KR20210134003A - 병태 및 질환의 치료를 위한 안티센스 올리고머 - Google Patents

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KR20210134003A
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스톡 테라퓨틱스, 인크.
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Abstract

SCN1A 유전자에서의 선택적 스플라이싱 이벤트는 비생산적 mRNA 전사체를 초래하여 결국 비정상적 단백질 발현으로 이어질 수 있으며, SCN1A 유전자에서의 선택적 스플라이싱 이벤트를 표적화할 수 있는 치료제는 드라벳 증후군 환자에서 기능성 단백질의 발현 수준을 조절하고/하거나 비정상적 단백질 발현을 억제할 수 있다. 이러한 치료제는 SCN1A, SCN8A 또는 SCN5A 단백질 결핍에 의해 유발된 병태를 치료하는 데 사용될 수 있다.

Description

병태 및 질환의 치료를 위한 안티센스 올리고머
상호 참조
본 출원은 2019년 2월 27일에 출원된 미국 가출원 제62/811,511호의 이익을 특허청구한 것이며, 상기 가출원은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
신경계 장애는 종종 뉴런 흥분성, 뉴런 상호작용 및 전체적인 뇌 기능을 매개하는 이온 통로의 기능 장애를 특징으로 하는 이온통로병증(channelopathy)과 관련된다. 뉴런 전압 개폐 나트륨 통로의 알파 세공 형성 서브유닛을 코딩하는 SCN1A-SCN2A-SCN3A 유전자 클러스터의 일부분인 SCN1A 유전자에서의 돌연변이는 드라벳 증후군(DS)과 같은 질환 및 병태의 질환 수의 발달과 관련된다(Miller, et al., 1993-2015, GeneReviews, Eds. Pagon RA, et al. Seattle (WA): University of Washington, Seattle, Bookshelf ID: NBK1318, and Mulley, et al., 2005, Hum. Mutat. 25: 535-542).
개요
소정 실시양태에서, SCN1A 단백질을 코딩하고 넌센스 매개 RNA 붕괴 유도 엑손(non-sense mediated RNA decay-inducing exon)을 함유하는 mRNA(NMD 엑손 mRNA)를 갖는 세포에서 SCN1A 단백질의 발현을 조절하는 방법으로서, 치료제를 세포에 접촉시키는 단계를 포함하고, 이에 의해 치료제는 SCN1A 단백질을 코딩하는 NMD 엑손 mRNA로부터 NMD 엑손의 스플라이싱을 조절하며, 이로써 세포에서 SCN1A 단백질을 코딩하는 프로세싱된 mRNA의 수준을 조절하고 SCN1A 단백질의 발현을 조절하며, 여기서 치료제는 SCN1A를 코딩하는 NMD 엑손 mRNA의 표적화된 부분에 결합하고, 표적화된 부분은 NMD 유도 엑손(NIE)의 5' 말단으로부터의 상류 약 1000개 뉴클레오티드 내지 NIE의 5' 말단으로부터의 상류 약 100개 뉴클레오티드; 또는 NIE의 3' 말단의 하류 약 100개 뉴클레오티드 내지 NIE의 3' 말단의 하류 약 1000개 뉴클레오티드인 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 치료제는 표적화된 부분의 영역으로부터 NMD 엑손의 스플라이싱에 관여하는 인자의 결합을 방해한다. 일부 실시양태에서, 표적화된 부분은 NIE의 5' 말단의 상류 최대 약 800개 뉴클레오티드, 약 700개 뉴클레오티드, 약 600개 뉴클레오티드, 약 500개 뉴클레오티드, 약 400개 뉴클레오티드, 약 300개 뉴클레오티드, 약 200개 뉴클레오티드, 약 100개 뉴클레오티드, 약 80개 뉴클레오티드, 약 70개 뉴클레오티드, 약 60개 뉴클레오티드, 약 50개 뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 표적화된 부분은 NIE의 5' 말단의 상류 적어도 약 800개 뉴클레오티드, 약 700개 뉴클레오티드, 약 600개 뉴클레오티드, 약 500개 뉴클레오티드, 약 400개 뉴클레오티드, 약 300개 뉴클레오티드, 약 200개 뉴클레오티드, 약 100개 뉴클레오티드, 약 80개 뉴클레오티드, 약 70개 뉴클레오티드, 약 60개 뉴클레오티드, 약 50개 뉴클레오티드, 약 40개 뉴클레오티드, 약 30개 뉴클레오티드, 약 20개 뉴클레오티드, 약 10개 뉴클레오티드, 약 5개 뉴클레오티드, 약 4개 뉴클레오티드, 약 2개 뉴클레오티드, 약 1개 뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 표적화된 부분은 NIE의 3' 말단의 하류 최대 약 800개 뉴클레오티드, 약 700개 뉴클레오티드, 약 600개 뉴클레오티드, 약 500개 뉴클레오티드, 약 400개 뉴클레오티드, 약 300개 뉴클레오티드, 약 200개 뉴클레오티드, 약 100개 뉴클레오티드, 약 80개 뉴클레오티드, 약 70개 뉴클레오티드, 약 60개 뉴클레오티드, 약 50개 뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 표적화된 부분은 NIE의 3' 말단의 하류 적어도 약 800개 뉴클레오티드, 약 700개 뉴클레오티드, 약 600개 뉴클레오티드, 약 500개 뉴클레오티드, 약 400개 뉴클레오티드, 약 300개 뉴클레오티드, 약 200개 뉴클레오티드, 약 100개 뉴클레오티드, 약 80개 뉴클레오티드, 약 70개 뉴클레오티드, 약 60개 뉴클레오티드, 약 50개 뉴클레오티드, 약 40개 뉴클레오티드, 약 30개 뉴클레오티드, 약 20개 뉴클레오티드, 약 10개 뉴클레오티드, 약 5개 뉴클레오티드, 약 4개 뉴클레오티드, 약 2개 뉴클레오티드, 약 1개 뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 치료제는 안티센스 올리고머(ASO)이다. 일부 실시양태에서, ASO는 서열번호 12 내지 731 중 어느 하나와 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 97% 또는 100% 동일성인 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 치료제는 SCN1A 단백질을 코딩하는 프로세싱된 mRNA로부터 NMD 엑손의 배제를 촉진한다. 일부 실시양태에서, 치료제와 접촉된 세포에서 SCN1A 단백질을 코딩하는 프로세싱된 mRNA로부터 NMD 엑손의 배제는 대조군 세포에서 SCN1A 단백질을 코딩하는 프로세싱된 mRNA로부터 NMD 엑손의 배제와 비교하여 약 1.1 내지 약 10배, 약 1.5 내지 약 10배, 약 2 내지 약 10배, 약 3 내지 약 10배, 약 4 내지 약 10배, 약 1.1 내지 약 5배, 약 1.1 내지 약 6배, 약 1.1 내지 약 7배, 약 1.1 내지 약 8배, 약 1.1 내지 약 9배, 약 2 내지 약 5배, 약 2 내지 약 6배, 약 2 내지 약 7배, 약 2 내지 약 8배, 약 2 내지 약 9배, 약 3 내지 약 6배, 약 3 내지 약 7배, 약 3 내지 약 8배, 약 3 내지 약 9배, 약 4 내지 약 7배, 약 4 내지 약 8배, 약 4 내지 약 9배, 적어도 약 1.1배, 적어도 약 1.5배, 적어도 약 2배, 적어도 약 2.5배, 적어도 약 3배, 적어도 약 3.5배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배 또는 적어도 약 10배 증가된다. 일부 실시양태에서, 치료제는 세포에서 SCN1A 단백질을 코딩하는 프로세싱된 mRNA의 수준을 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 치료제와 접촉된 세포에서 SCN1A 단백질을 코딩하는 프로세싱된 mRNA의 양은 대조군 세포에서 SCN1A 단백질을 코딩하는 프로세싱된 mRNA의 총량과 비교하여 약 1.1 내지 약 10배, 약 1.5 내지 약 10배, 약 2 내지 약 10배, 약 3 내지 약 10배, 약 4 내지 약 10배, 약 1.1 내지 약 5배, 약 1.1 내지 약 6배, 약 1.1 내지 약 7배, 약 1.1 내지 약 8배, 약 1.1 내지 약 9배, 약 2 내지 약 5배, 약 2 내지 약 6배, 약 2 내지 약 7배, 약 2 내지 약 8배, 약 2 내지 약 9배, 약 3 내지 약 6배, 약 3 내지 약 7배, 약 3 내지 약 8배, 약 3 내지 약 9배, 약 4 내지 약 7배, 약 4 내지 약 8배, 약 4 내지 약 9배, 적어도 약 1.1배, 적어도 약 1.5배, 적어도 약 2배, 적어도 약 2.5배, 적어도 약 3배, 적어도 약 3.5배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배 또는 적어도 약 10배 증가된다.
소정 실시양태에서, 치료를 필요로 하는 대상체의 세포에서 SCN1A 단백질의 발현을 조절함으로써 대상체에서 질환 또는 병태를 치료하는 방법으로서, 대상체의 세포를 넌센스 매개 mRNA 붕괴 유도 엑손(NMD 엑손)을 함유하고 SCN1A를 코딩하는 세포에서의 mRNA로부터 NMD 엑손의 스플라이싱을 조절하는 치료제와 접촉시키는 단계를 포함하고, 이로써 대상체의 세포에서 SCN1A 단백질을 코딩하는 프로세싱된 mRNA의 수준을 조절하고 SCN1A 단백질의 발현을 조절하며, 여기서 치료제는 SCN1A를 코딩하는 NMD 엑손 mRNA의 표적화된 부분에 결합하고, 표적화된 부분은 NMD 유도 엑손(NIE)의 5' 말단으로부터의 상류 약 1000개 뉴클레오티드 내지 NIE의 5' 말단으로부터의 상류 약 100개 뉴클레오티드; 또는 NIE의 3' 말단의 하류 약 100개 뉴클레오티드 내지 NIE의 3' 말단의 하류 약 1000개 뉴클레오티드인 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 치료제는 표적화된 부분의 영역으로부터 NMD 엑손의 스플라이싱에 관여하는 인자의 결합을 방해한다. 일부 실시양태에서, 표적화된 부분은 NIE의 5' 말단의 상류 최대 약 800개 뉴클레오티드, 약 700개 뉴클레오티드, 약 600개 뉴클레오티드, 약 500개 뉴클레오티드, 약 400개 뉴클레오티드, 약 300개 뉴클레오티드, 약 200개 뉴클레오티드, 약 100개 뉴클레오티드, 약 80개 뉴클레오티드, 약 70개 뉴클레오티드, 약 60개 뉴클레오티드, 약 50개 뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 표적화된 부분은 NIE의 5' 말단의 상류 적어도 약 800개 뉴클레오티드, 약 700개 뉴클레오티드, 약 600개 뉴클레오티드, 약 500개 뉴클레오티드, 약 400개 뉴클레오티드, 약 300개 뉴클레오티드, 약 200개 뉴클레오티드, 약 100개 뉴클레오티드, 약 80개 뉴클레오티드, 약 70개 뉴클레오티드, 약 60개 뉴클레오티드, 약 50개 뉴클레오티드, 약 40개 뉴클레오티드, 약 30개 뉴클레오티드, 약 20개 뉴클레오티드, 약 10개 뉴클레오티드, 약 5개 뉴클레오티드, 약 4개 뉴클레오티드, 약 2개 뉴클레오티드, 약 1개 뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 표적화된 부분은 NIE의 3' 말단의 하류 최대 약 800개 뉴클레오티드, 약 700개 뉴클레오티드, 약 600개 뉴클레오티드, 약 500개 뉴클레오티드, 약 400개 뉴클레오티드, 약 300개 뉴클레오티드, 약 200개 뉴클레오티드, 약 100개 뉴클레오티드, 약 80개 뉴클레오티드, 약 70개 뉴클레오티드, 약 60개 뉴클레오티드, 약 50개 뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 표적화된 부분은 NIE의 3' 말단의 하류 적어도 약 800개 뉴클레오티드, 약 700개 뉴클레오티드, 약 600개 뉴클레오티드, 약 500개 뉴클레오티드, 약 400개 뉴클레오티드, 약 300개 뉴클레오티드, 약 200개 뉴클레오티드, 약 100개 뉴클레오티드, 약 80개 뉴클레오티드, 약 70개 뉴클레오티드, 약 60개 뉴클레오티드, 약 50개 뉴클레오티드, 약 40개 뉴클레오티드, 약 30개 뉴클레오티드, 약 20개 뉴클레오티드, 약 10개 뉴클레오티드, 약 5개 뉴클레오티드, 약 4개 뉴클레오티드, 약 2개 뉴클레오티드, 약 1개 뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 치료제는 안티센스 올리고머(ASO)이다. 일부 실시양태에서, ASO는 서열번호 12 내지 731 중 어느 하나와 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 97% 또는 100% 동일성인 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 치료제는 SCN1A 단백질을 코딩하는 프로세싱된 mRNA로부터 NMD 엑손의 배제를 촉진한다. 일부 실시양태에서, 치료제와 접촉된 세포에서 SCN1A 단백질을 코딩하는 프로세싱된 mRNA로부터 NMD 엑손의 배제는 대조군 세포에서 SCN1A 단백질을 코딩하는 프로세싱된 mRNA로부터 NMD 엑손의 배제와 비교하여 약 1.1 내지 약 10배, 약 1.5 내지 약 10배, 약 2 내지 약 10배, 약 3 내지 약 10배, 약 4 내지 약 10배, 약 1.1 내지 약 5배, 약 1.1 내지 약 6배, 약 1.1 내지 약 7배, 약 1.1 내지 약 8배, 약 1.1 내지 약 9배, 약 2 내지 약 5배, 약 2 내지 약 6배, 약 2 내지 약 7배, 약 2 내지 약 8배, 약 2 내지 약 9배, 약 3 내지 약 6배, 약 3 내지 약 7배, 약 3 내지 약 8배, 약 3 내지 약 9배, 약 4 내지 약 7배, 약 4 내지 약 8배, 약 4 내지 약 9배, 적어도 약 1.1배, 적어도 약 1.5배, 적어도 약 2배, 적어도 약 2.5배, 적어도 약 3배, 적어도 약 3.5배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배 또는 적어도 약 10배 증가된다. 일부 실시양태에서, 치료제는 세포에서 SCN1A 단백질을 코딩하는 프로세싱된 mRNA의 수준을 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 치료제와 접촉된 세포에서 SCN1A 단백질을 코딩하는 프로세싱된 mRNA의 양은 대조군 세포에서 SCN1A 단백질을 코딩하는 프로세싱된 mRNA의 총량과 비교하여 약 1.1 내지 약 10배, 약 1.5 내지 약 10배, 약 2 내지 약 10배, 약 3 내지 약 10배, 약 4 내지 약 10배, 약 1.1 내지 약 5배, 약 1.1 내지 약 6배, 약 1.1 내지 약 7배, 약 1.1 내지 약 8배, 약 1.1 내지 약 9배, 약 2 내지 약 5배, 약 2 내지 약 6배, 약 2 내지 약 7배, 약 2 내지 약 8배, 약 2 내지 약 9배, 약 3 내지 약 6배, 약 3 내지 약 7배, 약 3 내지 약 8배, 약 3 내지 약 9배, 약 4 내지 약 7배, 약 4 내지 약 8배, 약 4 내지 약 9배, 적어도 약 1.1배, 적어도 약 1.5배, 적어도 약 2배, 적어도 약 2.5배, 적어도 약 3배, 적어도 약 3.5배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배 또는 적어도 약 10배 증가된다. 일부 실시양태에서, 질환 또는 병태는 Nav1.1에서의 기능 상실 돌연변이에 의해 유도된다. 일부 실시양태에서, 질환 또는 병태는 SCN1A 유전자의 반가불충분성과 관련되며, 대상체는 기능성 SCN1A를 코딩하는 제1 대립유전자, 및 SCN1A가 생성되지 않거나 감소된 수준으로 생성되는 제2 대립유전자, 또는 비기능성 SCN1A 또는 부분 기능성 SCN1A를 코딩하는 제2 대립유전자를 갖는다. 일부 실시양태에서, 질환 또는 병태는 뇌병증이다. 일부 실시양태에서, 뇌병증은 간질성 뇌병증이다. 일부 실시양태에서, 질환 또는 병태는 드라벳 증후군(DS); 유아기의 중증 근간대성 뇌전증(severe myoclonic epilepsy of infancy: SMEI)-경계(borderland)(SMEB); 열성 발작(Febrile seizure: FS); 열성 발작 플러스를 동반하는 전신 뇌전증(epilepsy, generalized, with febrile seizures plus: GEFS+); 조기 유아 간질성 뇌병증 13(epileptic encephalopathy, early infantile, 13); 잠재성(cryptogenic) 전신 뇌전증; 잠재성 국소 뇌전증; 근간대성 무정위 뇌전증; 레녹스-가스토 증후군; 웨스트 증후군; 특발성 경련; 조기 근간대성 뇌병증; 진행성 근간대성 뇌전증; 소아기 교대성 편마비; 미분류 간질성 뇌병증; 뇌전증에서의 돌연사(sudden unexpected death in epilepsy: SUDEP); 동기능 부전 증후군 1(sick sinus syndrome 1); 자폐증; 또는 유아기의 악성 이동성 부분 발작이다. 일부 실시양태에서, GEFS+는 열성 발작 플러스를 동반하는 전신 뇌전증 2형(epilepsy, generalized, with febrile seizures plus, type 2)이다. 일부 실시양태에서, 열성 발작은 가족성 열성 발작 3A(Febrile seizures, familial, 3A)이다. 일부 실시양태에서, SMEB는 전신 극파가 없는 SMEB(SMEB without generalized spike wave: SMEB-SW), 근간대성 발작이 없는 SMEB(SMEB without myoclonic seizures: SMEB-M), SMEI의 하나 초과의 특징이 결여된 SMEB(SMEB lacking more than one feature of SMEI: SMEB-O) 또는 전신 강직-간대성 발작을 동반한 난치성 소아기 뇌전증(intractable childhood epilepsy with generalized tonic-clonic seizures: ICEGTC)이다.
소정 실시양태에서, SCN1A 단백질을 코딩하고 넌센스 매개 RNA 붕괴 유도 엑손을 함유하는 mRNA(NMD 엑손 mRNA)를 갖는 세포에서 SCN1A 단백질의 발현을 조절하는 방법으로서, 치료제를 세포에 접촉시키는 단계를 포함하고, 이에 의해 치료제는 SCN1A 단백질을 코딩하는 NMD 엑손 mRNA로부터 NMD 엑손의 스플라이싱을 조절하며, 이로써 세포에서 SCN1A 단백질을 코딩하는 프로세싱된 mRNA의 수준을 조절하고 SCN1A 단백질의 발현을 조절하며, 여기서 치료제는 SCN1A를 코딩하는 NMD 엑손 mRNA의 표적화된 부분에 결합하고, 표적화된 부분은 NMD 유도 엑손(NIE)의 5' 말단으로부터의 상류 약 1000개 뉴클레오티드 내지 NIE의 3' 말단의 하류 약 1000개 뉴클레오티드인 방법이 본원에 제공된다.
소정 실시양태에서, 치료를 필요로 하는 대상체의 세포에서 SCN1A 단백질의 발현을 조절함으로써 대상체에서 질환 또는 병태를 치료하는 방법으로서, 대상체의 세포를 넌센스 매개 mRNA 붕괴 유도 엑손(NMD 엑손)을 함유하고 SCN1A를 코딩하는 세포에서의 mRNA로부터 NMD 엑손의 스플라이싱을 조절하는 치료제와 접촉시키는 단계를 포함하고, 이로써 대상체의 세포에서 SCN1A 단백질을 코딩하는 프로세싱된 mRNA의 수준을 조절하고 SCN1A 단백질의 발현을 조절하며, 여기서 치료제는 SCN1A를 코딩하는 NMD 엑손 mRNA의 표적화된 부분에 결합하고, 표적화된 부분은 NMD 유도 엑손(NIE)의 5' 말단으로부터의 상류 약 1000개 뉴클레오티드 내지 NIE의 3' 말단의 하류 약 1000개 뉴클레오티드인 방법이 본원에 제공된다.
소정 실시양태에서, 서열번호 12 내지 731 중 어느 하나와 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 97% 또는 100% 동일성인 서열을 포함하는 안티센스 올리고머(ASO)가 본원에 개시된다.
소정 실시양태에서, 서열번호 12 내지 731로부터 선택된 서열로 이루어진 안티센스 올리고머(ASO)가 본원에 개시된다.
소정 실시양태에서, 치료를 필요로 하는 대상체의 세포에서 SCN1A 단백질의 발현을 조절함으로써 대상체에서 질환 또는 병태를 치료하는 방법으로서, 대상체의 세포를 서열번호 12 내지 731 중 어느 하나와 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 97% 또는 100% 동일성인 서열을 포함하는 ASO 또는 서열번호 12 내지 731로부터 선택된 서열로 이루어진 ASO와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법이 본원에 개시된다.
소정 실시양태에서, 서열번호 12 내지 731 중 어느 하나와 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 97% 또는 100% 동일성인 서열을 포함하는 ASO; 또는 서열번호 12 내지 731로부터 선택된 서열로 이루어진 ASO를 포함하는 키트가 개시된다.
참고에 의한 포함
본 명세서에서 언급된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 각각의 개별 간행물, 특허 또는 특허 출원이 참고로 포함된 것으로 구체적이고 개별적으로 명시된 것과 동일한 정도로 본원에 참고로 포함된다.
본 발명의 신규 특징은 첨부된 청구범위에 구체적으로 제시되어 있다. 본 발명의 특징 및 이점은 본 발명의 원리가 이용되는 예시적인 실시양태 및 하기의 첨부 도면을 제시하는 다음의 상세한 설명을 참조하여 더 잘 이해될 것이다:
도 1은 넌센스 매개 mRNA 붕괴 유도 엑손을 함유하는 표적 mRNA(NMD 엑손 mRNA), 및 전장의 표적 단백질 또는 기능성 RNA의 발현을 증가시키는 넌센스 매개 mRNA 붕괴 유도 엑손의 치료제 매개 배제의 개략도를 도시한다. 도 1a는 핵 및 세포질 구획으로 나뉜 세포를 나타낸다. 핵에서, 표적 유전자의 프리-mRNA(pre-mRNA) 전사체는 스플라이싱을 거쳐 mRNA를 생성하고, 이러한 mRNA는 세포질로 유출되고 표적 단백질로 번역된다. 이 표적 유전자에 대해, mRNA의 일부 분획은 세포질에서 분해되는 넌센스 매개 mRNA 붕괴 유도 엑손(NMD 엑손 mRNA)을 함유하여 표적 단백질 생산으로 이어지지 않는다. 도 1b는 핵 및 세포질 구획으로 나뉜 동일한 세포의 예를 나타낸다. 안티센스 올리고머(ASO)와 같은 치료제에 의한 치료는 넌센스 매개 mRNA 붕괴 유도 엑손의 배제를 촉진하고 mRNA의 증가를 초래하며, 이는 결국 더 높은 수준의 표적 단백질로 번역된다. 도 1c는 넌센스 매개 mRNA 붕괴 유도 엑손의 치료적 ASO 매개 배제의 개략도로서, 이러한 배제는 비생산적 mRNA를 감소시키고 생산적 mRNA를 증가시키고 생산적 mRNA로부터 전장의 표적 단백질의 발현을 증가시킨다.
도 2는 SCN1A 유전자에서 예시적인 넌센스 매개 mRNA 붕괴(NMD) 유도 엑손의 식별을 도시한다. 비교 게놈학을 사용한 SCN1A 유전자에서의 NMD 유도 엑손의 식별을 UCSC 게놈 브라우저에서 시각화하여 나타낸다. 상단 패널은 스케일링할 SCN1A 유전자의 도식적 표현을 나타낸다. 100종의 척추동물 종에 대한 보존 수준을 피크로서 나타낸다. 가장 높은 피크는 엑손(검은 박스)에 해당하는 한편, 대부분의 인트론(화살표가 있는 선)에는 피크가 관찰되지 않는다. 중간 패널에 나타낸 인트론 20(NM_006920)에서 보존 피크가 식별된다. 보존된 서열을 검사하여 3' 및 5' 스플라이스 부위(밑줄 친 서열)의 측면에 위치한 64 bp의 엑손 유사 서열(하단 패널, 회색으로 강조된 서열)을 식별하였으며; 이를 본 발명자들은 엑손 20x로 지칭한다. 상기 엑손의 포함은 프레임시프트 및 엑손 21 내 조기 종결 코돈의 도입을 초래하여 전사체를 NMD의 표적으로 만든다.
도 3a는 사이클로헥시미드 처리를 통한 NMD 유도 엑손의 확인을 도시한다. DMSO 처리된(CHX-) 또는 사이클로헥시미드 처리된(CHX+) Neuro 2A(마우스 신경 전구 세포)의 세포질 RNA 및 엑손 21 및 하류 엑손 내의 프라이머를 사용한 RT-PCR 분석으로 NMD 유도 엑손(21x)에 상응하는 밴드의 존재를 확인하였다. 생성물의 동일성은 시퀀싱에 의해 확인하였다. 밴드의 밀도측정 분석을 수행하여 총 SCN1A 전사체의 엑손 21x 포함 퍼센트를 계산하였다. NMD를 억제하기 위한 사이클로헥시미드로의 Neuro 2A 처리(CHX+)는 세포질 분획에서 NMD 유도 엑손 21x에 상응하는 생성물의 2배 증가를 초래하였다(연회색 막대, CHX-와 진회색 막대, CHX+ 비교).
도 3b는 사이클로헥시미드 처리를 통한 NMD 유도 엑손의 확인을 도시한다. DMSO 처리된(CHX-) 또는 사이클로헥시미드 처리된(CHX+) RenCell VM(인간 신경 전구 세포)의 세포질 RNA 및 엑손 20 및 엑손 23 내의 프라이머를 사용한 RT-PCR 분석으로 NMD 유도 엑손(20x)에 상응하는 밴드의 존재를 확인하였다. 생성물의 동일성은 시퀀싱에 의해 확인하였다. 밴드의 밀도측정 분석을 수행하여 총 SCN1A 전사체의 엑손 20x 포함 퍼센트를 계산하였다. NMD를 억제하기 위한 사이클로헥시미드로의 RenCell VM 처리(CHX+)는 세포질 분획에서 NMD 유도 엑손 20x에 상응하는 생성물의 2배 증가를 초래하였다(연회색 막대, CHX-와 진회색 막대, CHX+ 비교).
도 4는 엑손 20x의 3' 스플라이스 부위 상류의 2개의 표시된 영역(영역 1 및 영역 2) 및 엑손 20x의 5' 스플라이스 부위 하류의 2개의 표시된 영역(영역 3 및 영역 4)을 표적화하는 SCN1A 엑손 20x 영역에 대해 수행된 ASO 워크(walk)의 예시적인 도식적 표현을 도시한다. ASO는 한 번에 5개의 뉴클레오티드를 이동시켜 이들 영역을 포함하도록 설계되었다.
도 5a는 RT-PCR에 의해 평가된 확장된 ASO 워크로부터 선택된 SCN1A 엑손 20x 영역 ASO를 도시한다. 대표적인 PAGE는 모의 처리된, 대조군 ASO 처리된(NT), 24시간 동안 1 uM에서 뉴클레오펙션을 통해 RenCell에서 확장된 워크로부터 SCN1A 엑손 20x 영역 ASO 처리된 SCN1A의 SYBR-세이프 염색된 RT-PCR 생성물을 나타낸다. 모의 = ASO 없음; 대조 NT = 비표적화 대조군; Postctrl = 양성 대조군.
도 5b는 도 5b의 데이터로부터의 엑손 20x 포함 퍼센트를 플롯팅한 그래프를 도시한다.
도 5c는 도 5a의 샘플을 사용한 확장된 ASO 워크의 qPCR 결과의 그래프를 도시한다. RPL32 내부 대조군에 대해 정규화된 5A 및 모의에 대한 SCN1A mRNA의 배수 변화가 플롯팅된다.
스플라이싱 및 넌센스 매개 mRNA 붕괴
개재 서열 또는 인트론은 스플라이스좀이라 명명되는 크고 매우 역동적인 RNA-단백질 복합체에 의해 제거되며, 이는 1차 전사체, 작은 핵 RNA(snRNA) 및 다수의 단백질 사이의 복잡한 상호작용을 조정한다. 스플라이스좀은 U1 snRNA에 의한 5' 스플라이스 부위(5'ss) 또는 U2 경로에 의한 3' 스플라이스 부위(3'ss)의 인식으로 시작하여, 순차적인 방식으로 각 인트론에서 그때그때 조립되며, 상기 경로는 3'ss의 영역에 U2 보조 인자(U2AF)의 결합을 수반하여 분지점 서열(branch point sequence: BPS)에 U2 결합을 용이하게 한다. U2AF는 폴리피리미딘 트랙(PPT)에 결합하는 U2AF2-코딩된 65 kD 서브유닛(U2AF65), 및 3'ss에서 고도로 보존된 AG 디뉴클레오티드와 상호작용하고 U2AF65 결합을 안정화시키는 U2AF1-코딩된 35 kD 서브유닛(U2AF35)으로 구성된 안정한 이종이량체이다. 정확한 스플라이싱은 BPS/PPT 유닛 및 3'ss/5'ss 외에도 인트론 또는 엑손 스플라이싱 인핸서 또는 사일런서로서 공지된, 스플라이스 부위 인식을 활성화 또는 억제하는 보조 서열 또는 구조를 필요로 한다. 이들 요소는 동일한 서열을 갖지만 진정한 부위가 수십 배나 더 많은 고등 진핵생물의 게놈에서 상당히 과량의 잠재 또는 가성(pseudo) 부위 중에서 진정한 스플라이스 부위를 인식할 수 있게 한다. 이들은 종종 조절 기능을 갖지만, 이들의 활성화 또는 억제의 정확한 메커니즘은 잘 이해되지 않고 있다.
스플라이싱될지 또는 스플라이싱되지 않을지의 여부에 대한 결정은 전형적으로 결정론적 과정보다는 확률론적 과정으로 모델링될 수 있어, 가장 결정적인 스플라이싱 신호조차 때때로 부정확하게 스플라이싱될 수 있다. 그러나, 정상적인 조건 하에, 프리-mRNA 스플라이싱은 놀랍도록 높은 정확도로 진행된다. 이는 인접한 시스-작용 보조 엑손 및 인트론 스플라이싱 조절 요소(ESR 또는 ISR)의 활성에 부분적으로 기인한다. 전형적으로, 이들 기능적 요소는 스플라이싱을 자극하거나 억제하는 능력에 기초하여 각각 엑손 또는 인트론 스플라이싱 인핸서(ESE 또는 ISE) 또는 사일런서(ESS 또는 ISS)로 분류된다. 현재 일부 보조 시스-작용 요소가 U1 snRNP와 5'ss 사이의 복합체의 배열과 같은 스플라이스좀 조립체의 동역학에 영향을 미침으로써 작용할 수 있다는 증거가 있지만, 많은 요소는 트랜스-작용 RNA 결합 단백질(RBP)과 협력하여 기능을 할 가능성이 매우 크다. 예를 들어, 세린 및 아르기닌이 풍부한 RBP 패밀리(SR 단백질)는 엑손을 정의하는 데 중요한 역할을 하는 보존된 단백질 패밀리이다. SR 단백질은 프리-스플라이스좀의 성분을 인접한 스플라이스 부위로 동원하거나 근처에서 ESS의 효과를 길항시킴으로써 엑손 인식을 촉진한다. ESS의 억제 효과는 이종 핵 리보핵 단백질(hnRNP) 패밀리의 구성원에 의해 매개될 수 있으며, 인접 스플라이스 부위로의 코어 스플라이싱 인자의 동원을 변경할 수 있다. 사일런서 요소는 스플라이싱 조절에서의 역할 외에도, 전형적인 엑손 간격을 갖지만 기능적인 오픈 리딩 프레임이 없는 붕괴 인트론 스플라이스 부위 세트인 가성-엑손의 억제에 역할을 할 것으로 제안되어 있다. ESE와 ESS는 이들의 동족 트랜스-작용 RBP와 협력하여, mRNA가 이들의 전구체로부터 언제, 어디서, 그리고 어떻게 조립되지를 지정하는 한 세트의 스플라이싱 제어에서 중요한 구성 요소를 나타낸다.
엑손-인트론 경계를 표시하는 서열은 인간 유전자 내에서 높은 빈도로 발생할 수 있는 다양한 강도의 축퇴성 신호이다. 다중-엑손 유전자에서, 상이한 쌍의 스플라이스 부위가 많은 상이한 조합으로 서로 연결되어 단일 유전자로부터 다양한 전사체를 생성할 수 있다. 이는 일반적으로 선택적 프리-mRNA 스플라이싱으로 지칭된다. 선택적 스플라이싱에 의해 생성된 대부분의 mRNA 이소형이 핵으로부터 유출되어 기능성 폴리펩티드로 번역될 수 있지만, 단일 유전자로부터의 상이한 mRNA 이소형은 이들의 번역 효율이 크게 다를 수 있다. 엑손 접합부 복합체의 상류의 적어도 50 bp에 조기 종결 코돈(PTC)을 갖는 이러한 mRNA 이소형은 넌센스 매개 mRNA 붕괴(NMD) 경로에 의한 분해의 표적이 될 가능성이 있다. 전통적(BPS/PPT/3'ss/5'ss) 및 보조적 스플라이싱 모티프에서의 돌연변이는 엑손 스키핑(exon skipping) 또는 잠재성(또는 가성) 엑손 포함 또는 스플라이스-부위 활성화와 같은 비정상적 스플라이싱을 유발할 수 있으며, 인간 이환율 및 사망률의 상당한 원인이 된다. 비정상적 스플라이싱 양상과 선택적 스플라이싱 양상은 둘 다 엑손 및 인트론에서의 천연 DNA 변이체에 의해 영향받을 수 있다.
엑손-인트론 경계가 코돈의 3개 위치 중 어느 하나에서 발생할 수 있음을 고려하면, 선택적 스플라이싱 이벤트의 서브세트만이 표준 오픈 리딩 프레임을 유지할 수 있다는 것은 명백하다. 예를 들어, 균등하게 3으로 나뉠 수 있는 엑손만이 리딩 프레임을 변경하지 않고 스키핑되거나 mRNA에 포함될 수 있다. 적합한 상태가 없는 스플라이싱 이벤트는 프레임-시프트를 유발할 것이다. 하류 이벤트에 의해 역전되지 않는 한, 프레임-시프트는 확실히 하나 이상의 PTC로 이어질 수 있으며, 이는 아마도 NMD에 의한 후속 분해를 초래할 수 있다. NMD는 PTC를 함유하는 mRNA를 제거하는 번역 결합된 메커니즘이다. NMD는 모든 진핵생물에 존재하는 감시 경로로서 기능을 할 수 있다. NMD는 조기 정지 코돈을 함유하는 mRNA 전사체를 제거함으로써 유전자 발현에서 오류를 감소시킬 수 있다. 이들 비정상적 mRNA의 번역은, 일부 경우에, 생성된 단백질의 유해한 기능 획득 또는 우성-음성적 활성으로 이어질 수 있다. NMD는 PTC가 있는 전사체뿐 아니라 많은 내인성 유전자로부터 발현된 광범위한 mRNA 이소형을 표적화하며, 이는 NMD가 세포에서 정상 상태(steady-state) RNA 수준에서 미세한 조정과 조악한 조정 둘 다를 유도하는 마스터 조절인자임을 시사한다.
NMD 유도 엑손(NIE)은 인트론 내의 영역인 엑손 또는 가성-엑손이며, 성숙한 RNA 전사체에 포함되는 경우 NMD 경로를 활성화시킬 수 있다. 구성적 스플라이싱 이벤트에서, NIE를 함유하는 인트론은 일반적으로 스플라이싱되지만, 인트론 또는 이의 일부분(예를 들어, NIE)는 선택적 또는 비정상적 스플라이싱 이벤트 동안 유지될 수 있다. 이러한 NIE를 함유하는 성숙한 mRNA 전사체는 NMD 경로를 유도하는 프레임 시프트로 인해 비생산적일 수 있다. 성숙한 RNA 전사체에 NIE가 포함되면 유전자 발현을 하향조절할 수 있다. NIE를 함유하는 mRNA 전사체는 본 개시내용에서 "NIE 함유 mRNA" 또는 "NMD 엑손 mRNA"로 지칭될 수 있다.
잠재성(또는 가성-스플라이스 부위)은 진정한 스플라이스 부위와 동일한 스플라이싱 인식 서열을 갖지만 스플라이싱 반응에는 사용되지 않는다. 이들은 인간 게놈에서 진정한 스플라이스 부위보다 수십 배 더 많으며 일반적으로 이제까지 잘 이해되지 않은 분자 메커니즘에 의해 억제된다. 잠재성 5' 스플라이스 부위는 컨센서스(consensus) NNN/GUNNNN 또는 NNN/GCNNNN을 가지며, 여기서 N은 임의의 뉴클레오티드이고 엑손-인트론 경계이다. 잠재성 3' 스플라이스 부위는 컨센서스 NAG/N을 가진다. 이들의 활성화는 진정한 스플라이스 부위, 즉 각각 MAG/GURAGU 및 YAG/G(여기서 M은 C 또는 A이고, R은 G 또는 A이고, Y는 C 또는 U이다)의 최적의 컨센서스와 더 유사하게 만드는 주변 뉴클레오티드에 의해 양성적으로 영향을 받는다.
스플라이스 부위 및 이의 조절 서열은 예를 들어 문헌[Kralovicova, J. and Vorechovsky, I. (2007) Global control of aberrant splice site activation by auxiliary splicing sequences: evidence for a gradient in exon and intron definition. Nucleic Acids Res., 35, 6399-6413,(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2095810/pdf/gkm680.pdf)]에 열거된 공개적으로 이용 가능한 적합한 알고리즘을 사용하여 당업자에 의해 용이하게 식별될 수 있다.
잠재성 스플라이스 부위 또는 스플라이싱 조절 서열은 U2AF와 같은 RNA 결합 단백질에 대해 NIE의 스플라이스 부위와 경쟁할 수 있다. 일 실시양태에서, 제제(agent)는 잠재성 스플라이스 부위 또는 스플라이싱 조절 서열에 결합하여 RNA 결합 단백질의 결합을 방지함으로써 NIE 스플라이스 부위의 이용을 유리하게 할 수 있다.
일 실시양태에서, 잠재성 스플라이스 부위는 NIE의 5' 또는 3' 스플라이스 부위를 포함하지 않을 수 있다. 잠재성 스플라이스 부위는 NIE 5' 스플라이스 부위의 상류 적어도 10개 뉴클레오티드이다. 잠재성 스플라이스 부위는 NIE 5' 스플라이스 부위의 상류 적어도 20개 뉴클레오티드일 수 있다. 잠재성 스플라이스 부위는 NIE 5' 스플라이스 부위의 상류 적어도 50개 뉴클레오티드일 수 있다. 잠재성 스플라이스 부위는 NIE 5' 스플라이스 부위의 상류 적어도 100개 뉴클레오티드일 수 있다. 잠재성 스플라이스 부위는 NIE 5' 스플라이스 부위의 상류 적어도 200개 뉴클레오티드일 수 있다.
잠재성 스플라이스 부위는 NIE 3' 스플라이스 부위의 하류 적어도 10개 뉴클레오티드일 수 있다. 잠재성 스플라이스 부위는 NIE 3' 스플라이스 부위의 하류 적어도 20개 뉴클레오티드일 수 있다. 잠재성 스플라이스 부위는 NIE 3' 스플라이스 부위의 하류 적어도 50개 뉴클레오티드일 수 있다. 잠재성 스플라이스 부위는 NIE 3' 스플라이스 부위의 하류 적어도 100개 뉴클레오티드일 수 있다. 잠재성 스플라이스 부위는 NIE 3' 스플라이스 부위의 하류 적어도 200개 뉴클레오티드일 수 있다.
표적 전사체
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 SCN1A 유전자로부터 전사된 프리-mRNA 내의 NIE 존재를 이용한다. 기능성의 성숙한 SCN1A mRNA를 생성하기 위한 식별된 SCN1A NIE 프리-mRNA 종의 스플라이싱은 NIE의 엑손 스키핑을 자극하는 ASO와 같은 치료제를 사용하여 유도될 수 있다. 엑손 스키핑의 유도는 NMD 경로의 억제를 초래할 수 있다. 생성된 성숙한 SCN1A mRNA는 NMD 경로를 활성화시키지 않으면서 정상적으로 번역될 수 있으며, 이로써 환자 세포에서 SCN1A 단백질의 양을 증가시키고 SCN1A 결핍과 관련된 병태, 예컨대 드라벳 증후군(DS); 열성 발작 플러스를 동반하는 전신 뇌전증 2형; 가족성 열성 발작 3A; 자폐증; 조기 유아 간질성 뇌병증 13; 동기능 부전 증후군　1; 알츠하이머병; 또는 SUDEP의 증상을 완화시킨다.
다양한 실시양태에서, 본 개시내용은 SCN1A mRNA 전사체를 표적화하여, 스플라이싱 또는 단백질 발현 수준을 조절, 예를 들어, 향상시키거나 억제할 수 있는 치료제를 제공한다. 치료제는 소분자, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드일 수 있다. 일부 실시양태에서, 치료제는 ASO이다. SCN1A 프리-mRNA 상의 다양한 영역 또는 서열이 ASO와 같은 치료제에 의해 표적화될 수 있다. 일부 실시양태에서, ASO는 NIE를 함유하는 SCN1A 프리-mRNA 전사체를 표적화한다. 일부 실시양태에서, ASO는 SCN1A 프리-mRNA 전사체의 NIE 내의 서열을 표적화한다. 일부 실시양태에서, ASO는 SCN1A 프리-mRNA 전사체의 NIE의 5' 말단으로부터 상류(또는 5')의 서열(3'ss)을 표적화한다. 일부 실시양태에서, ASO는 SCN1A 프리-mRNA 전사체의 NIE의 3' 말단으로부터 하류(또는 3')의 서열(5'ss)을 표적화한다. 일부 실시양태에서, ASO는 SCN1A 프리-mRNA 전사체의 NIE의 5' 말단의 측면에 위치한 인트론 내에 있는 서열을 표적화한다. 일부 실시양태에서, ASO는 SCN1A 프리-mRNA 전사체의 NIE의 3' 말단의 측면에 위치한 인트론 내에 있는 서열을 표적화한다. 일부 실시양태에서, ASO는 SCN1A 프리-mRNA 전사체의 NIE-인트론 경계를 포함하는 서열을 표적화한다. NIE-인트론 경계는 인트론 서열과 NIE 영역의 접합부를 지칭할 수 있다. 인트론 서열은 NIE의 5' 말단 또는 NIE의 3' 말단의 측면에 위치할 수 있다. 일부 실시양태에서, ASO는 SCN1A 프리-mRNA 전사체의 엑손 내의 서열을 표적화한다. 일부 실시양태에서, ASO는 SCN1A 프리-mRNA 전사체의 인트론 내의 서열을 표적화한다. 일부 실시양태에서, ASO는 인트론의 일부분과 엑손의 일부분 둘 다를 포함하는 서열을 표적화한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 치료제는 NMD 엑손 mRNA의 스플라이싱에 관여하는 인자의 결합을 조절한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 치료제는 NMD 엑손 mRNA의 스플라이싱에 관여하는 인자의 결합을 방해한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 치료제는 NMD 엑손 mRNA의 스플라이싱에 관여하는 인자의 결합을 방지한다.
일부 실시양태에서, 치료제는 SCN1A를 코딩하는 NMD 엑손 mRNA의 2개의 표준 엑손 영역 사이의 인트론 영역에 위치한 표적화된 부분을 표적화하며, 여기서 상기 인트론 영역은 NMD 엑손을 함유한다.
일부 실시양태에서, 치료제는 NMD 엑손과 적어도 부분적으로 중첩되는 표적화된 부분을 표적화한다.
일부 실시양태에서, 치료제는 NMD 엑손의 상류 인트론과 적어도 부분적으로 중첩되는 표적화된 부분을 표적화한다.
일부 실시양태에서, 치료제는 NMD 엑손 내의 표적화된 부분을 표적화한다.
일부 실시양태에서, 치료제는 NMD 엑손의 적어도 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30개 또는 그 이상의 연속적 뉴클레오티드를 포함하는 표적화된 부분을 표적화한다. 일부 실시양태에서, 치료제는 NMD 엑손의 최대 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30개 또는 그 이상의 연속적 뉴클레오티드를 포함하는 표적화된 부분을 표적화한다. 일부 실시양태에서, 치료제는 NMD 엑손의 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30개 또는 그 이상의 연속적 뉴클레오티드를 포함하는 표적화된 부분을 표적화한다.
일부 실시양태에서, 치료제는 NMD 엑손에 근접한 표적화된 부분을 표적화한다.
일부 실시양태에서, ASO는 NIE를 포함하는 인트론의 5' 말단으로부터의 하류 약 1 내지 약 5000개 뉴클레오티드의 서열을 표적화한다. 일부 실시양태에서, ASO는 NIE를 포함하는 인트론의 5' 말단으로부터의 하류 약 1 내지 약 20개 뉴클레오티드, 약 20 내지 약 50개 뉴클레오티드, 약 50 내지 약 100개 뉴클레오티드, 약 100 내지 약 150개 뉴클레오티드, 약 150 내지 약 200개 뉴클레오티드, 약 200 내지 약 250개 뉴클레오티드, 약 250 내지 약 300개, 약 250 내지 약 300개 뉴클레오티드, 약 350 내지 약 400개 뉴클레오티드, 약 450 내지 약 500개 뉴클레오티드, 약 550 내지 약 600개 뉴클레오티드, 약 650 내지 약 700개 뉴클레오티드, 약 750 내지 약 800개 뉴클레오티드, 약 850 내지 약 900개 뉴클레오티드, 약 950 내지 약 1000개 뉴클레오티드, 약 1050 내지 약 1100개 뉴클레오티드, 약 1150 내지 약 1200개 뉴클레오티드, 약 1250 내지 약 1300개 뉴클레오티드, 약 1350 내지 약 1400개 뉴클레오티드, 약 1450 내지 약 1500개 뉴클레오티드, 약 1550 내지 약 1600개 뉴클레오티드, 약 1650 내지 약 1700개 뉴클레오티드, 약 1750 내지 약 1800개 뉴클레오티드, 약 1850 내지 약 1900개 뉴클레오티드, 약 1950 내지 약 2000개 뉴클레오티드, 약 2000 내지 약 3000개 뉴클레오티드, 약 3000 내지 약 4000개 뉴클레오티드 또는 약 4000 내지 약 5000개 뉴클레오티드의 서열을 표적화한다. 일부 실시양태에서, ASO는 NIE를 포함하는 인트론의 5' 말단으로부터의 하류 약 1 내지 약 20개 뉴클레오티드, 약 20 내지 약 50개 뉴클레오티드, 약 50 내지 약 100개 뉴클레오티드, 약 100 내지 약 150개 뉴클레오티드, 약 150 내지 약 200개 뉴클레오티드, 약 200 내지 약 250개 뉴클레오티드, 약 250 내지 약 300개, 약 250 내지 약 300개 뉴클레오티드, 약 350 내지 약 400개 뉴클레오티드, 약 450 내지 약 500개 뉴클레오티드, 약 550 내지 약 600개 뉴클레오티드, 약 650 내지 약 700개 뉴클레오티드, 약 750 내지 약 800개 뉴클레오티드, 약 850 내지 약 900개 뉴클레오티드 또는 약 950 내지 약 1000개 뉴클레오티드의 서열을 표적화한다.
일부 실시양태에서, ASO는 NIE를 포함하는 인트론의 5' 말단으로부터의 하류 적어도 약 1개 뉴클레오티드, 적어도 약 10개 뉴클레오티드, 적어도 약 20개 뉴클레오티드, 적어도 약 50개 뉴클레오티드, 적어도 약 80개 뉴클레오티드, 적어도 약 85개 뉴클레오티드, 적어도 약 90개 뉴클레오티드, 적어도 약 95개 뉴클레오티드, 적어도 약 96개 뉴클레오티드, 적어도 약 97개 뉴클레오티드, 적어도 약 98개 뉴클레오티드, 적어도 약 99개 뉴클레오티드, 적어도 약 100개 뉴클레오티드, 적어도 약 101개 뉴클레오티드, 적어도 약 102개 뉴클레오티드, 적어도 약 103개 뉴클레오티드, 적어도 약 104개 뉴클레오티드, 적어도 약 105개 뉴클레오티드, 적어도 약 110개 뉴클레오티드, 적어도 약 120개 뉴클레오티드, 적어도 약 150개 뉴클레오티드, 적어도 약 200개 뉴클레오티드, 적어도 약 300개 뉴클레오티드, 적어도 약 400개 뉴클레오티드, 적어도 약 500개 뉴클레오티드, 적어도 약 600개 뉴클레오티드, 적어도 약 700개 뉴클레오티드, 적어도 약 800개 뉴클레오티드, 적어도 약 900개 뉴클레오티드, 적어도 약 1000개 뉴클레오티드, 적어도 약 1200개 뉴클레오티드, 적어도 약 1400개 뉴클레오티드, 적어도 약 1500개 뉴클레오티드, 적어도 약 1600개 뉴클레오티드, 적어도 약 1800개 뉴클레오티드, 적어도 약 2000개 뉴클레오티드, 적어도 약 3000개 뉴클레오티드, 적어도 약 4000개 뉴클레오티드 또는 적어도 약 5000개 뉴클레오티드의 서열을 표적화한다.
일부 실시양태에서, ASO는 NIE의 5' 말단으로부터 상류(또는 5')의 약 1 내지 약 2000개 뉴클레오티드의 서열을 표적화한다. 일부 실시양태에서, ASO는 NIE의 5' 말단으로부터 상류(또는 5')의 약 1 내지 약 20개 뉴클레오티드, 약 20 내지 약 50개 뉴클레오티드, 약 50 내지 약 100개 뉴클레오티드, 약 100 내지 약 150개 뉴클레오티드, 약 150 내지 약 200개 뉴클레오티드, 약 200 내지 약 250개 뉴클레오티드, 약 250 내지 약 300개, 약 250 내지 약 300개 뉴클레오티드, 약 350 내지 약 400개 뉴클레오티드, 약 450 내지 약 500개 뉴클레오티드, 약 550 내지 약 600개 뉴클레오티드, 약 650 내지 약 700개 뉴클레오티드, 약 750 내지 약 800개 뉴클레오티드, 약 850 내지 약 900개 뉴클레오티드, 약 950 내지 약 1000개 뉴클레오티드, 약 1050 내지 약 1100개 뉴클레오티드, 약 1150 내지 약 1200개 뉴클레오티드, 약 1250 내지 약 1300개 뉴클레오티드, 약 1350 내지 약 1400개 뉴클레오티드, 약 1450 내지 약 1500개 뉴클레오티드, 약 1550 내지 약 1600개 뉴클레오티드, 약 1650 내지 약 1700개 뉴클레오티드, 약 1750 내지 약 1800개 뉴클레오티드, 약 1850 내지 약 1900개 뉴클레오티드 또는 약 1950 내지 약 2000개 뉴클레오티드의 서열을 표적화한다. 일부 실시양태에서, ASO는 NIE의 5' 말단으로부터 상류(또는 5')의 약 1 내지 약 20개 뉴클레오티드, 약 20 내지 약 50개 뉴클레오티드, 약 50 내지 약 100개 뉴클레오티드, 약 100 내지 약 150개 뉴클레오티드, 약 150 내지 약 200개 뉴클레오티드, 약 200 내지 약 250개 뉴클레오티드, 약 250 내지 약 300개, 약 250 내지 약 300개 뉴클레오티드, 약 350 내지 약 400개 뉴클레오티드, 약 450 내지 약 500개 뉴클레오티드, 약 550 내지 약 600개 뉴클레오티드, 약 650 내지 약 700개 뉴클레오티드, 약 750 내지 약 800개 뉴클레오티드, 약 850 내지 약 900개 뉴클레오티드 또는 약 950 내지 약 1000개 뉴클레오티드의 서열을 표적화한다.
일부 실시양태에서, ASO는 NIE의 5' 말단으로부터 상류(또는 5')의 적어도 약 1개 뉴클레오티드, 적어도 약 10개 뉴클레오티드, 적어도 약 20개 뉴클레오티드, 적어도 약 50개 뉴클레오티드, 적어도 약 80개 뉴클레오티드, 적어도 약 85개 뉴클레오티드, 적어도 약 90개 뉴클레오티드, 적어도 약 95개 뉴클레오티드, 적어도 약 96개 뉴클레오티드, 적어도 약 97개 뉴클레오티드, 적어도 약 98개 뉴클레오티드, 적어도 약 99개 뉴클레오티드, 적어도 약 100개 뉴클레오티드, 적어도 약 101개 뉴클레오티드, 적어도 약 102개 뉴클레오티드, 적어도 약 103개 뉴클레오티드, 적어도 약 104개 뉴클레오티드, 적어도 약 105개 뉴클레오티드, 적어도 약 110개 뉴클레오티드, 적어도 약 120개 뉴클레오티드, 적어도 약 150개 뉴클레오티드, 적어도 약 200개 뉴클레오티드, 적어도 약 300개 뉴클레오티드, 적어도 약 400개 뉴클레오티드, 적어도 약 500개 뉴클레오티드, 적어도 약 600개 뉴클레오티드, 적어도 약 700개 뉴클레오티드, 적어도 약 800개 뉴클레오티드, 적어도 약 900개 뉴클레오티드, 적어도 약 1000개 뉴클레오티드, 적어도 약 1200개 뉴클레오티드, 적어도 약 1400개 뉴클레오티드, 적어도 약 1500개 뉴클레오티드, 적어도 약 1600개 뉴클레오티드, 적어도 약 1800개 뉴클레오티드 또는 적어도 약 2000개 뉴클레오티드의 서열을 표적화한다.
일부 실시양태에서, ASO는 NIE의 5' 말단으로부터의 하류 약 1 내지 약 500개 뉴클레오티드의 서열을 표적화한다. 일부 실시양태에서, ASO는 NIE 영역의 5' 말단으로부터의 하류 적어도 약 1개 뉴클레오티드, 적어도 약 10개 뉴클레오티드, 적어도 약 20개 뉴클레오티드, 적어도 약 50개 뉴클레오티드, 적어도 약 80개 뉴클레오티드, 적어도 약 85개 뉴클레오티드, 적어도 약 90개 뉴클레오티드, 적어도 약 95개 뉴클레오티드, 적어도 약 96개 뉴클레오티드, 적어도 약 97개 뉴클레오티드, 적어도 약 98개 뉴클레오티드, 적어도 약 99개 뉴클레오티드, 적어도 약 100개 뉴클레오티드, 적어도 약 101개 뉴클레오티드, 적어도 약 102개 뉴클레오티드, 적어도 약 103개 뉴클레오티드, 적어도 약 104개 뉴클레오티드, 적어도 약 105개 뉴클레오티드, 적어도 약 110개 뉴클레오티드, 적어도 약 120개 뉴클레오티드, 적어도 약 150개 뉴클레오티드, 적어도 약 200개 뉴클레오티드, 적어도 약 300개 뉴클레오티드, 적어도 약 400개 뉴클레오티드 또는 적어도 약 500개 뉴클레오티드의 서열을 표적화한다.
일부 실시양태에서, ASO는 NIE의 3' 말단으로부터의 상류 약 1 내지 약 500개 뉴클레오티드의 서열을 표적화한다. 일부 실시양태에서, ASO는 NIE 영역의 3' 말단으로부터의 상류 적어도 약 1개 뉴클레오티드, 적어도 약 10개 뉴클레오티드, 적어도 약 20개 뉴클레오티드, 적어도 약 50개 뉴클레오티드, 적어도 약 80개 뉴클레오티드, 적어도 약 85개 뉴클레오티드, 적어도 약 90개 뉴클레오티드, 적어도 약 95개 뉴클레오티드, 적어도 약 96개 뉴클레오티드, 적어도 약 97개 뉴클레오티드, 적어도 약 98개 뉴클레오티드, 적어도 약 99개 뉴클레오티드, 적어도 약 100개 뉴클레오티드, 적어도 약 101개 뉴클레오티드, 적어도 약 102개 뉴클레오티드, 적어도 약 103개 뉴클레오티드, 적어도 약 104개 뉴클레오티드, 적어도 약 105개 뉴클레오티드, 적어도 약 110개 뉴클레오티드, 적어도 약 120개 뉴클레오티드, 적어도 약 150개 뉴클레오티드, 적어도 약 200개 뉴클레오티드, 적어도 약 300개 뉴클레오티드, 적어도 약 400개 뉴클레오티드 또는 적어도 약 500개 뉴클레오티드의 서열을 표적화한다.
일부 실시양태에서, ASO는 NIE의 3' 말단으로부터 하류(또는 3')의 약 1 내지 약 2000개 뉴클레오티드의 서열을 표적화한다. 일부 실시양태에서, ASO는 NIE의 3' 말단으로부터 하류(또는 3')의 약 1 내지 약 20개 뉴클레오티드, 약 20 내지 약 50개 뉴클레오티드, 약 50 내지 약 100개 뉴클레오티드, 약 100 내지 약 150개 뉴클레오티드, 약 150 내지 약 200개 뉴클레오티드, 약 200 내지 약 250개 뉴클레오티드, 약 250 내지 약 300개, 약 250 내지 약 300개 뉴클레오티드, 약 350 내지 약 400개 뉴클레오티드, 약 450 내지 약 500개 뉴클레오티드, 약 550 내지 약 600개 뉴클레오티드, 약 650 내지 약 700개 뉴클레오티드, 약 750 내지 약 800개 뉴클레오티드, 약 850 내지 약 900개 뉴클레오티드, 약 950 내지 약 1000개 뉴클레오티드, 약 1050 내지 약 1100개 뉴클레오티드, 약 1150 내지 약 1200개 뉴클레오티드, 약 1250 내지 약 1300개 뉴클레오티드, 약 1350 내지 약 1400개 뉴클레오티드, 약 1450 내지 약 1500개 뉴클레오티드, 약 1550 내지 약 1600개 뉴클레오티드, 약 1650 내지 약 1700개 뉴클레오티드, 약 1750 내지 약 1800개 뉴클레오티드, 약 1850 내지 약 1900개 뉴클레오티드 또는 약 1950 내지 약 2000개 뉴클레오티드의 서열을 표적화한다. 일부 실시양태에서, ASO는 NIE의 3' 말단으로부터 하류(또는 3')의 약 1 내지 약 20개 뉴클레오티드, 약 20 내지 약 50개 뉴클레오티드, 약 50 내지 약 100개 뉴클레오티드, 약 100 내지 약 150개 뉴클레오티드, 약 150 내지 약 200개 뉴클레오티드, 약 200 내지 약 250개 뉴클레오티드, 약 250 내지 약 300개, 약 250 내지 약 300개 뉴클레오티드, 약 350 내지 약 400개 뉴클레오티드, 약 450 내지 약 500개 뉴클레오티드, 약 550 내지 약 600개 뉴클레오티드, 약 650 내지 약 700개 뉴클레오티드, 약 750 내지 약 800개 뉴클레오티드, 약 850 내지 약 900개 뉴클레오티드 또는 약 950 내지 약 1000개 뉴클레오티드의 서열을 표적화한다.
일부 실시양태에서, ASO는 NIE의 3' 말단으로부터 하류(또는 3')의 적어도 약 1개 뉴클레오티드, 적어도 약 10개 뉴클레오티드, 적어도 약 20개 뉴클레오티드, 적어도 약 50개 뉴클레오티드, 적어도 약 80개 뉴클레오티드, 적어도 약 85개 뉴클레오티드, 적어도 약 90개 뉴클레오티드, 적어도 약 95개 뉴클레오티드, 적어도 약 96개 뉴클레오티드, 적어도 약 97개 뉴클레오티드, 적어도 약 98개 뉴클레오티드, 적어도 약 99개 뉴클레오티드, 적어도 약 100개 뉴클레오티드, 적어도 약 101개 뉴클레오티드, 적어도 약 102개 뉴클레오티드, 적어도 약 103개 뉴클레오티드, 적어도 약 104개 뉴클레오티드, 적어도 약 105개 뉴클레오티드, 적어도 약 110개 뉴클레오티드, 적어도 약 120개 뉴클레오티드, 적어도 약 150개 뉴클레오티드, 적어도 약 200개 뉴클레오티드, 적어도 약 300개 뉴클레오티드, 적어도 약 400개 뉴클레오티드, 적어도 약 500개 뉴클레오티드, 적어도 약 600개 뉴클레오티드, 적어도 약 700개 뉴클레오티드, 적어도 약 800개 뉴클레오티드, 적어도 약 900개 뉴클레오티드, 적어도 약 1000개 뉴클레오티드, 적어도 약 1200개 뉴클레오티드, 적어도 약 1400개 뉴클레오티드, 적어도 약 1500개 뉴클레오티드, 적어도 약 1600개 뉴클레오티드, 적어도 약 1800개 뉴클레오티드 또는 적어도 약 2000개 뉴클레오티드의 서열을 표적화한다.
일부 실시양태에서, ASO는 NIE를 포함하는 인트론의 3' 말단으로부터의 상류 약 1 내지 약 5000개 뉴클레오티드의 서열을 표적화한다. 일부 실시양태에서, ASO는 NIE를 포함하는 인트론의 3' 말단으로부터의 상류 약 1 내지 약 20개 뉴클레오티드, 약 20 내지 약 50개 뉴클레오티드, 약 50 내지 약 100개 뉴클레오티드, 약 100 내지 약 150개 뉴클레오티드, 약 150 내지 약 200개 뉴클레오티드, 약 200 내지 약 250개 뉴클레오티드, 약 250 내지 약 300개, 약 250 내지 약 300개 뉴클레오티드, 약 350 내지 약 400개 뉴클레오티드, 약 450 내지 약 500개 뉴클레오티드, 약 550 내지 약 600개 뉴클레오티드, 약 650 내지 약 700개 뉴클레오티드, 약 750 내지 약 800개 뉴클레오티드, 약 850 내지 약 900개 뉴클레오티드, 약 950 내지 약 1000개 뉴클레오티드, 약 1050 내지 약 1100개 뉴클레오티드, 약 1150 내지 약 1200개 뉴클레오티드, 약 1250 내지 약 1300개 뉴클레오티드, 약 1350 내지 약 1400개 뉴클레오티드, 약 1450 내지 약 1500개 뉴클레오티드, 약 1550 내지 약 1600개 뉴클레오티드, 약 1650 내지 약 1700개 뉴클레오티드, 약 1750 내지 약 1800개 뉴클레오티드, 약 1850 내지 약 1900개 뉴클레오티드, 약 1950 내지 약 2000개 뉴클레오티드, 약 2000 내지 약 3000개 뉴클레오티드, 약 3000 내지 약 4000개 뉴클레오티드 또는 약 4000 내지 약 5000개 뉴클레오티드의 서열을 표적화한다. 일부 실시양태에서, ASO는 NIE를 포함하는 인트론의 3' 말단으로부터의 상류 약 1 내지 약 20개 뉴클레오티드, 약 20 내지 약 50개 뉴클레오티드, 약 50 내지 약 100개 뉴클레오티드, 약 100 내지 약 150개 뉴클레오티드, 약 150 내지 약 200개 뉴클레오티드, 약 200 내지 약 250개 뉴클레오티드, 약 250 내지 약 300개, 약 250 내지 약 300개 뉴클레오티드, 약 350 내지 약 400개 뉴클레오티드, 약 450 내지 약 500개 뉴클레오티드, 약 550 내지 약 600개 뉴클레오티드, 약 650 내지 약 700개 뉴클레오티드, 약 750 내지 약 800개 뉴클레오티드, 약 850 내지 약 900개 뉴클레오티드 또는 약 950 내지 약 1000개 뉴클레오티드의 서열을 표적화한다.
일부 실시양태에서, ASO는 NIE를 포함하는 인트론의 3' 말단으로부터의 상류 적어도 약 1개 뉴클레오티드, 적어도 약 10개 뉴클레오티드, 적어도 약 20개 뉴클레오티드, 적어도 약 50개 뉴클레오티드, 적어도 약 80개 뉴클레오티드, 적어도 약 85개 뉴클레오티드, 적어도 약 90개 뉴클레오티드, 적어도 약 95개 뉴클레오티드, 적어도 약 96개 뉴클레오티드, 적어도 약 97개 뉴클레오티드, 적어도 약 98개 뉴클레오티드, 적어도 약 99개 뉴클레오티드, 적어도 약 100개 뉴클레오티드, 적어도 약 101개 뉴클레오티드, 적어도 약 102개 뉴클레오티드, 적어도 약 103개 뉴클레오티드, 적어도 약 104개 뉴클레오티드, 적어도 약 105개 뉴클레오티드, 적어도 약 110개 뉴클레오티드, 적어도 약 120개 뉴클레오티드, 적어도 약 150개 뉴클레오티드, 적어도 약 200개 뉴클레오티드, 적어도 약 300개 뉴클레오티드, 적어도 약 400개 뉴클레오티드, 적어도 약 500개 뉴클레오티드, 적어도 약 600개 뉴클레오티드, 적어도 약 700개 뉴클레오티드, 적어도 약 800개 뉴클레오티드, 적어도 약 900개 뉴클레오티드, 적어도 약 1000개 뉴클레오티드, 적어도 약 1200개 뉴클레오티드, 적어도 약 1400개 뉴클레오티드, 적어도 약 1500개 뉴클레오티드, 적어도 약 1600개 뉴클레오티드, 적어도 약 1800개 뉴클레오티드, 적어도 약 2000개 뉴클레오티드, 적어도 약 3000개 뉴클레오티드, 적어도 약 4000개 뉴클레오티드 또는 적어도 약 5000개 뉴클레오티드의 서열을 표적화한다.
일부 실시양태에서, ASO는 NIE의 5' 말단으로부터 상류(또는 5')의 약 4 내지 약 300개 뉴클레오티드의 서열을 표적화한다. 일부 실시양태에서, ASO는 NIE 영역의 5' 말단으로부터 상류(또는 5')의 약 1 내지 약 20개 뉴클레오티드, 약 20 내지 약 50개 뉴클레오티드, 약 50 내지 약 100개 뉴클레오티드, 약 100 내지 약 150개 뉴클레오티드, 약 150 내지 약 200개 뉴클레오티드, 약 200 내지 약 250개 뉴클레오티드, 약 250 내지 약 300개, 약 250 내지 약 300개 뉴클레오티드, 약 350 내지 약 400개 뉴클레오티드, 약 450 내지 약 500개 뉴클레오티드, 약 550 내지 약 600개 뉴클레오티드, 약 650 내지 약 700개 뉴클레오티드, 약 750 내지 약 800개 뉴클레오티드, 약 850 내지 약 900개 뉴클레오티드, 약 950 내지 약 1000개 뉴클레오티드, 약 1050 내지 약 1100개 뉴클레오티드, 약 1150 내지 약 1200개 뉴클레오티드, 약 1250 내지 약 1300개 뉴클레오티드, 약 1350 내지 약 1400개 뉴클레오티드 또는 약 1450 내지 약 1500개 뉴클레오티드의 서열을 표적화한다. 일부 실시양태에서, ASO는 NIE의 5' 말단으로부터의 상류 300개 초과의 뉴클레오티드의 서열을 표적화할 수 있다. 일부 실시양태에서, ASO는 NIE의 3' 말단으로부터 하류(또는 3')의 약 4 내지 약 300개 뉴클레오티드의 서열을 표적화할 수 있다. 일부 실시양태에서, ASO는 NIE의 3' 말단으로부터의 하류 약 1 내지 약 20개 뉴클레오티드, 약 20 내지 약 50개 뉴클레오티드, 약 50 내지 약 100개 뉴클레오티드, 약 100 내지 약 150개 뉴클레오티드, 약 150 내지 약 200개 뉴클레오티드, 약 200 내지 약 250개 뉴클레오티드, 약 250 내지 약 300개 뉴클레오티드, 약 350 내지 약 400개 뉴클레오티드, 약 450 내지 약 500개 뉴클레오티드, 약 550 내지 약 600개 뉴클레오티드, 약 650 내지 약 700개 뉴클레오티드, 약 750 내지 약 800개 뉴클레오티드, 약 850 내지 약 900개 뉴클레오티드, 약 950 내지 약 1000개 뉴클레오티드, 약 1050 내지 약 1100개 뉴클레오티드, 약 1150 내지 약 1200개 뉴클레오티드, 약 1250 내지 약 1300개 뉴클레오티드, 약 1350 내지 약 1400개 뉴클레오티드 또는 약 1450 내지 약 1500개 뉴클레오티드의 서열을 표적화한다. 일부 실시양태에서, ASO는 NIE의 3' 말단으로부터의 하류 300개 초과의 뉴클레오티드의 서열을 표적화한다.
일부 실시양태에서, ASO는 NIE의 5' 말단으로부터 상류(또는 5')의 약 4 내지 약 300개 뉴클레오티드의 서열을 표적화한다. 일부 실시양태에서, ASO는 NIE 영역의 5' 말단으로부터 상류(또는 5')의 적어도 약 1개 뉴클레오티드, 적어도 약 10개 뉴클레오티드, 적어도 약 20개 뉴클레오티드, 적어도 약 50개 뉴클레오티드, 적어도 약 80개 뉴클레오티드, 적어도 약 85개 뉴클레오티드, 적어도 약 90개 뉴클레오티드, 적어도 약 95개 뉴클레오티드, 적어도 약 96개 뉴클레오티드, 적어도 약 97개 뉴클레오티드, 적어도 약 98개 뉴클레오티드, 적어도 약 99개 뉴클레오티드, 적어도 약 100개 뉴클레오티드, 적어도 약 101개 뉴클레오티드, 적어도 약 102개 뉴클레오티드, 적어도 약 103개 뉴클레오티드, 적어도 약 104개 뉴클레오티드, 적어도 약 105개 뉴클레오티드, 적어도 약 110개 뉴클레오티드, 적어도 약 120개 뉴클레오티드, 적어도 약 150개 뉴클레오티드, 적어도 약 200개 뉴클레오티드, 적어도 약 300개 뉴클레오티드, 적어도 약 400개 뉴클레오티드, 적어도 약 500개 뉴클레오티드, 적어도 약 600개 뉴클레오티드, 적어도 약 700개 뉴클레오티드, 적어도 약 800개 뉴클레오티드, 적어도 약 900개 뉴클레오티드 또는 적어도 약 1000개 뉴클레오티드의 서열을 표적화한다. 일부 실시양태에서, ASO는 NIE의 3' 말단으로부터 하류(또는 3')의 약 4 내지 약 300개 뉴클레오티드의 서열을 표적화한다. 일부 실시양태에서, ASO는 NIE의 3' 말단으로부터의 하류 적어도 약 1개 뉴클레오티드, 적어도 약 10개 뉴클레오티드, 적어도 약 20개 뉴클레오티드, 적어도 약 50개 뉴클레오티드, 적어도 약 80개 뉴클레오티드, 적어도 약 85개 뉴클레오티드, 적어도 약 90개 뉴클레오티드, 적어도 약 95개 뉴클레오티드, 적어도 약 96개 뉴클레오티드, 적어도 약 97개 뉴클레오티드, 적어도 약 98개 뉴클레오티드, 적어도 약 99개 뉴클레오티드, 적어도 약 100개 뉴클레오티드, 적어도 약 101개 뉴클레오티드, 적어도 약 102개 뉴클레오티드, 적어도 약 103개 뉴클레오티드, 적어도 약 104개 뉴클레오티드, 적어도 약 105개 뉴클레오티드, 적어도 약 110개 뉴클레오티드, 적어도 약 120개 뉴클레오티드, 적어도 약 150개 뉴클레오티드, 적어도 약 200개 뉴클레오티드, 적어도 약 300개 뉴클레오티드, 적어도 약 400개 뉴클레오티드, 적어도 약 500개 뉴클레오티드, 적어도 약 600개 뉴클레오티드, 적어도 약 700개 뉴클레오티드, 적어도 약 800개 뉴클레오티드, 적어도 약 900개 뉴클레오티드 또는 적어도 약 1000개 뉴클레오티드의 서열을 표적화한다. 일부 실시양태에서, ASO는 NIE의 3' 말단으로부터의 하류 300개 초과의 뉴클레오티드의 서열을 표적화한다.
일부 실시양태에서, ASO는 NIE의 5' 말단으로부터 상류(또는 5')의 약 4 내지 약 300개 뉴클레오티드의 서열을 표적화한다. 일부 실시양태에서, ASO는 NIE 영역의 5' 말단으로부터 상류(또는 5')의 최대 약 10개 뉴클레오티드, 최대 약 20개 뉴클레오티드, 최대 약 50개 뉴클레오티드, 최대 약 80개 뉴클레오티드, 최대 약 85개 뉴클레오티드, 최대 약 90개 뉴클레오티드, 최대 약 95개 뉴클레오티드, 최대 약 96개 뉴클레오티드, 최대 약 97개 뉴클레오티드, 최대 약 98개 뉴클레오티드, 최대 약 99개 뉴클레오티드, 최대 약 100개 뉴클레오티드, 최대 약 101개 뉴클레오티드, 최대 약 102개 뉴클레오티드, 최대 약 103개 뉴클레오티드, 최대 약 104개 뉴클레오티드, 최대 약 105개 뉴클레오티드, 최대 약 110개 뉴클레오티드, 최대 약 120개 뉴클레오티드, 최대 약 150개 뉴클레오티드, 최대 약 200개 뉴클레오티드, 최대 약 300개 뉴클레오티드, 최대 약 400개 뉴클레오티드, 최대 약 500개 뉴클레오티드, 최대 약 600개 뉴클레오티드, 최대 약 700개 뉴클레오티드, 최대 약 800개 뉴클레오티드, 최대 약 900개 뉴클레오티드, 최대 약 1000개 뉴클레오티드, 최대 약 1100개 뉴클레오티드, 최대 약 1200개 뉴클레오티드, 최대 약 1300개 뉴클레오티드, 최대 약 1400개 뉴클레오티드 또는 최대 약 1500개 뉴클레오티드의 서열을 표적화한다. 일부 실시양태에서, ASO는 NIE의 3' 말단으로부터 하류(또는 3')의 약 4 내지 약 300개 뉴클레오티드의 서열을 표적화한다. 일부 실시양태에서, ASO는 NIE의 3' 말단으로부터의 하류 최대 약 10개 뉴클레오티드, 최대 약 20개 뉴클레오티드, 최대 약 50개 뉴클레오티드, 최대 약 80개 뉴클레오티드, 최대 약 85개 뉴클레오티드, 최대 약 90개 뉴클레오티드, 최대 약 95개 뉴클레오티드, 최대 약 96개 뉴클레오티드, 최대 약 97개 뉴클레오티드, 최대 약 98개 뉴클레오티드, 최대 약 99개 뉴클레오티드, 최대 약 100개 뉴클레오티드, 최대 약 101개 뉴클레오티드, 최대 약 102개 뉴클레오티드, 최대 약 103개 뉴클레오티드, 최대 약 104개 뉴클레오티드, 최대 약 105개 뉴클레오티드, 최대 약 110개 뉴클레오티드, 최대 약 120개 뉴클레오티드, 최대 약 150개 뉴클레오티드, 최대 약 200개 뉴클레오티드, 최대 약 300개 뉴클레오티드, 최대 약 400개 뉴클레오티드, 최대 약 500개 뉴클레오티드, 최대 약 600개 뉴클레오티드, 최대 약 700개 뉴클레오티드, 최대 약 800개 뉴클레오티드, 최대 약 900개 뉴클레오티드 또는 최대 약 1000개 뉴클레오티드, 최대 약 1100개 뉴클레오티드, 최대 약 1200개 뉴클레오티드, 최대 약 1300개 뉴클레오티드, 최대 약 1400개 뉴클레오티드 또는 최대 약 1500개 뉴클레오티드의 서열을 표적화한다. 일부 실시양태에서, ASO는 NIE의 3' 말단으로부터의 하류 300개 초과의 뉴클레오티드의 서열을 표적화한다.
일부 실시양태에서, 본원에 설명된 NIE(엑손 23)는 GRCh38/hg38: chr2: 166007230과 chr2: 166007293 사이에 위치한다. 일부 실시양태에서, NIE의 5' 말단은 GRCh38/hg38: chr2: 166007230에 위치한다. 일부 실시양태에서, NIE의 3' 말단은 GRCh38/hg38: chr2: 166007293에 위치한다.
일부 실시양태에서, ASO는 게놈 부위 GRCh38/hg38: chr2: 166007230으로부터 상류(또는 5')의 약 1 내지 약 2000개 뉴클레오티드의 서열을 표적화한다. 일부 실시양태에서, ASO는 게놈 부위 GRCh38/hg38: chr2: 166007230으로부터 상류(또는 5')의 약 1 내지 약 20개 뉴클레오티드, 약 20 내지 약 50개 뉴클레오티드, 약 50 내지 약 100개 뉴클레오티드, 약 100 내지 약 150개 뉴클레오티드, 약 150 내지 약 200개 뉴클레오티드, 약 200 내지 약 250개 뉴클레오티드, 약 250 내지 약 300개, 약 250 내지 약 300개 뉴클레오티드, 약 350 내지 약 400개 뉴클레오티드, 약 450 내지 약 500개 뉴클레오티드, 약 550 내지 약 600개 뉴클레오티드, 약 650 내지 약 700개 뉴클레오티드, 약 750 내지 약 800개 뉴클레오티드, 약 850 내지 약 900개 뉴클레오티드, 약 950 내지 약 1000개 뉴클레오티드, 약 1050 내지 약 1100개 뉴클레오티드, 약 1150 내지 약 1200개 뉴클레오티드, 약 1250 내지 약 1300개 뉴클레오티드, 약 1350 내지 약 1400개 뉴클레오티드, 약 1450 내지 약 1500개 뉴클레오티드, 약 1550 내지 약 1600개 뉴클레오티드, 약 1650 내지 약 1700개 뉴클레오티드, 약 1750 내지 약 1800개 뉴클레오티드, 약 1850 내지 약 1900개 뉴클레오티드 또는 약 1950 내지 약 2000개 뉴클레오티드의 서열을 표적화한다. 일부 실시양태에서, ASO는 게놈 부위 GRCh38/hg38: chr2: 166007230으로부터 상류(또는 5')의 약 1 내지 약 20개 뉴클레오티드, 약 20 내지 약 50개 뉴클레오티드, 약 50 내지 약 100개 뉴클레오티드, 약 100 내지 약 150개 뉴클레오티드, 약 150 내지 약 200개 뉴클레오티드, 약 200 내지 약 250개 뉴클레오티드, 약 250 내지 약 300개, 약 250 내지 약 300개 뉴클레오티드, 약 350 내지 약 400개 뉴클레오티드, 약 450 내지 약 500개 뉴클레오티드, 약 550 내지 약 600개 뉴클레오티드, 약 650 내지 약 700개 뉴클레오티드, 약 750 내지 약 800개 뉴클레오티드, 약 850 내지 약 900개 뉴클레오티드 또는 약 950 내지 약 1000개 뉴클레오티드의 서열을 표적화한다.
일부 실시양태에서, ASO는 게놈 부위 GRCh38/hg38: chr2: 166007230으로부터 상류(또는 5')의 적어도 약 1개 뉴클레오티드, 적어도 약 10개 뉴클레오티드, 적어도 약 20개 뉴클레오티드, 적어도 약 50개 뉴클레오티드, 적어도 약 80개 뉴클레오티드, 적어도 약 85개 뉴클레오티드, 적어도 약 90개 뉴클레오티드, 적어도 약 95개 뉴클레오티드, 적어도 약 96개 뉴클레오티드, 적어도 약 97개 뉴클레오티드, 적어도 약 98개 뉴클레오티드, 적어도 약 99개 뉴클레오티드, 적어도 약 100개 뉴클레오티드, 적어도 약 101개 뉴클레오티드, 적어도 약 102개 뉴클레오티드, 적어도 약 103개 뉴클레오티드, 적어도 약 104개 뉴클레오티드, 적어도 약 105개 뉴클레오티드, 적어도 약 110개 뉴클레오티드, 적어도 약 120개 뉴클레오티드, 적어도 약 150개 뉴클레오티드, 적어도 약 200개 뉴클레오티드, 적어도 약 300개 뉴클레오티드, 적어도 약 400개 뉴클레오티드, 적어도 약 500개 뉴클레오티드, 적어도 약 600개 뉴클레오티드, 적어도 약 700개 뉴클레오티드, 적어도 약 800개 뉴클레오티드, 적어도 약 900개 뉴클레오티드, 적어도 약 1000개 뉴클레오티드, 적어도 약 1200개 뉴클레오티드, 적어도 약 1400개 뉴클레오티드, 적어도 약 1500개 뉴클레오티드, 적어도 약 1600개 뉴클레오티드, 적어도 약 1800개 뉴클레오티드 또는 적어도 약 2000개 뉴클레오티드의 서열을 표적화한다.
일부 실시양태에서, ASO는 게놈 부위 GRCh38/hg38: chr2: 166007230으로부터의 하류 약 1 내지 약 500개 뉴클레오티드의 서열을 표적화한다. 일부 실시양태에서, ASO는 게놈 부위 GRCh38/hg38: chr2: 166007230으로부터의 하류 적어도 약 1개 뉴클레오티드, 적어도 약 10개 뉴클레오티드, 적어도 약 20개 뉴클레오티드, 적어도 약 50개 뉴클레오티드, 적어도 약 80개 뉴클레오티드, 적어도 약 85개 뉴클레오티드, 적어도 약 90개 뉴클레오티드, 적어도 약 95개 뉴클레오티드, 적어도 약 96개 뉴클레오티드, 적어도 약 97개 뉴클레오티드, 적어도 약 98개 뉴클레오티드, 적어도 약 99개 뉴클레오티드, 적어도 약 100개 뉴클레오티드, 적어도 약 101개 뉴클레오티드, 적어도 약 102개 뉴클레오티드, 적어도 약 103개 뉴클레오티드, 적어도 약 104개 뉴클레오티드, 적어도 약 105개 뉴클레오티드, 적어도 약 110개 뉴클레오티드, 적어도 약 120개 뉴클레오티드, 적어도 약 150개 뉴클레오티드, 적어도 약 200개 뉴클레오티드, 적어도 약 300개 뉴클레오티드, 적어도 약 400개 뉴클레오티드 또는 적어도 약 500개 뉴클레오티드의 서열을 표적화한다.
일부 실시양태에서, ASO는 게놈 부위 GRCh38/hg38: chr2: 166007293으로부터의 상류 약 1 내지 약 500개 뉴클레오티드의 서열을 표적화한다. 일부 실시양태에서, ASO는 게놈 부위 GRCh38/hg38: chr2: 166007293으로부터의 상류 적어도 약 1개 뉴클레오티드, 적어도 약 10개 뉴클레오티드, 적어도 약 20개 뉴클레오티드, 적어도 약 50개 뉴클레오티드, 적어도 약 80개 뉴클레오티드, 적어도 약 85개 뉴클레오티드, 적어도 약 90개 뉴클레오티드, 적어도 약 95개 뉴클레오티드, 적어도 약 96개 뉴클레오티드, 적어도 약 97개 뉴클레오티드, 적어도 약 98개 뉴클레오티드, 적어도 약 99개 뉴클레오티드, 적어도 약 100개 뉴클레오티드, 적어도 약 101개 뉴클레오티드, 적어도 약 102개 뉴클레오티드, 적어도 약 103개 뉴클레오티드, 적어도 약 104개 뉴클레오티드, 적어도 약 105개 뉴클레오티드, 적어도 약 110개 뉴클레오티드, 적어도 약 120개 뉴클레오티드, 적어도 약 150개 뉴클레오티드, 적어도 약 200개 뉴클레오티드, 적어도 약 300개 뉴클레오티드, 적어도 약 400개 뉴클레오티드 또는 적어도 약 500개 뉴클레오티드의 서열을 표적화한다.
일부 실시양태에서, ASO는 게놈 부위 GRCh38/hg38: chr2: 166007293으로부터 하류(또는 3') 약 1 내지 약 2000개 뉴클레오티드의 서열을 표적화한다. 일부 실시양태에서, ASO는 게놈 부위 GRCh38/hg38: chr2: 166007293으로부터 하류(또는 3')의 약 1 내지 약 20개 뉴클레오티드, 약 20 내지 약 50개 뉴클레오티드, 약 50 내지 약 100개 뉴클레오티드, 약 100 내지 약 150개 뉴클레오티드, 약 150 내지 약 200개 뉴클레오티드, 약 200 내지 약 250개 뉴클레오티드, 약 250 내지 약 300개, 약 250 내지 약 300개 뉴클레오티드, 약 350 내지 약 400개 뉴클레오티드, 약 450 내지 약 500개 뉴클레오티드, 약 550 내지 약 600개 뉴클레오티드, 약 650 내지 약 700개 뉴클레오티드, 약 750 내지 약 800개 뉴클레오티드, 약 850 내지 약 900개 뉴클레오티드, 약 950 내지 약 1000개 뉴클레오티드, 약 1050 내지 약 1100개 뉴클레오티드, 약 1150 내지 약 1200개 뉴클레오티드, 약 1250 내지 약 1300개 뉴클레오티드, 약 1350 내지 약 1400개 뉴클레오티드, 약 1450 내지 약 1500개 뉴클레오티드, 약 1550 내지 약 1600개 뉴클레오티드, 약 1650 내지 약 1700개 뉴클레오티드, 약 1750 내지 약 1800개 뉴클레오티드, 약 1850 내지 약 1900개 뉴클레오티드 또는 약 1950 내지 약 2000개 뉴클레오티드의 서열을 표적화한다. 일부 실시양태에서, ASO는 게놈 부위 GRCh38/hg38: chr2: 166007293으로부터 하류(또는 3')의 약 1 내지 약 20개 뉴클레오티드, 약 20 내지 약 50개 뉴클레오티드, 약 50 내지 약 100개 뉴클레오티드, 약 100 내지 약 150개 뉴클레오티드, 약 150 내지 약 200개 뉴클레오티드, 약 200 내지 약 250개 뉴클레오티드, 약 250 내지 약 300개, 약 250 내지 약 300개 뉴클레오티드, 약 350 내지 약 400개 뉴클레오티드, 약 450 내지 약 500개 뉴클레오티드, 약 550 내지 약 600개 뉴클레오티드, 약 650 내지 약 700개 뉴클레오티드, 약 750 내지 약 800개 뉴클레오티드, 약 850 내지 약 900개 뉴클레오티드 또는 약 950 내지 약 1000개 뉴클레오티드의 서열을 표적화한다.
일부 실시양태에서, ASO는 게놈 부위 GRCh38/hg38: chr2: 166007293으로부터 하류(또는 3')의 적어도 약 1개 뉴클레오티드, 적어도 약 10개 뉴클레오티드, 적어도 약 20개 뉴클레오티드, 적어도 약 50개 뉴클레오티드, 적어도 약 80개 뉴클레오티드, 적어도 약 85개 뉴클레오티드, 적어도 약 90개 뉴클레오티드, 적어도 약 95개 뉴클레오티드, 적어도 약 96개 뉴클레오티드, 적어도 약 97개 뉴클레오티드, 적어도 약 98개 뉴클레오티드, 적어도 약 99개 뉴클레오티드, 적어도 약 100개 뉴클레오티드, 적어도 약 101개 뉴클레오티드, 적어도 약 102개 뉴클레오티드, 적어도 약 103개 뉴클레오티드, 적어도 약 104개 뉴클레오티드, 적어도 약 105개 뉴클레오티드, 적어도 약 110개 뉴클레오티드, 적어도 약 120개 뉴클레오티드, 적어도 약 150개 뉴클레오티드, 적어도 약 200개 뉴클레오티드, 적어도 약 300개 뉴클레오티드, 적어도 약 400개 뉴클레오티드, 적어도 약 500개 뉴클레오티드, 적어도 약 600개 뉴클레오티드, 적어도 약 700개 뉴클레오티드, 적어도 약 800개 뉴클레오티드, 적어도 약 900개 뉴클레오티드, 적어도 약 1000개 뉴클레오티드, 적어도 약 1200개 뉴클레오티드, 적어도 약 1400개 뉴클레오티드, 적어도 약 1500개 뉴클레오티드, 적어도 약 1600개 뉴클레오티드, 적어도 약 1800개 뉴클레오티드 또는 적어도 약 2000개 뉴클레오티드의 서열을 표적화한다.
일부 실시양태에서, NIE를 포함하는 인트론은 GRCh38/hg38: chr2: 166002754와 chr2: 166009718 사이에 위치한다.　 일부 실시양태에서, NIE를 포함하는 인트론의 5' 말단은 GRCh38/hg38: chr2: 166002754에 위치한다.　 일부 실시양태에서, NIE를 포함하는 인트론의 3' 말단은 GRCh38/hg38: chr2: 166009718에 위치한다.
일부 실시양태에서, ASO는 게놈 부위 GRCh38/hg38: chr2: 166002754로부터의 하류 약 1 내지 약 5000개 뉴클레오티드의 서열을 표적화한다. 일부 실시양태에서, ASO는 게놈 부위 GRCh38/hg38: chr2: 166002754로부터의 하류 약 1 내지 약 20개 뉴클레오티드, 약 20 내지 약 50개 뉴클레오티드, 약 50 내지 약 100개 뉴클레오티드, 약 100 내지 약 150개 뉴클레오티드, 약 150 내지 약 200개 뉴클레오티드, 약 200 내지 약 250개 뉴클레오티드, 약 250 내지 약 300개, 약 250 내지 약 300개 뉴클레오티드, 약 350 내지 약 400개 뉴클레오티드, 약 450 내지 약 500개 뉴클레오티드, 약 550 내지 약 600개 뉴클레오티드, 약 650 내지 약 700개 뉴클레오티드, 약 750 내지 약 800개 뉴클레오티드, 약 850 내지 약 900개 뉴클레오티드, 약 950 내지 약 1000개 뉴클레오티드, 약 1050 내지 약 1100개 뉴클레오티드, 약 1150 내지 약 1200개 뉴클레오티드, 약 1250 내지 약 1300개 뉴클레오티드, 약 1350 내지 약 1400개 뉴클레오티드, 약 1450 내지 약 1500개 뉴클레오티드, 약 1550 내지 약 1600개 뉴클레오티드, 약 1650 내지 약 1700개 뉴클레오티드, 약 1750 내지 약 1800개 뉴클레오티드, 약 1850 내지 약 1900개 뉴클레오티드, 약 1950 내지 약 2000개 뉴클레오티드, 약 2000 내지 약 3000개 뉴클레오티드, 약 3000 내지 약 4000개 뉴클레오티드 또는 약 4000 내지 약 5000개 뉴클레오티드의 서열을 표적화한다. 일부 실시양태에서, ASO는 게놈 부위 GRCh38/hg38: chr2: 166002754로부터의 하류 약 1 내지 약 20개 뉴클레오티드, 약 20 내지 약 50개 뉴클레오티드, 약 50 내지 약 100개 뉴클레오티드, 약 100 내지 약 150개 뉴클레오티드, 약 150 내지 약 200개 뉴클레오티드, 약 200 내지 약 250개 뉴클레오티드, 약 250 내지 약 300개, 약 250 내지 약 300개 뉴클레오티드, 약 350 내지 약 400개 뉴클레오티드, 약 450 내지 약 500개 뉴클레오티드, 약 550 내지 약 600개 뉴클레오티드, 약 650 내지 약 700개 뉴클레오티드, 약 750 내지 약 800개 뉴클레오티드, 약 850 내지 약 900개 뉴클레오티드 또는 약 950 내지 약 1000개 뉴클레오티드의 서열을 표적화한다.
일부 실시양태에서, ASO는 게놈 부위 GRCh38/hg38: chr2: 166002754로부터의 하류 적어도 약 1개 뉴클레오티드, 적어도 약 10개 뉴클레오티드, 적어도 약 20개 뉴클레오티드, 적어도 약 50개 뉴클레오티드, 적어도 약 80개 뉴클레오티드, 적어도 약 85개 뉴클레오티드, 적어도 약 90개 뉴클레오티드, 적어도 약 95개 뉴클레오티드, 적어도 약 96개 뉴클레오티드, 적어도 약 97개 뉴클레오티드, 적어도 약 98개 뉴클레오티드, 적어도 약 99개 뉴클레오티드, 적어도 약 100개 뉴클레오티드, 적어도 약 101개 뉴클레오티드, 적어도 약 102개 뉴클레오티드, 적어도 약 103개 뉴클레오티드, 적어도 약 104개 뉴클레오티드, 적어도 약 105개 뉴클레오티드, 적어도 약 110개 뉴클레오티드, 적어도 약 120개 뉴클레오티드, 적어도 약 150개 뉴클레오티드, 적어도 약 200개 뉴클레오티드, 적어도 약 300개 뉴클레오티드, 적어도 약 400개 뉴클레오티드, 적어도 약 500개 뉴클레오티드, 적어도 약 600개 뉴클레오티드, 적어도 약 700개 뉴클레오티드, 적어도 약 800개 뉴클레오티드, 적어도 약 900개 뉴클레오티드, 적어도 약 1000개 뉴클레오티드, 적어도 약 1200개 뉴클레오티드, 적어도 약 1400개 뉴클레오티드, 적어도 약 1500개 뉴클레오티드, 적어도 약 1600개 뉴클레오티드, 적어도 약 1800개 뉴클레오티드, 적어도 약 2000개 뉴클레오티드, 적어도 약 3000개 뉴클레오티드, 적어도 약 4000개 뉴클레오티드 또는 적어도 약 5000개 뉴클레오티드의 서열을 표적화한다.
일부 실시양태에서, ASO는 게놈 부위 GRCh38/hg38: chr2: 166007229로부터의 상류 약 1 내지 약 5000개 뉴클레오티드의 서열을 표적화한다. 일부 실시양태에서, ASO는 게놈 부위 GRCh38/hg38: chr2: 166007229로부터의 상류 약 1 내지 약 20개 뉴클레오티드, 약 20 내지 약 50개 뉴클레오티드, 약 50 내지 약 100개 뉴클레오티드, 약 100 내지 약 150개 뉴클레오티드, 약 150 내지 약 200개 뉴클레오티드, 약 200 내지 약 250개 뉴클레오티드, 약 250 내지 약 300개, 약 250 내지 약 300개 뉴클레오티드, 약 350 내지 약 400개 뉴클레오티드, 약 450 내지 약 500개 뉴클레오티드, 약 550 내지 약 600개 뉴클레오티드, 약 650 내지 약 700개 뉴클레오티드, 약 750 내지 약 800개 뉴클레오티드, 약 850 내지 약 900개 뉴클레오티드, 약 950 내지 약 1000개 뉴클레오티드, 약 1050 내지 약 1100개 뉴클레오티드, 약 1150 내지 약 1200개 뉴클레오티드, 약 1250 내지 약 1300개 뉴클레오티드, 약 1350 내지 약 1400개 뉴클레오티드, 약 1450 내지 약 1500개 뉴클레오티드, 약 1550 내지 약 1600개 뉴클레오티드, 약 1650 내지 약 1700개 뉴클레오티드, 약 1750 내지 약 1800개 뉴클레오티드, 약 1850 내지 약 1900개 뉴클레오티드, 약 1950 내지 약 2000개 뉴클레오티드, 약 2000 내지 약 3000개 뉴클레오티드, 약 3000 내지 약 4000개 뉴클레오티드 또는 약 4000 내지 약 5000개 뉴클레오티드의 서열을 표적화한다. 일부 실시양태에서, ASO는 게놈 부위 GRCh38/hg38: chr2: 166007229로부터의 상류 약 1 내지 약 20개 뉴클레오티드, 약 20 내지 약 50개 뉴클레오티드, 약 50 내지 약 100개 뉴클레오티드, 약 100 내지 약 150개 뉴클레오티드, 약 150 내지 약 200개 뉴클레오티드, 약 200 내지 약 250개 뉴클레오티드, 약 250 내지 약 300개, 약 250 내지 약 300개 뉴클레오티드, 약 350 내지 약 400개 뉴클레오티드, 약 450 내지 약 500개 뉴클레오티드, 약 550 내지 약 600개 뉴클레오티드, 약 650 내지 약 700개 뉴클레오티드, 약 750 내지 약 800개 뉴클레오티드, 약 850 내지 약 900개 뉴클레오티드 또는 약 950 내지 약 1000개 뉴클레오티드의 서열을 표적화한다.
일부 실시양태에서, ASO는 게놈 부위 GRCh38/hg38: chr2: 166007229로부터의 상류 적어도 약 1개 뉴클레오티드, 적어도 약 10개 뉴클레오티드, 적어도 약 20개 뉴클레오티드, 적어도 약 50개 뉴클레오티드, 적어도 약 80개 뉴클레오티드, 적어도 약 85개 뉴클레오티드, 적어도 약 90개 뉴클레오티드, 적어도 약 95개 뉴클레오티드, 적어도 약 96개 뉴클레오티드, 적어도 약 97개 뉴클레오티드, 적어도 약 98개 뉴클레오티드, 적어도 약 99개 뉴클레오티드, 적어도 약 100개 뉴클레오티드, 적어도 약 101개 뉴클레오티드, 적어도 약 102개 뉴클레오티드, 적어도 약 103개 뉴클레오티드, 적어도 약 104개 뉴클레오티드, 적어도 약 105개 뉴클레오티드, 적어도 약 110개 뉴클레오티드, 적어도 약 120개 뉴클레오티드, 적어도 약 150개 뉴클레오티드, 적어도 약 200개 뉴클레오티드, 적어도 약 300개 뉴클레오티드, 적어도 약 400개 뉴클레오티드, 적어도 약 500개 뉴클레오티드, 적어도 약 600개 뉴클레오티드, 적어도 약 700개 뉴클레오티드, 적어도 약 800개 뉴클레오티드, 적어도 약 900개 뉴클레오티드, 적어도 약 1000개 뉴클레오티드, 적어도 약 1200개 뉴클레오티드, 적어도 약 1400개 뉴클레오티드, 적어도 약 1500개 뉴클레오티드, 적어도 약 1600개 뉴클레오티드, 적어도 약 1800개 뉴클레오티드, 적어도 약 2000개 뉴클레오티드, 적어도 약 3000개 뉴클레오티드, 적어도 약 4000개 뉴클레오티드 또는 적어도 약 5000개 뉴클레오티드의 서열을 표적화한다.
일부 실시양태에서, ASO는 게놈 부위 GRCh38/hg38: chr2: 166007294로부터의 하류 약 1 내지 약 5000개 뉴클레오티드의 서열을 표적화한다. 일부 실시양태에서, ASO는 게놈 부위 GRCh38/hg38: chr2: 166007294로부터의 하류 약 1 내지 약 20개 뉴클레오티드, 약 20 내지 약 50개 뉴클레오티드, 약 50 내지 약 100개 뉴클레오티드, 약 100 내지 약 150개 뉴클레오티드, 약 150 내지 약 200개 뉴클레오티드, 약 200 내지 약 250개 뉴클레오티드, 약 250 내지 약 300개, 약 250 내지 약 300개 뉴클레오티드, 약 350 내지 약 400개 뉴클레오티드, 약 450 내지 약 500개 뉴클레오티드, 약 550 내지 약 600개 뉴클레오티드, 약 650 내지 약 700개 뉴클레오티드, 약 750 내지 약 800개 뉴클레오티드, 약 850 내지 약 900개 뉴클레오티드, 약 950 내지 약 1000개 뉴클레오티드, 약 1050 내지 약 1100개 뉴클레오티드, 약 1150 내지 약 1200개 뉴클레오티드, 약 1250 내지 약 1300개 뉴클레오티드, 약 1350 내지 약 1400개 뉴클레오티드, 약 1450 내지 약 1500개 뉴클레오티드, 약 1550 내지 약 1600개 뉴클레오티드, 약 1650 내지 약 1700개 뉴클레오티드, 약 1750 내지 약 1800개 뉴클레오티드, 약 1850 내지 약 1900개 뉴클레오티드, 약 1950 내지 약 2000개 뉴클레오티드, 약 2000 내지 약 3000개 뉴클레오티드, 약 3000 내지 약 4000개 뉴클레오티드 또는 약 4000 내지 약 5000개 뉴클레오티드의 서열을 표적화한다. 일부 실시양태에서, ASO는 게놈 부위 GRCh38/hg38: chr2: 166007294로부터의 하류 약 1 내지 약 20개 뉴클레오티드, 약 20 내지 약 50개 뉴클레오티드, 약 50 내지 약 100개 뉴클레오티드, 약 100 내지 약 150개 뉴클레오티드, 약 150 내지 약 200개 뉴클레오티드, 약 200 내지 약 250개 뉴클레오티드, 약 250 내지 약 300개, 약 250 내지 약 300개 뉴클레오티드, 약 350 내지 약 400개 뉴클레오티드, 약 450 내지 약 500개 뉴클레오티드, 약 550 내지 약 600개 뉴클레오티드, 약 650 내지 약 700개 뉴클레오티드, 약 750 내지 약 800개 뉴클레오티드, 약 850 내지 약 900개 뉴클레오티드 또는 약 950 내지 약 1000개 뉴클레오티드의 서열을 표적화한다.
일부 실시양태에서, ASO는 게놈 부위 GRCh38/hg38: chr2: 166007294로부터의 하류 적어도 약 1개 뉴클레오티드, 적어도 약 10개 뉴클레오티드, 적어도 약 20개 뉴클레오티드, 적어도 약 50개 뉴클레오티드, 적어도 약 80개 뉴클레오티드, 적어도 약 85개 뉴클레오티드, 적어도 약 90개 뉴클레오티드, 적어도 약 95개 뉴클레오티드, 적어도 약 96개 뉴클레오티드, 적어도 약 97개 뉴클레오티드, 적어도 약 98개 뉴클레오티드, 적어도 약 99개 뉴클레오티드, 적어도 약 100개 뉴클레오티드, 적어도 약 101개 뉴클레오티드, 적어도 약 102개 뉴클레오티드, 적어도 약 103개 뉴클레오티드, 적어도 약 104개 뉴클레오티드, 적어도 약 105개 뉴클레오티드, 적어도 약 110개 뉴클레오티드, 적어도 약 120개 뉴클레오티드, 적어도 약 150개 뉴클레오티드, 적어도 약 200개 뉴클레오티드, 적어도 약 300개 뉴클레오티드, 적어도 약 400개 뉴클레오티드, 적어도 약 500개 뉴클레오티드, 적어도 약 600개 뉴클레오티드, 적어도 약 700개 뉴클레오티드, 적어도 약 800개 뉴클레오티드, 적어도 약 900개 뉴클레오티드, 적어도 약 1000개 뉴클레오티드, 적어도 약 1200개 뉴클레오티드, 적어도 약 1400개 뉴클레오티드, 적어도 약 1500개 뉴클레오티드, 적어도 약 1600개 뉴클레오티드, 적어도 약 1800개 뉴클레오티드, 적어도 약 2000개 뉴클레오티드, 적어도 약 3000개 뉴클레오티드, 적어도 약 4000개 뉴클레오티드 또는 적어도 약 5000개 뉴클레오티드의 서열을 표적화한다.
일부 실시양태에서, ASO는 게놈 부위 GRCh38/hg38: chr2: 166009718로부터의 상류 약 1 내지 약 5000개 뉴클레오티드의 서열을 표적화한다. 일부 실시양태에서, ASO는 게놈 부위 GRCh38/hg38: chr2: 166009718로부터의 상류 약 1 내지 약 20개 뉴클레오티드, 약 20 내지 약 50개 뉴클레오티드, 약 50 내지 약 100개 뉴클레오티드, 약 100 내지 약 150개 뉴클레오티드, 약 150 내지 약 200개 뉴클레오티드, 약 200 내지 약 250개 뉴클레오티드, 약 250 내지 약 300개, 약 250 내지 약 300개 뉴클레오티드, 약 350 내지 약 400개 뉴클레오티드, 약 450 내지 약 500개 뉴클레오티드, 약 550 내지 약 600개 뉴클레오티드, 약 650 내지 약 700개 뉴클레오티드, 약 750 내지 약 800개 뉴클레오티드, 약 850 내지 약 900개 뉴클레오티드, 약 950 내지 약 1000개 뉴클레오티드, 약 1050 내지 약 1100개 뉴클레오티드, 약 1150 내지 약 1200개 뉴클레오티드, 약 1250 내지 약 1300개 뉴클레오티드, 약 1350 내지 약 1400개 뉴클레오티드, 약 1450 내지 약 1500개 뉴클레오티드, 약 1550 내지 약 1600개 뉴클레오티드, 약 1650 내지 약 1700개 뉴클레오티드, 약 1750 내지 약 1800개 뉴클레오티드, 약 1850 내지 약 1900개 뉴클레오티드, 약 1950 내지 약 2000개 뉴클레오티드, 약 2000 내지 약 3000개 뉴클레오티드, 약 3000 내지 약 4000개 뉴클레오티드 또는 약 4000 내지 약 5000개 뉴클레오티드의 서열을 표적화한다. 일부 실시양태에서, ASO는 게놈 부위 GRCh38/hg38: chr2: 166009718로부터의 상류 약 1 내지 약 20개 뉴클레오티드, 약 20 내지 약 50개 뉴클레오티드, 약 50 내지 약 100개 뉴클레오티드, 약 100 내지 약 150개 뉴클레오티드, 약 150 내지 약 200개 뉴클레오티드, 약 200 내지 약 250개 뉴클레오티드, 약 250 내지 약 300개, 약 250 내지 약 300개 뉴클레오티드, 약 350 내지 약 400개 뉴클레오티드, 약 450 내지 약 500개 뉴클레오티드, 약 550 내지 약 600개 뉴클레오티드, 약 650 내지 약 700개 뉴클레오티드, 약 750 내지 약 800개 뉴클레오티드, 약 850 내지 약 900개 뉴클레오티드 또는 약 950 내지 약 1000개 뉴클레오티드의 서열을 표적화한다.
일부 실시양태에서, ASO는 게놈 부위 GRCh38/hg38: chr2: 166009718로부터의 상류 적어도 약 1개 뉴클레오티드, 적어도 약 10개 뉴클레오티드, 적어도 약 20개 뉴클레오티드, 적어도 약 50개 뉴클레오티드, 적어도 약 80개 뉴클레오티드, 적어도 약 85개 뉴클레오티드, 적어도 약 90개 뉴클레오티드, 적어도 약 95개 뉴클레오티드, 적어도 약 96개 뉴클레오티드, 적어도 약 97개 뉴클레오티드, 적어도 약 98개 뉴클레오티드, 적어도 약 99개 뉴클레오티드, 적어도 약 100개 뉴클레오티드, 적어도 약 101개 뉴클레오티드, 적어도 약 102개 뉴클레오티드, 적어도 약 103개 뉴클레오티드, 적어도 약 104개 뉴클레오티드, 적어도 약 105개 뉴클레오티드, 적어도 약 110개 뉴클레오티드, 적어도 약 120개 뉴클레오티드, 적어도 약 150개 뉴클레오티드, 적어도 약 200개 뉴클레오티드, 적어도 약 300개 뉴클레오티드, 적어도 약 400개 뉴클레오티드, 적어도 약 500개 뉴클레오티드, 적어도 약 600개 뉴클레오티드, 적어도 약 700개 뉴클레오티드, 적어도 약 800개 뉴클레오티드, 적어도 약 900개 뉴클레오티드, 적어도 약 1000개 뉴클레오티드, 적어도 약 1200개 뉴클레오티드, 적어도 약 1400개 뉴클레오티드, 적어도 약 1500개 뉴클레오티드, 적어도 약 1600개 뉴클레오티드, 적어도 약 1800개 뉴클레오티드, 적어도 약 2000개 뉴클레오티드, 적어도 약 3000개 뉴클레오티드, 적어도 약 4000개 뉴클레오티드 또는 적어도 약 5000개 뉴클레오티드의 서열을 표적화한다.
일부 실시양태에서, 본원에 설명된 NIE는 도 2에 도시된 바와 같이 GRCh37/hg19: chr2:166,863,740과 GRCh37/hg19: chr2:166,863,803 사이에 위치한다. 일부 실시양태에서, NIE의 5' 말단은 GRCh37/hg19: chr2:166,863,803에 위치한다. 일부 실시양태에서, NIE의 3' 말단은 GRCh37/hg19: chr2:166,863,740에 위치한다.
일부 실시양태에서, 일부 실시양태에서, ASO는 게놈 부위 GRCh37/hg19: chr2:166,863,803으로부터 상류(또는 5')의 약 4 내지 약 300개 뉴클레오티드의 서열을 표적화한다. 일부 실시양태에서, ASO는 게놈 부위 GRCh37/hg19: chr2:166,863,803으로부터 상류(또는 5')의 약 1 내지 약 20개 뉴클레오티드, 약 20 내지 약 50개 뉴클레오티드, 약 50 내지 약 100개 뉴클레오티드, 약 100 내지 약 150개 뉴클레오티드, 약 150 내지 약 200개 뉴클레오티드, 약 200 내지 약 250개 뉴클레오티드, 약 250 내지 약 300개, 약 250 내지 약 300개 뉴클레오티드, 약 350 내지 약 400개 뉴클레오티드, 약 450 내지 약 500개 뉴클레오티드, 약 550 내지 약 600개 뉴클레오티드, 약 650 내지 약 700개 뉴클레오티드, 약 750 내지 약 800개 뉴클레오티드, 약 850 내지 약 900개 뉴클레오티드, 약 950 내지 약 1000개 뉴클레오티드, 약 1050 내지 약 1100개 뉴클레오티드, 약 1150 내지 약 1200개 뉴클레오티드, 약 1250 내지 약 1300개 뉴클레오티드, 약 1350 내지 약 1400개 뉴클레오티드 또는 약 1450 내지 약 1500개 뉴클레오티드의 서열을 표적화한다. 일부 실시양태에서, ASO는 게놈 부위 GRCh37/hg19: chr2:166,863,803으로부터의 상류 300개 초과의 뉴클레오티드의 서열을 표적화할 수 있다. 일부 실시양태에서, ASO는 GRCh37/hg19: chr2:166,863,740으로부터 하류(또는 3')의 약 4 내지 약 300개 뉴클레오티드의 서열을 표적화한다. 일부 실시양태에서, ASO는 GRCh37/hg19: chr2:166,863,740으로부터의 하류 약 1 내지 약 20개 뉴클레오티드, 약 20 내지 약 50개 뉴클레오티드, 약 50 내지 약 100개 뉴클레오티드, 약 100 내지 약 150개 뉴클레오티드, 약 150 내지 약 200개 뉴클레오티드, 약 200 내지 약 250개 뉴클레오티드, 약 250 내지 약 300개 뉴클레오티드, 약 350 내지 약 400개 뉴클레오티드, 약 450 내지 약 500개 뉴클레오티드, 약 550 내지 약 600개 뉴클레오티드, 약 650 내지 약 700개 뉴클레오티드, 약 750 내지 약 800개 뉴클레오티드, 약 850 내지 약 900개 뉴클레오티드, 약 950 내지 약 1000개 뉴클레오티드, 약 1050 내지 약 1100개 뉴클레오티드, 약 1150 내지 약 1200개 뉴클레오티드, 약 1250 내지 약 1300개 뉴클레오티드, 약 1350 내지 약 1400개 뉴클레오티드 또는 약 1450 내지 약 1500개 뉴클레오티드의 서열을 표적화한다. 일부 실시양태에서, ASO는 GRCh37/hg19: chr2:166,863,740으로부터의 하류 300개 초과의 뉴클레오티드의 서열을 표적화한다.
일부 실시양태에서, ASO는 게놈 부위 GRCh37/hg19: chr2:166,863,803으로부터 상류(또는 5')의 약 4 내지 약 300개 뉴클레오티드의 서열을 표적화한다. 일부 실시양태에서, ASO는 게놈 부위 GRCh37/hg19: chr2:166,863,803으로부터 상류(또는 5')의 적어도 약 1개 뉴클레오티드, 적어도 약 10개 뉴클레오티드, 적어도 약 20개 뉴클레오티드, 적어도 약 50개 뉴클레오티드, 적어도 약 80개 뉴클레오티드, 적어도 약 85개 뉴클레오티드, 적어도 약 90개 뉴클레오티드, 적어도 약 95개 뉴클레오티드, 적어도 약 96개 뉴클레오티드, 적어도 약 97개 뉴클레오티드, 적어도 약 98개 뉴클레오티드, 적어도 약 99개 뉴클레오티드, 적어도 약 100개 뉴클레오티드, 적어도 약 101개 뉴클레오티드, 적어도 약 102개 뉴클레오티드, 적어도 약 103개 뉴클레오티드, 적어도 약 104개 뉴클레오티드, 적어도 약 105개 뉴클레오티드, 적어도 약 110개 뉴클레오티드, 적어도 약 120개 뉴클레오티드, 적어도 약 150개 뉴클레오티드, 적어도 약 200개 뉴클레오티드, 적어도 약 300개 뉴클레오티드, 적어도 약 400개 뉴클레오티드, 적어도 약 500개 뉴클레오티드, 적어도 약 600개 뉴클레오티드, 적어도 약 700개 뉴클레오티드, 적어도 약 800개 뉴클레오티드, 적어도 약 900개 뉴클레오티드 또는 적어도 약 1000개 뉴클레오티드의 서열을 표적화한다. 일부 실시양태에서, ASO는 GRCh37/hg19: chr2:166,863,740으로부터 하류(또는 3')의 약 4 내지 약 300개 뉴클레오티드의 서열을 표적화한다. 일부 실시양태에서, ASO는 GRCh37/hg19: chr2:166,863,740으로부터의 하류적어도 약 1개 뉴클레오티드, 적어도 약 10개 뉴클레오티드, 적어도 약 20개 뉴클레오티드, 적어도 약 50개 뉴클레오티드, 적어도 약 80개 뉴클레오티드, 적어도 약 85개 뉴클레오티드, 적어도 약 90개 뉴클레오티드, 적어도 약 95개 뉴클레오티드, 적어도 약 96개 뉴클레오티드, 적어도 약 97개 뉴클레오티드, 적어도 약 98개 뉴클레오티드, 적어도 약 99개 뉴클레오티드, 적어도 약 100개 뉴클레오티드, 적어도 약 101개 뉴클레오티드, 적어도 약 102개 뉴클레오티드, 적어도 약 103개 뉴클레오티드, 적어도 약 104개 뉴클레오티드, 적어도 약 105개 뉴클레오티드, 적어도 약 110개 뉴클레오티드, 적어도 약 120개 뉴클레오티드, 적어도 약 150개 뉴클레오티드, 적어도 약 200개 뉴클레오티드, 적어도 약 300개 뉴클레오티드, 적어도 약 400개 뉴클레오티드, 적어도 약 500개 뉴클레오티드, 적어도 약 600개 뉴클레오티드, 적어도 약 700개 뉴클레오티드, 적어도 약 800개 뉴클레오티드, 적어도 약 900개 뉴클레오티드 또는 적어도 약 1000개 뉴클레오티드의 서열을 표적화한다. 일부 실시양태에서, ASO는 GRCh37/hg19: chr2:166,863,740으로부터의 하류 300개 초과의 뉴클레오티드의 서열을 표적화한다.
일부 실시양태에서, ASO는 게놈 부위 GRCh37/hg19: chr2:166,863,803으로부터 상류(또는 5')의 약 4 내지 약 300개 뉴클레오티드의 서열을 표적화한다. 일부 실시양태에서, ASO는 게놈 부위 GRCh37/hg19: chr2:166,863,803으로부터 상류(또는 5')의 최대 약 10개 뉴클레오티드, 최대 약 20개 뉴클레오티드, 최대 약 50개 뉴클레오티드, 최대 약 80개 뉴클레오티드, 최대 약 85개 뉴클레오티드, 최대 약 90개 뉴클레오티드, 최대 약 95개 뉴클레오티드, 최대 약 96개 뉴클레오티드, 최대 약 97개 뉴클레오티드, 최대 약 98개 뉴클레오티드, 최대 약 99개 뉴클레오티드, 최대 약 100개 뉴클레오티드, 최대 약 101개 뉴클레오티드, 최대 약 102개 뉴클레오티드, 최대 약 103개 뉴클레오티드, 최대 약 104개 뉴클레오티드, 최대 약 105개 뉴클레오티드, 최대 약 110개 뉴클레오티드, 최대 약 120개 뉴클레오티드, 최대 약 150개 뉴클레오티드, 최대 약 200개 뉴클레오티드, 최대 약 300개 뉴클레오티드, 최대 약 400개 뉴클레오티드, 최대 약 500개 뉴클레오티드, 최대 약 600개 뉴클레오티드, 최대 약 700개 뉴클레오티드, 최대 약 800개 뉴클레오티드, 최대 약 900개 뉴클레오티드, 최대 약 1000개 뉴클레오티드, 최대 약 1100개 뉴클레오티드, 최대 약 1200개 뉴클레오티드, 최대 약 1300개 뉴클레오티드, 최대 약 1400개 뉴클레오티드 또는 최대 약 1500개 뉴클레오티드의 서열을 표적화한다. 일부 실시양태에서, ASO는 GRCh37/hg19: chr2:166,863,740으로부터 하류(또는 3')의 약 4 내지 약 300개 뉴클레오티드의 서열을 표적화한다. 일부 실시양태에서, ASO는 GRCh37/hg19: chr2:166,863,740으로부터의 하류 최대 약 10개 뉴클레오티드, 최대 약 20개 뉴클레오티드, 최대 약 50개 뉴클레오티드, 최대 약 80개 뉴클레오티드, 최대 약 85개 뉴클레오티드, 최대 약 90개 뉴클레오티드, 최대 약 95개 뉴클레오티드, 최대 약 96개 뉴클레오티드, 최대 약 97개 뉴클레오티드, 최대 약 98개 뉴클레오티드, 최대 약 99개 뉴클레오티드, 최대 약 100개 뉴클레오티드, 최대 약 101개 뉴클레오티드, 최대 약 102개 뉴클레오티드, 최대 약 103개 뉴클레오티드, 최대 약 104개 뉴클레오티드, 최대 약 105개 뉴클레오티드, 최대 약 110개 뉴클레오티드, 최대 약 120개 뉴클레오티드, 최대 약 150개 뉴클레오티드, 최대 약 200개 뉴클레오티드, 최대 약 300개 뉴클레오티드, 최대 약 400개 뉴클레오티드, 최대 약 500개 뉴클레오티드, 최대 약 600개 뉴클레오티드, 최대 약 700개 뉴클레오티드, 최대 약 800개 뉴클레오티드, 최대 약 900개 뉴클레오티드 또는 최대 약 1000개 뉴클레오티드, 최대 약 1100개 뉴클레오티드, 최대 약 1200개 뉴클레오티드, 최대 약 1300개 뉴클레오티드, 최대 약 1400개 뉴클레오티드 또는 최대 약 1500개 뉴클레오티드의 서열을 표적화한다. 일부 실시양태에서, ASO는 GRCh37/hg19: chr2:166,863,740으로부터의 하류 300개 초과의 뉴클레오티드의 서열을 표적화한다.
본원에서 실시예에 기재된 바와 같이, SCN1A 유전자(서열번호 1)를 NIE에 대해 분석하였고 인트론 20의 일부분(인트론 20 프리-mRNA를 코딩하는 서열번호 6 참조)의 포함이 관찰되었다(이 부분은 본 개시내용 전체에 걸쳐 엑손 23 또는 엑손 20x로 지칭됨). 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 ASO는 SCN1A 게놈 서열로부터 전사된 NIE 함유 프리-mRNA(서열번호 2)를 표적화한다. 일부 실시양태에서, ASO는 인트론 20의 일부분을 포함하는 SCN1A 게놈 서열로부터의 NIE 함유 프리-mRNA 전사체를 표적화한다. 일부 실시양태에서, ASO는 엑손 23(또는 엑손 20x)(서열번호 4)를 포함하는 SCN1A 게놈 서열로부터의 NIE 함유 프리-mRNA 전사체를 표적화한다. 일부 실시양태에서, ASO는 서열번호 2 또는 9의 NIE 함유 프리-mRNA 전사체를 표적화한다. 일부 실시양태에서, ASO는 NIE를 포함하는 서열번호 2 또는 9의 프리-mRNA 전사체를 표적화한다. 일부 실시양태에서, ASO는 엑손 23(또는 엑손 20x)(서열번호 7)을 포함하는 서열번호 2의 NIE 함유 프리-mRNA 전사체를 표적화한다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 ASO는 SCN1A 프리-mRNA 서열(서열번호 2 또는 9)을 표적화한다. 일부 실시양태에서, ASO는 NIE를 포함하는 SCN1A 프리-mRNA 서열(서열번호 7 또는 11)을 표적화한다. 일부 실시양태에서, ASO는 서열번호 6, 7, 10 또는 11 중 어느 하나에 따른 SCN1A 프리-mRNA 서열을 표적화한다. 일부 실시양태에서, ASO는 서열번호 12 내지 731 중 어느 하나에 따른 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, ASO는 서열번호 12 내지 371 중 어느 하나에 따른 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, ASO는 서열번호 372 내지 731 중 어느 하나에 따른 서열을 갖는다.
일부 실시양태에서, SCN1A NIE 함유 프리-mRNA 전사체는 서열번호 1 또는 8과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 유전자 서열에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, SCN1A NIE 프리-mRNA 전사체는 서열번호 2 내지 7 및 서열번호 9 내지 11 중 어느 하나와 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, SCN1A NIE 함유 프리-mRNA 전사체(또는 NMD 엑손 mRNA)는 서열번호 2, 6, 7, 9, 10 및 12 중 하나와 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 97% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, SCN1A NIE 함유 프리-mRNA 전사체(또는 NMD 엑손 mRNA)은 서열번호 1 및 8과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 97% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, NMD 엑손 mRNA의 표적화된 부분은 서열번호 2, 6, 7, 9, 10 및 12의 적어도 8개의 연속적 핵산을 포함하는 영역과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 97% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, ASO는 NIE의 5' 말단으로부터의 상류 서열을 표적화한다. 예를 들어, NIE(예를 들어, 인간 SCN1A의 엑손 23(또는 엑손 20x) 또는 마우스 SCN1A의 엑손 21x)의 5' 말단으로부터의 상류 서열을 표적화하는 ASO는 서열번호 12 내지 191 또는 서열번호 372 내지 551 중 어느 하나와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 97% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. 또 다른 예를 들어, NIE(예를 들어, 인간 SCN1A의 엑손 23(또는 엑손 20x) 또는 마우스 SCN1A의 엑손 21x)의 5' 말단으로부터의 상류 서열을 표적화하는 ASO는 서열번호 12 내지 191 중 어느 하나와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 97% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. 추가로 예를 들어, NIE(예를 들어, 인간 SCN1A의 엑손 23(또는 엑손 20x) 또는 마우스 SCN1A의 엑손 21x)의 5' 말단으로부터의 상류 서열을 표적화하는 ASO는 서열번호 372 내지 551 중 어느 하나와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 97% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, ASO는 엑손 23을 포함하는 SCN1A NIE 함유 프리-mRNA에서 엑손 23(또는 엑손 20x)을 표적화한다. 일부 실시양태에서, ASO는 SCN1A 프리-mRNA의 엑손 23의 5' 말단으로부터 하류(또는 3')의 엑손 23 서열을 표적화한다. 일부 실시양태에서, ASO는 SCN1A 프리-mRNA의 엑손 20x의 3' 말단으로부터 상류(또는 5')의 엑손 23 서열을 표적화한다.
일부 실시양태에서, ASO는 NIE의 3' 말단으로부터의 하류 서열을 표적화한다. 예를 들어, NIE(예를 들어, 인간 SCN1A의 엑손 23(또는 엑손 20x) 또는 마우스 SCN1A의 엑손 21x)의 3' 말단으로부터의 하류 서열을 표적화하는 ASO는 서열번호 192 내지 371 또는 서열번호 552 내지 731 중 어느 하나와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 97% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. 또 다른 예를 들어, NIE(예를 들어, 인간 SCN1A의 엑손 23(또는 엑손 20x) 또는 마우스 SCN1A의 엑손 21x)의 3' 말단으로부터의 하류 서열을 표적화하는 ASO는 서열번호 192 내지 371 중 어느 하나와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 97% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. 추가로 예를 들어, NIE(예를 들어, 인간 SCN1A의 엑손 23(또는 엑손 20x) 또는 마우스 SCN1A의 엑손 21x)의 3' 말단으로부터의 하류 서열을 표적화하는 ASO는 서열번호 552 내지 731 중 어느 하나와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 97% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, SCN1A NIE 함유 프리-mRNA의 표적화된 부분은 인트론 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25(NM_006920에서 mRNA 서열에 상응하는 인트론 번호매김)에 있다. 일부 실시양태에서, NIE 프리-mRNA의 표적화된 부분에 대한 ASO의 혼성화는 인트론 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25 내의 NIE 중 적어도 하나의 엑손 스키핑을 초래하고, 후속적으로 SCN1A 단백질 생산을 증가시킨다. 일부 실시양태에서, NIE 프리-mRNA의 표적화된 부분에 대한 ASO의 혼성화는 인트론 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25 내의 NIE 중 적어도 하나의 엑손 스키핑을 억제하거나 차단하고, 후속적으로 SCN1A 단백질 생산을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, SCN1A NIE 함유 프리-mRNA의 표적화된 부분은 인트론 20에 있다. 당업자는 본원에 제공된 인트론 서열에 기초하여 또는 NM_006920, NM_001202435, NM_001165964 또는 NM_001165963에서 mRNA 서열과 관련하여 제공된 인트론 번호를 사용하여, 임의의 SCN1A 이소형에서 상응하는 인트론 번호를 결정할 수 있다. 당업자는 또한 본원에 제공된 인트론 서열에 기초하여 또는 NM_006920, NM_001202435, NM_001165964 또는 NM_001165963에서 mRNA 서열을 관련하여 제공된 인트론 번호를 사용하여, 본 발명의 방법을 사용하여 표적화하기 위한 임의의 SCN1A 이소형에서 측면에 위치한 엑손의 서열을 결정할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 방법 및 조성물은 SCN1A NIE 함유 프리-mRNA의 가성-엑손의 엑손 스키핑을 유도하거나 억제함으로써 SCN1A의 발현을 조절, 예를 들어, 증가시키거나 감소시키는 데 사용된다. 일부 실시양태에서, 가성-엑손은 인트론 1 내지 25 중 어느 하나 내의 서열이다. 일부 실시양태에서, 가성-엑손은 인트론 2, 4, 6, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 20, 21, 22, 23, 24, 및 25 중 어느 하나 내의 서열이다. 가성-엑손은 인트론 15, 18, 및 19 중 어느 하나 내의 서열이다. 일부 실시양태에서, 가성-엑손은 임의의 SCN1A 인트론 또는 이의 일부일 수 있다. 일부 실시양태에서, 가성-엑손은 인트론 20 내에 있다. 본원에서 사용된 SCN1A 인트론 번호매김은 NM_006920에서의 mRNA 서열에 상응한다. 인트론 번호매김은 상이한 SCN1A 이소형 서열과 관련하여 변화될 수 있는 것으로 이해된다.
SCN1A 단백질
SCN1A 유전자는 SCN1A(나트륨 통로, 전압-개폐, I형, 알파 서브유닛) 단백질을 코딩할 수 있으며, 이는 전압-개폐 나트륨 통로 Nav1.1의 알파-서브유닛으로도 지칭될 수 있다. 또한, 전술한 바와 같이, DS 내의 SCN1A 돌연변이는 전체 단백질에 걸쳐 퍼져있다. 드노보(de novo) 발생이 더 약화된 100종 초과의 신규 돌연변이가 유전자 전체에 걸쳐 식별되었다. 이들은 절두(47%), 미스센스(43%), 결실(3%) 및 스플라이스 부위 돌연변이(7%)로 구성된다. SCN1A 돌연변이를 보유한 대상체의 백분율은 33 내지 100%로 다양하다. 대부분의 돌연변이는 신규 변화(88%)이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 기능성 SCN1A 단백질의 생산을 조절, 예를 들어 증가 또는 감소시키기 위해 사용된다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "기능성"은 치료되는 병태, 예를 들어 드라벳 증후군; 열성 발작 플러스를 동반하는 전신 뇌전증 2형; 가족성 열성 발작 3A; 자폐증; 조기 유아 간질성 뇌병증 13; 동기능 부전 증후군　1; 알츠하이머병; 또는 SUDEP의 임의의 하나 이상의 증상을 제거하는데 필요한 양의 SCN1A 단백질 활성 또는 기능을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 방법은 부분 기능성 SCN1A 단백질의 생산을 증가시키는 데 사용된다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "부분 기능성"은 질환 또는 병태의 임의의 하나 이상의 증상을 제거 또는 예방하는데 필요한 양의 활성 또는 기능보다 적은 임의의 양의 SCN1A 단백질 활성 또는 기능을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 부분 기능성 단백질 또는 RNA는 완전 기능성 단백질 또는 RNA와 비교하여 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 적은 활성을 가질 것이다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은 SCN1A 단백질을 코딩하는 NIE 함유 프리-mRNA를 갖는 대상체의 세포에 의한 SCN1A 단백질의 발현을 증가시키는 방법으로서, 대상체는 결핍된 양의 SCN1A 단백질 활성에 의해 야기된 드라벳 증후군을 가지며, 결핍된 양의 SCN1A 단백질은 SCN1A 단백질의 반가불충분성에 의해 야기되는 것인 방법이다. 이러한 실시양태에서, 대상체는 기능성 SCN1A 단백질을 코딩하는 제1 대립유전자, 및 SCN1A 단백질이 생성되지 않는 제2 대립유전자를 갖는다. 이러한 또 다른 실시양태에서, 대상체는 기능성 SCN1A 단백질을 코딩하는 제1 대립유전자, 및 비기능성 SCN1A 단백질을 코딩하는 제2 대립유전자를 갖는다. 이러한 또 다른 실시양태에서, 대상체는 기능성 SCN1A 단백질을 코딩하는 제1 대립유전자, 및 부분 기능성 SCN1A 단백질을 코딩하는 제2 대립유전자를 갖는다. 이들 임의의 실시양태에서, 안티센스 올리고머는 제2 대립유전자로부터 전사된 NIE 함유 프리-mRNA의 표적화된 부분에 결합함으로써 프리-mRNA로부터 가성-엑손의 엑손 스키핑을 유도하고, 대상체의 세포에서 기능성 SCN1A 단백질을 코딩하는 성숙한 mRNA의 수준 증가 및 SCN1A 단백질의 발현 증가를 유발한다.
관련 실시양태에서, 방법은 단백질 또는 기능성 RNA의 발현을 증가시키기 위해 ASO를 사용하는 방법이다. 일부 실시양태에서, ASO는 SCN1A 단백질을 코딩하는 NIE 함유 프리-mRNA를 갖는 대상체의 세포에서 SCN1A 단백질의 발현을 증가시키는 데 사용되며, 여기서 상기 대상체는 SCN1A 단백질의 양 또는 기능에 있어 결핍증, 예를 들어 드라벳 증후군(DS)(SMEI로도 알려짐); 유아기의 중증 근간대성 뇌전증(SMEI)-경계(SMEB); 열성 발작(FS); 열성 발작 플러스를 동반하는 전신 뇌전증(GEFS+); 조기 유아 간질성 뇌병증 13; 잠재성 전신 뇌전증; 잠재성 국소 뇌전증; 근간대성 무정위 뇌전증; 레녹스-가스토 증후군; 웨스트 증후군; 특발성 경련; 조기 근간대성 뇌병증; 진행성 근간대성 뇌전증; 소아기 교대성 편마비; 미분류 간질성 뇌병증; 뇌전증에서의 돌연사(SUDEP); 동기능 부전 증후군 1; 조기 유아 SCN1A 뇌병증; 조기 유아 간질성 뇌병증(EIEE); 또는 자폐증을 갖는다. 일부 실시양태에서, ASO는 대상체의 세포에서 SCN1A 단백질의 발현을 증가시키는 데 사용되며, 여기서 대상체는 SCN8A 단백질의 양 또는 기능에 있어 결핍증, 예를 들어 조기 유아 간질성 뇌병증 13을 갖는다. 일부 실시양태에서, ASO는 대상체의 세포에서 SCN1A 단백질의 발현을 증가시키는 데 사용되며, 여기서 대상체는 SCN5A 단백질의 양 또는 기능에 있어 결핍증, 예를 들어 동기능 부전 증후군　1을 갖는다.
일부 실시양태에서, 질환 또는 병태의 원인이 되는 단백질을 코딩하는 NIE 함유 프리-mRNA 전사체는 본원에 기재된 ASO에 의해 표적화된다. 일부 실시양태에서, 질환의 원인이 되지 않는 단백질을 코딩하는 NIE 함유 프리-mRNA 전사체는 ASO에 의해 표적화된다. 예를 들어, 특정 경로에서 제1 단백질의 돌연변이 또는 결핍의 결과인 질환은 제2 단백질을 코딩하는 NIE 함유 프리-mRNA를 표적화함으로써 제2 단백질의 생성을 증가시켜 개선될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제2 단백질의 기능은 (질환 또는 병태의 원인이 되는) 제1 단백질의 돌연변이 또는 결핍을 보상할 수 있다.
일부 실시양태에서, 대상체는
(a) (i) SCN1A 단백질이 야생형 대립유전자로부터의 생산과 비교하여 감소된 수준으로 생성되거나,
(ii) SCN1A 단백질이 동등한 야생형 단백질과 비교하여 기능이 감소된 형태로 생성되거나,
(iii) SCN1A 단백질 또는 기능성 RNA가 생성되지 않는
제1 돌연변이 대립유전자; 및
(b) (i) SCN1A 단백질이 야생형 대립유전자로부터의 생산과 비교하여 감소된 수준으로 생성되거나,
(ii) SCN1A 단백질이 동등한 야생형 단백질과 비교하여 기능이 감소된 형태로 생성되거나,
(iii) SCN1A 단백질이 생성되지 않는
제2 돌연변이 대립유전자를 가지며,
여기서 NIE 함유 프리-mRNA는 제1 대립유전자 및/또는 제2 대립유전자로부터 전사된다. 이들 실시양태에서, ASO는 제1 대립유전자 또는 제2 대립유전자로부터 전사된 NIE 함유 프리-mRNA의 표적화된 부분에 결합함으로써 NIE 함유 프리-mRNA로부터 가성-엑손의 엑손 스키핑을 유도하고, 대상체의 세포에서 SCN1A 단백질을 코딩하는 mRNA의 수준증가 및 표적 단백질 또는 기능성 RNA의 발현 증가를 유발한다. 이들 실시양태에서, NIE 함유 프리-mRNA로부터의 가성-엑손의 엑손 스키핑으로 인한 발현 수준의 증가를 갖는 표적 단백질 또는 기능성 RNA는 동등한 야생형 단백질과 비교하여 기능이 감소된 형태(부분 기능성) 또는 동등한 야생형 단백질과 비교하여 완전한 기능을 갖는 형태(완전 기능성)이다.
일부 실시양태에서, SCN1A 단백질을 코딩하는 mRNA의 수준은 대조군 세포, 예를 들어 안티센스 올리고머로 처리되지 않은 것 또는 SCN1A NIE 함유 프리-mRNA의 표적화된 부분에 결합하지 않는 안티센스 올리고머로 처리된 것에서 생성된 SCN1A 단백질을 코딩하는 mRNA의 양과 비교할 때 1.1 내지 10배 증가된다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 방법을 사용하여 치료되는 대상체는 하나의 대립유전자로부터 부분 기능성 SCN1A 단백질을 발현하며, 여기서 부분 기능성 SCN1A 단백질은 프레임시프트 돌연변이, 넌센스 돌연변이, 미스센스 돌연변이 또는 부분 유전자 결실에 의해 야기된다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 방법을 사용하여 치료되는 대상체는 하나의 대립유전자로부터 비기능성 SCN1A 단백질을 발현하며, 여기서 비기능성 SCN1A 단백질은 하나의 대립유전자에서의 프레임시프트 돌연변이, 넌센스 돌연변이, 미스센스 돌연변이, 부분 유전자 결실에 의해 유발된다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 방법을 사용하여 치료되는 대상체는 하나의 대립유전자에 SCN1A 전체 유전자 결실을 갖는다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은 SCN1A 단백질을 코딩하는 NIE 함유 프리-mRNA를 갖는 대상체의 세포에 의한 SCN1A 단백질의 발현을 감소시키는 방법이며, 여기서 상기 대상체는 Nav1.1에서의 기능 획득 돌연변이를 갖는다. 이러한 실시양태에서, 대상체는 SCN1A 단백질이 상승된 양으로 생성된 대립유전자 또는 세포에서 Nav1.1의 증가된 활성을 유도하는 돌연변이 SCN1A를 코딩하는 대립유전자를 갖는다. 일부 실시양태에서, Nav1.1의 증가된 활성은 돌연변이 Nav1.1 통로에 의해 매개되는 연장된 또는 거의 지속성인 나트륨 전류, 빠른 불활성화의 둔화, 정상 상태 불활성화의 양(positive)의 이동, 반복적인 자극 동안 높은 통로 이용 가능성, 비-불활성화된 탈분극-유도된 지속성 나트륨 전류의 증가, 불활성화로의 진입 지연, 빠른 불활성화로부터의 회복 가속화 및/또는 저온에서의 인큐베이션 또는 상호작용 단백질의 공동-발현에 의한 폴딩 결함의 구제를 특징으로 한다. 이들 임의의 실시양태에서, 안티센스 올리고머는 제2 대립유전자로부터 전사된 NIE 함유 프리-mRNA의 표적화된 부분에 결합함으로써 프리-mRNA로부터 가성-엑손의 엑손 스키핑을 억제하거나 차단하고, 대상체의 세포에서 기능성 SCN1A 단백질을 코딩하는 성숙한 mRNA의 수준 감소 및 SCN1A 단백질의 발현 감소를 유발한다.
관련 실시양태에서, 상기 방법은 단백질 또는 기능성 RNA의 발현을 감소시키기 위해 ASO를 사용하는 방법이다. 일부 실시양태에서, ASO는 SCN1A 단백질을 코딩하는 NIE 함유 프리-mRNA를 갖는 대상체의 세포에서 SCN1A 단백질의 발현을 감소시키는 데 사용된다. 일부 실시양태에서, 대상체는 Nav1.1에서의 기능 획득 돌연변이를 가지며, 예를 들어 편두통을 갖는다. 일부 실시양태에서, ASO는 대상체의 세포에서 SCN1A 단백질의 발현을 감소시키는 데 사용되며, 상기 대상체는 Nav1.1에서의 기능 획득 돌연변이를 가지며, 예를 들어 가족성 편마비 편두통 3을 갖는다.
일부 실시양태에서, SCN1A 단백질을 코딩하는 mRNA의 수준은 대조군 세포, 예를 들어 안티센스 올리고머로 처리되지 않은 것 또는 SCN1A NIE 함유 프리-mRNA의 표적화된 부분에 결합하지 않는 안티센스 올리고머로 처리된 것에서 생성된 SCN1A 단백질을 코딩하는 mRNA의 양과 비교할 때 1.1 내지 10배 감소된다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 방법을 사용하여 치료되는 대상체는 하나의 대립유전자로부터 돌연변이 SCN1A 단백질을 발현하며, 여기서 돌연변이 SCN1A 단백질은 프레임시프트 돌연변이, 넌센스 돌연변이, 미스센스 돌연변이 또는 부분 유전자 결실에 의해 야기되고, 돌연변이 SCN1A 단백질은 Nav1.1의 상승된 활성 수준을 유발한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 방법을 사용하여 치료되는 대상체는 프레임시프트 돌연변이, 넌센스 돌연변이, 미스센스 돌연변이 또는 부분 유전자 결실로 인해 하나의 대립유전자로부터 상승된 양의 SCN1A 단백질을 발현한다.
본 발명의 실시양태에서, 대상체는 SCN1A의 돌연변이를 가질 수 있다. SCN1A의 돌연변이는 상기 유전자 전체에 퍼져 있을 수 있다. SCN1A 단백질은 4개의 도메인으로 이루어질 수 있다. 상기 SCN1A 도메인은 막관통 세그먼트를 가질 수 있다. 상기 SCN1A 단백질의 돌연변이는 상기 단백질 전체에 걸쳐 발생할 수 있다. 상기 SCN1A 단백질은 적어도 2가지의 이소형으로 이루어질 수 있다. SCN1A의 돌연변이는 R931C, R946C, M934I, R1648C 또는 R1648H를 포함할 수 있다. 일부 경우에는, SCN1A 단백질의 C-말단에서 돌연변이가 관찰될 수 있다. SCN1A 단백질의 돌연변이는 또한 상기 SCN1A 단백질의 처음 3개 도메인의 세그먼트 5와 6 사이의 루프에서 발견될 수 있다. 일부 경우에, 돌연변이는 SCN1A 단백질의 N-말단에서 관찰될 수 있다. SCN1A 내의 예시적인 돌연변이는 R222X, R712X, I227S, R1892X, W952X, R1245X, R1407X, W1434R, c.4338+1G>A, S1516X, L1670fsX1678 또는 K1846fsX1856을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 본 발명에 의해 표적화될 수 있는 돌연변이는 또한 이온 통로의 세공을 코딩할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법 및 조성물은 DS를 치료하는 데 사용될 수 있다. 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 방법 및 조성물은 유아기의 중증 근간대성 뇌전증(SMEI)을 치료하는 데 사용될 수 있다. 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 방법 및 조성물은 경계성 드라벳 증후군; 열성 발작 플러스를 동반하는 전신 뇌전증 2형; 가족성 열성 발작 3A; 가족성 편마비 편두통 3; 자폐증; 조기 유아 간질성 뇌병증 13; 동기능 부전 증후군　1; 알츠하이머병 또는 SUDEP를 치료하는 데 사용될 수 있다. 본원에 기재된 방법 및 조성물은 또한 경계 SMEI를 치료하는 데 사용될 수 있다. 또한, 본원에 기재된 방법 및 조성물은 열성 발작 플러스를 동반하는 전신 뇌전증(GEFS+)을 치료하는 데 사용될 수 있다. GEFS+는 SCN1B 또는 GABRG2와 같은 뇌전증 관련 이온통로 서브유닛에서의 돌연변이와 연관될 수 있다. 본원에 기재된 방법 및 조성물은 또한 나트륨 이온통로병증을 치료하는 데 사용될 수 있다. 나트륨 이온통로병증은 SCN1A의 돌연변이와 연관될 수 있다. 나트륨 이온통로병증은 또한 베타 서브유닛 SCN1B와 같은 SCN1A의 서브유닛과 연관될 수 있다. 일부 경우에, SCN1A 돌연변이와 연관된 추가 질환이 또한 본 개시내용으로 치료될 수 있다. SCN1A 돌연변이와 연관된 관련 SCN1A 질환은 선천성 비정형 근긴장증, 고칼슘성 주기성 마비, 및 선천성 이상 근긴장증을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
일부 실시양태에서, 당업계에 공지되어 있고 상기 언급된 문헌(예를 들어, 문헌[Hamdan, et al., 2009, Mulley, et al., 2005])에 설명된 임의의 SCN1A 돌연변이를 갖는 대상체는 본원에 기재된 방법 및 조성물을 사용하여 치료될 수 있다. 일부 실시양태에서, 돌연변이는 임의의 SCN1A 인트론 또는 엑손 내에 있다.
엑손 포함
본원에 사용된 바와 같이, "NIE 함유 프리-mRNA"는 적어도 하나의 가성-엑손을 함유하는 프리-mRNA 전사체이다. 선택적 또는 비정상적 스플라이싱은 성숙한 mRNA 전사체에 적어도 하나의 가성-엑손의 포함을 초래할 수 있다. 용어 "성숙한 mRNA" 및 "완전히 스플라이싱된 mRNA"는 완전히 프로세싱된 mRNA를 기술하기 위해 본원에서 호환적으로 사용된다. 적어도 하나의 가성-엑손의 포함으로 비생산적인 mRNA가 될 수 있고 성숙한 mRNA의 NMD를 초래할 수 있다. NIE 함유 성숙한 mRNA는 때때로 비정상적 단백질 발현을 초래할 수 있다.
일부 실시양태에서, 포함된 가성-엑손은 세포에서 표적 단백질을 코딩하는 유전자로부터 전사된 NIE 함유 프리-mRNA 집단에서 가장 풍부한 가성-엑손이다. 일부 실시양태에서, 포함된 가성-엑손은 세포에서 표적 단백질을 코딩하는 유전자로부터 전사된 NIE 함유 프리-mRNA 집단에서 가장 풍부한 가성-엑손이고, 여기서 NIE 함유 프리-mRNA의 집단은 2개 이상의 포함된 가성-엑손을 포함한다. 일부 실시양태에서, 표적 단백질을 코딩하는 NIE 함유 프리-mRNA 집단에서 가장 풍부한 가성-엑손에 표적화되는 안티센스 올리고머는 안티센스 올리고머가 표적화되거나 결합하는 가성-엑손을 포함하여, 집단에서 하나 또는 둘 이상의 가성-엑손의 엑손 스키핑을 유도한다. 실시양태에서, 표적화된 영역은 SCN1A 단백질을 코딩하는 NIE 함유 프리-mRNA에서 가장 풍부한 가성-엑손인 가성-엑손 내에 있다.
엑손 포함의 정도는 엑손 포함 퍼센트, 예를 들어 주어진 가성-엑손이 포함된 전사체의 백분율로 표현될 수 있다. 간략하게, 엑손 포함 퍼센트는 엑손 포함을 갖는 RNA 전사체의 양의 평균과 엑손 배제를 갖는 RNA 전사체의 양의 평균의 합계에 대한 엑손 포함을 갖는 RNA 전사체의 양의 백분율로서 계산될 수 있다.
일부 실시양태에서, 포함된 가성-엑손은 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45% 또는 적어도 약 50% 포함의 결정에 기초하여 포함된 가성-엑손으로서 식별된 엑손이다. 일부 실시양태에서, 포함된 가성-엑손은 5% 내지 약 100%, 약 5% 내지 약 95%, 약 5% 내지 약 90%, 약 5% 내지 약 85%, 약 5% 내지 약 80%, 약 5% 내지 약 75%, 약 5% 내지 약 70%, 약 5% 내지 약 65%, 약 5% 내지 약 60%, 약 5% 내지 약 55%, 약 5% 내지 약 50%, 약 5% 내지 약 45%, 약 5% 내지 약 40%, 약 5% 내지 약 35%, 약 5% 내지 약 30%, 약 5% 내지 약 25%, 약 5% 내지 약 20%, 약 5% 내지 약 15%, 약 10% 내지 약 100%, 약 10% 내지 약 95%, 약 10% 내지 약 90%, 약 10% 내지 약 85%, 약 10% 내지 약 80%, 약 10% 내지 약 75%, 약 10% 내지 약 70%, 약 10% 내지 약 65%, 약 10% 내지 약 60%, 약 10% 내지 약 55%, 약 10% 내지 약 50%, 약 10% 내지 약 45%, 약 10% 내지 약 40%, 약 10% 내지 약 35%, 약 10% 내지 약 30%, 약 10% 내지 약 25%, 약 10% 내지 약 20%, 약 15% 내지 약 100%, 약 15% 내지 약 95%, 약 15% 내지 약 90%, 약 15% 내지 약 85%, 약 15% 내지 약 80%, 약 15% 내지 약 75%, 약 15% 내지 약 70%, 약 15% 내지 약 65%, 약 15% 내지 약 60%, 약 15% 내지 약 55%, 약 15% 내지 약 50%, 약 15% 내지 약 45%, 약 15% 내지 약 40%, 약 15% 내지 약 35%, 약 15% 내지 약 30%, 약 15% 내지 약 25%, 약 20% 내지 약 100%, 약 20% 내지 약 95%, 약 20% 내지 약 90%, 약 20% 내지 약 85%, 약 20% 내지 약 80%, 약 20% 내지 약 75%, 약 20% 내지 약 70%, 약 20% 내지 약 65%, 약 20% 내지 약 60%, 약 20% 내지 약 55%, 약 20% 내지 약 50%, 약 20% 내지 약 45%, 약 20% 내지 약 40%, 약 20% 내지 약 35%, 약 20% 내지 약 30%, 약 25% 내지 약 100%, 약 25% 내지 약 95%, 약 25% 내지 약 90%, 약 25% 내지 약 85%, 약 25% 내지 약 80%, 약 25% 내지 약 75%, 약 25% 내지 약 70%, 약 25% 내지 약 65%, 약 25% 내지 약 60%, 약 25% 내지 약 55%, 약 25% 내지 약 50%, 약 25% 내지 약 45%, 약 25% 내지 약 40% 또는 약 25% 내지 약 35% 포함의 결정에 기초하여 포함된 가성-엑손으로서 식별된 엑손이다. ENCODE 데이터(예를 들어, 문헌[Tilgner, et al., 2012, "Deep sequencing of subcellular RNA fractions shows splicing to be predominantly co-transcriptional in the human genome but inefficient for lncRNAs," Genome Research 22(9):1616-25]에 설명됨)를 사용하여 엑손 포함을 식별하는데 도움을 줄 수 있다.
일부 실시양태에서, SCN1A 프리-mRNA 전사체의 표적화된 부분에 상보적인 ASO와 세포의 접촉은 생성된 SCN1A 단백질의 양을 ASO의 부재/치료의 부재 하에 세포에 의해 생성된 SCN1A 단백질의 양과 비교하여 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 60, 80, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500 또는 1000% 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 안티센스 올리고머가 접촉되는 세포에 의해 생성된 SCN1A 단백질의 총량은 대조군 화합물에 의해 생성된 표적 단백질의 양과 비교하여 약 1.1 내지 약 10배, 약 1.5 내지 약 10배, 약 2 내지 약 10배, 약 3 내지 약 10배, 약 4 내지 약 10배, 약 1.1 내지 약 5배, 약 1.1 내지 약 6배, 약 1.1 내지 약 7배, 약 1.1 내지 약 8배, 약 1.1 내지 약 9배, 약 2 내지 약 5배, 약 2 내지 약 6배, 약 2 내지 약 7배, 약 2 내지 약 8배, 약 2 내지 약 9배, 약 3 내지 약 6배, 약 3 내지 약 7배, 약 3 내지 약 8배, 약 3 내지 약 9배, 약 4 내지 약 7배, 약 4 내지 약 8배, 약 4 내지 약 9배, 적어도 약 1.1배, 적어도 약 1.5배, 적어도 약 2배, 적어도 약 2.5배, 적어도 약 3배, 적어도 약 3.5배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배 또는 적어도 약 10배 증가된다, 대조군 화합물은 예를 들어 프리-mRNA의 표적화된 부분에 상보적이지 않은 올리고뉴클레오티드일 수 있다.
일부 실시양태에서, SCN1A 프리-mRNA 전사체의 표적화된 부분에 상보적인 ASO와 세포의 접촉은 생성된 SCN1A 단백질의 양을 ASO의 부재/치료의 부재 하에 세포에 의해 생성된 SCN1A 단백질의 양과 비교하여 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 60, 80, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500 또는 1000% 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 안티센스 올리고머가 접촉되는 세포에 의해 생성된 단백질의 총량은 대조군 화합물에 의해 생성된 표적 단백질의 양과 비교하여 약 1.1 내지 약 10배, 약 1.5 내지 약 10배, 약 2 내지 약 10배, 약 3 내지 약 10배, 약 4 내지 약 10배, 약 1.1 내지 약 5배, 약 1.1 내지 약 6배, 약 1.1 내지 약 7배, 약 1.1 내지 약 8배, 약 1.1 내지 약 9배, 약 2 내지 약 5배, 약 2 내지 약 6배, 약 2 내지 약 7배, 약 2 내지 약 8배, 약 2 내지 약 9배, 약 3 내지 약 6배, 약 3 내지 약 7배, 약 3 내지 약 8배, 약 3 내지 약 9배, 약 4 내지 약 7배, 약 4 내지 약 8배, 약 4 내지 약 9배, 적어도 약 1.1배, 적어도 약 1.5배, 적어도 약 2배, 적어도 약 2.5배, 적어도 약 3배, 적어도 약 3.5배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배 또는 적어도 약 10배 감소된다. 대조군 화합물은 예를 들어 프리-mRNA의 표적화된 부분에 상보적이지 않은 올리고뉴클레오티드일 수 있다.
일부 실시양태에서, SCN1A 프리-mRNA 전사체의 표적화된 부분에 상보적인 ASO와 세포의 접촉은 표적 단백질을 코딩하는 성숙한 mRNA를 포함하여 SCN1A를 코딩하는 mRNA의 양을 증가시킨다. 일부 실시양태에서, SCN1A 단백질을 코딩하는 mRNA 또는 SCN1A 단백질을 코딩하는 성숙한 mRNA의 양은 ASO의 부재/치료의 부재하에 세포에 의해 생성된 단백질의 양과 비교하여 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 60, 80, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500 또는 1000% 증가된다. 일부 실시양태에서, 안티센스 올리고머가 접촉되는 세포에서 생성된 SCN1A 단백질을 코딩하는 mRNA 또는 SCN1A 단백질을 코딩하는 성숙한 mRNA의 총량은 미처리된 세포, 예를 들어, 미처리된 세포 또는 대조군 화합물로 처리된 세포에서 생성된 성숙한 RNA의 양과 비교하여 약 1.1 내지 약 10배, 약 1.5 내지 약 10배, 약 2 내지 약 10배, 약 3 내지 약 10배, 약 4 내지 약 10배, 약 1.1 내지 약 5배, 약 1.1 내지 약 6배, 약 1.1 내지 약 7배, 약 1.1 내지 약 8배, 약 1.1 내지 약 9배, 약 2 내지 약 5배, 약 2 내지 약 6배, 약 2 내지 약 7배, 약 2 내지 약 8배, 약 2 내지 약 9배, 약 3 내지 약 6배, 약 3 내지 약 7배, 약 3 내지 약 8배, 약 3 내지 약 9배, 약 4 내지 약 7배, 약 4 내지 약 8배, 약 4 내지 약 9배, 적어도 약 1.1배, 적어도 약 1.5배, 적어도 약 2배, 적어도 약 2.5배, 적어도 약 3배, 적어도 약 3.5배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배 또는 적어도 약 10배 증가된다. 대조군 화합물은 예를 들어 SCN1A NIE 함유 프리-mRNA의 표적화된 부분에 상보적이지 않은 올리고뉴클레오티드일 수 있다.
일부 실시양태에서, SCN1A 프리-mRNA 전사체의 표적화된 부분에 상보적인 ASO와 세포의 접촉은 표적 단백질을 코딩하는 성숙한 mRNA를 포함하여 SCN1A를 코딩하는 mRNA의 양을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, SCN1A 단백질을 코딩하는 mRNA 또는 SCN1A 단백질을 코딩하는 성숙한 mRNA의 양은 ASO의 부재/치료의 부재하에 세포에 의해 생성된 단백질의 양과 비교하여 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 60, 80, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500 또는 1000% 감소된다. 일부 실시양태에서, 안티센스 올리고머가 접촉되는 세포에서 생성된 SCN1A 단백질을 코딩하는 mRNA 또는 SCN1A 단백질을 코딩하는 성숙한 mRNA의 총량은 미처리된 세포, 예를 들어, 미처리된 세포 또는 대조군 화합물로 처리된 세포에서 생성된 성숙한 RNA의 양과 비교하여 약 1.1 내지 약 10배, 약 1.5 내지 약 10배, 약 2 내지 약 10배, 약 3 내지 약 10배, 약 4 내지 약 10배, 약 1.1 내지 약 5배, 약 1.1 내지 약 6배, 약 1.1 내지 약 7배, 약 1.1 내지 약 8배, 약 1.1 내지 약 9배, 약 2 내지 약 5배, 약 2 내지 약 6배, 약 2 내지 약 7배, 약 2 내지 약 8배, 약 2 내지 약 9배, 약 3 내지 약 6배, 약 3 내지 약 7배, 약 3 내지 약 8배, 약 3 내지 약 9배, 약 4 내지 약 7배, 약 4 내지 약 8배, 약 4 내지 약 9배, 적어도 약 1.1배, 적어도 약 1.5배, 적어도 약 2배, 적어도 약 2.5배, 적어도 약 3배, 적어도 약 3.5배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배 또는 적어도 약 10배 감소된다. 대조군 화합물은 예를 들어 SCN1A NIE 함유 프리-mRNA의 표적화된 부분에 상보적이지 않은 올리고뉴클레오티드일 수 있다.
NIE는 임의의 길이일 수 있다. 일부 실시양태에서, NIE는 인트론의 전체 서열을 포함하고, 이 경우에, 이는 인트론 유지로 지칭될 수 있다. 일부 실시양태에서, NIE는 인트론의 일부분일 수 있다. 일부 실시양태에서, NIE는 5'ss 서열을 포함하는 인트론의 5' 말단 부분일 수 있다. 일부 실시양태에서, NIE는 3'ss의 서열을 포함하는 인트론의 3' 말단 부분일 수 있다. 일부 실시양태에서, NIE는 5'ss의 서열을 포함하지 않는 인트론 내의 일부분일 수 있다. 일부 실시양태에서, NIE는 3'ss의 서열을 포함하지 않는 인트론 내의 일부분일 수 있다. 일부 실시 예에서, NIE는 5'ss 또는 3'ss의 서열을 포함하지 않는 인트론 내의 일부분일 수 있다. 일부 실시양태에서, NIE는 5개 뉴클레오티드 내지 10개 뉴클레오티드 길이, 10개 뉴클레오티드 내지 15개 뉴클레오티드 길이, 15개 뉴클레오티드 내지 20개 뉴클레오티드 길이, 20개 뉴클레오티드 내지 25개 뉴클레오티드 길이, 25개 뉴클레오티드 내지 30개 뉴클레오티드 길이, 30개 뉴클레오티드 내지 35개 뉴클레오티드 길이, 35개 뉴클레오티드 내지 40개 뉴클레오티드 길이, 40개 뉴클레오티드 내지 45개 뉴클레오티드 길이, 45개 뉴클레오티드 내지 50개 뉴클레오티드 길이, 50개 뉴클레오티드 내지 55개 뉴클레오티드 길이, 55개 뉴클레오티드 내지 60개 뉴클레오티드 길이, 60개 뉴클레오티드 내지 65개 뉴클레오티드 길이, 65개 뉴클레오티드 내지 70개 뉴클레오티드 길이, 70개 뉴클레오티드 내지 75개 뉴클레오티드 길이, 75개 뉴클레오티드 내지 80개 뉴클레오티드 길이, 80개 뉴클레오티드 내지 85개 뉴클레오티드 길이, 85개 뉴클레오티드 내지 90개 뉴클레오티드 길이, 90개 뉴클레오티드 내지 95개 뉴클레오티드 길이, 또는 95개 뉴클레오티드 내지 100개 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 일부 실시양태에서, NIE는 적어도 10개 뉴클레오티드, 적어도 20개 뉴클레오티드, 적어도 30개 뉴클레오티드, 적어도 40개 뉴클레오티드, 적어도 50개 뉴클레오티드, 적어도 60개 뉴클레오티드, 적어도 70개 뉴클레오티드, 적어도 80개 뉴클레오티드 길이, 적어도 90개 뉴클레오티드 또는 적어도 100개 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 일부 실시양태에서, NIE는 100 내지 200개 뉴클레오티드 길이, 200 내지 300개 뉴클레오티드 길이, 300 내지 400개 뉴클레오티드 길이, 400 내지 500개 뉴클레오티드 길이, 500 내지 600개 뉴클레오티드 길이, 600 내지 700개 뉴클레오티드 길이, 700 내지 800개 뉴클레오티드 길이, 800 내지 900개 뉴클레오티드 길이, 900 내지 1,000개 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 일부 실시양태에서, NIE는 1,000개 뉴클레오티드 길이보다 더 길 수 있다.
가성-엑손의 포함은 프레임시프트 및 성숙한 mRNA 전사체 내 조기 종결 코돈 (PIC)의 도입을 초래하여 전사체를 NMD의 표적으로 만들 수 있다. NIE를 함유하는 성숙한 mRNA 전사체는 단백질 발현으로 이어지지 않는 비생산적인 mRNA 전사체일 수 있다. PIC는 NIE의 하류 임의의 위치에 존재할 수 있다. 일부 실시양태에서, PIC는 NIE의 하류 임의의 엑손에 존재할 수 있다. 일부 실시양태에서, PIC는 NIE 내에 존재할 수 있다. 예를 들어, SCN1A 유전자에 의해 코딩된 mRNA 전사체 내의 엑손 20x의 포함은 mRNA 전사체 내의 PIC, 예를 들어 mRNA 전사체의 엑손 21 내의 PIC를 유도할 수 있다.
치료제
본 개시내용의 다양한 실시양태에서, SCN1A의 단백질 발현 수준을 조절하기 위해 치료제를 포함하는 조성물 및 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, SCNA1 프리-mRNA의 선택적 스플라이싱을 조절하기 위한 조성물 및 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, SCN1A 프리-mRNA의 스플라이싱에서 엑손 스키핑을 유도하기 위한, 예를 들어 SCN1A 프리-mRNA의 스플라이싱 동안 가성-엑손의 스키핑을 유도하기 위한 조성물 및 방법이 본원에 제공된다. 다른 실시양태에서, 단백질 발현 수준을 감소시키기 위해 치료제를 사용하여 엑손의 포함을 유도할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 치료제는 소분자, 폴리펩티드 또는 폴리핵산 중합체이다. 일부 경우에, 치료제는 소분자이다. 일부 경우에, 치료제는 폴리펩티드이다. 일부 경우에, 치료제는 폴리핵산 중합체이다. 일부 경우에, 치료제는 리프레서(repressor) 제제이다. 추가의 경우에, 치료제는 인핸서 제제이다.
본원에 개시된 치료제는 NIE 리프레서 제제일 수 있다. 치료제는 폴리핵산 중합체를 포함할 수 있다.
본 개시내용의 한 측면에 따르면, 기능성 SCN1A 단백질의 수준을 증가시키기 위해 NIE 리프레서 제제를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 기능성 SCN1A 단백질 결핍과 관련된 병태의 치료 또는 예방 방법으로서, 상기 제제는 프리-mRNA 전사체의 영역에 결합하여 성숙한 전사체 내의 NIE의 포함을 감소시키는 것인 방법이 본원에 제공된다. 예를 들어, 기능성 SCN1A 단백질의 수준을 증가시키기 위해 NIE 리프레서 제제를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 기능성 SCN1A 단백질 결핍과 관련된 병태의 치료 또는 예방 방법으로서, 상기 제제는 프리-mRNA 전사체의 NIE를 함유하는 인트론의 영역(예를 들어, 인간 SCN1A 유전자에서 인트론 20) 또는 동일한 인트론 내의 NIE 활성화 조절 서열에 결합하는 것인 방법이 본원에서 제공된다.
성숙한 mRNA에 NIE 포함을 감소시키는 것이 언급되는 경우, 감소는 완전한, 예를 들어 100%일 수 있거나, 부분적일 수 있다. 감소는 임상적으로 유의할 수 있다. 감소/교정은 치료가 없는 대상체에서의 NIE 포함 수준에 상대적일 수 있거나 유사한 대상체 집단에서의 NIE 포함의 양에 상대적일 수 있다. 감소/교정은 평균 대상체 또는 치료 전 대상체에 비해 NIE 포함이 적어도 10% 적을 수 있다. 감소는 평균 대상체 또는 치료 전 대상체에 비해 NIE 포함이 적어도 20% 적을 수 있다. 감소는 평균 대상체 또는 치료 전 대상체에 비해 NIE 포함이 적어도 40% 적을 수 있다. 감소는 평균 대상체 또는 치료 전 대상체에 비해 NIE 포함이 적어도 50% 적을 수 있다. 감소는 평균 대상체 또는 치료 전 대상체에 비해 NIE 포함이 적어도 60% 적을 수 있다. 감소는 평균 대상체 또는 치료 전 대상체에 비해 NIE 포함이 적어도 80% 적을 수 있다. 감소는 평균 대상체 또는 치료 전 대상체에 비해 NIE 포함이 적어도 90% 적을 수 있다.
활성 SCN1A 단백질 수준을 증가시키는 것이 언급되는 경우, 증가는 임상적으로 유의할 수 있다. 증가는 치료 없는 대상체에서의 활성 SCN1A 단백질의 수준에 상대적일 수 있거나 유사한 대상체 집단에서의 활성 SCN1A 단백질의 양에 상대적일 수 있다. 증가는 평균 대상체 또는 치료 전 대상체에 비해 적어도 10% 많은 활성 SCN1A 단백질일 수 있다. 증가는 평균 대상체 또는 치료 전 대상체에 비해 적어도 20% 많은 활성 SCN1A 단백질일 수 있다. 증가는 평균 대상체 또는 치료 전 대상체에 비해 적어도 40% 많은 활성 SCN1A 단백질일 수 있다. 증가는 평균 대상체 또는 치료 전 대상체에 비해 적어도 50% 많은 활성 SCN1A 단백질일 수 있다. 증가는 평균 대상체 또는 치료 전 대상체에 비해 적어도 80% 많은 활성 SCN1A 단백질일 수 있다. 증가는 평균 대상체 또는 치료 전 대상체에 비해 적어도 100% 많은 활성 SCN1A 단백질일 수 있다. 증가는 평균 대상체 또는 치료 전 대상체에 비해 적어도 200% 많은 활성 SCN1A 단백질일 수 있다. 증가는 평균 대상체 또는 치료 전 대상체에 비해 적어도 500% 많은 활성 SCN1A 단백질일 수 있다.
NIE 리프레서 제제가 폴리핵산 중합체를 포함하는 실시양태에서, 폴리핵산 중합체는 약 50개 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 폴리핵산 중합체는 약 45개 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 폴리핵산 중합체는 약 40개 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 폴리핵산 중합체는 약 35개 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 폴리핵산 중합체는 약 30개 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 폴리핵산 중합체는 약 24 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 폴리핵산 중합체는 약 25개 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 폴리핵산 중합체는 약 20개 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 폴리핵산 중합체는 약 19개 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 폴리핵산 중합체는 약 18개 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 폴리핵산 중합체는 약 17개 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 폴리핵산 중합체는 약 16개 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 폴리핵산 중합체는 약 15개 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 폴리핵산 중합체는 약 14개 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 폴리핵산 중합체는 약 13개 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 폴리핵산 중합체는 약 12개 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 폴리핵산 중합체는 약 11개 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 폴리핵산 중합체는 약 10개 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 폴리핵산 중합체는 약 10 내지 약 50개 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 폴리핵산 중합체는 약 10 내지 약 45개 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 폴리핵산 중합체는 약 10 내지 약 40개 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 폴리핵산 중합체는 약 10 내지 약 35개 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 폴리핵산 중합체는 약 10 내지 약 30개 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 폴리핵산 중합체는 약 10 내지 약 25개 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 폴리핵산 중합체는 약 10 내지 약 20개 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 폴리핵산 중합체는 약 15 내지 약 25개 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 폴리핵산 중합체는 약 15 내지 약 30개 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 폴리핵산 중합체는 약 12 내지 약 30개 뉴클레오티드 길이일 수 있다.
폴리핵산 중합체의 서열은 mRNA 전사체, 예를 들어 부분적으로 프로세싱된 mRNA 전사체의 표적 서열과 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 99.5% 상보적일 수 있다. 폴리핵산 중합체의 서열은 프리-mRNA 전사체의 표적 서열에 100% 상보적일 수 있다.
폴리핵산 중합체의 서열은 프리-mRNA 전사체의 표적 서열과 4개 이하의 불일치를 가질 수 있다. 폴리핵산 중합체의 서열은 프리-mRNA 전사체의 표적 서열과 3개 이하의 불일치를 가질 수 있다. 폴리핵산 중합체의 서열은 프리-mRNA 전사체의 표적 서열과 2개 이하의 불일치를 가질 수 있다. 폴리핵산 중합체의 서열은 프리-mRNA 전사체의 표적 서열과 1개 이하의 불일치를 가질 수 있다. 폴리핵산 중합체의 서열은 프리-mRNA 전사체의 표적 서열과 불일치를 갖지 않을 수 있다.
폴리핵산 중합체는 프리-mRNA 전사체의 표적 서열에 특이적으로 혼성화할 수 있다. 예를 들어, 폴리핵산 중합체는 프리-mRNA 전사체의 표적 서열에 대해 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100% 서열 상보성을 가질 수 있다. 혼성화는 매우 엄격한 혼성화 조건 하에 있을 수 있다.
폴리핵산 중합체는 서열번호 12 내지 731로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 99.5% 서열 동일성을 갖는 서열을 가질 수 있다. 폴리핵산 중합체는 서열번호 12 내지 731로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 가질 수 있다. 일부 경우에, 폴리핵산 중합체는 서열번호 12 내지 371로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 99.5% 서열 동일성을 갖는 서열을 가질 수 있다. 일부 경우에, 폴리핵산 중합체는 서열번호 12 내지 371로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 가질 수 있다. 일부 경우에, 폴리핵산 중합체는 서열번호 372 내지 731로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 99.5% 서열 동일성을 갖는 서열을 가질 수 있다. 일부 경우에, 폴리핵산 중합체는 서열번호 372 내지 731로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 가질 수 있다.
폴리핵산 중합체 서열이 언급되는 경우, 당업자는 표적 서열에 혼성화하는 능력; 또는 표적 서열 내에 치환이 있는 경우, 표적 서열로 인식될 수 있는 능력이 유지되도록, 서열 내에 하나 이상의 치환이 허용될 수 있고, 임의로 2개의 치환이 허용될 수 있음을 이해할 것이다. 서열 동일성에 대한 기준은 표준/데폴트 파라미터를 사용한 BLAST 서열 정렬에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 서열은 99% 동일성을 갖고 본 개시내용에 따라 여전히 기능을 할 수 있다. 다른 실시양태에서, 서열은 98% 동일성을 갖고 본 개시내용에 따라 여전히 기능을 할 수 있다. 다른 실시 형태에서, 서열은 95% 동일성을 갖고 본 발명에 따라 여전히 기능을 할 수 있다. 다른 실시양태에서, 서열은 90% 동일성을 갖고 본 개시내용에 따라 여전히 기능을 할 수 있다.
안티센스 올리고머
SCN1A NIE 함유 프리-mRNA의 표적화된 부분에 결합함으로써 엑손 스키핑을 유도하는 안티센스 올리고머를 포함하는 조성물이 본원에 제공된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "ASO" 및 "안티센스 올리고머"는 호환적으로 사용되며, 왓슨-크릭(Watson-Crick) 염기 짝짓기 또는 워블(wobble) 염기 짝짓기(G-U)에 의해 표적 핵산(예를 들어, SCN1A NIE 함유 프리-mRNA) 서열에 혼성화하는 핵염기를 포함하는 폴리뉴클레오티드와 같은 올리고머를 지칭한다. ASO는 표적 서열에 상보적이거나 또는 거의 상보성인(예를 들어, 표적 서열에 결합하고 스플라이스 부위에서 스플라이싱을 향상시키기에 충분한 상보성) 정확한 서열을 가질 수 있다. ASO는 이들이 표적 핵산(예를 들어, 프리-mRNA 전사체의 표적화된 부분)에 결합(혼성화)하고 생리학적 조건 하에 혼성화된 상태를 유지하도록 설계된다. 전형적으로, 이들이 의도된(표적화된) 핵산 서열 이외의 부위에 혼성화하는 경우, 이들은 표적 핵산이 아닌 제한된 수의 서열에(표적 핵산 이외의 몇몇 부위에) 혼성화된다. ASO가 다른 부위에 결합하고 "표적 이탈(off-target)" 효과를 유발할 가능성이 제한되도록, ASO의 설계는 게놈 또는 세포 프리-mRNA 또는 트랜스크립톰(transcriptome)의 다른 위치에서의 프리-mRNA 전사체의 표적화된 부분의 핵산 서열 또는 충분히 유사한 핵산 서열의 발생을 고려할 수 있다. 당업계에 공지된, 예를 들어 "Reducing Nonsense-Mediated mRNA Decay"를 발명의 명칭으로 하는 WO 2015/035091호로서 공개된 PCT 출원 PCT/US2014/054151호(본원에 참고로 포함됨)에서의 임의의 안티센스 올리고머가 본원에 기재된 방법을 실시하는 데 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, ASO는 표적 핵산 또는 NIE 함유 프리-mRNA의 표적화된 부분에 "특이적으로 혼성화"하거나 "특이적"이다. 전형적으로, 이러한 혼성화는 실질적으로 37℃ 초과, 바람직하게는 적어도 50℃ 및 전형적으로 60℃ 내지 대략 90℃의 Tm에서 발생한다. 이러한 혼성화는 바람직하게는 엄격한 혼성화 조건에 상응한다. 주어진 이온 강도 및 pH에서, Tm은 표적 서열의 50%가 상보적인 올리고뉴클레오티드에 혼성화하는 온도이다.
올리고뉴클레오티드와 같은 올리고머는 2개의 단일 가닥 폴리뉴클레오티드 사이의 역평행 배치로 혼성화가 일어날 때 서로 "상보적"이다. 이중 가닥 폴리뉴클레오티드는 제1 폴리뉴클레오티드의 가닥 중 하나와 제2 폴리뉴클레오티드 사이에서 혼성화가 발생할 수 있는 경우 다른 폴리뉴클레오티드에 대해 "상보적"일 수 있다. 상보성(하나의 폴리뉴클레오티드가 다른 폴리뉴클레오티드와 상보적인 정도)은 일반적으로 허용되는 염기 짝짓기 규칙에 따라 서로 수소 결합을 형성할 것으로 예상되는 반대 가닥의 염기의 비율(예를 들어, 백분율) 면에서 정량화할 수 있다. 안티센스 올리고머(ASO)의 서열은 혼성화하기 위해 이의 표적 핵산의 서열과 100% 상보적일 필요는 없다. 소정 실시양태에서, ASO는 이들이 표적화되는 표적 핵산 서열 내의 표적 영역과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 상보성을 포함할 수 있다. 예를 들어, 올리고머 화합물의 20개 핵염기 중 18개가 표적 영역에 상보적이고, 따라서 특이적으로 혼성화하는 ASO는 90% 상보성을 나타낸다. 이러한 예에서, 나머지 비상보적인 핵염기는 함께 클러스터링되거나 상보적인 핵염기가 산재될 수 있으며, 서로 또는 상보적인 핵염기에 대해 인접할 필요는 없다. 표적 핵산의 영역과 ASO의 상보성 백분율은 당업계에 공지된 BLAST 프로그램(기본 국소 정렬 검색 도구) 및 PowerBLAST 프로그램(Altschul, et al., J. Mol. Biol., 1990, 215, 403-410; Zhang and Madden, Genome Res., 1997, 7, 649-656)을 사용하여 통상적으로 결정될 수 있다.
ASO는 표적 서열에서 모든 핵염기에 혼성화할 필요는 없고, 이것이 혼성화하는 핵염기는 인접하거나 비인접할 수 있다. ASO는 프리-mRNA 전사체의 하나 이상의 세그먼트에 걸쳐 혼성화할 수 있어서, 개재 또는 인접 세그먼트가 혼성화 이벤트에 관여하지 않는다(예를 들어, 루프 구조 또는 헤어핀 구조가 형성될 수 있다). 소정 실시양태에서, ASO는 표적 프리-mRNA 전사체에서 비인접 핵염기에 혼성화한다. 예를 들어, ASO는 ASO가 혼성화하지 않는 하나 이상의 핵염기(들)에 의해 분리된 프리-mRNA 전사체에서 핵염기에 혼성화할 수 있다.
본원에 기재된 ASO는 NIE 함유 프리-mRNA의 표적화된 부분에 존재하는 핵염기에 상보적인 핵염기를 포함한다. 용어 ASO는 올리고뉴클레오티드, 및 표적 mRNA 상의 상보적 핵염기와 혼성화할 수 있는 핵염기는 포함하지만 펩티드 핵산(PNA)과 같은 당 모이어티를 포함하지 않는 임의의 다른 올리고머 분자를 구체화한다. ASO는 천연 발생 뉴클레오티드, 뉴클레오티드 유사체, 변형된 뉴클레오티드, 또는 상기한 것 중 둘 또는 셋의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 용어 "천연 발생 뉴클레오티드"는 데옥시리보뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드를 포함한다. 용어 "변형된 뉴클레오티드"는 변형되거나 치환된 당 기를 갖고/거나 변형된 백본을 갖는 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, ASO의 모든 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드이다. 본원에 기재된 방법 및 조성물과 상용성인 ASO 또는 ASO의 성분의 화학적 변형은 당업자에게 자명할 것이며, 예를 들어 미국 특허 제8,258,109 B2호, 미국 특허 제5,656,612호, 미국 특허 공개 제2012/0190728호, 및 문헌[Dias and Stein, Mol. Cancer Ther. 2002, 347-355]에서 찾아볼 수 있으며, 이들은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
ASO의 하나 이상의 핵염기는 임의의 천연 발생, 비변형 핵염기, 예를 들어 아데닌, 구아닌, 시토신, 티민 및 우라실, 또는 비변형 핵염기와 충분히 유사하여 이것이 표적 프리-mRNA 상에 존재하는 핵염기와 수소 결합할 수 있는 임의의 합성 또는 변형된 핵염기일 수 있다. 변형된 핵염기의 예로는, 제한 없이, 히포크산틴, 크산틴, 7-메틸구아닌, 5,6-디하이드로우라실, 5-메틸시토신, 및 5-하이드록시메토일 시토신이 포함된다.
본원에 기재된 ASO는 또한 올리고머의 성분을 연결하는 백본 구조를 포함한다. 용어 "백본 구조" 및 "올리고머 결합"은 호환적으로 사용될 수 있으며 ASO의 단량체 사이의 연결을 지칭한다. 천연 발생 올리고뉴클레오티드에서, 백본은 올리고머의 당 모이어티를 연결하는 3'-5' 포스포디에스테르 결합을 포함한다. 본원에 기재된 ASO의 백본 구조 또는 올리고머 결합은 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포로셀레노에이트, 포스포로디셀레노에이트, 포스포로아닐로티오에이트, 포스포라닐라데이트, 포스포라미데이트 등을 포함할 수 있다(그러나, 이에 한정되지 않는다). 예를 들어, 문헌[LaPlanche, et al., Nucleic Acids Res. 14:9081 (1986); Stec, et al., J. Am. Chem. Soc. 106:6077 (1984), Stein, et al., Nucleic Acids Res. 16:3209 (1988), Zon, et al., Anti-Cancer Drug Design 6:539 (1991); Zon, et al., Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, pp. 87-108 (F. Eckstein, Ed., Oxford University Press, Oxford England (1991)); Stec, et al., 미국 특허 제5,151,510호; Uhlmann and Peyman, Chemical Reviews 90:543 (1990)]을 참조한다. 일부 실시양태에서, ASO의 백본 구조는 인을 함유하지 않고, 오히려 예를 들어 펩티드 핵산(PNA) 내 펩티드 결합, 또는 카바메이트, 아미드, 및 선형 및 환식 탄화수소 기를 포함하는 연결 기를 함유한다. 일부 실시양태에서, 백본 변형은 포스포티오에이트 결합이다. 일부 실시양태에서, 백본 변형은 포스포라미데이트 결합이다.
실시양태에서, ASO 백본의 인 뉴클레오티드간 결합의 각각에서 입체화학은 무작위적이다. 실시양태에서, ASO 백본의 인 뉴클레오티드간 결합의 각각에서 입체화학은 제어되고 무작위적이지 않다. 예를 들어, 본원에 참고로 포함된 미국 특허 출원 제2014/0194610호, "Methods for the Synthesis of Functionalized Nucleic Acids,"는 핵산 올리고머에서 각각의 인 원자에서 키랄 선성(handedness of chirality)을 독립적으로 선택하는 방법을 설명한다. 실시양태에서, 본원의 표 5 및 6에 제시된 임의의 ASO를 포함하지만 이에 한정되지 않는 본 발명의 방법에 사용된 ASO는 무작위적이지 않은 인 뉴클레오티드간 결합을 갖는 ASO를 포함한다. 실시양태에서, 본 발명의 방법에 사용된 조성물은 순수한 부분입체이성체 ASO를 포함한다. 실시양태에서, 본 발명의 방법에 사용된 조성물은 약 90% 이상, 약 91% 이상, 약 92% 이상, 약 93% 이상, 약 94% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 약 99% 이상, 약 100%, 약 90% 내지 약 100%, 약 91% 내지 약 100%, 약 92% 내지 약 100%, 약 93% 내지 약 100%, 약 94% 내지 약 100%, 약 95% 내지 약 100%, 약 96% 내지 약 100%, 약 97% 내지 약 100%, 약 98% 내지 약 100% 또는 약 99% 내지 약 100%의 부분입체이성체 순도를 갖는 ASO를 포함한다.
실시양태에서, ASO는 이의 인 뉴클레오티드간 결합에서 Rp 및 Sp 입체배치의 비무작위성 혼합물을 갖는다. 예를 들어, 우수한 활성과 뉴클레아제 안정성 사이의 균형을 달성하기 위해 안티센스 올리고뉴클레오티드에서 Rp와 Sp의 혼합이 필요하다는 것이 제안되었다(Wan, et al., 2014, "Synthesis, biophysical properties and biological activity of second generation antisense oligonucleotides containing chiral phosphorothioate linkages," Nucleic Acids Research 42(22): 13456-13468, 본원에 참고로 포함됨). 실시양태에서, 본원의 서열번호 12 내지 731에 제시된 임의의 ASO를 포함하지만 이에 한정되지 않는 본 발명의 방법에 사용되는 ASO는 약 5 내지 100% Rp, 적어도 약 5% Rp, 적어도 약 10% Rp, 적어도 약 15% Rp, 적어도 약 20% Rp, 적어도 약 25% Rp, 적어도 약 30% Rp, 적어도 약 35% Rp, 적어도 약 40% Rp, 적어도 약 45% Rp, 적어도 약 50% Rp, 적어도 약 55% Rp, 적어도 약 60% Rp, 적어도 약 65% Rp, 적어도 약 70% Rp, 적어도 약 75% Rp, 적어도 약 80% Rp, 적어도 약 85% Rp, 적어도 약 90% Rp, 또는 적어도 약 95% Rp, 그리고 나머지의 Sp, 또는 약 100% Rp를 포함한다. 실시양태에서, 본원의 서열번호 12 내지 731에 제시된 임의의 ASO를 포함하지만 이에 한정되지 않는 본 발명의 방법에 사용되는 ASO는 약 10% 내지 약 100% Rp, 약 15% 내지 약 100% Rp, 약 20% 내지 약 100% Rp, 약 25% 내지 약 100% Rp, 약 30% 내지 약 100% Rp, 약 35% 내지 약 100% Rp, 약 40% 내지 약 100% Rp, 약 45% 내지 약 100% Rp, 약 50% 내지 약 100% Rp, 약 55% 내지 약 100% Rp, 약 60% 내지 약 100% Rp, 약 65% 내지 약 100% Rp, 약 70% 내지 약 100% Rp, 약 75% 내지 약 100% Rp, 약 80% 내지 약 100% Rp, 약 85% 내지 약 100% Rp, 약 90% 내지 약 100% Rp, 또는 약 95% 내지 약 100% Rp, 약 20% 내지 약 80% Rp, 약 25% 내지 약 75% Rp, 약 30% 내지 약 70% Rp, 약 40% 내지 약 60% Rp, 또는 약 45% 내지 약 55% Rp, 그리고 나머지의 Sp를 포함한다.
실시양태에서, 본원의 서열번호 12 내지 731에 제시된 임의의 ASO를 포함하지만 이에 한정되지 않는 본 발명의 방법에 사용되는 ASO는 약 5 내지 100% Sp, 적어도 약 5% Sp, 적어도 약 10% Sp, 적어도 약 15% Sp, 적어도 약 20% Sp, 적어도 약 25% Sp, 적어도 약 30% Sp, 적어도 약 35% Sp, 적어도 약 40% Sp, 적어도 약 45% Sp, 적어도 약 50% Sp, 적어도 약 55% Sp, 적어도 약 60% Sp, 적어도 약 65% Sp, 적어도 약 70% Sp, 적어도 약 75% Sp, 적어도 약 80% Sp, 적어도 약 85% Sp, 적어도 약 90% Sp, 또는 적어도 약 95% Sp, 그리고 나머지의 Rp, 또는 약 100% Sp를 포함한다. 실시양태에서, 본원의 서열번호 12 내지 731에 제시된 임의의 ASO를 포함하지만 이에 한정되지 않는 본 발명의 방법에 사용되는 ASO는 약 10% 내지 약 100% Sp, 약 15% 내지 약 100% Sp, 약 20% 내지 약 100% Sp, 약 25% 내지 약 100% Sp, 약 30% 내지 약 100% Sp, 약 35% 내지 약 100% Sp, 약 40% 내지 약 100% Sp, 약 45% 내지 약 100% Sp, 약 50% 내지 약 100% Sp, 약 55% 내지 약 100% Sp, 약 60% 내지 약 100% Sp, 약 65% 내지 약 100% Sp, 약 70% 내지 약 100% Sp, 약 75% 내지 약 100% Sp, 약 80% 내지 약 100% Sp, 약 85% 내지 약 100% Sp, 약 90% 내지 약 100% Sp, 또는 약 95% 내지 약 100% Sp, 약 20% 내지 약 80% Sp, 약 25% 내지 약 75% Sp, 약 30% 내지 약 70% Sp, 약 40% 내지 약 60% Sp, 또는 약 45% 내지 약 55% Sp, 그리고 나머지의 Rp를 포함한다.
본원에 기재된 임의의 ASO는 천연 발생 뉴클레오티드에 존재하는 리보오스 또는 데옥시리보오스, 또는 변형된 당 모이어티, 또는 모르폴린 고리를 포함하는 당 유사체를 포함하는 당 모이어티를 함유할 수 있다. 변형된 당 모이어티의 비제한적 예는 2' 치환, 예컨대 2'-O-메틸(2'-O-Me), 2'-O-메톡시에틸(2'MOE), 2'-O-아미노에틸, 2'F; N3'->P5' 포스포라미데이트, 2'디메틸아미노옥시에톡시, 2'디메틸아미노에톡시에톡시, 2'-구아니디니듐, 2'-O-구아니디늄 에틸, 카바메이트 변형된 당, 및 이환식 변형된 당을 포함한다. 일부 실시양태에서, 당 모이어티 변형은 2'-O-Me, 2'F, 및 2'MOE로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 당 모이어티 변형은 잠금 핵산(LNA)에서와 같은 추가의 가교 결합이다. 일부 실시양태에서, 당 유사체는 포스포로디아미데이트 모르폴리노(PMO)와 같은 모르폴린 고리를 함유한다. 일부 실시양태에서, 당 모이어티는 리보푸란실 또는 2'데옥시리보푸란실 변형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 당 모이어티는 2'4'-구속된 2'O-메틸옥시에틸(cMOE) 변형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 당 모이어티는 cEt 2', 4' 구속된 2'-O 에틸 BNA 변형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 당 모이어티는 트리사이클로 DNA(tcDNA) 변형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 당 모이어티는 에틸렌 핵산(ENA) 변형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 당 모이어티는 MCE 변형을 포함한다. 변형은 당업계에 공지되어 있고 문헌, 예를 들어 본원에서 이러한 목적을 위해 참고로 포함된 문헌[Jarver, et al., 2014, "A Chemical View of Oligonucleotides for Exon Skipping and Related Drug Applications," Nucleic Acid Therapeutics 24(1): 37-47]에 설명되어 있다.
일부 실시양태에서, ASO의 각 단량체는 동일한 방식으로 변형되며, 예를 들어 ASO의 백본의 각각의 결합은 포스포로티오에이트 결합을 포함하거나 각각의 리보오스 당 모이어티는 2'O-메틸 변형을 포함한다. ASO의 각 단량체 성분에 존재하는 이러한 변형은 "균일한 변형"으로 지칭된다. 일부 예에서, 상이한 변형들의 조합이 바람직할 수 있으며, 예를 들어, ASO는 포스포로디아미데이트 결합과 모르폴린 고리(모르폴리노)를 포함하는 당 모이어티의 조합을 포함할 수 있다. ASO에 대한 상이한 변형의 조합은 "혼합 변형" 또는 "혼합 화학"으로 지칭된다.
일부 실시양태에서, ASO는 하나 이상의 백본 변형을 포함한다. 일부 실시양태에서, ASO는 하나 이상의 당 모이어티 변형을 포함한다. 일부 실시양태에서, ASO는 하나 이상의 백본 변형 및 하나 이상의 당 모이어티 변형을 포함한다. 일부 실시양태에서, ASO는 2'MOE 변형 및 포스포로티오에이트 백본을 포함한다. 일부 실시양태에서, ASO는 포스포로디아미데이트 모르폴리노(PMO)를 포함한다. 일부 실시양태에서, ASO는 펩티드 핵산(PNA)을 포함한다. 본원에 기재된 임의의 ASO 또는 ASO의 임의의 성분(예를 들어, 핵염기, 당 모이어티, 백본)은 ASO의 원하는 특성 또는 활성을 달성하거나 ASO의 원하지 않는 특성 또는 활성을 감소시키기 위해 변형될 수 있다. 예를 들어, ASO 또는 임의의 ASO의 하나 이상의 성분은 변형되어 프리-mRNA 전사체 상의 표적 서열에 대한 결합 친화성을 향상시키고/시키거나; 임의의 비-표적 서열에 대한 결합을 감소시키고/시키거나; 세포 뉴클레아제(즉, RNase H)에 의한 분해를 감소시키고/시키거나; 세포 및/또는 세포의 핵으로의 ASO의 흡수를 개선시키고/시키거나; ASO의 약동학 또는 약력학을 변경하고/하거나; ASO의 반감기를 조정할 수 있다.
일부 실시양태에서, ASO는 2'-O-(2-메톡시에틸)(MOE) 포스포로티오에이트-변형된 뉴클레오티드로 구성된다. 이러한 뉴클레오티드로 구성된 ASO는 본원에 개시된 방법에 특히 적합하며; 이러한 변형을 갖는 올리고머는 뉴클레아제 분해에 대한 향상된 내성 및 증가된 생체이용률을 가져서, 예를 들어 본원에 기재된 일부 실시양태에서 경구 전달에 적합하게 만드는 것으로 나타났다. 예를 들어, 문헌[Geary, et al., J Pharmacol Exp Ther. 2001; 296(3):890-7; Geary, et al., J Pharmacol Exp Ther. 2001; 296(3):898-904]을 참조할 수 있다.
ASO를 합성하는 방법은 당업자에게 공지될 것이다. 대안적으로 또는 추가로, ASO는 상업적 공급원으로부터 수득될 수 있다.
달리 명시되지 않는 한, 단일 가닥 핵산(예를 들어, 프리-mRNA 전사체, 올리고뉴클레오티드, ASO 등) 서열의 좌측 말단은 5' 말단이고 단일 또는 이중 가닥 핵산 서열의 좌측 방향은 5' 방향으로 지칭된다. 유사하게, 핵산 서열(단일 또는 이중 가닥)의 우측 말단 또는 방향은 3' 말단 또는 방향이다. 일반적으로, 핵산에서 기준점에 대해 5'인 영역 또는 서열은 "상류"로 지칭되고, 핵산에서 기준점에 대해 3'인 영역 또는 서열은 "하류"로 지칭된다. 일반적으로, mRNA의 5' 방향 또는 말단은 개시 또는 출발 코돈이 위치하는 곳인 반면, 3' 말단 또는 방향은 종결 코돈이 위치하는 곳이다. 일부 측면에서, 핵산에서 기준점의 상류에 있는 뉴클레오티드는 음수로 지정될 수 있는 반면, 기준점의 하류에 있는 뉴클레오티드는 양수로 지정될 수 있다. 예를 들어, 기준점(예를 들어, mRNA 내의 엑손-엑손 접합부)은 "0(zero)" 부위로 지정될 수 있고, 기준점의 바로 인접한 상류에 있는 뉴클레오티드는 "마이너스 1", 예를 들어 "-1"로 지정되는 반면, 기준점의 바로 인접한 하류에 있는 뉴클레오티드는 "플러스 1", 예를 들어 "+1"로 지정된다.
일부 실시양태에서, ASO는 SCN1A NIE 함유 프리-mRNA에 포함된 엑손의 5' 스플라이스 부위(또는 NIE의 3' 말단)의 하류(3' 방향)(예를 들어, 5' 스플라이스 부위에 대해 양수로 지정되는 방향)에 있는 SCN1A NIE 함유 프리-mRNA의 표적화된 부분에 상보적이다(그리고 이에 결합한다). 일부 실시양태에서, ASO는 포함된 엑손의 5' 스플라이스 부위(또는 3'말단)에 대해 약 +1 내지 약 +500의 영역 내에 있는 SCN1A NIE 함유 프리-mRNA의 표적화된 부분에 상보적이다. 일부 실시양태에서, ASO는 포함된 엑손의 5' 스플라이스 부위(또는 3' 말단)에 대해 뉴클레오티드 +6 내지 +496의 영역 내에 있는 SCN1A NIE 함유 프리-mRNA의 표적화된 부분에 상보적일 수 있다. 일부 측면에서, ASO는 포함된 엑손의 5' 스플라이스 부위(또는 3' 말단)에 대해 약 +1 내지 약 +500, 약 +1 내지 약 +490, 약 +1 내지 약 +480, 약 +1 내지 약 +470, 약 +1 내지 약 +460, 약 +1 내지 약 +450, 약 +1 내지 약 +440, 약 +1 내지 약 +430, 약 +1 내지 약 +420, 약 +1 내지 약 +410, 약 +1 내지 약 +400, 약 +1 내지 약 +390, 약 +1 내지 약 +380, 약 +1 내지 약 +370, 약 +1 내지 약 +360, 약 +1 내지 약 +350, 약 +1 내지 약 +340, 약 +1 내지 약 +330, 약 +1 내지 약 +320, 약 +1 내지 약 +310, 약 +1 내지 약 +300, 약 +1 내지 약 +290, 약 +1 내지 약 +280, 약 +1 내지 약 +270, 약 +1 내지 약 +260, 약 +1 내지 약 +250, 약 +1 내지 약 +240, 약 +1 내지 약 +230, 약 +1 내지 약 +220, 약 +1 내지 약 +210, 약 +1 내지 약 +200, 약 +1 내지 약 +190, 약 +1 내지 약 +180, 약 +1 내지 약 +170, 약 +1 내지 약 +160, 약 +1 내지 약 +150, 약 +1 내지 약 +140, 약 +1 내지 약 +130, 약 +1 내지 약 +120, 약 +1 내지 약 +110, 약 +1 내지 약 +100, 약 +1 내지 약 +90, 약 +1 내지 약 +80, 약 +1 내지 약 +70, 약 +1 내지 약 +60, 약 +1 내지 약 +50, 약 +1 내지 약 +40, 약 +1 내지 약 +30, 또는 약 +1 내지 약 +20의 영역 내에 있는 표적화된 부분에 상보적이다. 일부 측면에서, ASO는 포함된 엑손의 5' 스플라이스 부위(또는 3' 말단)에 대해 약 +1 내지 약 +100, 약 +100 내지 약 +200, 약 +200 내지 약 +300, 약 +300 내지 약 +400, 또는 약 +400 내지 약 +500의 영역 내에 있는 표적화된 부분에 상보적이다.
일부 실시양태에서, ASO는 SCN1A NIE 함유 프리-mRNA에 포함된 엑손의 5' 스플라이스 부위(또는 3' 말단)의 상류(5' 방향)(예를 들어, 5' 스플라이스 부위에 대해 음수로 지정되는 방향)에 있는 SCN1A NIE 함유 프리-mRNA의 표적화된 부분에 상보적이다(그리고 이에 결합한다). 일부 실시양태에서, ASO는 포함된 엑손의 5' 스플라이스 부위(또는 3' 말단)에 대해 약 -4 내지 약 -270의 영역 내에 있는 SCN1A NIE 함유 프리-mRNA의 표적화된 부분에 상보적이다. 일부 실시양태에서, ASO는 포함된 엑손의 5' 스플라이스 부위(또는 3' 말단)에 대해 뉴클레오티드 -1 내지 -264의 영역 내에 있는 SCN1A NIE 함유 프리-mRNA의 표적화된 부분에 상보적일 수 있다. 일부 측면에서, ASO는 포함된 엑손의 5' 스플라이스 부위(또는 3' 말단)에 대해 약 -1 내지 약 -270, 약 -1 내지 약 -260, 약 -1 내지 약 -250, 약 -1 내지 약 -240, 약 -1 내지 약 -230, 약 -1 내지 약 -220, 약 -1 내지 약 -210, 약 -1 내지 약 -200, 약 -1 내지 약 -190, 약 -1 내지 약 -180, 약 -1 내지 약 -170, 약 -1 내지 약 -160, 약 -1 내지 약 -150, 약 -1 내지 약 -140, 약 -1 내지 약 -130, 약 -1 내지 약 -120, 약 -1 내지 약 -110, 약 -1 내지 약 -100, 약 -1 내지 약 -90, 약 -1 내지 약 -80, 약 -1 내지 약 -70, 약 -1 내지 약 -60, 약 -1 내지 약 -50, 약 -1 내지 약 -40, 약 -1 내지 약 -30, 또는 약 -1 내지 약 -20의 영역 내에 있는 표적화된 부분에 상보적이다. 일부 측면에서, ASO는 포함된 엑손의 5' 스플라이스 부위(또는 3' 말단)에 대해 약 -1 내지 약 -50, 약 -50 내지 약 -100, 약 -100 내지 약 -150, 약 -150 내지 약 -200, 또는 약 -200 내지 약 -250의 영역 내에 있는 표적화된 부분에 상보적이다.
일부 실시양태에서, ASO는 SCN1A NIE 함유 프리-mRNA에 포함된 엑손의 3' 스플라이스 부위(또는 5' 말단)의 상류(5' 방향)(예를 들어, 음수로 지정되는 방향)에 있는 SCN1A NIE 함유 프리-mRNA의 표적화된 부분에 상보적이다. 일부 실시양태에서, ASO는 포함된 엑손의 3' 스플라이스 부위(또는 5' 말단)에 대해 약 -1 내지 약 -500의 영역 내에 있는 SCN1A NIE 함유 프리-mRNA의 표적화된 부분에 상보적이다. 일부 실시양태에서, ASO는 포함된 엑손의 3' 스플라이스 부위에 대해 -1 내지 -496의 영역 내에 있는 SCN1A NIE 함유 프리-mRNA의 표적화된 부분에 상보적이다. 일부 측면에서, ASO는 포함된 엑손의 3' 스플라이스 부위에 대해 약 -1 내지 약 -500, 약 -1 내지 약 -490, 약 -1 내지 약 -480, 약 -1 내지 약 -470, 약 -1 내지 약 -460, 약 -1 내지 약 -450, 약 -1 내지 약 -440, 약 -1 내지 약 -430, 약 -1 내지 약 -420, 약 -1 내지 약 -410, 약 -1 내지 약 -400, 약 -1 내지 약 -390, 약 -1 내지 약 -380, 약 -1 내지 약 -370, 약 -1 내지 약 -360, 약 -1 내지 약 -350, 약 -1 내지 약 -340, 약 -1 내지 약 -330, 약 -1 내지 약 -320, 약 -1 내지 약 -310, 약 -1 내지 약 -300, 약 -1 내지 약 -290, 약 -1 내지 약 -280, 약 -1 내지 약 -270, 약 -1 내지 약 -260, 약 -1 내지 약 -250, 약 -1 내지 약 -240, 약 -1 내지 약 -230, 약 -1 내지 약 -220, 약 -1 내지 약 -210, 약 -1 내지 약 -200, 약 -1 내지 약 -190, 약 -1 내지 약 -180, 약 -1 내지 약 -170, 약 -1 내지 약 -160, 약 -1 내지 약 -150, 약 -1 내지 약 -140, 약 -1 내지 약 -130, 약 -1 내지 약 -120, 약 -1 내지 약 -110, 약 -1 내지 약 -100, 약 -1 내지 약 -90, 약 -1 내지 약 -80, 약 -1 내지 약 -70, 약 -1 내지 약 -60, 약 -1 내지 약 -50, 약 -1 내지 약 -40, 또는 약 -1 내지 약 -30의 영역 내에 있는 표적화된 부분에 상보적이다. 일부 측면에서, ASO는 포함된 엑손의 3' 스플라이스 부위에 대해 약 -1 내지 약 -100, 약 -100 내지 약 -200, 약 -200 내지 약 -300, 약 -300 내지 약 -400, 또는 약 -400 내지 약 -500의 영역 내에 있는 표적화된 부분에 상보적이다.
일부 실시양태에서, ASO는 SCN1A NIE 함유 프리-mRNA에 포함된 엑손의 3' 스플라이스 부위(또는 5' 말단)의 하류(3' 방향)(예를 들어, 양수로 지정되는 방향)에 있는 SCN1A NIE 함유 프리-mRNA의 표적화된 부분에 상보적이다. 일부 실시양태에서, ASO는 포함된 엑손의 3' 스플라이스 부위에 대해 약 +1 내지 약 +100의 영역 내에 있는 SCN1A NIE 함유 프리-mRNA의 표적화된 부분에 상보적이다. 일부 측면에서, ASO는 포함된 엑손의 3' 스플라이스 부위에 대해 약 +1 내지 약 +90, 약 +1 내지 약 +80, 약 +1 내지 약 +70, 약 +1 내지 약 +60, 약 +1 내지 약 +50, 약 +1 내지 약 +40, 약 +1 내지 약 +30, 약 +1 내지 약 +20, 또는 약 +1 내지 약 +10의 영역 내에 있는 표적화된 부분에 상보적이다.
일부 실시양태에서, SCN1A NIE 함유 프리-mRNA의 표적화된 부분은 포함된 엑손의 5' 스플라이스 부위(3' 말단)에 대해 +100 내지 포함된 엑손의 3' 스플라이스 부위(5' 말단)에 대해 -100의 영역 내에 있다. 일부 실시양태에서, SCN1A NIE 함유 프리-mRNA의 표적화된 부분은 NIE 내에 있다. 일부 실시양태에서, SCN1A NIE 함유 프리-mRNA의 표적화된 부분은 가성-엑손과 인트론 경계를 포함한다.
ASO는 특이적 결합 및 스플라이싱의 효과적인 향상에 적합한 임의의 길이일 수 있다. 일부 실시양태에서, ASO는 8 내지 50개의 핵염기로 이루어진다. 예를 들어, ASO는 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 40, 45 또는 50개의 핵염기 길이일 수 있다. 일부 실시양태에서, ASO는 50개 초과의 핵염기로 이루어진다. 일부 실시양태에서, ASO는 8 내지 50개의 핵염기, 8 내지 40개의 핵염기, 8 내지 35개의 핵염기, 8 내지 30개의 핵염기, 8 내지 25개의 핵염기, 8 내지 20개의 핵염기, 8 내지 15개의 핵염기, 9 내지 50개의 핵염기, 9 내지 40개의 핵염기, 9 내지 35개의 핵염기, 9 내지 30개의 핵염기, 9 내지 25개의 핵염기, 9 내지 20개의 핵염기, 9 내지 15개의 핵염기, 10 내지 50개의 핵염기, 10 내지 40개의 핵염기, 10 내지 35개의 핵염기, 10 내지 30개의 핵염기, 10 내지 25개의 핵염기, 10 내지 20개의 핵염기, 10 내지 15개의 핵염기, 11 내지 50개의 핵염기, 11 내지 40개의 핵염기, 11 내지 35개의 핵염기, 11 내지 30개의 핵염기, 11 내지 25개의 핵염기, 11 내지 20개의 핵염기, 11 내지 15개의 핵염기, 12 내지 50개의 핵염기, 12 내지 40개의 핵염기, 12 내지 35개의 핵염기, 12 내지 30개의 핵염기, 12 내지 25개의 핵염기, 12 내지 20개의 핵염기, 12 내지 15개의 핵염기, 13 내지 50개의 핵염기, 13 내지 40개의 핵염기, 13 내지 35개의 핵염기, 13 내지 30개의 핵염기, 13 내지 25개의 핵염기, 13 내지 20개의 핵염기, 14 내지 50개의 핵염기, 14 내지 40개의 핵염기, 14 내지 35개의 핵염기, 14 내지 30개의 핵염기, 14 내지 25개의 핵염기, 14 내지 20개의 핵염기, 15 내지 50개의 핵염기, 15 내지 40개의 핵염기, 15 내지 35개의 핵염기, 15 내지 30개의 핵염기, 15 내지 25개의 핵염기, 15 내지 20개의 핵염기, 20 내지 50개의 핵염기, 20 내지 40개의 핵염기, 20 내지 35개의 핵염기, 20 내지 30개의 핵염기, 20 내지 25개의 핵염기, 25 내지 50개의 핵염기, 25 내지 40개의 핵염기, 25 내지 35개의 핵염기, 또는 25 내지 30개의 핵염기 길이이다. 일부 실시양태에서, ASO는 18개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, ASO는 15개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, ASO는 25개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 상이한 화학을 갖지만 NIE 함유 프리-mRNA의 동일한 표적화된 부분에 상보적인 2개 이상의 ASO가 사용된다. 일부 실시양태에서, NIE 함유 프리-mRNA의 상이한 표적화된 부분에 상보적인 2개 이상의 ASO가 사용된다.
실시양태에서, 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 모이어티 또는 접합체, 예를 들어, 올리고뉴클레오티드의 활성 또는 세포 흡수를 향상시키는 표적화 모이어티 또는 다른 접합체에 화학적으로 연결된다. 이러한 모이어티는 지질 모이어티, 예를 들어 콜레스테롤 모이어티, 콜레스테릴 모이어티, 지방족 쇄, 예를 들어 도데칸디올 또는 운데실 잔기, 폴리아민 또는 폴리에틸렌 글리콜 쇄, 또는 아다만탄 아세트산을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 친유성 모이어티를 포함하는 올리고뉴클레오티드 및 제조 방법은 공개된 문헌에 기재되어 있다. 실시양태에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 무염기 뉴클레오티드, 폴리에테르, 폴리아민, 폴리아미드, 펩티드, 탄수화물, 예를 들어 N-아세틸갈락토사민(GalNAc), N-Ac-글루코사민(GluNAc), 또는 만노스(예를 들어, 만노스-6-포스페이트), 지질, 또는 다가 탄화수소 화합물을 포함하지만 이에 한정되지 않는 모이어티에 접합된다. 접합체는 당업계에서 이해되고 문헌에 기재된 바와 같이, 예를 들어 링커를 사용하여 당, 염기 또는 포스페이트 기 상의 여러 위치 중 임의의 위치에서 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함하는 임의의 뉴클레오티드 중 하나 이상에 연결될 수 있다. 링커는 2가 또는 3가의 분지형 링커를 포함할 수 있다. 실시양태에서, 접합체는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 부착된다. 올리고뉴클레오티드 접합체를 제조하는 방법은 예를 들어, 본원에 참고로 포함된 미국 특허 제8,450,467호, "Carbohydrate conjugates as delivery agents for oligonucleotides"에 설명되어 있다.
일부 실시양태에서, ASO에 의해 표적화되는 핵산은 진핵 세포와 같은 세포에서 발현된 SCN1A NIE 함유 프리-mRNA이다. 일부 실시양태에서, 용어 "세포"는 세포 집단을 지칭할 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포는 대상체에 있다. 일부 실시양태에서, 세포는 대상체로부터 단리된다. 일부 실시양태에서, 세포는 생체외 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 병태 또는 질환 관련 세포 또는 세포주이다. 일부 실시양태에서, 세포는 시험관 내 세포(예를 들어, 세포 배양물)이다.
약제학적 조성물
기재된 조성물의 제제, 예를 들어 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함하고 기재된 임의의 방법에 사용하기 위한 약제학적 조성물 또는 제형은 약제 산업에 널리 공지되어 있고 공개된 문헌에 설명된 통상적인 기술에 따라 제조될 수 있다. 실시양태에서, 대상체를 치료하기 위한 약제학적 조성물 또는 제형은 유효량의 본원에 기재된 바와 같은 임의의 안티센스 올리고머, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염, 용매화물, 수화물 또는 에스테르를 포함한다. 안티센스 올리고머를 포함하는 약제학적 제형은 약제학적으로 허용되는 부형제, 희석제 또는 담체를 추가로 포함할 수 있다.
약제학적으로 허용되는 염은 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응 등이 없이 인간 및 하등 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합하고, 합리적인 편익/위험 비에 상응한다(예를 들어, 이러한 목적을 위해 본원에 참고로 포함된 문헌[S. M. Berge, et al., J. Pharmaceutical Sciences, 66: 1-19 (1977)]을 참조할 수 있다). 염은 화합물의 최종 단리 및 정제 동안 원위치에서 제조될 수 있거나, 유리 염기 작용기를 적합한 유기산과 반응시킴으로서 별도로 제조될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 비독성 산부가 염의 예는 염산, 브롬화수소산, 인산, 황산 및 과염소산과 같은 무기산, 또는 아세트산, 옥살산, 말레산, 타르타르산, 시트르산, 숙신산 또는 말론 산과 같은 유기산과 함께 또는 이온 교환과 같은 다른 문서화된 방법을 사용함으로써 형성된 아미노기의 염이다. 다른 약제학적으로 허용되는 염은 아디페이트, 알기네이트, 아스코르베이트, 아스파테이트, 벤젠술포네이트, 벤조에이트, 바이(bi)술페이트, 보레이트, 부티레이트, 캄포레이트, 캄포술포네이트, 시트레이트, 사이클로펜탄프로피오네이트, 디글루코네이트, 도데실술페이트, 에탄술포네이트, 포르메이트, 푸마레이트, 글루코헵토 네이트, 글리세로포스페이트, 글루코네이트, 헤미술페이트, 헵타노에이트, 헥사노에이트, 하이드로요오다이드, 2-하이드록시-에탄술포네이트, 락토비오네이트, 락테이트, 라우레이트, 라우릴 술페이트, 말레이트, 말레에이트, 말로네이트, 메탄술포네이트, 2-나프탈렌술포네이트, 니코티네이트, 니트레이트, 올레에이트, 옥살레이트, 팔미테이트, 파모에이트, 펙티네이트, 퍼술페이트, 3-페닐프로피오네이트, 포스페이트, 피크레이트, 피발레이트, 프로피오네이트, 스테아레이트, 숙시네이트, 술페이트, 타르트레이트, 티오시아네이트, p-톨루엔술포네이트, 운데카노에이트, 발레레이트 염 등을 포함한다. 대표적인 알칼리 또는 알칼리 토금속 염은 나트륨, 리튬, 칼륨, 칼슘, 마그네슘 등을 포함한다. 추가의 약제학적으로 허용되는 염은, 적절한 경우, 할라이드, 하이드록시드, 카르복실레이트, 술페이트, 포스페이트, 니트레이트, 저급 알킬 술포네이트 및 아릴 술포네이트와 같은 카운터 이온을 사용하여 형성된 비독성 암모늄, 4차 암모늄 및 아민 양이온을 포함한다.
실시양태에서, 조성물은 정제, 캡슐, 겔 캡슐, 액상 시럽, 연질 겔, 좌제 및 관장제와 같지만 이에 한정되지 않는 가능한 많은 임의의 투여 형태로 제형화된다. 실시양태에서, 조성물은 수성, 비수성 또는 혼합 매질에서 현탁액으로서 제형화된다. 수성 현탁액은 예를 들어 소듐 카르복시메틸셀룰로스, 소르비톨 및/또는 덱스트란을 포함하여 현탁액의 점도를 증가시키는 물질을 추가로 함유할 수 있다. 현탁액은 또한 안정화제를 함유할 수 있다. 실시양태에서, 본 발명의 약제학적 제형 또는 조성물은 용액, 에멀젼, 마이크로에멀젼, 폼 또는 리포솜 함유 제형(예를 들어, 양이온성 또는 비양이온성 리포솜)을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
본원에 기재된 약제학적 조성물 또는 제형은 적절하고 당업자에게 널리 공지되거나 공개된 문헌에 기재된 하나 이상의 투과 증진제, 담체, 부형제 또는 다른 활성 또는 비활성 성분을 포함할 수 있다. 실시양태에서, 리포솜은 또한 입체적으로 안정화된 리포솜, 예를 들어 하나 이상의 특수화된 지질을 포함하는 리포솜을 포함한다. 이러한 특화된 지질은 순환 수명이 향상된 리포솜을 생성한다. 실시양태에서, 입체적으로 안정화된 리포솜은 하나 이상의 당지질을 포함하거나 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 모이어티와 같은 하나 이상의 친수성 중합체로 유도체화된다. 실시양태에서, 계면활성제가 약제학적 제형 또는 조성물에 포함된다. 의약품, 제형 및 에멀젼에서 계면활성제의 사용은 당업계에 널리 공지되어 있다. 실시양태에서, 본 발명은 안티센스 올리고뉴클레오티드의 효율적인 전달을 수행하기 위해, 예를 들어 세포막을 통한 확산을 보조하고/하거나 친유성 약물의 투과성을 향상시키기 위해 투과 증진제를 사용한다. 실시양태에서, 투과 증진제는 계면활성제, 지방산, 담즙산 염, 킬레이트제 또는 비킬레이트화 비-계면활성제이다.
실시양태에서, 약제학적 제형은 다수의 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 실시양태에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 다른 약물 또는 치료제와 병용하여 투여된다.
병용 요법
일부 실시양태에서, 본 개시내용에 개시된 ASO는 하나 이상의 추가 치료제와 병용하여 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 추가 치료제는 소분자를 포함할 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 추가 치료제는 WO2016128343A1, WO2017053982A1, WO2016196386A1, WO201428459A1, WO201524876A2, WO2013119916A2, 및 WO2014209841A2에 기재된 소분자를 포함할 수 있으며, 이들은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 추가 치료제는 인트론 유지를 교정하기 위해 사용될 수 있는 ASO를 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 다른 제제는 표 4에 열거된 ASO로부터 선택된다.
대상체의 치료
본원에 제공된 임의의 조성물은 개체에게 투여될 수 있다. "개체"는 "대상체" 또는 "환자"와 호환적으로 사용될 수 있다. 개체는 포유동물, 예를 들어 인간 또는 비인간 영장류, 설치류, 토끼, 래트, 마우스, 말, 당나귀, 염소, 고양이, 개, 소, 돼지 또는 양과 같은 동물일 수 있다. 실시양태에서, 개체는 인간이다. 실시양태에서, 개체는 태아, 배아, 또는 소아이다. 다른 실시양태에서, 개체는 식물과 같은 다른 진핵 유기체일 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 조성물은 생체외 세포에 투여된다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 조성물은 질환 또는 장애의 치료 방법으로서 개체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 개체는 본원에 기재된 임의의 질환과 같은 유전 질환을 갖는다. 일부 실시양태에서, 개체는 본원에 기재된 임의의 질환과 같은 질환을 가질 위험에 있다. 일부 실시양태에서, 개체는 단백질의 불충분한 양 또는 단백질의 불충분한 활성에 의해 유발된 질환 또는 장애를 가질 위험이 증가한다. 개체가 단백질의 불충분한 양 또는 단백질의 불충분한 활성에 의해 유발된 질환 또는 장애를 가질 "위험이 증가"한 경우, 방법은 방지적 또는 예방적 치료를 포함한다. 예를 들어, 개체는 질환의 가족력으로 인해 이러한 질환 또는 장애를 가질 위험이 증가할 수 있다. 전형적으로, 이러한 질환 또는 장애를 가질 위험이 증가한 개체는 예방적 치료(예를 들어, 질환 또는 장애의 발병 또는 진행을 방지하거나 지연시킴으로써)가 유익하다. 실시양태에서, 태아는 예를 들어 ASO 조성물을 태아에게 직접 또는 간접적으로(예를 들어, 모체를 통해) 투여함으로써 자궁 내에서 치료된다.
본 발명의 ASO의 투여에 적합한 경로는 ASO의 전달이 요망되는 세포 유형에 따라 달라질 수 있다. 다수의 조직 및 기관이 드라벳 증후군; 열성 발작 플러스를 동반하는 전신 뇌전증 2형; 가족성 열성 발작 3A; 가족성 편마비 편두통 3; 자폐증; 조기 유아 간질성 뇌병증 13; 동기능 부전 증후군　1; 알츠하이머병 또는 SUDEP에 의해 영향을 받는데, 뇌가 가장 크게 영향을 받는 조직이다. 본 발명의 ASO는 비경구로, 예를 들어 수막강내 주사, 뇌실내 주사, 복강내 주사, 근육내 주사, 피하 주사, 안내 주사 또는 정맥내 주사에 의해 환자에게 투여될 수 있다.
일부 실시양태에서, 질환 또는 병태는 Nav1.1(SCN1A 유전자에 의해 코딩된 단백질)의 돌연변이에 의해 유도된다. 일부 경우에, 돌연변이는 Nav1.1에서의 기능 상실 돌연변이이다. 일부 경우에, Nav1.1에서의 기능 상실 돌연변이는 Nav1.1에서의 기능을 야생형 Nav1.1에서의 기능에 비해 (예를 들어, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 그 이상) 감소시키거나 손상시키는 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 경우에, Nav1.1에서의 기능 상실 돌연변이는 질환 표현형을 초래하는 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 예시적인 기능 상실 돌연변이는 R859C, T875M, V1353L, I1656M, R1657C, A1685V, M1841T 및 R1916G를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
다른 경우에, 돌연변이는 Nav1.1에서의 기능 획득 돌연변이이다. 이러한 경우, 기능 획득 돌연변이는 Nav1.1의 활성화를 야생형 Nav1.1에서의 기능에 비해 (예를 들어, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 그 이상) 연장시키는 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 이러한 경우, Nav1.1에서의 기능 획득 돌연변이는 질환 표현형을 초래하는 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 예시적인 기능 획득 돌연변이는 D188V, W1204R, R1648H, 및 D1866Y를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
일부 실시양태에서, 질환 또는 병태는 뇌병증이다. 일부 경우에, 뇌병증은 Nav1.1에서의 기능 상실 돌연변이에 의해 유도된다.
일부 실시양태에서, 뇌병증은 간질성 뇌병증이다. 예시적인 간질성 뇌병증은 드라벳 증후군(DS)(유아기의 중증 근간대성 뇌전증 또는 SMEI로도 알려짐); 유아기의 중증 근간대성 뇌전증(SMEI)-경계(SMEB); 열성 발작(FS); 열성 발작 플러스를 동반하는 전신 뇌전증(GEFS+); 조기 유아 간질성 뇌병증 13; 잠재성 전신 뇌전증; 잠재성 국소 뇌전증; 근간대성 무정위 뇌전증; 레녹스-가스토 증후군; 웨스트 증후군; 특발성 경련; 조기 근간대성 뇌병증; 진행성 근간대성 뇌전증; 소아기 교대성 편마비; 미분류 간질성 뇌병증; 뇌전증에서의 돌연사(SUDEP); 조기 유아 SCN1A 뇌병증; 조기 유아 간질성 뇌병증(EIEE); 또는 동기능 부전 증후군 1을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 일부 실시양태에서, 질환 또는 병태는 임의로 드라벳 증후군(DS)(유아기의 중증 근간대성 뇌전증 또는 SMEI로도 알려짐); 유아기의 중증 근간대성 뇌전증(SMEI)-경계(SMEB); 열성 발작(FS); 열성 발작 플러스를 동반하는 전신 뇌전증(GEFS+); 조기 유아 간질성 뇌병증 13; 잠재성 전신 뇌전증; 잠재성 국소 뇌전증; 근간대성 무정위 뇌전증; 레녹스-가스토 증후군; 웨스트 증후군; 특발성 경련; 조기 근간대성 뇌병증; 진행성 근간대성 뇌전증; 소아기 교대성 편마비; 미분류 간질성 뇌병증; 뇌전증에서의 돌연사(SUDEP); 및 동기능 부전 증후군 1로부터 선택된 간질성 뇌병증이다.
일부 경우에, GEFS+는 열성 발작 플러스를 동반하는 전신 뇌전증 2형이다.
일부 경우에, 열성 발작은 가족성 열성 발작 3A이다.
일부 경우에, SMEB는 전신 극파가 없는 SMEB(SMEB-SW), 근간대성 발작이 없는 SMEB(SMEB-M), SMEI의 하나 초과의 특징이 결여된 SMEB(SMEB-O) 또는 전신 강직-간대성 발작을 동반한 난치성 소아기 뇌전증(ICEGTC)이다.
일부 실시양태에서, Nav1.1에서의 기능 상실 돌연변이에 의해 유발되는 질환 또는 병태는 드라벳 증후군(DS)(SMEI로도 알려짐); 유아기의 중증 근간대성 뇌전증(SMEI)-경계(SMEB); 열성 발작(FS); 열성 발작 플러스를 동반하는 전신 뇌전증(GEFS+); 조기 유아 간질성 뇌병증 13; 잠재성 전신 뇌전증; 잠재성 국소 뇌전증; 근간대성 무정위 뇌전증; 레녹스-가스토 증후군; 웨스트 증후군; 특발성 경련; 조기 근간대성 뇌병증; 진행성 근간대성 뇌전증; 소아기 교대성 편마비; 미분류 간질성 뇌병증; 뇌전증에서의 돌연사(SUDEP); 동기능 부전 증후군 1; 조기 유아 SCN1A 뇌병증; 조기 유아 간질성 뇌병증(EIEE); 자폐증; 또는 유아기의 악성 이동성 부분 발작을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
일부 실시양태에서, 질환 또는 병태는 Nav1.1에서의 기능 획득 돌연변이에 의해 유발된다. Nav1.1에서의 기능 획득 돌연변이와 관련된 예시적인 질환 또는 병태는 편두통을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 일부 경우에, Nav1.1에서의 기능 획득 돌연변이에 의해 유도되는 질환 또는 병태는 편두통이다.
일부 경우에, 편두통은 가족성 편마비 편두통 3이다.
일부 실시양태에서, 질환 또는 병태는 Nav1.1 유전성 뇌전증이다. Nav1.1 유전성 뇌전증은 Nav1.1에서의 기능 상실 돌연변이 또는 Nav1.1에서의 기능 획득 돌연변이를 포함할 수 있다. 일부 경우에, Nav1.1 유전성 뇌전증은 하나 이상의 유전 돌연변이를 포함한다. 다른 경우에, Nav1.1 유전성 뇌전증은 하나 이상의 드노보 돌연변이를 포함한다. 일부 경우에, Nav1.1 유전성 뇌전증은 드라벳 증후군(DS)(유아기의 중증 근간대성 뇌전증 또는 SMEI로도 알려짐); 유아기의 중증 근간대성 뇌전증(SMEI)-경계(SMEB); 열성 발작(FS); 열성 발작 플러스를 동반하는 전신 뇌전증(GEFS+); 조기 유아 간질성 뇌병증 13; 잠재성 전신 뇌전증; 잠재성 국소 뇌전증; 근간대성 무정위 뇌전증; 레녹스-가스토 증후군; 웨스트 증후군; 특발성 경련; 조기 근간대성 뇌병증; 진행성 근간대성 뇌전증; 소아기 교대성 편마비; 미분류 간질성 뇌병증; 조기 유아 SCN1A 뇌병증; 조기 유아 간질성 뇌병증(EIEE); 뇌전증에서의 돌연사(SUDEP); 또는 유아기의 악성 이동성 부분 발작을 포함한다. 일부 경우에, Nav1.1에서의 기능 상실 돌연변이와 관련된 Nav1.1 유전성 뇌전증은 드라벳 증후군(DS)(유아기의 중증 근간대성 뇌전증 또는 SMEI로도 알려짐); 유아기의 중증 근간대성 뇌전증(SMEI)-경계(SMEB); 열성 발작(FS); 열성 발작 플러스를 동반하는 전신 뇌전증(GEFS+); 조기 유아 간질성 뇌병증 13; 잠재성 전신 뇌전증; 잠재성 국소 뇌전증; 근간대성 무정위 뇌전증; 레녹스-가스토 증후군; 웨스트 증후군; 특발성 경련; 조기 근간대성 뇌병증; 진행성 근간대성 뇌전증; 소아기 교대성 편마비; 미분류 간질성 뇌병증; 조기 유아 SCN1A 뇌병증; 조기 유아 간질성 뇌병증(EIEE); 뇌전증에서의 돌연사(SUDEP); 유아기의 악성 이동성 부분 발작을 포함한다.
일부 실시양태에서, 질환 또는 병태는 SCN1A 유전자의 반가불충분성과 관련된다. SCN1A 유전자의 반가불충분성과 관련된 예시적인 질환 또는 병태는 드라벳 증후군(DS)(SMEI로도 알려짐); 유아기의 중증 근간대성 뇌전증(SMEI)-경계(SMEB); 열성 발작(FS); 열성 발작 플러스를 동반하는 전신 뇌전증(GEFS+); 조기 유아 간질성 뇌병증 13; 잠재성 전신 뇌전증; 잠재성 국소 뇌전증; 근간대성 무정위 뇌전증; 레녹스-가스토 증후군; 웨스트 증후군; 특발성 경련; 조기 근간대성 뇌병증; 진행성 근간대성 뇌전증; 소아기 교대성 편마비; 미분류 간질성 뇌병증; 뇌전증에서의 돌연사(SUDEP); 동기능 부전 증후군 1; 조기 유아 SCN1A 뇌병증; 조기 유아 간질성 뇌병증(EIEE); 또는 유아기의 악성 이동성 부분 발작을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 일부 경우에, 질환 또는 병태는 드라벳 증후군(DS)(SMEI로도 알려짐); 유아기의 중증 근간대성 뇌전증(SMEI)-경계(SMEB); 열성 발작(FS); 열성 발작 플러스를 동반하는 전신 뇌전증(GEFS+); 조기 유아 간질성 뇌병증 13; 잠재성 전신 뇌전증; 잠재성 국소 뇌전증; 근간대성 무정위 뇌전증; 레녹스-가스토 증후군; 웨스트 증후군; 특발성 경련; 조기 근간대성 뇌병증; 진행성 근간대성 뇌전증; 소아기 교대성 편마비; 미분류 간질성 뇌병증; 뇌전증에서의 돌연사(SUDEP); 동기능 부전 증후군 1; 조기 유아 SCN1A 뇌병증; 조기 유아 간질성 뇌병증(EIEE); 또는 유아기의 악성 이동성 부분 발작이다.
일부 경우에, 질환 또는 병태는 드라벳 증후군(DS)이다.
달리 유아기의 중증 근간대성 뇌전증(SMEI)으로도 알려진 드라벳 증후군(DS)은 생애 첫 해에 나타나는 간질성 뇌병증이다. 드라벳 증후군은 환자의 약 70 내지 80%에서 나트륨 통로 유전자 돌연변이의 발견에 의해 임상 진단이 뒷받침되는 간질성 뇌병증으로 점점 더 인식되고 있다. 이온 통로 유전자의 돌연변이는 다양한 뇌전증 증후군의 발병에 중요한 역할을 하여, 이온통로병증으로 간주되는 일부 뇌전증을 초래한다. 전압 개폐 나트륨 통로(VGSC)은 신경 흥분성에 필수적인 역할을 한다: 따라서, DS와 관련된 많은 돌연변이가 VGSC 서브유닛을 코딩하는 유전자에서 식별되었다는 것은 놀라운 일이 아니다. 상기 질환은 예를 들어, 문헌(Mulley, et al., 2005) 및 OMIM #607208(Online Mendelian Inheritance in Man, Johns Hopkins University, 1966-2015)의 질환 설명에 의해 설명되며, 둘 다 본원에 참고로 포함된다.
환자의 70% 내지 80%는 나트륨 통로 α1 서브유닛 유전자(SCN1A) 이상을 보유하고, 절두 돌연변이가 약 40%를 차지하며, 이른 나이의 발작 개시와 유의한 상관관계를 갖는다. 시퀀싱 돌연변이는 약 70%의 사례에서 발견되며, 절두(40%) 및 미스센스 돌연변이(40%)를 포함하며, 나머지는 스플라이스-부위 변화이다. 대부분의 돌연변이는 드노보이지만, 가족성 돌연변이가 5 내지 10%의 사례에서 발생하며 대개는 사실상 미스센스이다. 나머지 SCN1A 돌연변이는 스플라이스-부위 및 미스센스 돌연변이를 포함하며, 이들 대부분은 나트륨 통로의 세공-형성 영역에 속한다. 현재, 500개가 넘는 돌연변이가 DS와 관련되었고 유전자를 따라 무작위로 분포되어 있다(Mulley, et al., Neurol. 2006, 67, 1094-1095).
SCN1A 유전자는 인간 염색체 2q24 상의 나트륨 통로 유전자 클러스터에 위치하고 뉴런 전압 개폐 나트륨 통로의 Nav1.1로 알려진 α-세공 형성 서브유닛을 코딩한다. SCN1A 유전자는 대략 100 kb의 게놈 DNA에 걸쳐 있으며 26개의 엑손을 포함한다. SCN1A 단백질은 각각 6개의 막관통 세그먼트를 갖는 4개의 도메인으로 이루어진다. 엑손 11에서 도메인 1과 도메인 2 사이의 세포질 루프 내의 11개 아미노산의 존재 또는 부재 하에 상이한 길고 짧은 이소형을 생성하는 2종의 스플라이스 변이체가 식별되었다(Miller, et al., 1993-2015, and Mulley, et al., 2005, 25, 535-542, 본원에 참고로 포함됨).
SCN1A 유전자에서의 선택적 스플라이싱 이벤트는 비생산적 mRNA 전사체를 초래하여 결국 비정상적 단백질 발현으로 이어질 수 있으며, SCN1A 유전자에서의 선택적 스플라이싱 이벤트를 표적화할 수 있는 치료제는 DS 환자에서 기능성 단백질의 발현 수준을 조절하고/하거나 비정상적 단백질 발현을 억제할 수 있다. 이러한 치료제는 SCN1A 단백질 결핍에 의해 유발된 병태를 치료하는 데 사용될 수 있다.
비생산적인 mRNA 전사체를 초래할 수 있는 선택적 스플라이싱 이벤트 중 하나는 넌센스 매개 mRNA 붕괴를 유도할 수 있는 mRNA 전사체에 추가의 엑손을 포함시키는 것이다. 본 개시내용은 단백질을 코딩하는 성숙한 mRNA의 생성을 증가시켜 번역된 기능성 SCN1A 단백질을 증가시키기 위해 SCN1A의 선택적 스플라이싱을 조절하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 이들 조성물 및 방법은 엑손 스키핑을 유발하고 SCN1A 프리-mRNA의 구성적 스플라이싱을 촉진할 수 있는 안티센스 올리고머(ASO)를 포함한다. 다양한 실시양태에서, 본 개시내용의 방법을 사용하여 기능성 SCN1A 단백질을 증가시켜 SCN1A 단백질 결핍에 의해 유발된 병태를 치료할 수 있다.
일부 경우에, 질환 또는 병태는 SMEB이다.
일부 경우에, 질환 또는 병태는 GEFS+이다.
일부 경우에, 질환 또는 병태는 열성 발작(예를 들어, 가족성 열성 발작 3A)이다.
일부 경우에, 질환 또는 병태는 자폐증(자폐 스펙트럼 장애 또는 ASD로도 알려짐)이다.
일부 경우에, 질환 또는 병태는 편두통(예를 들어, 가족성 편마비 편두통 3)이다.
일부 경우에, 질환 또는 병태는 알츠하이머병이다.
일부 실시양태에서, 질환 또는 병태는 SCN2A 뇌병증이다.
일부 실시양태에서, 질환 또는 병태는 SCN8A 뇌병증이다.
일부 실시양태에서, 질환 또는 병태는 SCN5A 부정맥이다.
실시양태에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 혈뇌 장벽을 통한 본 안티센스 올리고뉴클레오티드의 투과를 촉진할 수 있는 하나 이상의 제제와 함께 투여된다. 예를 들어, 근육 조직에서 운동 뉴런으로 아데노 바이러스 벡터의 투여에 의한 제제의 전달은 본원에 참고로 포함된 미국 특허 제6,632,427호, "Adenoviral-vector-mediated gene transfer into medullary motor neurons"에 설명되어 있다. 뇌, 예를 들어 선조, 시상, 해마 또는 흑질로 직접적인 벡터의 전달은 예를 들어 본원에 참고로 포함된 미국 특허 제6,756,523호, "Adenovirus vectors for the transfer of foreign genes into cells of the central nervous system particularly in brain"에 설명되어 있다.
실시양태에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 바람직한 약제학적 또는 약력 학적 특성을 제공하는 제제와 연결되거나 접합된다. 실시양태에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 혈뇌 장벽를 통한 투과 또는 수송을 촉진하기 위해 당업계에 공지된 물질, 예를 들어 트랜스페린 수용체에 대한 항체에 커플링된다. 실시양태에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 바이러스 벡터와 연결되어, 예를 들어 안티센스 화합물을 더 효과적으로 만들거나 혈뇌 장벽을 통한 수송을 증가시킨다. 실시양태에서, 삼투성 혈뇌 장벽 파괴는 당, 예를 들어 메조 에리트리톨, 자일리톨, D(+) 갈락토오스, D(+) 락토오스, D(+) 자일로스, 둘시톨, 미오-이노시톨, L(-) 프룩토오스, D(-) 만니톨, D(+) 글루코오스, D(+) 아라비노스, D(-) 아라비노오스, 셀로비오스, D(+) 말토오스, D(+) 라피노스, L(+) 람노오스, D(+) 멜리비오스, D(-) 리보오스, 아도니톨, D(+) 아라비톨, L(-) 아라비톨, D(+) 푸코오스, L(-) 푸코오스, D(-) 릭소오스, L(+) 릭소오스, 및 L(-) 릭소오스, 또는 아미노산, 예를 들어 글루타민, 리신, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 티로신, 발린 및 타우린의 주입에 의해 보조받는다. 혈뇌 장벽 투과를 향상시키기 위한 방법 및 물질은 예를 들어 미국 특허 제9,193,969호, "Compositions and methods for selective delivery of oligonucleotide molecules to specific neuron types", 미국 특허 제4,866,042호, "Method for the delivery of genetic material across the blood brain barrier", 미국 특허 제6,294,520호, "Material for passage through the blood-brain barrier" 및 미국 특허 제6,936,589호, "Parenteral delivery systems"에 설명되어 있으며, 이들 각각은 본원에 참고로 포함된다.
실시양태에서, 본 발명의 ASO는 예를 들어 본원에 참고로 포함된 미국 특허 제9,193,969호에 기재된 방법을 사용하여 도파민 재흡수 억제제(DRI), 선택적 세로토닌 재흡수 억제제(SSRI), 노르아드레날린 재흡수 억제제(NRI), 노르에피네프린-도파민 재흡수 억제제(NDRI), 및 세로토닌-노르에피네프린-도파민 재흡수 억제제(SNDRI)에 커플링된다.
실시양태에서, 방법 및 조성물을 사용하여 치료된 대상체는 당업계에 공지되고 설명된 임의의 방법을 사용하여 병태의 개선에 대해 평가된다.
엑손 스키핑을 유도하는 추가 ASO의 식별 방법
SCN1A NIE 함유 프리-mRNA의 엑손 스키핑을 유도하는 ASO를 식별 또는 결정하기 위한 방법도 본 발명의 범위 내에 있다. 예를 들어, 방법은 SCN1A NIE 함유 프리-mRNA의 가성-엑손 스키핑을 유도하는 ASO를 식별 또는 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 프리-mRNA의 표적 영역 내의 상이한 뉴클레오티드에 특이적으로 혼성화하는 ASO를 스크리닝하여 표적 인트론의 스플라이싱 속도 및/또는 정도를 개선시키는 ASO를 식별 또는 결정할 수 있다. 일부 실시 형태에서, ASO는 스플라이싱 리프레서(들)/사일런서의 결합 부위(들)를 차단하거나 방해할 수 있다. 엑손의 표적 영역에 혼성화될 때 원하는 효과(예를 들어, 가성-엑손 스키핑, 단백질 또는 기능성 RNA 생성)를 초래하는 ASO를 식별(결정)하기 위해 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용할 수 있다. 또한, 포함된 엑손의 측면에 위치한 인트론 또는 포함되지 않은 엑손 내의 표적화된 영역에 결합함으로써 포함된 엑손의 엑손 스키핑를 유도하는 ASO를 식별하기 위해 이들 방법을 사용할 수 있다. 사용할 수 있는 방법의 예는 하기에 제공된다.
프리-mRNA의 표적 영역에 혼성화하도록 설계된 ASO를 사용하여 ASO "워크"로 지칭되는 한 라운드의 스크리닝이 수행될 수 있다. 예를 들어, ASO 워크에 사용된 ASO는 포함된 엑손의 3' 스플라이스 부위의 상류 대략 100개 뉴클레오티드(예를 들어, 표적/포함된 엑손의 상류에 위치한 엑손 서열의 일부분)부터 표적/포함된 엑손의 3' 스플라이스 부위의 하류 약 100개 뉴클레오티드까지 및/또는 포함된 엑손의 5' 스플라이스 부위의 상류 약 100개 뉴클레오티드부터 표적/포함된 엑손의 5' 스플라이스 부위의 하류 약 100개 뉴클레오티드(예를 들어, 표적/포함된 엑손의 하류에 위치한 엑손의 서열의 일부분)까지 5개 뉴클레오티드마다 타일링될 수 있다. 예를 들어, 15개 뉴클레오티드 길이의 제1 ASO는 표적/포함된 엑손의 3' 스플라이스 부위에 대해 뉴클레오티드 +6 내지 +20에 특이적으로 혼성화하도록 설계될 수 있다. 제2 ASO는 표적/포함된 엑손의 3'스플라이스 부위에 대해 뉴클레오티드 +11 내지 +25에 특이적으로 혼성화하도록 설계될 수 있다. ASO는 프리-mRNA의 표적 영역에 이렇게 걸쳐있는 것으로 설계된다. 실시양태에서, ASO는 예를 들어 1, 2, 3 또는 4개 뉴클레오티드마다 더 가까이 타일링될 수 있다. 또한, ASO는 5' 스플라이스 부위의 하류 100개 뉴클레오티드부터 3' 스플라이스 부위의 상류 100개 뉴클레오티드까지 타일링될 수 있다. 일부 실시양태에서, ASO는 3' 스플라이스 부위의 상류 약 1,160개 뉴클레오티드부터 5'스플라이스 부위의 하류 약 500개 뉴클레오티드까지 타일링될 수 있다. 일부 실시양태에서, ASO는 3' 스플라이스 부위의 상류 약 500개 뉴클레오티드부터 3' 스플라이스 부위의 하류 약 1,920개 뉴클레오티드까지 타일링될 수 있다.
하나 이상의 ASO, 또는 대조군 ASO(표적 영역에 혼성화하지 않을 것으로 예상되는 서열인 스크램블된 서열을 갖는 ASO)는, 예를 들어 형질감염에 의해, 표적 프리-mRNA(예를 들어, 본원에 기재된 NIE 함유 프리-mRNA)을 발현하는 질환 관련 세포주 내로 전달된다. 각각의 ASO의 엑손 스키핑 효과는 당업계에 공지된 임의의 방법, 예를 들어 실시예 4에 기재된 바와 같이 스플라이스 접합부에 걸쳐있는 프라이머를 사용하는 역전사 효소(RT)-PCR에 의해 평가될 수 있다. 대조군 ASO 처리된 세포와 비교하여 ASO 처리된 세포에서 포함된 엑손(예를 들어, NIE의 측면 엑손 포함)을 함유하는 영역에 걸친 프라이머를 사용하여 생성된 더 긴 RT-PCR 생성물의 감소 또는 부재는 표적 NIE의 스플라이싱이 향상되었음을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 엑손 스키핑 효율(또는 NIE를 함유하는 인트론을 스플라이싱하는 스플라이싱 효율), 스플라이싱된 프리-mRNA 대 스플라이싱되지 않은 프리-mRNA의 비, 스플라이싱 속도 또는 스플라이싱 정도는 본원에 기재된 ASO를 사용하여 개선될 수 있다. 또한, 표적 프리-mRNA에 의해 코딩되는 단백질 또는 기능성 RNA의 양을 평가하여 각각의 ASO가 원하는 효과(예를 들어, 기능성 단백질 생산의 향상)를 달성했는지 여부를 결정할 수 있다. 웨스턴 블롯팅, 유세포 분석, 면역형광 현미경법 및 ELISA와 같은 당업계에 공지된 단백질 생산을 평가 및/또는 정량화하기 위한 임의의 방법이 이용될 수 있다.
프리-mRNA의 표적 영역에 혼성화하도록 설계된 ASO를 사용하여 ASO "마이크로-워크"라 지칭되는 제2 라운드의 스크리닝을 수행할 수 있다. ASO 마이크로-워크에 사용된 ASO를 1개의 뉴클레오티드마다 타일링하여 ASO와 혼성화될 때 엑손 스키핑(또는 NIE의 향상된 스플라이싱)을 초래하는 프리-mRNA의 뉴클레오티드 서열을 추가로 정제(refine)한다.
표적 인트론의 스플라이싱을 촉진하는 ASO에 의해 정의된 영역은 1-nt 스텝 간격의 ASO뿐만 아니라 더 긴 ASO, 전형적으로 18 내지 25 nt를 포함하는 ASO "마이크로-워크"에 의해 더 상세하게 탐색된다.
상기 ASO 워크에 대해 설명된 바와 같이, 하나 이상의 ASO 또는 대조군 ASO(표적 영역에 혼성화할 것으로 예상되지 않는 서열인 스크램블된 서열을 갖는 ASO)를, 예를 들어 형질감염에 의해, 표적 프리-mRNA를 발현하는 질환 관련 세포주 내로 전달하여 ASO 마이크로-워크를 수행한다. 각각의 ASO의 스플라이싱 유도 효과는 당업계에 공지된 임의의 방법, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같이 NIE에 걸친 프라이머를 사용하는 역전사 효소(RT)-PCR에 의해 평가될 수 있다(예를 들어, 실시예 4 참조). 대조군 ASO 처리된 세포와 비교하여 ASO 처리된 세포에서 NIE에 걸친 프라이머를 사용하여 생성된 더 긴 RT-PCR 생성물의 감소 또는 부재는 엑손 스키핑(또는 NIE를 함유하는 표적 인트론의 스플라이싱)이 향상되었음을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 엑손 스키핑 효율(또는 NIE를 함유하는 인트론을 스플라이싱하는 스플라이싱 효율), 스플라이싱된 프리-mRNA 대 스플라이싱되지 않은 프리-mRNA의 비, 스플라이싱 속도 또는 스플라이싱 정도는 본원에 기재된 ASO를 사용하여 개선될 수 있다. 또한, 표적 프리-mRNA에 의해 코딩되는 단백질 또는 기능성 RNA의 양을 평가하여 각각의 ASO가 원하는 효과(예를 들어, 기능성 단백질 생산의 향상)를 달성했는지 여부를 결정할 수 있다. 웨스턴 블롯팅, 유세포 분석, 면역형광 현미경법 및 ELISA와 같은 당업계에 공지된 단백질 생산을 평가 및/또는 정량화하기 위한 임의의 방법이 이용될 수 있다.
프리-mRNA의 영역에 혼성화될 때 엑손 스키핑(또는 NIE를 함유하는 인트론의 스플라이싱 향상) 및 단백질 생산 증가를 초래하는 ASO는 동물 모델, 예를 들어 전장 인간 유전자가 녹인된 트랜스제닉 마우스 모델을 사용하여 또는 질환의 인간화된 마우스 모델에서 생체내에서 시험될 수 있다. ASO의 적절한 투여 경로는 질환 및/또는 ASO의 전달이 요망되는 세포 유형에 따라 달라질 수 있다. ASO는 예를 들어 수막강내 주사, 뇌실내 주사, 복강내 주사, 근육내 주사, 피하 주사, 안내 주사 또는 정맥내 주사에 의해 투여될 수 있다. 투여 후, 모델 동물의 세포, 조직 및/또는 기관은 예를 들어 당업계에 공지되고 본원에 기재된 방법에 의해 스플라이싱(효율, 속도, 정도) 및 단백질 생산을 평가함으로써 ASO 처리의 효과를 결정하기 위해 평가될 수 있다. 동물 모델은 또한 질환 또는 질환 중증도의 임의의 표현형 또는 행동 지표일 수 있다.
본원에서 다양한 예로 설명된 바와 같이, 인간 SCN1A 유전자의 엑손 20x는 마우스 SCN1A 유전자의 엑손 21x와 동등하다.
NMD 억제제, 예를 들어 사이클로헥시미드의 존재 하에 NMD 유도 엑손을 식별 또는 검증하는 방법도 본 발명의 범위 내에 있다. 예시적인 방법은 도 3 및 실시예 2에 제공된다.
구체적인 실시양태
실시양태 1. SCN1A 단백질을 코딩하고 넌센스 매개 RNA 붕괴 유도 엑손을 함유하는 mRNA(NMD 엑손 mRNA)를 갖는 세포에서 SCN1A 단백질의 발현을 조절하는 방법으로서, 치료제를 세포에 접촉시키는 단계를 포함하고, 이에 의해 치료제는 SCN1A 단백질을 코딩하는 NMD 엑손 mRNA로부터 NMD 엑손의 스플라이싱을 조절하며, 이로써 세포에서 SCN1A 단백질을 코딩하는 프로세싱된 mRNA의 수준을 조절하고 SCN1A 단백질의 발현을 조절하며, 여기서 치료제는 SCN1A를 코딩하는 NMD 엑손 mRNA의 표적화된 부분에 결합하고, 표적화된 부분은 NMD 유도 엑손(NIE)의 5' 말단로부터의 상류 약 1000개 뉴클레오티드 내지 NIE의 5' 말단으로부터의 상류 약 100개 뉴클레오티드; 또는 NIE의 3' 말단의 하류 약 100개 뉴클레오티드 내지 NIE의 3' 말단의 하류 약 1000개 뉴클레오티드인 방법.
실시양태 2. 질환 또는 병태의 치료를 필요로 하는 대상체의 세포에서 SCN1A 단백질의 발현을 조절함으로써 대상체에서 질환 또는 병태를 치료하는 방법으로서, 대상체의 세포를 넌센스 매개 mRNA 붕괴 유도 엑손(NMD 엑손)을 함유하고 SCN1A를 코딩하는 세포에서의 mRNA로부터 NMD 엑손의 스플라이싱을 조절하는 치료제와 접촉시키는 단계를 포함하고, 이로써 대상체의 세포에서 SCN1A 단백질을 코딩하는 프로세싱된 mRNA의 수준을 조절하고 SCN1A 단백질의 발현을 조절하고, 여기서 치료제는 SCN1A를 코딩하는 NMD 엑손 mRNA의 표적화된 부분에 결합하고, 표적화된 부분은 NMD 유도 엑손(NIE)의 5' 말단로부터의 상류 약 1000개 뉴클레오티드 내지 NIE의 5' 말단으로부터의 상류 약 100개 뉴클레오티드; 또는 NIE의 3' 말단의 하류 약 100개 뉴클레오티드 내지 NIE의 3' 말단의 하류 약 1000개 뉴클레오티드인 방법.
실시양태 3. 실시양태 1 또는 2에 있어서, 치료제는 표적화된 부분의 영역으로부터 NMD 엑손의 스플라이싱에 관여하는 인자의 결합을 방해하는 것인 방법.
실시양태 4. 실시양태 1 또는 2에 있어서, 표적화된 부분은 NIE의 5' 말단의 상류 최대 약 800개 뉴클레오티드, 약 700개 뉴클레오티드, 약 600개 뉴클레오티드, 약 500개 뉴클레오티드, 약 400개 뉴클레오티드, 약 300개 뉴클레오티드, 약 200개 뉴클레오티드, 약 100개 뉴클레오티드, 약 80개 뉴클레오티드, 약 70개 뉴클레오티드, 약 60개 뉴클레오티드, 약 50개 뉴클레오티드인 방법.
실시양태 5. 실시양태 1 또는 2에 있어서, 표적화된 부분은 NIE의 5' 말단의 상류 적어도 약 800개 뉴클레오티드, 약 700개 뉴클레오티드, 약 600개 뉴클레오티드, 약 500개 뉴클레오티드, 약 400개 뉴클레오티드, 약 300개 뉴클레오티드, 약 200개 뉴클레오티드, 약 100개 뉴클레오티드, 약 80개 뉴클레오티드, 약 70개 뉴클레오티드, 약 60개 뉴클레오티드, 약 50개 뉴클레오티드, 약 40개 뉴클레오티드, 약 30개 뉴클레오티드, 약 20개 뉴클레오티드, 약 10개 뉴클레오티드, 약 5개 뉴클레오티드, 약 4개 뉴클레오티드, 약 2개 뉴클레오티드, 약 1개 뉴클레오티드인 방법.
실시양태 6. 실시양태 1 또는 2에 있어서, 표적화된 부분은 NIE의 3' 말단의 하류 최대 약 800개 뉴클레오티드, 약 700개 뉴클레오티드, 약 600개 뉴클레오티드, 약 500개 뉴클레오티드, 약 400개 뉴클레오티드, 약 300개 뉴클레오티드, 약 200개 뉴클레오티드, 약 100개 뉴클레오티드, 약 80개 뉴클레오티드, 약 70개 뉴클레오티드, 약 60개 뉴클레오티드, 약 50개 뉴클레오티드인 방법.
실시양태 7. 실시양태 1 또는 2에 있어서, 표적화된 부분은 NIE의 3' 말단의 하류 적어도 약 800개 뉴클레오티드, 약 700개 뉴클레오티드, 약 600개 뉴클레오티드, 약 500개 뉴클레오티드, 약 400개 뉴클레오티드, 약 300개 뉴클레오티드, 약 200개 뉴클레오티드, 약 100개 뉴클레오티드, 약 80개 뉴클레오티드, 약 70개 뉴클레오티드, 약 60개 뉴클레오티드, 약 50개 뉴클레오티드, 약 40개 뉴클레오티드, 약 30개 뉴클레오티드, 약 20개 뉴클레오티드, 약 10개 뉴클레오티드, 약 5개 뉴클레오티드, 약 4개 뉴클레오티드, 약 2개 뉴클레오티드, 약 1개 뉴클레오티드인 방법.
실시양태 8. 실시양태 1 내지 7 중 어느 하나에 있어서, 치료제는 안티센스 올리고머(ASO)인 방법.
실시양태 9. 실시양태 8에 있어서, ASO는 서열번호 12 내지 731 중 어느 하나와 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 97% 또는 100% 동일성인 서열을 포함하는 것인 방법.
실시양태 10. 실시양태 1 내지 9 중 어느 하나에 있어서, 치료제는 SCN1A 단백질을 코딩하는 프로세싱된 mRNA로부터 NMD 엑손의 배제를 촉진하는 것인 방법.
실시양태 11. 실시양태 10에 있어서, 치료제와 접촉된 세포에서 SCN1A 단백질을 코딩하는 프로세싱된 mRNA로부터 NMD 엑손의 배제는 대조군 세포에서 SCN1A 단백질을 코딩하는 프로세싱된 mRNA로부터 NMD 엑손의 배제와 비교하여 약 1.1 내지 약 10배, 약 1.5 내지 약 10배, 약 2 내지 약 10배, 약 3 내지 약 10배, 약 4 내지 약 10배, 약 1.1 내지 약 5배, 약 1.1 내지 약 6배, 약 1.1 내지 약 7배, 약 1.1 내지 약 8배, 약 1.1 내지 약 9배, 약 2 내지 약 5배, 약 2 내지 약 6배, 약 2 내지 약 7배, 약 2 내지 약 8배, 약 2 내지 약 9배, 약 3 내지 약 6배, 약 3 내지 약 7배, 약 3 내지 약 8배, 약 3 내지 약 9배, 약 4 내지 약 7배, 약 4 내지 약 8배, 약 4 내지 약 9배, 적어도 약 1.1배, 적어도 약 1.5배, 적어도 약 2배, 적어도 약 2.5배, 적어도 약 3배, 적어도 약 3.5배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배 또는 적어도 약 10배 증가되는 것인 방법.
실시양태 12. 실시양태 10에 있어서, 치료제는 세포에서 SCN1A 단백질을 코딩하는 프로세싱된 mRNA의 수준을 증가시키는 것인 방법.
실시양태 13. 실시양태 10에 있어서, 치료제와 접촉된 세포에서 SCN1A 단백질을 코딩하는 프로세싱된 mRNA의 양은 대조군 세포에서 SCN1A 단백질을 코딩하는 프로세싱된 mRNA의 총량과 비교하여 약 1.1 내지 약 10배, 약 1.5 내지 약 10배, 약 2 내지 약 10배, 약 3 내지 약 10배, 약 4 내지 약 10배, 약 1.1 내지 약 5배, 약 1.1 내지 약 6배, 약 1.1 내지 약 7배, 약 1.1 내지 약 8배, 약 1.1 내지 약 9배, 약 2 내지 약 5배, 약 2 내지 약 6배, 약 2 내지 약 7배, 약 2 내지 약 8배, 약 2 내지 약 9배, 약 3 내지 약 6배, 약 3 내지 약 7배, 약 3 내지 약 8배, 약 3 내지 약 9배, 약 4 내지 약 7배, 약 4 내지 약 8배, 약 4 내지 약 9배, 적어도 약 1.1배, 적어도 약 1.5배, 적어도 약 2배, 적어도 약 2.5배, 적어도 약 3배, 적어도 약 3.5배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배 또는 적어도 약 10배 증가되는 것인 방법.
실시양태 14. 실시양태 2에 있어서, 질환 또는 병태는 Nav1.1에서의 기능 상실 돌연변이에 의해 유도되는 것인 방법.
실시양태 15. 실시양태 14에 있어서, 질환 또는 병태는 SCN1A 유전자의 반가불충분성과 관련되며, 대상체는 기능성 SCN1A를 코딩하는 제1 대립유전자, 및 SCN1A가 생성되지 않거나 감소된 수준으로 생성되는 제2 대립유전자 또는 비기능성 SCN1A 또는 부분 기능성 SCN1A를 코딩하는 제2 대립유전자를 갖는 것인 방법.
실시양태 16. 실시양태 14에 있어서, 질환 또는 병태는 뇌병증인 방법.
실시양태 17. 실시양태 16에 있어서, 뇌병증은 간질성 뇌병증인 방법.
실시양태 18. 실시양태 14에 있어서, 질환 또는 병태는 드라벳 증후군(DS); 유아기의 중증 근간대성 뇌전증(SMEI)-경계(SMEB); 열성 발작(FS); 열성 발작 플러스를 동반하는 전신 뇌전증(GEFS+); 조기 유아 간질성 뇌병증 13; 잠재성 전신 뇌전증; 잠재성 국소 뇌전증; 근간대성 무정위 뇌전증; 레녹스-가스토 증후군; 웨스트 증후군; 특발성 경련; 조기 근간대성 뇌병증; 진행성 근간대성 뇌전증; 소아기 교대성 편마비; 미분류 간질성 뇌병증; 뇌전증에서의 돌연사(SUDEP); 동기능 부전 증후군 1; 자폐증; 또는 유아기의 악성 이동성 부분 발작인 방법.
실시양태 19. 실시양태 18에 있어서, GEFS+는 열성 발작 플러스를 동반하는 전신 뇌전증 2형인 방법.
실시양태 20. 실시양태 18에 있어서, 열성 발작은 가족성 열성 발작 3A인 방법.
실시양태 21. 실시양태 18에 있어서, SMEB는 전신 극파가 없는 SMEB(SMEB-SW), 근간대성 발작이 없는 SMEB(SMEB-M), SMEI의 하나 초과의 특징이 결여된 SMEB(SMEB-O) 또는 전신 강직-간대성 발작을 동반한 난치성 소아기 뇌전증(ICEGTC)인 방법.
실시양태 22. 실시양태 1 또는 2에 있어서, ASO는 서열번호 72 또는 432로부터 선택된 서열로 이루어진 것인 방법.
실시양태 23. 실시양태 1 또는 2에 있어서, ASO는 서열번호 73 또는 433으로부터 선택된 서열로 이루어진 것인 방법.
실시양태 24. 실시양태 1 또는 2에 있어서, ASO는 서열번호 76 또는 436으로부터 선택된 서열로 이루어진 것인 방법.
실시양태 25. 실시양태 1 또는 2에 있어서, ASO는 서열번호 181 또는 541로부터 선택된 서열로 이루어진 것인 방법.
실시양태 26. 실시양태 1 또는 2에 있어서, ASO는 서열번호 220 또는 580으로부터 선택된 서열로 이루어진 것인 방법.
실시양태 27. SCN1A 단백질을 코딩하고 넌센스 매개 RNA 붕괴 유도 엑손을 함유하는 mRNA(NMD 엑손 mRNA)를 갖는 세포에서 SCN1A 단백질의 발현을 조절하는 방법으로서, 치료제를 세포에 접촉시키는 단계를 포함하고, 이에 의해 치료제는 SCN1A 단백질을 코딩하는 NMD 엑손 mRNA로부터 NMD 엑손의 스플라이싱을 조절하며, 이로써 세포에서 SCN1A 단백질을 코딩하는 프로세싱된 mRNA의 수준을 조절하고 SCN1A 단백질의 발현을 조절하며, 여기서 치료제는 SCN1A를 코딩하는 NMD 엑손 mRNA의 표적화된 부분에 결합하고, 표적화된 부분은 NMD 유도 엑손(NIE)의 5' 말단으로부터의 상류 약 1000개 뉴클레오티드 내지 NIE의 3' 말단의 하류 약 1000개 뉴클레오티드인 방법.
실시양태 28. 질환 또는 병태의 치료를 필요로 하는 대상체의 세포에서 SCN1A 단백질의 발현을 조절함으로써 대상체에서 질환 또는 병태를 치료하는 방법으로서, 대상체의 세포를 넌센스 매개 mRNA 붕괴 유도 엑손(NMD 엑손)을 함유하고 SCN1A를 코딩하는 세포에서의 mRNA로부터 NMD 엑손의 스플라이싱을 조절하는 치료제와 접촉시키는 단계를 포함하며, 이로써 대상체의 세포에서 SCN1A 단백질을 코딩하는 프로세싱된 mRNA의 수준을 조절하고 SCN1A 단백질의 발현을 조절하며, 여기서 치료제는 SCN1A를 코딩하는 NMD 엑손 mRNA의 표적화된 부분에 결합하고, 표적화된 부분은 NMD 유도 엑손(NIE)의 5' 말단으로부터의 상류 약 1000개 뉴클레오티드 내지 NIE의 3' 말단의 하류 약 1000개 뉴클레오티드인 방법.
실시양태 29. 서열번호 12 내지 731 중 어느 하나와 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 97% 또는 100% 동일성인 서열을 포함하는 안티센스 올리고머(ASO).
실시양태 30. 서열번호 12 내지 731로부터 선택된 서열로 이루어진 안티센스 올리고머(ASO).
실시양태 31. 질환 또는 병태의 치료를 필요로 하는 대상체의 세포에서 SCN1A 단백질의 발현을 조절함으로써 대상체에서 질환 또는 병태를 치료하는 방법으로서, 대상체의 세포를 실시양태 29 또는 실시양태 30의 ASO와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
실시양태 32. 실시양태 29 또는 실시양태 30의 ASO를 포함하는 키트.
본 발명의 바람직한 실시양태가 본원에 제시되고 설명되었지만, 이러한 실시양태가 단지 예로서 제공된다는 것은 당업자에게 자명할 것이다. 당업자는 본 발명을 벗어나지 않으면서 다수의 변형, 변경 및 치환을 생각해 낼 것이다. 본원에 설명된 본 발명의 실시양태에 대한 다양한 대안이 본 발명을 실시하는 데 사용될 수 있음을 이해해야 한다. 다음의 청구범위는 본 발명의 범위를 정의하고 이들 청구범위 내의 방법 및 구조 및 이들의 등가물이 이에 의해 포함되는 것으로 의도된다.
실시예
본 발명은 다음의 실시예에 의해 더 구체적으로 설명될 것이다. 그러나, 본 발명은 이들 실시예에 의해 어떠한 방식으로도 제한되지 않음을 이해해야 한다.
실시예 1: 차세대 시퀀싱을 사용한 RNAseq에 의한 SCN1A 전사체에서의 NMD 유도 엑손 포함 이벤트의 식별
SCN1A 유전자에 의해 생성된 전사체의 스냅샷을 밝혀 NIE 포함 이벤트를 식별하기 위해 차세대 시퀀싱을 사용하여 전체 트랜스크립톰 샷건 시퀀싱을 수행하였다. 이를 위해, HCN(인간 피질 뉴런)의 핵 및 세포질 분획으로부터 폴리A+ RNA를 단리하고 일루미나(Illumina)의 TruSeq 스트랜디드 mRNA 라이브러리 프렙 키트(TruSeq Stranded mRNA library Prep Kit)를 사용하여 cDNA 라이브러리를 작제하였다. 라이브러리를 페어-엔드(pair-end) 시퀀싱하여 인간 게놈에 맵핑되는 100개 뉴클레오티드 리드(read)를 생성하였다(2009년 2월, GRCh37/hg19 조립체). SCN1A의 시퀀싱 결과는 도 2에 나타낸다. 간략하게, 도 2는 UCSC 게놈 브라우저(UCSC 인포매틱스 그룹(UCSC Genome Informatics Group, 캘리포니아 대학교, 산타 크루즈(미국 캘리포니아주 95064 산타 크루즈 하이 스트리트 1156) 바이오 분자 과학 및 공학 센터(Center for Biomolecular Science & Engineering))에 의해 운영되고 예를 들어, 문헌[Rosenbloom, et al., 2015, "The UCSC Genome Browser database: 2015 update," Nucleic Acids Research 43, Database Issue, doi: 10.1093/nar/gku1177]에 의해 설명됨)를 사용하여 시각화된 맵핑된 리드를 나타내며 리드의 커버리지(coverage) 및 수는 피크 신호에 의해 추론될 수 있다. 피크의 높이는 특정 영역 내의 리드의 밀도로 주어진 발현 수준을 나타낸다. 상단 패널은 스케일링할 SCN1A 유전자의 도식적 표현을 나타낸다. 100종의 척추동물 종에 걸친 보존 수준을 피크로서 나타낸다. 가장 높은 피크는 엑손(검은 박스)에 상응하는 한편, 대부분의 인트론(화살표가 있는 선)에는 피크가 관찰되지 않는다. 중간 패널에 나타낸 인트론 20(NM_006920)에서 보존 피크가 식별되었다. 보존된 서열을 검사하여 3' 및 5' 스플라이스 부위(밑줄 친 서열)의 측면에 위치한 64 bp의 엑손 유사 서열(하단 패널, 회색으로 강조된 서열)을 식별하였다. 이러한 엑손의 포함은 프레임시프트 및 엑손 21 내의 조기 종결 코돈의 도입을 초래하여 전사체를 NMD의 표적으로 만든다.
예시적인 SCN1A 유전자, 프리-mRNA, 엑손 및 인트론 서열은 표 1에 요약한다. 각 엑손 또는 인트론에 대한 서열은 표 2에 요약한다.
Figure pct00001
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Figure pct00003
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실시예 2: 사이클로헥시미드 처리를 통한 NIE의 확인
DMSO 처리된(CHX-) 또는 사이클로헥시미드 처리된(CHX+) 마우스 Neuro 2A 세포(도 3a) 및 RenCell VM(인간 신경 전구 세포)(도 3b)의 세포질 RNA 및 엑손 20 및 엑손 23 내의 프라이머를 사용한 RT-PCR 분석으로 NMD 유도 엑손(20x)에 상응하는 밴드의 존재를 확인하였다. 생성물의 동일성은 시퀀싱에 의해 확인하였다. 밴드의 밀도측정 분석을 수행하여 총 SCN1A 전사체의 엑손 20x 포함 퍼센트를 계산하였다. NMD를 억제하기 위한 사이클로헥시미드(CHX+)로의 RenCell VM 처리는 세포질 분획에서 NMD 유도 엑손 20x에 상응하는 생성물의 2배 증가를 초래하였다(연회색 막대, CHX-와 진회색 막대, CHX+ 비교).
실시예 3: SCN1A 엑손 23(엑손 20x) 영역 ASO 워크
ASO는 한 번에 5개 뉴클레오티드를 이동시켜 SCN1A 엑손 23(엑손 20x) 유전자의 5' 말단의 상류 약 1000개 내지 약 100개 뉴클레오티드의 영역을 포함하도록 설계하였다. ASO는 또한 한 번에 5개 뉴클레오티드를 이동시켜 SCN1A 엑손 23(엑손 20x) 유전자의 3' 말단으로부터의 하류 약 1000개 내지 약 100개 뉴클레오티드의 제2 영역을 포함하도록 설계하였다. SCN1A를 표적화하는 ASO의 목록은 표 3에 요약되어 있다. ASO의 서열은 표 4에 요약되어 있다.
Figure pct00009
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실시예 4: RT-PCR에 의해 평가된 SCN1A 엑손 23(엑손 20x) 영역 확장된 ASO 워크
ASO 워크 서열은 예를 들어 RT-PCR에 의해 평가할 수 있다. 도 5a에서, 대표적인 PAGE는 뉴클레오펙션에 의해 RenCells에서 1μM 농도에서, 모의 처리된, 대조군 ASO 처리된, 본원에서 실시예 3 및 도 3의 설명에 기재된 바와 같이 엑손 20x 영역을 표적화하도록 처리된 SCN1A의 SYBR-세이프 염색된 RT-PCR 생성물을 나타낸다. 하나는 엑손 20x를 포함하고 다른 하나는 엑손 20x를 배제한 2가지 생성물을 정량화하고, 엑손 20x 포함 퍼센트를 막대 그래프로 플롯팅한다(도 5b). 또한, Taqman q PCR 생성물을 RPL32 내부 대조군에 대해 정규화하였고, 모의에 대한 배수 변화를 막대 그래프로 플롯팅한다(도 5c).
본 발명의 바람직한 실시양태가 본원에 제시되고 설명되었지만, 이러한 실시양태가 단지 예로서 제공된다는 것은 당업자에게 자명할 것이다. 당업자는 본 발명을 벗어나지 않으면서 다수의 변형, 변경 및 치환을 생각해 낼 것이다. 본원에 설명된 본 발명의 실시양태에 대한 다양한 대안이 본 발명을 실시하는 데 사용될 수 있음을 이해해야 한다. 다음의 청구범위는 본 발명의 범위를 정의하고 이들 청구범위 내의 방법 및 구조 및 이들의 등가물은 이에 의해 포함되는 것으로 의도된다.

Claims (32)

  1. SCN1A 단백질을 코딩하고 넌센스 매개 RNA 붕괴 유도 엑손(non-sense mediated RNA decay-inducing exon)을 함유하는 mRNA(NMD 엑손 mRNA)를 갖는 세포에서 SCN1A 단백질의 발현을 조절하는 방법으로서,
    치료제를 세포에 접촉시키는 단계를 포함하고, 이에 의해 치료제는 SCN1A 단백질을 코딩하는 NMD 엑손 mRNA로부터 NMD 엑손의 스플라이싱을 조절하며, 이로써 세포에서 SCN1A 단백질을 코딩하는 프로세싱된 mRNA의 수준을 조절하고 SCN1A 단백질의 발현을 조절하고, 여기서 치료제는 SCN1A를 코딩하는 NMD 엑손 mRNA의 표적화된 부분에 결합하고, 표적화된 부분은
    NMD 유도 엑손(NIE)의 5' 말단으로부터의 상류 약 1000개 뉴클레오티드 내지 NIE의 5' 말단으로부터의 상류 약 100개 뉴클레오티드; 또는
    NIE의 3' 말단의 하류 약 100개 뉴클레오티드 내지 NIE의 3' 말단의 하류 약 1000개 뉴클레오티드인 방법.
  2. 질환 또는 병태의 치료를 필요로 하는 대상체의 세포에서 SCN1A 단백질의 발현을 조절함으로써 대상체에서 질환 또는 병태를 치료하는 방법으로서,
    대상체의 세포를 넌센스 매개 mRNA 붕괴 유도 엑손(NMD 엑손)을 함유하고 SCN1A를 코딩하는 세포에서의 mRNA로부터 NMD 엑손의 스플라이싱을 조절하는 치료제와 접촉시키는 단계를 포함하며, 이로써 대상체의 세포에서 SCN1A 단백질을 코딩하는 프로세싱된 mRNA의 수준을 조절하고 SCN1A 단백질의 발현을 조절하며, 여기서 치료제는 SCN1A를 코딩하는 NMD 엑손 mRNA의 표적화된 부분에 결합하고, 표적화된 부분은
    NMD 유도 엑손(NIE)의 5' 말단으로부터의 상류 약 1000개 뉴클레오티드 내지 NIE의 5' 말단으로부터의 상류 약 100개 뉴클레오티드; 또는
    NIE의 3' 말단의 하류 약 100개 뉴클레오티드 내지 NIE의 3' 말단의 하류 약 1000개 뉴클레오티드인 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 치료제는 표적화된 부분의 영역으로부터 NMD 엑손의 스플라이싱에 관여하는 인자의 결합을 방해하는 것인 방법.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 표적화된 부분은 NIE의 5' 말단의 상류 최대 약 800개 뉴클레오티드, 약 700개 뉴클레오티드, 약 600개 뉴클레오티드, 약 500개 뉴클레오티드, 약 400개 뉴클레오티드, 약 300개 뉴클레오티드, 약 200개 뉴클레오티드, 약 100개 뉴클레오티드, 약 80개 뉴클레오티드, 약 70개 뉴클레오티드, 약 60개 뉴클레오티드, 약 50개 뉴클레오티드인 방법.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 표적화된 부분은 NIE의 5' 말단의 상류 적어도 약 800개 뉴클레오티드, 약 700개 뉴클레오티드, 약 600개 뉴클레오티드, 약 500개 뉴클레오티드, 약 400개 뉴클레오티드, 약 300개 뉴클레오티드, 약 200개 뉴클레오티드, 약 100개 뉴클레오티드, 약 80개 뉴클레오티드, 약 70개 뉴클레오티드, 약 60개 뉴클레오티드, 약 50개 뉴클레오티드, 약 40개 뉴클레오티드, 약 30개 뉴클레오티드, 약 20개 뉴클레오티드, 약 10개 뉴클레오티드, 약 5개 뉴클레오티드, 약 4개 뉴클레오티드, 약 2개 뉴클레오티드, 약 1개 뉴클레오티드인 방법.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 표적화된 부분은 NIE의 3' 말단의 하류 최대 약 800개 뉴클레오티드, 약 700개 뉴클레오티드, 약 600개 뉴클레오티드, 약 500개 뉴클레오티드, 약 400개 뉴클레오티드, 약 300개 뉴클레오티드, 약 200개 뉴클레오티드, 약 100개 뉴클레오티드, 약 80개 뉴클레오티드, 약 70개 뉴클레오티드, 약 60개 뉴클레오티드, 약 50개 뉴클레오티드인 방법.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 표적화된 부분은 NIE의 3' 말단의 하류 적어도 약 800개 뉴클레오티드, 약 700개 뉴클레오티드, 약 600개 뉴클레오티드, 약 500개 뉴클레오티드, 약 400개 뉴클레오티드, 약 300개 뉴클레오티드, 약 200개 뉴클레오티드, 약 100개 뉴클레오티드, 약 80개 뉴클레오티드, 약 70개 뉴클레오티드, 약 60개 뉴클레오티드, 약 50개 뉴클레오티드, 약 40개 뉴클레오티드, 약 30개 뉴클레오티드, 약 20개 뉴클레오티드, 약 10개 뉴클레오티드, 약 5개 뉴클레오티드, 약 4개 뉴클레오티드, 약 2개 뉴클레오티드, 약 1개 뉴클레오티드인 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 치료제는 안티센스 올리고머(ASO)인 방법.
  9. 제8항에 있어서, ASO는 서열번호 12 내지 731 중 어느 하나와 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 97% 또는 100% 동일성인 서열을 포함하는 것인 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 치료제는 SCN1A 단백질을 코딩하는 프로세싱된 mRNA로부터 NMD 엑손의 배제를 촉진하는 것인 방법.
  11. 제10항에 있어서, 치료제와 접촉된 세포에서 SCN1A 단백질을 코딩하는 프로세싱된 mRNA로부터 NMD 엑손의 배제는 대조군 세포에서 SCN1A 단백질을 코딩하는 프로세싱된 mRNA로부터 NMD 엑손의 배제와 비교하여 약 1.1 내지 약 10배, 약 1.5 내지 약 10배, 약 2 내지 약 10배, 약 3 내지 약 10배, 약 4 내지 약 10배, 약 1.1 내지 약 5배, 약 1.1 내지 약 6배, 약 1.1 내지 약 7배, 약 1.1 내지 약 8배, 약 1.1 내지 약 9배, 약 2 내지 약 5배, 약 2 내지 약 6배, 약 2 내지 약 7배, 약 2 내지 약 8배, 약 2 내지 약 9배, 약 3 내지 약 6배, 약 3 내지 약 7배, 약 3 내지 약 8배, 약 3 내지 약 9배, 약 4 내지 약 7배, 약 4 내지 약 8배, 약 4 내지 약 9배, 적어도 약 1.1배, 적어도 약 1.5배, 적어도 약 2배, 적어도 약 2.5배, 적어도 약 3배, 적어도 약 3.5배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 또는 적어도 약 10배 증가되는 것인 방법.
  12. 제10항에 있어서, 치료제는 세포에서 SCN1A 단백질을 코딩하는 프로세싱된 mRNA의 수준을 증가시키는 것인 방법.
  13. 제10항에 있어서, 치료제와 접촉된 세포에서 SCN1A 단백질을 코딩하는 프로세싱된 mRNA의 양은 대조군 세포에서 SCN1A 단백질을 코딩하는 프로세싱된 mRNA의 총량과 비교하여 약 1.1 내지 약 10배, 약 1.5 내지 약 10배, 약 2 내지 약 10배, 약 3 내지 약 10배, 약 4 내지 약 10배, 약 1.1 내지 약 5배, 약 1.1 내지 약 6배, 약 1.1 내지 약 7배, 약 1.1 내지 약 8배, 약 1.1 내지 약 9배, 약 2 내지 약 5배, 약 2 내지 약 6배, 약 2 내지 약 7배, 약 2 내지 약 8배, 약 2 내지 약 9배, 약 3 내지 약 6배, 약 3 내지 약 7배, 약 3 내지 약 8배, 약 3 내지 약 9배, 약 4 내지 약 7배, 약 4 내지 약 8배, 약 4 내지 약 9배, 적어도 약 1.1배, 적어도 약 1.5배, 적어도 약 2배, 적어도 약 2.5배, 적어도 약 3배, 적어도 약 3.5배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 또는 적어도 약 10배 증가되는 것인 방법.
  14. 제2항에 있어서, 질환 또는 병태는 Nav1.1에서의 기능 상실 돌연변이에 의해 유도되는 것인 방법.
  15. 제14항에 있어서, 질환 또는 병태는 SCN1A 유전자의 반가불충분성과 관련되며, 대상체는 기능성 SCN1A를 코딩하는 제1 대립유전자, 및 SCN1A가 생성되지 않거나 감소된 수준으로 생성되는 제2 대립유전자 또는 비기능성 SCN1A 또는 부분 기능성 SCN1A를 코딩하는 제2 대립유전자를 갖는 것인 방법.
  16. 제14항에 있어서, 질환 또는 병태는 뇌병증인 방법.
  17. 제16항에 있어서, 뇌병증은 간질성 뇌병증인 방법.
  18. 제14항에 있어서, 질환 또는 병태는 드라벳 증후군(DS); 유아기의 중증 근간대성 뇌전증(SMEI)-경계(SMEB); 열성 발작(FS); 열성 발작 플러스를 동반하는 전신 뇌전증(GEFS+); 조기 유아 간질성 뇌병증 13(epileptic encephalopathy, early infantile, 13); 잠재성(cryptogenic) 전신 뇌전증; 잠재성 국소 뇌전증; 근간대성 무정위 뇌전증; 레녹스-가스토 증후군; 웨스트 증후군; 특발성 경련; 조기 근간대성 뇌병증; 진행성 근간대성 뇌전증; 소아기 교대성 편마비; 미분류 간질성 뇌병증; 뇌전증에서의 돌연사(SUDEP); 동기능 부전 증후군 1(sick sinus syndrome 1); 자폐증; 또는 유아기의 악성 이동성 부분 발작인 방법.
  19. 제18항에 있어서, GEFS+는 열성 발작 플러스를 동반하는 전신 뇌전증 2형(epilepsy, generalized, with febrile seizures plus, type 2)인 방법.
  20. 제18항에 있어서, 열성 발작은 가족성 열성 발작 3A(Febrile seizures, familial, 3A)인 방법.
  21. 제18항에 있어서, SMEB는 전신 극파가 없는 SMEB(SMEB-SW), 근간대성 발작이 없는 SMEB(SMEB-M), SMEI의 하나 초과의 특징이 결여된 SMEB(SMEB-O) 또는 전신 강직-간대성 발작을 동반한 난치성 소아기 뇌전증(ICEGTC)인 방법.
  22. 제1항 또는 제2항에 있어서, ASO는 서열번호 72 또는 432로부터 선택된 서열로 이루어진 것인 방법.
  23. 제1항 또는 제2항에 있어서, ASO는 서열번호 73 또는 433으로부터 선택된 서열로 이루어진 것인 방법.
  24. 제1항 또는 제2항에 있어서, ASO는 서열번호 76 또는 436으로부터 선택된 서열로 이루어진 것인 방법.
  25. 제1항 또는 제2항에 있어서, ASO는 서열번호 181 또는 541로부터 선택된 서열로 이루어진 것인 방법.
  26. 제1항 또는 제2항에 있어서, ASO는 서열번호 220 또는 580로부터 선택된 서열로 이루어진 것인 방법.
  27. SCN1A 단백질을 코딩하고 넌센스 매개 RNA 붕괴 유도 엑손을 함유하는 mRNA(NMD 엑손 mRNA)를 갖는 세포에서 SCN1A 단백질의 발현을 조절하는 방법으로서,
    치료제를 세포에 접촉시키는 단계를 포함하고, 이에 의해 치료제는 SCN1A 단백질을 코딩하는 NMD 엑손 mRNA로부터 NMD 엑손의 스플라이싱을 조절하며, 이로써 세포에서 SCN1A 단백질을 코딩하는 프로세싱된 mRNA의 수준을 조절하고 SCN1A 단백질의 발현을 조절하며, 여기서 치료제는 SCN1A를 코딩하는 NMD 엑손 mRNA의 표적화된 부분에 결합하고, 표적화된 부분은 NMD 유도 엑손(NIE)의 5' 말단으로부터의 상류 약 1000개 뉴클레오티드 내지 NIE의 3' 말단의 하류 약 1000개 뉴클레오티드인 방법.
  28. 질환 또는 병태의 치료를 필요로 하는 대상체의 세포에서 SCN1A 단백질의 발현을 조절함으로써 대상체에서 질환 또는 병태를 치료하는 방법으로서,
    대상체의 세포를 넌센스 매개 mRNA 붕괴 유도 엑손(NMD 엑손)을 함유하고 SCN1A를 코딩하는 세포에서의 mRNA로부터 NMD 엑손의 스플라이싱을 조절하는 치료제와 접촉시키는 단계를 포함하며, 이로써 대상체의 세포에서 SCN1A 단백질을 코딩하는 프로세싱된 mRNA의 수준을 조절하고 SCN1A 단백질의 발현을 조절하며, 여기서 치료제는 SCN1A를 코딩하는 NMD 엑손 mRNA의 표적화된 부분에 결합하고, 표적화된 부분은 NMD 유도 엑손(NIE)의 5' 말단으로부터의 상류 약 1000개 뉴클레오티드 내지 NIE의 3' 말단의 하류 약 1000개 뉴클레오티드인 방법.
  29. 서열번호 12 내지 731 중 어느 하나와 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 97% 또는 100% 동일성인 서열을 포함하는 안티센스 올리고머(ASO).
  30. 서열번호 12 내지 731로부터 선택된 서열로 이루어진 안티센스 올리고머(ASO).
  31. 질환 또는 병태의 치료를 필요로 하는 대상체의 세포에서 SCN1A 단백질의 발현을 조절함으로써 대상체에서 질환 또는 병태를 치료하는 방법으로서,
    대상체의 세포를 제29항 또는 제30항의 ASO와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
  32. 제29항 또는 제30항의 ASO를 포함하는 키트.
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