JP2023083426A - ガンマラクトンの生合成生産 - Google Patents
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Abstract
【課題】ガンマラクトンの生合成生産の提供。【解決手段】カルボン酸基質を、カルボン酸4-ヒドロキシラーゼ活性を有する異種シトクロムP450(CYP450)タンパク質と反応させることを含む、ガンマラクトンを作製する方法が本明細書で提供される。上記タンパク質は、カルボン酸基質のカルボニル炭素に対してガンマに位置する炭素原子で特異的にヒドロキシラーゼ活性を有し、それによって、4-ヒドロキシカルボン酸を生成し、これが、酸性にすると、自発的にガンマラクトンに変換することができるという発見に基づく。【選択図】なし
Description
関連出願
本出願は、各々の開示がこれにより全体が参照により本明細書に組み込まれる、2018年7月17日に出願された米国仮特許出願第62/699,374号、および2018年11月9日に出願された米国仮特許出願第62/758,019号に基づく優先権および利益を主張する。
本出願は、各々の開示がこれにより全体が参照により本明細書に組み込まれる、2018年7月17日に出願された米国仮特許出願第62/699,374号、および2018年11月9日に出願された米国仮特許出願第62/758,019号に基づく優先権および利益を主張する。
発明の分野
本発明の分野は、組換えタンパク質および/またはこのような組換えタンパク質を発現するように改変された微生物培養物を介してガンマラクトンを生成するための方法およびプロセスに関する。より具体的には、本開示は、酵素的変換を介した対応するカルボン酸基質からのC4~C20ガンマラクトンの生産に関する。
本発明の分野は、組換えタンパク質および/またはこのような組換えタンパク質を発現するように改変された微生物培養物を介してガンマラクトンを生成するための方法およびプロセスに関する。より具体的には、本開示は、酵素的変換を介した対応するカルボン酸基質からのC4~C20ガンマラクトンの生産に関する。
背景
心地よい味および匂いを有する食品、フレグランスおよび化粧品に対する普遍的な欲求が存在する。多くの場合、これらの心地よい匂いおよび味の特性は、望ましい芳香および香味の特徴を有するさまざまなガンマラクトンを含むさまざまなラクトン化合物を通して提供される。ラクトン化合物の現在の需要は、主に化学合成または植物からの抽出プロセスのいずれかによって対処されている。植物抽出ベースの生産には、目的の化合物の強度および存在量に対する天候の影響、植物病害および/または不作のリスク、化合物の安定性、生産増加の環境への影響、ならびに貿易制限などの重大な欠点がある。工業生産は環境に損害を与えるおそれがあり、危険な前駆体を使用する可能性があり、重要な基質のコストのためにそれ自体がコストの増加にさらされる可能性がある。
心地よい味および匂いを有する食品、フレグランスおよび化粧品に対する普遍的な欲求が存在する。多くの場合、これらの心地よい匂いおよび味の特性は、望ましい芳香および香味の特徴を有するさまざまなガンマラクトンを含むさまざまなラクトン化合物を通して提供される。ラクトン化合物の現在の需要は、主に化学合成または植物からの抽出プロセスのいずれかによって対処されている。植物抽出ベースの生産には、目的の化合物の強度および存在量に対する天候の影響、植物病害および/または不作のリスク、化合物の安定性、生産増加の環境への影響、ならびに貿易制限などの重大な欠点がある。工業生産は環境に損害を与えるおそれがあり、危険な前駆体を使用する可能性があり、重要な基質のコストのためにそれ自体がコストの増加にさらされる可能性がある。
したがって、当技術分野では、植物抽出および化学合成によってもたらされる制限なしに、経済的かつ確実にガンマラクトンを生成するための新規な方法が必要とされている。
発明の要旨
本発明によると、ガンマラクトンは、細菌および/または酵母などの微生物を使用する遺伝子改変および発酵技術によって、高収率で確実に生産され得る。これらの微生物は、新規に、または脂肪酸の生体内変換によってラクトンを合成して、商業的に有意な収量を提供することができる。したがって、ガンマラクトン生産のコストを削減し、これらのラクトン化合物を抽出できる天然資源の大規模な培養および処理の環境への影響を軽減するための新しい生産方法が本明細書で提供される。
本発明によると、ガンマラクトンは、細菌および/または酵母などの微生物を使用する遺伝子改変および発酵技術によって、高収率で確実に生産され得る。これらの微生物は、新規に、または脂肪酸の生体内変換によってラクトンを合成して、商業的に有意な収量を提供することができる。したがって、ガンマラクトン生産のコストを削減し、これらのラクトン化合物を抽出できる天然資源の大規模な培養および処理の環境への影響を軽減するための新しい生産方法が本明細書で提供される。
より具体的には、本開示は、異種シトクロムP450(CYP450)タンパク質を発現する細胞系を含む微生物発酵によってガンマラクトンを生成するための方法および組成物を包含する。
本開示は、一部は、特定のCYP450タンパク質およびその機能的変異体が、カルボン酸基質のカルボニル炭素に対してガンマに位置する炭素原子で特異的にヒドロキシラーゼ活性を有し、それによって、4-ヒドロキシカルボン酸を生成し、これが、酸性にすると、自発的にガンマラクトンに変換することができるという発見に基づく。改変された微生物系でこれらのCYP450タンパク質を過剰発現させ、これに適切なカルボン酸基質を供給することによって、さまざまなガンマラクトンを高力価で生産することができる。したがって、本開示は、化学合成または植物抽出に関連する欠点なしに、カルボン酸(例えば、さまざまな市販の脂肪酸)からガンマラクトンを作製するための経済的で確実な方法を提供する。
したがって、本開示の一態様は、C4~C20ガンマラクトンを生成する方法であって、(a)C4~C20カルボン酸基質を含む培地中で異種CYP450タンパク質を発現する細胞系をインキュベートして、4-ヒドロキシC4~C20カルボン酸を提供することと、(b)4-ヒドロキシC4~C20カルボン酸を酸性条件に供して、C4~C20ガンマラクトンを提供することとを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、4-ヒドロキシカルボン酸を、酸性化の前に細胞系から単離することができる。
さまざまな実施形態では、細胞系が、異種CYP450タンパク質をコードする配列を含む形質転換宿主細胞であり得る。いくつかの実施形態では、細胞系が、細菌細胞、酵母細胞、目的のラクトンを自然に産生しない植物細胞、藻類細胞、および/または本明細書に記載される特定の真菌CYP450タンパク質を自然にコードしない真菌細胞を含むことができる。特定の実施形態では、細胞系が、Escherichia;Salmonella;Bacillus;Acinetobacter;Streptomyces;Corynebacterium;Methylosinus;Methylomonas;Rhodococcus;Pseudomonas;Rhodobacter;Synechocystis;Saccharomyces;Zygosaccharomyces;Kluyveromyces;Candida;Hansenula;Debaryomyces;Mucor;Pichia;Torulopsis;Aspergillus;Arthrobotlys;Brevibacteria;Microbacterium;Arthrobacter;Citrobacter;Klebsiella;Mucor;Pantoea;Corynebacterium;およびClostridiumからなる群から選択される形質転換細菌および/または酵母細胞を含むことができる。いくつかの実施形態では、細胞系が、増殖細胞を含むことができる。他の実施形態では、細胞系が、休止細胞(例えば、凍結され、次いで、再懸濁された凍結乾燥細胞)を含むことができる。
本開示はまた、C4~C20ガンマラクトンを生成する方法であって、本明細書に記載される組換えCYP450タンパク質およびC4~C20カルボン酸基質を含む反応混合物を提供して、4-ヒドロキシC4~C20カルボン酸を提供することと、4-ヒドロキシC4~C20カルボン酸を酸性条件に供して、C4~C20ガンマラクトンを生成することとを含む方法を包含する。いくつかの実施形態では、組換えCYP450タンパク質が、反応混合物中の形質転換宿主細胞によって発現され得る。他の実施形態では、組換えCYP450タンパク質を、単離し、次いで、反応混合物に提供することができる。
本開示によるC4~C20ガンマラクトンを生成する方法のさまざまな実施形態では、CYP450タンパク質が、カルボン酸4-ヒドロキシラーゼ活性を有するMucor ambiguous CYP450タンパク質またはその機能的変異体であり得る。例えば、CYP450タンパク質は、配列番号1と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%または99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。特定の実施形態では、CYP450タンパク質が、配列番号1のアミノ酸配列を含むことができる。他の実施形態では、CYP450タンパク質が、配列番号1のアミノ酸配列からなることができる。したがって、このようなCYP450タンパク質またはその変異体を発現するように形質転換された形質転換宿主細胞は、配列番号2と少なくとも80%、85%、90%、95%、97%、98%または99%の同一性を有するヌクレオチド配列を含むことができる。
いくつかの他の実施形態では、CYP450タンパク質が、カルボン酸4-ヒドロキシラーゼ活性を有するBasidiobolus meristosporus CYP450タンパク質またはその機能的変異体であり得る。例えば、CYP450タンパク質は、配列番号3と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%または99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。特定の実施形態では、CYP450タンパク質が、配列番号3のアミノ酸配列を含むことができる。他の実施形態では、CYP450タンパク質が、配列番号3のアミノ酸配列からなることができる。したがって、このようなCYP450タンパク質またはその変異体を発現するように形質転換された形質転換宿主細胞は、配列番号4と少なくとも80%、85%、90%、95%、97%、98%または99%の同一性を有するヌクレオチド配列を含むことができる。
さらに他の実施形態では、CYP450タンパク質が、カルボン酸4-ヒドロキシラーゼ活性を有するUmbelopsis isabelline CYP450タンパク質またはその機能的変異体であり得る。例えば、CYP450タンパク質は、配列番号5と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%または99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。特定の実施形態では、CYP450タンパク質が、配列番号5のアミノ酸配列を含むことができる。他の実施形態では、CYP450タンパク質が、配列番号5のアミノ酸配列からなることができる。したがって、このようなCYP450タンパク質またはその変異体を発現するように形質転換された形質転換宿主細胞は、配列番号6と少なくとも80%、85%、90%、95%、97%、98%または99%の同一性を有するヌクレオチド配列を含むことができる。
いくつかの実施形態では、C4~C20カルボン酸基質が、C4~C20カルボン酸:C4~C20カルボン酸の塩;C4~C20カルボン酸のエステル;C4~C20カルボン酸のモノ-、ジ-もしくはトリグリセリド;またはこれらの組み合わせを含むことができる。特定の実施形態では、C4~C20カルボン酸基質がC4~C20カルボン酸またはその塩であり得る。C4~C20カルボン酸は、直鎖C4~C20カルボン酸、分岐C4~C20カルボン酸、飽和C4~C20カルボン酸、または不飽和C4~C20カルボン酸であり得る。C4~C20カルボン酸は、任意の置換が、カルボン酸のカルボニル炭素に対してアルファ、ベータ、またはガンマに位置する炭素原子にないという条件で、ヒドロキシル基およびアミノ基から選択される1またはそれを超える官能基で必要に応じて置換され得る(図1参照)。特定の実施形態では、C4~C20カルボン酸が直鎖完全飽和カルボン酸であり得る。特定の実施形態では、C4~C20カルボン酸基質が、ヘキサン酸、ヘキセン酸、ヘプタン酸、1-ヘプテン酸、2-ヘプテン酸、オクタン酸、1-オクテン酸、2-オクテン酸、3-オクテン酸、ノナン酸、1-ノネン酸、2-ノネン酸、3-ノネン酸、デカン酸、1-デセン酸、2-デセン酸、3-デセン酸、ウンデカン酸、1-ウンデセン酸、2-ウンデセン酸、3-ウンデセン酸、ドデカン酸、1-ドデセン酸、2-ドデセン酸、3-ドデセン酸、トリデカン酸、1-トリデセン酸、2-トリデセン酸、3-トリデセン酸、テトラデカン酸、1-テトラデセン酸、2-テトラデセン酸、および3-テトラデセン酸から選択され得る。
C4~C20カルボン酸基質の素生に応じて、本方法によって生産されるガンマラクトンが、γ-ヘキサラクトン、γ-ヘキセノラクトン、γ-ヘプタラクトン、γ-ヘプテノラクトン、γ-オクタラクトン、γ-オクテノラクトン、γ-ノナラクトン、γ-ノネノラクトン、γ-デカラクトン、γ-デカセノラクトン、γ-ウンデカラクトン、γ-ウンデセノラクトン、γ-ドデカラクトン、γ-ドデセノラクトン、γ-トリデカラクトン、γ-トリデセノラクトン、γ-テトラデカラクトン、およびγ-テトラデセノラクトンから選択されるC4~C20ガンマラクトンを含むことができる。
本明細書に記載される任意の方法は、細胞系からガンマラクトンを単離して、粗生成物を提供することをさらに含み得る。いくつかの実施形態では、このような単離ステップから得られる粗生成物が、少なくとも70%純粋であるラクトン内容物を含むことができる。いくつかの実施形態では、方法が、ガンマラクトンを含む粗生成物を精製することをさらに含む。いくつかの実施形態では、前記粗生成物がカラムクロマトグラフィーによって精製される。いくつかの実施形態では、前記粗生成物が酸塩基抽出によって精製される。いくつかの実施形態では、前記粗生成物が真空蒸留によって精製される。いくつかの実施形態では、方法が、セミ分取HPLCを使用して前記ラクトンを精製することをさらに含む。
本明細書に記載される方法によって生産されるガンマラクトンは、単独で使用する、または他のラクトン、香味、または香気と混合して、さまざまな消費者製品または食品で使用するための所望の組成物を得ることができる。例えば、本明細書に記載されるガンマラクトンは、食品(飲料、清涼飲料、アイスクリーム、乳製品、菓子類、シリアル、チューインガム、焼き菓子等など)、栄養補助食品、医学的栄養、ならびに所望の香味または芳香特性を与える医薬品に含まれ得る。いくつかの実施形態では、本開示は、特定の香味条件、配合またはレシピで使用するための、上記の方法のいずれか1つによって生産される、または本明細書の他の場所に記載される香味量または香気量のラクトンを含む消耗品を提供する。いくつかの実施形態では、消耗品が食品、飲料、香水または化粧品であり得る。いくつかの実施形態では、組成物が飲料、菓子類、ベーカリー製品、クッキー、およびチューインガムから選択され得る。特定の実施形態では、組成物が、モモ、アンズ、ナシ、カエデ、ココナツ、バニラ、バタースコッチ、グレナディンおよび/またはナツメヤシのような味または匂いに設計された香味または芳香プロファイルを有する食品、飲料、香水または化粧品であり得る。
本開示は、さまざまな修正および代替形態の影響を受けやすいが、その特定の実施形態を、例として図面に示し、本明細書で詳細に説明する。しかしながら、本明細書に提示される図面および詳細な説明は、本開示を開示される特定の実施形態に限定することを意図するものではなく、逆に、添付の特許請求の範囲によって定義される本開示の精神および範囲に入る全ての修正、同等物および代替物を網羅することを意図していることを理解すべきである。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される:
(項目1)
C4~C20ガンマラクトンを生成する方法であって、
カルボン酸4-ヒドロキシラーゼ活性を有する組換えCYP450タンパク質およびC4~C20カルボン酸基質を含む反応混合物を提供して、4-ヒドロキシC4~C20カルボン酸を提供することと;
前記4-ヒドロキシC4~C20カルボン酸を酸性条件に供して、前記C4~C20ガンマラクトンを生成することと
を含み、
前記組換えCYP450タンパク質は、配列番号1、配列番号3または配列番号5と少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、
方法。
(項目2)
前記組換えCYP450タンパク質が、前記反応混合物中の形質転換宿主細胞によって発現される、項目1に記載の方法。
(項目3)
前記形質転換宿主細胞が細菌細胞および酵母細胞から選択される、項目2に記載の方法。
(項目4)
前記組換えCYP450タンパク質が、(a)配列番号1と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含む;(b)配列番号1と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を含む;(c)配列番号1と少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含む;または(d)配列番号1のアミノ酸配列を含む、項目1から3のいずれか一項に記載の方法。
(項目5)
前記組換えCYP450タンパク質が、(a)配列番号3と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含む;(b)配列番号3と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を含む;(c)配列番号3と少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含む;または(d)配列番号3のアミノ酸配列を含む、項目1から3のいずれか一項に記載の方法。
(項目6)
前記組換えCYP450タンパク質が、(a)配列番号5と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含む;(b)配列番号5と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を含む;(c)配列番号5と少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含む;または(d)配列番号5のアミノ酸配列を含む、項目1から3のいずれか一項に記載の方法。
(項目7)
前記C4~C20カルボン酸基質が、C4~C20カルボン酸:C4~C20カルボン酸の塩;C4~C20カルボン酸のエステル;C4~C20カルボン酸のモノ-、ジ-もしくはトリグリセリド;またはこれらの組み合わせを含む、項目1から6のいずれか一項に記載の方法。
(項目8)
前記C4~C20カルボン酸が、直鎖C4~C20カルボン酸、分岐C4~C20カルボン酸、飽和C4~C20カルボン酸、不飽和C4~C20カルボン酸、またはこれらの組み合わせを含む、項目1から7のいずれか一項に記載の方法。
(項目9)
前記C4~C20カルボン酸基質が、ヘプタン酸、オクタン酸、ノナン酸、デカン酸、ウンデカン酸、ドデカン酸、トリデカン酸、およびテトラデカン酸から選択される、γ-ヘプタラクトン、γ-オクタラクトン、γ-ノナラクトン、γ-デカラクトン、γ-ウンデカラクトン、γ-ドデカラクトン、γ-トリデカラクトン、およびγ-テトラデカラクトンから選択されるC4~C20ガンマラクトンを生成するための項目4に記載の方法。
(項目10)
前記C4~C20カルボン酸基質がウンデカン酸およびウンデセン酸から選択される、γ-ウンデカラクトンおよびγ-ウンデセノラクトンから選択されるC4~C20ガンマラクトンを生成するための項目5に記載の方法。
(項目11)
前記C4~C20カルボン酸酸基質が、ヘキサン酸、ヘプタン酸、デカン酸、ウンデカン酸、ドデカン酸、トリデカン酸、およびテトラデカン酸から選択される、γ-ヘキサラクトン、γ-ヘプタラクトン、γ-デカラクトン、γ-ウンデカラクトン、γ-ドデカラクトン、γ-トリデカラクトン、およびγ-テトラデカラクトンから選択されるC4~C20ガンマラクトンを生成するための項目6に記載の方法。
(項目12)
C4~C20ガンマラクトンを生成する方法であって、
カルボン酸4-ヒドロキシラーゼ活性を有するCYP450タンパク質をコードする配列を含む形質転換宿主細胞をC4~C20カルボン酸基質と共にインキュベートして、4-ヒドロキシC4~C20カルボン酸を提供することと;
前記4-ヒドロキシC4~C20カルボン酸を酸性条件に供して、前記C4~C20ガンマラクトンを生成することと
を含み、
前記CYP450タンパク質をコードする前記配列は、配列番号2、配列番号4または配列番号6と少なくとも80%の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、
方法。
(項目13)
前記形質転換宿主細胞が細菌細胞または酵母細胞から選択される、項目12に記載の方法。
(項目14)
前記ヌクレオチド配列が配列番号2と少なくとも80%の同一性を有し、前記CYP450タンパク質が、(a)配列番号1と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含む;(b)配列番号1と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を含む;(c)配列番号1と少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含む;または(d)配列番号1のアミノ酸配列を含む、項目13に記載の方法。
(項目15)
前記ヌクレオチド配列が配列番号4と少なくとも80%の同一性を有し、前記CYP450タンパク質が、(a)配列番号3と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含む;(b)配列番号3と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を含む;(c)配列番号3と少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含む;または(d)配列番号3のアミノ酸配列を含む、項目13に記載の方法。
(項目16)
前記ヌクレオチド配列が配列番号6と少なくとも80%の同一性を有し、前記CYP450タンパク質が、(a)配列番号5と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含む;(b)配列番号5と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を含む;(c)配列番号5と少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含む;または(d)配列番号5のアミノ酸配列を含む、項目13に記載の方法。
(項目17)
前記C4~C20カルボン酸基質が、C4~C20カルボン酸:C4~C20カルボン酸の塩;C4~C20カルボン酸のエステル;C4~C20カルボン酸のモノ-、ジ-もしくはトリグリセリド;またはこれらの組み合わせを含む、項目12から16のいずれか一項に記載の方法。
(項目18)
前記C4~C20カルボン酸が、直鎖C4~C20カルボン酸、分岐C4~C20カルボン酸、飽和C4~C20カルボン酸、不飽和C4~C20カルボン酸、またはこれらの組み合わせを含む、項目12から17のいずれか一項に記載の方法。
(項目19)
前記C4~C20カルボン酸基質が、ヘプタン酸、オクタン酸、ノナン酸、デカン酸、ウンデカン酸、ドデカン酸、トリデカン酸、およびテトラデカン酸から選択される、γ-ヘプタラクトン、γ-オクタラクトン、γ-ノナラクトン、γ-デカラクトン、γ-ウンデカラクトン、γ-ドデカラクトン、γ-トリデカラクトン、およびγ-テトラデカラクトンから選択されるC4~C20ガンマラクトンを生成するための項目14に記載の方法。
(項目20)
前記C4~C20カルボン酸基質がウンデカン酸およびウンデセン酸から選択される、γ-ウンデカラクトンおよびγ-ウンデセノラクトンから選択されるC4~C20ガンマラクトンを生成するための項目15に記載の方法。
(項目21)
前記C4~C20カルボン酸酸基質が、ヘキサン酸、ヘプタン酸、デカン酸、ウンデカン酸、ドデカン酸、トリデカン酸、およびテトラデカン酸から選択される、γ-ヘキサラクトン、γ-ヘプタラクトン、γ-デカラクトン、γ-ウンデカラクトン、γ-ドデカラクトン、γ-トリデカラクトン、およびγ-テトラデカラクトンから選択されるC4~C20ガンマラクトンを生成するための項目16に記載の方法。
(項目22)
前記形質転換宿主細胞が増殖細胞である、項目12から21のいずれか一項に記載の方法。
(項目23)
前記形質転換宿主細胞が休止細胞である、項目12から21のいずれか一項に記載の方法。
本発明の他の特徴および利点は、添付の図面を参照して、本発明の好ましい実施形態の以下の詳細な説明で明らかになる。
(項目1)
C4~C20ガンマラクトンを生成する方法であって、
カルボン酸4-ヒドロキシラーゼ活性を有する組換えCYP450タンパク質およびC4~C20カルボン酸基質を含む反応混合物を提供して、4-ヒドロキシC4~C20カルボン酸を提供することと;
前記4-ヒドロキシC4~C20カルボン酸を酸性条件に供して、前記C4~C20ガンマラクトンを生成することと
を含み、
前記組換えCYP450タンパク質は、配列番号1、配列番号3または配列番号5と少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、
方法。
(項目2)
前記組換えCYP450タンパク質が、前記反応混合物中の形質転換宿主細胞によって発現される、項目1に記載の方法。
(項目3)
前記形質転換宿主細胞が細菌細胞および酵母細胞から選択される、項目2に記載の方法。
(項目4)
前記組換えCYP450タンパク質が、(a)配列番号1と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含む;(b)配列番号1と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を含む;(c)配列番号1と少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含む;または(d)配列番号1のアミノ酸配列を含む、項目1から3のいずれか一項に記載の方法。
(項目5)
前記組換えCYP450タンパク質が、(a)配列番号3と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含む;(b)配列番号3と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を含む;(c)配列番号3と少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含む;または(d)配列番号3のアミノ酸配列を含む、項目1から3のいずれか一項に記載の方法。
(項目6)
前記組換えCYP450タンパク質が、(a)配列番号5と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含む;(b)配列番号5と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を含む;(c)配列番号5と少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含む;または(d)配列番号5のアミノ酸配列を含む、項目1から3のいずれか一項に記載の方法。
(項目7)
前記C4~C20カルボン酸基質が、C4~C20カルボン酸:C4~C20カルボン酸の塩;C4~C20カルボン酸のエステル;C4~C20カルボン酸のモノ-、ジ-もしくはトリグリセリド;またはこれらの組み合わせを含む、項目1から6のいずれか一項に記載の方法。
(項目8)
前記C4~C20カルボン酸が、直鎖C4~C20カルボン酸、分岐C4~C20カルボン酸、飽和C4~C20カルボン酸、不飽和C4~C20カルボン酸、またはこれらの組み合わせを含む、項目1から7のいずれか一項に記載の方法。
(項目9)
前記C4~C20カルボン酸基質が、ヘプタン酸、オクタン酸、ノナン酸、デカン酸、ウンデカン酸、ドデカン酸、トリデカン酸、およびテトラデカン酸から選択される、γ-ヘプタラクトン、γ-オクタラクトン、γ-ノナラクトン、γ-デカラクトン、γ-ウンデカラクトン、γ-ドデカラクトン、γ-トリデカラクトン、およびγ-テトラデカラクトンから選択されるC4~C20ガンマラクトンを生成するための項目4に記載の方法。
(項目10)
前記C4~C20カルボン酸基質がウンデカン酸およびウンデセン酸から選択される、γ-ウンデカラクトンおよびγ-ウンデセノラクトンから選択されるC4~C20ガンマラクトンを生成するための項目5に記載の方法。
(項目11)
前記C4~C20カルボン酸酸基質が、ヘキサン酸、ヘプタン酸、デカン酸、ウンデカン酸、ドデカン酸、トリデカン酸、およびテトラデカン酸から選択される、γ-ヘキサラクトン、γ-ヘプタラクトン、γ-デカラクトン、γ-ウンデカラクトン、γ-ドデカラクトン、γ-トリデカラクトン、およびγ-テトラデカラクトンから選択されるC4~C20ガンマラクトンを生成するための項目6に記載の方法。
(項目12)
C4~C20ガンマラクトンを生成する方法であって、
カルボン酸4-ヒドロキシラーゼ活性を有するCYP450タンパク質をコードする配列を含む形質転換宿主細胞をC4~C20カルボン酸基質と共にインキュベートして、4-ヒドロキシC4~C20カルボン酸を提供することと;
前記4-ヒドロキシC4~C20カルボン酸を酸性条件に供して、前記C4~C20ガンマラクトンを生成することと
を含み、
前記CYP450タンパク質をコードする前記配列は、配列番号2、配列番号4または配列番号6と少なくとも80%の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、
方法。
(項目13)
前記形質転換宿主細胞が細菌細胞または酵母細胞から選択される、項目12に記載の方法。
(項目14)
前記ヌクレオチド配列が配列番号2と少なくとも80%の同一性を有し、前記CYP450タンパク質が、(a)配列番号1と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含む;(b)配列番号1と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を含む;(c)配列番号1と少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含む;または(d)配列番号1のアミノ酸配列を含む、項目13に記載の方法。
(項目15)
前記ヌクレオチド配列が配列番号4と少なくとも80%の同一性を有し、前記CYP450タンパク質が、(a)配列番号3と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含む;(b)配列番号3と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を含む;(c)配列番号3と少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含む;または(d)配列番号3のアミノ酸配列を含む、項目13に記載の方法。
(項目16)
前記ヌクレオチド配列が配列番号6と少なくとも80%の同一性を有し、前記CYP450タンパク質が、(a)配列番号5と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含む;(b)配列番号5と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を含む;(c)配列番号5と少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含む;または(d)配列番号5のアミノ酸配列を含む、項目13に記載の方法。
(項目17)
前記C4~C20カルボン酸基質が、C4~C20カルボン酸:C4~C20カルボン酸の塩;C4~C20カルボン酸のエステル;C4~C20カルボン酸のモノ-、ジ-もしくはトリグリセリド;またはこれらの組み合わせを含む、項目12から16のいずれか一項に記載の方法。
(項目18)
前記C4~C20カルボン酸が、直鎖C4~C20カルボン酸、分岐C4~C20カルボン酸、飽和C4~C20カルボン酸、不飽和C4~C20カルボン酸、またはこれらの組み合わせを含む、項目12から17のいずれか一項に記載の方法。
(項目19)
前記C4~C20カルボン酸基質が、ヘプタン酸、オクタン酸、ノナン酸、デカン酸、ウンデカン酸、ドデカン酸、トリデカン酸、およびテトラデカン酸から選択される、γ-ヘプタラクトン、γ-オクタラクトン、γ-ノナラクトン、γ-デカラクトン、γ-ウンデカラクトン、γ-ドデカラクトン、γ-トリデカラクトン、およびγ-テトラデカラクトンから選択されるC4~C20ガンマラクトンを生成するための項目14に記載の方法。
(項目20)
前記C4~C20カルボン酸基質がウンデカン酸およびウンデセン酸から選択される、γ-ウンデカラクトンおよびγ-ウンデセノラクトンから選択されるC4~C20ガンマラクトンを生成するための項目15に記載の方法。
(項目21)
前記C4~C20カルボン酸酸基質が、ヘキサン酸、ヘプタン酸、デカン酸、ウンデカン酸、ドデカン酸、トリデカン酸、およびテトラデカン酸から選択される、γ-ヘキサラクトン、γ-ヘプタラクトン、γ-デカラクトン、γ-ウンデカラクトン、γ-ドデカラクトン、γ-トリデカラクトン、およびγ-テトラデカラクトンから選択されるC4~C20ガンマラクトンを生成するための項目16に記載の方法。
(項目22)
前記形質転換宿主細胞が増殖細胞である、項目12から21のいずれか一項に記載の方法。
(項目23)
前記形質転換宿主細胞が休止細胞である、項目12から21のいずれか一項に記載の方法。
本発明の他の特徴および利点は、添付の図面を参照して、本発明の好ましい実施形態の以下の詳細な説明で明らかになる。
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本開示の特定の態様をさらに実証するために含まれ、本明細書に提示される特定の実施形態の詳細な説明と組み合わせてこれらの図面の1またはそれを超えるものを参照することによってよりよく理解することができる。
詳細な説明
図1を参照すると、脂肪酸からのガンマラクトンの生合成生産は、少なくとも2つの異なる経路を介して実施することができる。β酸化経路によると、オメガ炭素(例えば、ω-1、ω-2、ω-3、ω-4、ω-5、ω-6等)に近いヒドロキシル基を有する中鎖(C6~C12)または長鎖脂肪酸(C13~C21)を、酵母とインキュベートして、各β酸化サイクルがヒドロキシル化炭素原子とカルボニル炭素原子との間の炭化水素骨格フラグメントからC2残基を除去する複数のβ酸化サイクルを引き起こすことができる(ステップa1)。このような炭化水素骨格フラグメント内に奇数の炭素原子があるか偶数の炭素原子があるかに応じて、4-ヒドロキシ(ガンマ-ヒドロキシ)または5-ヒドロキシ(デルタ-ヒドロキシ)脂肪酸が生じることができ、酸性条件下でのラクトン化(ステップa2)で、ガンマラクトンまたはデルタラクトンのいずれかが生産される。
図1を参照すると、脂肪酸からのガンマラクトンの生合成生産は、少なくとも2つの異なる経路を介して実施することができる。β酸化経路によると、オメガ炭素(例えば、ω-1、ω-2、ω-3、ω-4、ω-5、ω-6等)に近いヒドロキシル基を有する中鎖(C6~C12)または長鎖脂肪酸(C13~C21)を、酵母とインキュベートして、各β酸化サイクルがヒドロキシル化炭素原子とカルボニル炭素原子との間の炭化水素骨格フラグメントからC2残基を除去する複数のβ酸化サイクルを引き起こすことができる(ステップa1)。このような炭化水素骨格フラグメント内に奇数の炭素原子があるか偶数の炭素原子があるかに応じて、4-ヒドロキシ(ガンマ-ヒドロキシ)または5-ヒドロキシ(デルタ-ヒドロキシ)脂肪酸が生じることができ、酸性条件下でのラクトン化(ステップa2)で、ガンマラクトンまたはデルタラクトンのいずれかが生産される。
比較すると、本方法は、4-ヒドロキシラーゼ活性で特異的に同定されたシトクロムP450タンパク質を利用する。カルボン酸またはその誘導体は、このようなシトクロムP450タンパク質によって4-ヒドロキシカルボン酸に生物変換され(ステップb1)、酸性にすると(ステップb2)、対応するガンマラクトンを生成する。したがって、本方法は、商業的スケールアップ生産に適したガンマラクトンを生成するための経済的で確実なアプローチを提供する。
ラクトンを生産する方法
本明細書に記載される方法は、いくつかの実施形態で、C4~C20カルボン酸基質からのC4~C20ガンマラクトンの生産を提供する。いくつかの実施形態では、このようなガンマラクトンを生成する方法が、(a)異種シトクロムP450(CYP450)タンパク質を発現する細胞系をC4~C20カルボン酸基質と共にインキュベートして、4-ヒドロキシC4~C20カルボン酸を提供することと、(b)4-ヒドロキシカルボン酸を酸性条件に接触させるまたは供して、C4~C20ガンマラクトンを生成することとを含む。
本明細書に記載される方法は、いくつかの実施形態で、C4~C20カルボン酸基質からのC4~C20ガンマラクトンの生産を提供する。いくつかの実施形態では、このようなガンマラクトンを生成する方法が、(a)異種シトクロムP450(CYP450)タンパク質を発現する細胞系をC4~C20カルボン酸基質と共にインキュベートして、4-ヒドロキシC4~C20カルボン酸を提供することと、(b)4-ヒドロキシカルボン酸を酸性条件に接触させるまたは供して、C4~C20ガンマラクトンを生成することとを含む。
いくつかの実施形態では、ラクトンを生産する方法が、異種CYP450タンパク質を発現する細胞系から収穫された細胞ペレットをカルボン酸基質と共にインキュベートすることを含む。いくつかの実施形態では、ラクトンを生産する方法が、細胞系から収穫された再懸濁された細胞ペレットをカルボン酸基質と共にインキュベートすることを含む。
本明細書に記載されるガンマラクトンを生成する方法は、任意の比率でカルボン酸基質を含む培地中で異種CYP450タンパク質を発現する細胞系をインキュベートすることを含む。いくつかの実施形態では、ガンマラクトンを生成する方法が、培地1リットル当たり1グラムの細胞~1リットル当たり200グラムの細胞(1g/L~200g/L)を含む細胞系をインキュベートすることを含む。培地は、1リットル当たり1グラムのカルボン酸基質~1リットル当たり20グラムの脂肪酸(1g/L~20g/L)を含むことができる。いくつかの実施形態では、ラクトンを生産する方法が、1リットル当たり1グラムのカルボン酸基質(1g/L)を含む培地中で、1リットル当たり100グラムの細胞(100g/L)を含む細胞系をインキュベートすることを含む。
いくつかの実施形態では、ラクトンを生産する方法が、4-ヒドロキシカルボン酸の形成に十分な適切な期間、細胞系をカルボン酸基質を含む培地と共にインキュベートすることを含む。いくつかの実施形態では、ラクトンを生産する方法が、細胞培養物中のガンマラクトンの形成に十分な適切な期間、4-ヒドロキシカルボン酸を細胞培養物と接触させることを含む。いくつかの実施形態では、ラクトンを生産する方法が、細胞培養物との接触前に、4-ヒドロキシカルボン酸を単離することを含む。いくつかの実施形態では、ラクトンを生産する方法が、細胞培養物を含む培地中で4-ヒドロキシカルボン酸をインキュベートすることを含む。
本明細書に記載されるラクトンを生産する方法は、ある時間インキュベートすること(例えば、異種CYP450タンパク質を発現する細胞系を適切なカルボン酸基質を含む培地と共にインキュベートすること)を包含する。いくつかの実施形態では、ラクトンを生産する方法が、0.5時間~96時間の時間インキュベートすることを含む。
本明細書に記載されるラクトンを生産する方法は、ある温度でインキュベートすること(例えば、異種CYP450タンパク質を発現する細胞系を適切なカルボン酸基質を含む培地と共にインキュベートすること)を包含する。いくつかの実施形態では、ラクトンを生産する方法が、16℃~40℃の温度でインキュベートすることを含む。
シトクロムP450
シトクロムP450(CYP450)タンパク質は、一般に、基質の酸化を触媒する酵素である。CYP450タンパク質は、ヘムタンパク質スーパーファミリーのメンバーであり、補因子としてヘムを含む。CYP450酵素は、それだけに限らないが、動物、植物、真菌、細菌、古細菌およびウイルスを含む多くの生物で同定されている。しかしながら、本発明者らの知識の限りでは、本発明以前は、特異的なカルボン酸4-ヒドロキシラーゼ活性を有するCYP450酵素は報告されていなかった。
シトクロムP450(CYP450)タンパク質は、一般に、基質の酸化を触媒する酵素である。CYP450タンパク質は、ヘムタンパク質スーパーファミリーのメンバーであり、補因子としてヘムを含む。CYP450酵素は、それだけに限らないが、動物、植物、真菌、細菌、古細菌およびウイルスを含む多くの生物で同定されている。しかしながら、本発明者らの知識の限りでは、本発明以前は、特異的なカルボン酸4-ヒドロキシラーゼ活性を有するCYP450酵素は報告されていなかった。
カルボン酸4-ヒドロキシラーゼ活性を有する真菌シトクロムP450酵素の候補遺伝子の大規模なライブラリーの厳密なハイスループットスクリーニングを実施した後、本発明者らは、高いカルボン酸4-ヒドロキシラーゼ活性を示す特定のCYP450遺伝子を同定した。
本方法で使用するのに適したCYP450タンパク質は、カルボン酸4-ヒドロキシラーゼ活性を有するMucor ambiguous CYP450タンパク質またはその機能的変異体であり得る。具体的には、CYP450タンパク質は、配列番号1と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%または99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。特定の実施形態では、CYP450タンパク質が、配列番号1のアミノ酸配列を含むことができる。他の実施形態では、CYP450タンパク質が、配列番号1のアミノ酸配列からなることができる。したがって、このような異種CYP450タンパク質を発現するために使用される細胞系は、配列番号2と少なくとも80%、85%、90%、95%、97%、98%または99%の同一性を有するヌクレオチド配列を有する宿主細胞を含むことができる。
いくつかの他の実施形態では、CYP450タンパク質が、カルボン酸4-ヒドロキシラーゼ活性を有するBasidiobolus meristosporus CYP450タンパク質またはその機能的変異体であり得る。例えば、CYP450タンパク質は、配列番号3と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%または99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。特定の実施形態では、CYP450タンパク質が、配列番号3のアミノ酸配列を含むことができる。他の実施形態では、CYP450タンパク質が、配列番号3のアミノ酸配列からなることができる。したがって、このような異種CYP450タンパク質を発現するために使用される細胞系は、配列番号4と少なくとも80%、85%、90%、95%、97%、98%または99%の同一性を有するヌクレオチド配列を有する宿主細胞を含むことができる。
さらに他の実施形態では、CYP450タンパク質が、カルボン酸4-ヒドロキシラーゼ活性を有するUmbelopsis isabelline CYP450タンパク質またはその機能的変異体であり得る。例えば、CYP450タンパク質は、配列番号5と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%または99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。特定の実施形態では、CYP450タンパク質が、配列番号5のアミノ酸配列を含むことができる。他の実施形態では、CYP450タンパク質が、配列番号5のアミノ酸配列からなることができる。したがって、このような異種CYP450タンパク質を発現するために使用される細胞系は、配列番号6と少なくとも80%、85%、90%、95%、97%、98%または99%の同一性を有するヌクレオチド配列を有する宿主細胞を含むことができる。
カルボン酸基質
本明細書に記載される方法によると、C4~C20カルボン酸基質は、4-ヒドロキシカルボン酸に変換され得る。カルボン酸基質はカルボン酸および/またはその誘導体であり得る。例えば、C4~C20カルボン酸基質は、C4~C20カルボン酸:C4~C20カルボン酸の塩;C4~C20カルボン酸のエステル;C4~C20カルボン酸のモノ-、ジ-もしくはトリグリセリド;またはこれらの組み合わせを含むことができる。本明細書で使用される場合、C4~C20は、4~20個の炭素原子を有する有機化合物を示す。C4~C20によって表される範囲は、それだけに限らないが、C5~C20、C6~C20、C7~C20、C8~C20、C9~C20、C10~C20、C6~C14、C7~C14、C8~C14、C9~C14、C10~C14等を含む、その中の任意の範囲を伝えることを意図している。したがって、本明細書に記載されるカルボン酸基質は、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20個の炭素原子を有するカルボン酸またはその誘導体を含むことができる。特定の実施形態では、C4~C20カルボン酸基質がC4~C20カルボン酸またはその塩であり得る。限定されないが、基質酸は、そのナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、アンモニウム塩などの形態であり得る。
本明細書に記載される方法によると、C4~C20カルボン酸基質は、4-ヒドロキシカルボン酸に変換され得る。カルボン酸基質はカルボン酸および/またはその誘導体であり得る。例えば、C4~C20カルボン酸基質は、C4~C20カルボン酸:C4~C20カルボン酸の塩;C4~C20カルボン酸のエステル;C4~C20カルボン酸のモノ-、ジ-もしくはトリグリセリド;またはこれらの組み合わせを含むことができる。本明細書で使用される場合、C4~C20は、4~20個の炭素原子を有する有機化合物を示す。C4~C20によって表される範囲は、それだけに限らないが、C5~C20、C6~C20、C7~C20、C8~C20、C9~C20、C10~C20、C6~C14、C7~C14、C8~C14、C9~C14、C10~C14等を含む、その中の任意の範囲を伝えることを意図している。したがって、本明細書に記載されるカルボン酸基質は、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20個の炭素原子を有するカルボン酸またはその誘導体を含むことができる。特定の実施形態では、C4~C20カルボン酸基質がC4~C20カルボン酸またはその塩であり得る。限定されないが、基質酸は、そのナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、アンモニウム塩などの形態であり得る。
C4~C20カルボン酸は、直鎖C4~C20カルボン酸、分岐C4~C20カルボン酸、飽和C4~C20カルボン酸、または不飽和C4~C20カルボン酸であり得る。C4~C20カルボン酸は、任意の置換が、カルボン酸のカルボニル炭素に対してアルファ、ベータ、またはガンマに位置する炭素原子にないという条件で、ヒドロキシル基およびアミノ基から選択される1またはそれを超える官能基で必要に応じて置換され得る(図1参照)。特定の実施形態では、C4~C20カルボン酸が直鎖完全飽和カルボン酸であり得る。
C4~C20カルボン酸の例としては、それだけに限らないが、ペンタン酸、ヘキサン酸、ヘプタン酸、オクタン酸、ノナン酸、デカン酸、ウンデカン酸、ドデカン酸、トリデカン酸、テトラデカン酸、ペンタデカン酸、ヘキサデカン酸、ヘプタデカン酸、オクタデカン酸、ノナデカン酸、エイコサン酸、ヘンエイコサン酸、ドコサン酸、トリコサン酸、テトラコサン酸、ペンタコサン酸、ヘキサコサン酸、ヘプタコサン酸、オクタコサン酸、ノナコサン酸、トリアコンタン酸、ヘントリアコンタン酸(henatriacontanoic acid)、ドトリアコンタン酸、トリトリアコンタン酸、テトラトリアコンタン酸、ペンタトリアコンタン酸、ヘキサトリアコンタン酸、ヘプタトリアコンタン酸、オクタトリアコンタン酸、ノナトリアコンタン酸、およびテトラコンタン酸が挙げられる。表1は、例示的な脂肪酸の一般名、構造式および脂質数を提供する。
不飽和C4~C20カルボン酸の例としては、ヘキセン酸、1-ヘプテン酸、2-ヘプテン酸、1-オクテン酸、2-オクテン酸、3-オクテン酸、1-ノネン酸、2-ノネン酸、3-ノネン酸、1-デセン酸、2-デセン酸、3-デセン酸、1-ウンデセン酸、2-ウンデセン酸、3-ウンデセン酸、1-ドデセン酸、2-ドデセン酸、3-ドデセン酸、1-トリデセン酸、2-トリデセン酸、3-トリデセン酸、1-テトラデセン酸、2-テトラデセン酸、および3-テトラデセン酸が挙げられる。
いくつかの実施形態では、カルボン酸基質を含む培地が緩衝液を含む。緩衝液の例としては、限定されないが、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、MOPS緩衝液、HEPES緩衝液、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、リンゴ酸緩衝液、MES緩衝液、ヒスチジン緩衝液、PIPES緩衝液、ビストリス緩衝液、およびエタノールアミン緩衝液が挙げられる。
いくつかの実施形態では、カルボン酸基質を含む培地が、基質の分散を助けるための界面活性剤を含む。界面活性剤の非限定的な例としては、ポリソルベート20(TWEEN(登録商標)20)、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート(TWEEN(登録商標)40)、4-(1,1,3,3-テトラメチルブチル)フェニル-ポリエチレングリコール(TRITON(登録商標)X-100)、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、エチルトリメチルアンモニウムブロミド(ETMAB)、ラウリルトリメチルアンモニウムブロミド(LTAB)、およびラウリルトリメチルアンモニウムクロリド(LTAC)が挙げられる。
カルボン酸基質を含む培地は、任意の濃度のカルボン酸基質を含み得る。いくつかの実施形態では、カルボン酸基質を含む培地が、0.5g/L~100g/Lのカルボン酸基質、例えば、1g/L~10g/Lのカルボン酸基質を含むことができる。いくつかの実施形態では、カルボン酸基質を含む培地が、0.5g/L、1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L、6g/L、7g/L、8g/L、9g/L、10g/L、20g/L、30g/L、40g/L、50g/L、60g/L、70g/L、80g/L、90g/Lまたは100g/Lのカルボン酸基質を含むことができる。
ラクトン
本明細書に記載される方法によると、カルボン酸基質が、本明細書に記載されるCYP450タンパク質の存在下で4-ヒドロキシカルボン酸に変換される。酸性にすると、4-ヒドロキシカルボン酸は対応するガンマラクトンに変換され得る。酸性化は、塩酸、酢酸などの酸で行うことができる。本開示によると、本明細書で提供される方法は、4-ヒドロキシカルボン酸を、限定されないが、γ-ヘキサラクトン、γ-ヘキセノラクトン、γ-ヘプタラクトン、γ-ヘプテノラクトン、γ-オクタラクトン、γ-オクテノラクトン、γ-ノナラクトン、γ-ノネノラクトン、γ-デカラクトン、γ-デカセノラクトン、γ-ウンデカラクトン、γ-ウンデセノラクトン、γ-ドデカラクトン、γ-ドデセノラクトン、γ-トリデカラクトン、γ-トリデセノラクトン、γ-テトラデカラクトン、およびγ-テトラデセノラクトンを含むさまざまなγ-ラクトンに変換することができる。
本明細書に記載される方法によると、カルボン酸基質が、本明細書に記載されるCYP450タンパク質の存在下で4-ヒドロキシカルボン酸に変換される。酸性にすると、4-ヒドロキシカルボン酸は対応するガンマラクトンに変換され得る。酸性化は、塩酸、酢酸などの酸で行うことができる。本開示によると、本明細書で提供される方法は、4-ヒドロキシカルボン酸を、限定されないが、γ-ヘキサラクトン、γ-ヘキセノラクトン、γ-ヘプタラクトン、γ-ヘプテノラクトン、γ-オクタラクトン、γ-オクテノラクトン、γ-ノナラクトン、γ-ノネノラクトン、γ-デカラクトン、γ-デカセノラクトン、γ-ウンデカラクトン、γ-ウンデセノラクトン、γ-ドデカラクトン、γ-ドデセノラクトン、γ-トリデカラクトン、γ-トリデセノラクトン、γ-テトラデカラクトン、およびγ-テトラデセノラクトンを含むさまざまなγ-ラクトンに変換することができる。
本明細書に記載される方法に従って生産されたガンマラクトンは、当技術分野で知られている任意の方法を使用して、細胞培養物から単離または精製することができる。例えば、ガンマラクトンは、溶媒抽出、蒸留、クロマトグラフィー分離、高圧液体クロマトグラフィーなどによって細胞培養物から単離または精製することができる。単離または精製されたラクトンは、製品、例えば、食品、飲料、香水または化粧品に組み込むことができる。
細胞系
本明細書で言及されるように、本方法による細胞系は、本明細書に記載されるCYP450タンパク質の発現を提供する任意の細胞を含むことができる。このような細胞系には、それだけに限らないが、細菌細胞、酵母細胞、植物細胞および動物細胞が含まれ得る。いくつかの実施形態では、細胞系が細菌細胞、酵母細胞またはこれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、細胞系が原核細胞、真核細胞およびこれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、細胞系がリボソームなどの細胞成分に基づくタンパク質のインビトロ発現を含む。
本明細書で言及されるように、本方法による細胞系は、本明細書に記載されるCYP450タンパク質の発現を提供する任意の細胞を含むことができる。このような細胞系には、それだけに限らないが、細菌細胞、酵母細胞、植物細胞および動物細胞が含まれ得る。いくつかの実施形態では、細胞系が細菌細胞、酵母細胞またはこれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、細胞系が原核細胞、真核細胞およびこれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、細胞系がリボソームなどの細胞成分に基づくタンパク質のインビトロ発現を含む。
本開示の細菌細胞には、限定されないが、以下が含まれる:Escherichia spp.、Streptomyces spp.、Zymomonas spp.、Acetobacter spp.、Citrobacter spp.、Synechocystis spp.、Rhizobium spp.、Clostridium spp.、Corynebacterium spp.、Streptococcus spp.、Xanthomonas spp.、Lactobacillus spp.、Lactococcus spp.、Bacillus spp.、Alcaligenes spp.、Pseudomonas spp.、Aeromonas spp.、Azotobacter spp.、Comamonas spp.、Mycobacterium spp.、Rhodococcus spp.、Gluconobacter
spp.、Ralstonia spp.、Acidithiobacillus spp.、Microlunatus spp.、Geobacter spp.、Geobacillus spp.、Arthrobacter spp.、Flavobacterium spp.、Serratia spp.、Saccharopolyspora spp.、Thermus spp.、Stenotrophomonas spp.、Chromobacterium spp.、Sinorhizobium spp.、Saccharopolyspora spp.、Agrobacterium
spp.、Pantoea spp.およびVibrio natriegens。
spp.、Ralstonia spp.、Acidithiobacillus spp.、Microlunatus spp.、Geobacter spp.、Geobacillus spp.、Arthrobacter spp.、Flavobacterium spp.、Serratia spp.、Saccharopolyspora spp.、Thermus spp.、Stenotrophomonas spp.、Chromobacterium spp.、Sinorhizobium spp.、Saccharopolyspora spp.、Agrobacterium
spp.、Pantoea spp.およびVibrio natriegens。
本開示の酵母細胞には、限定されないが、操作されたSaccharomyces spp.、Schizosaccharomyces、Hansenula、Candida、Kluyveromyces、Yarrowia、Candida boidiniiおよびPichiaが含まれる。本開示によると、本明細書で請求される酵母は、菌界のメンバーとして分類される真核生物の単細胞微生物である。酵母は、多細胞の祖先から進化した単細胞生物であるが、本開示に有用ないくつかの種は、仮性菌糸または偽菌糸として知られる接続された出芽細胞のストリングを形成することによって多細胞特性を発達させる能力を有するものである。
いくつかの実施形態では、細胞ペレットが、CYP450を発現する細胞系から収穫される。いくつかの実施形態では、細胞ペレットが、さまざまな濃度で再懸濁され得る。いくつかの実施形態では、細胞ペレットが、1g/L~250g/Lの濃度で再懸濁される。いくつかの実施形態では、細胞系から収穫された細胞ペレットが、1g/L、10g/L、25g/L、50g/L、75g/L、100g/L、125g/L、150g/L、175g/L、200g/L、225 g/Lまたは250g/Lの濃度で再懸濁される。
細胞培養物
細胞培養物は、培養物中の任意の細胞を指す。培養またはインキュベートは、細胞を制御された条件下で、典型的にはその天然環境の外で増殖させるプロセスである。例えば、酵母細胞などの細胞は、液体栄養ブロス中の細胞懸濁液として増殖させられ得る。細胞培養物には、それだけに限らないが、細菌細胞培養物、酵母細胞培養物、植物細胞培養物および動物細胞培養物が含まれる。いくつかの実施形態では、細胞培養物が細菌細胞、酵母細胞またはこれらの組み合わせを含む。
細胞培養物は、培養物中の任意の細胞を指す。培養またはインキュベートは、細胞を制御された条件下で、典型的にはその天然環境の外で増殖させるプロセスである。例えば、酵母細胞などの細胞は、液体栄養ブロス中の細胞懸濁液として増殖させられ得る。細胞培養物には、それだけに限らないが、細菌細胞培養物、酵母細胞培養物、植物細胞培養物および動物細胞培養物が含まれる。いくつかの実施形態では、細胞培養物が細菌細胞、酵母細胞またはこれらの組み合わせを含む。
本開示の細菌細胞培養物は、それだけに限らないが、以下を含む細菌細胞を含む:Escherichia spp.、Streptomyces spp.、Zymomonas spp.、Acetobacter spp.、Citrobacter spp.、Synechocystis spp.、Rhizobium spp.、Clostridium spp.、Corynebacterium spp.、Streptococcus spp.、Xanthomonas spp.、Lactobacillus spp.、Lactococcus spp.、Bacillus spp.、Alcaligenes spp.、Pseudomonas spp.、Aeromonas spp.、Azotobacter spp.、Comamonas spp.、Mycobacterium spp.、Rhodococcus spp.、Gluconobacter spp.、Ralstonia spp.、Acidithiobacillus spp.、Microlunatus spp.、Geobacter spp.、Geobacillus spp.、Arthrobacter spp.、Flavobacterium spp.、Serratia spp.、Saccharopolyspora spp.、Thermus spp.、Stenotrophomonas spp.、Chromobacterium spp.、Sinorhizobium spp.、Saccharopolyspora spp.、Agrobacterium spp.、Pantoea sppおよびVibrio natriegens。
本開示の酵母細胞培養物は、それだけに限らないが、Saccharomyces spp.、Schizosaccharomyces、Hansenula、Candida、Kluyveromyces、Yarrowia、Candida boidiniiおよびPichiaを含む酵母細胞を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される細胞培養物が、当技術分野で知られている1またはそれを超える栄養物質を含む水性培地であり得る。このような液体培地は、1またはそれを超える炭素源、窒素源、無機塩および/または成長因子を含むことができる。適切な炭素源には、グルコース、フルクトース、キシロース、スクロース、マルトース、ラクトース、マンニトール、ソルビトール、グリセロールおよびコーンシロップが含まれ得る。適切な窒素源の例としては、ペプトン、コーンスティープリカー、ミーンエキストラクト(mean extract)、イーストエキストラクト、カゼイン、尿素、アミノ酸、アンモニウム塩、硝酸塩およびこれらの混合物などの有機および無機窒素含有物質が挙げられ得る。無機塩の例としては、リン酸塩、硫酸塩、マグネシウム、ナトリウム、カルシウムおよびカリウム塩が挙げられ得る。液体培地はまた、1またはそれを超えるビタミンおよび/またはミネラルを含むことができる。
いくつかの実施形態では、細胞が16℃~40℃の温度で培養される。例えば、細胞は、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃または40℃の温度で培養され得る。
いくつかの実施形態では、細胞が、約3~約9のpH範囲、好ましくは約4~約8の範囲で培養される。pHは、塩酸、酢酸、水酸化ナトリウム、炭酸カルシウム、アンモニアなどの無機もしくは有機酸または塩基の添加によって、あるいはリン酸、フタル酸またはTris(登録商標)などの緩衝液の添加によって調整することができる。
いくつかの実施形態では、細胞が、0.5時間~96時間、またはそれを超えた期間培養される。例えば、細胞は、12、18、24、30、36、42、48、54、60、66または72時間の期間培養され得る。典型的には、細菌細胞などの細胞が12~24時間の期間培養される。いくつかの実施形態では、細胞が37℃の温度で12~24時間培養される。いくつかの実施形態では、細胞が16℃の温度で12~24時間培養される。
いくつかの実施形態では、細胞が、1×108(OD600<1)~2×1011(OD約200)の生細胞/ml細胞培養培地の密度まで培養される。いくつかの実施形態では、細胞が、1×108、2×108、3×108、4×108、5×108、6×108、7×108、8×108、9×108、1×109、2x109、3x109、4x109、5x109、6x109、7x109、8x109、9x109、1x1010、2x1010、3x1010、4x1010、5x1010、6x1010、7x1010、8x1010、9x1010、1x1011または2x1011生細胞/mlの密度まで培養される。(換算係数:OD 1=8x108細胞/ml)。
合成生物学
ここで使用される標準的な組換えDNAおよび分子クローニング技術は当技術分野で周知であり、例えば、各々の全体がこれにより参照により本明細書に組み込まれる、Sambrook,J.、Fritsch,E.F.およびManiatis,T.Molecular Cloning:A Laboratory Manual、第2版;Cold Spring Harbor Laboratory:Cold Spring Harbor、N.Y.、1989(以下「Maniatis」);およびSilhavy,T.J.、Bennan,M.L.およびEnquist,L.W.Experiments with Gene Fusions;Cold Spring Harbor
Laboratory:Cold Spring Harbor、N.Y.、1984;およびAusubel,F.M.ら、In Current Protocols in Molecular Biology、Greene Publishing and Wiley-Interscienceによって出版、1987によって記載されている。
ここで使用される標準的な組換えDNAおよび分子クローニング技術は当技術分野で周知であり、例えば、各々の全体がこれにより参照により本明細書に組み込まれる、Sambrook,J.、Fritsch,E.F.およびManiatis,T.Molecular Cloning:A Laboratory Manual、第2版;Cold Spring Harbor Laboratory:Cold Spring Harbor、N.Y.、1989(以下「Maniatis」);およびSilhavy,T.J.、Bennan,M.L.およびEnquist,L.W.Experiments with Gene Fusions;Cold Spring Harbor
Laboratory:Cold Spring Harbor、N.Y.、1984;およびAusubel,F.M.ら、In Current Protocols in Molecular Biology、Greene Publishing and Wiley-Interscienceによって出版、1987によって記載されている。
細菌生産系
原核生物におけるタンパク質の発現は、ほとんどの場合、融合タンパク質または非融合タンパク質のいずれかの発現を指示する構成的または誘導性プロモーターを含むベクターを用いて細菌宿主細胞で行われる。融合ベクターは、そこにコードされるタンパク質、通常は組換えタンパク質のアミノ末端にいくつかのアミノ酸を付加する。このような融合ベクターは、典型的には、以下の3つの目的にかなう:1)組換えタンパク質の発現を増加させる;2)組換えタンパク質の溶解度を増加させる;および3)アフィニティー精製においてリガンドとして作用することによって、組換えタンパク質の精製を助ける。通常、タンパク質分解切断部位を融合部分と組換えタンパク質の接合部で導入して、融合タンパク質の精製に続いて融合部分から組換えタンパク質を分離できるようにする。このようなベクターは、本開示の範囲内にある。
原核生物におけるタンパク質の発現は、ほとんどの場合、融合タンパク質または非融合タンパク質のいずれかの発現を指示する構成的または誘導性プロモーターを含むベクターを用いて細菌宿主細胞で行われる。融合ベクターは、そこにコードされるタンパク質、通常は組換えタンパク質のアミノ末端にいくつかのアミノ酸を付加する。このような融合ベクターは、典型的には、以下の3つの目的にかなう:1)組換えタンパク質の発現を増加させる;2)組換えタンパク質の溶解度を増加させる;および3)アフィニティー精製においてリガンドとして作用することによって、組換えタンパク質の精製を助ける。通常、タンパク質分解切断部位を融合部分と組換えタンパク質の接合部で導入して、融合タンパク質の精製に続いて融合部分から組換えタンパク質を分離できるようにする。このようなベクターは、本開示の範囲内にある。
ある実施形態では、発現ベクターが、細菌細胞における組換えポリペプチドの発現のためにそれらの遺伝子要素を含む。細菌細胞における転写および翻訳のための要素は、プロモーター、タンパク質複合体のコード領域および転写ターミネーターを含むことができる。
当業者は、発現ベクターの調製に利用可能な分子生物学技術を知っているだろう。本明細書に記載される、本技術の発現ベクターへの組み込みに使用されるポリヌクレオチドは、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)などの日常的な技術によって調製することができる。
相補的付着末端を介してDNAをベクターに作動可能に連結するために、いくつかの分子生物学技術が開発されてきた。一実施形態では、相補的ホモポリマー区域を、ベクターDNAに挿入される核酸分子に付加することができる。次いで、ベクターと核酸分子を、相補的ホモポリマーテール間の水素結合によって結合して、組換えDNA分子を形成する。
代替実施形態では、提供される1つまたは複数の制限部位を含む合成リンカーを使用して、本技術のポリヌクレオチドを発現ベクターに作動可能に連結する。ある実施形態では、ポリヌクレオチドを、制限エンドヌクレアーゼ消化によって生成する。ある実施形態では、核酸分子を、3’-5’-エキソヌクレアーゼ活性を有する突出3’一本鎖末端を除去し、重合活性を有する陥凹3’末端を埋めて、それによって平滑末端DNAセグメントを生成する酵素であるバクテリオファージT4 DNAポリメラーゼまたは大腸菌(E.coli)DNAポリメラーゼIで処理する。次いで、平滑末端セグメントを、バクテリオファージT4 DNAリガーゼなどの平滑末端DNA分子のライゲーションを触媒することができる酵素の存在下で、大モル過剰のリンカー分子と共にインキュベートする。したがって、反応の生成物は、その末端にポリマーリンカー配列を有するポリヌクレオチドである。次いで、これらのポリヌクレオチドを、適切な制限酵素で切断し、ポリヌクレオチドの末端と適合性の末端を生成する酵素で切断された発現ベクターに連結する。
あるいは、ライゲーション非依存クローニング(LIC)部位を有するベクターを使用することができる。その場合、必要なPCR増幅ポリヌクレオチドを制限消化もライゲーションもなしでLICベクターにクローニングすることができる(本明細書と矛盾のない程度に参照により本明細書に組み込まれる、Aslanidisおよびde Jong、Nucl.Acid.Res.18 6069-74、(1990)、Haunら、Biotechniques 13、515-18(1992))。
ある実施形態では、選択されたプラスミドへの挿入のために目的のポリヌクレオチドを単離および/または改変するために、PCRを使用することが適切である。配列のPCR調製に使用するための適切なプライマーは、核酸分子の必要なコード領域を単離し、制限エンドヌクレアーゼまたはLIC部位を付加し、コード領域を所望のリーディングフレームに配置するように設計することができる。
ある実施形態では、本技術の発現ベクターに組み込むためのポリヌクレオチドを、適切なオリゴヌクレオチドプライマーを使用するPCRを使用することによって調製する。コード領域が増幅され、プライマー自体は増幅された配列産物に組み込まれる。ある実施形態では、増幅プライマーが、制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含み、これにより、増幅された配列産物を適切なベクターにクローニングすることが可能になる。
発現ベクターは、従来の形質転換またはトランスフェクション技術によって植物または微生物宿主細胞に導入することができる。本技術の発現ベクターによる適切な細胞の形質転換は、当技術分野で知られている方法によって達成され、典型的には、ベクターと細胞の両方のタイプに依存する。適切な技術には、リン酸カルシウムもしくは塩化カルシウム共沈、DEAE-デキストランを介したトランスフェクション、リポフェクション、ケモポレーション(chemoporation)またはエレクトロポレーションが含まれる。
首尾よく形質転換された細胞、すなわち、発現ベクターを含む細胞は、当技術分野で周知の技術によって同定することができる。例えば、本技術の発現ベクターでトランスフェクトされた細胞を培養して、本明細書に記載されるポリペプチドを生産することができる。当技術分野で周知の技術によって、発現ベクターDNAの存在について細胞を調べることができる。
宿主細胞は、前記の発現ベクターの単一コピー、あるいは、発現ベクターの複数のコピーを含むことができる。
いくつかの実施形態では、形質転換細胞が、細菌細胞、酵母細胞、藻類細胞、真菌細胞、植物細胞、昆虫細胞または動物細胞であり得る。いくつかの実施形態では、細胞が、カノーラ植物細胞、菜種植物細胞、ヤシ植物細胞、ヒマワリ植物細胞、ワタ植物細胞、トウモロコシ植物細胞、落花生植物細胞、亜麻植物細胞、ゴマ植物細胞、大豆植物細胞、およびペチュニア植物細胞からなる群から選択される植物細胞である。
いくつかの実施形態では、形質転換細胞が、細菌細胞、酵母細胞、藻類細胞、真菌細胞、植物細胞、昆虫細胞または動物細胞であり得る。いくつかの実施形態では、細胞が、カノーラ植物細胞、菜種植物細胞、ヤシ植物細胞、ヒマワリ植物細胞、ワタ植物細胞、トウモロコシ植物細胞、落花生植物細胞、亜麻植物細胞、ゴマ植物細胞、大豆植物細胞、およびペチュニア植物細胞からなる群から選択される植物細胞である。
外来タンパク質の高レベルの発現を指示する調節配列を含む微生物宿主細胞発現系および発現ベクターは、当業者に周知である。これらのいずれかを使用して、微生物宿主細胞における本技術の組換えポリペプチドの発現のためのベクターを構築することができる。次いで、これらのベクターを、形質転換を介して適切な微生物に導入して、本技術の組換えポリペプチドの高レベルの発現を可能にすることができる。
適切な微生物宿主細胞の形質転換に有用なベクターまたはカセットは、当技術分野で周知である。典型的には、ベクターまたはカセットは、関連するポリヌクレオチドの転写および翻訳を指示する配列、選択マーカー、ならびに自律複製または染色体組込みを可能にする配列を含む。適切なベクターは、転写開始制御を有するポリヌクレオチドの領域5’および転写終結を制御するDNAフラグメントの領域3’を含む。両制御領域が、形質転換宿主細胞に相同な遺伝子に由来することが好ましいが、このような制御領域が、宿主として選択された特定の種に固有の遺伝子に由来する必要はないことが理解されるべきである。
所望の微生物宿主細胞における組換えポリペプチドの発現を駆動するのに有用な開始制御領域またはプロモーターは多数あり、当業者によく知られている。それだけに限らないが、CYCI、HIS3、GALI、GALIO、ADHI、PGK、PH05、GAPDH、ADCI、TRPI、URA3、LEU2、ENO、TPI(Saccharomycesでの発現に有用);AOXI(Pichiaでの発現に有用);ならびにlac、trp、JPL、IPR、T7、tacおよびtrc(大腸菌(Escherichia coli)での発現に有用)を含む、これらの遺伝子を駆動することができる事実上いずれのプロモーターも本技術に適している。
終結制御領域はまた、微生物宿主に固有のさまざまな遺伝子に由来し得る。終結部位を必要に応じて本明細書に記載される微生物宿主のために含めることができる。
植物細胞では、本技術の発現ベクターが、発達の所望の段階で、所望の組織で、本技術の組換えポリペプチドの発現を指示することができるプロモーターに作動可能に連結されたコード領域を含むことができる。便宜上、発現されるポリヌクレオチドは、同じポリヌクレオチドに由来するプロモーター配列および翻訳リーダー配列を含み得る。転写終結シグナルをコードする3’非コード配列も存在すべきである。発現ベクターはまた、ポリヌクレオチド発現を促進するために、1またはそれを超えるイントロンを含み得る。
植物宿主細胞の場合、コード領域の発現を誘導することができる任意のプロモーターと任意のターミネーターの任意の組み合わせを、本技術のベクター配列で使用することができる。プロモーターおよびターミネーターのいくつかの適切な例としては、ノパリンシンターゼ(nos)、オクトピンシンターゼ(ocs)およびカリフラワーモザイクウイルス(CaMV)遺伝子からのものが挙げられる。使用され得る効率的な植物プロモーターの1つのタイプは、高レベル植物プロモーターである。このようなプロモーターは、本技術の発現ベクターと作動可能に連結して、ベクターの発現を促進することができるはずである。本技術で使用され得る高レベル植物プロモーターには、例えば大豆由来のリブロース-1,5-二リン酸カルボキシラーゼの小サブユニットのプロモーター(本明細書と矛盾のない程度に全体がこれにより本明細書に組み込まれる、Berry-Loweら、J.Molecular and App.Gen.、1:483-98(1982)、およびクロロフィル結合タンパク質のプロモーターが含まれる。これらの2つのプロモーターは、植物細胞で光誘導されることが知られている(例えば、本明細書と矛盾のない程度に各々がこれにより参照により本明細書に組み込まれる、Genetic Engineering of Plants,an Agricultural Perspective、A.Cashmore、Plenum、N.Y.(1983)、29~38頁;Coruzzi,G.ら、The Journal of Biological Chemistry、258:1399(1983)およびDunsmuir,P.ら、Journal of Molecular and Applied Genetics、2:285(1983)参照)。
同一性スコアリングを使用した配列類似性の分析
本明細書で使用される場合、「配列同一性」は、2つの最適に整列されたポリヌクレオチドまたはペプチド配列が、成分、例えば、ヌクレオチドまたはアミノ酸のアラインメントのウィンドウ全体にわたって不変である程度を指す。試験配列と参照配列の整列されたセグメントの「同一性の割合(identity fraction)」は、2つの整列された配列によって共有される同一の成分の数を、参照配列セグメント内の成分の総数、すなわち、参照配列全体または参照配列のより小さな規定の部分で割ったものである。
本明細書で使用される場合、「配列同一性」は、2つの最適に整列されたポリヌクレオチドまたはペプチド配列が、成分、例えば、ヌクレオチドまたはアミノ酸のアラインメントのウィンドウ全体にわたって不変である程度を指す。試験配列と参照配列の整列されたセグメントの「同一性の割合(identity fraction)」は、2つの整列された配列によって共有される同一の成分の数を、参照配列セグメント内の成分の総数、すなわち、参照配列全体または参照配列のより小さな規定の部分で割ったものである。
本明細書で使用される場合、「パーセント配列同一性(percent sequence identity)」または「パーセント同一性(percent identity)」という用語は、(比較窓全体で参照配列の合計20パーセント未満の適切なヌクレオチドの挿入、欠失またはギャップにより)2つの配列を最適に整列させた場合の、試験(「本」)ポリヌクレオチド分子(またはその相補鎖)と比較した参照(「クエリ」)ポリヌクレオチド分子(またはその相補鎖)の線形ポリヌクレオチド配列中の同一ヌクレオチドのパーセンテージを指す。比較窓を整列させるための配列の最適なアラインメントは、当業者に周知であり、SmithおよびWatermanの局地的相同性アルゴリズム、NeedlemanおよびWunschの相同性アラインメントアルゴリズム、PearsonおよびLipmanの類似性の検索方法などのツールによって、好ましくはGCG(登録商標)Wisconsin Package(登録商標)(Accelrys
Inc.、マサチューセッツ州バーリントン)の一部として利用可能なGAP、BESTFIT、FASTAおよびTFASTAなどのこれらのアルゴリズムのコンピューター化された実装によって行われ得る。試験配列と参照配列の整列されたセグメントの「同一性の割合(identity fraction)」は、2つの整列された配列によって共有される同一の成分の数を、参照配列セグメント内の成分の総数、すなわち、参照配列全体または参照配列のより小さな規定の部分で割ったものである。パーセント配列同一性は、同一性の割合に100を掛けたものとして表される。1またはそれを超えるポリヌクレオチド配列の比較は、完全長ポリヌクレオチド配列もしくはその一部、またはより長いポリヌクレオチド配列に対するものであり得る。本開示の目的のために、「パーセント同一性(percent identity)」はまた、翻訳されたヌクレオチド配列についてはBLASTXバージョン2.0、ポリヌクレオチド配列についてはBLASTNバージョン2.0を使用して決定され得る。
Inc.、マサチューセッツ州バーリントン)の一部として利用可能なGAP、BESTFIT、FASTAおよびTFASTAなどのこれらのアルゴリズムのコンピューター化された実装によって行われ得る。試験配列と参照配列の整列されたセグメントの「同一性の割合(identity fraction)」は、2つの整列された配列によって共有される同一の成分の数を、参照配列セグメント内の成分の総数、すなわち、参照配列全体または参照配列のより小さな規定の部分で割ったものである。パーセント配列同一性は、同一性の割合に100を掛けたものとして表される。1またはそれを超えるポリヌクレオチド配列の比較は、完全長ポリヌクレオチド配列もしくはその一部、またはより長いポリヌクレオチド配列に対するものであり得る。本開示の目的のために、「パーセント同一性(percent identity)」はまた、翻訳されたヌクレオチド配列についてはBLASTXバージョン2.0、ポリヌクレオチド配列についてはBLASTNバージョン2.0を使用して決定され得る。
配列同一性のパーセントは、好ましくは、Sequence Analysis Software Package(商標)(バージョン10;Genetics Computer Group,Inc.、ウィスコンシン州マディソン)の「Best Fit」または「Gap」プログラムを使用して決定される。「Gap」は、NeedlemanおよびWunschのアルゴリズム(NeedlemanおよびWunsch、Journal of Molecular Biology 48:443-53、1970)を利用して、一致数を最大化し、ギャップ数を最小化する2つの配列のアラインメントを見出す。「BestFit」は、SmithおよびWatermanの局地的相同性アルゴリズムを使用して、2つの配列間の類似性の最良のセグメントの最適なアラインメントを実施し、ギャップを挿入して一致数を最大化する(SmithおよびWaterman、Advances in Applied Mathematics、2:482-489、1981、Smithら、Nucleic Acids Research 11:2205-2220、1983)。パーセント同一性は、最も好ましくは「Best
Fit」プログラムを使用して決定される。
Fit」プログラムを使用して決定される。
配列同一性を決定するための有用な方法は、20894メリーランド州ベセスダにある国立衛生研究所の国立医学図書館のアメリカ国立生物工学情報センター(NCBI)から公的に入手可能なBasic Local Alignment Search Tool(BLAST)プログラム;BLAST Manual、Altschulら、NCBI、NLM、NIH;Altschulら、J.Mol.Biol.215:403-10(1990)参照にも開示されており;BLASTプログラムのバージョン2.0またはそれを超えるバージョンは、ギャップ(欠失および挿入)のアラインメントへの導入を可能にし;ペプチド配列については、BLASTXを使用して配列同一性を決定することができ;ポリヌクレオチド配列については、BLASTNを使用して配列同一性を決定することができる。
本明細書で使用される場合、「実質的なパーセント配列同一性(substantial percent sequence identity)」という用語は、少なくとも約70%の配列同一性、少なくとも約80%の配列同一性、少なくとも約85%の同一性、少なくとも約90%の配列同一性、またはさらに大きな配列同一性、例えば約98%または約99%の配列同一性のパーセント配列同一性を指す。したがって、本開示の一実施形態は、本明細書に記載されるポリヌクレオチド配列と少なくとも約70%の配列同一性、少なくとも約80%の配列同一性、少なくとも約85%の同一性、少なくとも約90%の配列同一性、またはさらに大きな配列同一性、例えば約98%または約99%の配列同一性を有するポリヌクレオチド分子である。本開示のシトクロムP450遺伝子の活性を有するポリヌクレオチド分子は、さまざまなγ-およびデルタ-ラクトンの生産を指示することができ、このようなポリヌクレオチド分子は、本明細書で提供されるポリヌクレオチド配列と実質的なパーセント配列同一性を有することができ、本開示の範囲内に包含される。
同一性および類似性
同一性は、配列のアラインメント後の配列のペア間で同じであるアミノ酸の割合であり(これは、配列情報または構造情報またはいくらかの他の情報のみを使用して行うことができるが、通常は配列情報のみに基づく)、類似性は、ある類似性マトリックスを使用したアラインメントに基づいて割り当てられたスコアである。類似性指数は、以下のBLOSUM62、PAM250もしくはGONNETのいずれか1つ、またはタンパク質の配列アラインメントのために当業者によって使用される任意のマトリックスであり得る。
同一性は、配列のアラインメント後の配列のペア間で同じであるアミノ酸の割合であり(これは、配列情報または構造情報またはいくらかの他の情報のみを使用して行うことができるが、通常は配列情報のみに基づく)、類似性は、ある類似性マトリックスを使用したアラインメントに基づいて割り当てられたスコアである。類似性指数は、以下のBLOSUM62、PAM250もしくはGONNETのいずれか1つ、またはタンパク質の配列アラインメントのために当業者によって使用される任意のマトリックスであり得る。
同一性は、2つの部分配列間の対応の程度である(配列間にギャップはない)。25%またはそれを超える同一性は機能の類似性を意味し、18~25%は構造または機能の類似性を意味する。2つの完全に無関係またはランダムな配列(100残基を超える)が、20%を超える同一性を有する可能性があることに留意されたい。類似性は、2つの配列を比較した場合の類似度である。これはその同一性に依存する。
本明細書で使用される用語の説明:
本明細書で使用される場合、単数形「a、an」および「the」は、文脈が明確に別段の指示をしない限り、複数の言及を含む。
本明細書で使用される場合、単数形「a、an」および「the」は、文脈が明確に別段の指示をしない限り、複数の言及を含む。
「含む(include)」、「有する(have)」などの用語が明細書または特許請求の範囲で使用される限り、このような用語は、「含む(comprise)」が請求項の移行語として使用される場合に解釈されるように、「含む(comprise)」という用語と同様の方法で包括的であることを意図している。
「例示的(exemplary)」という単語は、本明細書では、「例、実例または例示として役立つ」ことを意味するために使用される。本明細書で「例示的(exemplary)」として記載される任意の実施形態は、必ずしも他の実施形態よりも好ましいまたは有利であると解釈されるべきではない。
「相補的(complementary)」という用語は、当業者にその通常の慣用的な意味を与えられるべきであり、限定されないが、互いにハイブリダイズすることができるヌクレオチド塩基間の関係を説明するために使用される。例えば、DNAに関して、アデノシンはチミンに相補的であり、シトシンはグアニンに相補的である。したがって、本技術には、添付の配列表に報告されている完全な配列に相補的な単離された核酸フラグメント、ならびに実質的に類似の核酸配列も含まれる。
「核酸(nucleic acid)」および「ヌクレオチド(nucleotide)」という用語は、当業者にそれぞれの通常の慣用的な意味を与えられるべきであり、限定されないが、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよびそれらの一本鎖もしくは二本鎖形態のポリマーを指すために使用される。特に限定されない限り、この用語は、参照核酸と同様の結合特性を有し、天然に存在するヌクレオチドと同様の方法で代謝される天然ヌクレオチドの既知の類似体を含む核酸を包含する。別段の指示がない限り、特定の核酸配列はまた、その保存的改変または縮重変異体(例えば、縮重コドン置換)および相補的配列、ならびに明示的に示された配列も暗黙的に包含する。
「コード配列(coding sequence)」は、当業者にその通常の慣用的な意味を与えられるべきであり、限定されないが、特定のアミノ酸配列をコードするDNA配列を指すために使用される。
「単離された(isolated)」という用語は、当業者にその通常の慣用的な意味を与えられるべきであり、単離された核酸または単離されたポリペプチドの文脈で使用される場合、限定されないが、人の手によって、その天然の環境から離れて存在し、したがって天然の産物ではない核酸またはポリペプチドを指すために使用される。単離された核酸またはポリペプチドは、精製形態で存在することができる、または、例えば、トランスジェニック宿主細胞などの非天然環境に存在することができる。
本明細書で使用される「インキュベートする(incubating)」および「インキュベーション(incubation)」という用語は、2またはそれを超える化学的または生物学的実体(化合物および酵素など)を混合し、所望の生成物を生成するのに好ましい条件下でこれらが相互作用することを可能にするプロセスを意味する。
「縮重変異体(degenerate variant)」という用語は、1またはそれを超える縮重コドン置換によって参照核酸配列とは異なる残基配列を有する核酸配列を指す。縮重コドン置換は、1またはそれを超える選択された(または全ての)コドンの3番目の位置が混合塩基および/またはデオキシイノシン残基で置換されている配列を生成することによって達成することができる。核酸配列とその縮重変異体の全ては、同じアミノ酸またはポリペプチドを発現する。
「ポリペプチド(polypeptide)」、「タンパク質(protein)」、および「ペプチド(peptide)」という用語は、当業者にそれぞれの通常の慣用的な意味を与えられるべきであり、3つの用語は時々互換的に使用され、限定されないが、そのサイズまたは機能に関係なく、アミノ酸またはアミノ酸類似体のポリマーを指すために使用される。「タンパク質(protein)」は通常、比較的大きなポリペプチドに関して使用され、「ペプチド(peptide)」は通常、小さなポリペプチドに関して使用されるが、当技術分野におけるこれらの用語の使用は重複し、変化する。本明細書で使用される「ポリペプチド(polypeptide)」という用語は、特に注記しない限り、ペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質を指す。「タンパク質(protein)」、「ポリペプチド(polypeptide)」、および「ペプチド(peptide)」という用語は、ポリヌクレオチド産物を指す場合、本明細書では互換的に使用される。したがって、例示的なポリペプチドには、ポリヌクレオチド産物、天然に存在するタンパク質、ホモログ、オルソログ、パラログ、フラグメントおよび他の同等物、変異体、ならびに前記の類似体が含まれる。
参照ポリペプチドに関して使用される場合、「ポリペプチドフラグメント(polypeptide fragment)」および「フラグメント(fragment)」という用語は、当業者にそれらの通常の慣用的な意味を与えられるべきであり、限定されないが、アミノ酸残基が参照ポリペプチド自体と比較して欠失しているが、残りのアミノ酸配列が参照ポリペプチド中の対応する位置と通常同一であるポリペプチドを指すために使用される。このような欠失は、参照ポリペプチドのアミノ末端もしくはカルボキシ末端、またはその両方で起こり得る。
ポリペプチドまたはタンパク質の「機能的フラグメント(functional fragment)」という用語は、完全長ポリペプチドまたはタンパク質の一部であり、実質的に同じ生物学的活性を有する、または完全長ポリペプチドもしくはタンパク質と実質的に同じ機能を実行する(例えば、同じ酵素反応を実行する)ペプチドフラグメントを指す。
互換的に使用される「変異体ポリペプチド(variant polypeptide)」、「改変アミノ酸配列(modified amino acid sequence)」または「改変ポリペプチド(modified polypeptide)」という用語は、1またはそれを超えるアミノ酸、例えば1またはそれを超えるアミノ酸置換、欠失および/または付加によって参照ポリペプチドとは異なるアミノ酸配列を指す。ある態様では、変異体が、参照ポリペプチドの能力の一部または全てを保持する「機能的変異体(functional variant)」である。
「機能的変異体(functional variant)」という用語は、保守的に置換された変異体をさらに含む。「保存的に置換された変異体(conservatively substituted variant)」という用語は、1またはそれを超える保存的アミノ酸置換によって参照ペプチドとは異なり、参照ペプチドの活性の一部または全てを維持するアミノ酸配列を有するペプチドを指す。「保存的アミノ酸置換(conservative amino acid substitution)」は、アミノ酸残基の機能的に類似した残基による置換である。保存的置換の例としては、イソロイシン、バリン、ロイシンもしくはメチオニンなどのある非極性(疎水性)残基の別の残基への置換;アルギニンとリジンの間、グルタミンとアスパラギンの間、スレオニンとセリンの間など、ある荷電もしくは極性(親水性)残基の別の残基への置換;リジンもしくはアルギニンなどのある塩基性残基の別の残基への置換;またはアスパラギン酸もしくはグルタミン酸などのある酸性残基の別の残基への置換;またはフェニルアラニン、チロシンもしくはトリプトファンなどのある芳香族残基の別の残基への置換が挙げられる。このような置換は、タンパク質またはポリペプチドの見かけの分子量にも等電点にもほとんどまたは全く影響を及ぼさないと予想される。「保存的に置換された変異体(conservatively substituted variant)」という句はまた、得られるペプチドが本明細書に記載される参照ペプチドの活性の一部または全てを維持する限り、残基が化学的に誘導体化された残基で置き換えられているペプチドを含む。
本技術のポリペプチドに関連する「変異体(variant)」という用語は、参照ポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも75%、少なくとも76%、少なくとも77%、少なくとも78%、少なくとも79%、少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、さらには100%同一であるアミノ酸配列を有する機能的に活性なポリペプチドをさらに含む。
本技術の変異体ポリペプチド配列に関する「パーセント(%)アミノ酸配列同一性(percent(%)amino acid sequence identity)」は、配列を整列させ、必要に応じて、最大パーセント配列同一性を達成するためにギャップを導入した後の、参照ポリペプチドのアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージを指し、いかなる保存的置換も配列同一性の一部として考慮しない。
パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的でのアラインメントは、当業者の技能の範囲内のさまざまな方法で、例えば、BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2またはMegalign(DNASTAR)ソフトウェアなどの公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して達成することができる。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。例えば、%アミノ酸配列同一性は、配列比較プログラムNCBI-BLAST2を使用して決定され得る。NCBI-BLAST2配列比較プログラムは、ncbi.nlm.nih.govからダウンロードされ得る。NCBI BLAST2は、いくつかの検索パラメータを使用し、これらの検索パラメータの全てが、例えば、アンマスク(unmask)はい(yes)、鎖=全て、予想される発生10、最小低複雑性長=15/5、マルチパスe値=0.01、マルチパスの定数=25、最終ギャップアラインメントのドロップオフ=25およびスコアリングマトリックス=BLOSUM62を含むデフォルト値に設定される。NCBI-BLAST2がアミノ酸配列の比較に使用される状況では、所与のアミノ酸配列Aの所与のアミノ酸配列Bへの、これとの、またはこれに対する%アミノ酸配列同一性(あるいは、所与のアミノ酸配列Bへ、これと、またはこれに対して所定の%アミノ酸配列同一性を有するまたは含む所与のアミノ酸配列Aと表現することができる)が、以下の通り計算される:分数X/Yの100倍(式中、Xは、配列アラインメントプログラムNCBI-BLAST2によって、AとBのそのプログラムのアラインメントにおいて同一マッチとしてスコアリングされたアミノ酸残基の数であり、YはBのアミノ酸残基の総数である)。アミノ酸配列Aの長さがアミノ酸配列Bの長さと等しくない場合、AのBへの%アミノ酸配列同一性が、BのAへの%アミノ酸配列同一性と等しくないことが理解されるだろう。
この意味で、アミノ酸配列の「類似性(similarity)」を決定するための技術は当技術分野で周知である。一般に、「類似性(similarity)」は、アミノ酸が同一である、あるいは電荷または疎水性などの類似の化学的および/または物理的特性を有する適切な場所での2またはそれを超えるポリペプチドの正確なアミノ酸対アミノ酸の比較を指す。そのため、いわゆる「パーセント類似性(percent similarity)」を、比較されるポリペプチド配列間で決定することができる。核酸およびアミノ酸配列の同一性を決定するための技術も当技術分野で周知であり、これらはその遺伝子のmRNAのヌクレオチド配列を決定し(通常はcDNA中間体を介して)、そこにコードされるアミノ酸配列を決定し、これを第2のアミノ酸配列と比較することを含む。一般に、「同一性(identity)」は、それぞれ2つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の正確なヌクレオチド対ヌクレオチドまたはアミノ酸対アミノ酸の対応を指す。2またはそれを超えるアミノ酸配列がそうであるように、2またはそれを超えるポリヌクレオチド配列を、それらの「パーセント同一性(percent identity)」を決定することによって比較することができる。Wisconsin Sequence Analysis Package、バージョン8(Genetics Computer Group、ウィスコンシン州マディソンから入手可能)で利用可能なプログラム、例えばGAPプログラムは、それぞれ、2つのポリヌクレオチド間の同一性と、2つのポリペプチド配列間の同一性および類似性の両方を計算することができる。配列間の同一性または類似性を計算するための他のプログラムは当業者に知られている。
参照位置に「対応する(corresponding to)」アミノ酸位置は、アミノ酸配列を整列させることによって特定される、参照配列と整列する位置を指す。このようなアラインメントは、手動で、またはClustalW2、Blast 2等などの周知の配列アラインメントプログラムを使用して行うことができる。
特に明記しない限り、2つのポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列のパーセント同一性は、2つの配列のうち短い方の全長にわたる同一のアミノ酸残基またはヌクレオチドのパーセンテージを指す。
全ての文法形態および綴りのバリエーションにおける「相同(homologous)」という用語は、スーパーファミリーからのポリヌクレオチドまたはポリペプチドと異なる種からの相同ポリヌクレオチドまたはタンパク質を含む、「共通の進化的起源(common evolutionary origin)」を有するポリヌクレオチドまたはポリペプチド間の関係を指す(Reeckら、Cell 50:667、1987)。このようなポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、パーセント同一性または保存された位置での特定のアミノ酸もしくはモチーフの存在に関して、それらの配列類似性によって反映される配列相同性を有する。例えば、2つの相同ポリペプチドは、少なくとも75%、少なくとも76%、少なくとも77%、少なくとも78%、少なくとも79%、少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも900、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、さらには100%同一であるアミノ酸配列を有することができる。
「適切な調節配列(suitable regulatory sequences)」は、当業者にその通常の慣用的な意味を与えられるべきであり、限定されないが、コード配列の上流(5’非コード配列)、内部または下流(3’非コード配列)に位置し、関連するコード配列の転写、RNAプロセシングまたは安定性、または翻訳に影響を及ぼすヌクレオチド配列を指すために使用される。調節配列には、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、およびポリアデニル化認識配列が含まれ得る。
「プロモーター(promoter)」は、当業者にその通常の慣用的な意味を与えられるべきであり、限定されないが、コード配列または機能的RNAの発現を制御することができるDNA配列を指すために使用される。一般に、コード配列はプロモーター配列の3’に位置している。プロモーターは、その全体が天然遺伝子に由来してもよく、または天然に見られる異なるプロモーターに由来する異なる要素で構成されていてもよく、またはさらには合成DNAセグメントを含んでもよい。異なるプロモーターが、異なる組織もしくは細胞型において、または異なる発達段階において、または異なる環境条件に応答して、遺伝子の発現を指示し得ることが当業者によって理解される。ほとんどの場合、ほとんどの細胞型で遺伝子を発現させるプロモーターは、一般に「構成的プロモーター(constitutive promoter)」と呼ばれる。ほとんどの場合、調節配列の正確な境界が完全に定義されていないため、異なる長さのDNAフラグメントが同一のプロモーター活性を有する可能性があることがさらに認識されている。
「作動可能に連結された(operably linked)」という用語は、一方の機能が他方によって影響を受けるような、単一核酸フラグメント上の核酸配列の会合を指す。例えば、プロモーターは、そのコード配列の発現に影響を及ぼすことができる場合(すなわち、コード配列がプロモーターの転写制御下にある場合)、コード配列と作動可能に連結している。コード配列を、センスまたはアンチセンス方向で調節配列に作動可能に連結することができる。
本明細書で使用される「発現(expression)」という用語は、当業者にその通常の慣用的な意味を与えられるべきであり、限定されないが、本技術の核酸フラグメントに由来するセンス(mRNA)またはアンチセンスRNAの転写および安定な蓄積を指すために使用される。「過剰発現(over-expression)」は、正常な生物または非形質転換生物における産生のレベルを超える、トランスジェニックまたは組換え生物における遺伝子産物の産生を指す。
「形質転換(transformation)」は、当業者にその通常の慣用的な意味を与えられるべきであり、限定されないが、その細胞によるさらなる発現のための標的細胞へのポリヌクレオチドの導入を指すために使用される。導入されたポリヌクレオチドは、標的細胞のゲノムまたは染色体DNAに組み込まれ、遺伝的に安定な遺伝をもたらす、または宿主染色体とは無関係に複製することができる。形質転換核酸フラグメントを含む宿主生物は、「トランスジェニック(transgenic)」または「組換え(recombinant)」または「形質転換(transformed)」生物と呼ばれる。
「形質転換(transformed)」、「トランスジェニック(transgenic)」、および「組換え(recombinant)」という用語は、本明細書で宿主細胞に関連して使用される場合、当業者にそれぞれの通常の慣用的な意味を与えられるべきであり、限定されないが、異種核酸分子が導入された、植物または微生物細胞などの宿主生物の細胞を指すために使用される。核酸分子は宿主細胞のゲノムに安定的に組み込まれ得る、または核酸分子は染色体外分子として存在し得る。このような染色体外分子は自己複製することができる。形質転換細胞、組織、または対象は、形質転換プロセスの最終産物だけでなく、そのトランスジェニック子孫も包含すると理解される。
本明細書でポリヌクレオチドに関連して使用される場合、「組換え(recombinant)」、「異種(heterologous)」および「外因性(exogenous)」という用語は、当業者にその通常の慣用的な意味を与えられるべきであり、限定されないが、特定の宿主細胞に対して外来の供給源に由来する、または同じ供給源に由来する場合、元の形態から改変されているポリヌクレオチド(例えば、DNA配列または遺伝子)を指すために使用される。したがって、宿主細胞における異種遺伝子は、特定の宿主細胞に対して内因性であるが、例えば、部位特異的突然変異誘発または他の組換え技術の使用によって改変された遺伝子を含む。この用語はまた、天然に存在するDNA配列の天然に存在しない複数のコピーも含む。したがって、これらの用語は、細胞に対して外来もしくは異種である、または細胞に対して相同であるが、要素が通常は見られない宿主細胞内の位置もしくは形態にあるDNAセグメントを指す。
同様に、「組換え(recombinant)」、「異種(heterologous)」、および「外因性(exogenous)」という用語は、本明細書でポリペプチドまたはアミノ酸配列に関連して使用される場合、特定の宿主細胞に対して外来の供給源に由来する、または同じ供給源に由来する場合、元の形態から改変されているポリペプチドまたはアミノ酸配列を意味する。したがって、組換えDNAセグメントを宿主細胞で発現させて、組換えポリペプチドを生産することができる。
「プラスミド(plasmid)」、「ベクター(vector)」、および「カセット(cassette)」という用語は、当業者にそれぞれの通常の慣用的な意味を与えられるべきであり、限定されないが、細胞の中央代謝の一部ではないが、通常は環状二本鎖DNA分子の形態である遺伝子を通常有する染色体外要素を指すために使用される。このような要素は、いくつかのヌクレオチド配列が、選択された遺伝子産物のためのプロモーターフラグメントおよびDNA配列を適切な3’非翻訳配列と共に細胞に導入することができる独自の構築物に結合されたまたは組み換えられた、任意の供給源に由来する一本鎖または二本鎖のDNAまたはRNAの線形または環状の自律複製配列、ゲノム組込み配列、ファージまたはヌクレオチド配列であり得る。「形質転換カセット(transformation cassette)」は、外来遺伝子を含み、外来遺伝子に加えて、特定の宿主細胞の形質転換を促進する要素を有する特定のベクターを指す。「発現カセット(expression cassette)」は、外来遺伝子を含み、外来遺伝子に加えて、外来宿主におけるその遺伝子の発現の増強を可能にする要素を有する特定のベクターを指す。
別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本開示が属する分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似または同等の任意の方法および材料を本開示の実施または試験に使用することができるが、好ましい材料および方法を以下に説明する。
以下の非限定的な実施例を検討すると、本開示はより完全に理解されるだろう。これらの実施例は、本技術の好ましい実施形態を示しているが、単なる例示として与えられていることを理解すべきである。上記の議論およびこれらの実施例から、当業者であれば、本技術の本質的な特徴を確認することができ、その精神および範囲から逸脱することなく、本技術をさまざまな用途および条件に適合させるためにさまざまな変更および修正を行うことができる。
実施例1:脂肪酸4-ヒドロキシラーゼ活性を有する真菌シトクロムP450酵素の候補遺伝子の同定
シトクロムP450(CYP)酵素は、多種多様な有機基質(脂肪酸を含む)の酸化を触媒して、さまざまなヒドロキシル化化合物(ヒドロキシ脂肪酸を含む)を生成することができる。ただし、炭化水素骨格に沿ってヒドロキシル化が起こる炭素原子の位置が重要となり得る。例えば、さまざまなP450の中で、細菌および真菌P450 BM3酵素が、ω-1~ω-3ヒドロキシ脂肪酸の形成を触媒することが報告されている。例えば、Miura,Y.およびFulco,A.J.、「ω-1,ω-2 and ω-3 Hydroxylation of Long-Chain Fatty Acids,Amides and Alcohols by a Soluble Enzyme System from Bacillus megatyerium」、Biochimica et Biophysica Acta‐Lipids and Lipid Metabolism、388(3):305-317(1975);ならびにKitazume,T.ら、「Fusarium oxysporum Fatty-acid Subterminal Hydroxylase(CYP505)Is a Membrane-bound Eukaryotic Counterpart of Bacillus megaterium Cytochrome P450BM3」、J.Bio.Chem.、275:39734-39740(2000)を参照されたい。
シトクロムP450(CYP)酵素は、多種多様な有機基質(脂肪酸を含む)の酸化を触媒して、さまざまなヒドロキシル化化合物(ヒドロキシ脂肪酸を含む)を生成することができる。ただし、炭化水素骨格に沿ってヒドロキシル化が起こる炭素原子の位置が重要となり得る。例えば、さまざまなP450の中で、細菌および真菌P450 BM3酵素が、ω-1~ω-3ヒドロキシ脂肪酸の形成を触媒することが報告されている。例えば、Miura,Y.およびFulco,A.J.、「ω-1,ω-2 and ω-3 Hydroxylation of Long-Chain Fatty Acids,Amides and Alcohols by a Soluble Enzyme System from Bacillus megatyerium」、Biochimica et Biophysica Acta‐Lipids and Lipid Metabolism、388(3):305-317(1975);ならびにKitazume,T.ら、「Fusarium oxysporum Fatty-acid Subterminal Hydroxylase(CYP505)Is a Membrane-bound Eukaryotic Counterpart of Bacillus megaterium Cytochrome P450BM3」、J.Bio.Chem.、275:39734-39740(2000)を参照されたい。
図1を参照すると、さまざまな脂肪酸からガンマラクトンへの効率的な合成経路は、ガンマに位置する炭素原子を脂肪酸基質のカルボニル炭素にヒドロキシル化し、それによって4-ヒドロキシ脂肪酸を生成することを含む(4-ヒドロキシラーゼ経路)。その後、4-ヒドロキシ脂肪酸を酸性条件下でガンマ-ラクトンに変換することができる。
Mucor circinelloides、Aspergillus oryzaeおよびMortierella isabellinaなどのいくつかの糸状菌が、対応するカルボン酸からさまざまなガンマラクトンまたはデルタラクトンを生成できることが報告されている。米国特許第5,032,513号および米国特許第7,863,023号を参照されたい。それにもかかわらず、これらの生物変換活性の分子機序はほとんど知られていない。さらに、このような糸状菌の複雑な形態が、これらのプロセスのスケールアップを大きな課題にしている。
本発明者らの知識の限りでは、本発明以前は、特異的な脂肪酸4-ヒドロキシラーゼ遺伝子も酵素も同定されていなかった。脂肪酸4-ヒドロキシラーゼ活性を有する真菌シトクロムP450(CYP、P450またはCYP450)酵素の候補遺伝子の大規模ライブラリーの厳密なハイスループットスクリーニングを実施した後、本発明者らは以下の候補遺伝子を同定した:Mucor ambiguus由来のシトクロムP450モノオキシゲナーゼ遺伝子(GenBank:GAN03094.1)、前記Mucor ambiguus CYPのアミノ酸配列は配列番号1として提供される;Basidiobolus meristosporus由来のシトクロムP450モノオキシゲナーゼ遺伝子(GenBank:ORX85448.1)、前記Basidiobolus meristosporus CYPのアミノ酸配列は配列番号3として提供される;およびUmbelopsis isabellina由来のシトクロムP450モノオキシゲナーゼ遺伝子(GenBank:ORX85448.1)、前記Umbelopsis isabellina CYPのアミノ酸配列は配列番号5として提供される。
実施例2:ガンマラクトンを生成するための高収量株の作製およびシトクロムP450の過剰発現
大腸菌(E.coli)でのタンパク質発現を促進するために、候補遺伝子の各々を大腸菌(E.coli)ゲノムに対してコドン最適化し、Gene Universal Inc.(Newark、ドイツ)によって合成した。
大腸菌(E.coli)でのタンパク質発現を促進するために、候補遺伝子の各々を大腸菌(E.coli)ゲノムに対してコドン最適化し、Gene Universal Inc.(Newark、ドイツ)によって合成した。
コドン最適化されたMucor ambiguus P450遺伝子を、HindIIIおよびXhoI部位を通してpET17bベクター(AMP+、Novagen)にクローニングした。構築物を、発現のためにBL21(DE3)細胞に形質転換した。典型的な実験では、一晩培養物を使用して、100mg/Lのカルベニシリンを含有する液体LB培地(2%)に接種した。培養物を最初に37℃でOD600が0.6になるまで増殖させ、25℃に冷却した。次いで、1mMのIPTGを添加して、タンパク質発現を誘導した。25℃で3時間インキュベートした後、γ-ラクトン生産のために脂肪酸基質を1g/Lで添加した。
コドン最適化されたBasidiobolus meristosporus P450およびUmbelopsis isabellina P450遺伝子の各々を、HindIIIおよびXhoI部位を通してpET-32a-(+)ベクター(AMP+、Novagen)にクローニングした。構築物を、発現のためにBL21(DE3)細胞に形質転換した。典型的な実験では、一晩培養物を使用して、100mg/Lのカルベニシリンを含有する液体LB培地(2%)に接種した。培養物を最初に37℃でOD600が0.8になるまで増殖させ、16℃に冷却した。次いで、1mMのIPTGを添加して、タンパク質発現を誘導した。16℃で5時間インキュベートした後、温度を30℃に上げ、γ-ラクトン生産のために脂肪酸基質を1g/Lで添加した。
実施例3:ガンマラクトン生産の分析
γ-ラクトン生産を分析するために、0.5mlの実施例2に記載される大腸菌(E.coli)培養物を取り、10μlの2N HClで酸性化し、次いで、室温で60分間振盪しながら0.5mlの酢酸エチルで抽出した。14,000rpmで15分間遠心分離した後、酢酸エチル相をGC/MSまたはGC/FID分析に使用した。
γ-ラクトン生産を分析するために、0.5mlの実施例2に記載される大腸菌(E.coli)培養物を取り、10μlの2N HClで酸性化し、次いで、室温で60分間振盪しながら0.5mlの酢酸エチルで抽出した。14,000rpmで15分間遠心分離した後、酢酸エチル相をGC/MSまたはGC/FID分析に使用した。
GC/MS分析は、GCMS-QP2010S検出器と連結したShimadzu GC-2010システムで行った。分析カラムはSHRXI-5MS(厚さ0.25μm;長さ30m;直径0.25mm)とし、注入温度は分割モード下で265℃とする。温度勾配は0~3分80℃;3~8.7分120℃~263℃、25の勾配;8.7~10.7分、263℃である。
GC/FID分析はShimadzu GC-2014システムで行った。分析カラムはRestek RXi-5ms(厚さ0.25μm;長さ30m;直径0.25mm)とし、注入温度は分割モードで240℃とする。温度勾配は0~3分、100℃;3~9分100℃~280℃、30の勾配;9~12分、280℃である。
実施例4:Mucor ambiguus P450を過剰発現する高収量株を使用したガンマラクトン生産
実施例2に記載される手順を、Mucor ambiguus P450を過剰発現する大腸菌(E.coli)培養物を使用して実施した。具体的には、大腸菌(E.coli)培養物の試料を採取し、脂肪酸基質を添加した2日後または16時間後に酸性化した。図2は、対応するカルボン酸からのさまざまなガンマラクトンの生産を示している:(a)エナント酸(ヘプタン酸、C7)からのγ-ヘプタラクトン(GC7)、(b)カプリル酸(オクタン酸、C8)からのγ-オクタラクトン(GC8)、(c)ペラルゴン酸(ノナン酸、C9)からのγ-ノナラクトン(GC9)、(d)カプリン酸(デカン酸、C10)からのγ-デカラクトン(GC10)、(e)ウンデシル酸(ウンデカン酸、C11)からのγ-ウンデカラクトン(GC11)、(f)ラウリン酸(ドデカン酸、C12)からのγ-ドデカラクトン(GC12)、(g)トリデシル酸(トリデカン酸、C13)からのγ-トリデカラクトン(GC13)、および(h)ミリスチン酸(テトラデカン酸、C14)からのγ-テトラデカラクトン(GC14)。
実施例2に記載される手順を、Mucor ambiguus P450を過剰発現する大腸菌(E.coli)培養物を使用して実施した。具体的には、大腸菌(E.coli)培養物の試料を採取し、脂肪酸基質を添加した2日後または16時間後に酸性化した。図2は、対応するカルボン酸からのさまざまなガンマラクトンの生産を示している:(a)エナント酸(ヘプタン酸、C7)からのγ-ヘプタラクトン(GC7)、(b)カプリル酸(オクタン酸、C8)からのγ-オクタラクトン(GC8)、(c)ペラルゴン酸(ノナン酸、C9)からのγ-ノナラクトン(GC9)、(d)カプリン酸(デカン酸、C10)からのγ-デカラクトン(GC10)、(e)ウンデシル酸(ウンデカン酸、C11)からのγ-ウンデカラクトン(GC11)、(f)ラウリン酸(ドデカン酸、C12)からのγ-ドデカラクトン(GC12)、(g)トリデシル酸(トリデカン酸、C13)からのγ-トリデカラクトン(GC13)、および(h)ミリスチン酸(テトラデカン酸、C14)からのγ-テトラデカラクトン(GC14)。
図2a~図2hに示されるように、GC7~GC14γ-ラクトンは、Mucor ambiguusシトクロムP450(配列番号1)を過剰発現する異種系において、対応するC7~C14カルボン酸から有効に産生された。特に、GC7~GC12のピークは、保持時間と質量スペクトルの両方の点で、Sigma-Aldrich(ミズーリ州セントルイス)の対応する標準と一致している。γ-トリデカラクトン(GC13)およびγ-テトラデカラクトン(GC14)の標準は市販されていない。それにもかかわらず、推定上のGC13およびGC14のピークはGC12よりも長い保持時間を有することが注目された。
実施例5:Basidiobolus meristosporus P450を過剰発現する高収量株を使用したガンマラクトン生産
実施例2に記載される手順を、Basidiobolus meristosporus P450を過剰発現する大腸菌(E.coli)培養物を使用して実施した。具体的には、大腸菌(E.coli)培養物の試料を採取し、脂肪酸基質を添加した17時間後に酸性化した。図3は、対応するカルボン酸からのさまざまなガンマラクトンの生産を示している:(a)ウンデシル酸(ウンデカン酸、C11)からのγ-ウンデカラクトン(GC11)、および(b)ウンデシレン酸(ウンデセン酸、C11:1)からのγ-ウンデセノラクトン(GC11’)。
実施例2に記載される手順を、Basidiobolus meristosporus P450を過剰発現する大腸菌(E.coli)培養物を使用して実施した。具体的には、大腸菌(E.coli)培養物の試料を採取し、脂肪酸基質を添加した17時間後に酸性化した。図3は、対応するカルボン酸からのさまざまなガンマラクトンの生産を示している:(a)ウンデシル酸(ウンデカン酸、C11)からのγ-ウンデカラクトン(GC11)、および(b)ウンデシレン酸(ウンデセン酸、C11:1)からのγ-ウンデセノラクトン(GC11’)。
図3に示されるように、GC11およびGC11’γ-ラクトンは、Basidiobolus meristosporusシトクロムP450(配列番号3)を過剰発現する異種系において、対応するC11およびC11:1カルボン酸から有効に産生された。特に、C11、GC11およびC11:1のピークは、保持時間と質量スペクトルの両方の点で、Sigma-Aldrich(ミズーリ州セントルイス)の対応する標準と一致している。GC11’の標準は市販されていない。それにもかかわらず、推定上のGC11’ピークはGC11と同様の保持時間を示すことが注目された。
記載された反応条件下で、約69mg/LのGC11および約18mg/LのGC11’が、それぞれ1g/LのC11またはC11:1を大腸菌(E.coli)増殖細胞培養物に添加した17時間後に産生された。
増殖細胞に加えて、休止細胞も、脂肪酸のガンマラクトンへの生物変換におけるその潜在的な使用について調査した。この実験では、一晩培養物を使用して、100mg/Lのカルベニシリンを含有する液体SOC培地(3%)に接種した。培養物を最初に37℃でOD600が0.8になるまで増殖させ、16℃に冷却した。次いで、1mMのIPTGを添加して、タンパク質発現を誘導した。16℃で16時間培養した後、培養物を収穫し、遠心分離によって細胞ペレットを回収し、使用するまで-80℃で保管した。
典型的な生物変換実験では、凍結細胞を100mM K-Pi緩衝液、pH7に100g/L新鮮重量の細胞濃度で再懸濁した。次いで、1g/LのC11またはC11:1を、0.1%のTween 40および10mMのNADPHと共に添加した。その後、混合物を250rpmで振盪しながら30℃でインキュベートした。試料を3時間後に採取した。GC11およびGC11’の力価はそれぞれ419mg/Lおよび185mg/Lであった。
実施例6:Umbelopsis isabellina P450を過剰発現する高収量株を使用したガンマラクトン生産
実施例2に記載される手順を、Umbelopsis isabellina P450を過剰発現する大腸菌(E.coli)培養物を使用して実施した。具体的には、大腸菌(E.coli)培養物の試料を採取し、脂肪酸基質を添加した25時間後に酸性化した。図4は、保持時間分で、対応するカルボン酸からのさまざまなガンマラクトンの生産を示している:(a)ウンデシル酸(ウンデカン酸、C11)からのγ-ウンデカラクトン(GC11)、および(b)ウンデシレン酸(ウンデセン酸、C11:1)からのγ-ウンデセノラクトン(GC11’)。
実施例2に記載される手順を、Umbelopsis isabellina P450を過剰発現する大腸菌(E.coli)培養物を使用して実施した。具体的には、大腸菌(E.coli)培養物の試料を採取し、脂肪酸基質を添加した25時間後に酸性化した。図4は、保持時間分で、対応するカルボン酸からのさまざまなガンマラクトンの生産を示している:(a)ウンデシル酸(ウンデカン酸、C11)からのγ-ウンデカラクトン(GC11)、および(b)ウンデシレン酸(ウンデセン酸、C11:1)からのγ-ウンデセノラクトン(GC11’)。
図4は、対応するカルボン酸からのさまざまなガンマラクトンの生産を示している:(a)ヘキサン酸(C6)からのγ-ヘキサラクトン(GC6)、(b)エナント酸(ヘプタン酸、C7)からのγ-ヘプタラクトン(GC7)、(c)カプリン酸(デカン酸、C10)からのγ-デカラクトン(GC10)、(d)ウンデシル酸(ウンデカン酸、C11)からのγ-ウンデカラクトン(GC11)、(e)ラウリン酸(ドデカン酸、C12)からのγ-ドデカラクトン(GC12)、(f)トリデシル酸(トリデカン酸、C13)からのγ-トリデカラクトン(GC13)、および(g)ミリスチン酸(テトラデカン酸、C14)からのγ-テトラデカラクトン(GC14)。
図4a~図4gに示されるように、GC6、GC7、GC10、GC11、GC12、GC13およびGC14 γ-ラクトンは、Umbelopsis isabellinaシトクロムP450(配列番号5)を過剰発現する異種系において、対応するC6、C7、C10、C11、C12、C13およびC14カルボン酸から有効に産生された。特に、GC6、GC7、GC10、GC11およびGC12のピークは、保持時間と質量スペクトルの両方の点で、Sigma-Aldrich(ミズーリ州セントルイス)の対応する標準と一致している。γ-トリデカラクトン(GC13)およびγ-テトラデカラクトン(GC14)の標準は市販されていない。それにもかかわらず、推定上のGC13およびGC14のピークはGC12よりも長い保持時間を有することが注目された。
記載された反応条件下で、約42mg/LのGC6が、1g/LのC6を大腸菌(E.coli)増殖細胞培養物に添加した25時間後に産生された。
増殖細胞に加えて、休止細胞も、脂肪酸のガンマラクトンへの生物変換におけるその潜在的な使用について調査した。この実験では、一晩培養物を使用して、100mg/Lのカルベニシリンを含有する液体SOC培地(3%)に接種した。培養物を最初に37℃でOD600が0.8になるまで増殖させ、16℃に冷却した。次いで、1mMのIPTGを添加して、タンパク質発現を誘導した。16℃で16時間培養した後、培養物を収穫し、遠心分離によって細胞ペレットを回収し、使用するまで-80℃で保管した。
典型的な生物変換実験では、凍結細胞を100mM K-Pi緩衝液、pH7に100g/L新鮮重量の細胞濃度で再懸濁した。次いで、1g/LのC6を添加し、混合物を250rpmで振盪しながら30℃でインキュベートした。試料を3時間後に採取した。GC6の力価は198mg/Lであった。
目的の配列
Mucor ambiguusシトクロムP450
GAN03094.1遺伝子のアミノ酸配列(配列番号1):
MTKYAHDQIPGPEPHYLLGNVPDIFPDSLGNLIKLHDKYGPIVHLSMGGHELLSVDDPAVLETICEDNEYFTKEIESVYSDLAILNGRGLVTTSTADPDWQLGHKLIMNAFSARAMKAYHYKMGESISELCEIMDSFAKSGEDFDVSRWFIALALESIGKIGFDYDFDLLKDPNAPRHPFTVALAYVQSMIMKRASTLSWLKWYQTTTNVRFHRDLQTLRGTVEEVLKDRREHPHTEADQSDLLDFMIKAESKEGEKLNDSLIRDNIITFLSAGHNTTSAFLSWTMLELCKHPEVVENIKQEIANCGIKAGEVPTPEQVKECKYLDLVIKESLRIHPPITSILKYCKKDATVKASNGDEYDIKAGQLLQVNINALHHNPKVWEDPDVFNPDRFSGDTDNLPNTAWLTFSTGPRACIGRQFALQEGKLALVMILSRFHFKMDDPSQKIGYAVVVSTKPVGFFAKIESSQLPEPTEEIVVTKRRESKAVPQEKVKPAEFPLPPVTFLFGTQTNTSEEYARKLSGQAKEMGFKEVTVQDLDDWKLVKGEAIAKAQHDADAPSSEDDVKVSELVVVVTATYNGFPPDDANEFAKWLDERTKDSEATKNNMLSGMLYAVFGCGNRDWTSTFQKFPKKVDSGFELLGGERLLPAGEGDASDDIDGDFSLWSASFWTALMQRYGQSSSGKNADIMSNNGPAADPSQDFTLEFINIVKEKVKTEQAALNCNQLETVATIVENRELQHTEKSHRSTRHIQVQFDKSVDGKPLYEAGDHLEVVPVNEDRLVEIIATNLGLVLDSVFEVKDLDIKNLSPRSVAANIKGPCTIRNALKYYADLTGPPTRFSLSILSKQLKDSRPDIAERLQKALQPGKETERLKEFLASHRTLIDIIQAFKIKELNFKEFISSVNCIVPRKYSISSGPLEHPFDPSISVGVVDTVGGPDGNTHYFGLASGYLSHQEPGTKINAQIKACKSTFRLPDDPSTPVIFIAAGTGFSPFRGFLQERHAKGLKSSKKNSNGESSECYMFFGCRHPDQDFIYKEEFDAYLEDGTITELYTTFSRSGEVVKYVQHALLKHANLLYKLMEESNAKVYICGSAGSMAKDVKRTWERLLVQMSGVSESEAAEQIQAWVDEGKYNEDVWGT
Mucor ambiguusシトクロムP450
GAN03094.1遺伝子のアミノ酸配列(配列番号1):
MTKYAHDQIPGPEPHYLLGNVPDIFPDSLGNLIKLHDKYGPIVHLSMGGHELLSVDDPAVLETICEDNEYFTKEIESVYSDLAILNGRGLVTTSTADPDWQLGHKLIMNAFSARAMKAYHYKMGESISELCEIMDSFAKSGEDFDVSRWFIALALESIGKIGFDYDFDLLKDPNAPRHPFTVALAYVQSMIMKRASTLSWLKWYQTTTNVRFHRDLQTLRGTVEEVLKDRREHPHTEADQSDLLDFMIKAESKEGEKLNDSLIRDNIITFLSAGHNTTSAFLSWTMLELCKHPEVVENIKQEIANCGIKAGEVPTPEQVKECKYLDLVIKESLRIHPPITSILKYCKKDATVKASNGDEYDIKAGQLLQVNINALHHNPKVWEDPDVFNPDRFSGDTDNLPNTAWLTFSTGPRACIGRQFALQEGKLALVMILSRFHFKMDDPSQKIGYAVVVSTKPVGFFAKIESSQLPEPTEEIVVTKRRESKAVPQEKVKPAEFPLPPVTFLFGTQTNTSEEYARKLSGQAKEMGFKEVTVQDLDDWKLVKGEAIAKAQHDADAPSSEDDVKVSELVVVVTATYNGFPPDDANEFAKWLDERTKDSEATKNNMLSGMLYAVFGCGNRDWTSTFQKFPKKVDSGFELLGGERLLPAGEGDASDDIDGDFSLWSASFWTALMQRYGQSSSGKNADIMSNNGPAADPSQDFTLEFINIVKEKVKTEQAALNCNQLETVATIVENRELQHTEKSHRSTRHIQVQFDKSVDGKPLYEAGDHLEVVPVNEDRLVEIIATNLGLVLDSVFEVKDLDIKNLSPRSVAANIKGPCTIRNALKYYADLTGPPTRFSLSILSKQLKDSRPDIAERLQKALQPGKETERLKEFLASHRTLIDIIQAFKIKELNFKEFISSVNCIVPRKYSISSGPLEHPFDPSISVGVVDTVGGPDGNTHYFGLASGYLSHQEPGTKINAQIKACKSTFRLPDDPSTPVIFIAAGTGFSPFRGFLQERHAKGLKSSKKNSNGESSECYMFFGCRHPDQDFIYKEEFDAYLEDGTITELYTTFSRSGEVVKYVQHALLKHANLLYKLMEESNAKVYICGSAGSMAKDVKRTWERLLVQMSGVSESEAAEQIQAWVDEGKYNEDVWGT
大腸菌(E.coli)ゲノム用にコドン最適化されたGAN03094.1のヌクレオチド配列(配列番号2):
ATGACCAAATATGCCCATGATCAGATTCCGGGTCCTGAACCGCATTATCTGCTGGGTAATGTTCCGGATATTTTTCCGGATAGCCTGGGCAATCTGATTAAACTGCATGATAAATATGGTCCGATTGTGCATCTGAGCATGGGTGGTCATGAACTGCTGAGCGTTGATGATCCGGCAGTTCTGGAAACCATTTGTGAAGATAATGAATATTTCACCAAAGAAATCGAAAGCGTGTATAGCGATCTGGCAATTCTGAATGGTCGTGGTCTGGTTACCACCAGTACCGCAGATCCGGATTGGCAGCTGGGTCATAAACTGATTATGAATGCATTTAGCGCACGTGCCATGAAAGCCTATCACTATAAAATGGGTGAAAGCATTAGCGAACTGTGCGAAATTATGGATAGCTTTGCAAAAAGCGGTGAGGATTTTGATGTTAGCCGTTGGTTTATTGCACTGGCACTGGAAAGCATTGGTAAAATCGGTTTCGATTATGATTTCGACCTGCTGAAAGATCCGAATGCACCGCGTCATCCGTTTACCGTTGCGCTGGCCTATGTTCAGAGTATGATCATGAAACGTGCAAGCACCCTGAGCTGGCTGAAATGGTATCAGACCACCACCAATGTTCGTTTTCATCGTGATCTGCAGACCCTGCGTGGCACCGTTGAAGAAGTTCTGAAAGACCGTCGTGAACATCCGCATACCGAAGCAGATCAGAGCGATCTGCTGGATTTTATGATTAAAGCCGAAAGCAAAGAAGGCGAGAAACTGAACGATAGCCTGATTCGTGATAACATCATTACCTTTCTGAGCGCAGGTCATAATACCACCTCAGCATTTCTGAGCTGGACCATGCTGGAACTGTGTAAACATCCGGAAGTTGTCGAAAACATCAAACAAGAAATTGCCAACTGCGGTATTAAAGCGGGTGAAGTTCCGACACCGGAACAGGTTAAAGAATGTAAATATCTGGACCTGGTGATCAAAGAAAGCCTGCGTATTCATCCGCCTATTACCAGCATTCTGAAATACTGTAAAAAAGACGCAACCGTGAAAGCCAGCAATGGTGATGAATATGATATTAAAGCAGGTCAGCTGCTGCAGGTTAACATTAATGCACTGCATCATAACCCGAAAGTTTGGGAAGATCCTGATGTTTTTAACCCGGATCGTTTTAGCGGTGATACCGATAATCTGCCGAATACCGCATGGCTGACCTTTAGCACCGGTCCGCGTGCATGTATTGGTCGTCAGTTTGCACTGCAAGAAGGTAAACTGGCCCTGGTTATGATTCTGAGCCGTTTTCATTTCAAAATGGATGATCCGAGCCAGAAAATTGGTTATGCAGTTGTTGTTAGCACCAAACCGGTTGGTTTTTTTGCCAAAATTGAAAGCAGCCAGCTGCCGGAACCGACCGAAGAAATTGTTGTTACCAAACGTCGTGAAAGTAAAGCAGTTCCGCAAGAAAAAGTTAAACCGGCAGAATTTCCGCTGCCTCCGGTGACCTTTCTGTTTGGCACCCAGACCAATACCAGCGAAGAATATGCACGTAAACTGAGCGGTCAGGCAAAAGAAATGGGTTTTAAAGAAGTTACCGTCCAGGATCTGGATGATTGGAAACTGGTTAAAGGTGAAGCAATTGCAAAAGCACAGCATGATGCCGATGCACCGAGCAGCGAAGATGATGTTAAAGTGAGCGAACTGGTTGTTGTTGTGACCGCAACCTATAATGGTTTTCCGCCTGATGATGCAAACGAATTTGCAAAATGGCTGGATGAACGTACCAAAGATAGCGAAGCAACCAAAAATAACATGCTGAGCGGTATGCTGTATGCAGTGTTTGGTTGTGGTAATCGTGATTGGACCAGCACCTTTCAGAAATTCCCGAAAAAAGTTGATAGCGGCTTTGAACTGTTAGGTGGTGAACGTCTGCTGCCAGCCGGTGAAGGTGATGCAAGTGATGATATTGATGGTGATTTTAGCCTGTGGTCTGCCAGCTTTTGGACCGCACTGATGCAGCGTTATGGTCAGAGCAGCAGCGGTAAAAATGCAGATATTATGAGCAATAATGGTCCGGCAGCAGATCCGAGTCAGGATTTTACCCTGGAATTTATCAACATCGTGAAAGAGAAGGTCAAAACCGAACAGGCAGCACTGAATTGTAATCAGCTGGAAACCGTTGCAACCATTGTTGAAAATCGCGAACTGCAGCATACAGAAAAAAGCCATCGTAGCACCCGTCATATTCAGGTTCAGTTTGATAAAAGCGTGGATGGTAAACCGCTGTATGAAGCCGGTGATCATCTGGAAGTGGTTCCGGTTAATGAAGATCGTCTGGTTGAAATTATTGCCACCAATCTGGGTTTAGTTCTGGATAGCGTTTTTGAGGTGAAAGACCTGGATATTAAGAATCTGAGTCCGCGTAGCGTTGCAGCAAACATTAAAGGTCCGTGTACCATTCGTAATGCCCTGAAATATTACGCAGATCTGACCGGTCCTCCGACACGTTTTAGTCTGAGCATTCTGTCAAAACAGCTGAAAGACAGCCGTCCTGATATTGCAGAACGCCTGCAGAAAGCACTGCAGCCTGGTAAAGAAACCGAACGTCTGAAAGAATTTCTGGCAAGTCATCGTACCCTGATCGATATTATTCAGGCCTTCAAAATCAAAGAACTGAACTTCAAAGAGTTTATCAGCAGCGTTAATTGCATCGTTCCGCGTAAATATAGCATTAGCAGTGGTCCGCTGGAACATCCGTTTGATCCGAGTATTAGCGTTGGTGTTGTTGATACCGTTGGTGGTCCGGATGGTAATACCCATTATTTTGGTCTGGCAAGCGGTTATCTGAGCCATCAAGAACCGGGTACAAAAATCAATGCACAGATTAAAGCATGCAAGAGTACCTTTCGTCTGCCGGATGATCCTAGCACACCGGTTATCTTTATTGCAGCAGGCACCGGTTTTAGCCCGTTTCGTGGTTTTCTGCAAGAACGTCATGCAAAAGGTCTGAAAAGCAGCAAAAAAAACAGCAATGGCGAAAGCAGCGAGTGCTATATGTTTTTTGGCTGTCGTCATCCGGATCAGGATTTCATCTATAAAGAAGAATTTGACGCCTACCTGGAAGATGGCACCATTACAGAACTGTATACCACCTTTAGCCGTAGCGGTGAAGTTGTTAAATATGTTCAGCACGCACTGCTGAAACATGCAAATCTGCTGTACAAACTGATGGAAGAAAGCAACGCCAAAGTGTATATTTGTGGTAGCGCAGGTAGCATGGCAAAAGATGTTAAACGTACCTGGGAGCGCCTGCTGGTTCAGATGAGCGGTGTTAGCGAAAGCGAAGCAGCAGAGCAGATTCAGGCATGGGTTGATGAAGGCAAATATAACGAAGATGTTTGGGGCACCTAA
ATGACCAAATATGCCCATGATCAGATTCCGGGTCCTGAACCGCATTATCTGCTGGGTAATGTTCCGGATATTTTTCCGGATAGCCTGGGCAATCTGATTAAACTGCATGATAAATATGGTCCGATTGTGCATCTGAGCATGGGTGGTCATGAACTGCTGAGCGTTGATGATCCGGCAGTTCTGGAAACCATTTGTGAAGATAATGAATATTTCACCAAAGAAATCGAAAGCGTGTATAGCGATCTGGCAATTCTGAATGGTCGTGGTCTGGTTACCACCAGTACCGCAGATCCGGATTGGCAGCTGGGTCATAAACTGATTATGAATGCATTTAGCGCACGTGCCATGAAAGCCTATCACTATAAAATGGGTGAAAGCATTAGCGAACTGTGCGAAATTATGGATAGCTTTGCAAAAAGCGGTGAGGATTTTGATGTTAGCCGTTGGTTTATTGCACTGGCACTGGAAAGCATTGGTAAAATCGGTTTCGATTATGATTTCGACCTGCTGAAAGATCCGAATGCACCGCGTCATCCGTTTACCGTTGCGCTGGCCTATGTTCAGAGTATGATCATGAAACGTGCAAGCACCCTGAGCTGGCTGAAATGGTATCAGACCACCACCAATGTTCGTTTTCATCGTGATCTGCAGACCCTGCGTGGCACCGTTGAAGAAGTTCTGAAAGACCGTCGTGAACATCCGCATACCGAAGCAGATCAGAGCGATCTGCTGGATTTTATGATTAAAGCCGAAAGCAAAGAAGGCGAGAAACTGAACGATAGCCTGATTCGTGATAACATCATTACCTTTCTGAGCGCAGGTCATAATACCACCTCAGCATTTCTGAGCTGGACCATGCTGGAACTGTGTAAACATCCGGAAGTTGTCGAAAACATCAAACAAGAAATTGCCAACTGCGGTATTAAAGCGGGTGAAGTTCCGACACCGGAACAGGTTAAAGAATGTAAATATCTGGACCTGGTGATCAAAGAAAGCCTGCGTATTCATCCGCCTATTACCAGCATTCTGAAATACTGTAAAAAAGACGCAACCGTGAAAGCCAGCAATGGTGATGAATATGATATTAAAGCAGGTCAGCTGCTGCAGGTTAACATTAATGCACTGCATCATAACCCGAAAGTTTGGGAAGATCCTGATGTTTTTAACCCGGATCGTTTTAGCGGTGATACCGATAATCTGCCGAATACCGCATGGCTGACCTTTAGCACCGGTCCGCGTGCATGTATTGGTCGTCAGTTTGCACTGCAAGAAGGTAAACTGGCCCTGGTTATGATTCTGAGCCGTTTTCATTTCAAAATGGATGATCCGAGCCAGAAAATTGGTTATGCAGTTGTTGTTAGCACCAAACCGGTTGGTTTTTTTGCCAAAATTGAAAGCAGCCAGCTGCCGGAACCGACCGAAGAAATTGTTGTTACCAAACGTCGTGAAAGTAAAGCAGTTCCGCAAGAAAAAGTTAAACCGGCAGAATTTCCGCTGCCTCCGGTGACCTTTCTGTTTGGCACCCAGACCAATACCAGCGAAGAATATGCACGTAAACTGAGCGGTCAGGCAAAAGAAATGGGTTTTAAAGAAGTTACCGTCCAGGATCTGGATGATTGGAAACTGGTTAAAGGTGAAGCAATTGCAAAAGCACAGCATGATGCCGATGCACCGAGCAGCGAAGATGATGTTAAAGTGAGCGAACTGGTTGTTGTTGTGACCGCAACCTATAATGGTTTTCCGCCTGATGATGCAAACGAATTTGCAAAATGGCTGGATGAACGTACCAAAGATAGCGAAGCAACCAAAAATAACATGCTGAGCGGTATGCTGTATGCAGTGTTTGGTTGTGGTAATCGTGATTGGACCAGCACCTTTCAGAAATTCCCGAAAAAAGTTGATAGCGGCTTTGAACTGTTAGGTGGTGAACGTCTGCTGCCAGCCGGTGAAGGTGATGCAAGTGATGATATTGATGGTGATTTTAGCCTGTGGTCTGCCAGCTTTTGGACCGCACTGATGCAGCGTTATGGTCAGAGCAGCAGCGGTAAAAATGCAGATATTATGAGCAATAATGGTCCGGCAGCAGATCCGAGTCAGGATTTTACCCTGGAATTTATCAACATCGTGAAAGAGAAGGTCAAAACCGAACAGGCAGCACTGAATTGTAATCAGCTGGAAACCGTTGCAACCATTGTTGAAAATCGCGAACTGCAGCATACAGAAAAAAGCCATCGTAGCACCCGTCATATTCAGGTTCAGTTTGATAAAAGCGTGGATGGTAAACCGCTGTATGAAGCCGGTGATCATCTGGAAGTGGTTCCGGTTAATGAAGATCGTCTGGTTGAAATTATTGCCACCAATCTGGGTTTAGTTCTGGATAGCGTTTTTGAGGTGAAAGACCTGGATATTAAGAATCTGAGTCCGCGTAGCGTTGCAGCAAACATTAAAGGTCCGTGTACCATTCGTAATGCCCTGAAATATTACGCAGATCTGACCGGTCCTCCGACACGTTTTAGTCTGAGCATTCTGTCAAAACAGCTGAAAGACAGCCGTCCTGATATTGCAGAACGCCTGCAGAAAGCACTGCAGCCTGGTAAAGAAACCGAACGTCTGAAAGAATTTCTGGCAAGTCATCGTACCCTGATCGATATTATTCAGGCCTTCAAAATCAAAGAACTGAACTTCAAAGAGTTTATCAGCAGCGTTAATTGCATCGTTCCGCGTAAATATAGCATTAGCAGTGGTCCGCTGGAACATCCGTTTGATCCGAGTATTAGCGTTGGTGTTGTTGATACCGTTGGTGGTCCGGATGGTAATACCCATTATTTTGGTCTGGCAAGCGGTTATCTGAGCCATCAAGAACCGGGTACAAAAATCAATGCACAGATTAAAGCATGCAAGAGTACCTTTCGTCTGCCGGATGATCCTAGCACACCGGTTATCTTTATTGCAGCAGGCACCGGTTTTAGCCCGTTTCGTGGTTTTCTGCAAGAACGTCATGCAAAAGGTCTGAAAAGCAGCAAAAAAAACAGCAATGGCGAAAGCAGCGAGTGCTATATGTTTTTTGGCTGTCGTCATCCGGATCAGGATTTCATCTATAAAGAAGAATTTGACGCCTACCTGGAAGATGGCACCATTACAGAACTGTATACCACCTTTAGCCGTAGCGGTGAAGTTGTTAAATATGTTCAGCACGCACTGCTGAAACATGCAAATCTGCTGTACAAACTGATGGAAGAAAGCAACGCCAAAGTGTATATTTGTGGTAGCGCAGGTAGCATGGCAAAAGATGTTAAACGTACCTGGGAGCGCCTGCTGGTTCAGATGAGCGGTGTTAGCGAAAGCGAAGCAGCAGAGCAGATTCAGGCATGGGTTGATGAAGGCAAATATAACGAAGATGTTTGGGGCACCTAA
Basidiobolus meristosporusシトクロムP450
ORX85448.1遺伝子のアミノ酸配列(配列番号3):
MSSQSDEIPGPKPHILLGNVQDIIPDTIGNHRRLHDEYGPVMRLYLGGHDFVSICDPEVIQSITGEGDFTKEIYSAYEDLAILSGRGLVTTATKDPDWILAHKLLMPAFSARAMKAYHDIMGKCILDLLKIMESYQECGEAIDMSRWMISLALESIGVIGFGYNFNLLDDKDSERHPFSVALNYVQSMIMKRTNSVTWTKWLQTTANVRFRRDLATLRDTVDDVLKQRRLNPPSEDARRDLLDFMLAAESKQGEKLDDNLIRDEIITFLSAGHNTTSSFLSWTFFELARNPDVEQKILQEIVNAGIKPGEIPSTEQVAKCKYIDMVIKESLRFHSPIPLVIKYCQNDCTIKTSEGKEYEIKRGQLAQIQISAVHKDPKLWENPNVFDPERFNPEKEADRHPCAWIPFSDGPRACIGRQFSLQEGKLALIMLLCKFRFRLLDETKEVGYQIIVSLKPVDLIMKVLPAELPSPNAGSDTSSVKDTVKPQLKPKENEVLEHARFPLPPVTFLYGTQTGTSEEYARKLSGQAKEFGFTDIAVAELDDWEVVKNNRIPSNKGQSSPSDEDGTKVSQLAVIVTATYNGYPPDNALKFDSWLTDITKDQKNQLEGLLYAVFGCGNKQWQSTFQAFPKKVDASIELLGAERLVPAGAGNADQDIDGDFTNWSASFWAALMQKYGRGASDKDADLMTTSGPVADPSNDFTLEFLPLGGDQAAMEAALGNRNSDPGAQVAILENKELQDVEKSGRSTRHIVVECPPASPGSGKKASYRAGDHLEIKPYNDDQLVENIAIGFGYVLDSVFQIKDCKITNLSPRSLAANIIGPCTVRNALTYFADLSGPPTRYTLTVMAKQLEKTRPDVAERLLHALQPGKETPRLREFLSTHRTILDIQRAFKIKELSFKEFLSSVNVIVPRRYSISSGPLEHPNEVSVTVGVVKDIGGADNNTDYYGLASGYLMRCPIGSKIDAKIKPCKNNFRLPENEQTPVIFICAGTGFAPFRGFLQERHAKGWKSKEKGGSSDAYLFFGCRHPDHDFIYQKELEEYLEDGTLTKLYTTFSRYNQTKKYVQHLLLTHAQLLFNLIMNENANIYVCGAGRGMAHDVRRTFERLAVQVAGMSEPEAVDAISHMVDAERYNEDVWG
ORX85448.1遺伝子のアミノ酸配列(配列番号3):
MSSQSDEIPGPKPHILLGNVQDIIPDTIGNHRRLHDEYGPVMRLYLGGHDFVSICDPEVIQSITGEGDFTKEIYSAYEDLAILSGRGLVTTATKDPDWILAHKLLMPAFSARAMKAYHDIMGKCILDLLKIMESYQECGEAIDMSRWMISLALESIGVIGFGYNFNLLDDKDSERHPFSVALNYVQSMIMKRTNSVTWTKWLQTTANVRFRRDLATLRDTVDDVLKQRRLNPPSEDARRDLLDFMLAAESKQGEKLDDNLIRDEIITFLSAGHNTTSSFLSWTFFELARNPDVEQKILQEIVNAGIKPGEIPSTEQVAKCKYIDMVIKESLRFHSPIPLVIKYCQNDCTIKTSEGKEYEIKRGQLAQIQISAVHKDPKLWENPNVFDPERFNPEKEADRHPCAWIPFSDGPRACIGRQFSLQEGKLALIMLLCKFRFRLLDETKEVGYQIIVSLKPVDLIMKVLPAELPSPNAGSDTSSVKDTVKPQLKPKENEVLEHARFPLPPVTFLYGTQTGTSEEYARKLSGQAKEFGFTDIAVAELDDWEVVKNNRIPSNKGQSSPSDEDGTKVSQLAVIVTATYNGYPPDNALKFDSWLTDITKDQKNQLEGLLYAVFGCGNKQWQSTFQAFPKKVDASIELLGAERLVPAGAGNADQDIDGDFTNWSASFWAALMQKYGRGASDKDADLMTTSGPVADPSNDFTLEFLPLGGDQAAMEAALGNRNSDPGAQVAILENKELQDVEKSGRSTRHIVVECPPASPGSGKKASYRAGDHLEIKPYNDDQLVENIAIGFGYVLDSVFQIKDCKITNLSPRSLAANIIGPCTVRNALTYFADLSGPPTRYTLTVMAKQLEKTRPDVAERLLHALQPGKETPRLREFLSTHRTILDIQRAFKIKELSFKEFLSSVNVIVPRRYSISSGPLEHPNEVSVTVGVVKDIGGADNNTDYYGLASGYLMRCPIGSKIDAKIKPCKNNFRLPENEQTPVIFICAGTGFAPFRGFLQERHAKGWKSKEKGGSSDAYLFFGCRHPDHDFIYQKELEEYLEDGTLTKLYTTFSRYNQTKKYVQHLLLTHAQLLFNLIMNENANIYVCGAGRGMAHDVRRTFERLAVQVAGMSEPEAVDAISHMVDAERYNEDVWG
大腸菌(E.coli)ゲノム用にコドン最適化されたORX85448.1のヌクレオチド配列(配列番号4):
ATGAGCAGCCAGAGCGATGAAATTCCGGGCCCGAAACCGCATATTCTGCTGGGTAATGTTCAGGATATTATTCCGGATACCATTGGCAATCATCGCCGTCTGCATGATGAATATGGCCCGGTTATGCGTCTGTATCTGGGTGGTCATGATTTTGTGAGCATTTGTGATCCGGAAGTGATTCAGAGCATTACCGGCGAAGGCGATTTTACCAAAGAAATCTATAGCGCATACGAAGATCTGGCAATTCTGAGCGGCCGTGGCCTGGTTACCACCGCAACCAAAGATCCGGATTGGATTCTGGCCCATAAACTGCTGATGCCGGCCTTTAGTGCCCGCGCAATGAAAGCCTATCATGATATTATGGGTAAATGTATTCTGGATCTGCTGAAAATTATGGAAAGCTATCAGGAATGTGGTGAAGCCATTGATATGAGCCGTTGGATGATTAGCCTGGCACTGGAAAGTATTGGCGTTATTGGTTTTGGCTATAATTTTAATCTGCTGGATGATAAAGACAGCGAACGCCATCCGTTTAGCGTTGCACTGAATTATGTGCAGAGTATGATTATGAAACGCACCAATAGCGTTACCTGGACCAAATGGCTGCAGACCACCGCCAATGTGCGTTTTCGTCGCGATCTGGCCACCCTGCGCGATACCGTGGATGATGTGCTGAAACAGCGTCGTCTGAATCCGCCGAGCGAAGATGCCCGCCGCGATCTGCTGGATTTTATGCTGGCCGCCGAAAGCAAACAGGGCGAAAAACTGGATGATAATCTGATTCGCGATGAAATTATTACCTTTCTGAGTGCAGGCCATAATACCACCAGTAGTTTTCTGAGTTGGACCTTTTTCGAACTGGCCCGCAATCCGGATGTGGAACAGAAAATTCTGCAGGAAATTGTGAATGCCGGCATTAAGCCGGGTGAAATTCCGAGTACCGAACAGGTGGCCAAATGTAAATATATTGATATGGTTATCAAGGAGAGCCTGCGCTTTCATAGCCCGATTCCGCTGGTTATTAAGTATTGTCAGAATGATTGCACCATTAAGACCAGTGAAGGTAAAGAATATGAAATTAAGCGCGGCCAGCTGGCCCAGATTCAGATTAGCGCCGTGCATAAAGATCCGAAACTGTGGGAAAATCCGAATGTGTTTGATCCGGAACGCTTTAATCCGGAAAAAGAAGCAGATCGTCATCCGTGTGCATGGATTCCGTTTAGCGATGGTCCGCGTGCCTGCATTGGTCGCCAGTTTAGCCTGCAGGAAGGTAAACTGGCCCTGATTATGCTGCTGTGCAAATTTCGTTTTCGTCTGCTGGATGAAACCAAAGAAGTGGGTTATCAGATTATTGTGAGCCTGAAACCGGTGGATCTGATTATGAAAGTGCTGCCGGCAGAACTGCCGAGTCCGAATGCCGGCAGCGATACCAGTAGTGTGAAAGATACCGTTAAACCGCAGCTGAAACCGAAAGAAAATGAAGTGCTGGAACATGCCCGTTTTCCGCTGCCGCCGGTTACCTTTCTGTATGGTACCCAGACCGGCACCAGTGAAGAATATGCACGCAAACTGAGTGGTCAGGCAAAAGAATTTGGCTTTACCGATATTGCCGTGGCAGAACTGGATGATTGGGAAGTTGTTAAAAATAATCGTATCCCGAGTAATAAGGGTCAGAGTAGTCCGAGCGATGAAGATGGCACCAAAGTGAGCCAGCTGGCTGTTATTGTTACCGCAACCTATAATGGTTATCCGCCGGATAATGCACTGAAATTTGATAGCTGGCTGACCGATATTACCAAAGATCAGAAAAATCAGCTGGAAGGTCTGCTGTATGCCGTGTTTGGTTGTGGCAATAAGCAGTGGCAGAGCACCTTTCAGGCATTTCCGAAAAAAGTGGATGCCAGTATTGAACTGCTGGGCGCAGAACGTCTGGTGCCGGCAGGCGCAGGCAATGCCGATCAGGATATTGATGGTGACTTTACCAATTGGAGTGCCAGCTTTTGGGCCGCACTGATGCAGAAATATGGCCGCGGCGCCAGTGATAAAGATGCCGATCTGATGACCACCAGTGGCCCGGTGGCCGATCCGAGTAATGATTTTACCCTGGAATTTCTGCCGCTGGGTGGTGACCAGGCAGCAATGGAAGCAGCCCTGGGTAATCGTAATAGCGATCCGGGCGCACAGGTGGCCATTCTGGAAAATAAGGAACTGCAGGATGTTGAAAAAAGTGGCCGTAGTACCCGCCATATTGTTGTTGAATGCCCGCCGGCCAGCCCGGGCAGTGGTAAAAAAGCAAGTTATCGCGCCGGTGACCATCTGGAAATTAAGCCGTATAATGATGATCAGCTGGTGGAAAATATTGCCATTGGCTTTGGCTATGTTCTGGATAGTGTTTTTCAGATTAAGGATTGCAAAATCACCAATCTGAGTCCGCGCAGTCTGGCCGCCAATATTATTGGTCCGTGCACCGTTCGCAATGCCCTGACCTATTTTGCCGATCTGAGTGGTCCGCCGACCCGCTATACCCTGACCGTGATGGCAAAACAGCTGGAAAAAACCCGCCCGGATGTGGCAGAACGTTTACTGCATGCACTGCAGCCGGGCAAAGAAACCCCGCGCCTGCGCGAATTTCTGAGTACCCATCGTACCATTCTGGATATTCAGCGCGCCTTTAAAATTAAGGAACTGAGCTTTAAAGAGTTCCTGAGCAGTGTTAATGTTATTGTTCCGCGCCGCTATAGTATTAGCAGCGGCCCGCTGGAACATCCGAATGAAGTGAGTGTGACCGTGGGTGTTGTTAAAGATATTGGCGGTGCAGATAATAATACCGATTATTATGGTCTGGCCAGTGGTTATCTGATGCGCTGCCCGATTGGTAGTAAAATTGATGCCAAAATTAAGCCGTGCAAAAATAATTTTCGCCTGCCGGAAAATGAACAGACCCCGGTTATTTTTATTTGCGCCGGCACCGGCTTTGCCCCGTTTCGTGGTTTTCTGCAGGAACGCCATGCCAAAGGTTGGAAAAGTAAAGAAAAAGGCGGTAGTAGCGATGCATATCTGTTTTTCGGCTGTCGTCATCCGGATCATGATTTTATCTATCAGAAAGAACTGGAAGAATACCTGGAAGATGGTACCCTGACCAAACTGTATACCACCTTTAGCCGCTATAATCAGACCAAAAAATATGTGCAGCATCTGCTGCTGACCCATGCCCAGCTGCTGTTTAATCTGATTATGAATGAAAACGCAAACATCTATGTGTGTGGTGCAGGCCGTGGCATGGCCCATGATGTGCGCCGCACCTTTGAACGCCTGGCAGTTCAGGTTGCAGGCATGAGCGAACCGGAAGCCGTGGATGCCATTAGTCACATGGTTGATGCCGAACGCTATAATGAAGATGTTTGGGGTTAA
ATGAGCAGCCAGAGCGATGAAATTCCGGGCCCGAAACCGCATATTCTGCTGGGTAATGTTCAGGATATTATTCCGGATACCATTGGCAATCATCGCCGTCTGCATGATGAATATGGCCCGGTTATGCGTCTGTATCTGGGTGGTCATGATTTTGTGAGCATTTGTGATCCGGAAGTGATTCAGAGCATTACCGGCGAAGGCGATTTTACCAAAGAAATCTATAGCGCATACGAAGATCTGGCAATTCTGAGCGGCCGTGGCCTGGTTACCACCGCAACCAAAGATCCGGATTGGATTCTGGCCCATAAACTGCTGATGCCGGCCTTTAGTGCCCGCGCAATGAAAGCCTATCATGATATTATGGGTAAATGTATTCTGGATCTGCTGAAAATTATGGAAAGCTATCAGGAATGTGGTGAAGCCATTGATATGAGCCGTTGGATGATTAGCCTGGCACTGGAAAGTATTGGCGTTATTGGTTTTGGCTATAATTTTAATCTGCTGGATGATAAAGACAGCGAACGCCATCCGTTTAGCGTTGCACTGAATTATGTGCAGAGTATGATTATGAAACGCACCAATAGCGTTACCTGGACCAAATGGCTGCAGACCACCGCCAATGTGCGTTTTCGTCGCGATCTGGCCACCCTGCGCGATACCGTGGATGATGTGCTGAAACAGCGTCGTCTGAATCCGCCGAGCGAAGATGCCCGCCGCGATCTGCTGGATTTTATGCTGGCCGCCGAAAGCAAACAGGGCGAAAAACTGGATGATAATCTGATTCGCGATGAAATTATTACCTTTCTGAGTGCAGGCCATAATACCACCAGTAGTTTTCTGAGTTGGACCTTTTTCGAACTGGCCCGCAATCCGGATGTGGAACAGAAAATTCTGCAGGAAATTGTGAATGCCGGCATTAAGCCGGGTGAAATTCCGAGTACCGAACAGGTGGCCAAATGTAAATATATTGATATGGTTATCAAGGAGAGCCTGCGCTTTCATAGCCCGATTCCGCTGGTTATTAAGTATTGTCAGAATGATTGCACCATTAAGACCAGTGAAGGTAAAGAATATGAAATTAAGCGCGGCCAGCTGGCCCAGATTCAGATTAGCGCCGTGCATAAAGATCCGAAACTGTGGGAAAATCCGAATGTGTTTGATCCGGAACGCTTTAATCCGGAAAAAGAAGCAGATCGTCATCCGTGTGCATGGATTCCGTTTAGCGATGGTCCGCGTGCCTGCATTGGTCGCCAGTTTAGCCTGCAGGAAGGTAAACTGGCCCTGATTATGCTGCTGTGCAAATTTCGTTTTCGTCTGCTGGATGAAACCAAAGAAGTGGGTTATCAGATTATTGTGAGCCTGAAACCGGTGGATCTGATTATGAAAGTGCTGCCGGCAGAACTGCCGAGTCCGAATGCCGGCAGCGATACCAGTAGTGTGAAAGATACCGTTAAACCGCAGCTGAAACCGAAAGAAAATGAAGTGCTGGAACATGCCCGTTTTCCGCTGCCGCCGGTTACCTTTCTGTATGGTACCCAGACCGGCACCAGTGAAGAATATGCACGCAAACTGAGTGGTCAGGCAAAAGAATTTGGCTTTACCGATATTGCCGTGGCAGAACTGGATGATTGGGAAGTTGTTAAAAATAATCGTATCCCGAGTAATAAGGGTCAGAGTAGTCCGAGCGATGAAGATGGCACCAAAGTGAGCCAGCTGGCTGTTATTGTTACCGCAACCTATAATGGTTATCCGCCGGATAATGCACTGAAATTTGATAGCTGGCTGACCGATATTACCAAAGATCAGAAAAATCAGCTGGAAGGTCTGCTGTATGCCGTGTTTGGTTGTGGCAATAAGCAGTGGCAGAGCACCTTTCAGGCATTTCCGAAAAAAGTGGATGCCAGTATTGAACTGCTGGGCGCAGAACGTCTGGTGCCGGCAGGCGCAGGCAATGCCGATCAGGATATTGATGGTGACTTTACCAATTGGAGTGCCAGCTTTTGGGCCGCACTGATGCAGAAATATGGCCGCGGCGCCAGTGATAAAGATGCCGATCTGATGACCACCAGTGGCCCGGTGGCCGATCCGAGTAATGATTTTACCCTGGAATTTCTGCCGCTGGGTGGTGACCAGGCAGCAATGGAAGCAGCCCTGGGTAATCGTAATAGCGATCCGGGCGCACAGGTGGCCATTCTGGAAAATAAGGAACTGCAGGATGTTGAAAAAAGTGGCCGTAGTACCCGCCATATTGTTGTTGAATGCCCGCCGGCCAGCCCGGGCAGTGGTAAAAAAGCAAGTTATCGCGCCGGTGACCATCTGGAAATTAAGCCGTATAATGATGATCAGCTGGTGGAAAATATTGCCATTGGCTTTGGCTATGTTCTGGATAGTGTTTTTCAGATTAAGGATTGCAAAATCACCAATCTGAGTCCGCGCAGTCTGGCCGCCAATATTATTGGTCCGTGCACCGTTCGCAATGCCCTGACCTATTTTGCCGATCTGAGTGGTCCGCCGACCCGCTATACCCTGACCGTGATGGCAAAACAGCTGGAAAAAACCCGCCCGGATGTGGCAGAACGTTTACTGCATGCACTGCAGCCGGGCAAAGAAACCCCGCGCCTGCGCGAATTTCTGAGTACCCATCGTACCATTCTGGATATTCAGCGCGCCTTTAAAATTAAGGAACTGAGCTTTAAAGAGTTCCTGAGCAGTGTTAATGTTATTGTTCCGCGCCGCTATAGTATTAGCAGCGGCCCGCTGGAACATCCGAATGAAGTGAGTGTGACCGTGGGTGTTGTTAAAGATATTGGCGGTGCAGATAATAATACCGATTATTATGGTCTGGCCAGTGGTTATCTGATGCGCTGCCCGATTGGTAGTAAAATTGATGCCAAAATTAAGCCGTGCAAAAATAATTTTCGCCTGCCGGAAAATGAACAGACCCCGGTTATTTTTATTTGCGCCGGCACCGGCTTTGCCCCGTTTCGTGGTTTTCTGCAGGAACGCCATGCCAAAGGTTGGAAAAGTAAAGAAAAAGGCGGTAGTAGCGATGCATATCTGTTTTTCGGCTGTCGTCATCCGGATCATGATTTTATCTATCAGAAAGAACTGGAAGAATACCTGGAAGATGGTACCCTGACCAAACTGTATACCACCTTTAGCCGCTATAATCAGACCAAAAAATATGTGCAGCATCTGCTGCTGACCCATGCCCAGCTGCTGTTTAATCTGATTATGAATGAAAACGCAAACATCTATGTGTGTGGTGCAGGCCGTGGCATGGCCCATGATGTGCGCCGCACCTTTGAACGCCTGGCAGTTCAGGTTGCAGGCATGAGCGAACCGGAAGCCGTGGATGCCATTAGTCACATGGTTGATGCCGAACGCTATAATGAAGATGTTTGGGGTTAA
Umbelopsis isabellinaシトクロムP450
アミノ酸配列(配列番号5):
MTVYESDKIPGPEPRVLLGNIPDVYPDFVGNITQLHEKYGPVMRLYLGGHDYVSVCDPDCLQTTHKDGEYFTKEIQSTYEDLAILNGRGLVTTATKDPDWILGHKLLMPAFSARAMKAYHYKMGDTIKDLLNIIESFQKSGEDFDVSRWMIALALESIGNIGFDYDFNLLKDPNAERHPFTVALSYVQSMIMKRSASVSWMKWMKTSANARFQRDLGTLRNTLDSVLKERHEHPHSEDQQSDLLDFMISASTKEGDKLDDKIIRDNVMTFLSAGHNTTSSFLSWTILELCRHPEVAATIRQELANAGVQPGEIPTPEQVNACKYLDLVIKESLRMHPPIVAVLKYCKKDCTIKAGTTGDEYKIKAGQLLQSNINALHHSTKVWDEPMVFNPDRFADAELHPNAWMPFSDGPRACIGRQFSLQEGKLALVMMLSKFNFSMEDPSQKIGYEIIVAIKPVGLMVKVTPAELPEPTEEIVVTQRRESKAEPQESLKPAEFPLPPVTILYGTQTNTSEEYAKKLSGQAKEFGFKTIKVDDLDNWKLLNGGKLTKLNKDQSAPSSGDDVKVSELVVVVTATYNGNPPDNAMKFDEWLSKKTESIEDTKSNELEGILYAVFGCGNRDWSSTFQKFPTAVDTGLELLGGERLLPAGVGDASDDIDGDFSEWSANFWSTLMQRYGQSSSGKNADIMTSTAPLADPSKDFNLEFLPVHKNKELVTQANENRNQRGKTVTIKENRELQNIEKSHRSTKHIEVQFDKSEDGKPLYIAGDHLEITPVNKEELVELVAVNLGLVLDSVFQIQMNEVDISHLSPRSLAANIKGPCTIRNALKYYADLTGPPTRYTLSVLGKQLEKTRPEIAKRLQEALQPGKETPRLKEFLSTHRTFVDIMKAFNIKELNFKEFLSSVNCIVPRKYSISSGPTEHPFDPSVSIGIVRDIGGPDGKTEYRGLASGYLDTLKPGSQVNAQIKDCKSTFRLPDDGSTPVIFICAGTGMSPFRGFLQERHAQGLKSSKKGGSSEAYMFFGCRHPDQDFIYKDELQSYVEDGTLTELYTTFSRSNQVVKYVQHSLLQHAQMLYELMVDHNAKVYVCGSAGSMAKDVKRTWERITVQMSGMSEPEAEDLLKEWSDKGKYNEDVWGT
アミノ酸配列(配列番号5):
MTVYESDKIPGPEPRVLLGNIPDVYPDFVGNITQLHEKYGPVMRLYLGGHDYVSVCDPDCLQTTHKDGEYFTKEIQSTYEDLAILNGRGLVTTATKDPDWILGHKLLMPAFSARAMKAYHYKMGDTIKDLLNIIESFQKSGEDFDVSRWMIALALESIGNIGFDYDFNLLKDPNAERHPFTVALSYVQSMIMKRSASVSWMKWMKTSANARFQRDLGTLRNTLDSVLKERHEHPHSEDQQSDLLDFMISASTKEGDKLDDKIIRDNVMTFLSAGHNTTSSFLSWTILELCRHPEVAATIRQELANAGVQPGEIPTPEQVNACKYLDLVIKESLRMHPPIVAVLKYCKKDCTIKAGTTGDEYKIKAGQLLQSNINALHHSTKVWDEPMVFNPDRFADAELHPNAWMPFSDGPRACIGRQFSLQEGKLALVMMLSKFNFSMEDPSQKIGYEIIVAIKPVGLMVKVTPAELPEPTEEIVVTQRRESKAEPQESLKPAEFPLPPVTILYGTQTNTSEEYAKKLSGQAKEFGFKTIKVDDLDNWKLLNGGKLTKLNKDQSAPSSGDDVKVSELVVVVTATYNGNPPDNAMKFDEWLSKKTESIEDTKSNELEGILYAVFGCGNRDWSSTFQKFPTAVDTGLELLGGERLLPAGVGDASDDIDGDFSEWSANFWSTLMQRYGQSSSGKNADIMTSTAPLADPSKDFNLEFLPVHKNKELVTQANENRNQRGKTVTIKENRELQNIEKSHRSTKHIEVQFDKSEDGKPLYIAGDHLEITPVNKEELVELVAVNLGLVLDSVFQIQMNEVDISHLSPRSLAANIKGPCTIRNALKYYADLTGPPTRYTLSVLGKQLEKTRPEIAKRLQEALQPGKETPRLKEFLSTHRTFVDIMKAFNIKELNFKEFLSSVNCIVPRKYSISSGPTEHPFDPSVSIGIVRDIGGPDGKTEYRGLASGYLDTLKPGSQVNAQIKDCKSTFRLPDDGSTPVIFICAGTGMSPFRGFLQERHAQGLKSSKKGGSSEAYMFFGCRHPDQDFIYKDELQSYVEDGTLTELYTTFSRSNQVVKYVQHSLLQHAQMLYELMVDHNAKVYVCGSAGSMAKDVKRTWERITVQMSGMSEPEAEDLLKEWSDKGKYNEDVWGT
大腸菌(E.coli)ゲノム用にコドン最適化されたヌクレオチド配列(配列番号6):
ATGACCGTGTATGAAAGCGATAAAATTCCGGGTCCGGAACCGCGCGTTCTGCTGGGTAATATTCCGGATGTTTATCCGGATTTTGTTGGCAATATTACCCAGCTGCATGAAAAATATGGTCCGGTTATGCGTCTGTATCTGGGCGGCCATGATTATGTGAGTGTTTGTGATCCGGATTGTCTGCAGACCACCCATAAAGATGGTGAATATTTTACCAAAGAGATCCAGAGCACCTATGAAGATCTGGCCATTCTGAATGGCCGTGGCCTGGTGACCACCGCCACCAAAGATCCGGATTGGATTCTGGGCCATAAACTGCTGATGCCGGCATTTTCAGCCCGCGCCATGAAAGCCTATCATTATAAAATGGGTGACACCATTAAGGATCTGCTGAATATTATTGAAAGTTTTCAGAAGTCCGGTGAAGATTTTGATGTTAGCCGTTGGATGATTGCCCTGGCACTGGAAAGCATTGGCAATATTGGTTTTGATTATGATTTCAACCTGCTGAAAGATCCGAATGCCGAACGTCATCCGTTTACCGTTGCCCTGAGTTATGTTCAGAGTATGATTATGAAACGCAGTGCAAGCGTTAGCTGGATGAAATGGATGAAAACCAGTGCCAATGCCCGCTTTCAGCGTGATCTGGGTACCCTGCGCAATACCCTGGATAGTGTGCTGAAAGAACGCCATGAACATCCGCATAGCGAAGATCAGCAGAGCGATCTGCTGGATTTTATGATTAGTGCCAGTACCAAAGAAGGCGATAAACTGGATGATAAAATTATTCGCGATAACGTTATGACCTTTCTGAGCGCAGGTCATAATACCACCAGCAGTTTTCTGAGTTGGACCATTCTGGAACTGTGCCGTCATCCGGAAGTTGCCGCAACCATTCGTCAGGAACTGGCAAATGCCGGTGTGCAGCCGGGTGAAATTCCGACCCCGGAACAGGTGAATGCCTGTAAATATCTGGATCTGGTTATTAAGGAAAGCCTGCGTATGCATCCGCCGATTGTGGCAGTTCTGAAATATTGTAAAAAGGATTGTACCATCAAGGCCGGTACCACCGGTGACGAATATAAAATTAAGGCAGGCCAGCTGCTGCAGAGCAATATTAATGCACTGCATCATAGCACCAAAGTTTGGGATGAACCGATGGTTTTTAATCCGGATCGTTTTGCCGATGCAGAACTGCATCCGAATGCCTGGATGCCGTTTAGTGATGGTCCGCGTGCCTGTATTGGCCGTCAGTTTAGCCTGCAGGAAGGCAAACTGGCACTGGTTATGATGCTGAGCAAATTCAATTTTAGCATGGAAGATCCGAGCCAGAAAATTGGCTATGAAATTATTGTGGCCATTAAGCCGGTGGGCCTGATGGTGAAAGTGACCCCGGCCGAACTGCCGGAACCGACCGAAGAAATTGTTGTTACCCAGCGCCGTGAAAGTAAAGCAGAACCGCAGGAAAGTCTGAAACCGGCCGAATTTCCGCTGCCGCCGGTTACCATTCTGTATGGCACCCAGACCAATACCAGCGAAGAATATGCAAAAAAGCTGAGCGGCCAGGCCAAAGAATTTGGTTTTAAAACCATTAAGGTGGATGATCTGGATAATTGGAAACTGCTGAATGGCGGTAAACTGACCAAACTGAATAAGGATCAGAGTGCACCGAGTAGTGGTGACGATGTGAAAGTGAGTGAACTGGTGGTGGTTGTTACCGCAACCTATAATGGCAATCCGCCGGATAATGCAATGAAATTTGATGAATGGCTGAGTAAAAAGACCGAAAGCATTGAAGATACCAAAAGCAATGAACTGGAAGGCATTCTGTATGCAGTTTTTGGCTGCGGCAATCGTGATTGGAGCAGTACCTTTCAGAAATTTCCGACCGCAGTGGATACCGGTCTGGAACTGCTGGGCGGCGAACGTCTGCTGCCGGCAGGCGTTGGCGATGCCAGTGATGATATTGATGGCGATTTTAGCGAATGGAGCGCAAATTTTTGGAGTACCCTGATGCAGCGTTATGGTCAGAGCAGTAGCGGCAAAAATGCAGATATTATGACCAGCACCGCACCGCTGGCAGATCCGAGTAAAGATTTTAATCTGGAATTTCTGCCGGTGCATAAAAATAAGGAACTGGTGACCCAGGCAAATGAAAATCGCAATCAGCGCGGTAAAACCGTGACCATTAAGGAAAATCGCGAACTGCAGAATATTGAAAAAAGCCATCGTAGTACCAAACATATTGAAGTTCAGTTTGATAAGAGCGAAGATGGTAAACCGCTGTATATTGCCGGTGACCATCTGGAAATTACCCCGGTTAATAAGGAAGAACTGGTTGAACTGGTGGCCGTTAATCTGGGTCTGGTGCTGGATAGCGTGTTTCAGATTCAGATGAATGAAGTTGATATTAGTCACCTGAGCCCGCGCAGTCTGGCAGCAAATATTAAGGGCCCGTGCACCATTCGCAATGCACTGAAATATTATGCAGATCTGACCGGTCCGCCGACCCGTTATACCCTGAGTGTGCTGGGTAAACAGCTGGAAAAAACCCGTCCGGAAATTGCCAAACGTCTGCAGGAAGCCCTGCAGCCGGGCAAAGAAACCCCGCGCCTGAAAGAATTTCTGAGTACCCATCGTACCTTTGTTGATATTATGAAAGCATTCAATATCAAGGAGCTGAATTTTAAAGAGTTCCTGAGCAGTGTGAATTGTATTGTGCCGCGCAAATATAGCATTAGTAGTGGTCCGACCGAACATCCGTTTGATCCGAGCGTGAGCATTGGTATTGTTCGCGATATTGGTGGTCCGGATGGCAAAACCGAATATCGCGGTCTGGCAAGCGGCTATCTGGATACCCTGAAACCGGGTAGTCAGGTGAATGCGCAGATTAAGGATTGTAAAAGTACCTTTCGCCTGCCGGATGATGGTAGCACCCCGGTTATTTTTATTTGCGCCGGTACCGGCATGAGCCCGTTTCGTGGCTTTCTGCAGGAACGCCATGCCCAGGGTCTGAAAAGCAGTAAAAAAGGTGGCAGTAGTGAAGCATATATGTTTTTCGGTTGCCGCCATCCGGATCAGGATTTTATCTATAAAGATGAACTGCAGAGTTACGTTGAAGATGGTACCCTGACCGAACTGTATACCACCTTTAGTCGTAGTAATCAGGTGGTTAAATATGTGCAGCATAGCCTGCTGCAGCATGCACAGATGCTGTATGAACTGATGGTGGATCATAATGCAAAAGTTTATGTTTGTGGCAGCGCCGGTAGCATGGCAAAAGATGTTAAACGCACCTGGGAACGCATTACCGTTCAGATGAGTGGCATGAGCGAACCGGAAGCCGAAGATCTGCTGAAAGAATGGAGCGATAAAGGCAAATATAATGAAGATGTGTGGGGCACCTAA
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