基を含むが、ペプチド核酸（ＰＮＡ）のような糖部分を含まない、オリゴヌクレオチド及び任意の他のオリゴマー分子を包含する。ＡＳＯは、天然に生じるヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、修飾ヌクレオチド、又はそれらの２つか３つの任意の組合せを含むことができる。用語「天然に生じるヌクレオチド」には、デオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドが含まれる。用語「修飾ヌクレオチド」には、修飾若しくは置換糖基を有し、及び／又は修飾骨格を有するヌクレオチドが含まれる。一部の実施形態では、ＡＳＯの全てのヌクレオチドは修飾ヌクレオチドである。本明細書に記載の方法及び組成物に適合するＡＳＯ又はＡＳＯの構成成分の化学修飾は、当業者に明白であり、例えば、本明細書にその全体が援用される、米国特許第８，２５８，１０９Ｂ２号、米国特許第５，６５６，６１２号、米国特許出願公開第２０１２／０１９０７２８号、及びDias and Stein, Mol. Cancer Ther. 2002 ,347-355に見出すことができる。
[0098]ＡＳＯの１個以上の核酸塩基は、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、及びウラシルなどの任意の天然に生じる非修飾核酸塩基、又は標的プレｍＲＮＡに存在する核酸塩基と水素結合可能であるような、非修飾核酸塩基と十分に類似している任意の合成若しくは修飾核酸塩基であり得る。修飾核酸塩基の例としては、限定されるものではないが、ヒポキサンチン、キサンチン、７－メチルグアニン、５、６－ジヒドロウラシル、５－メチルシトシン、及び５－ヒドロキシメトイルシトシンが挙げられる。
[0099]本明細書に記載のＡＳＯは、オリゴマーの構成成分を接続する骨格構造も含む。用語「骨格構造」及び「オリゴマー連結」は交換可能に使用することができ、ＡＳＯのモノマー間の接続を表す。天然に生じるオリゴヌクレオチドでは、骨格は、オリゴマーの糖部分を接続する３’－５’ホスホジエステル連結を含む。本明細書に記載のＡＳＯの骨格
構造又はオリゴマー連結には（限定されるものではないが）、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート（phosphoroanilothioate）、ホスホラニラデート（phosphoraniladate）、ホスホロアミデートなどが含まれ得る。例えば、LaPlanche, et al., Nucleic Acids Res. 14: 9081 (1986)；Stec, et al., J. Am. Chem. Soc. 106: 6077 (1984)；Stein, et al., Nucleic Acids Res. 16: 3209 (1988)；Zon, et al., Anti Cancer Drug Design 6: 539 (1991)；Zon, et al. ,Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, pp. 87-108 (F. Eckstein, Ed., Oxford University Press, Oxford England (1991))；Stec, et al.、米国特許第５，１５１，５１０号；Uhlmann and Peyman, Chemical Reviews 90:
543 (1990)を参照。一部の実施形態では、ＡＳＯの骨格構造は、リンを含有せず、むし
ろ、例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）におけるペプチド結合、又はカルバメート、アミド、並びに直鎖及び環状の炭化水素基を含めた連結基を含有する。一部の実施形態では、骨格修飾はホスホチオエート連結である。一部の実施形態では、骨格修飾はホスホロアミデート連結である。
[0100]一部の実施形態では、ＡＳＯ骨格のリンのヌクレオチド間連結のそれぞれの立体化学はランダムである。一部の実施形態では、ＡＳＯ骨格のリンのヌクレオチド間連結のそれぞれの立体化学は、制御されており、ランダムではない。例えば、本明細書に援用される、米国特許出願公開第２０１４／０１９４６１０号、“Methods for the Synthesis of Functionalized Nucleic Acids”は、核酸オリゴマーにおける各リン原子のキラリテ
ィーの掌性を独立して選択する方法を記載する。一部の実施形態では、限定されるものではないが、表３に記載のＡＳＯのいずれかを含めた本発明の方法に使用されるＡＳＯは、ランダムではないリンのヌクレオチド間連結を有するＡＯＳを含む。一部の実施形態では、本発明の方法に使用される組成物は、純粋なジアステレオマーＡＳＯを含む。一部の実施形態では、本発明の方法に使用される組成物は、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、約１００％、約９０％～約１００％、約９１％～約１００％、約９２％～約１００％、約９３％～約１００％、約９４％～約１００％、約９５％～約１００％、約９６％～約１００％、約９７％～約１００％、約９８％～約１００％、又は約９９％～約１００％のジアステレオマー純度を有するＡＳＯを含む。
[0101]一部の実施形態では、ＡＳＯは、リンのヌクレオチド間連結において、Ｒｐ及びＳｐ立体配置の非ランダム混合物を有する。例えば、良好な活性とヌクレアーゼ安定性とのバランスを達成するには、アンチセンスオリゴマーにＲｐとＳｐのミックスが必要であることが示唆されている（Wan, et al., 2014, “Synthesis, biophysical properties and biological activity of second generation antisense oligonucleotides containing chiral phosphorothioate linkages, ”Nucleic Acids Research 42 (22): 13456-13468、本明細書に援用される）。一部の実施形態では、限定されるものではないが、表３に
記載のＡＳＯのいずれかを含めた本発明の方法に使用されるＡＳＯは、約５～１００％のＲｐ、少なくとも約５％のＲｐ、少なくとも約１０％のＲｐ、少なくとも約１５％のＲｐ、少なくとも約２０％のＲｐ、少なくとも約２５％のＲｐ、少なくとも約３０％のＲｐ、少なくとも約３５％のＲｐ、少なくとも約４０％のＲｐ、少なくとも約４５％のＲｐ、少なくとも約５０％のＲｐ、少なくとも約５５％のＲｐ、少なくとも約６０％のＲｐ、少なくとも約６５％のＲｐ、少なくとも約７０％のＲｐ、少なくとも約７５％のＲｐ、少なくとも約８０％のＲｐ、少なくとも約８５％のＲｐ、少なくとも約９０％のＲｐ、又は少なくとも約９５％のＲｐを含み、残りはＳｐであるか、あるいは約１００％のＲｐを含む。一部の実施形態では、限定されるものではないが、表３に記載のＡＳＯのいずれかを含めた本発明の方法に使用されるＡＳＯは、約１０％～約１００％のＲｐ、約１５％～約１００％のＲｐ、約２０％～約１００％のＲｐ、約２５％～約１００％のＲｐ、約３０％～約
１００％のＲｐ、約３５％～約１００％のＲｐ、約４０％～約１００％のＲｐ、約４５％～約１００％のＲｐ、約５０％～約１００％のＲｐ、約５５％～約１００％のＲｐ、約６０％～約１００％のＲｐ、約６５％～約１００％のＲｐ、約７０％～約１００％のＲｐ、約７５％～約１００％のＲｐ、約８０％～約１００％のＲｐ、約８５％～約１００％のＲｐ、約９０％～約１００％のＲｐ、約９５％～約１００％のＲｐ、約２０％～約８０％のＲｐ、約２５％～約７５％のＲｐ、約３０％～約７０％のＲｐ、約４０％～約６０％のＲｐ、又は約４５％～約５５％のＲｐを含み、残りはＳｐである。
[0102]ある実施形態では、限定されるものではないが、表３に記載のＡＳＯのいずれかを含めた本発明の方法に使用されるＡＳＯは、約５～１００％のＳｐ、少なくとも約５％のＳｐ、少なくとも約１０％のＳｐ、少なくとも約１５％のＳｐ、少なくとも約２０％のＳｐ、少なくとも約２５％のＳｐ、少なくとも約３０％のＳｐ、少なくとも約３５％のＳｐ、少なくとも約４０％のＳｐ、少なくとも約４５％のＳｐ、少なくとも約５０％のＳｐ、少なくとも約５５％のＳｐ、少なくとも約６０％のＳｐ、少なくとも約６５％のＳｐ、少なくとも約７０％のＳｐ、少なくとも約７５％のＳｐ、少なくとも約８０％のＳｐ、少なくとも約８５％のＳｐ、少なくとも約９０％のＳｐ、又は少なくとも約９５％のＳｐを含み、残りはＲｐであるか、あるいは約１００％のＳｐを含む。一部の実施形態では、限定されるものではないが、表３に記載されているＡＳＯのいずれかを含めた本発明の方法に使用されるＡＳＯは、約１０％～約１００％のＳｐ、約１５％～約１００％のＳｐ、約２０％～約１００％のＳｐ、約２５％～約１００％のＳｐ、約３０％～約１００％のＳｐ、約３５％～約１００％のＳｐ、約４０％～約１００％のＳｐ、約４５％～約１００％のＳｐ、約５０％～約１００％のＳｐ、約５５％～約１００％のＳｐ、約６０％～約１００％のＳｐ、約６５％～約１００％のＳｐ、約７０％～約１００％のＳｐ、約７５％～約１００％のＳｐ、約８０％～約１００％のＳｐ、約８５％～約１００％のＳｐ、約９０％～約１００％のＳｐ、約９５％～約１００％のＳｐ、約２０％～約８０％のＳｐ、約２５％～約７５％のＳｐ、約３０％～約７０％のＳｐ、約４０％～約６０％のＳｐ、又は約４５％～約５５％のＳｐを含み、残りはＲｐである。
[0103]本明細書に記載されているいずれかのＡＳＯは、天然に生じるヌクレオチドに存在するようなリボース若しくはデオキシリボースを含む糖部分、又はモルホリン環を含めた修飾糖部分若しくは糖類似体を含有することができる。修飾糖部分の非限定例としては、２’－Ｏ－メチル（２’－Ｏ－Ｍｅ）、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’ＭＯＥ）、２’－Ｏ－アミノエチル、２’Ｆ、Ｎ３’→Ｐ５’ホスホロアミデート、２’ジメチルアミノオキシエトキシ、２’ジメチルアミノエトキシエトキシ、２’－グアニジニジウム、２’－Ｏ－グアニジニウムエチル、カルバメート修飾糖、及び２環式修飾糖などの２’置換体が挙げられる。一部の実施形態では、糖部分の修飾は、２’－Ｏ－Ｍｅ、２’Ｆ、及び２’ＭＯＥから選択される。一部の実施形態では、糖部分の修飾は、ロックド核酸（ＬＮＡ）におけるような余分な架橋結合である。一部の実施形態では、糖類似体は、ホスホロジアミデートモルホリノ（ＰＭＯ）のようなモルホリン環を含有する。一部の実施形態では、糖部分は、リボフラノシル（ribofuransyl）又は２’デオキシリボフラノシル（deoxyribofuransyl）修飾を含む。一部の実施形態では、糖部分は、２’４’拘束（constrained）２’Ｏ－メチルオキシエチル（ｃＭＯＥ）修飾を含む。一部の実施形態では、糖部分は、ｃＥｔ ２’、４’拘束２’－Ｏ－エチルＢＮＡ修飾を含む。一部の実施形態では、糖部分は、トリシクロＤＮＡ（ｔｃＤＮＡ）修飾を含む。一部の実施形態では、糖部分は、エチレン核酸（ＥＮＡ）修飾を含む。一部の実施形態では、糖部分は、ＭＣＥ修飾を含む。修飾は、当該技術分野において公知であり、文献、例えばこの目的で本明細書に援用されるJarver, et al., 2014, “A Chemical View of Oligonucleotides for Exon Skipping and Related Drug Applications, ”Nucleic Acid Therapeutics 24 (1): 37-47に記載されている。
[0104]一部の実施形態では、ＡＳＯの各モノマーは同じように修飾され、例えばＡＳＯの骨格の各連結はホスホロチオエート連結を含み、又は各リボース糖部分は２’Ｏ－メチル修飾を含む。ＡＳＯのモノマー構成成分のそれぞれに存在するそのような修飾は、「均一修飾」と称される。一部の実施形態では、異なる修飾の組合せが望ましいこともあり、例えば、ＡＳＯは、ホスホロジアミデート連結と、モルホリン環（モルホリノ）を含む糖部分との組合せを含んでもよい。ＡＳＯにおける異なる修飾の組合せは、「混合型修飾」又は「混合型化学」と称される。
[0105]一部の実施形態では、ＡＳＯは１個以上の骨格修飾を含む。一部の実施形態では、ＡＳＯは１個以上の糖部分修飾を含む。一部の実施形態では、ＡＳＯは、１個以上の骨格修飾及び１個以上の糖部分修飾を含む。一部の実施形態では、ＡＳＯは、２’ＭＯＥ修飾及びホスホロチオエート骨格を含む。一部の実施形態では、ＡＳＯはホスホロジアミデートモルホリノ（ＰＭＯ）を含む。一部の実施形態では、ＡＳＯはペプチド核酸（ＰＮＡ）を含む。本明細書に記載のＡＳＯのいずれか、又はＡＳＯの任意の構成成分（例えば、核酸塩基、糖部分、骨格）は、ＡＳＯの所望の特性若しくは活性を達成するため、又はＡＳＯの望ましくない特性若しくは活性を低減するために修飾され得る。一部の実施形態では、ＡＳＯ又は任意のＡＳＯの１以上の構成成分は、プレｍＲＮＡ転写産物上の標的配列への結合親和性を増強するため；任意の非標的配列への結合を低減させるため；細胞内ヌクレアーゼ（すなわちＲＮアーゼＨ）による分解を低減させるため；細胞及び／又は細胞核へのＡＳＯの取り組みを改善するため：ＡＳＯの薬物動態又は薬力学を変更するため、及びＡＳＯの半減期を調節するために修飾され得る。
[0106]一部の実施形態では、ＡＳＯは、２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）（ＭＯＥ）ホスホロチオエート修飾ヌクレオチドで構成される。そのようなヌクレオチドで構成されるＡＳＯは、本明細書に記載の方法にとりわけ好適であり、そのような修飾を有するオリゴマーは、ヌクレアーゼ分解に対する抵抗性が有意に増強され、バイオアベイラビリティが増加することが示されており、例えば、本明細書に記載の一部の実施形態では、経口送達に適したものになる。例えば、Geary, et al., J Pharmacol Exp Ther. 2001; 296 (3): 890-7；Geary, et al., J Pharmacol Exp Ther. 2001; 296 (3): 898-904を参照。
[0107]ＡＳＯを合成する方法は当業者に公知である。代替的に又は追加として、ＡＳＯは商業的供給源から得ることができる。
[0108]他に特定されない限り、１本鎖核酸（例えば、プレｍＲＮＡ転写産物、オリゴヌクレオチド、ＡＳＯなど）配列の左側末端は５’末端であり、１本鎖又は２本鎖核酸配列の左側方向は、５’方向と称される。同様に、核酸配列（１本鎖又は２本鎖）の右側末端又は右側方向は、３’末端又は３’方向である。一般に、核酸の基点に対して５’の領域又は配列は「上流」と称され、核酸の基点に対して３’の領域又は配列は「下流」と称さばれる。一般に、ｍＲＮＡの５’方向又は５’末端は開始コドンが位置し、３’末端又は３’方向は終止コドンが位置する。一部の実施形態では、核酸の基点の上流にあるヌクレオチドには負数が指定され、一方、基点の下流にあるヌクレオチドには正数が指定される。例えば、基点（例えば、ｍＲＮＡにおけるエクソン－エクソンジャンクション）には「ゼロ」部位が指定され、基点に直接隣接して上流にあるヌクレオチドには「マイナス１」、例えば「－１」が指定され、一方、基点に直接隣接して下流にあるヌクレオチドには、「プラス１」、例えば「＋１」が指定される。
[0109]一部の実施形態では、ＡＳＯは、ＬＩＰＡ ＳＥＣプレｍＲＮＡのスキップ可能なエクソンの５’スプライス部位の下流（３’方向）（例えば、５’スプライス部位に対して正数が指定される方向）にあるＬＩＰＡ ＳＥＣプレｍＲＮＡの標的化部分に相補的である（そして結合する）。一部の実施形態では、ＡＳＯは、スキップ可能なエクソンの５’スプライス部位に対して約＋６～約＋５００の領域内にあるＬＩＰＡ ＳＥＣプレｍ
ＲＮＡの標的化部分に相補的である。一部の実施形態では、ＡＳＯは、５’スプライス部位に対して＋１～＋５のヌクレオチド（５’スプライス部位の下流に位置する最初の５ヌクレオチド）に相補的ではない。一部の実施形態では、ＡＳＯは、スキップ可能なエクソンの５’スプライス部位に対して＋６～＋１００の領域内にあるＬＩＰＡ ＳＥＣプレｍＲＮＡの標的化部分に相補的であり得る。一部の実施形態では、ＡＳＯは、スキップ可能なエクソンの５’スプライス部位に対して、約＋６～約＋５００、約＋６～約＋４９０、約＋６～約＋４８０、約＋６～約＋４７０、約＋６～約＋４６０、約＋６～約＋４５０、約＋６～約＋４４０、約＋６～約＋４３０、約＋６～約＋４２０、約＋６～約＋４１０、約＋６～約＋４００、約＋６～約＋３９０、約＋６～約＋３８０、約＋６～約＋３７０、約＋６～約＋３６０、約＋６～約＋３５０、約＋６～約＋３４０、約＋６～約＋３３０、約＋６～約＋３２０、約＋６～約＋３１０、約＋６～約＋３００、約＋６～約＋２９０、約＋６～約＋２８０、約＋６～約＋２７０、約＋６～約＋２６０、約＋６～約＋２５０、約＋６～約＋２４０、約＋６～約＋２３０、約＋６～約＋２２０、約＋６～約＋２１０、約＋６～約＋２００、約＋６～約＋１９０、約＋６～約＋１８０、約＋６～約＋１７０、約＋６～約＋１６０、約＋６～約＋１５０、約＋６～約＋１４０、約＋６～約＋１３０、約＋６～約＋１２０、約＋６～約＋１１０、約＋６～約＋１００、約＋６～約＋９０、約＋６～約＋８０、約＋６～約＋７０、約＋６～約＋６０、約＋６～約＋５０、約＋６～約＋４０、約＋６～約＋３０、又は約＋６～約＋２０の領域内にある標的化部分に相補的である。
[0110]一部の実施形態では、ＡＳＯは、ＬＩＰＡ ＳＥＣプレｍＲＮＡのスキップ可能なエクソンの３’スプライス部位の上流（５’方向）（例えば、３’スプライス部位に対して負数が指定される方向）にあるＬＩＰＡ ＳＥＣプレｍＲＮＡの標的化部分に相補的である（そして結合する）。一部の実施形態では、ＡＳＯは、スキップ可能なエクソンの３’スプライス部位に対して約－１６～約－５００の領域内にあるＬＩＰＡ ＳＥＣプレｍＲＮＡの標的化部分に相補的である。一部の実施形態では、ＡＳＯは、５’スプライス部位に対して－１～－１５のヌクレオチド（５’スプライス部位の下流に位置する最初の５ヌクレオチド）に相補的ではない。一部の実施形態では、ＡＳＯは、スキップ可能なエクソンの３’スプライス部位に対して約－１６～－１００のヌクレオチドの領域内にあるＬＩＰＡ ＳＥＣプレｍＲＮＡの標的化部分に相補的であり得る。一部の実施形態では、ＡＳＯは、スキップ可能なエクソンの３’スプライス部位に対して、約＋６～約＋５００、約＋６～約＋４９０、約＋６～約＋４８０、約＋６～約＋４７０、約＋６～約＋４６０、約＋６～約＋４５０、約＋６～約＋４４０、約＋６～約＋４３０、約＋６～約＋４２０、約＋６～約＋４１０、約＋６～約＋４００、約＋６～約＋３９０、約＋６～約＋３８０、約＋６～約＋３７０、約＋６～約＋３６０、約＋６～約＋３５０、約＋６～約＋３４０、約＋６～約＋３３０、約＋６～約＋３２０、約＋６～約＋３１０、約＋６～約＋３００、約＋６～約＋２９０、約＋６～約＋２８０、約＋６～約＋２７０、約＋６～約＋２６０、約＋６～約＋２５０、約＋６～約＋２４０、約＋６～約＋２３０、約＋６～約＋２２０、約＋６～約＋２１０、約＋６～約＋２００、約＋６～約＋１９０、約＋６～約＋１８０、約＋６～約＋１７０、約＋６～約＋１６０、約＋６～約＋１５０、約＋６～約＋１４０、約＋６～約＋１３０、約＋６～約＋１２０、約＋６～約＋１１０、約＋６～約＋１００、約＋６～約＋９０、約＋６～約＋８０、約＋６～約＋７０、約＋６～約＋６０、約＋６～約＋５０、約＋６～約＋４０、約＋６～約＋３０、又は約＋６～約＋２０の領域内にある標的化部分に相補的である。
[0111]一部の実施形態では、ＬＩＰＡ ＳＥＣプレｍＲＮＡの標的化部分は、スキップ可能なエクソンの３’スプライス部位（５’末端）に対して－４ｅからスキップ可能なエクソンの５’スプライス部位（３’末端）に対して＋２ｅまでの領域内にある。
[0112]ＡＳＯは、特異的結合及びスプライシングの有効な増強に適した任意の長さのも
のであり得る。一部の実施形態では、ＡＳＯは、８～５０個の核酸塩基から成る。例えば、ＡＳＯの長さは、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、４０、４５、又は５０核酸塩基であり得る。一部の実施形態では、ＡＳＯは、５０核酸塩基を超える核酸塩基から成る。一部の実施形態では、ＡＳＯの長さは、８～５０核酸塩基、８～４０核酸塩基、８～３５核酸塩基、８～３０核酸塩基、８～２５核酸塩基、８～２０核酸塩基、８～１５核酸塩基、９～５０核酸塩基、９～４０核酸塩基、９～３５核酸塩基、９～３０核酸塩基、９～２５核酸塩基、９～２０核酸塩基、９～１５核酸塩基、１０～５０核酸塩基、１０～４０核酸塩基、１０～３５核酸塩基、１０～３０核酸塩基、１０～２５核酸塩基、１０～２０核酸塩基、１０～１５核酸塩基、１１～５０核酸塩基、１１～４０核酸塩基、１１～３５核酸塩基、１１～３０核酸塩基、１１～２５核酸塩基、１１～２０核酸塩基、１１～１５核酸塩基、１２～５０核酸塩基、１２～４０核酸塩基、１２～３５核酸塩基、１２～３０核酸塩基、１２～２５核酸塩基、１２～２０核酸塩基、１２～１５核酸塩基、１３～５０核酸塩基、１３～４０核酸塩基、１３～３５核酸塩基、１３～３０核酸塩基、１３～２５核酸塩基、１３～２０核酸塩基、１４～５０核酸塩基、１４～４０核酸塩基、１４～３５核酸塩基、１４～３０核酸塩基、１４～２５核酸塩基、１４～２０核酸塩基、１５～５０核酸塩基、１５～４０核酸塩基、１５～３５核酸塩基、１５～３０核酸塩基、１５～２５核酸塩基、１５～２０核酸塩基、２０～５０核酸塩基、２０～４０核酸塩基、２０～３５核酸塩基、２０～３０核酸塩基、２０～２５核酸塩基、２５～５０核酸塩基、２５～４０核酸塩基、２５～３５核酸塩基、又は２５～３０核酸塩基である。一部の実施形態では、ＡＳＯの長さは１５ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ＡＳＯの長さは１６ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ＡＳＯの長さは１７ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ＡＳＯの長さは１８ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ＡＳＯの長さは２５ヌクレオチドである。
[0113]一部の実施形態では、異なる化学を有するが、ＳＥＣプレｍＲＮＡの同じ標的化部分に相補的である２以上のＡＳＯが使用される。一部の実施形態では、ＳＥＣプレｍＲＮＡの異なる標的化部分に相補的である２以上のＡＳＯが使用される。
[0114]一部の実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、１以上の部分又はコンジュゲート、例えば、オリゴヌクレオチドの活性又は細胞内への取り込みを増強させる標的化部分又は他のコンジュゲートに化学的に連結する。そのような部分には、脂質部分、例えば、コレステロール部分、コレステリル部分、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオール基若しくはウンデシル残基、ポリアミン若しくはポリエチレングリコール鎖、又はアダマンタン酢酸が含まれるが、これらに限定されない。親油性部分を含むオリゴヌクレオチド及び調製方法は、公開された文献に記載されている。ある実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、脱塩基ヌクレオチド、ポリエーテル、ポリアミン、ポリアミド、ペプチド、炭水化物、例えば、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、Ｎ－Ａｃ－グルコサミン（ＧｌｕＮＡｃ）、若しくはマンノース（例えば、マンノース－６－ホスフェート）、脂質、又はポリ炭化水素化合物が含まれるが、これらに限定されない部分にコンジュゲートする。コンジュゲートは、当該技術分野において理解されており、文献に記載されているように、例えば、リンカーを使用して、糖、塩基、又はリン酸基上のいくつかの位置にアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む１以上の任意のヌクレオチドに連結することができる。リンカーには、２価又は３価分の岐リンカーが含まれ得る。ある実施形態では、コンジュゲートは、アンチセンスオリゴヌクレオチドの３’末端に結合する。オリゴヌクレオチドコンジュゲートの調製方法は、例えば、本明細書に援用される米国特許第８，４５０，４６７号、“Carbohydrate conjugates as delivery agents for oligonucleotides，”に記載されている。
[0115]一部の実施形態では、ＡＳＯに標的にされる核酸は、真核細胞などの細胞内で発
現されたＬＩＰＡ ＳＥＣプレｍＲＮＡである。一部の実施形態では、用語「細胞」は、細胞の集団を表すことがある。一部の実施形態では、細胞は対象内にある。一部の実施形態では、細胞は対象から単離される。一部の実施形態では、細胞はｅｘ ｖｉｖｏにある。一部の実施形態では、細胞は、病態又は疾患に関連する細胞又は細胞株である。一部の実施形態では、細胞はｉｎ ｖｉｔｒｏ（例えば細胞培養物中）にある。
医薬組成物
[0116]記載の組成物の薬剤、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチドを含み、記載の方法のいずれかに使用するための医薬組成物又は製剤は、医薬品産業に周知であり、公開された文献に記載されている慣用技術に従って調製することができる。ある実施形態では、対象を処置するための医薬組成物又は製剤は、本明細書に記載の任意のアンチセンスオリゴマー、又はその薬学的に許容される塩、溶媒和物、水和物、若しくはエステルの有効量を含む。アンチセンスオリゴマーを含む医薬製剤は、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、又は担体を更に含むことができる。
[0117]薬学的に許容される塩は、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応などを有することなくヒト及び下等動物の組織との接触に使用するのに適しており、妥当な利益／危険率に見合うものである。（例えば、この目的で本明細書に援用される、S .M. Berge, et al.,
J. Pharmaceutical Sciences, 66: 1-19 (1977)を参照）。塩は、化合物の最終単離及び精製の際にｉｎ ｓｉｔｕで調製することも、遊離塩基と適切な有機酸との反応によって別個に調製することもできる。薬学的に許容される非毒性の酸付加塩の例は、塩酸、臭化水素酸、リン酸、硫酸、及び過塩素酸などの無機酸と、又は酢酸、シュウ酸、マレイン酸、酒石酸、クエン酸、コハク酸、又はマロン酸などの有機酸と形成されるか、あるいはイオン交換などの文書化された他の方法を使用することにより形成されるアミノ基の塩である。他の薬学的に許容される塩には、アジピン酸塩、アルギニン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、ショウノウ酸塩、ショウノウスルホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、グルコヘプトン酸塩、グリセロリン酸塩、グルコン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、ヨウ化水素酸塩、２－ヒドロキシ－エタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２－ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３－フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、吉草酸塩などが含まれる。代表的なアルカリ金属又はアルカリ土類金属の塩には、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなどが含まれる。更なる薬学的に許容される塩には、適切な場合、非毒性のアンモニウム、第４級アンモニウム、並びにハロゲン化物、水酸化物、カルボン酸塩、硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、低級アルキルスルホン酸塩、及びアリールスルホン酸塩など対イオンを使用して形成されたアミンカチオンが含まれる。
[0118]一部の実施形態では、組成物は、限定されるものではないが錠剤、カプセル剤、ゲルカプセル剤、液体シロップ剤、ソフトゲル剤、坐剤、及び浣腸剤などの多くの可能な剤形に処方される。一部の実施形態では、組成物は、水性、非水性、又は混合型媒体中の懸濁剤として処方される。水性懸濁剤は、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、及び／又はデキストランを含めた懸濁剤の粘稠度を増加する物質を更に含有してもよい。懸濁剤は安定剤を含有することもできる。一部の実施形態では、本発明の医薬製剤又は組成物には、液剤、乳剤、マイクロエマルション剤、フォーム剤、又はリポソーム含有製剤（例えばカチオン性又は非カチオン性リポソーム）が含まれるが、こ
れらに限定されない。
[0119]本発明の医薬組成物又は製剤は、適切であれば、当業者に周知であるか又は公開文献に記載されている１以上の浸透増強剤、担体、賦形剤、又は他の活性若しくは不活性成分を含むことができる。一部の実施形態では、リポソームには、立体的に安定化されたリポソーム、例えば１以上の特定化された脂質を含むリポソームも含まれる。これらの特定化された脂質は、循環寿命が増強されたリポソームを生ずる。一部の実施形態では、立体的に安定化されたリポソームは、１以上の糖脂質を含むか、又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分などの１以上の親水性ポリマーで誘導体化される。一部の実施形態では、界面活性剤が、医薬製剤又は組成物に含まれる。医薬品、製剤、及び乳剤における界面活性剤の使用は、当該技術分野において周知である。一部の実施形態では、本発明は、浸透増加剤を用いてアンチセンスオリゴヌクレオチドの効率的な送達を実施し、例えば、細胞膜を通過する拡散を助け及び／又は親油性薬物の浸透性を増強させる。一部の実施形態では、浸透増強剤は、界面活性剤、脂肪酸、胆汁塩、キレート化剤、又は非キレート性非界面活性剤である。
[0120]一部の実施形態では、医薬製剤は、多数のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、別の薬物又は治療剤と組み合わせて投与される。
対象の処置
[0121]本明細書に提供されている組成物は、個体に投与することができる。「個体」は、「対象」又は「患者」と交換可能に使用され得る。個体は、哺乳動物、例えば、ヒト、又は非ヒト霊長類、齧歯類、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ロバ、ヤギ、ネコ、イヌ、ウシ、ブタ、若しくはヒツジなどの動物であり得る。一部の実施形態では、個体はヒトである。一部の実施形態では、個体は、胎児、胚、又は小児である。他の実施形態では、個体は、植物などの別の真核生物であり得る。一部の実施形態では、本明細書に提供されている組成物は、細胞にｅｘ ｖｉｖｏで投与される。
[0122]一部の実施形態では、本明細書に提供されている組成物は、疾患又は障害を処置する方法として個体に投与される。一部の実施形態では、個体は、本明細書に記載の疾患のいずれかのような遺伝子疾患を有する。一部の実施形態では、個体は、本明細書に記載の疾患のいずれかのような疾患を有する危険性がある。一部の実施形態では、個体は、タンパク質の不十分な量又はタンパク質の不十分な活性によって引き起こされる疾患又は障害を有する危険性が増加している。一部の実施形態では、個体が、タンパク質の不十分な量又はタンパク質の不十分な活性によって引き起こされる疾患又は障害を有する「危険性が増加している」場合、本方法は予防処置を伴う。例えば、個体は、疾患の家族歴のために、そのような疾患又は障害を有する危険が増加し得る。典型的には、そのような疾患又は障害を有する危険が増加している個体は、予防処置から（例えば、疾患又は障害の発症又は進行を防止又は遅延させることによって）恩恵を受ける。一部の実施形態では、胎児は、例えばＡＳＯ組成物を胎児に直接的又は間接的に（例えば母体を介して）投与することにより、子宮において処置される。
[0123]本発明のＡＳＯの適切な投与経路は、ＡＳＯの送達が望ましい細胞の種類に応じて変わり得る。多数の組織及び臓器がＣＥＳＤによって影響を受ける可能性がある。一部の実施形態では、肝臓が最も有意に影響を受ける組織であり得る。本発明のＡＳＯは、例えば、髄腔内注射、脳室内注射、腹腔内注射、筋肉内注射、皮下注射、又は静脈内注射により、患者に非経口投与され得る。
エクソンスキッピングを防止する追加のＡＳＯを同定する方法
[0124]ＬＩＰＡ ＳＥＣプレｍＲＮＡのエクソンスキッピングを防止するＡＳＯを同定又は決定する方法も、本開示の範囲内である。例えば、方法は、ＬＩＰＡ ＳＥＣプレｍＲＮＡのエクソンスキッピングを防止するＡＳＯを同定又は決定することを含むことができる。プレｍＲＮＡの標的領域内の異なるヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするＡＳＯを、スクリーニングして、スキップ可能なエクソンの保持の程度を改善するＡＳＯを同定又は決定することができる。一部の実施形態では、ＡＳＯは、スプライシングサイレンサーの結合部位を遮断又は干渉することができる。当該技術分野に公知の任意の方法を用いて、スキップ可能なエクソンの標的領域にハイブリダイズしたときに所望の効果（例えば、エクソン含有、タンパク質又は機能性ＲＮＡの産生）を生ずるＡＳＯを同定（決定）することができる。これらの方法は、スキップ可能なエクソンに隣接するイントロン内の標的化領域に結合することによって、スキップ可能なエクソンのエクソンスキッピングを防止するＡＳＯを同定するために使用することもできる。使用し得る方法の例を以下に提供する。
[0125]ＡＳＯ「ウォーク」と称されるスクリーニングのラウンドは、プレｍＲＮＡの標的領域にハイブリダイズするように設計されたＡＳＯを使用して実施することができる。例えば、ＡＳＯウォークに使用されるＡＳＯは、スキップ可能なエクソンの３’スプライス部位のおよそ１００ヌクレオチ上流（例えば、標的／スキップ可能なエクソンの上流に位置するイントロンの配列部分）から、標的／スキップ可能なエクソンの３’スプライス部位のおよそ１００ヌクレオチド下流まで、及び／又はスキップ可能なエクソンの５’スプライス部位のおよそ１００ヌクレオチ上流から、標的／スキップ可能なエクソンの５’スプライス部位のおよそ１００ヌクレオチド下流（例えば、標的／スキップ可能なエクソンの下流に位置するイントロンの配列部分）まで、５ヌクレオチドごとに並べることができる。例えば、長さ１８ヌクレオチドの第１のＡＳＯは、標的／スキップ可能なエクソンの５’スプライス部位に対して＋６～＋２３のヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするように設計することができる。第２のＡＳＯは、標的／スキップ可能なエクソンの５’スプライス部位に対して＋１１～＋２８のヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするように設計される。ＡＳＯは、プレｍＲＮＡの標的部分をスパンするように設計される。一部の実施形態では、ＡＳＯは、より近接させて、例えば、１、２、３、又は４ヌクレオチドごとに並べることができる。更に、ＡＳＯは、５’スプライス部位の１００ヌクレオチド下流から、３’スプライス部位の１００ヌクレオチド上流まで並べることができる。一部の実施形態では、ＡＳＯは、３’スプライス部位の約５７２ヌクレオチド上流から、５’スプライス部位の約５００ヌクレオチド下流まで並べることができる。一部の実施形態では、ＡＳＯは、３’スプライス部位の約５００ヌクレオチド上流から、３’スプライス部位の約５７２ヌクレオチド下流まで並べることができる。
[0126]１以上のＡＳＯ、又は対照ＡＳＯ（標的領域にハイブリダイズすることが予測されない配列であるスクランブル配列を有するＡＳＯ）は、例えば、標的プレｍＲＮＡ（例えば本明細書に記載のＳＥＣプレｍＲＮＡ）を発現する疾患関連細胞株へのトランスフェクションによって送達される。ＡＳＯのそれぞれのエクソン保持効果は、当該技術分野に公知の任意の方法により、例えば、実施例に記載のように、スプライスジャンクションをスパンするプライマーを使用する逆転写酵素（ＲＴ）－ＰＣＲにより評価することができる。ＡＳＯ処理細胞において、スキップ可能なエクソンを含有する領域をスパンするプライマーを使用して産生された、より長いＲＴ－ＰＣＲ産物の増加又は存在は、対照ＡＳＯ処理細胞と比較して、スキップ可能なエクソンの保持が増強されたことを示している。一部の実施形態では、エクソン保持効率、又は保持されたスキップ可能なエクソンを含有するｍＲＮＡのエクソンがスキップされたｍＲＮＡに対する比は、本明細書に記載のＡＳＯを使用して改善することができる。標的プレｍＲＮＡによりコードされるタンパク質又は機能性ＲＮＡの量を評価して、各ＡＳＯが所望の効果（例えば機能性タンパク質産生の増強）を達成したかどうかを決定することもできる。ウエスタンブロッティング、フローサ
イトメトリー、免疫蛍光顕微鏡検査法、及びＥＬＩＳＡなどの、タンパク質産生を評価及び／又は定量化する当該技術分野に公知の任意の方法を使用することができる。
[0127]ＡＳＯ「マイクロウォーク」と称される第２ラウンドのスクリーニングは、プレｍＲＮＡの標的領域にハイブリダイズするように設計されたＡＳＯを使用して実施することができる。ＡＳＯマイクロウォークに使用されるＡＳＯは、１ヌクレオチドごとに並べて、ＡＳＯとハイブリダイズしたときにエクソン保持を生ずるプレｍＲＮＡの核酸配列を更に洗練させる。
[0128]標的のスキップ可能なエクソンの含有を促進させるＡＳＯにより規定される領域は、１ヌクレオチドごとに間隔が置かれているＡＳＯ、並びにより長い、典型的には１５～２５ヌクレオチドのＡＳＯを包含するＡＳＯ「マイクロウォーク」によって更に詳細に探索される。
[0129]上記のＡＳＯウォークについて記載されたように、ＡＳＯマイクロウォークは、１以上のＡＳＯ、又は対照ＡＳＯ（標的領域にハイブリダイズすることが予測されない配列であるスクランブル配列を有するＡＳＯ）を、例えば標的プレｍＲＮＡを発現する疾患関連細胞株へのトランスフェクションにより送達することによって実施される。それぞれのＡＳＯのスプライシング誘導効果は、当該技術分野に公知の任意の方法により、例えば、本明細書に記載されているように（例えば実施例を参照）、スキップ可能なエクソンをスパンするプライマーを使用する逆転写酵素（ＲＴ）－ＰＣＲにより評価することができる。ＡＳＯ処理細胞において、スキップ可能なエクソンを含有する領域をスパンするプライマーを使用して産生された、より長いＲＴ－ＰＣＲ産物の増加又は存在は、対照ＡＳＯ処理細胞と比較して、スキップ可能なエクソンの保持が増強されたことを示している。一部の実施形態では、エクソン保持効率、又は保持されたスキップ可能なエクソンを含有するｍＲＮＡのエクソンがスキップされたｍＲＮＡに対する比は、本明細書に記載のＡＳＯを使用して改善することができる。標的プレｍＲＮＡによりコードされるタンパク質又は機能性ＲＮＡの量を評価して、各ＡＳＯが所望の効果（例えば機能性タンパク質産生の増強）を達成したかどうかを決定することもできる。ウエスタンブロッティング、フローサイトメトリー、免疫蛍光顕微鏡検査法、及びＥＬＩＳＡなどの、タンパク質産生を評価及び／又は定量化する当該技術分野に公知の任意の方法を使用することができる。
[0130]プレｍＲＮＡの領域にハイブリダイズしたときにエクソン含有及びタンパク質産生増加を生ずるＡＳＯは、動物モデル、例えば全長ヒト遺伝子がノックインされているトランスジェニックマウスモデルを使用してｉｎ ｖｉｖｏで、又は疾患のヒト化マウスモデルにおいて試験することができる。ＡＳＯの適切な投与経路は、ＡＳＯの送達が望ましい疾患及び／又は細胞の種類に応じて変わり得る。ＡＳＯは、例えば髄腔内注射、脳室内注射、腹腔内注射、筋肉内注射、皮下注射、又は静脈内注射により投与することができる。投与後、モデル動物の細胞、組織、及び／又は臓器を評価して、例えば、当該技術分野に公知であり、本明細書に記載の方法によりスプライシング（効率、比、程度）及びタンパク質産生を評価することによって、ＡＳＯ処置の効果を決定することができる。動物モデルは、疾患又は疾患の重篤度の任意の表現型又は行動指標（behavioral indication）
でもあり得る。
[0131]本発明は、以下の実施例によって、より具体的に説明される。しかし本発明は、これらの実施例にいかようにも限定されるものではないことが理解されるべきである。
実施例１： ＬＩＰＡ転写産物におけるエクソンスキッピング事象のＲＴ－ＰＣＲによる確認
[0132]ＲＴ－ＰＣＲを実施して、健康なドナー及びコレステリルエステル蓄積症（ＣＥ
ＳＤ）を有するドナーから得た線維芽細胞のＬＩＰＡ遺伝子から産生された転写産物の長さの差異を明らかにした。正常な細胞は、エクソン８を保持するＬＩＰＡ遺伝子のｍＲＮＡ転写産物を産生し、全長活性型ＬＡＬタンパク質を生じた。エクソン８がスキップしている場合、ＬＩＰＡ遺伝子における変異（ｃ．８９４Ｇ＞Ａ）に起因してＣＥＳＤが生じ、非機能型ＬＡＬタンパク質が優勢的に発現される。正常及びＣＥＳＤ線維芽細胞のｍＲＮＡ転写産物を、エクソン７及び９に隣接するプライマーを使用して増幅し、産生されたＬＩＰＡ転写産物におけるエクソン８の存在又は非存在を検出した。次いでポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を使用して、得られたＲＴ－ＰＣＲ産物のサイズを示した。対照（正常）線維芽細胞は、エクソン７、８、及び９を含有する長いＰＣＲ産物を発生するが、ＣＥＳＤ患者の線維芽細胞から増幅されたＰＣＲ産物は長さが短く、エクソン７及び９のみが転写産物に保持されたものの存在と一致し、ＣＥＳＤ患者の線維芽細胞においてエクソン８スキッピングが確認された。この分析によって、ＣＥＳＤ患者のｍＲＮＡ転写産物の約９５％が短鎖型形態（エクソン８がスキップされている）を生じ、非機能性ＬＡＬタンパク質をもたらすこと、及びエクソン８が保持された全長ｍＲＮＡは約５％産生されることが示された。産物の同一性は、配列決定により確認した。
実施例２： ＬＩＰＡのエクソン８を標的にするＡＳＯウォークの設計
[0133]本明細書に記載の方法を使用して、ＡＳＯウォークは、ＬＩＰＡ（表１、配列番号１）のエクソン８（表２、配列番号４）を標的にするように設計した（表３、配列番号５４～６３）。ヌクレオチドの＋２ｅ～－４ｅに及ぶエクソン８の３’スプライス部位の直ぐ下流及びエクソン８の５’スプライス部位の上流領域を利用して、ＬＩＰＡ ＳＥＣプレｍＲＮＡのスキップ可能なエクソンを標的にしたＡＳＯを設計した。表３は、設計された例示的なＡＳＯ及びそれらの標的配列を列挙する。この設計から、５ヌクレオチド間隔でシフトした２’－ＭＯＥ、ＰＳ骨格、１８－ｍｅｒのＡＳＯを作製し、ＬＩＰＡ ＳＥＣプレｍＲＮＡを標的にして、ＬＡＬタンパク質産生を増加させるために利用する。
Figure 2024079818000002
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実施例３： ＬＩＰＡのイントロン７を標的にするＡＳＯウォークの設計
[0134]本明細書に記載の方法を使用して、ＡＳＯウォークは、ＬＩＰＡ（表１、配列番号１）のイントロン７（表２、配列番号３）を標的にするように設計した（表３、配列番３９～５３）。ヌクレオチドの－１６～－１００に及ぶイントロン７の３’スプライス部位の直ぐ上流領域を利用して、ＬＩＰＡ ＳＥＣプレｍＲＮＡのイントロン７を標的にしたＡＳＯを設計した。表３は、設計された例示的なＡＳＯ及びそれらの標的配列を列挙する。この設計から、５ヌクレオチド間隔でシフトした２’－ＭＯＥ、ＰＳ骨格、１８－ｍｅｒのＡＳＯを作製し、ＬＩＰＡ ＳＥＣプレｍＲＮＡを標的にして、ＬＡＬタンパク質産生を増加させるために利用する。
実施例４： ＬＩＰＡのイントロン８を標的にするＡＳＯウォークの設計
[0135]本明細書に記載の方法を使用して、ＡＳＯウォークは、ＬＩＰＡ（表１、配列番
号１）のイントロン８（図３、表２、配列番号２）を標的にするように設計した（表３、配列番１～３８）。ヌクレオチドの＋６～＋１００に及ぶイントロン８の５’スプライス部位の直ぐ下流領域を利用して、ＬＩＰＡ ＳＥＣプレｍＲＮＡのイントロン８を標的にしたＡＳＯを設計した。表３は、設計された例示的なＡＳＯ及びそれらの標的配列を列挙する。この設計から、＋６～＋１０は１ヌクレオチド間隔で、その後は５ヌクレオチド間隔でシフトした２’－ＭＯＥ、ＰＳ骨格、１８－ｍｅｒのＡＳＯを作製し、ＬＩＰＡ ＳＥＣプレｍＲＮＡを標的にして、ＬＡＬタンパク質産生を増加させるために利用した（図４Ａ及び図４Ｂを参照）。
実施例５：
[0136]ＬＩＰＡ ＳＥＣプレｍＲＮＡを標的にしたＡＳＯの用量依存的能力を実証するために一連の実験を設計し、転写産物のスプライシングを変更させて成熟ｍＲＮＡ産物におけるイントロン８の保持を増加させ、それにより、ｃ．８９４Ｇ＞Ａ変異を有するドナーＣＥＳＤ細胞における全長機能性ＬＡＬタンパク質の産生を増加させた。細胞を、イントロン８を標的にした様々な２’－ＭＯＥ ＡＳＯの一連の濃度のセットで、エレクトロポレーション（例えば、図５、７、及び９のＡ－３３３４（＋９））又は自由取り込み（例えば、図６のＡ－３３３４（＋９））にて処理したところ、ＡＳＯの処理量が増加すると、未処理細胞と比較して、ＣＥＳＤ線維芽細胞で産生されたＬＩＰＡ転写産物においてエクソン８の保持の増加をもたらすことを示した（例えば、図５Ａ、５Ｃ）。代表的なＰＡＧＥは、２つの転写産物についてのＲＴ－ＰＣＲ産物がエクソン８の含有（全長、上側バンド）及びエクソン８スキッピング（下側バンド）に対応することを示しており、それぞれを定量化して全長転写産物の百分率として評価した（図５、６及び９）。追加の分析を実施して、ＡＳＯ処理がｍＲＮＡ転写産物の生成を変更するだけでなく、ＣＥＳＤ細胞における全長機能性ＬＡＬタンパク質産生の用量依存的増加も生じることを確認した。ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）は、リソソーム酸リパーゼ（ＬＡＬ）タンパク質が、ｃ．８９４Ｇ＞Ａ変異を有するＣＥＳＤ患者の線維芽細胞を、イントロン８を標的にした２’－ＭＯＥ ＡＳＯの量を増加させて処理した細胞において、ｍｏｃｋ処理細胞（－）と比較して、産生レベルが増加したことを示す（図７）。グリコシル化全長タンパク質に対応する産物を定量化し、ポンソーＳ染色ブロットに正規化した。ＡＳＯ処理ＣＥＳＤ細胞内で産生されたＬＡＬタンパク質の活性を、酵素アッセイを使用して確認した。結果は、発現したタンパク質が機能的であること、及び活性の量がＬＡＬタンパク質の量と比例することを実証している（図８及び１０）。
[0137]本発明の好ましい実施形態が本明細書に示され、記載されているが、そのような実施形態が単なる例示として提供されていることは当業者に明白である。ここで多数の変更、変化、及び置き換えが、本発明を逸脱することなく当業者によって考え出される。本明細書に記載されている本発明の実施形態に対する様々な代替案を、本発明の実施に用いてもよいことが理解されるべきである。以下の特許請求の範囲が本発明の範囲を確定すること、及びこれらの請求項の範囲内の方法及び構造、並びにそれらの等価物が網羅されることが意図される。
本願は以下の発明を包含する。
［項目１］ コレステリルエステル蓄積症（ＣＥＳＤ）の処置を必要とする対象において、対象の細胞による標的タンパク質又は機能性ＲＮＡの発現を調節することによってそれを処置する方法であって、前記細胞はスキップ可能なエクソン含有プレｍＲＮＡ（ＳＥＣプレｍＲＮＡ）を有し、前記ＳＥＣプレｍＲＮＡは、前記スキップ可能なエクソン、前記スキップ可能なエクソンの５’スプライス部位に隣接するイントロン、及び前記スキップ可能なエクソンの３’スプライス部位に隣接するイントロンを含み、前記ＳＥＣプレｍＲＮＡは前記標的タンパク質又は機能性ＲＮＡをコードし、前記方法は、前記対象の細胞を、前記標的タンパク質又は機能性ＲＮＡをコードする前記ＳＥＣプレｍＲＮＡの標的化部分に相補的なアンチセンスオリゴマー（ＡＳＯ）と接触させ、それにより、前記スキップ可能なエクソンが、前記標的タンパク質又は機能性ＲＮＡをコードする前記ＳＥＣプレｍＲＮＡからプロセシングされたｍＲＮＡに保持され、それにより、前記対象の細胞において、前記標的タンパク質又は機能性ＲＮＡをコードするｍＲＮＡのレベルを調節し、そして前記標的タンパク質又は機能性ＲＮＡの発現を調節する、ことを含む、前記方法。
［項目２］ スキップ可能なエクソン含有プレｍＲＮＡ（ＳＥＣプレｍＲＮＡ）を有する細胞による、リソソーム酸リパーゼ（ＬＡＬ）である標的タンパク質の発現を調節する方法であって、前記ＳＥＣプレｍＲＮＡは、前記スキップ可能なエクソン、前記スキップ可能なエクソンの５’スプライス部位に隣接するイントロン、及び前記スキップ可能なエクソンの３’スプライス部位に隣接するイントロンを含み、前記ＳＥＣプレｍＲＮＡはＬＡＬタンパク質をコードし、前記方法は、前記細胞を、ＬＡＬタンパク質をコードする前記ＳＥＣプレｍＲＮＡの標的化部分に相補的なアンチセンスオリゴマー（ＡＳＯ）と接触させ、それにより、前記スキップ可能なエクソンが、ＬＡＬタンパク質をコードする前記ＳＥＣプレｍＲＮＡからプロセシングされたｍＲＮＡに保持され、それにより、前記細胞において、ＬＡＬタンパク質をコードするｍＲＮＡのレベルを調節し、そしてＬＡＬタンパク質の発現を調節する、ことを含む、前記方法。
［項目３］ 前記標的タンパク質又は前記標的タンパク質をコードするｍＲＮＡの発現又はレベルを調節することが、前記標的タンパク質又は前記標的タンパク質をコードするｍＲＮＡの発現又はレベルを増加させる、項目１に記載の方法。
［項目４］ ＬＡＬタンパク質又はＬＡＬタンパク質をコードするｍＲＮＡの発現又はレベルを調節することが、ＬＡＬタンパク質又はＬＡＬタンパク質をコードするｍＲＮＡの発現又はレベルを増加させる、項目２に記載の方法。
［項目５］ 前記標的タンパク質がＬＡＬである、項目１又は３に記載の方法。
［項目６］ 前記細胞が、ＬＡＬタンパク質の量又は活性の欠損により引き起こされる病態を有する対象内にあるか又は対象由来のものである、項目１～５のいずれか１項に記載の方法。
［項目７］ 前記５’スプライス部位に隣接するイントロンの＋１～＋６及び前記スキップ可能なエクソンの－３ｅ～－１ｅにある９個のヌクレオチドのうちの少なくとも１個のヌクレオチドが、少なくとも１個の変異を含む、項目１～６のいずれか１項に記載の方法。
［項目８］ 前記変異が置換である、項目７に記載の方法。
［項目９］ 前記変異が－１ｅにある、項目７記載の方法。
［項目１０］ 前記変異がｃ．８９４Ｇ＞Ａである、項目７に記載の方法。
［項目１１］ 前記標的タンパク質の量の欠損が、常染色体劣性遺伝により引き起こされる、項目１～１０のいずれか１項に記載の方法。
［項目１２］ 前記対象が、機能性標的タンパク質をコードする第１の対立遺伝子及び（ａ）機能性標的タンパク質をコードする第２の対立遺伝子を有し、前記アンチセンスオリゴマーが、前記第１若しくは第２の対立遺伝子から転写されたＳＥＣプレｍＲＮＡの標的化部分に結合するか、又は前記第１の対立遺伝子及び（ｂ）第２の対立遺伝子を有し、前記アンチセンスオリゴマーが、前記第１の対立遺伝子から転写されたＳＥＣプレｍＲＮＡの標的化部分に結合する、項目１１に記載の方法。
［項目１３］ 前記対象が、前記標的タンパク質の量又は機能の欠損によってもたらされる障害によって引き起こされる病態を有し、前記対象が、
（ａ）第１の変異を含む第１の対立遺伝子であって、第１の変異により、
（ｉ）前記標的タンパク質が、野生型対立遺伝子からの産生と比較して低減されたレベルで産生されるか、
（ｉｉ）前記標的タンパク質が、同等の野生型タンパク質と比較して低減された機能を有する形態で産生されるか、又は
（ｉｉｉ）前記標的タンパク質が産生されない、
第１の対立遺伝子、及び
（ｂ）第２の変異を含む第２の対立遺伝子であって、第２の変異により、
（ｉ）前記標的タンパク質が、野生型対立遺伝子からの産生と比較して低減されたレベルで産生されるか、
（ｉｉ）前記標的タンパク質が、同等の野生型タンパク質と比較して低減された機能を有する形態で産生されるか、又は
（ｉｉｉ）前記標的タンパク質が産生されない、
第２の対立遺伝子、
を有し、前記第１及び第２の変異が同一か又は異なっている、項目１～１２のいずれか１項に記載の方法。
［項目１４］ 前記標的タンパク質が、同等の野生型タンパク質と比較して低減された機能を有する形態で産生される、項目１３に記載の方法。
［項目１５］ 前記標的タンパク質が、同等の野生型タンパク質と比較して完全に機能性の形態で産生される、項目１３に記載の方法。
［項目１６］ 前記ＳＥＣプレｍＲＮＡの前記標的化部分が、前記スキップ可能なエクソン内の前記スキップ可能なエクソンの５’スプライス部位に対して－４ｅから前記スキップ可能なエクソンの３’スプライス部位に対して＋２ｅまでの領域内にある、項目１～１５のいずれか１項に記載の方法。
［項目１７］ 前記ＳＥＣプレｍＲＮＡの前記標的化部分が、
（ａ）前記スキップ可能なエクソンの５’スプライス部位に隣接するイントロンの＋６～＋５００の領域内、又は
（ｂ）前記スキップ可能なエクソンの３’スプライス部位に隣接するイントロンの－１６～－５００領域内、
にある、項目１～１５のいずれか１項に記載の方法。
［項目１８］ 前記ＳＥＣプレｍＲＮＡの前記標的化部分が、
（ａ）前記スキップ可能なエクソンの５’スプライス部位に対して－４ｅ～－５００ｅの領域内、
（ｂ）前記スキップ可能なエクソンの５’スプライス部位に対して＋６～＋５００の領域内、
（ｃ）前記スキップ可能なエクソンの３’スプライス部位に対して－１６～－５００の領域内、又は
（ｄ）前記スキップ可能なエクソンの３’スプライス部位に対して＋２ｅ～＋５００ｅの領域内、
にある、項目１～１５のいずれか１項に記載の方法。
［項目１９］ 前記ＳＥＣプレｍＲＮＡが、配列番号１又はその相補配列のいずれか１つに少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、又は１００％の配列同一性を有する配列を含む、項目１～１８のいずれか１項に記載の方法。
［項目２０］ 前記ＳＥＣプレｍＲＮＡが、配列番号１又はその相補配列に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、又は１００％の配列同一性を有する遺伝子配列によりコードされる、項目１～１８のいずれか１項に記載の方法。
［項目２１］ 前記ＳＥＣプレｍＲＮＡの前記標的化部分が、配列番号２～４又はそれらの相補配列の少なくとも８個の連続した核酸を含む領域に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、又は１００％の配列同一性を有する配列を含む、項目１～２０のいずれか１項に記載の方法。
［項目２２］ 前記ＡＳＯが、配列番号５～６３又はそれらの相補配列のいずれか１つに少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、又は１００％の同一性がある配列を含む、項目１～２１のいずれか１項に記載の方法。
［項目２３］ 前記ＳＥＣプレｍＲＮＡの前記標的化部分が、前記スキップ可能なエクソンの５’スプライス部位に対して－４ｅから前記スキップ可能なエクソンの３’スプライス部位に対して＋２ｅまでの領域内にあり、前記スキップ可能なエクソンがエクソン８である、項目１～２２のいずれか１項に記載の方法。
［項目２４］ 前記ＡＳＯが、配列番号５４～６３又はそれらの相補配列のいずれか１つに少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、又は１００％の同一性がある配列を含む、項目２３に記載の方法。
［項目２５］ 前記ＳＥＣプレｍＲＮＡの前記標的化部分が、前記スキップ可能なエクソンの５’スプライス部位に対して＋６～＋５００の領域内にあり、前記スキップ可能なエクソンがエクソン８である、項目１～２２のいずれか１項に記載の方法。
［項目２６］ 前記ＡＳＯが、配列番号５～３８又はそれらの相補配列のいずれか１つに少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、又は１００％の同一性がある配列を含む、項目２５に記載の方法。
［項目２７］ 前記ＳＥＣプレｍＲＮＡの前記標的化部分が、前記スキップ可能なエクソンの３’スプライス部位に対して－１６～－５００の領域内にあり、前記スキップ可能なエクソンがエクソン８である、項目１～２２のいずれか１項に記載の方法。
［項目２８］ 前記ＡＳＯが、配列番号３９～５３又はそれらの相補配列のいずれか１つに少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、又は１００％の同一性がある配列を含む、項目２７に記載の方法。
［項目２９］ 前記ＳＥＣプレｍＲＮＡが、全長プレｍＲＮＡの部分的にスプライシングされたプレｍＲＮＡであるか、又は野生型プレｍＲＮＡの部分的にスプライシングされたプレｍＲＮＡである、項目１～２８のいずれか１項に記載の方法。
［項目３０］ 前記標的タンパク質又は機能性ＲＮＡをコードする前記ｍＲＮＡが、全長成熟ｍＲＮＡ又は野生型成熟ｍＲＮＡである、項目１～２９のいずれか１項に記載の方法。
［項目３１］ 産生される前記標的タンパク質が、全長タンパク質若しくは野生型タンパク質、又はそれらの組合せである、項目１～３０のいずれか１項に記載の方法。
［項目３２］ 前記アンチセンスオリゴマーと接触させた前記細胞内で産生される前記標的タンパク質又は機能性ＲＮＡをコードする前記ｍＲＮＡの総量が、対照細胞内で産生される前記標的タンパク質又は機能性ＲＮＡをコードする前記ｍＲＮＡの総量と比較して、約１．１～約１０倍、約１．５～約１０倍、約２～約１０倍、約３～約１０倍、約４～約１０倍、約１．１～約５倍、約１．１～約６倍、約１．１～約７倍、約１．１～約８倍、約１．１～約９倍、約２～約５倍、約２～約６倍、約２～約７倍、約２～約８倍、約２～約９倍、約３～約６倍、約３～約７倍、約３～約８倍、約３～約９倍、約４～約７倍、約４～約８倍、約４～約９倍、少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、又は少なくとも約１０倍増加する、項目１～３１のいずれか１項に記載の方法。
［項目３３］ 前記アンチセンスオリゴマーと接触させた前記細胞内で産生される前記標的タンパク質又は機能性ＲＮＡをコードする前記ｍＲＮＡの総量が、対照細胞内で産生される前記標的タンパク質又は機能性ＲＮＡをコードする前記ｍＲＮＡの総量と比較して、約２０％～約３００％、約５０％～約３００％、約１００％～約３００％、約１５０％～約３００％、約２０％～約５０％、約２０％～約１００％、約２０％～約１５０％、約２０％～約２００％、約２０％～約２５０％、約５０％～約１００％、約５０％～約１５０％、約５０％～約２００％、約５０％～約２５０％、約１００％～約１５０％、約１００％～約２００％、約１００％～約２５０％、約１５０％～約２００％、約１５０％～約２５０％、約２００％～約２５０％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約５０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１５０％、少なくとも約２００％、少なくとも約２５０％、又は少なくとも約３００％増加する、項目１～３１のいずれか１項に記載の方法。
［項目３４］ 前記アンチセンスオリゴマーと接触させた前記細胞により産生される標的タンパク質の総量が、対照細胞により産生される標的タンパク質の総量と比較して、約１．１～約１０倍、約１．５～約１０倍、約２～約１０倍、約３～約１０倍、約４～約１０倍、約１．１～約５倍、約１．１～約６倍、約１．１～約７倍、約１．１～約８倍、約１．１～約９倍、約２～約５倍、約２～約６倍、約２～約７倍、約２～約８倍、約２～約９倍、約３～約６倍、約３～約７倍、約３～約８倍、約３～約９倍、約４～約７倍、約４～約８倍、約４～約９倍、少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、又は少なくとも約１０倍増加する、項目１～３３のいずれか１項に記載の方法。
［項目３５］ 前記アンチセンスオリゴマーと接触させた前記細胞により産生される標的タンパク質の総量が、対照細胞により産生される標的タンパク質の総量と比較して、約２０％～約３００％、約５０％～約３００％、約１００％～約３００％、約１５０％～約３００％、約２０％～約５０％、約２０％～約１００％、約２０％～約１５０％、約２０％～約２００％、約２０％～約２５０％、約５０％～約１００％、約５０％～約１５０％、約５０％～約２００％、約５０％～約２５０％、約１００％～約１５０％、約１００％～約２００％、約１００％～約２５０％、約１５０％～約２００％、約１５０％～約２５０％、約２００％～約２５０％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約５０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１５０％、少なくとも約２００％、少なくとも約２５０％、又は少なくとも約３００％増加する、項目１～３３のいずれか１項に記載の方法。
［項目３６］ 前記アンチセンスオリゴマーが、ホスホロチオエート連結又はホスホロジアミデート連結を含む骨格修飾を含む、項目１～３５のいずれか１項に記載の方法。
［項目３７］ 前記アンチセンスオリゴマーが、ホスホロジアミデートモルホリノ、ロックド核酸、ペプチド核酸、２’－Ｏ－メチル、２’－フルオロ、又は２’－Ｏ－メトキシエチル部分を含む、項目１～３６のいずれか１項に記載の方法。
［項目３８］ 前記アンチセンスオリゴマーが、少なくとも１個の修飾糖部分を含む、項目１～３７のいずれか１項に記載の方法。
［項目３９］ 各糖部分が修飾糖部分である、項目３８に記載の方法。
［項目４０］ 前記アンチセンスオリゴマーが、８～５０個の核酸塩基、８～４０個の核酸塩基、８～３５個の核酸塩基、８～３０個の核酸塩基、８～２５個の核酸塩基、８～２０個の核酸塩基、８～１５個の核酸塩基、９～５０個の核酸塩基、９～４０個の核酸塩基、９～３５個の核酸塩基、９～３０個の核酸塩基、９～２５個の核酸塩基、９～２０個の核酸塩基、９～１５個の核酸塩基、１０～５０個の核酸塩基、１０～４０個の核酸塩基、１０～３５個の核酸塩基、１０～３０個の核酸塩基、１０～２５個の核酸塩基、１０～２０個の核酸塩基、１０～１５個の核酸塩基、１１～５０個の核酸塩基、１１～４０個の核酸塩基、１１～３５個の核酸塩基、１１～３０個の核酸塩基、１１～２５個の核酸塩基、１１～２０個の核酸塩基、１１～１５個の核酸塩基、１２～５０個の核酸塩基、１２～４０個の核酸塩基、１２～３５個の核酸塩基、１２～３０個の核酸塩基、１２～２５個の核酸塩基、１２～２０個の核酸塩基、又は１２～１５個の核酸塩基から成る、項目１～３９のいずれか１項に記載の方法。
［項目４１］ 前記アンチセンスオリゴマーが、前記タンパク質をコードする前記ＳＥＣプレｍＲＮＡの前記標的化部分に少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の相補性がある、項目１～４０のいずれか１項に記載の方法。
［項目４２］ ＬＩＰＡタンパク質発現を評価することを更に含む、項目１～４１のいずれか１項に記載の方法。
［項目４３］ ＣＥＳＤが処置され、前記アンチセンスオリゴマーがＬＩＰＡ ＳＥＣプレｍＲＮＡの標的化部分に結合し、前記標的化部分が配列番号２～４又はそれらの相補配列の少なくとも８個の連続した核酸を含む、項目１～４２のいずれか１項に記載の方法。
［項目４４］ 前記対象がヒトである、項目１～４３のいずれか１項に記載の方法。
［項目４５］ 前記対象が非ヒト動物である、項目１～４４のいずれか１項に記載の方法。
［項目４６］ 前記対象が、胎児、胚、又は小児である、項目１～４５のいずれか１項に記載の方法。
［項目４７］ 前記細胞をｅｘ ｖｉｖｏで接触させる、項目１～４６のいずれか１項に記載の方法。
［項目４８］ 前記アンチセンスオリゴマーが、前記対象への髄腔内注射、脳室内注射、腹腔内注射、筋肉内注射、皮下注射、又は静脈内注射により投与される、項目１～４７のいずれか１項に記載の方法。
［項目４９］ 前記イントロンの－１５～－１及び前記３’スプライス部位に隣接する前記スキップ可能なエクソンの＋１ｅにある１６個のヌクレオチドが、対応する野生型配列と同一であり、前記イントロンがイントロン７であり、前記スキップ可能なエクソンがエクソン８である、項目１～４８のいずれか１項に記載の方法。
［項目５０］ 項目１～４９のいずれか１項に記載の方法に使用される、アンチセンスオリゴマー。
［項目５１］ 配列番号５～６３又はそれらの相補配列のいずれか１つに少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、又は１００％の配列同一性を有する配列を含む、アンチセンスオリゴマー。
［項目５２］ 項目５０又は５１に記載のアンチセンスオリゴマーと、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、又は担体とを含む医薬組成物。
［項目５３］ 項目５２に記載の医薬組成物を、髄腔内注射、脳室内注射、腹腔内注射、筋肉内注射、皮下注射、又は静脈内注射で投与することによる、処置を必要とする対象を処置する方法。
［項目５４］ 欠損タンパク質又は欠損機能性ＲＮＡに関連するコレステリルエステル蓄積症（ＣＥＳＤ）を処置する必要がある対象においてそれを処置するための、細胞による標的タンパク質又は機能性ＲＮＡの発現を調節する方法に使用するためのアンチセンスオリゴマーを含む組成物であって、前記欠損タンパク質又は欠損機能性ＲＮＡは、前記対象において量又は活性が欠損しており、前記アンチセンスオリゴマーは、前記標的タンパク質又は前記機能性ＲＮＡをコードするスキップ可能なエクソン含有プレｍＲＮＡ（ＳＥＣプレｍＲＮＡ）からのエクソンの除去を低減させ、前記標的タンパク質は前記欠損タンパク質であり、前記機能性ＲＮＡは前記欠損ＲＮＡであり、前記ＳＥＣプレｍＲＮＡは、前記スキップ可能なエクソン、前記スキップ可能なエクソンの５’スプライス部位に隣接するイントロン、及び前記スキップ可能なエクソンの３’スプライス部位に隣接するイントロンを含み、前記スキップ可能なエクソンは、前記標的タンパク質又は前記機能性ＲＮＡをコードする前記ＳＥＣプレｍＲＮＡからプロセシングされたｍＲＮＡに保持され、それにより、前記対象において前記標的タンパク質又は前記機能性ＲＮＡの産生又は活性を調節する、前記組成物。
［項目５５］ リソソーム酸リパーゼ（ＬＡＬ）タンパク質に関連する病態を処置する必要がある対象においてそれを処置する方法に使用するためのアンチセンスオリゴマーを含む組成物であって、前記方法は前記対象の細胞によるＬＡＬタンパク質の発現を調節することを含み、前記細胞は、スキップ可能なエクソン、前記スキップ可能なエクソンの５’スプライス部位に隣接するイントロン、前記スキップ可能なエクソンの３’スプライス部位に隣接するイントロンを含む前記スキップ可能なエクソン含有プレｍＲＮＡ（ＳＥＣプレｍＲＮＡ）を有し、前記ＳＥＣプレｍＲＮＡは前記ＬＡＬタンパク質をコードし、前記方法は、前記細胞を前記アンチセンスオリゴマーと接触させ、それにより、前記スキップ可能なエクソンが、ＬＡＬタンパク質をコードする前記ＳＥＣプレｍＲＮＡ転写産物からプロセシングされたｍＲＮＡに保持され、それにより、前記対象の前記細胞において、ＬＡＬタンパク質をコードするｍＲＮＡのレベルを調節し、そしてＬＡＬタンパク質の発現を調節する、ことを含む、前記組成物。
［項目５６］ 前記標的タンパク質又は前記標的タンパク質をコードするｍＲＮＡの活性、発現、及び／又は産生を調節することが、前記標的タンパク質又は前記標的タンパク質をコードするｍＲＮＡの活性、発現、及び／又は産生を増加させる、項目５４に記載の組成物。
［項目５７］ ＬＡＬタンパク質又はＬＡＬタンパク質をコードするｍＲＮＡの活性、発現、及び／又は産生を調節することが、ＬＡＬタンパク質又はＬＡＬタンパク質をコードするｍＲＮＡの活性、発現、及び／又は産生を増加させる、項目５４に記載の組成物。
［項目５８］ 前記標的タンパク質がＬＡＬである、項目５４又は５６に記載の組成物。
［項目５９］ 前記病態が疾患又は障害である、項目５５に記載の組成物。
［項目６０］ 前記疾患又は障害がＣＥＳＤである、項目５９に記載の組成物。
［項目６１］ 前記標的タンパク質及びＳＥＣプレｍＲＮＡが、ＬＩＰＡ遺伝子によりコードされる、項目６０に記載の組成物。
［項目６２］ 前記ＡＳＯが、前記スキップ可能なエクソン内の前記スキップ可能なエクソンの５’スプライス部位に対して－４ｅから前記スキップ可能なエクソンの３’スプライス部位に対して＋２ｅまでの領域内にある前記ＳＥＣプレｍＲＮＡの部分を標的にする、項目５４～６１のいずれか１項に記載の組成物。
［項目６３］ 前記アンチセンスオリゴマーが、前記スキップ可能なエクソン内の、
（ａ）前記スキップ可能なエクソンの５’スプライス部位に対して＋６～＋５００の領域内、又は
（ｂ）前記スキップ可能なエクソンの３’スプライス部位に対して－１６～－５００の領域内、
にある前記ＳＥＣプレｍＲＮＡの部分を標的にする、項目５４～６１のいずれか１項に記載の組成物。
［項目６４］ 前記アンチセンスオリゴマーが、前記スキップ可能なエクソンの５’スプライス部位の約１００ヌクレオチド下流から前記スキップ可能なエクソンの３’スプライス部位の約１００ヌクレオチド上流までの領域内にある前記ＳＥＣプレｍＲＮＡの部分を標的にする、項目５４～６１のいずれか１項に記載の組成物。
［項目６５］ 前記ＳＥＣプレｍＲＮＡの前記標的化部分が、
（ａ）前記スキップ可能なエクソンの５’スプライス部位に隣接するイントロンの＋６～＋５００の領域内、又は
（ｂ）前記スキップ可能なエクソンの３’スプライス部位に隣接するエクソンの－１６～－５００の領域内、
にある、項目５４～６１のいずれか１項に記載の組成物。
［項目６６］ 前記ＳＥＣプレｍＲＮＡの前記標的化部分が、
（ａ）前記スキップ可能なエクソンの５’スプライス部位に対して－４ｅ～－５００ｅの領域内、
（ｂ）前記スキップ可能なエクソンの５’スプライス部位に対して＋６～＋５００の領域内、
（ｃ）前記スキップ可能なエクソンの３’スプライス部位に対して－１６～－５００の領域内、又は
（ｄ）前記スキップ可能なエクソンの３’スプライス部位に対して＋２ｅ～＋５００ｅの領域内
にある、項目５４～６１のいずれか１項に記載の組成物。
［項目６７］ 前記標的タンパク質がＬＡＬである、項目５４～６１のいずれか１項に記載の組成物。
［項目６８］ 前記ＳＥＣプレｍＲＮＡが、配列番号１又はその相補配列のいずれか１つに少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、又は１００％の配列同一性を有する配列を含む、項目６７に記載の組成物。
［項目６９］ 前記ＳＥＣプレｍＲＮＡが、配列番号１又はその相補配列に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、又は１００％の配列同一性を有する遺伝子配列によりコードされる、項目６７に記載の組成物。
［項目７０］ 前記ＳＥＣプレｍＲＮＡの前記標的化部分が、配列番号２～４又はそれらの相補配列の少なくとも８個の連続した核酸を含む領域に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、又は１００％の配列同一性を有する配列を含む、項目６７に記載の組成物。
［項目７１］ 前記ＡＳＯが、配列番号５～６３又はそれらの相補配列のいずれか１つに少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、又は１００％の同一性がある配列を含む、項目６７に記載の組成物。
［項目７２］ 前記ＳＥＣプレｍＲＮＡの前記標的化部分が、前記スキップ可能なエクソンの５’スプライス部位に対して－４ｅから前記スキップ可能なエクソンの３’スプライス部位に対して＋２ｅまでの領域内にあり、前記スキップ可能なエクソンがエクソン８である、項目６７に記載の組成物。
［項目７３］ 前記ＡＳＯが、配列番号５４～６３又はそれらの相補配列のいずれか１つに少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、又は１００％の同一性がある配列を含む、項目７２に記載の方法。
［項目７４］ 前記ＳＥＣプレｍＲＮＡの前記標的化部分が、前記スキップ可能なエクソンの３’スプライス部位に対して－１６～－５００の領域内にあり、前記スキップ可能なエクソンがエクソン８である、項目６７に記載の組成物。
［項目７５］ 前記ＡＳＯが、配列番号５～３８又はそれらの相補配列のいずれか１つに少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、又は１００％の同一性がある配列を含む、項目７２に記載の方法。
［項目７６］ 前記ＳＥＣプレｍＲＮＡの前記標的化部分が、前記スキップ可能なエクソンの５’スプライス部位に対して＋６～＋５００の領域内にあり、前記スキップ可能なエクソンがエクソン８である、項目６７に記載の組成物。
［項目７７］ 前記ＡＳＯが、配列番号３９～５３又はそれらの相補配列のいずれか１つに少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、又は１００％の同一性がある配列を含む、項目７２に記載の方法。
［項目７８］ 前記ＳＥＣプレｍＲＮＡが、全長プレｍＲＮＡ又は野生型プレｍＲＮＡの部分的スプライシングにより産生される、項目５４～７７のいずれか１項に記載の組成物。
［項目７９］ 前記標的タンパク質又は機能性ＲＮＡをコードする前記ｍＲＮＡが、全長成熟ｍＲＮＡ又は野生型成熟ｍＲＮＡである、項目５４～７８のいずれか１項に記載の組成物。
［項目８０］ 産生される前記標的タンパク質が、全長タンパク質又は野生型タンパク質である、項目５４～７９のいずれか１項に記載の組成物。
［項目８１］ 前記アンチセンスオリゴマーが、ホスホロチオエート連結又はホスホロジアミデート連結を含む骨格修飾を含む、項目５４～８０のいずれか１項に記載の組成物。
［項目８２］ 前記アンチセンスオリゴマーが、アンチセンスオリゴヌクレオチドである、項目５４～８１のいずれか１項に記載の組成物。
［項目８３］ 前記アンチセンスオリゴマーが、ホスホロジアミデートモルホリノ、ロックド核酸、ペプチド核酸、２’－Ｏ－メチル、２’－フルオロ、又は２’－Ｏ－メトキシエチル部分を含む、項目５４～８２のいずれか１項に記載の組成物。
［項目８４］ 前記アンチセンスオリゴマーが、少なくとも１個の修飾糖部分を含む、項目５４～８３のいずれか１項に記載の組成物。
［項目８５］ 各糖部分が修飾糖部分である、項目８４に記載の組成物。
［項目８６］ 前記アンチセンスオリゴマーが、８～５０個の核酸塩基、８～４０個の核酸塩基、８～３５個の核酸塩基、８～３０個の核酸塩基、８～２５個の核酸塩基、８～２０個の核酸塩基、８～１５個の核酸塩基、９～５０個の核酸塩基、９～４０個の核酸塩基、９～３５個の核酸塩基、９～３０個の核酸塩基、９～２５個の核酸塩基、９～２０個の核酸塩基、９～１５個の核酸塩基、１０～５０個の核酸塩基、１０～４０個の核酸塩基、１０～３５個の核酸塩基、１０～３０個の核酸塩基、１０～２５個の核酸塩基、１０～２０個の核酸塩基、１０～１５個の核酸塩基、１１～５０個の核酸塩基、１１～４０個の核酸塩基、１１～３５個の核酸塩基、１１～３０個の核酸塩基、１１～２５個の核酸塩基、１１～２０個の核酸塩基、１１～１５個の核酸塩基、１２～５０個の核酸塩基、１２～４０個の核酸塩基、１２～３５個の核酸塩基、１２～３０個の核酸塩基、１２～２５個の核酸塩基、１２～２０個の核酸塩基、又は１２～１５個の核酸塩基から成る、項目５４～８５のいずれか１項に記載の組成物。
［項目８７］ 項目５４～８６に記載のいずれかの組成物のアンチセンスオリゴマーと、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、又は担体とを含む医薬組成物。
［項目８８］ 項目８７に記載の医薬組成物を、髄腔内注射、脳室内注射、腹腔内注射、筋肉内注射、皮下注射、又は静脈内注射で投与することによる、処置を必要とする対象を処置する方法。
［項目８９］ ＬＩＰＡ ｍＲＮＡ転写産物の標的配列にハイブリダイズするアンチセンスオリゴマーと、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、又は担体とを含む医薬組成物であって、前記ＬＩＰＡ ｍＲＮＡ転写産物はスキップされるエクソンを含み、前記アンチセンスオリゴマーは、前記ＬＩＰＡ ｍＲＮＡ転写産物からスキップされるエクソンの保持を誘導する、前記医薬組成物。
［項目９０］ 前記ＬＩＰＡ ｍＲＮＡ転写産物が、ＬＩＰＡ ＳＥＣプレｍＲＮＡ転写産物である、項目８９に記載の医薬組成物。
［項目９１］ 前記ＬＩＰＡ ＳＥＣプレｍＲＮＡ転写産物の前記標的化部分が、前記スキップ可能なエクソン内の前記スキップ可能なエクソンの５’スプライス部位に対して－４ｅから前記スキップ可能なエクソンの３’スプライス部位に対して＋２ｅまでの領域内にある、項目８９又は９０に記載の医薬組成物。
［項目９２］ 前記ＬＩＰＡ ＳＥＣプレｍＲＮＡ転写産物が、配列番号１又はその相補配列のいずれか１つに少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する遺伝子配列によりコードされる、項目８９又は９０に記載の医薬組成物。
［項目９３］ 前記ＬＩＰＡ ＳＥＣプレｍＲＮＡ転写産物が、配列番号１又はその相補配列のいずれか１つに少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する配列を含む、項目８９又は９０に記載の医薬組成物。
［項目９４］ 前記アンチセンスオリゴマーが、ホスホロチオエート連結又はホスホロジアミデート連結を含む骨格修飾を含む、項目８９に記載の医薬組成物。
［項目９５］ 前記アンチセンスオリゴマーが、アンチセンスオリゴヌクレオチドである、項目８９に記載の医薬組成物。
［項目９６］ 前記アンチセンスオリゴマーが、ホスホロジアミデートモルホリノ、ロックド核酸、ペプチド核酸、２’－Ｏ－メチル、２’－フルオロ、又は２’－Ｏ－メトキシエチル部分を含む、項目８９に記載の医薬組成物。
［項目９７］ 前記アンチセンスオリゴマーが、少なくとも１個の修飾糖部分を含む、項目８９に記載の医薬組成物。
［項目９８］ 前記アンチセンスオリゴマーが、８～５０個の核酸塩基、８～４０個の核酸塩基、８～３５個の核酸塩基、８～３０個の核酸塩基、８～２５個の核酸塩基、８～２０個の核酸塩基、８～１５個の核酸塩基、９～５０個の核酸塩基、９～４０個の核酸塩基、９～３５個の核酸塩基、９～３０個の核酸塩基、９～２５個の核酸塩基、９～２０個の核酸塩基、９～１５個の核酸塩基、１０～５０個の核酸塩基、１０～４０個の核酸塩基、１０～３５個の核酸塩基、１０～３０個の核酸塩基、１０～２５個の核酸塩基、１０～２０個の核酸塩基、１０～１５個の核酸塩基、１１～５０個の核酸塩基、１１～４０個の核酸塩基、１１～３５個の核酸塩基、１１～３０個の核酸塩基、１１～２５個の核酸塩基、１１～２０個の核酸塩基、１１～１５個の核酸塩基、１２～５０個の核酸塩基、１２～４０個の核酸塩基、１２～３５個の核酸塩基、１２～３０個の核酸塩基、１２～２５個の核酸塩基、１２～２０個の核酸塩基、又は１２～１５個の核酸塩基を含む、項目８９に記載の医薬組成物。
［項目９９ 前記アンチセンスオリゴマーが、前記ＬＩＰＡ ＳＥＣプレｍＲＮＡ転写産物の標的化部分に少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の相補性がある、項目８９又は９０に記載の医薬組成物。
［項目１００］ 前記ＬＩＰＡ ＳＥＣプレｍＲＮＡ転写産物の前記標的化部分が、配列番号２～４又はそれらの相補配列から選択される配列内にある、項目８９又は９０に記載の医薬組成物。
［項目１０１］ 前記アンチセンスオリゴマーが、配列番号５～６３又はそれらの相補配列のいずれか１つに少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性があるヌクレオチド配列を含む、項目８９に記載の医薬組成物。
［項目１０２］ 前記アンチセンスオリゴマーが、配列番号５～６３又はそれらの相補配列から選択されるヌクレオチド配列を含む、項目８９に記載の医薬組成物。
［項目１０３］ 髄腔内注射、脳室内注射、腹腔内注射、筋肉内注射、皮下注射、又は静脈内注射用に処方される、項目８９～１０２のいずれか１項に記載の医薬組成物。
［項目１０４］ ＬＡＬタンパク質の量又は活性の欠損により引き起こされる病態を有する対象を処置する方法であって、配列番号５～６３又はそれらの相補配列のいずれか１つに少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むアンチセンスオリゴマーを前記対象に投与することを含む、前記方法。
［項目１０５］ 前記対象がヒトである、項目１０４に記載の方法。

Claims (105)

  1. コレステリルエステル蓄積症（ＣＥＳＤ）の処置を必要とする対象において、対象の細胞による標的タンパク質又は機能性ＲＮＡの発現を調節することによってそれを処置する方法であって、前記細胞はスキップ可能なエクソン含有プレｍＲＮＡ（ＳＥＣプレｍＲＮＡ）を有し、前記ＳＥＣプレｍＲＮＡは、前記スキップ可能なエクソン、前記スキップ可能なエクソンの５’スプライス部位に隣接するイントロン、及び前記スキップ可能なエクソンの３’スプライス部位に隣接するイントロンを含み、前記ＳＥＣプレｍＲＮＡは前記標的タンパク質又は機能性ＲＮＡをコードし、前記方法は、前記対象の細胞を、前記標的タンパク質又は機能性ＲＮＡをコードする前記ＳＥＣプレｍＲＮＡの標的化部分に相補的なアンチセンスオリゴマー（ＡＳＯ）と接触させ、それにより、前記スキップ可能なエクソンが、前記標的タンパク質又は機能性ＲＮＡをコードする前記ＳＥＣプレｍＲＮＡからプロセシングされたｍＲＮＡに保持され、それにより、前記対象の細胞において、前記標的タンパク質又は機能性ＲＮＡをコードするｍＲＮＡのレベルを調節し、そして前記標的タンパク質又は機能性ＲＮＡの発現を調節する、ことを含む、前記方法。
  2. スキップ可能なエクソン含有プレｍＲＮＡ（ＳＥＣプレｍＲＮＡ）を有する細胞による、リソソーム酸リパーゼ（ＬＡＬ）である標的タンパク質の発現を調節する方法であって、前記ＳＥＣプレｍＲＮＡは、前記スキップ可能なエクソン、前記スキップ可能なエクソンの５’スプライス部位に隣接するイントロン、及び前記スキップ可能なエクソンの３’スプライス部位に隣接するイントロンを含み、前記ＳＥＣプレｍＲＮＡはＬＡＬタンパク質をコードし、前記方法は、前記細胞を、ＬＡＬタンパク質をコードする前記ＳＥＣプレｍＲＮＡの標的化部分に相補的なアンチセンスオリゴマー（ＡＳＯ）と接触させ、それにより、前記スキップ可能なエクソンが、ＬＡＬタンパク質をコードする前記ＳＥＣプレｍＲＮＡからプロセシングされたｍＲＮＡに保持され、それにより、前記細胞において、ＬＡＬタンパク質をコードするｍＲＮＡのレベルを調節し、そしてＬＡＬタンパク質の発現を調節する、ことを含む、前記方法。
  3. 前記標的タンパク質又は前記標的タンパク質をコードするｍＲＮＡの発現又はレベルを調節することが、前記標的タンパク質又は前記標的タンパク質をコードするｍＲＮＡの発現又はレベルを増加させる、請求項１に記載の方法。
  4. ＬＡＬタンパク質又はＬＡＬタンパク質をコードするｍＲＮＡの発現又はレベルを調節することが、ＬＡＬタンパク質又はＬＡＬタンパク質をコードするｍＲＮＡの発現又はレベルを増加させる、請求項２に記載の方法。
  5. 前記標的タンパク質がＬＡＬである、請求項１又は３に記載の方法。
  6. 前記細胞が、ＬＡＬタンパク質の量又は活性の欠損により引き起こされる病態を有する対象内にあるか又は対象由来のものである、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 前記５’スプライス部位に隣接するイントロンの＋１～＋６及び前記スキップ可能なエクソンの－３ｅ～－１ｅにある９個のヌクレオチドのうちの少なくとも１個のヌクレオチドが、少なくとも１個の変異を含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 前記変異が置換である、請求項７に記載の方法。
  9. 前記変異が－１ｅにある、請求項７記載の方法。
  10. 前記変異がｃ．８９４Ｇ＞Ａである、請求項７に記載の方法。
  11. 前記標的タンパク質の量の欠損が、常染色体劣性遺伝により引き起こされる、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。
  12. 前記対象が、機能性標的タンパク質をコードする第１の対立遺伝子及び（ａ）機能性標的タンパク質をコードする第２の対立遺伝子を有し、前記アンチセンスオリゴマーが、前記第１若しくは第２の対立遺伝子から転写されたＳＥＣプレｍＲＮＡの標的化部分に結合するか、又は前記第１の対立遺伝子及び（ｂ）第２の対立遺伝子を有し、前記アンチセンスオリゴマーが、前記第１の対立遺伝子から転写されたＳＥＣプレｍＲＮＡの標的化部分に結合する、請求項１１に記載の方法。
  13. 前記対象が、前記標的タンパク質の量又は機能の欠損によってもたらされる障害によって引き起こされる病態を有し、前記対象が、
    （ａ）第１の変異を含む第１の対立遺伝子であって、第１の変異により、
    （ｉ）前記標的タンパク質が、野生型対立遺伝子からの産生と比較して低減されたレベルで産生されるか、
    （ｉｉ）前記標的タンパク質が、同等の野生型タンパク質と比較して低減された機能を有する形態で産生されるか、又は
    （ｉｉｉ）前記標的タンパク質が産生されない、
    第１の対立遺伝子、及び
    （ｂ）第２の変異を含む第２の対立遺伝子であって、第２の変異により、
    （ｉ）前記標的タンパク質が、野生型対立遺伝子からの産生と比較して低減されたレベルで産生されるか、
    （ｉｉ）前記標的タンパク質が、同等の野生型タンパク質と比較して低減された機能を有する形態で産生されるか、又は
    （ｉｉｉ）前記標的タンパク質が産生されない、
    第２の対立遺伝子、
    を有し、前記第１及び第２の変異が同一か又は異なっている、請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。
  14. 前記標的タンパク質が、同等の野生型タンパク質と比較して低減された機能を有する形態で産生される、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記標的タンパク質が、同等の野生型タンパク質と比較して完全に機能性の形態で産生される、請求項１３に記載の方法。
  16. 前記ＳＥＣプレｍＲＮＡの前記標的化部分が、前記スキップ可能なエクソン内の前記スキップ可能なエクソンの５’スプライス部位に対して－４ｅから前記スキップ可能なエクソンの３’スプライス部位に対して＋２ｅまでの領域内にある、請求項１～１５のいずれか１項に記載の方法。
  17. 前記ＳＥＣプレｍＲＮＡの前記標的化部分が、
    （ａ）前記スキップ可能なエクソンの５’スプライス部位に隣接するイントロンの＋６～＋５００の領域内、又は
    （ｂ）前記スキップ可能なエクソンの３’スプライス部位に隣接するイントロンの－１６～－５００領域内、
    にある、請求項１～１５のいずれか１項に記載の方法。
  18. 前記ＳＥＣプレｍＲＮＡの前記標的化部分が、
    （ａ）前記スキップ可能なエクソンの５’スプライス部位に対して－４ｅ～－５００
    ｅの領域内、
    （ｂ）前記スキップ可能なエクソンの５’スプライス部位に対して＋６～＋５００の領域内、
    （ｃ）前記スキップ可能なエクソンの３’スプライス部位に対して－１６～－５００の領域内、又は
    （ｄ）前記スキップ可能なエクソンの３’スプライス部位に対して＋２ｅ～＋５００ｅの領域内、
    にある、請求項１～１５のいずれか１項に記載の方法。
  19. 前記ＳＥＣプレｍＲＮＡが、配列番号１又はその相補配列のいずれか１つに少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、又は１００％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１～１８のいずれか１項に記載の方法。
  20. 前記ＳＥＣプレｍＲＮＡが、配列番号１又はその相補配列に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、又は１００％の配列同一性を有する遺伝子配列によりコードされる、請求項１～１８のいずれか１項に記載の方法。
  21. 前記ＳＥＣプレｍＲＮＡの前記標的化部分が、配列番号２～４又はそれらの相補配列の少なくとも８個の連続した核酸を含む領域に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、又は１００％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１～２０のいずれか１項に記載の方法。
  22. 前記ＡＳＯが、配列番号５～６３又はそれらの相補配列のいずれか１つに少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、又は１００％の同一性がある配列を含む、請求項１～２１のいずれか１項に記載の方法。
  23. 前記ＳＥＣプレｍＲＮＡの前記標的化部分が、前記スキップ可能なエクソンの５’スプライス部位に対して－４ｅから前記スキップ可能なエクソンの３’スプライス部位に対して＋２ｅまでの領域内にあり、前記スキップ可能なエクソンがエクソン８である、請求項１～２２のいずれか１項に記載の方法。
  24. 前記ＡＳＯが、配列番号５４～６３又はそれらの相補配列のいずれか１つに少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、又は１００％の同一性がある配列を含む、請求項２３に記載の方法。
  25. 前記ＳＥＣプレｍＲＮＡの前記標的化部分が、前記スキップ可能なエクソンの５’スプライス部位に対して＋６～＋５００の領域内にあり、前記スキップ可能なエクソンがエクソン８である、請求項１～２２のいずれか１項に記載の方法。
  26. 前記ＡＳＯが、配列番号５～３８又はそれらの相補配列のいずれか１つに少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、又は１００％の同一性がある配列を含む、請求項２５に記載の方法。
  27. 前記ＳＥＣプレｍＲＮＡの前記標的化部分が、前記スキップ可能なエクソンの３’スプライス部位に対して－１６～－５００の領域内にあり、前記スキップ可能なエクソンがエクソン８である、請求項１～２２のいずれか１項に記載の方法。
  28. 前記ＡＳＯが、配列番号３９～５３又はそれらの相補配列のいずれか１つに少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、又は１００％の同一性がある配列を含む、請求項２７に記載の方法。
  29. 前記ＳＥＣプレｍＲＮＡが、全長プレｍＲＮＡの部分的にスプライシングされたプレｍＲＮＡであるか、又は野生型プレｍＲＮＡの部分的にスプライシングされたプレｍＲＮＡである、請求項１～２８のいずれか１項に記載の方法。
  30. 前記標的タンパク質又は機能性ＲＮＡをコードする前記ｍＲＮＡが、全長成熟ｍＲＮＡ又は野生型成熟ｍＲＮＡである、請求項１～２９のいずれか１項に記載の方法。
  31. 産生される前記標的タンパク質が、全長タンパク質若しくは野生型タンパク質、又はそれらの組合せである、請求項１～３０のいずれか１項に記載の方法。
  32. 前記アンチセンスオリゴマーと接触させた前記細胞内で産生される前記標的タンパク質又は機能性ＲＮＡをコードする前記ｍＲＮＡの総量が、対照細胞内で産生される前記標的タンパク質又は機能性ＲＮＡをコードする前記ｍＲＮＡの総量と比較して、約１．１～約１０倍、約１．５～約１０倍、約２～約１０倍、約３～約１０倍、約４～約１０倍、約１．１～約５倍、約１．１～約６倍、約１．１～約７倍、約１．１～約８倍、約１．１～約９倍、約２～約５倍、約２～約６倍、約２～約７倍、約２～約８倍、約２～約９倍、約３～約６倍、約３～約７倍、約３～約８倍、約３～約９倍、約４～約７倍、約４～約８倍、約４～約９倍、少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、又は少なくとも約１０倍増加する、請求項１～３１のいずれか１項に記載の方法。
  33. 前記アンチセンスオリゴマーと接触させた前記細胞内で産生される前記標的タンパク質又は機能性ＲＮＡをコードする前記ｍＲＮＡの総量が、対照細胞内で産生される前記標的タンパク質又は機能性ＲＮＡをコードする前記ｍＲＮＡの総量と比較して、約２０％～約３００％、約５０％～約３００％、約１００％～約３００％、約１５０％～約３００％、約２０％～約５０％、約２０％～約１００％、約２０％～約１５０％、約２０％～約２００％、約２０％～約２５０％、約５０％～約１００％、約５０％～約１５０％、約５０％～約２００％、約５０％～約２５０％、約１００％～約１５０％、約１００％～約２００％、約１００％～約２５０％、約１５０％～約２００％、約１５０％～約２５０％、約２００％～約２５０％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約５０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１５０％、少なくとも約２００％、少なくとも約２５０％、又は少なくとも約３００％増加する、請求項１～３１のいずれか１項に記載の方法。
  34. 前記アンチセンスオリゴマーと接触させた前記細胞により産生される標的タンパク質の総量が、対照細胞により産生される標的タンパク質の総量と比較して、約１．１～約１０倍、約１．５～約１０倍、約２～約１０倍、約３～約１０倍、約４～約１０倍、約１．１～約５倍、約１．１～約６倍、約１．１～約７倍、約１．１～約８倍、約１．１～約９倍、約２～約５倍、約２～約６倍、約２～約７倍、約２～約８倍、約２～約９倍、約３～約６倍、約３～約７倍、約３～約８倍、約３～約９倍、約４～約７倍、約４～約８倍、約４～約９倍、少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、又は少なくとも約１０倍増加する、請求項１～３３のいずれか１項に記載の方法。
  35. 前記アンチセンスオリゴマーと接触させた前記細胞により産生される標的タンパク質の総量が、対照細胞により産生される標的タンパク質の総量と比較して、約２０％～約３００％、約５０％～約３００％、約１００％～約３００％、約１５０％～約３００％、約２
    ０％～約５０％、約２０％～約１００％、約２０％～約１５０％、約２０％～約２００％、約２０％～約２５０％、約５０％～約１００％、約５０％～約１５０％、約５０％～約２００％、約５０％～約２５０％、約１００％～約１５０％、約１００％～約２００％、約１００％～約２５０％、約１５０％～約２００％、約１５０％～約２５０％、約２００％～約２５０％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約５０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１５０％、少なくとも約２００％、少なくとも約２５０％、又は少なくとも約３００％増加する、請求項１～３３のいずれか１項に記載の方法。
  36. 前記アンチセンスオリゴマーが、ホスホロチオエート連結又はホスホロジアミデート連結を含む骨格修飾を含む、請求項１～３５のいずれか１項に記載の方法。
  37. 前記アンチセンスオリゴマーが、ホスホロジアミデートモルホリノ、ロックド核酸、ペプチド核酸、２’－Ｏ－メチル、２’－フルオロ、又は２’－Ｏ－メトキシエチル部分を含む、請求項１～３６のいずれか１項に記載の方法。
  38. 前記アンチセンスオリゴマーが、少なくとも１個の修飾糖部分を含む、請求項１～３７のいずれか１項に記載の方法。
  39. 各糖部分が修飾糖部分である、請求項３８に記載の方法。
  40. 前記アンチセンスオリゴマーが、８～５０個の核酸塩基、８～４０個の核酸塩基、８～３５個の核酸塩基、８～３０個の核酸塩基、８～２５個の核酸塩基、８～２０個の核酸塩基、８～１５個の核酸塩基、９～５０個の核酸塩基、９～４０個の核酸塩基、９～３５個の核酸塩基、９～３０個の核酸塩基、９～２５個の核酸塩基、９～２０個の核酸塩基、９～１５個の核酸塩基、１０～５０個の核酸塩基、１０～４０個の核酸塩基、１０～３５個の核酸塩基、１０～３０個の核酸塩基、１０～２５個の核酸塩基、１０～２０個の核酸塩基、１０～１５個の核酸塩基、１１～５０個の核酸塩基、１１～４０個の核酸塩基、１１～３５個の核酸塩基、１１～３０個の核酸塩基、１１～２５個の核酸塩基、１１～２０個の核酸塩基、１１～１５個の核酸塩基、１２～５０個の核酸塩基、１２～４０個の核酸塩基、１２～３５個の核酸塩基、１２～３０個の核酸塩基、１２～２５個の核酸塩基、１２～２０個の核酸塩基、又は１２～１５個の核酸塩基から成る、請求項１～３９のいずれか１項に記載の方法。
  41. 前記アンチセンスオリゴマーが、前記タンパク質をコードする前記ＳＥＣプレｍＲＮＡの前記標的化部分に少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の相補性がある、請求項１～４０のいずれか１項に記載の方法。
  42. ＬＩＰＡタンパク質発現を評価することを更に含む、請求項１～４１のいずれか１項に記載の方法。
  43. ＣＥＳＤが処置され、前記アンチセンスオリゴマーがＬＩＰＡ ＳＥＣプレｍＲＮＡの標的化部分に結合し、前記標的化部分が配列番号２～４又はそれらの相補配列の少なくとも８個の連続した核酸を含む、請求項１～４２のいずれか１項に記載の方法。
  44. 前記対象がヒトである、請求項１～４３のいずれか１項に記載の方法。
  45. 前記対象が非ヒト動物である、請求項１～４４のいずれか１項に記載の方法。
  46. 前記対象が、胎児、胚、又は小児である、請求項１～４５のいずれか１項に記載の方法
    。
  47. 前記細胞をｅｘ ｖｉｖｏで接触させる、請求項１～４６のいずれか１項に記載の方法。
  48. 前記アンチセンスオリゴマーが、前記対象への髄腔内注射、脳室内注射、腹腔内注射、筋肉内注射、皮下注射、又は静脈内注射により投与される、請求項１～４７のいずれか１項に記載の方法。
  49. 前記イントロンの－１５～－１及び前記３’スプライス部位に隣接する前記スキップ可能なエクソンの＋１ｅにある１６個のヌクレオチドが、対応する野生型配列と同一であり、前記イントロンがイントロン７であり、前記スキップ可能なエクソンがエクソン８である、請求項１～４８のいずれか１項に記載の方法。
  50. 請求項１～４９のいずれか１項に記載の方法に使用される、アンチセンスオリゴマー。
  51. 配列番号５～６３又はそれらの相補配列のいずれか１つに少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、又は１００％の配列同一性を有する配列を含む、アンチセンスオリゴマー。
  52. 請求項５０又は５１に記載のアンチセンスオリゴマーと、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、又は担体とを含む医薬組成物。
  53. 請求項５２に記載の医薬組成物を、髄腔内注射、脳室内注射、腹腔内注射、筋肉内注射、皮下注射、又は静脈内注射で投与することによる、処置を必要とする対象を処置する方法。
  54. 欠損タンパク質又は欠損機能性ＲＮＡに関連するコレステリルエステル蓄積症（ＣＥＳＤ）を処置する必要がある対象においてそれを処置するための、細胞による標的タンパク質又は機能性ＲＮＡの発現を調節する方法に使用するためのアンチセンスオリゴマーを含む組成物であって、前記欠損タンパク質又は欠損機能性ＲＮＡは、前記対象において量又は活性が欠損しており、前記アンチセンスオリゴマーは、前記標的タンパク質又は前記機能性ＲＮＡをコードするスキップ可能なエクソン含有プレｍＲＮＡ（ＳＥＣプレｍＲＮＡ）からのエクソンの除去を低減させ、前記標的タンパク質は前記欠損タンパク質であり、前記機能性ＲＮＡは前記欠損ＲＮＡであり、前記ＳＥＣプレｍＲＮＡは、前記スキップ可能なエクソン、前記スキップ可能なエクソンの５’スプライス部位に隣接するイントロン、及び前記スキップ可能なエクソンの３’スプライス部位に隣接するイントロンを含み、前記スキップ可能なエクソンは、前記標的タンパク質又は前記機能性ＲＮＡをコードする前記ＳＥＣプレｍＲＮＡからプロセシングされたｍＲＮＡに保持され、それにより、前記対象において前記標的タンパク質又は前記機能性ＲＮＡの産生又は活性を調節する、前記組成物。
  55. リソソーム酸リパーゼ（ＬＡＬ）タンパク質に関連する病態を処置する必要がある対象においてそれを処置する方法に使用するためのアンチセンスオリゴマーを含む組成物であって、前記方法は前記対象の細胞によるＬＡＬタンパク質の発現を調節することを含み、前記細胞は、スキップ可能なエクソン、前記スキップ可能なエクソンの５’スプライス部位に隣接するイントロン、前記スキップ可能なエクソンの３’スプライス部位に隣接するイントロンを含む前記スキップ可能なエクソン含有プレｍＲＮＡ（ＳＥＣプレｍＲＮＡ）を有し、前記ＳＥＣプレｍＲＮＡは前記ＬＡＬタンパク質をコードし、前記方法は、前記細胞を前記アンチセンスオリゴマーと接触させ、それにより、前記スキップ可能なエクソ
    ンが、ＬＡＬタンパク質をコードする前記ＳＥＣプレｍＲＮＡ転写産物からプロセシングされたｍＲＮＡに保持され、それにより、前記対象の前記細胞において、ＬＡＬタンパク質をコードするｍＲＮＡのレベルを調節し、そしてＬＡＬタンパク質の発現を調節する、ことを含む、前記組成物。
  56. 前記標的タンパク質又は前記標的タンパク質をコードするｍＲＮＡの活性、発現、及び／又は産生を調節することが、前記標的タンパク質又は前記標的タンパク質をコードするｍＲＮＡの活性、発現、及び／又は産生を増加させる、請求項５４に記載の組成物。
  57. ＬＡＬタンパク質又はＬＡＬタンパク質をコードするｍＲＮＡの活性、発現、及び／又は産生を調節することが、ＬＡＬタンパク質又はＬＡＬタンパク質をコードするｍＲＮＡの活性、発現、及び／又は産生を増加させる、請求項５４に記載の組成物。
  58. 前記標的タンパク質がＬＡＬである、請求項５４又は５６に記載の組成物。
  59. 前記病態が疾患又は障害である、請求項５５に記載の組成物。
  60. 前記疾患又は障害がＣＥＳＤである、請求項５９に記載の組成物。
  61. 前記標的タンパク質及びＳＥＣプレｍＲＮＡが、ＬＩＰＡ遺伝子によりコードされる、請求項６０に記載の組成物。
  62. 前記ＡＳＯが、前記スキップ可能なエクソン内の前記スキップ可能なエクソンの５’スプライス部位に対して－４ｅから前記スキップ可能なエクソンの３’スプライス部位に対して＋２ｅまでの領域内にある前記ＳＥＣプレｍＲＮＡの部分を標的にする、請求項５４～６１のいずれか１項に記載の組成物。
  63. 前記アンチセンスオリゴマーが、前記スキップ可能なエクソン内の、
    （ａ）前記スキップ可能なエクソンの５’スプライス部位に対して＋６～＋５００の領域内、又は
    （ｂ）前記スキップ可能なエクソンの３’スプライス部位に対して－１６～－５００の領域内、
    にある前記ＳＥＣプレｍＲＮＡの部分を標的にする、請求項５４～６１のいずれか１項に記載の組成物。
  64. 前記アンチセンスオリゴマーが、前記スキップ可能なエクソンの５’スプライス部位の約１００ヌクレオチド下流から前記スキップ可能なエクソンの３’スプライス部位の約１００ヌクレオチド上流までの領域内にある前記ＳＥＣプレｍＲＮＡの部分を標的にする、請求項５４～６１のいずれか１項に記載の組成物。
  65. 前記ＳＥＣプレｍＲＮＡの前記標的化部分が、
    （ａ）前記スキップ可能なエクソンの５’スプライス部位に隣接するイントロンの＋６～＋５００の領域内、又は
    （ｂ）前記スキップ可能なエクソンの３’スプライス部位に隣接するエクソンの－１６～－５００の領域内、
    にある、請求項５４～６１のいずれか１項に記載の組成物。
  66. 前記ＳＥＣプレｍＲＮＡの前記標的化部分が、
    （ａ）前記スキップ可能なエクソンの５’スプライス部位に対して－４ｅ～－５００ｅの領域内、
    （ｂ）前記スキップ可能なエクソンの５’スプライス部位に対して＋６～＋５００の領域内、
    （ｃ）前記スキップ可能なエクソンの３’スプライス部位に対して－１６～－５００の領域内、又は
    （ｄ）前記スキップ可能なエクソンの３’スプライス部位に対して＋２ｅ～＋５００ｅの領域内
    にある、請求項５４～６１のいずれか１項に記載の組成物。
  67. 前記標的タンパク質がＬＡＬである、請求項５４～６１のいずれか１項に記載の組成物。
  68. 前記ＳＥＣプレｍＲＮＡが、配列番号１又はその相補配列のいずれか１つに少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、又は１００％の配列同一性を有する配列を含む、請求項６７に記載の組成物。
  69. 前記ＳＥＣプレｍＲＮＡが、配列番号１又はその相補配列に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、又は１００％の配列同一性を有する遺伝子配列によりコードされる、請求項６７に記載の組成物。
  70. 前記ＳＥＣプレｍＲＮＡの前記標的化部分が、配列番号２～４又はそれらの相補配列の少なくとも８個の連続した核酸を含む領域に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、又は１００％の配列同一性を有する配列を含む、請求項６７に記載の組成物。
  71. 前記ＡＳＯが、配列番号５～６３又はそれらの相補配列のいずれか１つに少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、又は１００％の同一性がある配列を含む、請求項６７に記載の組成物。
  72. 前記ＳＥＣプレｍＲＮＡの前記標的化部分が、前記スキップ可能なエクソンの５’スプライス部位に対して－４ｅから前記スキップ可能なエクソンの３’スプライス部位に対して＋２ｅまでの領域内にあり、前記スキップ可能なエクソンがエクソン８である、請求項６７に記載の組成物。
  73. 前記ＡＳＯが、配列番号５４～６３又はそれらの相補配列のいずれか１つに少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、又は１００％の同一性がある配列を含む、請求項７２に記載の方法。
  74. 前記ＳＥＣプレｍＲＮＡの前記標的化部分が、前記スキップ可能なエクソンの３’スプライス部位に対して－１６～－５００の領域内にあり、前記スキップ可能なエクソンがエクソン８である、請求項６７に記載の組成物。
  75. 前記ＡＳＯが、配列番号５～３８又はそれらの相補配列のいずれか１つに少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、又は１００％の同一性がある配列を含む、請求項７２に記載の方法。
  76. 前記ＳＥＣプレｍＲＮＡの前記標的化部分が、前記スキップ可能なエクソンの５’スプライス部位に対して＋６～＋５００の領域内にあり、前記スキップ可能なエクソンがエクソン８である、請求項６７に記載の組成物。
  77. 前記ＡＳＯが、配列番号３９～５３又はそれらの相補配列のいずれか１つに少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、又は１００％の同一性がある配列を含む、
    請求項７２に記載の方法。
  78. 前記ＳＥＣプレｍＲＮＡが、全長プレｍＲＮＡ又は野生型プレｍＲＮＡの部分的スプライシングにより産生される、請求項５４～７７のいずれか１項に記載の組成物。
  79. 前記標的タンパク質又は機能性ＲＮＡをコードする前記ｍＲＮＡが、全長成熟ｍＲＮＡ又は野生型成熟ｍＲＮＡである、請求項５４～７８のいずれか１項に記載の組成物。
  80. 産生される前記標的タンパク質が、全長タンパク質又は野生型タンパク質である、請求項５４～７９のいずれか１項に記載の組成物。
  81. 前記アンチセンスオリゴマーが、ホスホロチオエート連結又はホスホロジアミデート連結を含む骨格修飾を含む、請求項５４～８０のいずれか１項に記載の組成物。
  82. 前記アンチセンスオリゴマーが、アンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項５４～８１のいずれか１項に記載の組成物。
  83. 前記アンチセンスオリゴマーが、ホスホロジアミデートモルホリノ、ロックド核酸、ペプチド核酸、２’－Ｏ－メチル、２’－フルオロ、又は２’－Ｏ－メトキシエチル部分を含む、請求項５４～８２のいずれか１項に記載の組成物。
  84. 前記アンチセンスオリゴマーが、少なくとも１個の修飾糖部分を含む、請求項５４～８３のいずれか１項に記載の組成物。
  85. 各糖部分が修飾糖部分である、請求項８４に記載の組成物。
  86. 前記アンチセンスオリゴマーが、８～５０個の核酸塩基、８～４０個の核酸塩基、８～３５個の核酸塩基、８～３０個の核酸塩基、８～２５個の核酸塩基、８～２０個の核酸塩基、８～１５個の核酸塩基、９～５０個の核酸塩基、９～４０個の核酸塩基、９～３５個の核酸塩基、９～３０個の核酸塩基、９～２５個の核酸塩基、９～２０個の核酸塩基、９～１５個の核酸塩基、１０～５０個の核酸塩基、１０～４０個の核酸塩基、１０～３５個の核酸塩基、１０～３０個の核酸塩基、１０～２５個の核酸塩基、１０～２０個の核酸塩基、１０～１５個の核酸塩基、１１～５０個の核酸塩基、１１～４０個の核酸塩基、１１～３５個の核酸塩基、１１～３０個の核酸塩基、１１～２５個の核酸塩基、１１～２０個の核酸塩基、１１～１５個の核酸塩基、１２～５０個の核酸塩基、１２～４０個の核酸塩基、１２～３５個の核酸塩基、１２～３０個の核酸塩基、１２～２５個の核酸塩基、１２～２０個の核酸塩基、又は１２～１５個の核酸塩基から成る、請求項５４～８５のいずれか１項に記載の組成物。
  87. 請求項５４～８６に記載のいずれかの組成物のアンチセンスオリゴマーと、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、又は担体とを含む医薬組成物。
  88. 請求項８７に記載の医薬組成物を、髄腔内注射、脳室内注射、腹腔内注射、筋肉内注射、皮下注射、又は静脈内注射で投与することによる、処置を必要とする対象を処置する方法。
  89. ＬＩＰＡ ｍＲＮＡ転写産物の標的配列にハイブリダイズするアンチセンスオリゴマーと、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、又は担体とを含む医薬組成物であって、前記ＬＩＰＡ ｍＲＮＡ転写産物はスキップされるエクソンを含み、前記アンチセンスオリゴマーは、前記ＬＩＰＡ ｍＲＮＡ転写産物からスキップされるエクソンの保持を誘導する、
    前記医薬組成物。
  90. 前記ＬＩＰＡ ｍＲＮＡ転写産物が、ＬＩＰＡ ＳＥＣプレｍＲＮＡ転写産物である、請求項８９に記載の医薬組成物。
  91. 前記ＬＩＰＡ ＳＥＣプレｍＲＮＡ転写産物の前記標的化部分が、前記スキップ可能なエクソン内の前記スキップ可能なエクソンの５’スプライス部位に対して－４ｅから前記スキップ可能なエクソンの３’スプライス部位に対して＋２ｅまでの領域内にある、請求項８９又は９０に記載の医薬組成物。
  92. 前記ＬＩＰＡ ＳＥＣプレｍＲＮＡ転写産物が、配列番号１又はその相補配列のいずれか１つに少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する遺伝子配列によりコードされる、請求項８９又は９０に記載の医薬組成物。
  93. 前記ＬＩＰＡ ＳＥＣプレｍＲＮＡ転写産物が、配列番号１又はその相補配列のいずれか１つに少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する配列を含む、請求項８９又は９０に記載の医薬組成物。
  94. 前記アンチセンスオリゴマーが、ホスホロチオエート連結又はホスホロジアミデート連結を含む骨格修飾を含む、請求項８９に記載の医薬組成物。
  95. 前記アンチセンスオリゴマーが、アンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項８９に記載の医薬組成物。
  96. 前記アンチセンスオリゴマーが、ホスホロジアミデートモルホリノ、ロックド核酸、ペプチド核酸、２’－Ｏ－メチル、２’－フルオロ、又は２’－Ｏ－メトキシエチル部分を含む、請求項８９に記載の医薬組成物。
  97. 前記アンチセンスオリゴマーが、少なくとも１個の修飾糖部分を含む、請求項８９に記載の医薬組成物。
  98. 前記アンチセンスオリゴマーが、８～５０個の核酸塩基、８～４０個の核酸塩基、８～３５個の核酸塩基、８～３０個の核酸塩基、８～２５個の核酸塩基、８～２０個の核酸塩基、８～１５個の核酸塩基、９～５０個の核酸塩基、９～４０個の核酸塩基、９～３５個の核酸塩基、９～３０個の核酸塩基、９～２５個の核酸塩基、９～２０個の核酸塩基、９～１５個の核酸塩基、１０～５０個の核酸塩基、１０～４０個の核酸塩基、１０～３５個の核酸塩基、１０～３０個の核酸塩基、１０～２５個の核酸塩基、１０～２０個の核酸塩基、１０～１５個の核酸塩基、１１～５０個の核酸塩基、１１～４０個の核酸塩基、１１～３５個の核酸塩基、１１～３０個の核酸塩基、１１～２５個の核酸塩基、１１～２０個の核酸塩基、１１～１５個の核酸塩基、１２～５０個の核酸塩基、１２～４０個の核酸塩基、１２～３５個の核酸塩基、１２～３０個の核酸塩基、１２～２５個の核酸塩基、１２～２０個の核酸塩基、又は１２～１５個の核酸塩基を含む、請求項８９に記載の医薬組成物。
  99. 前記アンチセンスオリゴマーが、前記ＬＩＰＡ ＳＥＣプレｍＲＮＡ転写産物の標的化部分に少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の相補性がある、請求項８９又は９０に記載の医薬組成物。
  100. 前記ＬＩＰＡ ＳＥＣプレｍＲＮＡ転写産物の前記標的化部分が、配列番号２～４又はそれらの相補配列から選択される配列内にある、請求項８９又は９０に記載の医薬組成物。
  101. 前記アンチセンスオリゴマーが、配列番号５～６３又はそれらの相補配列のいずれか１つに少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性があるヌクレオチド配列を含む、請求項８９に記載の医薬組成物。
  102. 前記アンチセンスオリゴマーが、配列番号５～６３又はそれらの相補配列から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項８９に記載の医薬組成物。
  103. 髄腔内注射、脳室内注射、腹腔内注射、筋肉内注射、皮下注射、又は静脈内注射用に処方される、請求項８９～１０２のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  104. ＬＡＬタンパク質の量又は活性の欠損により引き起こされる病態を有する対象を処置する方法であって、配列番号５～６３又はそれらの相補配列のいずれか１つに少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むアンチセンスオリゴマーを前記対象に投与することを含む、前記方法。
  105. 前記対象がヒトである、請求項１０４に記載の方法。
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