JP2021530996A - ガンマラクトンの生合成生産 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、各々の開示がこれにより全体が参照により本明細書に組み込まれる、2018年7月17日に出願された米国仮特許出願第62/699,374号、および2018年11月9日に出願された米国仮特許出願第62/758,019号に基づく優先権および利益を主張する。
本発明の分野は、組換えタンパク質および/またはこのような組換えタンパク質を発現するように改変された微生物培養物を介してガンマラクトンを生成するための方法およびプロセスに関する。より具体的には、本開示は、酵素的変換を介した対応するカルボン酸基質からのC4〜C20ガンマラクトンの生産に関する。
心地よい味および匂いを有する食品、フレグランスおよび化粧品に対する普遍的な欲求が存在する。多くの場合、これらの心地よい匂いおよび味の特性は、望ましい芳香および香味の特徴を有するさまざまなガンマラクトンを含むさまざまなラクトン化合物を通して提供される。ラクトン化合物の現在の需要は、主に化学合成または植物からの抽出プロセスのいずれかによって対処されている。植物抽出ベースの生産には、目的の化合物の強度および存在量に対する天候の影響、植物病害および/または不作のリスク、化合物の安定性、生産増加の環境への影響、ならびに貿易制限などの重大な欠点がある。工業生産は環境に損害を与えるおそれがあり、危険な前駆体を使用する可能性があり、重要な基質のコストのためにそれ自体がコストの増加にさらされる可能性がある。
本発明によると、ガンマラクトンは、細菌および/または酵母などの微生物を使用する遺伝子改変および発酵技術によって、高収率で確実に生産され得る。これらの微生物は、新規に、または脂肪酸の生体内変換によってラクトンを合成して、商業的に有意な収量を提供することができる。したがって、ガンマラクトン生産のコストを削減し、これらのラクトン化合物を抽出できる天然資源の大規模な培養および処理の環境への影響を軽減するための新しい生産方法が本明細書で提供される。
図1を参照すると、脂肪酸からのガンマラクトンの生合成生産は、少なくとも2つの異なる経路を介して実施することができる。β酸化経路によると、オメガ炭素(例えば、ω−1、ω−2、ω−3、ω−4、ω−5、ω−6等)に近いヒドロキシル基を有する中鎖(C6〜C12)または長鎖脂肪酸(C13〜C21)を、酵母とインキュベートして、各β酸化サイクルがヒドロキシル化炭素原子とカルボニル炭素原子との間の炭化水素骨格フラグメントからC2残基を除去する複数のβ酸化サイクルを引き起こすことができる(ステップa1)。このような炭化水素骨格フラグメント内に奇数の炭素原子があるか偶数の炭素原子があるかに応じて、4−ヒドロキシ(ガンマ−ヒドロキシ)または5−ヒドロキシ(デルタ−ヒドロキシ)脂肪酸が生じることができ、酸性条件下でのラクトン化(ステップa2)で、ガンマラクトンまたはデルタラクトンのいずれかが生産される。
本明細書に記載される方法は、いくつかの実施形態で、C4〜C20カルボン酸基質からのC4〜C20ガンマラクトンの生産を提供する。いくつかの実施形態では、このようなガンマラクトンを生成する方法が、(a)異種シトクロムP450(CYP450)タンパク質を発現する細胞系をC4〜C20カルボン酸基質と共にインキュベートして、4−ヒドロキシC4〜C20カルボン酸を提供することと、(b)4−ヒドロキシカルボン酸を酸性条件に接触させるまたは供して、C4〜C20ガンマラクトンを生成することとを含む。
シトクロムP450(CYP450)タンパク質は、一般に、基質の酸化を触媒する酵素である。CYP450タンパク質は、ヘムタンパク質スーパーファミリーのメンバーであり、補因子としてヘムを含む。CYP450酵素は、それだけに限らないが、動物、植物、真菌、細菌、古細菌およびウイルスを含む多くの生物で同定されている。しかしながら、本発明者らの知識の限りでは、本発明以前は、特異的なカルボン酸4−ヒドロキシラーゼ活性を有するCYP450酵素は報告されていなかった。
本明細書に記載される方法によると、C4〜C20カルボン酸基質は、4−ヒドロキシカルボン酸に変換され得る。カルボン酸基質はカルボン酸および/またはその誘導体であり得る。例えば、C4〜C20カルボン酸基質は、C4〜C20カルボン酸:C4〜C20カルボン酸の塩;C4〜C20カルボン酸のエステル;C4〜C20カルボン酸のモノ−、ジ−もしくはトリグリセリド;またはこれらの組み合わせを含むことができる。本明細書で使用される場合、C4〜C20は、4〜20個の炭素原子を有する有機化合物を示す。C4〜C20によって表される範囲は、それだけに限らないが、C5〜C20、C6〜C20、C7〜C20、C8〜C20、C9〜C20、C10〜C20、C6〜C14、C7〜C14、C8〜C14、C9〜C14、C10〜C14等を含む、その中の任意の範囲を伝えることを意図している。したがって、本明細書に記載されるカルボン酸基質は、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20個の炭素原子を有するカルボン酸またはその誘導体を含むことができる。特定の実施形態では、C4〜C20カルボン酸基質がC4〜C20カルボン酸またはその塩であり得る。限定されないが、基質酸は、そのナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、アンモニウム塩などの形態であり得る。
本明細書に記載される方法によると、カルボン酸基質が、本明細書に記載されるCYP450タンパク質の存在下で4−ヒドロキシカルボン酸に変換される。酸性にすると、4−ヒドロキシカルボン酸は対応するガンマラクトンに変換され得る。酸性化は、塩酸、酢酸などの酸で行うことができる。本開示によると、本明細書で提供される方法は、4−ヒドロキシカルボン酸を、限定されないが、γ−ヘキサラクトン、γ−ヘキセノラクトン、γ−ヘプタラクトン、γ−ヘプテノラクトン、γ−オクタラクトン、γ−オクテノラクトン、γ−ノナラクトン、γ−ノネノラクトン、γ−デカラクトン、γ−デカセノラクトン、γ−ウンデカラクトン、γ−ウンデセノラクトン、γ−ドデカラクトン、γ−ドデセノラクトン、γ−トリデカラクトン、γ−トリデセノラクトン、γ−テトラデカラクトン、およびγ−テトラデセノラクトンを含むさまざまなγ−ラクトンに変換することができる。
本明細書で言及されるように、本方法による細胞系は、本明細書に記載されるCYP450タンパク質の発現を提供する任意の細胞を含むことができる。このような細胞系には、それだけに限らないが、細菌細胞、酵母細胞、植物細胞および動物細胞が含まれ得る。いくつかの実施形態では、細胞系が細菌細胞、酵母細胞またはこれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、細胞系が原核細胞、真核細胞およびこれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、細胞系がリボソームなどの細胞成分に基づくタンパク質のインビトロ発現を含む。
細胞培養物は、培養物中の任意の細胞を指す。培養またはインキュベートは、細胞を制御された条件下で、典型的にはその天然環境の外で増殖させるプロセスである。例えば、酵母細胞などの細胞は、液体栄養ブロス中の細胞懸濁液として増殖させられ得る。細胞培養物には、それだけに限らないが、細菌細胞培養物、酵母細胞培養物、植物細胞培養物および動物細胞培養物が含まれる。いくつかの実施形態では、細胞培養物が細菌細胞、酵母細胞またはこれらの組み合わせを含む。
ここで使用される標準的な組換えDNAおよび分子クローニング技術は当技術分野で周知であり、例えば、各々の全体がこれにより参照により本明細書に組み込まれる、Sambrook,J.、Fritsch,E.F.およびManiatis,T.Molecular Cloning:A Laboratory Manual、第2版;Cold Spring Harbor Laboratory:Cold Spring Harbor、N.Y.、1989(以下「Maniatis」);およびSilhavy,T.J.、Bennan,M.L.およびEnquist,L.W.Experiments with Gene Fusions;Cold Spring Harbor Laboratory:Cold Spring Harbor、N.Y.、1984;およびAusubel,F.M.ら、In Current Protocols in Molecular Biology、Greene Publishing and Wiley−Interscienceによって出版、1987によって記載されている。
原核生物におけるタンパク質の発現は、ほとんどの場合、融合タンパク質または非融合タンパク質のいずれかの発現を指示する構成的または誘導性プロモーターを含むベクターを用いて細菌宿主細胞で行われる。融合ベクターは、そこにコードされるタンパク質、通常は組換えタンパク質のアミノ末端にいくつかのアミノ酸を付加する。このような融合ベクターは、典型的には、以下の3つの目的にかなう:1)組換えタンパク質の発現を増加させる;2)組換えタンパク質の溶解度を増加させる;および3)アフィニティー精製においてリガンドとして作用することによって、組換えタンパク質の精製を助ける。通常、タンパク質分解切断部位を融合部分と組換えタンパク質の接合部で導入して、融合タンパク質の精製に続いて融合部分から組換えタンパク質を分離できるようにする。このようなベクターは、本開示の範囲内にある。
いくつかの実施形態では、形質転換細胞が、細菌細胞、酵母細胞、藻類細胞、真菌細胞、植物細胞、昆虫細胞または動物細胞であり得る。いくつかの実施形態では、細胞が、カノーラ植物細胞、菜種植物細胞、ヤシ植物細胞、ヒマワリ植物細胞、ワタ植物細胞、トウモロコシ植物細胞、落花生植物細胞、亜麻植物細胞、ゴマ植物細胞、大豆植物細胞、およびペチュニア植物細胞からなる群から選択される植物細胞である。
本明細書で使用される場合、「配列同一性」は、2つの最適に整列されたポリヌクレオチドまたはペプチド配列が、成分、例えば、ヌクレオチドまたはアミノ酸のアラインメントのウィンドウ全体にわたって不変である程度を指す。試験配列と参照配列の整列されたセグメントの「同一性の割合(identity fraction)」は、2つの整列された配列によって共有される同一の成分の数を、参照配列セグメント内の成分の総数、すなわち、参照配列全体または参照配列のより小さな規定の部分で割ったものである。
同一性は、配列のアラインメント後の配列のペア間で同じであるアミノ酸の割合であり(これは、配列情報または構造情報またはいくらかの他の情報のみを使用して行うことができるが、通常は配列情報のみに基づく)、類似性は、ある類似性マトリックスを使用したアラインメントに基づいて割り当てられたスコアである。類似性指数は、以下のBLOSUM62、PAM250もしくはGONNETのいずれか1つ、またはタンパク質の配列アラインメントのために当業者によって使用される任意のマトリックスであり得る。
本明細書で使用される場合、単数形「a、an」および「the」は、文脈が明確に別段の指示をしない限り、複数の言及を含む。
シトクロムP450(CYP)酵素は、多種多様な有機基質(脂肪酸を含む)の酸化を触媒して、さまざまなヒドロキシル化化合物(ヒドロキシ脂肪酸を含む)を生成することができる。ただし、炭化水素骨格に沿ってヒドロキシル化が起こる炭素原子の位置が重要となり得る。例えば、さまざまなP450の中で、細菌および真菌P450 BM3酵素が、ω−1〜ω−3ヒドロキシ脂肪酸の形成を触媒することが報告されている。例えば、Miura,Y.およびFulco,A.J.、「ω−1,ω−2 and ω−3 Hydroxylation of Long−Chain Fatty Acids,Amides and Alcohols by a Soluble Enzyme System from Bacillus megatyerium」、Biochimica et Biophysica Acta‐Lipids and Lipid Metabolism、388(3):305−317(1975);ならびにKitazume,T.ら、「Fusarium oxysporum Fatty−acid Subterminal Hydroxylase(CYP505)Is a Membrane−bound Eukaryotic Counterpart of Bacillus megaterium Cytochrome P450BM3」、J.Bio.Chem.、275:39734−39740(2000)を参照されたい。
大腸菌(E.coli)でのタンパク質発現を促進するために、候補遺伝子の各々を大腸菌(E.coli)ゲノムに対してコドン最適化し、Gene Universal Inc.(Newark、ドイツ)によって合成した。
γ−ラクトン生産を分析するために、0.5mlの実施例2に記載される大腸菌(E.coli)培養物を取り、10μlの2N HClで酸性化し、次いで、室温で60分間振盪しながら0.5mlの酢酸エチルで抽出した。14,000rpmで15分間遠心分離した後、酢酸エチル相をGC/MSまたはGC/FID分析に使用した。
実施例2に記載される手順を、Mucor ambiguus P450を過剰発現する大腸菌(E.coli)培養物を使用して実施した。具体的には、大腸菌(E.coli)培養物の試料を採取し、脂肪酸基質を添加した2日後または16時間後に酸性化した。図2は、対応するカルボン酸からのさまざまなガンマラクトンの生産を示している:(a)エナント酸(ヘプタン酸、C7)からのγ−ヘプタラクトン(GC7)、(b)カプリル酸(オクタン酸、C8)からのγ−オクタラクトン(GC8)、(c)ペラルゴン酸(ノナン酸、C9)からのγ−ノナラクトン(GC9)、(d)カプリン酸(デカン酸、C10)からのγ−デカラクトン(GC10)、(e)ウンデシル酸(ウンデカン酸、C11)からのγ−ウンデカラクトン(GC11)、(f)ラウリン酸(ドデカン酸、C12)からのγ−ドデカラクトン(GC12)、(g)トリデシル酸(トリデカン酸、C13)からのγ−トリデカラクトン(GC13)、および(h)ミリスチン酸(テトラデカン酸、C14)からのγ−テトラデカラクトン(GC14)。
実施例2に記載される手順を、Basidiobolus meristosporus P450を過剰発現する大腸菌(E.coli)培養物を使用して実施した。具体的には、大腸菌(E.coli)培養物の試料を採取し、脂肪酸基質を添加した17時間後に酸性化した。図3は、対応するカルボン酸からのさまざまなガンマラクトンの生産を示している:(a)ウンデシル酸(ウンデカン酸、C11)からのγ−ウンデカラクトン(GC11)、および(b)ウンデシレン酸(ウンデセン酸、C11:1)からのγ−ウンデセノラクトン(GC11’)。
実施例2に記載される手順を、Umbelopsis isabellina P450を過剰発現する大腸菌(E.coli)培養物を使用して実施した。具体的には、大腸菌(E.coli)培養物の試料を採取し、脂肪酸基質を添加した25時間後に酸性化した。図4は、保持時間分で、対応するカルボン酸からのさまざまなガンマラクトンの生産を示している:(a)ウンデシル酸(ウンデカン酸、C11)からのγ−ウンデカラクトン(GC11)、および(b)ウンデシレン酸(ウンデセン酸、C11:1)からのγ−ウンデセノラクトン(GC11’)。
Mucor ambiguusシトクロムP450
GAN03094.1遺伝子のアミノ酸配列(配列番号1):
MTKYAHDQIPGPEPHYLLGNVPDIFPDSLGNLIKLHDKYGPIVHLSMGGHELLSVDDPAVLETICEDNEYFTKEIESVYSDLAILNGRGLVTTSTADPDWQLGHKLIMNAFSARAMKAYHYKMGESISELCEIMDSFAKSGEDFDVSRWFIALALESIGKIGFDYDFDLLKDPNAPRHPFTVALAYVQSMIMKRASTLSWLKWYQTTTNVRFHRDLQTLRGTVEEVLKDRREHPHTEADQSDLLDFMIKAESKEGEKLNDSLIRDNIITFLSAGHNTTSAFLSWTMLELCKHPEVVENIKQEIANCGIKAGEVPTPEQVKECKYLDLVIKESLRIHPPITSILKYCKKDATVKASNGDEYDIKAGQLLQVNINALHHNPKVWEDPDVFNPDRFSGDTDNLPNTAWLTFSTGPRACIGRQFALQEGKLALVMILSRFHFKMDDPSQKIGYAVVVSTKPVGFFAKIESSQLPEPTEEIVVTKRRESKAVPQEKVKPAEFPLPPVTFLFGTQTNTSEEYARKLSGQAKEMGFKEVTVQDLDDWKLVKGEAIAKAQHDADAPSSEDDVKVSELVVVVTATYNGFPPDDANEFAKWLDERTKDSEATKNNMLSGMLYAVFGCGNRDWTSTFQKFPKKVDSGFELLGGERLLPAGEGDASDDIDGDFSLWSASFWTALMQRYGQSSSGKNADIMSNNGPAADPSQDFTLEFINIVKEKVKTEQAALNCNQLETVATIVENRELQHTEKSHRSTRHIQVQFDKSVDGKPLYEAGDHLEVVPVNEDRLVEIIATNLGLVLDSVFEVKDLDIKNLSPRSVAANIKGPCTIRNALKYYADLTGPPTRFSLSILSKQLKDSRPDIAERLQKALQPGKETERLKEFLASHRTLIDIIQAFKIKELNFKEFISSVNCIVPRKYSISSGPLEHPFDPSISVGVVDTVGGPDGNTHYFGLASGYLSHQEPGTKINAQIKACKSTFRLPDDPSTPVIFIAAGTGFSPFRGFLQERHAKGLKSSKKNSNGESSECYMFFGCRHPDQDFIYKEEFDAYLEDGTITELYTTFSRSGEVVKYVQHALLKHANLLYKLMEESNAKVYICGSAGSMAKDVKRTWERLLVQMSGVSESEAAEQIQAWVDEGKYNEDVWGT
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ORX85448.1遺伝子のアミノ酸配列(配列番号3):
MSSQSDEIPGPKPHILLGNVQDIIPDTIGNHRRLHDEYGPVMRLYLGGHDFVSICDPEVIQSITGEGDFTKEIYSAYEDLAILSGRGLVTTATKDPDWILAHKLLMPAFSARAMKAYHDIMGKCILDLLKIMESYQECGEAIDMSRWMISLALESIGVIGFGYNFNLLDDKDSERHPFSVALNYVQSMIMKRTNSVTWTKWLQTTANVRFRRDLATLRDTVDDVLKQRRLNPPSEDARRDLLDFMLAAESKQGEKLDDNLIRDEIITFLSAGHNTTSSFLSWTFFELARNPDVEQKILQEIVNAGIKPGEIPSTEQVAKCKYIDMVIKESLRFHSPIPLVIKYCQNDCTIKTSEGKEYEIKRGQLAQIQISAVHKDPKLWENPNVFDPERFNPEKEADRHPCAWIPFSDGPRACIGRQFSLQEGKLALIMLLCKFRFRLLDETKEVGYQIIVSLKPVDLIMKVLPAELPSPNAGSDTSSVKDTVKPQLKPKENEVLEHARFPLPPVTFLYGTQTGTSEEYARKLSGQAKEFGFTDIAVAELDDWEVVKNNRIPSNKGQSSPSDEDGTKVSQLAVIVTATYNGYPPDNALKFDSWLTDITKDQKNQLEGLLYAVFGCGNKQWQSTFQAFPKKVDASIELLGAERLVPAGAGNADQDIDGDFTNWSASFWAALMQKYGRGASDKDADLMTTSGPVADPSNDFTLEFLPLGGDQAAMEAALGNRNSDPGAQVAILENKELQDVEKSGRSTRHIVVECPPASPGSGKKASYRAGDHLEIKPYNDDQLVENIAIGFGYVLDSVFQIKDCKITNLSPRSLAANIIGPCTVRNALTYFADLSGPPTRYTLTVMAKQLEKTRPDVAERLLHALQPGKETPRLREFLSTHRTILDIQRAFKIKELSFKEFLSSVNVIVPRRYSISSGPLEHPNEVSVTVGVVKDIGGADNNTDYYGLASGYLMRCPIGSKIDAKIKPCKNNFRLPENEQTPVIFICAGTGFAPFRGFLQERHAKGWKSKEKGGSSDAYLFFGCRHPDHDFIYQKELEEYLEDGTLTKLYTTFSRYNQTKKYVQHLLLTHAQLLFNLIMNENANIYVCGAGRGMAHDVRRTFERLAVQVAGMSEPEAVDAISHMVDAERYNEDVWG
ATGAGCAGCCAGAGCGATGAAATTCCGGGCCCGAAACCGCATATTCTGCTGGGTAATGTTCAGGATATTATTCCGGATACCATTGGCAATCATCGCCGTCTGCATGATGAATATGGCCCGGTTATGCGTCTGTATCTGGGTGGTCATGATTTTGTGAGCATTTGTGATCCGGAAGTGATTCAGAGCATTACCGGCGAAGGCGATTTTACCAAAGAAATCTATAGCGCATACGAAGATCTGGCAATTCTGAGCGGCCGTGGCCTGGTTACCACCGCAACCAAAGATCCGGATTGGATTCTGGCCCATAAACTGCTGATGCCGGCCTTTAGTGCCCGCGCAATGAAAGCCTATCATGATATTATGGGTAAATGTATTCTGGATCTGCTGAAAATTATGGAAAGCTATCAGGAATGTGGTGAAGCCATTGATATGAGCCGTTGGATGATTAGCCTGGCACTGGAAAGTATTGGCGTTATTGGTTTTGGCTATAATTTTAATCTGCTGGATGATAAAGACAGCGAACGCCATCCGTTTAGCGTTGCACTGAATTATGTGCAGAGTATGATTATGAAACGCACCAATAGCGTTACCTGGACCAAATGGCTGCAGACCACCGCCAATGTGCGTTTTCGTCGCGATCTGGCCACCCTGCGCGATACCGTGGATGATGTGCTGAAACAGCGTCGTCTGAATCCGCCGAGCGAAGATGCCCGCCGCGATCTGCTGGATTTTATGCTGGCCGCCGAAAGCAAACAGGGCGAAAAACTGGATGATAATCTGATTCGCGATGAAATTATTACCTTTCTGAGTGCAGGCCATAATACCACCAGTAGTTTTCTGAGTTGGACCTTTTTCGAACTGGCCCGCAATCCGGATGTGGAACAGAAAATTCTGCAGGAAATTGTGAATGCCGGCATTAAGCCGGGTGAAATTCCGAGTACCGAACAGGTGGCCAAATGTAAATATATTGATATGGTTATCAAGGAGAGCCTGCGCTTTCATAGCCCGATTCCGCTGGTTATTAAGTATTGTCAGAATGATTGCACCATTAAGACCAGTGAAGGTAAAGAATATGAAATTAAGCGCGGCCAGCTGGCCCAGATTCAGATTAGCGCCGTGCATAAAGATCCGAAACTGTGGGAAAATCCGAATGTGTTTGATCCGGAACGCTTTAATCCGGAAAAAGAAGCAGATCGTCATCCGTGTGCATGGATTCCGTTTAGCGATGGTCCGCGTGCCTGCATTGGTCGCCAGTTTAGCCTGCAGGAAGGTAAACTGGCCCTGATTATGCTGCTGTGCAAATTTCGTTTTCGTCTGCTGGATGAAACCAAAGAAGTGGGTTATCAGATTATTGTGAGCCTGAAACCGGTGGATCTGATTATGAAAGTGCTGCCGGCAGAACTGCCGAGTCCGAATGCCGGCAGCGATACCAGTAGTGTGAAAGATACCGTTAAACCGCAGCTGAAACCGAAAGAAAATGAAGTGCTGGAACATGCCCGTTTTCCGCTGCCGCCGGTTACCTTTCTGTATGGTACCCAGACCGGCACCAGTGAAGAATATGCACGCAAACTGAGTGGTCAGGCAAAAGAATTTGGCTTTACCGATATTGCCGTGGCAGAACTGGATGATTGGGAAGTTGTTAAAAATAATCGTATCCCGAGTAATAAGGGTCAGAGTAGTCCGAGCGATGAAGATGGCACCAAAGTGAGCCAGCTGGCTGTTATTGTTACCGCAACCTATAATGGTTATCCGCCGGATAATGCACTGAAATTTGATAGCTGGCTGACCGATATTACCAAAGATCAGAAAAATCAGCTGGAAGGTCTGCTGTATGCCGTGTTTGGTTGTGGCAATAAGCAGTGGCAGAGCACCTTTCAGGCATTTCCGAAAAAAGTGGATGCCAGTATTGAACTGCTGGGCGCAGAACGTCTGGTGCCGGCAGGCGCAGGCAATGCCGATCAGGATATTGATGGTGACTTTACCAATTGGAGTGCCAGCTTTTGGGCCGCACTGATGCAGAAATATGGCCGCGGCGCCAGTGATAAAGATGCCGATCTGATGACCACCAGTGGCCCGGTGGCCGATCCGAGTAATGATTTTACCCTGGAATTTCTGCCGCTGGGTGGTGACCAGGCAGCAATGGAAGCAGCCCTGGGTAATCGTAATAGCGATCCGGGCGCACAGGTGGCCATTCTGGAAAATAAGGAACTGCAGGATGTTGAAAAAAGTGGCCGTAGTACCCGCCATATTGTTGTTGAATGCCCGCCGGCCAGCCCGGGCAGTGGTAAAAAAGCAAGTTATCGCGCCGGTGACCATCTGGAAATTAAGCCGTATAATGATGATCAGCTGGTGGAAAATATTGCCATTGGCTTTGGCTATGTTCTGGATAGTGTTTTTCAGATTAAGGATTGCAAAATCACCAATCTGAGTCCGCGCAGTCTGGCCGCCAATATTATTGGTCCGTGCACCGTTCGCAATGCCCTGACCTATTTTGCCGATCTGAGTGGTCCGCCGACCCGCTATACCCTGACCGTGATGGCAAAACAGCTGGAAAAAACCCGCCCGGATGTGGCAGAACGTTTACTGCATGCACTGCAGCCGGGCAAAGAAACCCCGCGCCTGCGCGAATTTCTGAGTACCCATCGTACCATTCTGGATATTCAGCGCGCCTTTAAAATTAAGGAACTGAGCTTTAAAGAGTTCCTGAGCAGTGTTAATGTTATTGTTCCGCGCCGCTATAGTATTAGCAGCGGCCCGCTGGAACATCCGAATGAAGTGAGTGTGACCGTGGGTGTTGTTAAAGATATTGGCGGTGCAGATAATAATACCGATTATTATGGTCTGGCCAGTGGTTATCTGATGCGCTGCCCGATTGGTAGTAAAATTGATGCCAAAATTAAGCCGTGCAAAAATAATTTTCGCCTGCCGGAAAATGAACAGACCCCGGTTATTTTTATTTGCGCCGGCACCGGCTTTGCCCCGTTTCGTGGTTTTCTGCAGGAACGCCATGCCAAAGGTTGGAAAAGTAAAGAAAAAGGCGGTAGTAGCGATGCATATCTGTTTTTCGGCTGTCGTCATCCGGATCATGATTTTATCTATCAGAAAGAACTGGAAGAATACCTGGAAGATGGTACCCTGACCAAACTGTATACCACCTTTAGCCGCTATAATCAGACCAAAAAATATGTGCAGCATCTGCTGCTGACCCATGCCCAGCTGCTGTTTAATCTGATTATGAATGAAAACGCAAACATCTATGTGTGTGGTGCAGGCCGTGGCATGGCCCATGATGTGCGCCGCACCTTTGAACGCCTGGCAGTTCAGGTTGCAGGCATGAGCGAACCGGAAGCCGTGGATGCCATTAGTCACATGGTTGATGCCGAACGCTATAATGAAGATGTTTGGGGTTAA
アミノ酸配列(配列番号5):
MTVYESDKIPGPEPRVLLGNIPDVYPDFVGNITQLHEKYGPVMRLYLGGHDYVSVCDPDCLQTTHKDGEYFTKEIQSTYEDLAILNGRGLVTTATKDPDWILGHKLLMPAFSARAMKAYHYKMGDTIKDLLNIIESFQKSGEDFDVSRWMIALALESIGNIGFDYDFNLLKDPNAERHPFTVALSYVQSMIMKRSASVSWMKWMKTSANARFQRDLGTLRNTLDSVLKERHEHPHSEDQQSDLLDFMISASTKEGDKLDDKIIRDNVMTFLSAGHNTTSSFLSWTILELCRHPEVAATIRQELANAGVQPGEIPTPEQVNACKYLDLVIKESLRMHPPIVAVLKYCKKDCTIKAGTTGDEYKIKAGQLLQSNINALHHSTKVWDEPMVFNPDRFADAELHPNAWMPFSDGPRACIGRQFSLQEGKLALVMMLSKFNFSMEDPSQKIGYEIIVAIKPVGLMVKVTPAELPEPTEEIVVTQRRESKAEPQESLKPAEFPLPPVTILYGTQTNTSEEYAKKLSGQAKEFGFKTIKVDDLDNWKLLNGGKLTKLNKDQSAPSSGDDVKVSELVVVVTATYNGNPPDNAMKFDEWLSKKTESIEDTKSNELEGILYAVFGCGNRDWSSTFQKFPTAVDTGLELLGGERLLPAGVGDASDDIDGDFSEWSANFWSTLMQRYGQSSSGKNADIMTSTAPLADPSKDFNLEFLPVHKNKELVTQANENRNQRGKTVTIKENRELQNIEKSHRSTKHIEVQFDKSEDGKPLYIAGDHLEITPVNKEELVELVAVNLGLVLDSVFQIQMNEVDISHLSPRSLAANIKGPCTIRNALKYYADLTGPPTRYTLSVLGKQLEKTRPEIAKRLQEALQPGKETPRLKEFLSTHRTFVDIMKAFNIKELNFKEFLSSVNCIVPRKYSISSGPTEHPFDPSVSIGIVRDIGGPDGKTEYRGLASGYLDTLKPGSQVNAQIKDCKSTFRLPDDGSTPVIFICAGTGMSPFRGFLQERHAQGLKSSKKGGSSEAYMFFGCRHPDQDFIYKDELQSYVEDGTLTELYTTFSRSNQVVKYVQHSLLQHAQMLYELMVDHNAKVYVCGSAGSMAKDVKRTWERITVQMSGMSEPEAEDLLKEWSDKGKYNEDVWGT
ATGACCGTGTATGAAAGCGATAAAATTCCGGGTCCGGAACCGCGCGTTCTGCTGGGTAATATTCCGGATGTTTATCCGGATTTTGTTGGCAATATTACCCAGCTGCATGAAAAATATGGTCCGGTTATGCGTCTGTATCTGGGCGGCCATGATTATGTGAGTGTTTGTGATCCGGATTGTCTGCAGACCACCCATAAAGATGGTGAATATTTTACCAAAGAGATCCAGAGCACCTATGAAGATCTGGCCATTCTGAATGGCCGTGGCCTGGTGACCACCGCCACCAAAGATCCGGATTGGATTCTGGGCCATAAACTGCTGATGCCGGCATTTTCAGCCCGCGCCATGAAAGCCTATCATTATAAAATGGGTGACACCATTAAGGATCTGCTGAATATTATTGAAAGTTTTCAGAAGTCCGGTGAAGATTTTGATGTTAGCCGTTGGATGATTGCCCTGGCACTGGAAAGCATTGGCAATATTGGTTTTGATTATGATTTCAACCTGCTGAAAGATCCGAATGCCGAACGTCATCCGTTTACCGTTGCCCTGAGTTATGTTCAGAGTATGATTATGAAACGCAGTGCAAGCGTTAGCTGGATGAAATGGATGAAAACCAGTGCCAATGCCCGCTTTCAGCGTGATCTGGGTACCCTGCGCAATACCCTGGATAGTGTGCTGAAAGAACGCCATGAACATCCGCATAGCGAAGATCAGCAGAGCGATCTGCTGGATTTTATGATTAGTGCCAGTACCAAAGAAGGCGATAAACTGGATGATAAAATTATTCGCGATAACGTTATGACCTTTCTGAGCGCAGGTCATAATACCACCAGCAGTTTTCTGAGTTGGACCATTCTGGAACTGTGCCGTCATCCGGAAGTTGCCGCAACCATTCGTCAGGAACTGGCAAATGCCGGTGTGCAGCCGGGTGAAATTCCGACCCCGGAACAGGTGAATGCCTGTAAATATCTGGATCTGGTTATTAAGGAAAGCCTGCGTATGCATCCGCCGATTGTGGCAGTTCTGAAATATTGTAAAAAGGATTGTACCATCAAGGCCGGTACCACCGGTGACGAATATAAAATTAAGGCAGGCCAGCTGCTGCAGAGCAATATTAATGCACTGCATCATAGCACCAAAGTTTGGGATGAACCGATGGTTTTTAATCCGGATCGTTTTGCCGATGCAGAACTGCATCCGAATGCCTGGATGCCGTTTAGTGATGGTCCGCGTGCCTGTATTGGCCGTCAGTTTAGCCTGCAGGAAGGCAAACTGGCACTGGTTATGATGCTGAGCAAATTCAATTTTAGCATGGAAGATCCGAGCCAGAAAATTGGCTATGAAATTATTGTGGCCATTAAGCCGGTGGGCCTGATGGTGAAAGTGACCCCGGCCGAACTGCCGGAACCGACCGAAGAAATTGTTGTTACCCAGCGCCGTGAAAGTAAAGCAGAACCGCAGGAAAGTCTGAAACCGGCCGAATTTCCGCTGCCGCCGGTTACCATTCTGTATGGCACCCAGACCAATACCAGCGAAGAATATGCAAAAAAGCTGAGCGGCCAGGCCAAAGAATTTGGTTTTAAAACCATTAAGGTGGATGATCTGGATAATTGGAAACTGCTGAATGGCGGTAAACTGACCAAACTGAATAAGGATCAGAGTGCACCGAGTAGTGGTGACGATGTGAAAGTGAGTGAACTGGTGGTGGTTGTTACCGCAACCTATAATGGCAATCCGCCGGATAATGCAATGAAATTTGATGAATGGCTGAGTAAAAAGACCGAAAGCATTGAAGATACCAAAAGCAATGAACTGGAAGGCATTCTGTATGCAGTTTTTGGCTGCGGCAATCGTGATTGGAGCAGTACCTTTCAGAAATTTCCGACCGCAGTGGATACCGGTCTGGAACTGCTGGGCGGCGAACGTCTGCTGCCGGCAGGCGTTGGCGATGCCAGTGATGATATTGATGGCGATTTTAGCGAATGGAGCGCAAATTTTTGGAGTACCCTGATGCAGCGTTATGGTCAGAGCAGTAGCGGCAAAAATGCAGATATTATGACCAGCACCGCACCGCTGGCAGATCCGAGTAAAGATTTTAATCTGGAATTTCTGCCGGTGCATAAAAATAAGGAACTGGTGACCCAGGCAAATGAAAATCGCAATCAGCGCGGTAAAACCGTGACCATTAAGGAAAATCGCGAACTGCAGAATATTGAAAAAAGCCATCGTAGTACCAAACATATTGAAGTTCAGTTTGATAAGAGCGAAGATGGTAAACCGCTGTATATTGCCGGTGACCATCTGGAAATTACCCCGGTTAATAAGGAAGAACTGGTTGAACTGGTGGCCGTTAATCTGGGTCTGGTGCTGGATAGCGTGTTTCAGATTCAGATGAATGAAGTTGATATTAGTCACCTGAGCCCGCGCAGTCTGGCAGCAAATATTAAGGGCCCGTGCACCATTCGCAATGCACTGAAATATTATGCAGATCTGACCGGTCCGCCGACCCGTTATACCCTGAGTGTGCTGGGTAAACAGCTGGAAAAAACCCGTCCGGAAATTGCCAAACGTCTGCAGGAAGCCCTGCAGCCGGGCAAAGAAACCCCGCGCCTGAAAGAATTTCTGAGTACCCATCGTACCTTTGTTGATATTATGAAAGCATTCAATATCAAGGAGCTGAATTTTAAAGAGTTCCTGAGCAGTGTGAATTGTATTGTGCCGCGCAAATATAGCATTAGTAGTGGTCCGACCGAACATCCGTTTGATCCGAGCGTGAGCATTGGTATTGTTCGCGATATTGGTGGTCCGGATGGCAAAACCGAATATCGCGGTCTGGCAAGCGGCTATCTGGATACCCTGAAACCGGGTAGTCAGGTGAATGCGCAGATTAAGGATTGTAAAAGTACCTTTCGCCTGCCGGATGATGGTAGCACCCCGGTTATTTTTATTTGCGCCGGTACCGGCATGAGCCCGTTTCGTGGCTTTCTGCAGGAACGCCATGCCCAGGGTCTGAAAAGCAGTAAAAAAGGTGGCAGTAGTGAAGCATATATGTTTTTCGGTTGCCGCCATCCGGATCAGGATTTTATCTATAAAGATGAACTGCAGAGTTACGTTGAAGATGGTACCCTGACCGAACTGTATACCACCTTTAGTCGTAGTAATCAGGTGGTTAAATATGTGCAGCATAGCCTGCTGCAGCATGCACAGATGCTGTATGAACTGATGGTGGATCATAATGCAAAAGTTTATGTTTGTGGCAGCGCCGGTAGCATGGCAAAAGATGTTAAACGCACCTGGGAACGCATTACCGTTCAGATGAGTGGCATGAGCGAACCGGAAGCCGAAGATCTGCTGAAAGAATGGAGCGATAAAGGCAAATATAATGAAGATGTGTGGGGCACCTAA
Claims (23)
- C4〜C20ガンマラクトンを生成する方法であって、
カルボン酸4−ヒドロキシラーゼ活性を有する組換えCYP450タンパク質およびC4〜C20カルボン酸基質を含む反応混合物を提供して、4−ヒドロキシC4〜C20カルボン酸を提供することと;
前記4−ヒドロキシC4〜C20カルボン酸を酸性条件に供して、前記C4〜C20ガンマラクトンを生成することと
を含み、
前記組換えCYP450タンパク質は、配列番号1、配列番号3または配列番号5と少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、
方法。 - 前記組換えCYP450タンパク質が、前記反応混合物中の形質転換宿主細胞によって発現される、請求項1に記載の方法。
- 前記形質転換宿主細胞が細菌細胞および酵母細胞から選択される、請求項2に記載の方法。
- 前記組換えCYP450タンパク質が、(a)配列番号1と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含む;(b)配列番号1と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を含む;(c)配列番号1と少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含む;または(d)配列番号1のアミノ酸配列を含む、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記組換えCYP450タンパク質が、(a)配列番号3と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含む;(b)配列番号3と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を含む;(c)配列番号3と少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含む;または(d)配列番号3のアミノ酸配列を含む、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記組換えCYP450タンパク質が、(a)配列番号5と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含む;(b)配列番号5と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を含む;(c)配列番号5と少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含む;または(d)配列番号5のアミノ酸配列を含む、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記C4〜C20カルボン酸基質が、C4〜C20カルボン酸:C4〜C20カルボン酸の塩;C4〜C20カルボン酸のエステル;C4〜C20カルボン酸のモノ−、ジ−もしくはトリグリセリド;またはこれらの組み合わせを含む、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記C4〜C20カルボン酸が、直鎖C4〜C20カルボン酸、分岐C4〜C20カルボン酸、飽和C4〜C20カルボン酸、不飽和C4〜C20カルボン酸、またはこれらの組み合わせを含む、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記C4〜C20カルボン酸基質が、ヘプタン酸、オクタン酸、ノナン酸、デカン酸、ウンデカン酸、ドデカン酸、トリデカン酸、およびテトラデカン酸から選択される、γ−ヘプタラクトン、γ−オクタラクトン、γ−ノナラクトン、γ−デカラクトン、γ−ウンデカラクトン、γ−ドデカラクトン、γ−トリデカラクトン、およびγ−テトラデカラクトンから選択されるC4〜C20ガンマラクトンを生成するための請求項4に記載の方法。
- 前記C4〜C20カルボン酸基質がウンデカン酸およびウンデセン酸から選択される、γ−ウンデカラクトンおよびγ−ウンデセノラクトンから選択されるC4〜C20ガンマラクトンを生成するための請求項5に記載の方法。
- 前記C4〜C20カルボン酸酸基質が、ヘキサン酸、ヘプタン酸、デカン酸、ウンデカン酸、ドデカン酸、トリデカン酸、およびテトラデカン酸から選択される、γ−ヘキサラクトン、γ−ヘプタラクトン、γ−デカラクトン、γ−ウンデカラクトン、γ−ドデカラクトン、γ−トリデカラクトン、およびγ−テトラデカラクトンから選択されるC4〜C20ガンマラクトンを生成するための請求項6に記載の方法。
- C4〜C20ガンマラクトンを生成する方法であって、
カルボン酸4−ヒドロキシラーゼ活性を有するCYP450タンパク質をコードする配列を含む形質転換宿主細胞をC4〜C20カルボン酸基質と共にインキュベートして、4−ヒドロキシC4〜C20カルボン酸を提供することと;
前記4−ヒドロキシC4〜C20カルボン酸を酸性条件に供して、前記C4〜C20ガンマラクトンを生成することと
を含み、
前記CYP450タンパク質をコードする前記配列は、配列番号2、配列番号4または配列番号6と少なくとも80%の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、
方法。 - 前記形質転換宿主細胞が細菌細胞または酵母細胞から選択される、請求項12に記載の方法。
- 前記ヌクレオチド配列が配列番号2と少なくとも80%の同一性を有し、前記CYP450タンパク質が、(a)配列番号1と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含む;(b)配列番号1と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を含む;(c)配列番号1と少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含む;または(d)配列番号1のアミノ酸配列を含む、請求項13に記載の方法。
- 前記ヌクレオチド配列が配列番号4と少なくとも80%の同一性を有し、前記CYP450タンパク質が、(a)配列番号3と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含む;(b)配列番号3と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を含む;(c)配列番号3と少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含む;または(d)配列番号3のアミノ酸配列を含む、請求項13に記載の方法。
- 前記ヌクレオチド配列が配列番号6と少なくとも80%の同一性を有し、前記CYP450タンパク質が、(a)配列番号5と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含む;(b)配列番号5と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を含む;(c)配列番号5と少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含む;または(d)配列番号5のアミノ酸配列を含む、請求項13に記載の方法。
- 前記C4〜C20カルボン酸基質が、C4〜C20カルボン酸:C4〜C20カルボン酸の塩;C4〜C20カルボン酸のエステル;C4〜C20カルボン酸のモノ−、ジ−もしくはトリグリセリド;またはこれらの組み合わせを含む、請求項12から16のいずれか一項に記載の方法。
- 前記C4〜C20カルボン酸が、直鎖C4〜C20カルボン酸、分岐C4〜C20カルボン酸、飽和C4〜C20カルボン酸、不飽和C4〜C20カルボン酸、またはこれらの組み合わせを含む、請求項12から17のいずれか一項に記載の方法。
- 前記C4〜C20カルボン酸基質が、ヘプタン酸、オクタン酸、ノナン酸、デカン酸、ウンデカン酸、ドデカン酸、トリデカン酸、およびテトラデカン酸から選択される、γ−ヘプタラクトン、γ−オクタラクトン、γ−ノナラクトン、γ−デカラクトン、γ−ウンデカラクトン、γ−ドデカラクトン、γ−トリデカラクトン、およびγ−テトラデカラクトンから選択されるC4〜C20ガンマラクトンを生成するための請求項14に記載の方法。
- 前記C4〜C20カルボン酸基質がウンデカン酸およびウンデセン酸から選択される、γ−ウンデカラクトンおよびγ−ウンデセノラクトンから選択されるC4〜C20ガンマラクトンを生成するための請求項15に記載の方法。
- 前記C4〜C20カルボン酸酸基質が、ヘキサン酸、ヘプタン酸、デカン酸、ウンデカン酸、ドデカン酸、トリデカン酸、およびテトラデカン酸から選択される、γ−ヘキサラクトン、γ−ヘプタラクトン、γ−デカラクトン、γ−ウンデカラクトン、γ−ドデカラクトン、γ−トリデカラクトン、およびγ−テトラデカラクトンから選択されるC4〜C20ガンマラクトンを生成するための請求項16に記載の方法。
- 前記形質転換宿主細胞が増殖細胞である、請求項12から21のいずれか一項に記載の方法。
- 前記形質転換宿主細胞が休止細胞である、請求項12から21のいずれか一項に記載の方法。
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