KR101455794B1 - 심바스타틴 및 관련 화합물의 제조를 위한 방법 및 재료 - Google Patents

Abstract

본 명세서에 개시된 발명은 심바스타틴(simvastatin) 및 관련 화합물, 예를 들면, 후바스타틴(huvastatin)의 제조 방법 및 그 제조를 위한 재료에 관한 것이다.

심바스타틴, 후바스타틴, LovD, 트랜스아실화, 티오에스테르

Description

심바스타틴 및 관련 화합물의 제조를 위한 방법 및 재료{Methods and materials for making simvastatin and related compounds}

관련 출원에 대한 교차 참조

본 출원은 2006년 5월 24일에 출원되고, 그 내용 전체가 참조에 의해 본 명세서에 포함함된, 미국 임시 특허출원 제60/808,088호에 기초한 우선권을 주장한다.

발명의 분야

본 발명은 미생물 숙주(microbial host)를 이용하는 절차를 포함하는, 심바스타틴과 같은 화합물의 생합성을 위한 방법 및 재료에 관한 것이다.

심바스타틴은 아스퍼길러스 테레우스(Aspergillus terreus)의 발효 배양액으로부터 분리될 수 있는 천연 생성물 로바스타틴의 반합성(semisynthetic) 유도체이다. 로바스타틴과 심바스타틴은 모두 성인에서 심장질환의 위험을 상당히 낮추는 콜레스테롤 저하 약물이다. 로바스타틴과 심바스타틴은 각각 메바코르(Mevacor) 및 조코르(Zocor)로 Merck Co.에 의해 판매되고 있다. 심바스타틴은 로바스타틴의 보다 강력한 유도체이고 2005년 미국에서 2위로 많이 팔린 약물이며, 미국에서만 45 억 달러의 매출이 예상된다.

아스퍼길러스 테레우스에서 로바스타틴 생합성을 위한 유전자 클러스터(예를 들면, J. Kennedy, K. et. al., Science, 1999, 284, 1368-1372; 및 C. R. Hutchinson, J. et. al., Antonie Van Ljeeuwenhoek 2000, 78, 287-295 참조)가 이전에 개시되었다(예를 들면, 참조에 의해 그 내용이 본 명세서에 포함된, 미국특허 제6,391,583호 참조). 상기 유전자 클러스터에 의해 코딩되는 것은 처음에 에스테라아제 상동체(homolog)로 확인된, 46 kD 단백질 LovD이다. 로바스타틴의 직접적인 생합성 전구체(immediate biosynthetic precursor)인 모나콜린 J(Monacolin J)는 상류 메가신타아제(unstream megasynthase) LovB(예를 들면, L. Hendrickson, C. R. et. al., Cbem. Biol. 1999, 6, 429-439 참조)(로바스타틴 노나케티드 신타아제(lovastatin nonaketide synthase: LNKS)로도 알려짐), 에노일리덕타아제 LovC 및 CYP450 옥시게나아제에 의해 조립된다. 5개의 탄소로 구성된 단위의 곁사슬(five carbon unit side chain)은 아세틸-CoA와 말로닐-CoA 간의 축합을 통해 LovF(로바스타틴 디케티드 신타아제(lovastatin diketide synthase), LDKS)에 의해 합성된다. 축합된 디케티드는 개별적인 LovF 도메인에 의해 메틸화 및 환원성 테일러링(reductive tailoring)를 거쳐서 LovF의 ACP(acyl carrier protein) 상의 포스포판테테인 가지(phosphopantetheine arm)에 공유결합에 의해 결합된 α-S-메틸부티릴 티오에스테르를 생성하고(예를 들면, J. Kennedy, K. et. al., Science, 1999, 284, 1368-1372 및 C. R. Hutchinson, J. et. al., Antonie Van Leeuwenboek 2000, 78, 287-295 참조), 뒤이어 모나콜린 J로부터 로바스타틴이 생성된다. 아스 퍼길러스 테레우스에서 LovD 또는 LovF의 불활성화는 전구체인 모나콜린 J의 축적을 가져온다(예를 들면, J. Kennedy, K. et. al., Science, 1999, 284, 1368-1372 및 C. R. Hutchinson, J. et. al., Antonie Van Leeuwenhoek 2000, 78, 287- 295 참조).

예를 들면, 일단 로바스타틴이 아스퍼길러스 테레우스 숙주에서 발효를 통해 생성되면, 심바스타틴이 로바스타틴으로부터 생성될 수 있다. 현재, 심바스타틴은 로바스타틴의 반합성 유도체이다. 로바스타틴은 아스퍼길러스 테레우스 숙주의 발효를 통해 수득된다. 상기 화합물의 정제 후에, 반합성이 하기와 같이 진행될 수 있다: 1) 염기의 존재 하에 2-메틸부티레이트 곁 가지(side arm)가 가수분해되어 중간체인 모나콜린 J를 생성되고; 2) 유리산을 락톤화시키고; 3) C13에 있는 알코올 작용기가 보호기(예를 들면, 터트-부틸디메틸실릴)로 보호되며; 4) 2-디메틸부티릴 클로리드와 같은 아실 기질에 의한 노출된 C8 알코올의 에스테르화를 통해 심바스타틴의 C13 보호된 버전을 생성하고, 및 5) C13 OH의 탈보호화(deprotection)를 통해 심바스타틴을 생성한다(도 3).

심바스타틴의 다양한 다단계 합성이 이전에 개시되었다(예를 들면, 참조에 의해 그 내용이 본 명세서에 포함된, PCT WO 2005/066150 및 미국출원 제20050080275호 및 제20040068123호 참조). 예를 들면, 널리 이용되는 방법은 트리올 모나콜린 J를 생성하기 위해 로바스타틴에서 C8 에스테르의 가수분해로 시작되고, 뒤이어 C13 알코올의 선택적 실릴화, C8 알코올의 디메틸부티릴 클로리드에 의한 에스테르화 및 C13 알코올의 탈보호화에 의해 심바스타틴을 생성한다(예를 들 면, W. F. Hoffman, et. al., J. Med. Chem. 1986, 29, 849-852 참조). 리파아제 및 에스테라아제를 이용한 효소적 전환(enzymatic transformation)이 화학적 유도의 대안으로 연구되었다(예를 들면, 참조에 의해 그 내용이 본 명세서에 포함된, PCT WO 2005/040107, PCT WO 94/26920 및 T. G. Schimmel, et. al., Appl. Environ. Microbiol 1997, 63, 1307-1311 참조). 그러나, 위치선택적 에스테르화(regioselective esterification)의 요건은 다른 알코올기의 보호를 포함하고 종종 저하된 전체 수율을 초래한다. 그러므로, 모나콜린 J의 C8을 선택적으로 아실화할 수 있는 특정한 시약이 심바스타틴과 추가적인 스타틴 유사체의 효율적인 합성을 위해 중요하다.

전술된 방법들의 변형이 통상적이나, 대부분의 절차는 반드시 먼저 로바스타틴의 분리, 메틸부티레이트 곁사슬의 가수분해, 유리 알코올의 보호, 아실 기질과의 반응, 및 탈보호화를 포함할 것이다. 포함된 화학적 전환은 비교적 단순하나, 그들은 비효율적이고 복수의 단계들을 포함하며, 따라서 심바스타틴의 현재의 높은 제조비용에 기여한다(1정당 $3).

발명의 요약

본 발명은 로바스타틴이 로바스타틴의 유도체인 심바스타틴을 생성하기 위해 제조되는 것인 생물학적 방법을 이용하기 위해 설계된 방법 및 재료를 제공한다. 본 발명은 또한 프라바스타틴 유도체인 후바스타틴과 같은 관련 화합물을 생성하기 위해 로바스타틴이 제조되는 것인 생물학적 방법을 이용하기 위해 설계된 방법 및 재료를 제공한다. 전술된 바와 같이, 아스퍼길러스 테레우스의 발효로부터 로바스타틴의 생성을 위한 생물학적 방법이 본 발명이 속하는 기술 분야에서 잘 알려져 있다. 로바스타틴을 생성하는 통상적인 방법에서, 데칼린 코어(decalin core)와 로바스타틴 화합물의 부분을 닮은 HMG-CoA 모이어티가 생체 내에서(in vivo) 로바스타틴 노나케티드 신타아제(lovastatin nonaketide synthase)(LNKS) 및 세 개의 보조 효소에 의해 합성된다. 생체 내에서 2-메틸부티레이트 곁사슬은 로바스타틴 디케티드 신타아제(lovastatin diketide synthase)(LDKS)에 의해 합성된다. 2-메틸부티레이트는 티오에스테르 결합을 통해 LovF의 아실 운반체(acyl carrier) 도메인에 공유결합에 의해 결합된다(도 6). 그 후, 아실트랜스퍼라아제, LovD가 로바스타틴을 생성하기 위해 단일 단계에서 2-메틸부티레이트를 선택적으로 LDKS로부터의 C8 히드록시기로 전달할 수 있다. 하기에서 상세히 개시되는 바와 같이, 현재 이 방법들을 조작하여 인 비트로 또는 인 비보로 심바스타틴 및 관련 화합물을 생성할 수 있다.

본 발명의 구체예는 현재 심바스타틴을 생성하기 위해 이용되는 복수의 화학적 합성 단계들 없이 심바스타틴을 생성하는 방법을 포함한다. 본 발명의 전형적인 구체예는 제1 단계인 로바스타틴의 정제, 및 뒤이은 추가적인 반합성 절차를 요구하지 않고, 대신 심바스타틴을 생성하기 위해 하나의 발효 단계를 이용한다. 본 명세서에 개시된 방법들은 현재 로바스타틴을 생성하는 발효 설비가 최소의 변형으로 심바스타틴 및 관련된 화합물을 생성하기 위해 전환될 수 있도록 설계된다. 본 명세서에서 개시되는 방법에서 이용되는 재료는 비교적 싸고 정제 단계들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 잘 알려져 있고 용이하게 실시된다.

본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 본 명세서에서 제공되는 개시가 당업자에게 본 발명의 다양한 구체예를 생성할 수 있게 한다는 것을 이해할 것이다. 본 발명의 전형적 구체예는 모나콜린 J, LovD 아실트랜스퍼라아제의 존재 하에 아실 모이어티를 모나콜린 J의 C8 히드록시기에 공여하는 아실 티오에스테르, 및 LovD 아실트랜스퍼라아제를 조합하는 단계; 및 상기 LovD 아실트랜스퍼라아제가 상기 아실 티오에스테르로부터의 아실기를 이용하여 상기 모나콜린 J의 C8 히드록시기를 위치선택적으로(regioselectively) 아실화시켜, 심바스타틴을 생성하는 단계를 포함하는 것인 심바스타틴을 생산하는 방법이다. 본 발명의 전형적 구체예에서, LovD 아실트랜스퍼라아제는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는다. 본 발명의 관련된 구체예는 로바스타틴; LovD 아실트랜스퍼라아제의 존재 하에 아실 모이어티를 모나콜린 J의 C8 히드록시기에 공여하는 아실 티오에스테르; 및 LovD 아실트랜스퍼라아제를 조합하는 단계를 포함하는 심바스타틴을 제조하는 방법이다. 본 발명의 이 구체예에서, 상기 LovD 아실트랜스퍼라아제는 그 후 로바스타틴을 모나콜린 J로 가수분해하고; 상기 아실 티오에스테르로부터의 아실기를 이용하여 모나콜린 J의 C8 히드록시기를 위치선택적으로 아실화할 수 있게 하여, 심바스타틴이 제조된다. 특정한 구체예에서, 상기 심바스타틴은 단리된 개체의 부재 하에 인 비트로에서 제조된다.

하기에서 상세하게 검토되는 바와 같이, 심바스타틴을 제조하기 위해 이용되는 본 발명의 방법 및 재료는 심바스타틴과 구조적으로 유사한 화합물, 예를 들면, 후바스타틴을 생성하기 위해 개조될 수 있다. 이 상황에서, 본 발명의 일 구체예는 가수분해된 프라바스타틴 테트라-올, LovD 아실트랜스퍼라아제의 존재 하에 아실 모이어티를 가수분해된 프라바스타틴 테트라-올의 C8 히드록시기에 공여하는 아실 티오에스테르, 및 LovD 아실트랜스퍼라아제를 조합하는 단계; 및 (2) 상기 LovD 아실트랜스퍼라아제가 상기 아실 티오에스테르로부터의 아실기를 이용하여 상기 가수분해된 프라바스타틴 테트라-올의 C8 히드록시기를 위치선택적으로 아실화시켜, 후바스타틴을 생성하는 단계를 포함하는 것인 후바스타틴을 생산하는 방법이다. 본 발명의 관련된 구체예는 가수분해된 프라바스타틴 테트라-올; LovD 아실트랜스퍼라아제의 존재 하에 가수분해된 프라바스타틴 테트라-올의 C8 히드록시기에 아실 모이어티를 공여하는 아실 티오에스테르; LovD 아실트랜스퍼라아제; 및 후바스타틴을 포함하는 조성물이다. 결론적으로, 본 발명의 구체예는 본 명세서에서 개시되고 예시된 것과 실질적으로 같은 심바스타틴 또는 후바스타틴 조성물을 제조하는 방법을 포함한다.

본 발명의 일부 구체예에서, 상기 모나콜린 J; 아실 티오에스테르 및 LovD 아실트랜스퍼라아제가 LovD 아실트랜스퍼라아제를 생성하는 개체의 존재 하에 발효 배지에서 조합되고 또한 상기 개체는 대장균(Escherichia coli), 아스퍼길러스 테레우스(Aspergillus terreus), 모나스쿠스 루버(Monascus ruber), 모나스쿠스 푸르푸레우스(Monascus purpureus), 모나스쿠스 필로수스(Monascus pilosus), 모나스쿠스 비트레우스(Monascus vitreus), 모나스쿠스 푸비게루스(Monascus pubigerus), 칸디다 카리오실로그니콜라(Candida cariosilognicola), 아스퍼길러스 오리제아(Aspergillus oryzea), 도라토미세스 스테모니티스(Doratomyces stemonitis), 파에실로미세스 비리오티(Paecilomyces virioti), 페니실룸 시트리눔(Penicillum citrinum), 페니실린 크리소게눔(Penicillin chrysogenum), 스코풀라리옵시스 브레비카울리스(Scopulariopsis brevicaulis) 또는 트리코더마 비리데(Trichoderma viride)이다. 선택적으로, 상기 단리된 개체는 서열번호 1의 LovD 폴리펩티드를 발현하는 아스퍼길러스 테레우스이다. 특정한 구체예에서, 상기 아스퍼길러스 테레우스는 서열번호 3의 LovF 폴리펩티드를 발현하지 않는다. 대안적으로, 상기 개체는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 LovD 폴리펩티드를 발현하는 대장균일 수 있다. 특정한 구체예에서, 대장균은 서열번호 4의 bioH 폴리펩티드를 발현하지 않는다. 하기에서 상세하게 검토되는 바와 같이, 단리된 개체는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 공지된 다양한 발효 조건 중 하나에서 배양될 수 있고 정확한 조건은 예를 들면, 이용된 특정한 개체의 발효 요건에 근거하여 선택될 수 있다. 본 발명의 전형적 구체예에서, 상기 개체는 30-40℃의 온도에서, 4시간 이상 내지 48시간 이상의 시간 동안 및 6.5-8.5의 pH에서 배양된다. 예시적 구체예에서, 상기 개체는 LB, Fl 또는 TB 배지를 포함하는 발효 배지에서 배양된다.

선택적으로, 본 발명의 방법에서 다른 구성성분들과 조합된 모나콜린 J는 발효 배지 내에서, 단리된 개체, 예를 들면, LovD 아실트랜스퍼라아제를 생성하는 전술된 개체 중 하나에 의해 생성된다. 대안적으로, 본 발명의 방법에서 다른 구성성분들과 조합된 모나콜린 J는 발효 배지에 첨가되고 LovD 아실트랜스퍼라아제를 생성하는 개체와 함께 성장하는, 이 화합물을 생성하는 다른 개체에 의해 생성된다. 이 상황에서, 모나콜린 J를 생성하는 것으로 알려진 다수의 개체가 본 발명의 이 구체예에서의 이용을 위해 개조될 수 있다(예를 들면, Endo et al., J Antibiot (Tokyo). 1985 Mar;38(3):420-2. 및 Kennedy et al., 1999 May 21 ;284(5418): 1368-72 참조). 본 발명의 또 다른 구체예에서, 모나콜린 J는 대안적인 외래 공급원(예를 들면, 화학적 합성 방법)으로부터 유래되고 발효 혼합물에 첨가된다.

본 발명의 전형적 구체예에서, LovD 아실트랜스퍼라아제의 존재 하에 모나콜린 J의 C8 히드록시기에 아실 모이어티를 공여할 수 있는 아실 티오에스테르는 외래 공급원(예를 들면, 화학적 합성 방법)으로부터 유래되고 발효 혼합물에 첨가된다. 다양한 그와 같은 아실 티오에스테르가 본 명세서에서 개시된다. 통상적으로, 아실 티오에스테르는 부티릴-티오에스테르, N-아세틸시스테아민 티오에스테르 또는 메틸-티오글리콜레이트 티오에스테르이다. 선택적으로, 아실 티오에스테르는 중쇄 길이(medium chain length)(C3-C6) 아실기 모이어티를 포함한다. 본 발명의 일부 구체예에서, 아실 티오에스테르는 발효 배지 내에서 배양되는 대장균 또는 아스퍼길러스 테레우스의 세포막을 통과할 수 있다. 통상적으로, 아실 티오에스테르는 α-디메틸부티릴-S-메틸-머캅토프로피오네이트(DMB-S-MMP), 디메틸부티릴-S-에틸 머캅토프로피오네이트(DMB-S-EMP) 및 디메틸부티릴-S-메틸 티오글리콜레이트(DMB-S-MTG) 및 디메틸부티릴-S-메틸 머캅토부티레이트(DMB-S-MMB)로 구성된 군으로부터 선택된다. 예시적 구체예에서, 아실 티오에스테르는 발효 배지에 1 mM-100 mM의 농도 범위로 조합된 α-디메틸부티릴-S-메틸 머캅토프로피오네이트이다.

본 발명의 특정한 구체예에서, 상기 방법은 조합에 첨가된 모나콜린 J의 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상이 심바스타틴으로 전환되는 결과를 초래한다. 선택적으로, 본 발명의 방법은 조합에 최초로 첨가된 모나콜린 J를 0%-1% 포함하는 조성물을 생성한다. 심바스타틴 및 관련 화합물을 제조하는 방법의 특정한 구체예는 이 화합물들을 정제하는 추가적인 단계를 포함한다. 예를 들면, 본 발명의 구체예는 조합 내에 존재하는 단리된 개체의 세포의 용해를 포함하는 하나 이상의 정제 단계를 포함할 수 있다. 구체예는 또한 조합 내에 존재하는 단리된 개체의 세포 또는 세포 용해액의 원심분리를 포함하는 하나 이상의 정제 단계를 포함할 수 있다. 또한, 구체예는 조합 내에 존재하는 하나 이상의 화합물의 침전을 포함하는 하나 이상의 정제 단계를 포함할 수 있다. 침전 단계의 일 구체예는 심바스타틴의 유리산 형태의 침전을 포함한다. 선택적으로, 그와 같은 구체예에서, 심바스타틴의 이 유리산 형태를 심바스타틴 염으로 전환할 수 있다. 본 발명의 구체예는 또한 조합 내에 존재하는 하나 이상의 화합물의 여과를 포함하는 하나 이상의 정제 단계를 포함할 수 있다. 또한, 구체예는 조합 내에 존재하는 하나 이상의 화합물의 HPLC(high performance liquid chromatography)를 포함하는 하나 이상의 정제 단계를 포함할 수 있다.

본 발명의 구체예는 본 명세서에 개시된 방법에 의한 제조를 위해 유용하거나 또는 제조된 조성물을 포함한다. 예를 들면, 본 발명의 일 구체예는 모나콜린 J; LovD 아실트랜스퍼라아제의 존재 하에 모나콜린 J의 C8 히드록시기에 아실 모이어티를 공여하는 아실 티오에스테르; LovD 아실트랜스퍼라아제; 및 심바스타틴을 포함하는 조성물을 포함한다. 선택적으로 상기 조성물은 대장균, 아스퍼길러스 테레우스, 모나스쿠스 루버, 모나스쿠스 푸르푸레우스, 모나스쿠스 필로수스, 모나스쿠스 비트레우스, 모나스쿠스 푸비게루스, 칸디다 카리오실로그니콜라, 아스퍼길러스 오리제아, 도라토미세스 스테모니티스, 파에실로미세스 비리오티, 페니실룸 시트리눔, 페니실린 크리소게눔, 스코풀라리옵시스 브레비카울리스 또는 트리코더마 비리데와 같은 단리된 개체를 더 포함한다. 전형적인 구체예에서, 상기 조성물 내의 개체는 서열번호 1의 LovD 폴리펩티드를 발현하는 아스퍼길러스 테레우스 또는 대장균이다. 본 발명의 일 구체예에서, 개체는 서열번호 3의 LovF 폴리펩티드를 발현하지 않는 아스퍼길러스 테레우스이다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 개체는 서열번호 4의 bioH 폴리펩티드를 발현하지 않는 대장균이다. 본 발명의 일부 구체예에서, 상기 조성물 내의 단리된 개체는 아스퍼길러스 테레우스 LovD(서열번호 1)를 코딩하는 발현 벡터에 의해 형질도입되었다.

본 발명의 조성물에서 이용될 수 있는 다양한 아실 티오에스테르가 본 명세서에서 개시된다. 통상적으로, 아실 티오에스테르는 부티릴-티오에스테르, N-아세틸시스테아민 티오에스테르 또는 메틸-티오글리콜레이트 티오에스테르이다. 선택적으로, 상기 아실 티오에스테르는 중쇄 길이(C3-C6) 아실기 모이어티를 포함한다. 본 발명의 특정한 구체예에서, 상기 아실 티오에스테르는 발효 배지 내에서 성장하는 대장균 또는 아스퍼길러스 테레우스 세포의 세포막을 통과할 수 있다. 전형적으로, 상기 아실 티오에스테르는 α-디메틸부티릴-S-메틸-머캅토프로피오네이트(DMB-S-MMP), 디메틸부티릴-S-에틸 머캅토프로피오네이트(DMB-S-EMP) 및 디메틸부티릴-S-메틸 티오글리콜레이트(DMB-S-MTG) 및 디메틸부티릴-S-메틸 머캅토부티레이트(DMB-S-MMB)로 구성된 군으로부터 선택된다. 예시적 구체예에서, 상기 아실 티오에스테르는 발효 배지에 1 mM-100 mM의 농도 범위로 조합된 α-디메틸부티릴-S-메틸-머캅토프로피오네이트이다. 본 발명의 일부 구체예에서, 상기 조성물은 로바스타틴을 더 포함하고 상기 조성물에서 심바스타틴의 양은 상기 조성물 내의 로바스타틴의 양보다 더 많다.

본 발명의 특정한 구체예에서, 추가적인 성분 및/또는 방법적인 단계들이 전술된 하나 이상의 방법 및 재료와 조합될 수 있다. 예를 들면, 상기 방법은 LovD 아실트랜스퍼라아제의 유효농도를 증가시키고 발효 조건을 최적화하기 위해 높은 세포-밀도 발효를 이용하는 단계 또는 단백질 공학에 의해 LovD 아실트랜스퍼라아제의 하나 이상의 티오에스테르에 대한 촉매 효율을 증가시키는 단계를 더 포함한다. 다수의 다른 성분 또는 방법이 심바스타틴 또는 심바스타틴의 생성을 촉진하는 중간 화합물 또는 관련 화합물의 생성을 증가시키기 위해 이용될 수 있다.

본 발명의 구체예는 또한 본 발명의 방법을 촉진하기 위해 설계된 제품 및/또는 키트를 포함한다. 전형적으로, 그와 같은 키트는 본 발명의 방법에 따라 키트 내의 요소들을 이용하기 위한 설명서를 포함한다. 그와 같은 키트는 바이알, 튜브 등과 같은 하나 이상의 용기 수단을 폐쇄된 공간 내에 수용하도록 구획화된 캐리어 수단을 포함하고, 각각의 용기 수단은 본 발명에서 이용될 별개의 요소들 중 하나를 포함한다. 상기 용기들 중 하나는 바이알, 예를 들면, LovD 아실트랜스퍼라아제 및/또는 아스퍼길러스 테레우스를 담은 바이알을 포함하고, 또 다른 바이알은 티오에스테르 화합물 등을 담고, 양자가 모두 심바스타틴 및/또는 후바스타틴 등을 생성하기 위해 발효 혼합물에 첨가될 수 있다.

본 발명의 추가적인 구체예가 하기에서 검토된다.

발명의 상세한 설명

본 명세서에서 기재되거나 참조된 기법 및 절차는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 전반적으로 잘 이해되고, 관용적인 방법, 예를 들면, Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995)에 기재된 바와 같은 널리 이용되는 분자 클로닝 방법을 이용하여 통상적으로 이용된다. 적합한 경우, 상업적으로 입수가능하 키트 및 시약을 포함한 절차가 달리 표시되지 않으면 제조사가 정의한 프로토콜 및/또는 파라미터에 따라 일반적으로 수행된다. 달리 정의되지 않으면, 본 명세서에서 사용된 모든 기술 용어, 표시 및 기타 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 의미는 갖도록 의도된다. 일부 경우에, 통상적으로 이해되는 의미를 갖는 용어가 본 명세서에서 명확성 및/또는 편리한 참조를 위해 정의되고, 본 명세서에서 그와 같은 정의의 포함이 반드시 본 발명이 속하는 기술 분야에서 일반적으로 이해되는 것에 대한 실질적인 차이를 나타내는 것으로 이해되어서는 안된다.

일부 용어의 정의가 하기에 제공된다.

"로바스타틴" (Mevacor)은 아스퍼길러스 테레우스에 의해 생산되는 균류 폴리케티드(fungal polyketide)이다(예를 들면, A. W. Alberts, J. et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 1980, 77, 3957-3961 and A. Endo, J. Antibiot. 1980, 33, 334-336; 및 J. K. Chan, et. al., J. Am. Chem. Soc. 1983, 105, 3334-3336; Y. Yoshizawa, et. al., J. Am. Chem. Soc. 1994, 116, 2693-2694 참조). 로바스타틴은 콜레스테롤 생합성의 속도-결정 단계인 히드록시메틸글루타릴 코엔자임 A 리덕타아제(hydroxymethylglutaryl coenzyme A reductase)(HMGR)에 대한 강력한 저해 활성 때문에 약제학적으로 중요한 화합물이고, 따라서, 고지혈증, 고콜레스테롤혈증, 등의 치료를 위해 널리 이용된다. 로바스타틴은 또한 메바코르(Mevacor)로도 불린다.

"심바스타틴"은 로바스타틴의 유사체이다. 심바스타틴은 심각한 부작용의 부재 및 위에서의 높은 흡수성 때문에 로바스타틴에 비해 선호된다. 또한, 심바스타틴은 Ab42, AD와 연관된 β-아밀로이드 단백질의 생성을 지연시키는 것에 의해 알쯔하이머병(AD)의 위험을 예방하고 감소시키는 것으로 보고되었다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 심바스타틴은 금속 아미드 염기의 존재 하에 메틸 할로겐화물을 이용하여 로바스타틴의 8'-메틸부티릴옥시 곁사슬의 직접적인 메틸화에 의해 합성적으로 제조될 수 있는 것으로 알려져 있다. C-메틸화 단계는 대량 생산에서 취급하기 어려운 무수(anhydrous) 환경 하에서 강한 염기를 이용하여 매우 낮은 온도(-75 내지 -30℃)에서 수행되어야 한다(예를 들면, 참조에 의해 그 내용이 본 명세서에 포함된, 미국특허 제5,393,893호, 미국특허 제4,582,915호, 미국특허 제5,763,646호, 미국특허 제5,763,653호, 유럽특허 제299,656호 및 국제특허출원 공개 제WO 99/45003호 참조). 합성적으로 심바스타틴을 생성하는 다른 방법들도 본 발명이 속하는 기술 분야에서 알려져 있다. 예를 들면, 로바스타틴은 트리올 산을 생성하기 위해 2-메틸부티릴 곁사슬을 제거하고 동시에 그의 6-원 락톤(6-membered lactone)를 개방하기 위해 과량의 수산화리튬으로 가수분해될 수 있다. 그 후, 상기 트리올 산 화합물은 디올 락톤을 수득하기 위해 가열될 수 있다. 터트-부틸디메틸실릴 에테르를 수득하기 위해 디올 락톤의 락톤 고리 상에 있는 히드록시기가 보호되고 헥사히드로나프탈렌 고리 시스템의 C8에 있는 히드록시기가 디시클로헥실 카르보디미드 또는 2,2-디메틸 클로리드의 존재 하에 2,2-디메틸부타온산으로 아실화되어 화합물을 생성할 수 있다. 상기 화합물의 t-부틸디메틸실릴 보호기가 심바스타틴을 생성하기 위해 테트라부틸암모늄 플루오리드를 이용하여 최종 단계에서 제거될 수 있다(예를 들면, 참조에 의해 본 명세서에 그 내용이 포함된, 미국특허 제4,444,784호 참조).

본 명세서에서 사용된 "로바스타닌 유도체(Lovastatin derivatives)"는 로바스타틴 유도체 또는 전구체, 예를 들면, 프라바스타틴, 후바스타틴, 심바스타틴, 또는 가수분해된 프라바스타틴 테트라-올을 포함한다. "모나콜린 J 변이체(Monacholin J variant)"는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 개시된 모나콜린 J 변이체, 예를 들면, 가수분해된 프라바스타틴 테트라-올 또는 6-히드록실-6-데스메틸모나콜린 J 등을 의미한다. 본 발명의 특정한 구체예에서, "모나콜린 J 변이체"는 도 2에서 C6 위치에 치환기를 갖는 모나콜린 J 화합물을 의미한다. 심바스타틴, 프라바스타틴, 모나콜린 J 및 변이체 등과 같은 화합물의 기재에서, 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 이 언어가 이 화합물들 외에 이 화합물들의 염(예를 들면, 당해 기술 분야에서 공지된 약제학적으로 허용가능한 염)을 포괄하도록 의도된다는 것을 이해한다. 예를 들면, 본 발명이 속하는 기술 분양에서 공지된 바와 같이, 심바스타틴은 유리산 제형 및 심바스타틴 소디움, 포타슘, 또는 암모늄 염, 및 알칼리 토금속 또는 기타 금속 염으로부터 유래된 기타 염으로 존재할 수 있다.

"아스퍼길러스 테레우스(Aspergillus terrus 또는 A. terreus)"는 토양에서 통상적으로 발견되는 사상성 자낭균(filamentous ascomycete)이다. 다양한 아스퍼길러스 테레우스의 변종, 예를 들면, ATCC 20542 및 ATCC 20541로 기탁된 변종들이 본 발명이 속하는 기술 분야에서 알려져 있다.

본 발명이 속하는 기술 분야에서 공지된 바와 같이, 사상성 균류의 이차 대사산물의 생합성과 관련된 유전자는 균류 게놈 상에서 클러스터(cluster)를 형성할 수 있고 "유전자 클러스터(gene cluster)"로 지칭된다. 예를 들면, "로바스타틴-생성 유전자 클러스터(Lovastatin-producing gene cluster)"는 로바스타틴을 생성하는 일련의 유전자, LovA, P450I; LovC, 데히드로게나아제; LovD, 에스테라아제 및 아실트랜스퍼라아제; 및 LovF, ScPKS 또는 LDKS를 포함하는 유전자의 세트를 의미할 수 있다. 이 네개의 유전자(LovA, LovC, LovD, 및 LovF) 각각이 로바스타틴 합성을 위해 요구된다는 것이 이전에 결정되었다(예를 들면, 참조에 의해 그 내용이 본 명세서에 포함된 미국특허 제6,943,017호 참조). LovF(LDKS 유전자)는 폴리케티드 신타아제 유전자로 규명된다. LovD는 추정적인 에스테라아제/카르복시펩티다아제-유사 유전자로 규명되었다. LovF 유전자의 파괴(disruption)가 이전에 수행되었다(예를 들면, 참조에 의해 그 내용이 본 명세서에 포함된 미국특허 제6,943,017호 참조). LovD는 로바스타틴을 생성하기 위해 LovF와 상호작용하나, LovD-LovF 상호작용은 심바스타틴의 생성을 위해 요구되지 않는다. 또한, 로바스타틴-생성 유전자 클러스터 내의 또 다른 유전자는 LovE이고, 이는 나머지 유전자들의 전사를 조절할 수 있는 Zn 핑거이다. 로바스타틴-생성 유전자 클러스터는 또한 LovB(NPKS 유전자)를 포함한다.

"LDKS" 또는 "LDKS 유전자"는 로바스타틴-생성 유전자 클러스터의 구성물인 LovF 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 의미한다. LDKS는 로바스타틴 디케티드 신타아제(lovastatin diketide synthase)를 의미한다. LovF는 LDKS를 생성하는 유전자이다. LovF는 또한 LovF 단백질을 생성하는 유전자이다. "LDKS 유전자"는 또한 LDKS를 생성하는 유전자를 의미한다. 로바스타틴의 합성에서, LDKS는 아세틸-CoA와 말로닐-CoA 간의 축합을 통해 모나콜린 J의 5개의 탄소로 구성된 단위 사슬을 합성한다. 축합된 디케티드는 LovF의 ACP(acyl carrier protein) 상의 포스포판테테인 가지(phosphopantetheine arm)에 공유결합에 의해 결합된 α-S-메틸부티릴 티오에스테르를 생성하기 위해 개별적인 LovF 도메인에 의한 메틸화 및 환원성 테일러링(reductive tailoring)을 거친다.

본 명세서에서 사용된 "LovD 아실트랜스퍼라아제(LovD acyltransferase)"는 심바스타틴을 생성하기 위해 모나콜린 J의 C8 히드록시기를 위치특이적으로 아실화시키기 위해 아실 티오에스테르를 이용할 수 있는 아스퍼킬러스 테레우스 LovD 폴리펩티드(예를 들면, 서열번호 1)와 같은 폴리펩티드를 의미한다. 또한 본 명세서에서 개시된 바와 같이, 이 LovD 효소는 또한 후바스타틴을 생성하기 위해 가수분해된 프라바스타틴 테트라-올의 C8 히드록시기를 위치특이적으로 아실화시키기 위해 아실 티오에스테르를 이용할 수 있다.

LovD 아실트랜스퍼라아제는 예를 들면, 균류 폴리케티드 유전자 클러스터, 그러나 이에 한정되지 않는 클러스터에서 발견될 수 있는 아스퍼길러스 테레우스 LovD 폴리펩티드(예를 들면, 서열번호 1)에 대한 상동 효소(homologous enzyme)를 포함한다. 예를 들면, 당해 기술은 컴팩틴(compactin) 생합성 경로 내의 MIc가 동일한 트랜스아실화 반응을 촉매하나(예를 들면, Y. Abe, T. et al., Mol Genet Genomics. 2002, 267, 636-646 참조), 스쿠알레스타틴(squalestatin) 경로 내의 아실트랜스퍼라아제는 ACP-결합된 테트라케티드 티오에스테르와 아글리콘(aglycon) 간의 유사한 반응을 촉매할 수 있다(예를 들면, R. J. Cox, F. et. al., Chem Commun(Camb) 2004, 20, 2260-2261 참조)는 증거를 제공한다. 아스퍼길러스 테레우스 LovD 폴리펩티드의 아미노산 서열(예를 들면, 서열번호 1)은 β-락탐계의 항생제의 가수분해에 의한 불활성화를 촉매하는 타입 C β-락타마아제 효소와 유사하다(예를 들면, E. Lobkovsky, E. M. et. al., Biochemistry, 1994, 33, 6162-6112 및 A. Dubus, D. et. al., Biocbem. J. 1993, 292, 537-543 참조). 아스퍼길러스 테레우스 LovD 폴리펩티드(예를 들면, 서열번호 1)와 엔테로박터 글로아카에(enterobacter cloacae) P99 락타마아제의 정렬(예를 들면, S. D. Goldberg, et. al., Protein Sci. 2003, 12, 1633-1645 참조)은 촉매성 Ser76, Lys79, Tyrl88, 및 Lys315와 같은 잠재적으로 보존된 활성 부위 잔기들을 포함한 중간정도의 서열 상동성(moderate sequence homology)을 보인다(예를 들면, S. D. Goldberg, et. al., Protein Set. 2003, 12, 1633-1645 참조).

LovD 아실트랜스퍼라아제는 또한 서열 상 아스퍼길러스 테레우스 LovD 폴리펩티드(예를 들면, 서열번호 1)와 관련되나, 약간의 아미노산 차이(예를 들면, 1개 내지 10개의 아미노산 치환 돌연변이)를 포함하는 유전적으로 조작된 효소 및 천연 효소를 모두 의미할 수 있다. 예를 들면, 심바스타틴은 서열상 아스퍼길러스 테레우스 LovD 폴리펩티드(예를 들면, 서열번호 1)와 유사한 천연 효소(예를 들면, 컴팩틴 클러스터로부터의 MlCH)로부터 생성될 수 있다. "LovD 아실트랜스퍼라아제"는 또한 아스퍼길러스 테레우스 LovD 폴리펩티드(서열번호 1)의 돌연변이체를 의미할 수 있다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 돌연변이체가 예를 들면, 촉매 효율성 또는 그 등가물을 개선하는 서열번호 1의 돌연변이체를 생성하는 표준 분자 생물학 기법에 의해 생성될 수 있다는 것이 알려져 있다. 예를 들면, 본 발명자들은 아스퍼길러스 테레우스 LovD의 촉매 전환 속도(catalytic turnover rate)를 개선하기 위하여 합리적인 방향성 진화 접근방법(rational and directed evolution approach)을 이용하고 있다. 통상적으로, 그와 같은 돌연변이체는 서열번호 1과 50%-99% 서열 유사성을 가질 것이다. 본 발명에서, 용어 "LovD 상동 효소(LovD homologous enzyme)"는 서열번호 1로 표시된 아미노산 서열과 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 서열 동일성(sequence identity)을 갖는 LovD 폴리펩티드를 포함하고, 상기 폴리펩티드는 심바스타틴을 생성하기 위해 모나콜린 J의 C8 히드록시기를 위치특이적으로 아실화시키키 위해 아실 티오에스테를 이용하는 능력을 갖고, 및/또는 후바스타틴을 생성하기 위해 가수분해된 프라바스타틴 테트라-올의 C8 히드록시기를 위치특이적으로 아실화시키기 위해 아실 티오에스테르를 이용하는 능력을 갖는다. 그와 같은 돌연변이체는 용이하게 제조되고 심바스타틴과 같은 원하는 화합물의 생성을 관찰하는 분석법에서 확인된다(통상적으로 아스퍼길러스 테레우스 LovD 폴리펩티드(서열번호 1)를 대조군으로 이용함). 이 돌연변이체들은 예를 들면, 심바스타틴 또는 후바스타틴을 제조하기 위해 본 발명의 방법에 의해 이용될 수 있다.

코딩 서열 및 대조군 서열과 같은 핵산 서열과 관련하여 "이종성(Heterologous)"은 재조합 구조물(recombinant construct)의 영역과 정상적으로 관련되지 않고, 및/또는 정상적으로 특정한 세포와 연관되지 않은 서열을 나타낸다. 따라서, 핵산 구조물의 "이종성" 영역은 본래 대상 분자와 관련된 것으로 발견되지 않는 또 다른 핵산 분자 내에 있거나 또는 그에 부착된 핵산의 식별가능한 세그먼트일 수 있다. 예를 들면, 구조물의 이종성 영역은 본래 코딩 영역과 관련된 것으로 발견되지 않는 서열에 의해 플랭킹된(flanked) 코딩 서열을 포함할 수 있다. 마찬가지로, 정상적으로 숙주 세포에 존재하지 않는, 구조물에 의해 형질전환된 숙주 세포는 이종적인 것으로 간주될 것이다(예를 들면, 참조에 의해 그 내용이 본 명세서에 포함된 미국특허 제5,712,146호, 제6,558,942호, 제6,627,427호, 제5,849,541호 참조). 예를 들면, Lov 유전자를 갖는 구조물이 분리되고 비-로바스타틴 생성 (non-lovastatin producing) 균류 또는 효모 숙주 세포에서 발현될 수 있으며, 그에 의해 로바스타틴이 생성될 수 있다(예를 들면, 참조에 의해 그 내용이 본 명세서에 포함된 미국특허 제6,391,583호 및 제6,943,017호 참조). 또 다른 예로서, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 알려진 바와 같이, 세균과 같은 원핵생물이 숙주세포일 수 있다. 균류 유전자는 또한 원핵생물에서의 발현을 위한 발현 벡터로 클로닝될 수 있다(예를 들면, 참조에 의해 그 내용이 본 명세서에 포함된 미국특허 제5,849,541 참조).

대장균과 같은 원핵생물이 이종 숙주(heterologus host)로서 이용될 수 있다. 목적 유전자(gene of interest)를 갖는 플라스미드가 작제될 수 있고, 플라스미드는 대장균으로 형질전환될 수 있다. 목적 유전자가 번역되고, 그 후 상기 목적 유전자로부터 유래된 단백질이 정제될 수 있다. 이와 같은 발현 및 단백질 정제의 방법이 본 발명이 속하는 기술 분야에서 알려져 있다. 예를 들면, 스플라이스 중첩 신장 PCR(splice overlap extension PCR)을 이용하여 연속적인 개방 해독 프레임을 생성하기 위해 아스퍼길러스 테레우스로부터의 LovD 엑손이 아스퍼길러스 테레우스의 게놈 DNA로부터 개별적으로 증폭되고 스플라이싱될 수 있다. 제한효소 인식부위가 도입되고, 유전자 카세트가 벡터에 라이게이션되어 대장균에 형질전환될 수 있는 발현 구조물이 생성될 수 있다. 그에 의해, 대장균이 아스퍼길러스 테레우스 유전자의 발현을 위한 이종 숙주로 이용될 수 있다. 대장균은 또 다른 목적 기질을 생성하는 또 다른 균주와 함께 공-배양될 수 있다. 추가적으로, 기질이 이 배양물 또는 공-배양물에 첨가될 수 있다. 로바스타틴 생합성 유전자의 이종 발현이 본 발며이 속하는 기술 분야에서 공지되어 있다(예를 들면, 참조에 의해 그 내용이 본 명세서에 포함된 미국특허 제6,391,583호 및 제6,943,017호 참조).

또 다른 예로서, 균류 또는 다른 개체로부터의 폴리케티드와 같은 특정한 폴리케티드가 대장균, 효모, 및 기타 숙주 개체에서 이종적으로 발현될 수 있다. 이 숙주 개체들은 원하는 PKS의 이종 발현 및 또한 PKS에 의해 요구되는 적어도 일부 기질 분자를 생성하는 효소를 모두 필요로 할 수 있기 때문에 다른 기질로 보충될 수 있다(예를 들면, 참조에 의해 본 명세서에 포함될 수 있는, 미국특허 제7,011,959호 참조). 마찬가지로, 균류 Lov 유전자는 대장균 또는 다른 세균에서 발현될 수 있고, 이 숙주 세균은 아실-SNAC 또는 다른 아실 공여체 기와 같은 다른 기질로 보충될 수 있다. 이 아실 공여체기들은 세포 투과성일 수 있고 세균 세포로 들어갈 수 있다.

"발현 벡터(Expression vector)"는 숙주 세포로 도입될 수 있는 핵산을 의미한다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 알려진 바와 같이, 발현 벡터는 세포에서 또는 세포 구획(cellular compartment)에서 염색체 DNA 또는 다른 DNA의 일부로서, 예를 들면, 세포질에서 복제하는 벡터로서 영구적으로 또는 일시적으로 유지될 수 있다. 발현 벡터는 또한 통상적으로 세포 또는 세포 추출물에서 폴리펩티드로 번역되는, RNA의 발현을 추진하는 프로모터를 포함한다. 예를 들면, 본 발명의 발현 벡터에서의 내포를 위한 적합한 프로모터는 진핵 또는 원핵 숙주 세포에서 기능하는 프로모터들을 포함한다. 프로모터는 숙주 세포의 성장 대비 발현의 조절을 가능하게 하거나 또는 화학적 또는 물리적 자극에 반응하여 유전자의 발현을 작동시키거나 또는 중단시키는 조절 서열을 포함할 수 있다. 대장균 및 일부 다른 세균 숙주 세포의 경우, 생화학 경로의 효소, 항생제-내성 부여 효소 및 파아지 단백질에 대한 유전자로부터 유래된 프로모터가 이용될 수 있고, 예를 들면, 갈락토오스, 락토오스(lac), 말토오스, 트립토판(trp), 베타-락타마아제(b/a), 박테리오파아지 람다 PL, 및 T5 프로모터를 포함한다. 또한, tac 프로모터(미국특허 제4,551,433호)와 같은 합성 프로모터가 이용될 수 있다. 대장균 발현 벡터의 경우, pUC, plP, pll, 및 pBR과 같은, 대장균의 복제 원점(origin of replication)을 포함하는 것이 유용하다. RNA의 단백질로의 효율적인 번역을 위해, 발현 벡터는 또한 통상적으로 발현될 유전자의 코딩 서열의 개시 코돈의 상류에 위치한 리보좀-결합 부위의 서열을 포함한다. 인핸서(enhancer), 분비 신호 서열, 전사 종결 서열, 및 벡터를 함유한 숙주 세포가 식별 및/또는 선택되게 하는 하나 이상의 마커 유전자와 같은 다른 요소들이 또한 발현 벡터에 존재할 수 있다. 선택성 마커(selectable marker), 즉, 항생제 내성 또는 민감성을 부여하는 유전자가 이용되어 형질전환된 세포들이 적합한 선택 배지에서 배양될 때 형질전환된 세포에 선택가능한 표현형을 부여할 수 있다. 예를 들면, Lov 유전자 클러스터 또는 그의 부분을 포함하는 발현 벡터가 대장균과 같은 이종 숙주로 도입될 수 있다. 따라서, 재조합 발현 벡터는 프로모터에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 Lov 및/또는 다른 생합성 유전자 코팅 서열의 일부 및 선택적으로 친화성(compatible) 숙주 세포에서 코딩 서열의 발현을 수행하기 위해 작동하는 종결 서열들로 구성될 수 있는, 하나 이상의 발현 시스템을 포함할 수 있다.

"코딩 서열(coding sequence)"은 예를 들면, Lov 유전자 클러스터로부터의 유전자와 같은 특정한 유전자를 "코딩"하는 서열일 수 있다. 코딩 서열은 적합한 조절 서열의 제어 하에 배치되는 경우 인 비트로 또는 인 비보에서 (DNA의 경우) 전사되고, (mRNA의 경우) 폴리펩티드로 번역되는 핵산 서열이다. 코딩 서열의 경계는 5'(아미노) 말단에 있는 개시 코돈 및 3'(카르복시) 말단에 있는 번역 종결 코돈에 의해 결정된다. 전사 종결 서열은 통상적으로 코딩 서열의 3'에 위치할 것이다.

DNA "조절 서열(control sequence)"은 집합적으로 프로모터 서열, 리보좀 결합 부위, 폴리아데닐화 신호, 전사 종결 서열, 상류 조절 도메인(upstream regulatory domain), 인핸서 등을 의미하고, 이들은 집합적으로 숙주 세포에서 코딩 서열의 전사 및 번역을 제공한다.

"작동가능하게 연결된(operably linked)"은 그와 같이 기재된 성분들이 그들의 통상적인 기능을 수행하도록 배열된 것인 요소들의 배열을 의미한다. 따라서, 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 조절 서열은 코딩 서열의 발현을 수행할 수 있다. 조절 서열은 그들이 코딩 서열의 발현을 구동하도록 기능하는 한, 코딩 서열과 연속되지 않아도 된다.

"로바스타틴-생성 개체(Lovastatin-producing organism)"는 당해 기술 분야에서 로바스타틴을 생성하는 것으로 공지된 다양한 상이한 개체를 의미한다. 로바스타틴을 생성하는 이 개체들은 본 발명의 방법에 의해 심바스타틴을 생성하도록 변형될 수 있다. 아스퍼길러스 테레우스는 로바스타틴 생성 개체의 예이다. 로바스타틴(메비놀린)을 생성하는 것으로 보고된 아스퍼길러스 테레우스가 아닌 미생물은 모나스쿠스 종, 예를 들면, 모나스쿠스 루버(Monascus ruber), 모나스쿠스 푸르푸레아스(Monascus purpureus), 모나스쿠스 필로수스(Monascus pilosus), 모나스쿠스 비트레우스(Monascus vitreus), 모나스쿠스 푸비게루스(Monascus pubigerus), 및 페니실룸(Penicillium), 히포미세스(Hypomyces), 도라토미세스(Doratomyces), 포마(Pboma), 유페니실리움(Eupenicillium), 김노아스쿠스(Gymnoascus), 및 트리코더마 종, 피키아 라바센시스(Pichia labacensis), 칸디다 카리오실로그시콜라(Candida cariosilognicola), 아스퍼길러스 오리제아(Aspergilus oryzea), 도라토미세스 스테모니티스(Doratomyces stemonitis), 파에실로미세스 비리오티(Paecilomyces virioti), 페니실룸 시트리눔(Penicillum citrinum), 페니실린 크리소게눔(Penicillin chrysogenum), 스코풀라리옵시스 브레비카울리스(Scopulariopsis brevicaulis) 및 트리코더마 비리데(Trichoderma viride)를 포함한다(예를 들면, 참조에 의해 그 내용이 본 명세서에 포함된, 미국특허 제6,391,583호; Juzlova et al, J. Ind. Microbiol. 16:163-170; Gunde-Cimerman et al., FEMS Microbiol. Lett. 132:39-43 (1995); 및 Shindia et al.Folio Microbiol. 42:477-480 (1997) 참조).

본 명세서에서 사용된 "비-로바스타틴-생성 개체(non-lovastatin-producing organism)"는 인간에 의한 조작이 없는 경우 로바스타틴을 생성하지 않는 다수의 개체(예를 들면, 대장균)를 의미한다. 이 개체들은 예를 들면, 본 발명의 방법에 따라 LovD를 생성하도록 유도되거나 또는 LovD의 존재 하에 로바스타틴 또는 심바스타틴을 생성하도록 배양될 수 있다.

"LDKS 유전자에 파괴(disruption)를 갖는 아스퍼길러스 테레우스(A. terreus having a disruption in die LDKS gene)"는 LDKS 유전자를 갖지 않거나, 돌연변이된 LDKS 유전자를 갖거나, 넉-아웃된 LDKS 유전자를 갖거나, 결실된 LDKS 유전자를 갖거나, 그 발현이 파괴된 LDKS 유전자를 갖거나 또는 파괴된 LDKS 유전자를 갖는 아스퍼길러스 테레우스를 포함한다. "LDKS 유전자에 파괴를 갖는 아스퍼길러스 테레우스(A. terreus having a disruption in the LDKS)"는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 공지된 방법에 의해 침묵화된 LDKS 유전자를 갖는 아스퍼길러스 테레우스를 포함한다. "LDKS 유전자에 파괴를 갖는 아스퍼길러스 테레우스(A. terreus having a disruption in the LDKS gene)"는 기능성 LDKS를 생성할 수 없는 아스퍼길러스 테레우스를 의미한다. "LDKS 유전자에서 중단을 갖는 아스퍼길러스 테레우스(A. terreus having a disruption in the LDKS gene)"는 또한 기능성 LDKS를 생성하는 아스퍼길러스 테레우스를 의미할 수 있다. LDKS는 유전자 넉 아웃 프로토콜과 같은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 공지된 방법에 의해 불활성화되거나 저해될 수 있다. 존재하는 LDKS의 양은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 공지된 방법에 의해 감소될 수 있다. LDKS 유전자 또는 단백질의 저해, 불활성화 또는 파괴의 기타 방법은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 알려진 바와 같이, 안티센스, siRNA, RNAi, 또는 RNA 간섭을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 본 명세서에서 사용된 "LDKS 유전자"는 또한 LovF 유전자를 의미할 수 있다. LovF 유전자의 파괴가 본 발명이 속하는 기술 분야에서 알려져 있다(예를 들면, 참조에 의해 그 내용이 본 명세서에 포함된, 미국특허 제6,391,583호 참조). "LDKS 유전자에 파괴를 갖는 아스퍼길러스 테레우스"는 통상적으로 유전적으로 조작된 개체이다. 아스퍼길러스 테레우스의 유전적 조작은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 알려져 있다. 아스퍼길러스 테레우스에서 Lov 유전자의 유전자 파괴는 이전에 수행되었다(예를 들면, 참조에 의해 본 명세서에 포함된, 미국특허 제6,391,583호 및 제6,943,017호 참조). 아스퍼길러스 테레우스에서 구체적으로 LovF 유전자(LDKS 생성)의 파괴가 이전에 수행되었다(예를 들면, 참조에 의해 그 내용이 본 명세서에 포함된, 미국특허 제6,943,017호 참조). LovF 유전자의 파괴는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 공지된 다른 방법에 의해 일어날 수 있다. LDKS 유전자에 파괴를 갖는 아스퍼길러스 테레우스는 발효 혼합물 내에 존재할 수 있다. 로바스타틴 유사체를 생성하기 위해, LDKS 유전자에 파괴를 갖는 아스퍼길러스 테레우스의 발효 혼합물에 기질이 첨가될 수 있다.

본 명세서에서 사용된 "심바스타틴의 생성을 증가시키는 성분 또는 방법(a component or method to increase the production of simvastatin)"은 심바스타틴의 확장(scale-up) 및 대량 합성에서 생성되는 심바스타틴의 양을 증가시키기 위해 특정한 중간체의 생성을 증가시키는, 합성 또는 천연 화합물 또는 기질을 의미한다. 특정 중간체의 생성을 증가시키는 화합물 및 방법이 본 발명이 속하는 기술 분야에서 공지되어 있다. 예를 들면, 로바스타틴의 생성에서, 모나콜린 J와 같은 중간체의 양을 증가시키기 위해 발효 혼합물에 첨가되는 화합물이 당해 기술 분야에서 알려져 있다(예를 들면, 참조에 의해 그 내용이 본 명세서에 포함된 미국특허 제6,943,017호 참조). 모나콜린 J와 같은, 이 중간체들 중 일부는 또한 심바스타틴의 생성에서 사용될 수 있다. 생성되는 심바스타틴의 양을 증가시키기 위해, 모나콜린 J의 생성을 증가시키는 화합물이 직접 발효 배지에 첨가될 수 있다. 예를 들면, 샹송ㄷ하눈 심바스타틴의 양을 증가시키기 위해 모나콜린 J의 생성을 증가시키는 화합물이 직접 발효 혼합물에 첨가될 수 있다. 심바스타틴의 생성을 증가시키는 화합물의 예는 ATCC 수탁번호 98876으로 기탁된 로바스타틴 생성 유전자 클러스터의 D4B 세그먼트를 포함하는 클론이다. 이 클론은 당해 기술 분야에서 알려진 바와 같이, 모나콜린 J를 생성하기 위해 비-로바스타틴 생성 개체 내로 형질전환될 수 있다. 이 클론은 또한 모나콜린 J의 생성을 증가시키고, 그에 의해 심바스타틴의 생성을 증가시키기 위해 로바스타틴-생성 개체 내로 형질전환될 수 있다. 또한, 심바스타틴의 생성을 증가시키는 성분의 또 다른 예는 심바스타틴의 생성을 증가시키기 위해 로바스타틴-생성 개체 내로 형질전환될 수 있는, LovE/징크 핑거(zinc finger) 유전자이다. 바람직하게는, 이 로바스타틴-생성 개체는 LDKS 유전자에 파괴를 가질 것이다(예를 들면, 참조에 의해 그 내용이 본 명세서에 포함된 미국특허 제6,391,583호 참조). 심바스타틴의 생성을 증가시키는 성분 및 방법은 다수의 다른 성분 및 방법을 의미할 수 있고, 전술된 예들에 한정되지 않는다.

본 명세서에 개시된 바와 같이, "아실 공여체(Acyl donor)", 또는 "아실 운반체(acyl carrier)"는 심바스타틴 및/또는 심바스타틴 전구체 또는 관련 화합물에 전달될 수 있는 아실기를 갖는 화합물이다. 통상적으로, "아실 공여체" 또는 "아실 운반체"는 모나콜린 J의 C8 히드록시기에 아실 모이어티를 공여하는 아실 티오에스테르이다. 본 명세서에서 이 활성을 갖는 것으로 더 확인된 다양한 그와 같은 작용제가 당해 기술 분야에서 알려져 있다(예를 들면, 표 1에 예시된 아실 티오에스테르). 이 활성을 갖는 것으로 당해 기술분야에서 알려지고, 본 명세서의 개시에 의해 더 확인된 것들 외에, 심바스타틴을 생성하기 위해 모나콜린 J의 C8을 아실화시키는 능력을 갖는 것으로 당해 기술 분야에서 알려진(또는 새로 합성된) 잠재적인 아실 공여체/운반체가 본 명세서에 개시된 아실 공여체(예를 들면, 아실-SNAC)와의 비교 실험에 의해 용이하게 식별될 수 있다. 당해 기술 분야에서 알려진 바와 같이, 아실기는 R은 알킬 또는 아릴일 수 있고, N은 -Cl, -OOCR, -NH2, -OR, 또는 그 등가물일 수 있는 것인 식 RCON을 가질 수 있다. 아실기를 갖는 화합물은 산 염화물(acid chloride), 에스테르, 아미드, 또는 무수물 및 그 등가물을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 이 화합물들은 치환 또는 미치환인 지방족 또는 방향족일 수 있다. 예는 염화 벤조일, 벤조산 무수물, 벤자미드 또는 에틸 벤조산, 및 그 등가물을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 아실 공여체의 다른 예는 α-디메틸부티릴-SNAC, 아실-티오에스테르, acyl-CoA, 부티릴-CoA, 벤조일-CoA, 아세토아세틸-CoA, β-히드록시부티릴-CoA, 말로닐-CoA, 팔미토일-CoA, 부티릴-티오에스테르, N-아세틀시스테아민 티오에스테르(SNAC), 메틸-티오글리콜레이트(SMTG), 벤조일-SNAC, 벤조일-SMTG, 또는 α-S-메틸부티릴-SNAC를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 이 화합물들은 천연적으로 또는 합성에 의해 생성될 수 있고, 일부 경우에, 세포 막을 통과할 수 있다. 다수의 이와 같은 화합물들이 예를 들면, 심바스타틴을 생성하기 위해 모나콜린 J의 존재 하에 LovD에 첨가될 수 있다.

본 명세서에서 사용된 "아실-SNAC(acyl-SNAC)"는 α-디메틸부티릴-SNAC를 의미한다. 당해 기술 분야에서 알려진 바와 같이, 아실-SNAC는 인 비보 조건에서 세포막을 통과할 수 있다. LovD는 모나콜린 J의 C8 히드록시기를 위치특이적으로 아실화시키는 것에 의해 모나콜린 J로부터 심바스타틴을 생성하는 반응을 개시하기 위해 기질로서 아실 acyl-SNAC를 이용할 수 있다. 아실-SNAC는 그의 아실기를 LovD에 공여할 수 있다.

본 발명의 전형적인 구체예

본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 본 명세서에서 제공된 개시가 당업자가 본 발명의 광범위하게 다양한 구체예를 생성할 수 있게 한다는 것을 이해할 것이다. 본 발명의 전형적인 구체예는 모나콜린 J, LovD 아실트랜스퍼라아제의 존재 하에 아실 모이어티를 모나콜린 J의 C8 히드록시기에 공여하는 아실 티오에스테르, 및 LovD 아실트랜스퍼라아제를 조합하고 상기 LovD 아실트랜스퍼라아제가 상기 아실 티오에스테르로부터의 아실기를 이용하여 상기 모나콜린 J의 C8 히드록시기를 위치선택적으로(regioselectively) 아실화시켜, 심바스타틴을 생성하는 것에 의해 심바스틴을 제조하는 방법이다. 본 발명의 예시적 구체예에서, LovD 아실트랜스퍼라아제는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는다. 본 발명의 관련된 구체예는 로바스타틴: LovD 아실트랜스퍼라아제의 존재 하에 모나콜린 J의 C8 히드록시기에 아실 모이어티를 공여하는 아실 티오에스테르; 및 LovD 아실트랜스퍼라아제를 조합하는 단계를 포함하는 심바스타틴을 제조하는 방법이다. 이 관련된 방법에서, 심바스타틴을 제조하기 위해, LovD 아실트랜스퍼라아제는 로바스타틴을 모나콜린 J로 가수분해시키고, 아실 티오에스테르로부터의 아실기를 이용하여 모나콜린 J의 C8 히드록시기를 위치특이적으로 아실화시킬 수 있게 한다. 특정한 구체예에서, 심바스타틴은 단리된 개체의 부재 하에 인 비트로에서 제조된다.

본 발명의 일부 구체예에서, 모나콜린 J; 아실 티오에스테르 및 LovD 아실트랜스퍼라아제는 LovD 아실트랜스퍼라아제를 생성하는 단리된 개체의 존재 하에 발효 배지에서 조합되고, 또한, 상기 개체는 대장균, 아스퍼길러스 테레우스, 모나스쿠스 루버, 모나스쿠스 푸르푸레우스, 모나스쿠스 필로수스, 모나스쿠스 비트레우스, 모나스쿠스 푸비게루스, 칸디다 카리오실로그니콜라, 아스퍼길러스 오리제아, 도라토미세스 스테모니티스, 파에실로미세스 비리오티, 페니실룸 시트리눔, 페니실린 크리소게눔, 스코풀라리옵시스 브레비카울리스 또는 트리코더마 비리데이다. 선택적으로, 상기 단리된 개체는 서열번호 1의 LovD 폴리펩티드를 발현하는 아스퍼길러스 테레우스이다. 특정한 구체예에서, 상기 아스퍼길러스 테레우스는 서열번호 3의 LovF 폴리펩티드를 발현하지 않는다. 본 발명의 특정한 구체예에서, 서열번호 3 및 서열번호 4의 폴리펩티드와 같은 폴리펩티드의 발현은 내생 활성(endogenous activity)의 90, 95, 또는 99% 이상까지 감소된다. 대안적으로, 상기 개체는 서열번호 1의 LovD 폴리펩티드를 발현하는 대장균일 수 있다. 특정한 구체예에서, 상기 대장균은 서열번호 4의 bioH 폴리펩티드를 발현하지 않는다. 결론적으로, 숙주는 LovD 아실트랜스퍼라아제를 내생적으로 생성하는 숙주이거나 또는 대안적으로 LovD 아실트랜스퍼라아제가 예를 들면, 당해 기술 분야에서 알려지고 또한 본 명세서에서 검토된 클로닝 기술에 의해 개체 내로 도입된 이종 숙주(heterologus host)일 수 있다. 전형적인 구체예에서, LovD 아실트랜스퍼라아제를 발현하는 이종 숙주는 당해 분야에서 그와 같은 목적을 위해 유용한 것으로 알려진 세균, 효모, 또는 균류이다.

하기에서 상세하게 검토되는 바와 같이, 상기 단리된 개체는 당해 분야에서 알려진 다양한 발효 조건들 중 하나에서 배양될 수 있고, 정확한 조건은 예를 들면, 본 발명의 일 구체예에서 이용되는 특정한 개체의 최적화된 성장과 관련된 발효 파라미터에 근거하여 선택된다(예를 들면, 참조에 의해 그 내용이 본 명세서에 포함된, Miyake et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 70(5): 1154-1159 (2006) 및 Hajjaj et al., Applied and Environmental Microbiology, 67: 2596-2602 (2001) 참조). 통상적으로, 개체는 30-40℃의 온도에서, 4시간 이상 내지 48시간 이상의 시간 동안 배양된다. 통상적으로, 개체는 6.5-8.5의 pH에서 배양된다. 본 발명의 특정한 구체예에서, 발효 배지의 pH는 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8.0 또는 8.1일 수 있다. 예시적 구체예에서, 개체는 LB, Fl 또는 TB 배지를 포함하는 발효 배지에서 배양될 수 있다.

선택적으로, 본 발명의 방법에서 다른 구성성분들과 조합되는 모나콜린 J는 발효 배지 내에서 단리된 개체, 예를 들면, LovD 아실트랜스퍼라아제를 생성하는 전술된 개체들 중 하나에 의해 생성된다. 대안적으로, 본 발명의 방법에서 다른 구성성분들과 조합된 모나콜린 J는 발효 배지에 첨가되고 LovD 아실트랜스퍼라아제를 생성하는 개체와 함께 배양되는 이 화합물을 생성하는 상이한 개체에 의해 생성된다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 모나콜린 J는 외래 공급원으로부터 유래되고 발효 혼합물 내에 첨가된다. 선택적으로, 본 발명의 방법은 조합에 최초에 첨가된 모나콜린 J의 0%-1%를 포함하는 조성물을 생성한다. 본 발명의 특정한 구체예에서, 본 발명의 방법은 상기 조합에 첨가된 모나콜린 J의 95% 이상이 심바스타틴으로 전환되는 결과를 가져온다.

본 발명의 전형적인 구체예에서, LovD 아실트랜스퍼라아제의 존재 하에 모나콜린 J의 C8 히드록시에 아실 모이어티(moiety)를 공여할 수 있는 아실 티오에스테르는 외래 공급원(예를 들면, 화학적 합성 공정)으로부터 유래되고 발효 혼합물에 첨가된다. 다양한 그와 같은 아실 티오에스테르가 본 명세서에서 개시된다. 통상적으로, 아실 티오에스테르는 부티릴-티오에스테르, N-아세틸시스테아민 티오에스테르 또는 메틸-티오글리콜레이트 티오에스테르이다. 선택적으로, 아실 티오에스테르는 중쇄(medium chain) 길이(C3-C6)의 아실 모이어티를 포함한다. 본 발명의 특정한 구체예에서, 아실 티오에스테르는 발효 배지 내에서 성장하는 대장균 또는 아스퍼길러스 테레우스의 세포막을 통과할 수 있다. 통상적으로, 아실 티오에스테르는 α-디메틸부티릴-S-메틸-머캅토프로피오네이트(DMB-S-MMP), 디메틸부티릴-S-에틸 머캅토프로피오네이트(DMB-S-EMP) 및 디메틸부티릴-S-메틸 티오글리콜레이트(DMB-S-MTG) 및 디메틸부티릴-S-메틸 머캅토부티레이트(DMB-S-MMB)로 구성된 군으로부터 선택된다. 예시적인 구체예에서, 아실 티오에스테르는 1mM-100mM의 농도 범위로 발효 배지에 조합된 α-디메틸부티릴-S-메틸-머캅토프로피오네이트이다.

심바스타틴을 제조하는 방법의 특정한 구체예는 조합에 의해 심바스타틴을 정제하는 추가적인 단계를 포함한다. 예를 들면, 본 발명의 일부 구체예는 조합에 존재하는 단리된 개체의 세포의 용해를 포함하는 하나 이상의 정제 단계를 포함한다. 구체예는 상기 조합에 존재하는 단리된 개체의 세포 또는 세포 용해액의 원심분리를 포함하는 하나 이상의 정제 단계를 포함할 수 있다. 구체예는 상기 조합에 존재하는 하나 이상의 화합물의 침전을 포함하는 하나 이상의 정제 단계를 포함할 수 있다. 구체예는 상기 조합에 존재하는 하나 이상의 화합물의 여과를 포함하는 하나 이상의 정제 단계를 포함할 수 있다. 구체예는 상기 조합에 존재하는 하나 이상의 화합물의 HPLC(high performance liquid chromatography)를 포함하는 하나 이상의 정제 단계를 포함할 수 있다.

본 명세서에서 제공된 개시는 이 방법들의 다양한 변형(permutation)이 심바스타틴과 후바스타틴 및 그 등가물을 제조하기 위해 이용될 수 있다는 것을 보여준다. 본 발명의 특정한 구체예에서, 예를 들면, 숙주 개체는 아실 티오에스테르 및/또는 모나콜린 J를 생성한다. 대안적으로, 아실 티오에스테르 및/또는 모나콜린 J는 심바스타틴을 생성하는 방법의 일부로서 개체에 첨가된다. 본 발명의 방법은 또한 서열번호 1 또는 서열번호 2를 코딩하는 유전자와 같은 심바스타틴 및/또는 후바스타틴 또는 그 등가물의 생성을 촉진하는 것으로 알려진 하나 이상의 아스퍼길러스 테레우스 유전자를 갖는 발현 벡터를 첨가하는 단계 및 상기 발현 벡터를 이종 숙주 내로 형질감염시키고 그에 의해 아실트랜스퍼라아제 활성을 갖는 폴리펩티드가 발현되는 것인 단계를 더 포함할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 모나콜린 J는 이종 숙주로부터 생성될 수 있다.

본 발명의 또 다른 구체예는 LovD 아실트랜스퍼라아제를 발현하는 제1 개체를 (예를 들면, 발효 혼합물에서) 아실 티오에스테르 및/또는 모나콜린 J를 생성하는 제2 개체와 함께 배양하는 단계를 포함하고, 상기 아실 티오에스테르는 심바스타틴을 생성하기 위해 모나콜린 J의 존재 하에 LovD 아실트랜스퍼라아제 유전자 생성물과 상호작용하는 것인, LovD 아실트랜스퍼라아제 유전자를 발현하는 개체에서 모나콜린 J로부터 심바스타틴을 생성하는 방법이다. 선택적으로, 상기 제1 개체는 본래 로바스타틴을 생성하지 않는 개체이다(예를 들면, LovD 아실트랜스퍼라아제 유전자가 형질도입된 대장균). 대안적으로, 상기 제1 개체는 아스퍼길러스 테레우스와 같은 로바스타틴-생성 개체(예를 들면, 불활성화된 LovF/LDKS 유전자를 갖는 아스퍼길러스 테레우스). 상기 방법은 모나콜린 J와 같은 심바스타틴 전구체의 생성을 증가시키고 그에 의해 심바스타틴의 생성을 증가시키기 위해 발효 혼합물 내에 하나 이상의 외래 성분을 추가하는 단계를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 방법은 또한 모나콜린 J의 생성을 증가시키고 그에 의해 심바스타틴 및/또는 후바스타틴의 생성을 증가시키기 위해 발효 혼합물에 추가적인 성분을 추가하는 단계를 더 포함할 수 있다. 이 방법의 하나의 예시적인 구체예로서, 상기 성분은 LovE 유전자를 갖는 클론일 수 있고, 상기 개체는 상기 클론으로 형질전환되고, LovE가 번역되고 그에 의해 심바스타틴의 생성이 증가된다. 이 방법의 또 다른 예시적인 구체예로서, 상기 성분은 아스퍼길러스 테레우스 게놈(ATCC 수탁번호 98876)의 D4B 세그먼트를 포함하는 클론일 수 있고, 상기 개체는 상기 클론으로 형질전환되어 모나콜린 J의 생성이 증가된다.

본 발명의 또 다른 구체예는 외래 아실 티오에스테르의 존재 하에 인 비트로 또는 인 비보에서 모나콜린 J를 심바스타틴으로 전환시키는 방법이다. 바람직하게는, 상기 아실 티오에스테르는 세포막을 통과할 수 있다. 본 발명의 또 다른 구체예는 LovD를 생성하는 개체 내에서 아실 티오에스테르의 존재 하에 모나콜린 J를 직접 심바스타틴으로 전환시키는 방법이다. 본 발명의 예시적인 구체예에서, 상기 개체는 파괴된(disrupted) LDKS 유전자를 갖는 아스퍼길러스 테레우스이다.

본 발명의 또 다른 구체예는 모나콜린 J; LovD 아실트랜스퍼라아제의 존재 하에 아실 모이어티를 모나콜린 J의 C8 히드록시기에 공여하는 아실 티오에스테르, 및 LovD 아실트랜스퍼라아제를 조합하는 단계; 및 상기 LovD 아실트랜스퍼라아제가 상기 아실 티오에스테르로부터의 아실기를 이용하여 상기 모나콜린 J의 C8 히드록시기를 위치선택적으로 아실화시켜, 심바스타틴 생성물을 생성하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된 심바스타틴이다. 본 발명의 관련된 구체예는 가수분해된 프라바스타틴 테트라-올, LovD 아실트랜스퍼라아제의 존재 하에 아실 모이어티를 가수분해된 프라바스타틴 테트라-올의 C8 히드록시기에 공여하는 아실 티오에스테르, 및 LovD 아실트랜스퍼라아제를 조합하는 단계; 및 상기 LovD 아실트랜스퍼라아제가 상기 아실 티오에스테르로부터의 아실기를 이용하여 상기 가수분해된 프라바스타틴 테트라-올의 C8 히드록시기를 위치선택적으로 아실화시켜, 후바스타틴을 생성하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된 후바스타틴 생성물이다.

본 발명의 또 다른 구체예는 서열번호 1의 LovD 또는 LovD 상동체(homologue)의 존재 하에 로바스타틴을 모나콜린 J로 가수분해시키는 단계 및 모나콜린 J를 아실화시키는 단계를 포함하고, 상기 가수분해 및 아실화는 심바스타틴을 생성하는 것인 심바스타틴을 생성하는 방법이다. 본 발명의 또 다른 관련된 구체예는 서열번호 1의 LovD 또는 LovD 상동체의 존재 하에 프라바스타틴을 가수분해된 프라바스타틴으로 가수분해시키는 단계 및 모나콜린 J를 아실화시키는 단계를 포함하고, 상기 가수분해 및 아실화는 후바스타틴을 생성하는 것인 후바스타틴을 생성하는 방법이다.

본 발명의 구체예는 본 명세서에 개시된 방법에 의해 제조하기 위해 이용되거나 또는 제조된 조성물을 포함한다. 예를 들면, 본 발명의 일 구체예는 모나콜린 J 및 LovD 아실트랜스퍼라아제의 존재 하에 모나콜린 J의 C8 히드록시기에 아실 모이어티를 공여하는 아실 티오에스테르를 포함하는 조성물이다. 이 조성물의 특정한 구체예는 LovD 아실트랜스퍼라아제를 더 포함한다. 이 조성물의 특정한 구체예는 심바스타틴을 더 포함한다. 선택적으로, 본 발명의 조성물은 대장균, 아스퍼길러스 테레우스, 모나스쿠스 루버, 모나스쿠스 푸르푸레우스, 모나스쿠스 필로수스, 모나스쿠스 비트레우스, 모나스쿠스 푸비게루스, 칸디다 카리오실로그니콜라, 아스퍼길러스 오리제아, 도라토미세스 스테모니티스, 파에실로미세스 비리오티, 페니실룸 시트리눔, 페니실린 크리소게눔, 스코풀라리옵시스 브레비카울리스 또는 트리코더마 비리데와 같은 단리된 개체를 더 포함한다. 통상적인 구체예에서, 상기 조성물 내의 개체는 서열번호 1의 LovD 폴리펩티드를 발현하는 아스퍼길러스 테레우스 또는 대장균이다. 본 발명의 일 구체예에서, 상기 개체는 서열번호 3의 LovF 폴리펩티드를 발현하지 않는 아스퍼길러스 테레우스이다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 개체는 서열번호 4의 bioH 폴리펩티드를 발현하지 않는 대장균이다. 본 발명의 특정한 구체예에서, 상기 조성물 내의 단리된 개체는 서열번호 1의 아스퍼길러스 테레우스 LovD 폴리펩티드를 코딩하는 발현벡터로 형질도입된 것이다.

본 발명의 조성물에서 이용될 수 있는 다양한 아실 티오에스테르가 본 명세서에 개시된다. 통상적으로, 아실 티오에스테르는 부티릴-티오에스테르, N-아세틸시스테아민 티오에스테르 또는 메틸-티오글리콜레이트 티오에스테르이다. 선택적으로, 상기 아실 티오에스테르는 중쇄(medium chain) 길이(C3-C6)의 아실기 모이어티를 포함한다. 본 발명의 특정한 구체예에서, 상기 아실 티오에스테르는 발효 배지 내에서 성장하는 대장균 또는 아스퍼길러스 테레우스 세포의 세포막을 통과할 수 있다. 통상적으로, 상기 아실 티오에스테르는 α-디메틸부티릴-S-메틸-머캅토프로피오네이트(DMB-S-MMP), 디메틸부티릴-S-에틸-머캅토프로피오네이트(DMB-S-EMP) 및 디메틸부티릴-S-메틸 티오글리콜레이트(DMB-S-MTG) 및 디메틸부티릴-S-메틸 머캅토부티레이트(DMB-S-MMB)로 구성된 군으로부터 선택된다. 하나의 예시적인 구체예에서, 상기 아실 티오에스테르는 발효 배지에서 1mM-100mM의 농도로 조합되고, 통상적으로 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 또는 90 mM일 수 있는 α-디메틸부티릴-S-메틸-머캅토프로피오네이트이다. 본 발명의 일부 구체예에서, 상기 조성물은 로바스타틴을 더 포함하고 상기 조성물 내의 심바스타틴의 양은 상기 조성물 내의 로바스타틴의 양보다 많다.

하기에서 상세하게 검토되는 바와 같이, 심바스타틴을 제조하기 위해 이용되는 본 발명의 방법 및 재료는 심바스타틴과 구조적으로 유사한 화합물, 예를 들면, 후바스타틴을 생성하기 위해 개조될 수 있다. 이와 같은 배경에서, 본 발명의 일 구체예는 가수분해된 프라바스타틴 테트라-올, LovD 아실트랜스퍼라아제의 존재 하에 아실 모이어티를 가수분해된 프라바스타틴 테트라-올의 C8 히드록시기에 공여하는 아실 티오에스테르, 및 LovD 아실트랜스퍼라아제를 조합하는 단계; 및 상기 LovD 아실트랜스퍼라아제가 상기 아실 티오에스테르로부터의 아실기를 이용하여 상기 가수분해된 프라바스타틴 테트라-올의 C8 히드록시기를 위치선택적으로 아실화시켜, 후바스타틴을 생성하는 단계를 포함하는 것인 후바스타틴을 생산하는 방법이다. 본 발명의 관련된 구체예는 가수분해된 프라바스타틴 테트라-올; LovD 아실트랜스퍼라아제의 존재 하에 가수분해된 프라바스타틴 테트라-올의 C8 히드록시기에 아실 모이어티를 공여하는 아실 티오에스테르; LovD 아실트랜스퍼라아제; 및 후바스타틴을 포함하는 조성물이다.

본 발명의 또 다른 구체예는 모나콜린 J 또는 가수분해된 프라바스타틴 테트라-올과 같은 모나콜린 J 변이체의 C8 히드록시기를 아실화시키는 능력때문에 선택된 티오에스테르의 존재 하에 하나 이상의 후바스타틴 전구체, 예를 들면, 가수분해된 프라바스타틴 테트라-올 또는 6-히드록시-6-데스메틸로나콜린 J를 포함하는 조성물이다. 통상적으로, 그와 같은 조성물은 앞서 검토된 개체를 더 포함할 수 있다. 결론적으로, 본 발명의 구체예는 본 명세서에서 개시되고 예시된 것과 실질적으로 동일한 심바스타틴 또는 후바스타틴 조성물을 제조하는 방법을 포함한다.

심바스타틴을 생성하는 변형된 개체(예를 들면, LDKS 유전자에 파괴를 갖는 아스퍼길러스 테레우스)도 로바스타틴을 (예를 들면, 최소 잔량으로) 생성하는 경우, 본 명세서에서 개시된 방법 및 재료는 심바스타틴 또는 후바스타틴과 같은 관련된 화합물이 이 경로의 주요한 생성물이 되도록, 개체 내의 생화학적 경로/방법의 조작을 가능하게 한다. 관련된 구체예는 개체 및 상기 개체에 의해 생성되는 심바스타틴 및/또는 후바스타틴을 포함하는 조성물이고, 상기 조성물 내에서 심바스타틴 및/또는 후바스타틴의 양은 상기 조성물 내의 로바스타틴의 양보다 많다.

본 발명의 관련된 구체예는 LovD, 가수분해된 프라바스타틴, 및 아실 티오에스테르를 포함하는 조성물이다. 예시적인 구체예에서, 상기 조성물은 후바스타틴을 생성하는 대장균을 포함한다. 관련된 구체예에서, 상기 조성물은 후바스타틴을 생성하는 아스퍼길러스 테레우스(예를 들면, LDKS 유전자에 파괴를 갖는 아스퍼길러스 테레우스)이다. 후바스타틴을 생성하는 변형된 개체(예를 들면, LDKS 유전자에 파괴를 갖는 아스퍼길러스 테레우스)가 또한 로바스타틴을 (예를 들면, 최소 잔량으로) 생성하는 경우, 본 명세서에서 개시된 방법 및 재료는 후바스타틴이 이 경로의 주요한 생성물이 되도록, 개체 내의 생화학적 경로/방법의 조작을 가능하게 한다. 관련된 구체예는 개체 및 상기 개체에 의해 생성되는 후바스타틴을 포함하는 조성물이고, 상기 조성물 내에서 후바스타틴의 양은 상기 조성물 내의 로바스타틴의 양보다 많다.

본 발명의 특정한 구체예에서, 추가적인 성분 및/또는 방법적인 단계들이 하나 이상의 앞서 검토된 방법 및 재료와 조합될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 방법은 LovD 아실트랜스퍼라아제의 유효 농도를 증가시키고 발효 조건을 최적화하기 위해 고 세포-밀도 발효(high cell-density fermentation)을 이용하는 단계 및/또는 단백질 공학을 통해 상기 하나 이상의 아실 티오에스테르에 대한 LovD 아실트랜스퍼라아제의 촉매 효율을 증가시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 다수의 다른 성분들 또는 방법들이 심바스타틴의 생성 또는 심바스타틴의 생성을 촉진하는 중간체 화합물의 생성을 증가시키기 위해 이용될 수 있다.

전술된 바와 같이, (LovD 아실트랜스퍼라아제 활성을 요구하는) 로바스타틴 생성은 아스퍼길러스 테레우스, 모나스쿠스 루버, 모나스쿠스 푸르푸레우스, 모나스쿠스 필로수스, 모나스쿠스 비트레우스, 모나스쿠스 푸비게루스, 칸디다 카리오실로그니콜라, 아스퍼길러스 오리제아, 도라토미세스 스테모니티스, 파에실로미세스 비리오티, 페니실룸 시트리눔, 페니실린 크리소게눔, 스코풀라리옵시스 브레비카울리스 또는 트리코더마 비리데와 같은 다수의 개체에서 관찰된다. 본 명세서에서 개시된 발명의 특성을 고려할 때, 본 명세서에서 제공된 개시와 조합하여 공지된 방법 및 재료를 이용하여, 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 심바스타틴을 생성하는 LovD 아실트랜스퍼라아제를 이용하기 위해, 이 개체들 중 하나 이상(또는 로바스타틴을 생성하는 것으로 알려진 개체)의 배양을 모나콜린 J와, LovD 아실트랜스퍼라아제의 존재 하에 모나콜린 J의 C8 히드록시기에 아실 모이어티를 공여하는 아실 티오에스테르(예를 들면, α-디메틸부티릴-SNAC)를 조합할 수 있다. 본 명세서에서 알 수 있는 바와 같이, 예를 들면, 본 발명의 특성은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 알려진 다양한 로바스타틴을 생성하는 개체에서, 이 개체들에서 발현되는 특정한 LovD 아실트랜스퍼라아제의 특징에 대한 구체적인 지식 없이, 심바스타틴과 관련된 화합물을 제조할 수 있게 한다.

새로운 개체(예를 들면, 아스퍼길러스 테레우스와 관련된 균류 종)에서 심바스타틴을 생성하고 및/또는 개체에서 심바스타틴을 생성하는 능력을 테스트하기 위한 예시적 절차에서, 제1 단계는 모나콜린 J와, 모나콜린 J의 C8 히드록시기에 아실 모이어티를 공여하는 아실 티오에스테르의 혼합물을 제조하는 것이다. 제2 단계에서, 이 혼합물을 발효 혼합물에서 개체(예를 들면, 로바스타틴 생성 개체)와 조합하고 개체를 배양하는 것이다. 제3 단계에서, 상기 혼합물은 예를 들면, 하기의 실시예에서 검토된 바와 같이 HPLC 분석을 이용하여, 심바스타틴의 존재에 대해 테스트된다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 알려진 고효율 스크리닝(high throughput screening) 방법을 고려할 때(예를 들면, 참조에 의해 본 명세서에 포함된, Kittel et al., Metab. Eng. 2005, 7(1): 53-58 참조), 본 명세서에 개시된 발명의 구체예에서 이용될 수 있게 하는 LovD 아실트랜스퍼라아제 활성을 가진 폴리펩티드를 발현하는 개체의 종 및 출처를 용이하게 결정하기 위해, 그와 같은 방법은 당해 기술 분야에서 알려지고 당업자에게 용이하게 입수가능한 엄청난 수의 균류 배양물과 같은 다수의 테스트 시료에 대해 수행될 수 있다.

본 명세서에 개시된 방법들은 당업자가 추가적인 LovD 아실트랜스퍼라아제 구체예, 예를 들면, 다양한 반응 조건 하에서 증가된 안정성 및/또는 다양한 반응 조건 하에서 유리한 효소 반응속도와 같은 추가적인 바람직한 특성을 갖는 구체예를 분리하고 클로닝할 수 있게 한다. 이 경우, 본 발명의 또 다른 구체예는 본 발명의 추가적인 LovD 아실트랜스퍼라아제 구체예를 식별하는 방법이고, 상기 방법은 LovD 아실트랜스퍼라아제를 발현할 것 같은 개체(예를 들면, 로바스타틴 생성 개체) 또는 그 개체로부터의 세포 추출물을 LovD 아실트랜스퍼라아제의 존재 하에 모나콜린 J의 C8 히드록시기를 아실 모이어티에 공여하는 아실 티오에스테르(예를 들면, α-디메틸부티릴-SNAC)와 조합하는 단계 및 이 조합을 심바스타틴의 존재에 대해 테스트하는 단계를 포함한다. 심바스타틴의 존재는 원하는 LovD 아실트랜스퍼라아제 활성의 존재를 나타낸다. 본 명세서에 개시된 방법 및 본 발명이 속하는 기술 분야에서 공지된 고효율 스크리닝 방법(예를 들면, 참조에 의해 본 명세서에 포함된, Kittel et al., Metab. Eng. 2005, 7(1): 53-58 참조)을 고려할 때, 그와 같은 방법은 당해 기술 분야에서 알려지고 당업자에게 용이하게 입수가능한 엄청난 수의 균류 배양물(예를 들면, 로바스타틴 생성 배양물)과 같은 다수의 테스트 시료에 대해 최소량의 시험으로만 수행될 수 있다. 결론적으로, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 공지된 다수의 로바스타틴 생성 개체, 당해 기술 분야에서 공지된 고효율 스크리닝 방법 및 본 명세서의 개시는 작업자가 본 명세서에 개시된 발명의 구체예에서 사용될 수 있게 하는 LovD 아실트랜스퍼라아제 활성을 갖는 폴리펩티드의 출처 및 종을 용이하게 결정할 수 있도록 인도한다.

이 방법을 이용하여 LovD 아실트랜스퍼라아제 활성이 관찰되면, 그활성을 갖는 단백질을 코딩하는 유전자를 클로닝하는 허용된 방법에서 이용될 수 있다. 대안적으로, 서열번호 1 또는 서열번호 2에 대해 상동성을 갖는 신규한 LovD 아실트랜스퍼라아제를 식별하기 위해, LovD 아실트랜스퍼라아제 폴리뉴클레오티드 서열(예를 들면, 아스퍼길러스 테레우스 유래의 서열)을 단독으로 또는 전술된 기능 연구와 조합하여 이용하여 개체의 유전자 라이브러리를 스크리닝할 수 있다. 이 상황에서, LovD에 대한 상동 효소는 예를 들면, 균류 폴리케티드 유전자 클러스터에서 발견될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 예를 들면, 컴팩틴(compactin) 생합성 경로에서 Mlc가 동일한 트랜스아실화 반응을 촉매하는 데 관여되나(예를 들면, Y. Abe, T. et. al., MoI Genet Genomics. 2002, 267, 636-646 참조), 스쿠알레스타틴(squalestatin) 경로에서 아실트랜스퍼라아제는 ACP-결합 테트라케티드 티오에스테르와 아글리콘 간의 유사한 반응을 촉매할 수 있다(예를 들면, R. J. Cox, F. et. al., Chem Commun (Camb) 2004, 20, 2260-2261 참조). LovD의 아미노산 서열은 β-락탐계 항생제의 가수분해에 의한 불활성화를 촉매하는 타입 C β-락타마아제와 유사하다(예를 들면, E. Lobkovsky, E. M. et. al., Biochemistry, 1994, 33, 6762-6772 및 A. Dubus, D. et. al., Biochem. J. 1993, 292, 537-543 참조). LovD와 엔테로박터 클로아카애(enterobacter cloacae) V99 락타마아제의 정렬(예를 들면, S. D. Goldberg, et al., Protein Sri. 2003, 12, 1633- 1645 참조)은 촉매성 Ser76, Lys79, Tyrl88, 및 Lys315과 같은 잠재적으로 보존된 활성 부위 잔기들을 포함한, 적절한(moderate) 서열 상동성을 보여준다(예를 들면, S. D. Goldberg, et. al., Protein Sd. 2003, 12, 1633-1645 참조). 이 방법들을 고려할 때, 본 발명의 또 다른 구체예는 서열번호 1로 표시된 아미노산 서열과 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 단리된 LovD 아실트랜스퍼라아제 폴리펩티드이고, 상기 폴리펩티드는 적합한 아실 티오에스테르 공여체(예를 들면, α-디메틸부티릴-SNAC)의 존재 하에 모나콜린 J의 C8 히드록시기를 아실화시킬 수 있는 능력을 갖는다.

본 명세서에서 개시된 바와 같이, "모나콜린 J의 C8 히드록시기를 위치특이적으로 아실화시키는 아실 티오에스테르(acyl thioester to regioselectively acylate the C8 hydroxyl group of monacolin J)"는 본 명세서에 개시된 바와 같이 심바스타틴 또는 관련된 화합물을 제조하기 위해 모나콜린 J 또는 관련된 화합물에 전달할 수 있는 아실기를 갖는 화합물이다. 본 명세서에서 이 활성을 갖는 것으로 입증된, 다양한 그와 같은 작용제가 본 발명이 속하는 기술 분야에서 알려져 있다(예를 들면, 표 1에 예시된 아실-티오에스테르 참조). 본 발명이 속하는 기술 분야에서 공지되고 본 명세서에서 이 활성을 갖는 것으로 더 확인된 것들 외에, 심바스타틴을 생성하기 위해 모나콜린 J의 C8을 아실화시키는 능력을 더 갖는 당해 분야에서 공지된 (또는 새로 합성된) 잠재적인 아실 공여체/운반체가 본 명세서에 개시된 아실 공여체와의 비교 실험에 의해 용이하게 식별될 수 있다(예를 들면, 아실-SNAC). 통상적으로, 그와 같은 실험에서, 아실 티오에스테르는 부티릴-티오에스테르, N-아세틸시스테아민 티오에스테르 또는 메틸-티오글리콜레이트 티오에스테르이다. 선택적으로, 아실 티오에스테르는 중쇄 길이(C3-C6) 아실기 모이어티를 포함한다. 본 발명의 특정한 구체예에서, 아실 티오에스테르는 발효 배지에서 생장하는 대장균 또는 아스퍼길러스 테레우스의 세포막을 통과할 수 있다. 통상적으로, 아실 티오에스테르는 α-디메틸부티릴-S-메틸-머캅토프로피오네이트(DMB-S-MMP), 디메틸부티릴-S-에틸-머캅토프로피오네이트(DMB-S-EMP) 및 디메틸부티릴-S-메틸 티오글리콜레이트(DMB-S-MTG) 및 디메틸부티릴-S-메틸-머캅토부티레이트(DMB-S-MMB)로 구성된 군으로부터 포함된다.

본 명세서의 개시에 의해 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 특성은 최소의 실험으로 화합물을 용이하게 "모나콜린 J의 C8 히드록시기를 위치선택적으로 아실화시킬 수 있는 아실 티오에스테르"로 식별할 수 있게 한다. 화합물을 "모나콜린 J의 C8 히드록시기를 위치선택적으로 아실화시킬 수 있는 아실 티오에스테르"로 식별하기 위한 하나의 예시적인 절차에서, 제1 단계는 모나콜린 J와 아스퍼길러스 테레우스의 혼합물을 제조하는 것이다. 제2 단계에서, 이 혼합물을 발효 배지 내에서 테스트 화합물과 조합하고, 배양한다. 제3 단계에서, 이 혼합물을 하기의 실시예에서 검토된 바와 같이, 예를 들면, HPLC 분석을 이용하여 심바스타틴의 존재에 대해 테스트하고, 심바스타틴의 존재는 상기 화합물이 이 활성을 갖는 것으로 식별한다. 당해 기술 분야에서 알려진 고효율 스크리닝 방법을 고려할 때(예를 들면, 참조에 의해 본 명세서에 포함된, Kittel et al., Metab. Eng. 2005, 7(1): 53-58 참조), 그와 같은 방법은 본 명세서에서 개시된 구체예에서 그들을 이용할 수 있게 하는 유용성을 갖는 아실 공여체 화합물의 출처 및 종을 용이하게 결정하기 위해 다수의 테스트 시료에 대해 수행될 수 있다.

본 발명의 구체예는 본 발명의 방법을 용이하게 하기 위해 설계된 제품 및/또는 키트를 포함한다. 통상적으로, 그와 같은 키트는 본 발명의 방법에 따라 키트 내의 요소들을 이용하는 것을 위한 설명서를 포함한다. 그와 같은 키트는 바이알, 튜브, 및 그 등가물과 같은 하나 이상의 용기 수단을 폐쇄된 한정 내에 담도록 구획화된 운반체 수단을 포함할 수 있고, 상기 용기 수단의 각각은 본 발명에서 이용될 수 있는 별개의 요소들 중 하나를 포함한다. 예를 들면, 상기 용기들 중 하나는 바이알, 예를 들면, LDKS 유전자에 파괴를 갖는 아스퍼길러스 테레우스를 담은 바이알 및 아실-SNAC 화합물 또는 그 등가물을 담은 또 다른 바이알을 포함할 수 있고, 두개가 모두 심바스타틴을 생성하기 위한 발효 혼합물에 첨가될 수 있다.

본 발명의 전형적인 구체예에서, 심바스타틴의 생성을 위해 유용한 재료를 함유한 제품이 제공된다. 상기 제품은 용기 및 표지(label)를 포함한다. 적합한 용기는 예를 들면, 병, 바이알, 주사기, 및 시험관을 포함한다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 재료로부터 제조될 수 있다. 용기는 예를 들면, 심바스타틴을 생성할 수 있는ㄴ 조성물(예를 들면, 아실 운반체 및 개체)을 담을 수 있다. 상기 용기에 부착되거나 또는 연관된 표지는 조성물이 세포의 폴리펩티드를 조사하기 위해 이용될 수 있다는 것을 표시한다. 상기 제품은 예를 들면, 발효 혼합물에 첨가될 또 다른 화합물 또는 기질을 포함하는 제2 용기를 더 포함할 수 있다. 이 화합물 또는 기질은 예를 들면, 심바스타틴의 생성에서 모나콜린 J와 같은 특정한 중간체의 생성을 증가시키기 위해 이용될 수 있다. 상기 제품은 기타 완충액, 희석제, 필터, 주사바늘, 주사기, 및 사용 설명서를 담은 포장 삽입물을 포함한, 상업적 목적 및 사용자의 입장에서 유용한 기타 물질을 더 포함할 수 있다.

본 발명의 추가적인 생물학적 양태가 하기의 섹션에서 검토된다.

발명의 구체예의 생화학적 양태

본 발명의 특정 양태의 이해는 본 발명의 생화학적 양태의 검토에 의해 촉진된다. 본 명세서의 하기의 섹션 및 실시예에서, LovD 아실트랜스퍼라아제는 서열번호 1로 표시된 아스퍼길러스 테레우스 LovD 폴리펩티드이고, 통상적으로 "LovD" 또는 "LovD 효소"로 지칭된다.

대안적인 아실 공여체에 대한 LovD 효소의 무분별성(promiscuity)을 조사하였다. 본 발명자들은 아실 운반체/공여체가 LDKS에 결합되지 않아도 된다는 것을 확인하였다. 아실-CoA(코엔자임 A) 및, 보다 중요하게는 막 투과성 아실-SNAC를 포함한, 대안적인 티올 함유 운반체가 적합하다(도 7). 본 발명자들은 LovD가 LovF와 상호작용하지 않아도 되고, 다양한 상이한 공여체로부터 아실기를 수용할 수 있다는 것을 확인하였다. 본 발명자들은 또한 LovD가 다양한 로바스타틴 유사체를 생성하기 위해 모나콜린 J의 C8-히드록시기에 다양한 아실 기질을 전달할 수 있다는 것을 발견했다. 본 발명자들은 LovD가 다양한 아실 기질에 의해 모나콜린 J의 C8 히드록시 위치를 위치특이적으로 아실화시킬 수 있다는 것을 확인했다. 성공적인 아실기 중에는 LovD와 모나콜린 J의 존재 하에 심바스타틴을 생성하는, α-디메틸부티릴-SNAC가 있다. 본 발명자들은 또한 LovD의 트랜스아실화 활성이 인 비트로에서 확인되고 이종 숙주에서 재구성될 수 있다는 것을 확인했다. 본 발명자들은 LovD가 약제학적으로 중요한 심바스타틴을 생성하기 위해 모나콜린 J를 α-디메틸부티레이트에 의해 직접 아실화시킨다는 것을 확인했다. α-디메틸부티릴-SNAC는 세포-투과성이다. α-디메틸부티릴-SNAC의 세포 투과성은 중요한 관련성을 갖는다: 상기 화합물은 인 비보에서 LovD를 발현하는 원핵생물 또는 진핵생물과 같은 개체에게 전구체로서 공급될 수 있다. (내생적으로 생성되거나 또는 발효 배지에 외생적으로 공급된) 모나콜린 J의 존재 하에 발효되는 경우, 상기 원핵생물 또는 진핵생물이 심바스타틴을 직접적으로 공급할 수 있다. 예를 들면, 대장균이 모나콜린 J의 심바스타틴으로의 생물전환을 위한 미생물 숙주로서 조사되었다. 모나콜린 J와 디메틸부티릴-SNAC가 LovD 효소를 과발현하는 대장균 균주의 생장 배양물에 첨가되었다(도 10). 심바스타틴을 배양물의 발효액으로부터 우수한 수율로 분리하였다. 이 기법은 원형의(native) 로바스타틴 생성체인 아스퍼길러스 테레우스에서 이용될 수 있다. 2-메틸부티레이트 곁사슬을 합성할 수 없도록, LDKS가 결핍된 균주가 작제될 수 있다. α-디메틸부티릴-SNAC이 발효 배지에 첨가될 수 있다. 이 단일 단계 발효 동안 심바스타틴이 합성될 수 있다.

전술된 바와 같이, LovD는 로바스타틴 생합성 동안 최종 아실 전달 단계를 촉매할 수 있고 모나콜린 J에서 C8 히드록시기를 위치특이적으로 아실화시킬 수 있다. LovD는 데칼린 아글리콘, 아실 운반체 및 아실기에 대한 광범위한 기질 특이성을 보일 수 있다. 비천연 기질, α-디메틸부티릴-SNAC로 보충되는 경우, LovD는 인 비트로 및 인 비보에서 약제학적으로 중요한 심바스타틴을 생성할 수 있다. α-디메틸부티릴-티오에스테르 전구체가 아스퍼길러스 테레우스의 LovF-결핍 균주에 공급되는 경우, 로바스타틴 생합성 경로가 직접 심바스타틴을 제공하도록 재조정될 수 있다. 본 발명은: 1) 미생물에 의한 모나콜린 J의 심바스타틴으로의 전환(도 10); 2) 모나콜린 J를 생성하는 균주과 LovD 과다발현 균주의 공배양(coculturing); 및 3) 심바스타틴을 생성하기 위한 아스퍼길러스 테레우스(△LDKS)의 단일 단계 배양을 가능하게 한다. 각 경우에, 아실 기질인 α-디메틸부티릴-SNAC는 화학적으로 합성되어 발효 배양액에 첨가될 수 있다.

LovD는 LovF와 상호작용하지 않아도 되고, LovD는 아실-CoA와 다른 대안적인 티올-함유 운반체의 트랜스아실화 반응을 촉매할 수 있다(도 5).

본 발명자들은 먼저 아실-CoA가 트랜스아실화 반응의 기질로서 이용될 수 있는지 여부를 조사하였다. LovD의 완전한(uninterrupted) 유전자를 중첩 신장(overlap extension) PCR에 의한 스플라이스(splice)를 이용하여 아스퍼길러스 테레우스 게놈 DNA로부터 증폭하고 pET28a 발현 벡터에 삽입하였다. 가용성의 N-말단 6xHis 융합 LovD의 과발현을 대장균 균주 BL21(DE3)/pAW31에서 수행하였다. Nickel-NTA 친화도 컬럼을 이용하여 LovD를 균질한 수준으로 정제하였다(최종 수율 ~ 40 mg/L). 로바스타틴의 LiOH 가수분해를 통해 기질인 모나콜린 J(1 mM)를 제조하고 순수한 LovD(10 μM) 및, 천연 α-메틸부티레이트 곁사슬을 가장 유사하게 닮은 상업적으로 입수가능한 아실-CoA인 부티릴-CoA (4 mM)를 함유한 반응 혼합물에 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 실온에서 인큐베이션하고, 에틸 아세테이트로 추출하고 HPLC 및 LC-MS에 의해 분석하였다(도 5).

반응 혼합물에서 모나콜린 J의 감소와 함께, 로바스타틴과 동일한 UV 흡광도를 갖는 단일의 보다 소수성인 화합물이 형성되었다(도 5, 트레이스 a). 모나콜린 J로의 부티릴기의 첨가에 따라, 신규 화합물의 질량은 391(M+H)로 확인되었다. 4를 생성하기 위한, 모나콜린 J의 C8 히드록시기의 선택적 에스테르화가 양성자 NMR 분광법(CDCl₃, 500 MHz)에 의해 확인하였다. 4(락톤화 형태)의 양성자 NMR은 선형 아실 곁사슬의 지방족 신호를 제외하고는 로바스타틴의 양성자 NMR과 거의 동일하다. 4에서 진단적 H8 다중선(multiplet) (¹H-¹H COSY, ¹H-¹³C HMQC 및 ¹H-¹³C HMBC를 이용하여 지정됨)이 모나콜린 J의 동일한 양성자에 대해 관찰된 δ 4.23에 비해, 다운필드(downfield)로 δ 5.38로 이동된다. 이는 C8에서 아실옥시 치환의 비차폐(deshielding) 효과와 일치한다. 다른 히드록시기를 갖는 탄소의 양성자 H11 및 H13은 각각 모나콜린 J에서의 δ 4.71 및 δ 4.38로부터 4에서의 δ 4.51 및 δ 4.36로 이동하였다.

도 5A(트레이스 a)에 도시된 바와 같이, 부티릴-CoA를 아실 공여체로 이용하여 10시간 후에 모나콜린 J의 4로의 87% 전환을 관찰하였다. 시간 경과에 따른 연구(time-course study)는 0.18 min^-1의 겉보기 전환 속도를 밝혔다(도 5B). 관찰된 87% 전환은 도 5B에서 확인되는 바와 같이 평형에 접근하고 있다. 평형 전환의 생화학적 속성을 조사하기 위해, 본 발명자들은 LovD가 또한 역 가수분해 반응(reverse, hydrolysis reaction)을 촉매하는지 여부를 분석하였다. 실제로, 로바스타틴이 유일한 기질로 이용된 경우, 모나콜린 J의 형성이 각각 0.21 ± 0.01 min^-1과 0.56 ± 0.05 mM의 k_cat 및 K_m 값으로 용이하게 검출되었다(도 5C). LovD에서 추정적인 활성 부위 세린(Ser76)이 알라닌으로 돌연변이되면, 4의 형성 또는 로바스타틴의 가수분해가 검출될 수 없다(도 5A, 트레이스 b).

4의 효소적 합성은 LovD가 실제로 도 4에 표시된 아실 전달 반응을 촉매한다는 것을 확인한다. 또한, 이 결과는 이전에 가정된 LovD 촉매의 모드와 대조적으로, 촉매적 전환을 위해 LovF와 LovD의 도메인 간의 직접적인 결합이 요구되지 않는다는 것을 보여준다(예를 들면, J. Kennedy, K. et. al., Science, 1999, 284, 1368-1372 and C. R. Hutchinson, J. et. al., Antonie Van Leeuivenhoek 2000, 78, 287-295 참조). 잠재적인 단백질-단백질 상호작용의 상실 때문에, 훨씬 더 높은 K_m을 초래할 것 같아도, 아실-S-CoA가 아실-S-LovF를 대체할 수 있다.

여러 개의 상이한 상업적으로 입수가능한 아실 치환기에 의한 트랜스아실화 분석법은 중쇄 길이(C3-C6) 아실기에 대한 LovD의 선호를 밝혔다.

본 발명자들은 다양한 상업적으로 입수가능한 아실-CoA에 의한 트랜스아실화 분석법을 수행하여 다양한 아실 치환체에 대한 LovD의 허용도(tolerance)를 분석하였다(표 1A). 모든 분석은 1 mM 모나콜린 J, 4 mM 아실-CoA 및 10 uM LovD로 10시간 동안 수행하였다. 본 발명자들의 결과는 명확하게 LovD가 중쇄 길이(C3-C6) 아실기에 대한 선호도를 보이고, 부티릴 CoA가 최적의 알킬아실-CoA 기질이라는 것을 나타낸다. 놀랍게도, 부피가 보다 큰 벤조일-CoA가 조사된 최상의 아실 기질 중 하나이고, 심바스타틴의 상응하는 8-벤족시-로바스타틴 유사체로의 전환은 약 70%였다(겉보기 k_cat

0.16 min^-1). 크로토닐-CoA의 존재 하에 모나콜린 J의 6% 아실화에서 알 수 있는 바와 같이, α-β 비포화(unsaturation)를 도입하는 것은 반응 속도를 유의성있게 감소시켰다. 각각 천연 숙주로부터의 모나콜린 X(예를 들면, A. Endo, K et al , J. Antibiot, 1986, 38, 321-327 참조) 및 모나콜린 M(예를 들면, A. Endo, D. et al , J. Antibiot, 1986, 39, 1670-1673 참조)의 분리에서와 일치되게, 아세토아세틸-CoA와 β-히드록시부티릴-CoA는 모두 LovD의 탁월한 기질이었다. 분석된 CoA 기질 중에서, LovD는 말로닐-CoA 및 팔미토일-CoA에 대해 불활성이었다.

인 비보 조건에서 세포막을 통과할 수 있고 제조가 보다 간단한 대안적인 아실 운반체인 아실-SNAC에 의한 추가적인 트랜스아실화 분석법은 아실-SNAC가 LovD에 대한 적합한 기질이라는 것을 밝혔다

대안적인 아실 운반체, 특히, 합성에 의해 제조하기가 보다 간단하고 인 비보 조건 하에서 세포막을 통과할 수 있는 아실 운반체에 대한 LovD의 기질 특이성을 더 조사하기 위해, 본 발명자들은 LovD의 기질로서 부티릴-티오에스테르의 두 개의 변이체를 분석하였다(도 5). N-아세틸시스테아민 티오에스테르(SNAC)은 천연 산물 생화학의 연구에서 프로브 및 전구체로서 널리 이용되었다(예를 들면, Auclair et al, Science, 1997, 277, 367-369 참조). 메틸-티오글리콜레이트(SMTG)는 최근에 에리트로마이신의 전구체-방향성 생합성(precursor-directed biosynthesis)에서 SNAC에 대한 비용-효과적 대체물인 것으로 입증되었다(예를 들면, S Murli, K S. et. al , Appl. Environ. Microbiol. 2005, 71, 4503-4509 참조). 도 5(트레이스 c 및 d)는 이 부티릴-티오에스테르가 아실 공여체로서 사용되는 경우, 모나콜린 J의 4로의 전환을 보여준다. SNAC 및 SMTG 티오에스테르는 각각 0.09 min^-1 및 0.23 min^-1의 겉보기 k_cat 값으로, 부티릴-CoA를 효율적으로 대체하여 (도 5B), LovD와 LovF 간의 단백질-단백질 상호작용 및 LovD와 포스포판토테인 가지(arm) 간의 상호작용이 아실 전달을 위해 요구되지 않는다는 것을 더 강조했다. 그러나, 부티릴-α-티오에탄은 LovD의 적합한 기질이 아니었고 단지 모나콜린 J의 4로의 4%의 전환만을 지원하였다. 마찬가지로, 벤조일-SNAC 및 벤조일-SMTG는 효율적으로 벤질-CoA를 대체했고, 겉보기 k_cat 값은 각각 0.12 min^-1 및 0.15 min^-1이었다(표 1A).

α- S -메틸부티릴-SNAC 및 α-디메틸부티릴-SNAC를 이용한 로바스타틴과 심바스타틴의 인 비트로 화학효소(chemoenzymatic) 합성에 대한 분석은 아실-SNAC의 존재 하에 모나콜린 J가 심바스타틴으로 전환된다는 것을 밝혔다

본 발명자들은 그 후, α-S-메틸부티릴-SNAC 및 α-디메틸부티릴-SNAC를 합성하고 각각 로바스타틴 및 심바스타틴의 인 비트로 화학효소 합성에 대해 분석하였다. 결과는 도 8 및 표 1A에 표시된다. 로바스타틴 및 심바스타틴의 순수한 시료를 HPLC 검출을 위한 기준으로 이용하였다(도 8, 트레이스 a). 천연의, α-S-메틸부티레이트 곁사슬은 놀갑게도 부티릴-, 펜타노일- 및 헥사노일-SNAC에 비해 보다 열등한 기질이었다. 로바스타틴 합성의 겉보기 k_cat (~ 0.04 min^-1)는 LovD의 부티틸-SNAC에 대한 것보다 50% 이상 더 낮았다. 이는 야생형 LovD가 가지형 기질을 전달하는 것에 대해 최적화되지 않았다는 것을 시사했다. α-위치에서 제2의 메틸 치환기의 추가는 아실화의 속도를 더 약화시켰고, 이는 디메틸 모이어티의 증가된 입체 장애(steric hindrance)에서 기인하는 것으로 보인다. 표준 분석 조건 하에서, α-디메틸부티릴-SNAC가 기질로서 이용되는 경우(겉보기 k_cat = 0.02 min^-1), 약 10%의 모나콜린 J가 심바스타틴으로 전환되었다. 본 발명자들은 100 uM LovD 및 10배 과량의 α-디메틸-SNAC 또는 α-디메틸-SMTG가 인 비트로 반응 혼합물에 첨가되는 경우 70%보다 높은 평형 전환율에 도달할 수 있었다(도 8, 트레이스 b 및 c).

인 비트로에서, LovD는 다양한 로바스타틴 유사체를 생성하기 위해 모나콜린 J의 C-8 히드록시기에 (LDKS 외에) 다양한 아실 기질을 전달할 수 있다

LovD의 모나콜린 J 변이체에 대한 기질 특이성을 테스트하기 위해, 본 발명자들은 테트라-올(7)의 8, 프라바스타틴(5) 및 후바스타틴(6)으로의 전환을 분석하였다(도 9). 모나콜린 J 생합성이 차단된 아스퍼길러스 테레우스 돌연변이체에 8-데스메틸-모나콜린 J가 공급된 경우, 컴팩틴이 용이하게 분리될 수 있다는 것이 이전에 확인되었다(예를 들면, J. L. Sorensen, K. et. al., Org. Biomol. Chem. 2003, 1, 50-59 참조). 이는 LovD가 데칼린 코어(decalin core)의 C6 위치에서의 치환에 대해 관용적일 수 있다는 것을 시사한다. 실제로, LovD는 C6에서의 히드록시기 치환에 대해 완화된 특이성을 보였고 보다 높은 효율성으로 7의 아실화를 촉매했다. 상응하는 아실-티오에스테르를 이용한 8, 프라바스타틴, 또는 후바스타틴의 합성에 대한 겉보기 전환 속도는 각각 0.18, 0.11, 0.03 min^-1였다. 순수한 프라바스타틴의 잔류 시간(retention time)은 효소에 의해 합성된 화합물과 동일했다. 새로 형성된 화합물의 질량은 LC-MS에 의해 확인하였다. 본 발명자들은 반응 혼합물에서 디-아실화 생성물을 검출하지 않았다.

인 비보 데이터는 LovD가 로바스타틴 유사체의 분취 생합성(preparative biosynthesis)을 위해 이용될 수 있다는 것을 보여준다.

LovD가 로바스타틴 유사체의 분취 생합성을 위해 이용될 수 있다는 것을 입증하기 위해, 본 발명자들은 먼저 이종 숙주로서 대장균을 이용하여 인 비보에서 벤질화 반응을 수행하는 것을 시도하였다. BL21(DE3)/pAW31 과발현 균주를 진탕 플라스크(shake flask)(200 mL)에서 1.0의 OD₆₀₀까지 배양하고, 1 mM IPTG, 0.8 mM 모나콜린 J 및 4 mM의 벤조일-SNAC 또는 벤조일-SMTG를 배양액에 첨가하였다. LovD의 발현 및 생물전환을 18℃에서 수행하였다. 배양액을 추출하고 8-벤조일-모나콜린 J의 형성에 대해 분석하였다. 벤조일-SNAC로 보충된 경우, 유도 후 20 시간 이내에 모나콜린 J의 84% 전환을 검출하였다. 생성물을 락톤화시키고 단일 실리카-겔 크로마토그래피에 의해 정제하였다. NMR 스펩트럼은 진단적인 H8 다중선이 δ 5.61로 다운필드로 이동되었기 때문에, C8 히드록시기의 위치선택적 벤조일화를 확인하였다. 대조적으로, 벤조일-SMTG로 보충되지 않은 배양물에서는 단지 40%의 벤조일화만 관찰되었다. 벤조일-SMTG는 대장균에 의해 빠르게 분해되었고 24시간 후 배양 배지 내에서 미량도 검출할 수 없었다.

아실 기질, α-디메틸부티릴-SNAC는 정제된 LovD 및 모나콜린 J의 존재 하에 심바스타틴을 생성했다

본 발명자들은 단일 생합성 단계로 모나콜린 J로부터 심바스타틴을 생성하기 위해 α-디메틸부티릴-SNAC를 전구체로 이용하여 낮은 세포-밀도 발효를 수행하였다. 2일의 배양 후에, 본 발명자들은 모나콜린 J의 심바스타틴으로의 ~90% 전환을 관찰하였다(예를 들면, 하기에 기재된 "발효 조건"을 참조함). 생성물을 정제하였고 양성자 및 탄소 NMR 스펙트럼은 상업적으로 구매된 화합물의 스펙트럼과 동일했다. 심바스타틴의 보다 낮은 수율은 인 비트로에서 관찰된 보다 낮은 전환 속도와 일치했고, 이는 SNAC 전구체의 보다 낮은 세포내 농도에서 더 낮아질 수 있다. 심바스타틴의 가역적 가수분해(본 발명자들은 LovD의 존재 하에 심바스타틴의 가수분해를 관찰했다-가수분해의 k_cat(0.02 min^-1)는 도 5C에서 알 수 있는 바와 같이, 로바스타틴 가수분해의 값보다 ~10배 낮았다) 및 연장된 발효 후 LovD의 불활성화와 같은 다른 인자들이 관찰된 전환 속도를 초래할 수 있다. 본 발명자들은 수율이 1) LovD의 유효 농도를 증가시키고 발효 조건을 최적화하기 위해 높은 세포-밀도 배양을 이용하고; 2) 단백질 공학에 의해 LovD의 비천연 전구체에 대한 촉매 효율을 증가시키는 것과 같은 여러 수단에 의해 유의성 있게 개선될 수 있을 것으로 예상한다.

본 출원 명세서에서, 다양한 문헌들이 참조된다. 이 문헌들의 개시는 그 전체가 참조에 의해 본 명세서에 포함된다.

도 1. A. 로바스타틴. B. 심바스타틴. 두 화합물은 α 위치에서 하나의 메틸 치환기에 의해 다르다.

도 2. 로바스타틴 (1), 심바스타틴 (2), 프라바스타틴 (5), 후바스타틴 (6) 및 관련 화합물.

도 3. 기존의 심바스타틴 제조 방법.

도 4. 아스퍼길러스 테레우스에서 본 발명의 아실 전달 반응. 세린 76은 활성 부위 친핵체(nucleophile)일 수 있다.

도 5. A) LovD 매개 아실 전달에 의한 4의 형성을 보여주는 HPLC(238 nm) 트레이스(trace). 구배: 60%B-95%B, 5분; 95%B, 15분; A: H₂O+0.1% TFA; B: 아세토니트릴 + 0.1% TFA; a) LovD + 모나콜린 J + 부티릴-CoA 시간 경과(0, 1, 3, 6 및 10 시간); b) LovD S76A + 모나콜린 J + 부티릴-CoA, 10 시간; c) LovD + 부티릴- SNAC, 10 시간; d) LovD + 부티릴-SMTG, 10 시간. 분석 조건: 1 mM 모나콜린 J, 4 mM 부티릴-CoA, lOμLovD, 50 mM HEPES, pH 7.9, 25 ℃. (B) (◇) 부티릴-CoA (◆) 부티릴-SNAC, (■) 부티릴-SMTG에 대한 시간의 함수로서의 전환(conversion). 본문에서 보고된 겉보기(apparent) k_cat 값은 선형 범위의 초기 전환 속도(initial turnover rate)이다. (C) 로바스타틴의 모나콜린 J로의 LovD 촉매 가수분해의 Michaelis-Menten 플롯. 반응의 진행은 HPLC에 의해 모니터링하였다. k_cat: 0.21 ± 0.01 min^-1; K_m: 0.56 ± 0.05 mM.

도 6. LovD는 로바스타틴을 생성하기 위해 아실 전달을 촉매한다. 아실 공여체(acyl donor)가 LDKS에 부착된다.

도 7. Acyl-SNAC. 착색된(shaded) 원은 작용기를 나타낸다.

도 8. LovD 매개 아실 전달에 의한 심바스타틴과 로바스타틴의 형성을 보여주는 HPLC(238 nm) 트레이스. 구배는 도 1에 기재된 바와 동일하다; a) 로바스타틴과 심바스타틴의 순수한 표준(authentic standard); b) 모나콜린 J + α-S-메틸부티릴-SNAC; c) 모나콜린 J + α-디메틸부티릴-SNAC. 분석 조건: 1 mM 모나콜린 J, 10 mM 아실-SNAC, 100 μM LovD, 50 mM HEPES, pH 7.9, 25℃, 6 시간.

도 9. 테트라-올 7의 LovD 매개 아실화에 의한 프라바스타틴과 후바스타틴의 형성을 보여주는 HPLC(238 nm) 트레이스. 구배: 5% B-95%B, 5분; 95%B, 15분; A: H2O+0.1% TFA; B: 아세토니트릴 + 0.1% TFA; a) 프라바스타틴과 7의 순수한 표준; b) 7 + α-S-메틸부티릴-SNAC; c) 7 + α-디메틸부티릴-SNAC. 분석 조건: 1 mM 모나콜린 J, 10 mM 아실-SNAC, 100 μM LovD, 50 mM HEPES, pH 7.9, 25℃, 6 시간.

도 10. 모나콜린 J의 심바스타틴으로의 미생물에 의한 전환.

도 11. LovD 촉매 가수분해 및 LovD 촉매 아실화. 도 11은 LovD 및 아실 공여체의 존재 하에 후바스타틴 또는 심바스타틴을 생성하는 조성물을 포함한 본 발명의 구체예를 포괄한다. 도 11은 또한 모나콜린 J를 생성하기 위해 LovD의 존재 하에 로바스타틴을 가수분해하는 단계를 포함한 심바스타틴의 생성 방법을 예시한 다. 아실 공여체의 존재 하에 모나콜린 J는 그에 의해 심바스타틴으로 전환된다. 마찬가지로, 도 11은 또한 가수분해된 프라바스타틴을 생성하기 위해 LovD의 존재 하에 프라바스타틴을 가수분해하는 단계를 포함하는 후바스타틴을 생성하는 방법을 예시한다. 아실 공여체의 존재 하에 가수분해된 프라바스타틴은 그에 의해 후바스타틴으로 전환된다.

도 12. LovD를 발현하는 미생물에서 후바스타틴의 생성. 도 12는 LovD를 발현하는 개체에서의 후바스타틴의 생성을 포함한 본 발명의 구체예의 예시를 제공한다.

도 13. (A) 모나콜린 J 산과 DMB-S-MMP로부터 심바스타틴 산의 전세포 생촉매 전환(whole cell biocatalytic conversion). 대장균 균주는 아실트랜스퍼라아제 LovD를 과다발현한다. DMB-S-MPA를 생성하는 DMB-S-MMP의 가수분해가 경쟁 반응이다. (B) 상단 트레이스: 전세포 전환 실험으로부터의 반응물과 생성물의 전형적인 프로파일. 하단 트레이스: DMB-S-MMP 및 DMB-S-MPA에 대한 표준. 스펙트럼은 238 nm에서 수집하였다.

도 14. (A) DMB-S-MMP로 보충된 60개의 대장균 균주의 유기 추출물을 보여주는 박막 크로마토그래피(thin layer chromatography). 균주의 식별은 표 2에서 찾을 수 있다. DMB-S-MMP(상단)와 DMB-S-MPA(하단)를 분리하기 위해 헥산 중의 20% EA으로 TLC 플레이트를 현상하였다. 중간 스팟은 미지의 화합물이다. #56을 제외한 모든 균주에서, 10시간의 인큐베이션 후에 DMB-S-MMP가 DMB-S-MPA로 가수분해되었다. △bioH 균주는 DMB-S-MMP를 가수분해하지 않았다. (B) HPLC를 이용한 TLC 결과 의 확인. DMB-S-MPA는 △bioH 균주의 추출물에서 검출될 수 없다. 스펙트럼은 234 nm에서 수집하였다.

도 15. (A) DMB-S-MMP에 대한 BioH의 Michaelis-Menten 반응속도(kinetics). 결과는 3회의 수행에 대한 평균으로 표시하였다. k_cat 및 K_m 값은 각각 260 ± 45 sec^-1 및 229 ± 26 μM이었다. 고농도의 DMB-S-MMP에서 관찰된 높은 표준 편차는 완충액(50 mM HEPES, pH 7.9, 10% DMSO)에서 기질의 낮은 용해도 때문일 수 있다. (B) 세개의 상이한 디메틸부티릴 티오에스테르에 대한 가수분해 속도의 비교. 반응은 1 mM 티오에스테르 및 10 nM BioH로 수행하였다.

도 16. (A) F1 최소 배지에서 BL21(DE3)/pAW31 (회색 ◇) 및 YT2/pAW31 (비오틴 불포함: ○; 0.15 mg/L 비오틴 포함: ●)에 대한 성장 속도 및 최종 세포 밀도의 비교. 세포를 ~ 0.5의 OD600까지 배양하고, 100 μM IPTG로 유도하고 20℃ 진탕기로 옮겨 12시간 동안 방치하였다. △bioH 균주 YT2는 합성 배지에서 강건한 세포 생장을 유지하기 위해 외해 비오틴의 첨가를 필요로 한다. (B) 시간의 함수로서 심바스타틴 전환의 비교(15 mM MJ, 25 mM DMB-S-MMP). YT2/pAW31(○)은 99% 전환에 도달하는데 있어서 BL21(DE3)/pAW31(●)보다 훨씬 빨랐다 (Xie et al, (2007) Appl Environ Microbiol 73: 2054-2060로부터 수득한 데이터). 두 균주는 기질의 첨가 직후(0 시간)에 유도기(lag phase)를 보이고 반응 완료에 근접하여 유도기를 보였다. 유도기 간의 반응 속도는 선형이었다. YT2/pAW31 (1.5 mM/시)에 대한 전환 속도는 BL21(DE3)(0.75 mM/시)에 대한 속도보다 2배 빠르다.

도 17. 심바스타틴 정제 단계의 HPLC 분석(238 nm).

심바스타틴 산은 주입 전에 심바스타틴으로 락톤화(lactonize)된다. 트레이스 a: 반응의 완료(99% MJ 산의 심바스타틴 산으로의 전환) 후 YT2/pAW31의 조추출물(배양액과 세포 추출물의 조합). 6.80에서의 피크는 DMB-S-MMP이다; 트레이스 b: 미반응 DMB-S-MMP를 제거하기 위한 동일 부피의 헥산에 의한 세척 및 침전 후 수득된 조 시료(crude sample); 트레이스 c: dH2O에 의한 세척 및 ACN에서의 가용화 후 수득된 정제된 심바스타틴. 6.7분에서 관찰된 작은 피크는 완전히 락톤화되지 않은 심바스타틴 산이다(~1 %).

도 18. 로바스타틴 산, 모나콜린 J 산 및 심바스타틴 산의 화학적 구조. 연구된 생촉매 반응은 모나콜린 J의 심바스타틴으로의 효소적 전환이다(굵은 실선 화살표). LovD는 위치특이적으로 C8 히드록시기를 아실화시킬 수 있다. 두 개의 통상적으로 이용되는 반합성 방법이 점선 화살표로 표시된다.

도 19. DMB-S-MMP를 아실 티오에스테르로 이용하여 심바스타틴을 생성하기 위한, 모나콜린 J의 LovD 촉매 아실화의 반응속도 분석(kinetic analysis). y-축은 촉매적 전환(V/Eo)으로 표현된다. (A) 2 mM의 고정된 DMB-S-MMP 농도에서, 모나콜린 J 농도의 함수로서 LovD의 Michaelis-Menten 반응속도. 기질 억제는 관찰되지 않았다. Km(모나콜린 J) = 0.78 ± 0.12 mM. (B) 2 mM의 고정된 모나콜린 J 농도에서, DMB-S-MMP 농도의 함수로서 LovD의 Michaelis-Menten 반응속도. Km(DMB-S-MMP) = 0.67 ± 0.04 mM. 두 분석법에서, k_cat는 0.66 ± 0.03 min^-l로 추정되었다.

도 20. 저밀도 발효(low density fermentation) 및 생촉매반응. 밤새 LovD를 발현한 대장균 균주 BL21(DE3)/pAW31를 22의 최종 OD600까지 10배 농축시켰다. 기질인 모나콜린 J 및 DMB-S-MMP를 각각 15 mM 및 40 mM의 최종 농도까지 첨가하였다. 전환은 HPLC 분석에 의해 시간의 함수로 모니터링하였다. (A) 시간 경과(time course) 연구의 HPLC 트레이스. 표지된 피크는 1: 모나콜린 J(락톤화된 형태); 2: DMB-S-MMP 가수분해의 결과인 DMB-S-MPA; 3: DMB-S-MMP; 및 4: 심바스타틴(락톤화된 제형)이다. (B) 시간의 함수로서 모나콜린 J의 심바스타틴으로의 전환. 24시간차에서 최종 전환은 99%였다. 데이터 포인트는 2회의 실행에 대한 평균된 값이다.

도 21. 고밀도 발효 및 생촉매 반응. (A) F1 최소 배지에 의한 유가식(fed-batch) 발효(500 mL). 5.93의 OD600(원)(I)에서, 발효 온도는 실온까지 저하되고 실온에서 유지되었다. IPTG를 200 μM의 최종 농도까지 첨가하고 공급(feeding)을 개시하고 0.08 mL/분으로 유지하였다. 발효의 상이한 시점에서 LovD의 유효 농도를 측정하였다(사각형). (B) 도 21A에서 발효 동안 4개의 상이한 시점(1, 2, 3 및 4로 표시됨)에 세포에 의한 모나콜린 J의 심바스타틴으로의 전환 속도. 세포들을 50 mM HEPES, pH 7.9로 옮겨서 "휴지기(resting)" 상태로 유도하거나, 배지 교체없이 "비-휴지기(non-resting)" 상태로 유도하였다.

하기의 실시예는 본 명세서에 개시된 본 발명의 다양한 구체예의 실시예에서 이용될 수 있는 예시적 방법 및 재료를 제공한다.

실시예 1: 예시적 LovD 아실트랜스퍼라아제의 클로닝, 발현 및 정제

아스퍼길러스 테레우스 LovD의 3개의 엑손을 아스퍼길러스 테레우스의 게놈 DNA로부터 개별적으로 증폭하고 중첩 신장 PCR에 의한 스플라이스를 이용하여 연속된 개방 해독 프레임을 생성하기 위해 스플라이싱시켰다. 제한효소 인식부위 Ndel 및 HindIII를 각각 5' 및 3' 외부 프라이머(outside primer) 상에 도입하였다. 유전자 카세트를 pET28 (Novagen)에 라이게이션시켜서 발현 작제물(expression construct) pAW31을 생성하였다. pAW31로 형질전환된 대장균 BL21(DE3) 균주를 LB 배지에서 37℃에서 0.5의 OD₆₀₀까지 배양하고, 이 때, 1 mM IPTG를 배양물에 첨가하고 18℃에서 24시간 동안 발현을 수행하였다. 원심분리에 의해 세포를 회수하고 완충액 A(50 mM Tris, pH. 8.0, 2 mM DTT, 2 mM EDTA)에 재현탁시키고 초음파처리(sonication)에 의해 용해시켰다. 세포 파편 및 불용성 단백질을 원심분리에 의해 제거하였다(17,00Og, 4℃, 1 시간). 투명해진 용해액에, 2 mL의 Ni-NTA 수지(Qiagen)를 첨가했다. 이미다졸의 증가되는 농도로 완충액 A의 단계 구배(step gradient)를 이용하여 LovD를 정제하였다. 순수한(>95%) LovD 단백질을 250 mM 이미다졸을 함유한 완충액 A에서 용출시키고, 완충액을 이미다졸을 포함하지 않는 완충액 A로 교환하고, 농축하고, 분주하고, 급속 동결시켰다. 동결된 LovD 분주물은 1회용으로만 사용하였다. 본 발명자들은 반복된 동결-해동 사이클 후에 효소 활성의 상당한 감소를 관찰했다.

실시예 2: 예시적인 발효 조건

발효 조건: 30 mg/L 카나마이신을 포함하는 LB 배지에 의한 500 mL 배양. 1.0의 OD₆₀₀에서, 세포들을 5.0의 OD₆₀₀까지 농축하고 1 mM IPTG로 유도시켰다. 기질인 모나콜린 J와 α-디메틸부티릴-SNAC를 1 mM과 4 mM의 최종 농도까지 첨가하였다. 상이한 시점에, 배양액 시료를 채취하고, 원심분리하고, 여과시키고 HPLC에 주입하였다(20 ㎕).

추출 조건: 최대의 전환율에 도달했을 때, 배양액을 2.0의 pH까지 산성화시키고, 에틸 아세테이트로 추출하고 건조시키고 톨루엔에 재용해시켰다. 이전에 검토된 바와 같은 속슬레(soxhlet) 장치를 이용하여 환류시켜 모나콜린 J의 락톤형을 수득하였다(예를 들면, J. L. Sorensen, K. et. al, Org. Biomol. Chem. 2003, 1, 50-59 참조).

LB, TB 및 Fl을 포함한, 본 명세서에서 개시된 발명의 구체예에서 이용되거나 또는 이를 위해 개조될 수 있는 LB, Fl 또는 TB 발효 배지와 같은 다양한 발효 배지가 본 발명이 속하는 기술 분야에서 잘 알려져 있다. 아스퍼길러스 테레우스 및 모나스쿠스 필로수스와 같은 개체를 배양하기 위해 맞춤화된 추가적인 배지도 당해 분야에서 잘 알려져 있다(예를 들면, 참조에 의해 그 내용이 본 명세서에 포함된, Miyake et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 70(5): 1154-1159 (2006) 및 Hajjaj et al., Applied and Environmental Microbiology, 67: 2596-2602 (2001) 참조).

전형적인 LB(Luria Bertani Broth) 조성은 하기와 같다:

- 1Og 트립톤

- 5g 효모 추출물

- 1Og NaCl

- 1L의 증류수

7.3-7.5의 pH.

전형적인 TB 조성은 하기와 같다:

- 3g Pipes (1O mM)

- 2.2 g CaCl₂ H₂0 (15 mM)

- 18.6 KCl (25O mM)

- 10.9 g MnC1₂ (55 mM)

- 1L 증류수

KOH에 의해 pH를 6.7-6.8로 조정함.

전형적인 Fl 배지는 참조에 의해 그 내용이 본 명세서에 포함된 미국특허 제5,064,856호에서 찾을 수 있다.

통상적으로, 그와 같은 배지는 제조 후에 여과 또는 고압멸균(autoclave)과 같은 절차에 의해 멸균한다.

실시예 3: BioH의 검출에 의한 대장균에서 심바스타틴 생물전환의 개선

본 실시예는 또한 로바스타틴 유전자 클러스터에서 코딩되는 LovD 폴리펩티드를 특징으로 한다(예를 들면, Xie et al., (2006) Chem Biol 13: 1161-1169 참조). LovD는 로바스타틴 생합성의 마지막 단계를 촉매하고 메가신타아제(megasynthase) LovF로부터 2-메틸부티레이트 곁사슬을 직접적인 생합성 전구체인 모나콜린 J(MJ) 산으로 전달하는 것을 담당한다(예를 들면, Kennedy et al., (1999) Science 284: 1368- 1372 참조). 본 발명자들은 LovD가 데칼린 코어, 티오에스테르 아실 유닛 및 티오에스테르 아실 운반체에 대해 광범위한 기질 특이성을 보인다는 것을 입증했다. LovD를 과발현하는 대장균 균주 및 세포막 투과성 티오에스테르인 디메틸부티릴-S-메틸 머캅토프로피오네이트(DMB-S-MMP)를 이용하여(도 13A), 본 발명자들은 단일 단계에서 MJ 산을 높은 수율로 심바스타틴 산으로 전환할 수 있는 전세포 생촉매 방법을 개발했다(예를 들면, Xie et al., (2007) Appl Environ Microbiol 73: 2054-2060 참조). 발효 방법은 현재의 합성 경로에 대해 경제적으로 경쟁력 있는(economically competitive) 대안일 수 있다.

티오에스테르 DMB-S-MMP는 심바스타틴 생물전환의 필수적 성분이다. DMB-S-MMP는 아실 전달 반응을 위해 조사된 촉매적으로 가장 효율적인 아실 공여체에 속하고, 합성 비용이 가장 비싸지 않다. 이 화합물과 관련된 하나의 유의성 있는 단점은 디메틸부티릴 머캅토프로피온산(DMB-S-MPA)을 생성하는 DMB-S-MMP에서 메틸 에스테르 결합의 가수분해이다(도 13). 대장균의 부재시 분해가 관찰되지 않았기 때문에, 상기 가수분해 반응은 효소에 의한 것이고, 높은 세포-밀도 발효 동안 크게 증진된다. 부 반응(side reaction)은 세 가지 이유 때문에 바람직하지 않다: 1) 기질의 가수분해는 LovD-촉매 트랜스아실화를 위해 이용가능한 DMB-S-MMP를 고갈시켜서, 티오에스테르가 높은 몰 과량으로 첨가되고 발효 동안 보충될 것을 요구한다; 2) 디메틸부티레이트 공여체로서 DMB-S-MMP에 비해 DMB-S-MPA가 덜 효율적이므로(~10배 느림)(예를 들면, Xie et al., (2007) Appl Environ Microbiol 73: 2054-2060 참조), 보다 가용성 높은 DMB-S-MPA의 축적이 LovD에 대한 경쟁적인 아실 기질로서 작용할 수 있다. 이는 효과적으로 반응 속도를 저하시키고 정제된 LovD를 이용하여 인 비트로에서 입증되었다. 따라서, 생물전환의 총 지속기간이 불필요하게 연장된다; 및 3) DMB-S-MPA의 카르복시산 모이어티는 생물전환의 완료시 배양 배지로부터 심바스타틴 산의 정제를 방해한다. 두 화합물은 모두 배지의 산성화 후에 배양 배지로부터 침전되고 심바스타틴의 결정화 전에 추가적인 분리 단계가 요구된다. DMB-S-MPA가 과량의 물로 여과물을 세척하는 것에 의해 제거될 수 있으나, 세척 단계 동안 상당량의 심바스타틴이 손실되어, 전체 회수율의 감소를 초래한다.

따라서, 바람직하지 않은 가수분해 부반응을 제거하는 것이 전세포 생촉매 방법 및 다운스트림 정제 단계의 경제성을 제고할 수 있다. 가장 직접적인 목표는 따라서, 바람직하지 않는 부반응을 담당하는 효소를 정확하게 파악하는 것이다. 여기에서, 본 발명자들은 DMB-S-MMP를 DMB-S-MPA로 가수분해하는 대장균 카르복실에스테라아제인 BioH의 식별을 교시한다. LovD 과발현 균주의 △bioH 유도종(derivative)을 작제하는 것에 의해, 본 발명자들은 경쟁 반응을 완전히 제거하고 심바스타틴 산의 전세포 생촉매 합성의 강건성(robustness)을 더 개선했다.

재료, 균주 및 플라스미드

모나콜린 J와 DMB-S-MMP를 전술된 바와 같이 제조하였다(예를 들면, Xie et al., (2007) Appl Environ Microbiol 73: 2054-2060 참조). 모든 시약은 표준 공급원으로부터 구입하였다. BL21(DE3) 균주[F-omp hsdSB (rB- mB-) gal dcm λ(DE3)]는 Novagen으로부터 수득하였다. Keio 콜렉션(collection)은 일본의 국립 유전학 연구소(the National Institute of Genetics, Japan)로부터 수득하였다(예를 들면, Baba et al., (2006) Mol Syst Biol 2: 2006 0008 참조). 단일 유전자 넉아웃(knockout) 돌연변이체는 BW25113 균주[rrnB3 DElacZ4787 hsdR514 DE(araBAD)567 DE(rhaBAD)568rph-l]로부터 유래하였다. 제한효소인식부위-마이너스 및 변형-플러스(restriction-minus and modification-plus)인 대장균 B 균주인 WA837 (rB-, mB+, gal met)을 CGSC(The CoU Genetic Stock Center)로부터 수득하였다(예를 들면, Wood, W.B. (1966). J Mol Biol 16: 118-133 참조). 플라스미드 pAW31(kanr) 및 pXK8(kanr)은 pET28a로부터 유래되고 각각 아스퍼길러스 테레우스로부터의 lovD 유전자 및 대장균으로부터의 bioH 유전자를 포함한다.

전세포 기반 가수분해 분석법(WHOLE-CELL BASED HYDROLYSIS ASSAY)

BW25113, BL21(DE3) 및 BL21(DE3)/pAW31와 함께 Keio 콜렉션으로부터 수득된 선별된 57개의 돌연변이체를 96-웰 딥 웰(deep well) 플레이트에서 1 mL LB 배지에서 37℃로 포화수준까지 배양하였다. 순수한(neat) DMB-S-MMP(5 ㎕)를 20 mM의 최종 농도로 각 배양액에 첨가하였다. 10시간 동안 진탕(20℃, 300 rpm) 후에, 각 배 양액을 동일한 부피의 에틸 아세테이트(EA)/1% 아세트산(AcOH)으로 추출하였다. 유기상(organic phase)을 건조시키고, 20 ㎕ 아세토니트릴(CH₃CN)에 재용해시키고, 1 ㎕를 TLC 플레이트(실리카 겔 60 F254)에 스팟팅하였다. 상기 TLC 플레이트를 헥산 중의 20% EA로 현상시키고 요오드로 시각화시켰다.

또한, 분석용 Cl8 컬럼(Alltech Apollo 5u, 150 mm X 4.6 mm); 1 mL/분의 유속에 의한 선형 구배(linear gradient): 5분간 물 중의 60% CH₃CN(0.1% 트리플루오로아세트산(TFA))으로부터 물 중의 95% CH₃CN(0.1% TFA)까지의 구배, 10분 동안 물 중의 95% CH₃CN(0.1% TFA)를 이용한 HPLC로 화합물의 분석을 수행하였다. HPLC 잔류 시간(tR)은 하기와 같았다: MJ 락톤형: 3.40분; DMB-S-MPA: 3.82분; DMB-S-MMP: 6.80분; 심바스타틴 락톤형: 8.45분. HPLC 분석 전에 MJ 및 심바스타틴을 락톤화시켰다.

BIOH의 정제 및 효소적 분석법

대장균 게놈으로부터 프라이머 5'-AACATATGAATAACATCTGGTGGCA-3'(서열번호 5) 및 5'-AAGAATTCTACACCCTCTGCTTCAACG-3'(서열번호 6)을 이용하여 PCR에 의해 플랭킹 제한효소 인식 부위 NdeI와 EcoRI과 함께 bioH 유전자를 증폭하였다. 유전자 카세트를 제한효소로 처리하고 pET28a에 라이게이션시켜 발현 작제물 pXK8을 생성했다. pXK8로 형질전환된 대장균 BL21(DE3) 균주를 LB 배지에서 37℃에서 0.5의 OD₆₀₀까지 배양하고, 이 때, 0.1 mM IPTG를 배양액에 첨가하고 20℃에서 16시간 동안 발현을 수행하였다. 세포를 완충액 A(50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 2 mM DTT, 2 mM EDTA)에 재현탁시키고 초음파처리에 의해 용해시켰다. BioH의 정제는 N-말단 6xHis 택(tag) 및 Ni-NTA 수지(Qiagen)에 의해 촉진하였다. 거의 순수한(>95%) BioH를 250 mM 이미다졸을 함유한 완충액 A로 용출시키고, 완충액을 완충액 A로 교환하고 농축하고, 분주하고, 급속동결시켰다.

50 mM HEPES, pH 7.9에서 실온에서 가수분해 분석을 수행하였다. 티오에스테르 기질인 DMB-S-MMP를 0.1 mM 내지 1.0 mM의 최종 농도까지 첨가하였다. DMB-S-MMP의 가용화를 촉진하기 위해, 모든 시료에 대해 10%의 최종 농도까지 DMSO를 첨가하였다. 반응은 BioH (0.01 μM)의 첨가로 개시하고 원하는 시점(10분, 20분, 30분)에 동일 부피의 EA/1% AcOH를 첨가하는 것에 의해 퀀칭(quench)시켰다. 유기상을 분리하고, 건조시키고, 20 ㎕의 ACN에 재용해시키고 HPLC로 분석하였다. DMB-S-MMP의 DMB-S-MPA로의 전환은 234 nm에서의 피크의 통합에 의해 정량하였다. 1 mM 기질 농도 및 10 nM BioH 농도에서 3개의 디메틸부티릴 티오에스테르에 대한 BioH 촉매 효율성의 비교를 수행하였다.

Pl 형질도입

표준 프로토콜에 따라(예를 들면, Miller, J.H. (1992) A short course in bacterial genetics: A laboratory manual and handbook for Escherichia coli and related bacteria. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Press 참조), BL21(DE3)의 △bioH 결실 돌연변이체를 작제하기 위해 P1 형질도입을 이용하였다. 대장균 K 변종(BW25113)과 B 변종(BL21) 간의 상이한 제한효소 인식 시스템 때문에, 형질도입을 위한 중간 숙주로서 B 변종인 WA837(rB-, mB+)을 이용하였다. 먼저, △bioH::FRT-kan-FRT 마커를 JW3375로부터 WA837로 형질도입하여 YTO(WA837 △bioH::FRT-kan-FRT)를 생성했다. BL21(DE3)을 수용체(recipient)로 이용하고 YTO를 공여체(donor)로 이용하여, 균주 YTl(BL21 △bioH::FRT-kan-FRT λ(DE3))을 작제하였다. YTl 균주를 온도 민감성 복제 및 열 유도성(thermally inducible) FLP 유전자를 포함하는 보조 플라스미드 pCP20으로 형질전환시켰다(예를 들면, Datsenko et al., (2000) Proc Natl Acad Sci U.S.A. 97: 6640-6645; 및 Wanner, 2000 참조). YT2((BL21 △bioH::FRT λ(DE3))를 생성하기 위한 kan 마커의 제거는 발표된 절차에 따랐다(예를 들면, Datsenko et al., (2000) Proc Natl Acad Sci USA 97: 6640-6645; 및 Wanner, 2000 참조).

YT2의 유전적 변화를 검증하기 위해 PCR을 이용하였다. 3개의 프라이머를 설계하였다. 프라이머 Bl: 5'-TGACGGCTTCGCTATCCCAT-3'(서열번호 7); B2: 5'-TACACCCTCTGCTTCAACG-3'(서열번호 8); 및 B3: 5'-GCTGGATTGTTTCGCCGATC-3' (서열번호 9)를 각각 상류 유전자 yhgA, 온전하게 유지된 bioH의 3' 말단 및 하류 유전자 gntX에 어닐링시켰다. YT2 게놈 DNA를 주형으로 이용한 PCR 반응의 예상되는 생성물은 B1/B2: 602 bp; B1/B3: 1002 bp이다. BL21(DE3) 게놈 DNA를 주형으로 이용한 PCR 반응의 예상되는 생성물은 B1/B2: 1271 bp; B1/B3: 1771 bp이다. 각 균주에 대 해 예상되는 PCR 생성물을 관찰했다.

전세포 생촉매화(WHOLE CELL BIOCATALYSIS)

MJ 산 및 DMB-S-MMP로부터의 심바스타틴의 전세포 촉매 합성을 개시된 바와 같이 수행하였다(예를 들면, Xie et al., (2007) Appl Environ Microbiol 73: 2054-2060 참조). 비교를 위해, 대장균 BL21(DE3)/pAW31 및 YT2/pAW31 균주를 나란히 배양하였다. 새로 형질전환된 균주의 단일 콜로니를 35 mg/L 카나마이신으로 보충된 5 mL LB 배양액에 접종하고 37℃에서 밤새 배양하기 위해 이용하였다. 다음날 아침, 100 ㎕의 밤샘 배양액을 LB 배양액, Fl 최소 배지 및 0.15 mg/L 비오틴으로 보충된 F1 배지를 포함하는 50 mL 배양액에 접종하였다. 주기적으로 OD₆₀₀을 측정하여 성장속도를 모니터링하였다. OD₆₀₀이 ~ 0.5에 도달했을 때, 100 μM IPTG를 배양액에 첨가하고 20℃에서 16시간 동안 LovD의 발현을 수행하였다. 고밀도 발효 조건을 모사(mimic)하기 위해, 기질의 첨가 전에 세포를 10배 농축하였다. 통상적으로, 배양액의 14 mL 분획을 15 mL 원심분리 튜브로 옮기고 세포들을 원심분리(4℃, 4000 g, 10분)에 의해 회수하였다. 세포 펠릿을 1316 ㎕의 상층액에 조심스럽게 재현탁시키고, 뒤이어 MJ 산 스톡 용액(H2O 중 250 mM) 84 ㎕를 첨가하였다(최종 농도 15 mM). 농축된 배양액을 7개의 200 ㎕ 시료로 분리하고 1.2 ㎕의 순수한 DMB-S-MMP를 각 시료에 첨가하였다(최종 농도 ~ 25 mM). 그 후, 배양액을 실온에서 300 rpm에서 진탕하였다. 각 시점에, 세포를 용해하기 위해 10 ㎕의 20% SDS를 첨가하 고 500 ㎕ EA/1% AcOH에 의한 액체-액체 추출에 의해 총 추출을 수행하였다. 유기상을 제거하고, 증발시키고, HPLC 분석을 위해 50 ㎕의 ACN에 재용해시켰다. BL21(DE3) 시료의 경우, 가수분해된 기질을 보충하기 위해 DMB-S-MMP의 추가적인 1.2 ㎕ 분획을 첨가하였다.

BioH의 THE DMB-S-MMP 에스테라아제로서의 확인

본 발명자들은 먼저 발효 동안 DMB-S-MMP의 DMB-S-MPA로의 관찰된 가수분해를 일으키는 대장균 효소를 확인하는 것을 목적으로 하였다. 디메틸부티릴-S-에틸 머캅토프로피오네이트(DMB-S-EMP) 및 디메틸부티릴-S-메틸 티오글리콜레이트(DMB-S-MTG)와 같은 상이한 아실 운반체가 티오에스테르 기질로서 이용된 경우, 본 발명자들은 발효 배양액에서 상응하는 가수분해된 카르복시산을 관찰하였다. 이는 해당 효소가 에스테르 작용기(ester functionality)에 대해 완화된 기질 특이성을 갖는 에스테라아제 또는 히드롤라아제라는 것을 시사한다.

본 발명자들은 대장균 K-12 인-프레임(in-frame) 단일 유전자 넉아웃 돌연변이체 라이브러리(Keio Collection)를 이용하여, 해당 효소를 확인하기 위해 고효율 방법을 이용하였다(예를 들면, Baba et al., (2006) Mol Syst Biol 2: 2006 0008 참조). 본 발명자들은 DMB-S-MMP를 가수분해할 수 없는 돌연변이체 균주는 직접적으로 특정한 유전자 결실 때문인 것으로 판단하였다. 대장균 게놈 주석(annotation)의 조사(예를 들면, Blattner et al., (1997) Science 277: 1453-1474 참조)는 23개의 에스테라아제/에스테라아제-유사 효소, 94개의 히드롤라아제/ 히드롤라아제-유사 효소, 및 16개의 아실트랜스퍼라아제(총 133개의 후보 유전자)를 보여준다. DMB-S-MMP 가수분해에 관여될 것 같지 않은 확인된 활성 및 기질을 갖는 효소들은 1차 분석법에서 조사하지 않았다. 조사된 57개의 BW25113 돌연변이체 균주의 목록이 표 2에 표시된다.

돌연변이체, 야생형 BW21113 및 BL21(DE3)을 96-웰 플레이트에서 LB 배양액에서 포화상태까지 배양하였다. 본 발명자들은 각 배양액(1 mL)에 5 ㎕의 순수한 DMB-S-MMP를 첨가하고, 플레이트를 실온에서 추가적으로 10시간 동안 강하게 진탕시켰다. 배양액을 산성화시키고, 에틸 아세테이트로 추출하고, 유기상을 DMB-S-MMP와 DMB-S-MPA를 분리할 수 있게 하는 이동상(헥산 중 20% 에틸 아세테이트)을 이용하여 박막 크로마토그래피(TLC)에 의해 분석하였다(도 14A). 야생형 BW25113(래인 58) 및 BL2l(DE3)(래인 59) 각각은 유사한 수준의 기질 가수분해와 DMB-S-MPA의 축적을 보였다. 조사된 모든 돌연변이체는 △bioH(래인 56, 균주 JW3357)를 제외하고는 DMB-S-MMP에 대한 가수분해 활성을 보였다. 이 놀라운 발견은 비오틴(비타민 H)의 생합성에 관여된, BioH(예를 들면, O'Regan et al., (1989) Nucleic Acids Res 17: 8004 참조)가 인 비보에서 관찰된 가수분해를 담당하는 유일한 효소일 수 있다는 것을 시사한다. HPLC를 이용한 추가적인 조사는 DMB-S-MPA가 △bioH 돌연변이체의 유기 추출물에서 검출될 수 없고, 거의 30%가 bioH+ 균주에서 가수분해되었다는 것을 더 확인하였다(도 14B).

BioH 특성의 인 비트로 검증

발효 동안 BioH가 DMB-S-MMP를 가수분해시키는 것에 직접적으로 관련된다는 것을 입증하기 위해, 본 발명자들은 bioH 유전자를 클로닝하고 이를 BL21(DE3)으로부터 N-his-태깅된 단백질로서 발현시켰다(예를 들면, Tomczyk et al., (2002) FEBS Lett 513: 299-304 참조). Ni-NTA 친화도 크로마토그래피를 이용하여 상기 단백질을 9 mg/L의 최종 수율로 균질하게 정제하였다. BioH의 DMB-S-MMP에 대한 촉매 특성을 분석하고 가수분해의 정도는 HPLC(234 nm)에 의해 측정하였다. BioH는 DMB-S-MMP에 대해 Michaelis-Menten 반응속도를 보였고 k_cat 및 K_m 값은 각각 260 ± 45 sec^-1 및 229 ± 26 μM로 결정되었다(도 15A).

HPLC 분석을 이용하여, 다른 디메틸부티릴 티오에스테르에 대한 BioH의 활성을 조사하고 도 15B에 표시하였다. 동일한 반응 조건(1 mM 기질, 10 nM BioH) 하에서, 본 발명자들은 BioH가 DMB-S-MMP에 대해 강력한 에스테라아제 활성을 보인다는 것을 확인했다. 카르복시산 백본 길이를 탄수 하나만큼 줄이는 것은 가수분해의 속도(DMB-S-MTG)의 2.5배 감소를 초래하고, 에스테르 모이어티의 크기를 에틸 에스테르로 증가시키는 것은 기질 감수분해의 속도(DMB-S-EMP)를 유의성 있게 약화시켰다. 이 관찰들은 인 비보 결과와 일치하고, 두 기질은 모두 DMB-S-MMP 보다는 더 낮은 정도이나, 세포의 존재 하에 가수분해되었다.

BioH는 대장균에서 비오틴의 생합성에서 필수적인 효소이다(예를 들면, Lemoine et al., (1996) Mol Microbiol 19: 645-647 참조). BioH가 피멜로일-CoA 합성을 담당하는 것으로 제안되었으나(예를 들면, Guillen-Navarro et al., (2005) FEMS Microbiol Lett 246: 159-165 참조), 그의 정확한 생화학적 기능은 확인되지 않았다. 흥미롭게도, 구조적 특징으로부터 단백질 기능을 예측하기 위한 노력에서, 대장균 BioH의 결정 구조를 1.7Å 해상도까지 결정하였다(예를 들면, Sanishvili et al., (2003) J Biol Chem 278: 26039-26045 참조). 고효율 구조적 분석(high throughput structural analysis)은 BioH에서 공지된 히드롤라아제에서도 발견되는 촉매 삼인조(catalytic triad)를 밝혀서, BioH가 가수분해 활성을 가질 수 있다는 것을 시사했다. p-니트로페놀 에스테르를 이용한 분석법은 BioH가 단쇄(short chain) 지방산 에스테르에 대한 선호도를 가진, 카르복시에스테라아제 활성을 갖는다는 것을 보여주었다(예를 들면, Sanishvili et al., (2003) J Biol Chem 278: 26039-26045 참조). 본 발명자들의 연구는 인 비트로 및 인 비보 모두에서 BioH의 생물학적 특성을 더 규명하고, 상기 효소가 에스테르 모이어티에 대해 매우 광범위한 기질 특이성을 갖는다는 것을 보여주었다. 대조적으로, BioH는 본 연구에서 분석된 기질에 존재하는 티오에스테르에 대한 티오에스테라아제 활성을 보이지 않았다. 가수분해된 티오에스테르 산의 추가적인 분해는 관찰되지 않았다.

BL21(DE3) △BIOH 돌연변이체 YT2의 작제

BioH가 발효 동안 DMB-S-MMP를 가수분해하는 것을 담당하는 효소라는 것을 확인하고 검증한 후, BioH 결핍 대장균 균주가 심바스타틴 산의 전세포 생합성을 위한 숙주로서 이용되어야 한다는 것이 명백했다. 본 발명자들은 T7 폴리머라아제를 필요로 하지 않는 LovD의 다양한 발현 벡터를 작제하고, 그들을 JW3357로 형질 전환시켰다. 이 균주들에서 심바스타틴 산 생물전환 속도의 평가는 LovD 활성이 BL21(DE3)/pAW31의 LovD 활성보다 훨씬 더 낮다는 것을 보여주었다. 보다 느린 반응 속도는 SDS-PAGE에 의해 결정된 바와 같이, 주로 이 숙주/벡터 조합에서 LovD의 저하된 발현 수준에서 기인했다. 결과로서, 본 발명자들은 BL21(DE3)의 △bioH 유도종이 기질 가수분해를 제거하면서, 최대의 전환 속도를 달성하기 위해 필요하다는 결론을 얻었다.

각각의 Keio Collection 단일-유전자 넉아웃 돌연변이체는 표적 유전자 대신 카나마이신 내성 유전자를 포함했다(예를 들면, Baba et al., (2006) Mol Syst Biol 2: 2006 0008 참조). 마커는 FLP 효소에 의한 상기 마커의 편리한 제거를 촉진하는 FLP 부위에 의해 플랭킹된다. 본 발명자들은 △bioH::FRT-kan-FRT 마커를 JW3357로부터 BL21(DE3)로 옮기기 위해 P1 형질도입을 이용하였다. 공여체 K 변종과 수용체 B 변종 간의 제한효소 인식부위의 차이 때문에, 본 발명자들은 P1 형질도입을 위한 중간체로서 대장균 WA837(제한효소 인식부위-마이너스, 변형-플러스)을 이용하였다(예를 들면, Dien et al., (2001) J Ind Microbiol Biotechnol 27: 259-264 참조). YT1을 생성하기 위해 상기 마커를 BL21(DE3)으로 이식한 후, 온도 민감성 레플리콘(temperature sensitive replicon) 및 열 유도성 FLP 유전자(예를 들면, Datsenko et al., (2000) Proc Natl Acad Sci USA 97: 6640-6645; 및 Wanner, 2000 참조)를 포함하는 보조 플라스미드 pCP20을 이용하여 kan 유전자를 제거하여 YT2(BL21(DE3) △bioH::FRT)를 생성했다. 상류 및 하류 영역에 어닐링하는 프라이머를 이용한 PCR 분석은 bioH의 결실 및 kan 마커의 제거를 확인했다(데 이터가 도시되지 않음).

YT2를 LB 배지에서 배양하고 DMB-S-MMP 가수분해 분석을 수행하였다. 예상된 바와 같이, 새로운 균주는 티오에스테르의 검출가능한 가수분해를 촉매하지 않았고 배양액에서 DMB-S-MPA의 미량도 발견할 수 없었다. 24시간 이상 동안 배양된 포화된 배양으로부터 DMB-S-MMP을 거의 정량적으로 회수할 수 있어서 이 균주를 이용한 연장된 발효 동안 기질이 온전하게 유지되었다는 것을 재확인했다.

YT2를 이용한 전세포 생촉매반응

본 발명자들은 먼저 심바스타틴 산의 전세포 생촉매 합성을 위한 숙주로서 YT2의 생존력을 조사하였다. 전기천공을 통해 발현 플라스미드 pAW31를 YT2로 형질전환하여 YT2/pAW31을 생성하였다. BL21(DE3)/pAW31 및 YT2/pAW31 각각을 0.5의 OD₆₀₀까지 배양하고, 뒤이어 20℃에서 16시간 이하 동안 100 μM IPTG로 단백질 합성을 유도하였다. 상기 두 균주는 LB 배지를 이용한 경우, 동일한 성장 속도(growth kinetics)를 보여서, 단백질 발현기의 종료 시, 동일한 OD₆₀₀(3.9~4.0)에 도달했다. F1 최소 배지가 이용되는 경우, 상기 두 균주는 유도 전에 유사하게 성장했다(도 16A). 대조적으로, YT2/pAW31은 유도 후 비오틴 보충을 갖지 않는 배지에서 BL21(DE3)/pAW31보다 훨씬 더 느리게 성장했다. 돌연변이 균주에서 유도 후 세포 밀도는 모균주의 ~60% 였다. 본 발명자들은 둔화된 성장 속도를 YT2/pAW31이 최소 배지에서 비오틴을 합성하고 강건한 세포 성장을 지지할 수 없는 특성을 갖는 것에서 기인하는 것으로 판단했다. YT2/pAW31 균주를 0.15 mg/L 비오틴으로 보충된 F1 배지에서 생장시키는 경우, 상기 돌연변이 균주의 성장 속도는 BL21(DE3)/pAW31의 성장속도와 구별되지 않았다.

그 후, 본 발명자들은 전세포 분석법에서 YT2/pAW31의 효율성을 BL21(DE3)/pAW31과 비교하였다. 두 균주를 모두 LB 배지에서 배양하고 12시간의 LovD 발현 후, 높은 세포 밀도 환경을 모사하기 위해 10배 농축하였다. 생물전환을 개시하기 위해, MJ 산 및 DMB-S-MMP를 각각 15 mM과 25 mM의 최종 농도까지 첨가하였다. 도 16B는 bioH 결실의 결과, 분석에서 YT2/pAW31이 훨씬 더 효율적이라는 것을 보여준다. 돌연변이 균주에 대해 12시간 미만의 인큐베이션에서 완전한 전환(>99%)을 관찰했고, 미량의 DMB-S-MMP 가수분해도 검출되지 않았다. 대조적으로, BL21(DE3)/pAW31은 24시간 내에 동일한 전환을 달성했고, 기질 가수분해의 결과로, 발효 동안 추가로 25 mM의 DMB-S-MMP의 첨가를 요구했다. 반응의 선형 범위 동안, YT2/pAW31은 BL21(DE3)/pAW31에 대해 측정된 0.75 mM/시보다 훨씬 높은 1.5 mM/시의 속도로 심바스타틴 산을 합성했다(예를 들면, Xie et al., (2007) Appl Environ Microbiol 73: 2054-2060 참조). YT2/pAW31을 이용하여, 본 발명자들은 반응을 완료까지 진행시키기 위해 요구되는 DMB-S-MMP의 최소 농도를 감소시킬 수 있었다. 최초의 MJ 산(15 mM)에 대한 최초의 MMP(18 mM)의 몰비가 1.2로 낮은 경우, 심바스타틴 산의으로의 완전한 전환이 동일한 속도로 달성될 수 있었다.

속도의 증가는 주로 BioH의 부재 하에 증가된 DMB-S-MMP의 세포내 농도 때문이다. 인 비트로 연구로부터, 본 발명자들은 BioH가 DMB-S-MMP를 가수분해시키는 데 있어서 매우 빠르다는 것을 입증했다. 따라서, BioH의 낮은 세포내 농도에서도, 기질 가수분해 반응은 세포질에 존재하는 기질의 풀에 대해 경쟁할 수 있다. 특히, LovD가 아실 티오에스테르 공여체의 부재 하에 심바스타틴 산이 MJ 산으로 가수분해될 수 있는 가역적 반응을 촉매할 수 있다는 것을 고려할 때, DMB-S-MMP의 증가된 세포내 농도를 유지하는 것이 결정적이다(예를 들면, Xie et al., (2006) Chem Biol 13: 1161- 1169 참조).

YT2/pAW31의 확장 발효(scaled-up fermentation)(200 mL, 15 mM MJ, 18 mM DMB-S-MMP)를 수행하는 것에 의해 입증된 바와 같이, 생물전환 후 심바스타틴 산의 정제도 개선되었다. HPLC에 의해 MJ산의 심바스타틴 산으로의 완전한 전환을 확인한 후(도 17, 트레이스 a), 통합된 발효액과 세포 추출물을 헥산으로 세척하고, 6M HCl로 산성화시키고, 여과하여 침전된 심바스타틴 산을 회수하였다(트레이스 b). 여과 케이크(filter cake)를 동일 부피(1 volume)의 dH2O로 세척 후에, 심바스타틴 산을 ACN에서 가용화시키고, 여과하고 HPLC에 의해 분석하였다(트레이스 c). BL21(DE3)/pAW31에 존재하는 DMB-S-MPA를 제거하기 위해 추가적인 세척 단계는 요구되지 않았다. 이 방법을 이용한 심바스타틴 산의 최종 회수율은 94%였다.

결론

앞서 설명된 바와 같이, 본 발명자들은 Keio 단일-유전자 넉아웃 라이브러리를 이용하여 심바스타틴산의 MJ산으로부터의 전세포 생물촉매 전환 동안, BioH가 DMB-S-MMP를 가수분해하는 카르복실라아제라는 것을 확인했다. BioH는 매우 빠른 가수분해 속도를 보이고, 이는 LovD-촉매 트랜스에스테르화에서 아실 공여체로 이용가능한 DMB-S-MMP의 세포내 농도를 고갈시킨다. bioH 발현 균주 YT2를 이용하여, 본 발명자들은 DMB-S-MMP의 분해를 완전히 제거하고, 전세포 생물촉매의 강건성을 유의성있게 증가시킬 수 있었다. 이 균주는 사용된 하나 이상의 기질이 불안정한(labile) 에스테르 결합을 포함하는 다른 전구체-방향성 생합성 및 생물촉매 응용에서 유용한 숙주일 수 있다(예를 들면, Murli et al., (2005) Appl Environ Microbiol 71: 4503-4509 참조).

실시예 4: 전세포 생촉매반응을 이용한 심바스타틴의 효율적 합성

본 실시예는 모나콜린 J로부터 심바스타틴의 합성을 위한 단일-단계, 전세포 생물촉매 방법을 설명한다. 하기에서 상세하게 검토되는 바와 같이, 아스퍼길러스 테레우스 LovD를 과다발현하는 대장균 균주를 이용하여, 본 발명자들은 화학적 보호 단계의 사용 없이, 모나콜린 J의 심바스타틴으로의 99%보다 높은 전환율을 달성할 수 있었다. 핵심적인 발견은 LovD에 의해 아실 공여체로서 효율적으로 이용된, 막 투과성 기질인 α-디메틸부티릴-S-메틸-머캅토프로피오네이트(DMB-S-MMP)이다. 상기 방법은 심바스타틴의 그램-단위 합성을 위해 확장되었다. 본 발명자들은 이 방법을 통해 합성된 심바스타틴이 HPLC에 의해 결정된 바와 같이, 90%보다 높은 회수율 및 98%보다 높은 순도로 발효액으로부터 용이하게 정제될 수 있다는 것을 입증했다. 높은 세포 밀도, 유가식 발효(fed-batch fermentation)를 이용한 생물전환도 조사하였다. 따라서, 전세포 생물촉매반응은 현재의 다단계 반합성 전 환(multistep semisynthetic transformation)의 매력적인 대안일 수 있다.

현재, 두 개의 반합성 방법(예를 들면, Askin et al., 1991, J. Org. Chem. 56; 및 Hoffman et al., 1986 J Med Chem 29:849-52 참조)이 로바스타틴으로부터 심바스타틴을 합성하기 위해 널리 이용된다(도 18). 하나의 통상적으로 개조된 방법(예를 들면, Hoffman et al., 1986 J Med Chem 29:849-52 참조)은 핵심적인 중간체인 모나콜린 J를 생성하기 위한 로바스타틴의 가수분해로 개시되고, 뒤이어 C11 히드록시기를 보호하기 위한 상기 산의 락톤화 및 C13 히드록시기의 트리메틸실릴화 보호로 이어진다. 그 후, 보호된 모나콜린 J는 α-디메틸부티릴 클로리드에 의한 아실화를 거쳐서 심바스타틴의 보호된 형태를 생성하고, 뒤이어 탈보호되어 심바스타틴을 생성한다. 도 18에 표시된 두 개의 다단계 방법은 어렵고, 따라서, 이는 로바스타틴보다 거의 5배 이상 비싼 심바스타틴에 기여한다. 따라서, 화학적 전환의 수를 감소시키고 전환의 전체 효율성을 증가시킬 수 있는 새로운 반합성 방법은 상당히 유용할 수 있다.

본 발명자들은 이전에 로바스타틴 디케티드 신타아제(LDKS)로부터 α-메틸부티릴기를 모나콜린 J의 C8 히드록시로 위치특이적으로 전달하여 로바스타틴을 생성하는 로바스타틴 생합성 유전자 클러스터로부터 전용(dedicated) 아실트랜스퍼라아제의 클로닝 및 특성규명을 기재하였다(예를 들면, Xie et al., 2006,Chem Biol 13: 1161-1169 참조). 본 발명자들은 LovD가 아실 운반체, 아실기 및 데칼린 코어에 대해 광범위한 기질 특이성을 갖는다는 것을 입증했다. 가장 두드러지게, LovD는 심바스타틴을 제공하기 위해 α-디메틸부티릴-S-N-아세틸시스테아민(DMB-S-NAC) 에 의한 모나콜린 J의 직접적인 아실화를 촉매할 수 있었다. 상기 반응은 C8 알코올에 대해서만 고도로 위치특이적이고, 따라서, 보호 화학(protective chemistry)의 이용 없이, 모나콜린 J로부터 심바스타틴을 생성하는 잠재적인 단일-단계 방법이다.

본 실시예에서, 본 발명자들은 고도로 효율적인 방식으로 모나콜린 J를 심바스타틴으로 전환할 수 있는 전세포 생촉매 방법의 개발을 설명했다. 신규한 티오에스테르를 아실 공여체로 이용하여, 본 발명자들은 단일 단계로 모나콜린 J로부터 심바스타틴으로의 99% 보다 높은 전환율을 달성할 수 있었다. 발효 공정은 심바스타틴의 산업적-규모 수율을 생성하기 위해 용이하게 확대될 수 있다.

α-디메틸부티릴-S-메틸 3-머캅토프로피오네이트(PMB-S-MMP)의 합성:

0℃에서 디에틸 에테르 중의 메틸-3-머캅토프로피오네이트(1.30 mL, 12 mmol)와 트리에틸아민(3.340 mL, 24 mmol)의 50 mL 용액에 디메틸부티릴 클로리드(1.76 mL, 12 mmol)를 서서히 첨가하고, 상기 용액을 2시간 동안 교반하였다. 반응을 NH₄Cl 수용액으로 퀀칭시키고 100 mL 아세테이트로 2회 추출하였다. 유기층을 조합하고, 건조시키고, 증발시켜 무색 액체(2.6g)를 생성하였다. 잔류물을 실리카-겔 크로마토그래피(EA/hexane, 20/80)로 정제하여 순수한 DMB-S-MMP(2.35 g, 90% 수율)를 생성하였다. 1H NMR: δ 3.87 (s, 3H), 3.09 (t, 2H, 7.1 Hz), 2.58 (t, 2H, 7.0 Hz), 1.59 (q, 2H, 7.5 Hz), 1.18 (s, 6H), 0.83 (t, 3H, 7.4 Hz); 13C NMR:6 206.16, 172.26, 51.81, 50.04, 34.38, 33.73, 24.71, 23.60, 8.92.

LOVD의 반응속도 분석법(KINETIC ASSAY OF LOVD ASSAY):

LovD의 발현 및 정제가 이전에 상세하게 기재되었다(예를 들면, Xie et al., 2006, Chem Biol 13: 1161-1169 참조). 실온에서, 50 mM HEPES, pH 7.9에서 분석을 수행하였다. 10 μM LovD, 1 mM 모나콜린 J 및 4 mM 티오에스테르로 아실 기질의 초기 속도(ki)를 결정하였다. 상이한 시점에 반응 혼합물을 트리플루오로아세트산(TFA)에 의해 퀀칭시키고, 에틸 아세테이트로 추출하고, 건조상태까지 증발시키고, 아세토니트릴에 재용해시켰다. 모나콜린 J의 심바스타틴으로의 백분율 전환율을 HPLC 분석(C18)에 의해 결정하였다. 전환 속도의 선형 범위가 표 1B에 ki로 보고된다. DMB-S-MMP의 Km을 결정하기 위해, 모나콜린 J의 농도는 2 mM로 고정시키고, DMB-S-MMP의 농도는 0.2 mM에서 10 mM까지 변화시켰다. DMB-S-MMP의 가용화를 촉진하기 위해, DMSO를 5%의 최종 농도까지 첨가하였다. 모나콜린 J의 Km을 수득하기 위해, DMB-S-MMP 농도를 2 mM로 고정시키고, 모나콜린 J의 농도는 0.2 mM에서 5 mM까지 변화시켰다.

전세포 용해물 활성 분석법

상이한 발효 조건 하에서 LovD 활성의 수준을 결정하기 위해 전세포 용해물 분석법을 이용하였다. 예를 들면, pAW31로 형질전환시킨 대장균 BL21(DE3) 균주를 37℃에서 LB 배지에서 0.5의 OD₆₀₀까지 생장시키고, 이 때, 100 μM IPTG를 배양액에 첨가하고 16시간 동안 실온(RT)에서 발현을 수행하였다. 상기 배양액의 70 ml 분획을 원심분리(400Og, 20분)에 의해 회수하였다. 상층액을 제거하고, 세포 펠릿을 7 ml 용해 완충액(20 mM Tris-HCl, pH 7.9, 500 mM NaCl)에 재현탁시켰다. 세포들을 얼음 상에서 초음파처리에 의해 용해시키고 세포 파편을 원심분리(13,000 rpm, 10 minutes, 4℃)에 의해 제거하였다. 그 후, 용해액을 직접 인 비트로 분석에 첨가하였다. 최종 분석 조건: 50 mM HEPES, pH 7.9, 1 mM 모나콜린 J, 4 mM DMB-S-MMP, 5 ㎕ 세포 용해액, 25 ㎕ 최종 용량. 그 후, 0.6 min^-1을 전환 속도로 이용하여 초기 속도로부터 발효액에서 LovD의 유효 농도를 계산하였다.

저밀도 발효(LOW-DENSITY FERMENTATION)

대장균 BL21(DE3)/pAW31 균주를 37℃에서 LB 배지에서 0.5의 OD₆₀₀까지 생장시키고, 이 때, 100 μM IPTG를 배양액에 첨가하고 실온에서 16시간 동안 발현을 수행하였다. 10 ml 배양액을 15 mL 원심분리 튜브로 옮겼다. 세포를 원심분리(4000g, 10분)에 의해 회수하였다. 세포 펠릿을 957 ㎕의 상층액에 재현탁시켰다. pH를 1.0N NaOH로 pH 7.9로 조정하고, 뒤이어 33 ㎕의 450 mM MJ(최종 농도 15 mM) 및 6 ㎕의 순수한 DMB-S-MMP(최종 농도 ~ 25 mM)를 첨가하였다. 그 후, 배양액을 실온에서 300 rpm에서 진탕하였다. 각 시점에, 4 ㎕의 분획을 반응 혼합물로부터 제거하고, 1% TFA를 함유한 300 ㎕의 에틸 아세테이트에서 퀀칭시켰다. 유기상 을 제거하고, 증발시키고, HPLC 분석을 위해 아세토니트릴에 재용해시켰다.

보다 큰 규모의 심바스타틴 합성을 위해, 대장균 BL21(DE3)/pAW31 균주의 2개의 lL 진탕 플라스크 배양액으로부터 출발하여, 전술된 절차를 확장했다. 실온에서 16시간의 발현 후에, 배양액의 부피를 22의 최종 OD₆₀₀까지 200 mL로 농축하였다. 모나콜린 J(소디움 염 형태) 및 DMB-S-MMP를 각각 15 mM 및 25 mM의 최종 농도까지 첨가하였다. 세포들을 실온에서 진탕시키고, HPLC를 이용하여 반응의 진행을 모니터링하였다. 반응 완료(HPLC에 의해 판단된 99%를 초과하는 전환율) 후에 발효액으로부터 심바스타틴을 정제하기 위해, 하기의 절차를 이용하였다. 원심분리에 의해 세포들을 제거하였다. 세포 펠릿을 아세톤에서 교반하여 세포내 심바스타틴을 추출하였다. 그 후, 감압 하에 아세톤을 제거하고 잔류물을 dH2O에 용해시키고 여과시켰다. 여과액 및 투명해진 발효액을 합치고, 동일 부피의 n-헥산으로 2회 세척하고, 6N HCl로 pH 2.0까지 산성화시켰다. 백색 침전물을 여과에 의해 회수하고 공침전된(coprecipitatd) DMB-S-MPA를 제거하기 위해 얼음같이 차가운(ice-cold) dH2O로 과도하게 세척하였다. 여과 케이크를 진공 하에 건조시킨 후, 고형물을 200 mL의 아세토니트릴에서 1시간 동안 교반하고, 여과에 의해 불용물(insoluble)을 제거하였다. 감압 하에 니트레이트를 건조상태까지 증발시켜 심바스타틴의 산 형태를 생성했다.

고밀도 F1 유가식 발효(HIGH DENSITY Fl FED-BATCH FERMENTATION)

Fl 유가식 발효 및 배지 조성은 Pfeifer 등으로부터 채택하였다(예를 들면, Pfeifer et al., 2002, Appl Environ Microbiol 68:3287-92 참조). 본 발명자들은 발효 배지 및 공급 배지(feed medium)로부터 비타민 용액을 배제시켰다. 종배양(starter culture)을 37℃ 및 250 rpm에서 5 ml의 LB 배지(35 mg/L 카나마이신 포함)에서 밤새 배양하고, 1 mL를 이용하여 F1 배지(35 mg/L 카나마이신 포함)를 담은 100 ml 진탕 플라스크에 접종하기 위해 이용하였다. 10 mL의 종 F1 배양액을 이용하여 1L의 F1 배지를 담은 2-리터 Applikon Biobundle 용기에 접종하였다. 발효를 37℃에서 수행하고, 실험 동안 1M H₂SO₄ 및 1/2-농축된 NH₄OH로 pH를 7.1에서 유지시켰다. 통기(aeration)는 0.2 내지 0.4 L/분으로 제어하고 교반은 900 rpm에서 유지시켰다. OD₆₀₀ 값이 5 내지 10에 도달했을 때, 발효의 온도를 실온까지 저하시키고, 단백질 발효를 유도하기 위해 200μM IPTG를 첨가하였다. 동시에, 정량 펌프(peristaltic pump)로 0.08 mL/분의 공급 용액(feed solution)을 발효기에 전달했다.

발효의 상이한 단계에 유효 LovD 활성 및 농도를 전술된 바와 같이 측정하였다. 생물전환 연구를 위해 휴지기 세포를 제조하기 위해, 세포들을 5000 g로 10분 동안 원심분리시키고, 동일 용량의 PBS 완충액, pH 7.4에 조심스럽게 재현탁시켰다. 그 후, 모나콜린 J 및 DMB-S-MMP를 세포 분획에 첨가하여 심바스타틴의 합성을 개시하였다.

결과

반응속도적으로 탁월한(kinetically superior) 아실 공여체의 식별

본 발명자들은 LovD가 트랜스에스테르화 반응에서 아실 공여체로 세포 투과성 티오에스테르를 이용할 수 있다는 것을 입증했다(예를 들면, Xie et al., 2006,Chem Biol 13: 1161-1169 참조). DMB-S-NAC 및 DMB-S-MTG(표 1B)는 LovD의 기질인 것으로 입증되었다. 그러나, 상기 두 개의 기질은 모두 분당 ~ 0.02의 겉보기 ki 값으로, 심바스타틴의 합성에서 저조한 전환을 지지했다. 또한, 상기 기질 중 하나가 이용되는 경우, 반응은 모나콜린 J의 증가되는 농도에서 심각한 기질 억제를 겪었다. 따라서, LovD를 심바스타틴의 화학생합성을 위해 산업적으로 유용한 촉매로 개발하는 데 있어서 제1의 우선순위는 이 두 개의 제한을 극복할 수 있는 보다 우수한 기질을 식별하는 것이다.

본 발명자들은 DMB-S-MTG의 여러 개의 추가적이 변이체를 합성하고 인 비트로에서 촉매 특성에 대해 분석하였다. DMB-S-메틸 머캅토프로피오네이트(DMB-S-MMP), DMB-S-에틸 머캅토프로피오네이트(DMB-S-EMP) 및 DMB-S-메틸 머캅토부티레이트(DMB-S-MMB)를 각각 α-디메틸부티릴 클로리드와 상응하는 유리 티올을 반응시키는 것에 의해 합성하였다. 초기 전환 속도를 표 1B에서 비교하였다. 놀랍게도, 티오에스테르 운반체의 길이를 하나의 탄소에 의해 증가시키는 것은(S-MTG의 C2에서 S-MMP 및 S-EMP의 C3으로) 반응의 전환 속도를 유의성있게 증가시켰다. S-MMB (C4)에 추가적인 탄소를 삽입하는 것은 트랜스에스테르화 속도의 추가적인 증가를 가져왔다. 표준 반응 조건(1 mM MJ, 4 mM 아실 기질, 10 μM LovD, 50 mM HEPES, pH 7.9) 하에서, 에스테르화의 초기 전환 속도는 DMB-S-MMP, DMB-S-EMP 및 DMB-S-MMB에 대해, 각각 0.6, 0.7, 0.78 min^-1이었다. 속도의 30배 이상의 증가는 티오에스테르 결합에 대한 카르보닐기의 상대적 위치가 LovD로의 결합에 중요하다는 것을 반영한다. 대조적으로, DMB-S-MPA가 아실 공여체로 이용되는 경우, 초기 전환 속도는 분당 0.08로 유의성 있게 감소되었고, 이는 유리산(유리 산의 소디움 염일 것임)이 LovD 활성 부위에 부진하게 결합한다는 것을 나타낸다.

본 발명자들은 전구체 티올(메틸 머캅토프로피오네이트)이 다른 출발 물질보다 훨씬 더 싸기 때문에, DMB-S-MMP를 생촉매 반응을 위한 가장 적합한 아실 티오에스테르로 선택하였다. DMB-S-MMP가 아실 공여체로 이용되는 경우, 아실화 반응의 반응속도 파라미터를 결정하였고 도 19에 표시한다. 트랜스아실화 반응에서 각 기질의 Km 값을 수득하기 위해, 본 발명자들은 하나의 기질의 농도를 고정시키고, 나머지 기질의 농도를 변화시켜 Michaelis-Menten 반응속도 곡선을 수득하였다. 도 19A는 모나콜린 J 농도의 함수로서 반응 전환 속도(V/Eo)를 보여준다. 이전에 분석된 기질과 대조적으로, 모나콜린 J에 의한 기질 억제가 관찰되지 않았고 Km은 0.78 ± 0.12 mM로 결정되었다. 다양한 양의 DMB-S-MMP에서 LovD의 전환 속도는 모나콜린 J의 농도를 2 mM로 고정하는 것에 의해 유사하게 결정하였다(도 19B). DMB-S-MMP의 Km은 0.67 ± 0.04 mM로 확인되었다. 두 적정에서, 반응의 kcat는 0.66 ± 0.03 min^-1로 결정되었다. 본 발명자들의 반응속도 분석은 명확하게 DMB-S-MMP가 이전에 보고된 티오에스테르에 비해 반응속도적으로 탁월한 기질이라는 것을 확인했 다. Ping Pong Bi Bi 반응에서 기질 억제의 수준은 두 기질의 상대적 Km에 의존적이다. DMB-S-MMP가 아실 기질로 이용되는 경우, 그의 상대적으로 더 낮은 Km은 DMB-S-MMP가 용이하게 LovD에 결합할 수 있게 하고, 따라서, 모나콜린 J 농도를 증가시키는 것에 의해 억제되지 않았다. 따라서, 이 중요한 특성은 모나콜린 J 농도를 낮게 유지하고 기질 억제를 최소화하기 위해 모나콜린 J가 지속적으로 공급되어야 하는 것인 유가식 공정과 대조적으로 회분식 생촉매 공정(batch biocatalytic process)의 개발을 가능하게 한다.

발명자들은 이전에 아실-S-MTG가 대장균 발효액 반응에 첨가되는 경우, 빠르게 가수분해된다는 것을 관찰했다(예를 들면, Xie et al., 2006,Chem Biol 13: 1161-1169 참조). 인 비보 조건 하에서 새로 확인된 아실 공여체의 안정성을 테스트하기 위해, 순수한 DMB-S-MMP를 대장균 BL21(DE3)로 접종된 LB 배지에 첨가하고 상기 배양물을 37℃에서 밤새(16시간) 배양시켰다. 본 발명자들은 기질의 우세하게 더 극성인 화합물로의 ~20% 분해를 관찰했다. HPLC를 이용하여 공지된 화합물과 비교하여, 본 발명자들은 주요한 분해 생성물이 내생 대장균 리파아제(lipase)의 작용을 통해 나타날 수 있는 DMB-S-MPA인 것으로 확인하였다. 본 발명자들은 DMB-S-MMP가 회분(batch) 반응에서 과량으로 공급되는 경우, 낮은 수준의 분해가 모나콜린 J 의 심바스타틴으로의 생물전환을 제한하지 않을 것으로 결론지었다.

전세포 생촉매반응

훨씬 더 효율적인 DMB-S-MMP 티오에스테르를 갖추고, 본 발명자들은 대장균 을 전세포 생촉매로 이용하여 모나콜린 J의 심바스타틴으로의 전환을 연구하였다. pET28a 유래 발현 플라스미드 pAW31로 형질전환된 BL21(DE3) 균주를 미생물 숙주로 이용하였다. 실온에서 16시간 동안 LovD의 발현을 수행하고, 발현 수준을 SDS-PAGE로 가시화시켰다. 상이한 성장 조건 및 배지에서 발현된 LovD의 실제량을 정량하기 위해, 본 발명자들은 전세포 용해액이 1 mM 모나콜린 J, 50 mM HEPES, pH 7.9 중의 4 mM DMB-S-MMP를 포함하는 반응 분석액에 직접 첨가된 것인 활성 분석을 이용하였다. 모나콜린 J의 심바스타틴으로의 전환을 HPLC에 의해 정량하고 0.6 min^-1의 ki 값을 이용하여 LovD의 겉보기 농도를 추정하였다(표 1B). 낮은 세포 밀도 조건 하에서, LovD는 F1 최소 배지에서보다 LB 배지에서 약 3배 더 높게 발현되었다(표 3).

그 후, 본 발명자들은 LB 배지에서 심바스타틴의 화학생물합성을 테스트하였다. LovD의 밤샘 발현 후에, 10 mL 분획의 세포를 LB 중 1 mL로 10배 농축하였다. 발효 조건을 모사하는 높은 세포 밀도 환경을 달성하고 LovD의 보다 높은 유효 농도(약 20μM의 최종 농도)를 수득하기 위해 농축 단계를 수행하였다. 모나콜린 J의 소디움 염 형태를 (물 중의 450 mM의 스톡용액으로부터) 15 mM의 최종 농도까지 첨가하고 순수한 DMB-S-MMP를 25 mM의 최종 농축물에 첨가하였다. 그 후, 반응 혼합물을 실온에서 강하게 진탕시켰다. 모나콜린 J의 심바스타틴으로의 전환을 확인하기 위해 정기적으로 특정 시점에 시료를 채취하였다(도 20A).

도 20B에 도시된 바와 같이, BL21(DE3)/pAW31의 단순한, 저밀도 배양액은 심 바스타틴의 합성을 위한 강건한 전세포 생촉매였다. 두 개의 기질의 첨가 개시 후 2시간의 초기 유도기 후, 뒤이어 시간 당 ~ 0.73 mM의 선형 반응 속도로 신속한 전환을 관찰했다. 모나콜린 J 고갈의 결과로서, 반응 속도는 보다 높은 전환율(>95%)에서 둔화되었다. 24시간 이내에, 모나콜린 J의 99%가 심바스타틴으로 전환되었다. HPLC 분석에 근거하여, 세포 대사에 의한 모나콜린 J 또는 심바스타틴의 분해는 관찰되지 않았다. 본 발명자들은 24시간 후, 배양액의 OD₆₀₀ 값의 ~20% 감소를 관찰했고, 이는 전세포 방법이 연장된 촉매 작용을 위해 유지될 수 있다는 것을 시사한다.

본 발명자들은 LovD는 0.21 min^-1 반응의 kcat로 인 비트로에서 로바스타틴을 모나콜린 J로 가수분해시킬 수 있다는 것을 보고했다(예를 들면, Xie et al., 2006, Chem Biol 13: 1161-1169 참조). 본 발명자들은 단일 발효 수행에서 가수분해 단계를 아실화 단계와 결합할 수 있는지 여부를 조사하기 위해, BL21(DE3)/pAW31에 의한 로바스타틴 가수분해의 속도를 분석하였다. 전술된 바와 같이 동일한 인 비보 조건 하에서, 본 발명자들은 모나콜린 J 형성의 느린 속도를 관찰하였다. 0.5 mM 로바스타틴(소디움 염 형태)으로 개시하여, 본 발명자들은 48시간 내에 시간당 ~0.01 mM의 전환 속도로 91% 가수분해를 달성하였고, 이는 아실화 반응의 속도보다 약 75배 더 느렸다. 이는 가수분해 속도가 아실화 반응보다 3배 더 느린 것인 인 비트로 반응속도 결과와 크게 대조적이다. 인 비보 로바스타틴 가수분해 속도의 상당한 약화는 보다 높은 소수성의 로바스타틴에 대한 세포막의 투과 장벽때문일 것이다. 본 발명자들은 LovD가 원형질막 주위공간(periplasm space)으로의 국재화(localization)를 위한 N-말단 pelB 신호 서열과 함께 클로닝된 것인, 대안적인 균주 BL21(DE3)/pXXK2를 이용하여 막 투과 장벽을 피하고자 하였다. 이 균주에 대해 가수분해 활성의 개선이 관찰되지 않았고, 이는 외부 원형질막의 불투과성(impermeability)이 주요한 수송 장벽이라는 것을 나타낸다.

심바스타틴의 회수 및 정제

전세포 생촉매 공정으로부터 심바스타틴의 회수 수율을 평가하기 위해, 본 발명자들은 생물전환의 규모를 200 mL의 최종 용량까지 증가시켰다. 이는 LovD의 밤새 발현 후 LB 배지 중 발현 균주 1L 2개를 농축하는 것에 의해 달성하였다. 모나콜린 J의 소디움 염 형태 및 DMB-S-MMP를 각각 15 mM 및 25 mM의 최종 농도까지 첨가하고, 반응의 진행을 HPLC에 의해 모니터링하였다. 본 발명자들은 보다 큰 규모의 공정에서 동일한 전환 반응속도를 관찰하고, 기질의 첨가 24시간 후 99%보다 높은 전환율을 수득하였다. 화학생합성 경로로부터 수득된 심바스타틴을 크로마토그래피 단계를 사용하지 않고 발효 배양액으로부터 용이하게 정제할 수 있다. 세포와 발효 배양액을 분리하기 위해 원심분리 단계를 이용하였다. 세포 펠릿을 아세톤에서 교반하여 세포내 심바스타틴을 회수하고, 뒤이어 증발시키고 dH20에 재현탁시켰다. 세포내 심바스타틴을 포함하는 수용액을 발효 배양액과 합치고 DMB-S-MMP를 제거하기 위해 n-헥산으로 세척하였다. 그 후, 상기 수용액을 pH 2.0까지 6N HCl로 산성화시켜서, 심바스타틴의 유리산 형태와 DMB-S-MPA의 침전을 일으켰다. 본 발명 이 속하는 기술 분야에서 알려진 바와 같이, 심바스타틴의 유리산 형태를 소디움, 포타슘, 암모늄, 또는 알칼리 토금속으로부터 유래된 기타 염 또는 다른 금속 염으로 전환될 수 있다. 그 후, 이 염들을 예를 들면, 당해 기술 분야에서 알려진 통상적인 방법을 이용하여, 순수한 심바스타틴으로 전환시킬 수 있다. DMB-S-MPA 오염물을 여과 및 과량의 dH2O에 의한 여과 케이크의 세척에 의해 제거할 수 있다. 산성화된 여과물은 회수된 심바스타틴을 총량의 1% 미만으로 포함했다. 여과 케이크를 아세토니트릴로 세척하고, 뒤이은 여과물의 증발에 의해 거의 순수한 심바스타틴을 회수할 수 있다(최종 회수: 1.13 g, 90%; HPLC에 의해 결정된 최종 순도: 98%).

고밀도 세포 발효

본 발명자들은 높은 세포 밀도 발효기를 이용하여 전세포 생촉매의 활성을 탐구하였다. TB를 배지로 이용한 회분식 발효기로부터 측정된 유효 LovD 농도 및 F1 최소 배지를 이용한 유가식 배양으로부터의 유효 LovD 농도가 표 3에 표시된다. Pfeifer 등에 의해 보고된 것으로부터 채택된 유가식 공정을 이용하여(예를 들면, Pfeifer et al., 2002, Appl Environ Microbiol 68:3287-92 참조), 본 발명자들은 매우 높은 세포 밀도 및 LovD 활성을 갖는 배양물을 수득할 수 있었다(도 21A). 본 발명자들은 접종 40시간 후에, 75의 OD₆₀₀에서 ~1.5 g/L의 활성 LovD 발현을 달성할 수 있었다(도 21A).

출발 물질의 높은 비용 때문에, 본 발명자들은 전체 발효 배양액을 이용한 생물전환을 수행할 수 없었다. 대신에, 본 발명자들은 발효 수행 동안 다양한 시점에 배양액의 분획을 시료로 채취하였다(도 21A). 각 시점에 재료 및 방법에서 기재된 전세포 용해액 분석법을 이용하여 LovD의 활성을 결정하였다. 본 발명자들은 1 mL의 배양액을 이용하여 생물전환을 수행하고 심바스타틴 형성의 속도를 측정하였다(비-휴지기(non-resting) 세포, 도 21B). 대안적으로, 본 발명자들은 또한 세포 펠릿을 PBS, pH 7.4에 재현탁시킨 후 전세포 생촉매의 특성을 조사하였다(휴지기 세포). 도 21B에서 알 수 있는 바와 같이, 각 시점에, 세포들이 휴지기 환경에 배치된 경우, 높은 전환 속도를 수득할 수 있었다. 또한, 배양액에서 LovD의 총 활성은 전환 속도와 선형적으로 상관되지 않았다. 예를 들면, 시점 4로부터 수득된 세포에 비해 더 낮은 총 LovD 활성을 가짐에도 불구하고, 시점 3으로부터의 휴지기 세포는 약 1g/L/시의 심바스타틴 전환의 가장 높은 속도를 보였다. 이 세포들의 예외적인 강건성은 8시간 미만 내에 15 mM 모나콜린 J의 심바스타틴으로의 전환을 완료할 수 있었다.

이 실시예에서, 핵심적인 발견은 이 아실화 반응에서 훨씬 더 효율적인 것인 LovD 아실트랜스퍼라아제의 존재 하에 모나콜린 J의 C8 히드록시기에 아실 모이어티를 공여하는 또 다른 아실 티오에스테르의 확인이다. 본 발명자들은 이전에 DMB-S-NAC를 LovD의 기질로서 확인하였다(예를 들면, 2006, Chem Biol 13: 1161-1169 참조). 그러나, 아실화 반응은 이상적인 전환율보다 낮은 전환율로 진행되었고, LovD로의 약한 기질 결합의 결과, 제2 기질인 모나콜린 J는 DMB-S-NAC의 경쟁적 억 제자가 되었다. 후자의 특성은 생물전환 동안 모나콜린 J의 농도가 최소로 유지되게 하기 때문에, 특히 유해하다. DMB-S-MMP 및 DMB-S-MMB는 아실 공여체로서 DMB-S-NAC보다 탁월하다. DMB-S-MMP의 kcat 값은 아실 운반체의 미묘한 구조적 변형을 통해 약 30배 더 높으나, Km 값은 모나콜린 J의 Km 값에 유사하여, 모나콜린 J의 기질 억제를 제거하였다. 또한, S-MMP 티올 전구체는 S-NAC에 비해 훨씬 덜 비싸다. 아실 S-NAC 티오에스테르가 천연 생성물의 전구체 방향성 유도 생합성에서 주로 이용된다는 것을 고려할 때(예를 들면, Jacobsen et al., 1997, Science 277:367-9 참조), 이 연구에서 개시된 티오에스테르 아실 운반체는 또한 다른 개선된(engineered) 생합성 응용에서 중요한 유용성을 찾을 수 있다.

본 발명자들은 모나콜린 J를 심바스타틴으로 전환시키는 인 비트로 생촉매 공정을 개발하고자 하였다. 본 발명자들은 일차 정제된(crudely purified) LovD가 전세포 발효와 관련된 수송 및 정제 어려움을 극복하기 위해 유용할 수 있는 것으로 판단했다. LovD는 단일의 30% 암모늄 술페이트 침전 단계에 의해 대다수의 다른 세포 단백질로부터 용이하게 분획될 수 있다. 전세포 용해액으로부터 측정된 LovD 활성의 98% 이상이 50 mM HEPES, pH 7.9에 침전된 펠릿을 재가용화시키는 것에 의해 재구성될 수 있다. 그러나, 실온에서 분석 조건 하에서 LovD는 높은 단백질 농도(~100 μM)에서 용이하게 침전되고, 보다 낮은 농도(~10 μM)에서는 보다 느리게(수일 소요) 침전된다. 흥미롭게도, 침전된 LovD 단백질은 동일한 완충액에 희석시 재가용화될 수 있고 거의 모든 활성을 회복한다.

회분 발효(batch)에서 적당량의 모나콜린 J(>5 mM)가 이용된 경우, 본 발명 자들은 인 비트로 공정에서 연장된 인큐베이션 후에도 모나콜린 J의 심바스타틴으로의 60% 보다 높은 평형 전환률을 달성할 수 없었다. 이는 심바스타틴이 LovD에 의해 모나콜린 J로 다시 가수분해되는 것인 경쟁 반응때문일 수 있다. 심바스타틴 농도가 밀리몰 범위에 도달하는 경우, 가수분해 반응의 속도는 최대값(kcat = 0.3 min^-1)에 도달하고, 따라서, 아실화의 전체 순속도를 유의성있게 방해하였다.

흥미롭게도, 역 반응은 본 연구에서 달성된 모나콜린 J의 심바스타틴으로의 높은 전환율(>99%)에서 입증된 바와 같이, 스타틴 농도가 10 내지 15 mM(4 g/L - 6 g/L)일 때, 인 비보 조건에서 제한 요인이 아니었다. 본 발명자들은 모나콜린 J가 심바스타틴으로 전환된 후, AcrAB-TolC 삼중 복합체(tripatite complex)와 같은 다중약물 유출물(multidrug exporter)이 내부 막 또는 원형질막 공간으로부터 배지로 심바스타틴을 배출할 수 있는 것으로 판단한다(예를 들면, Murakami et al., 2006, Nature 443:173-9 참조). 대장균 외막의 불투과성은 소수성 심바스타틴의 재진입을 방해한다. 보다 극성이 높은, 모나콜린 J는 막을 통해 지속적으로 확산되고 LovD의 기질로 작용할 수 있다. 이를 고려할 때, 대장균 외막과 그의 유출 펌프(efflux pump)는 가수분해를 위해 이용가능한 심바스타틴의 세포내 농도를 효과적으로 감소시키고, 따라서, 바람직하지 않는 역 반응의 속도를 약화시키고, 원하는 반응의 전환율을 최대화한다. 그러나, 기질 농도가 20 mM 이상으로 증가되는 경우, 대장균에서 정상적으로 발현되는 유출 펌프는 과다적재될 수 있다. 모나콜린 J(따라서, 심바스타틴) 및 DMB-S-MMP의 증가된 농도 하에서, 본 발명자들은 85~90%의 최대 전환 율을 달성할 수 있었다. 배양물에서 심바스타틴의 분포의 조사는 상당한 양(>20%)이 세포 내에 국재화되고, 따라서, 증가된 수준의 생성물 가수분해를 초래할 수 있다는 것을 보여주었다. 심바스타틴이 내막, 세포질 또는 원형질막 공간에 분배되었는지 여부는 알려져 있지 않다. 본 발명자들은 현재 선택된 다중약물 유출 펌프를 통해 심바스타틴 유출의 속도를 증가시키는 방법을 연구하고 있다(예를 들면, Masi et al., 2003, J Chromatogr B Analyt Technol Biomed life Sci 786:197-205 참조).

본 실시예에서, 본 발명자들은 모나콜린 J로부터 심바스타틴의 합성을 위한 매우 강건한 전세포 생촉매 공정을 개발했다. 대장균을 숙주로 이용하여, 그램-규모의 합성을 수행할 수 있는 연구실 규모 공정을 구현하였다. 추가적으로, 생성물의 용이한 회수 및 정제를 위해 직접적인 다운스트림 정제 방법을 고안하였다. 본 발명자들은 현재 LovD의 촉매 전환 속도를 개선하기 위해 합리적인 방향성 진화(rational and directed evolution) 접근방법을 이용하고 있다. LovD 특성의 최적화 및 전환의 수율을 개선하기 위한 숙주의 대사 공학으로, 심바스타틴을 제공하는 화학생물합성 경로는 도 18에 도시된 합성 경로에 대한 경쟁적이고 매력적인 대안일 수 있다.

본 발명은 본 발명의 개별적인 양태의 예시로서만 의도된, 본 명세서에 개시된 구체예에 의해 그 범위가 한정되지 않으며, 기능적으로 균등한 구체예는 본 발명의 범위 내에 속한다. 본 명세서에 기재된 것들 외에, 본 발명의 모델 및 방법의 다양한 변형은 전술된 설명 및 교시로부터 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 게 자명할 것이고, 마찬가지로 본 발명의 범위 내에 속하도록 의도된다. 그와 같은 변형 또는 다른 구체예는 본 발명의 진정한 범위 및 원칙으로부터 벗어나지 않으면서 실시될 수 있다.

표

표 1A. LovD의 기질인 아실-티오에스테르^[a]

[a] 반응의 생성물은 LC-MS에 의해 확인하였다. 반응 조건: 10 μM LovD, 1 mM 모나콜린 J, 4 mM 아실-티오에스테르, 50 mM HEPES, pH 7.9, 25℃, 10 시간.

[b] 전환율은 HPLC(238 nm)를 이용하여 상응하는 로바스타틴으로 전환된 모나콜린 J의 백분율로 측정하였다. [c] 생성물의 유리산 형태의 HPLC(C18 역상) 잔류 시간. HPLC 구배는 도 5에 기재된 것과 동일했다.

표 1B: 티오에스테르 기질의 초기 속도의 비교.

^a 반응 조건: 1 mM MJ, 4 mM 티오에스테르 기질, 10 uM 순수한 LovD, 50 mM HEPES, pH 7.9; 초기 속도는 선형 범위에서 초기 전환의 속도로 정의된다.

표 2. 본 연구에서 스크니링된 대장균 BW25113 돌연변이체의 목록. 번호는 도 14A에 표시된 TLC 래인과 일치한다. BioH는 DMB-S-MMP 가수분해를 담당하는 유일한 효소로 확인되었다.

표 3: 상이한 발현 조건으로부터의 단백질 수율의 비교^a

^a 보고된 수율은 개별적인 조건 하에서 관찰된 최대값을 나타낸다.

^b 단백질 수율은 재료 및 방법에서 기재된 바와 같은 인 비트로 전세포 용해액으로부터 추정된다. 관찰된 전환율은 0.6 min-1 의 전환 속도를 이용한 LovD 농도를 추정하기 위해 이용된다.

표 4: 폴리펩티드 서열 정보

아스퍼길러스 테레우스 LOVD 트랜스에스테라아제. 수탁번호 AAD34555

Kennedy et al. Science. 1999 May 21 [pound]84(5418): 1368-72

페니실리움 시트리눔(Penicillium citrinum) MlcH 트랜스에스테라아제 수탁번호 BAC20561

Abe et al., Mol. Genet. Genomics 267(5), 636-646(2002)

아스퍼길러스 테레우스 LOVF 폴리케티드 신타아제. AAD34559

Kennedy et al., Science. 1999 May 21; 284(5418):1368-72

대장균 카르복실에스테라아제 bioH 수탁번호 Q8FCT4

Welsch et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99(26), 17020-17024(2002)

SEQUENCE LISTING <110> The Regents of the University of California Yi Tang Xinkai Xie <120> METHODS AND MATERIALS FOR MAKING SIMVASTATIN AND RELATED COMPOUNDS <130> 30435187WOU1 <150> 60/808,088 <151> 2006-05-24 <160> 9 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 413 <212> PRT <213> Aspergillus terreus LOVD transesterase <400> 1 Met Gly Ser Ile Ile Asp Ala Ala Ala Ala Ala Asp Pro Val Val Leu 1 5 10 15 Met Glu Thr Ala Phe Arg Lys Ala Val Lys Ser Arg Gln Ile Pro Gly 20 25 30 Ala Val Ile Met Ala Arg Asp Cys Ser Gly Asn Leu Asn Tyr Thr Arg 35 40 45 Cys Phe Gly Ala Arg Thr Val Arg Arg Asp Glu Cys Asn Gln Leu Pro 50 55 60 Pro Leu Gln Val Asp Thr Pro Cys Arg Leu Ala Ser Ala Thr Lys Leu 65 70 75 80 Leu Thr Thr Ile Met Ala Leu Gln Cys Met Glu Arg Gly Leu Val Asp 85 90 95 Leu Asp Glu Thr Val Asp Arg Leu Leu Pro Asp Leu Ser Ala Met Pro 100 105 110 Val Leu Glu Gly Phe Asp Asp Ala Gly Asn Ala Arg Leu Arg Glu Arg 115 120 125 Arg Gly Lys Ile Thr Leu Arg His Leu Leu Thr His Thr Ser Gly Leu 130 135 140 Ser Tyr Val Phe Leu His Pro Leu Leu Arg Glu Tyr Met Ala Gln Gly 145 150 155 160 His Leu Gln Ser Ala Glu Lys Phe Gly Ile Gln Ser Arg Leu Ala Pro 165 170 175 Pro Ala Val Asn Asp Pro Gly Ala Glu Trp Ile Tyr Gly Ala Asn Leu 180 185 190 Asp Trp Ala Gly Lys Leu Val Glu Arg Ala Thr Gly Leu Asp Leu Glu 195 200 205 Gln Tyr Leu Gln Glu Asn Ile Cys Ala Pro Leu Gly Ile Thr Asp Met 210 215 220 Thr Phe Lys Leu Gln Gln Arg Pro Asp Met Leu Ala Arg Arg Ala Asp 225 230 235 240 Gln Thr His Arg Asn Ser Ala Asp Gly Arg Leu Arg Tyr Asp Asp Ser 245 250 255 Val Tyr Phe Arg Ala Asp Gly Glu Glu Cys Phe Gly Gly Gln Gly Val 260 265 270 Phe Ser Gly Pro Gly Ser Tyr Met Lys Val Leu His Ser Leu Leu Lys 275 280 285 Arg Asp Gly Leu Leu Leu Gln Pro Gln Thr Val Asp Leu Met Phe Gln 290 295 300 Pro Ala Leu Glu Pro Arg Leu Glu Glu Gln Met Asn Gln His Met Asp 305 310 315 320 Ala Ser Pro His Ile Asn Tyr Gly Gly Pro Met Pro Met Val Leu Arg 325 330 335 Arg Ser Phe Gly Leu Gly Gly Ile Ile Ala Leu Glu Asp Leu Asp Gly 340 345 350 Glu Asn Trp Arg Arg Lys Gly Ser Leu Thr Phe Gly Gly Gly Pro Asn 355 360 365 Ile Val Trp Gln Ile Asp Pro Lys Ala Gly Leu Cys Thr Leu Ala Phe 370 375 380 Phe Gln Leu Glu Pro Trp Asn Asp Pro Val Cys Arg Asp Leu Thr Arg 385 390 395 400 Thr Phe Glu His Ala Ile Tyr Ala Gln Tyr Gln Gln Gly 405 410 <210> 2 <211> 418 <212> PRT <213> Penicillium citrinum MlcH transesterase <400> 2 Met Ala Pro Ser Ile Asp Val Ile Pro Thr Ala Ala Ser Thr Ala Ala 1 5 10 15 Gly Met Ile Ser Asp Met Glu Ala Ala Phe Lys Ser Ala Val Lys Leu 20 25 30 Lys Gln Ile Pro Gly Ala Val Val Met Ala Arg Ser Met Asn Gly Asp 35 40 45 Ile Asp Tyr Thr Arg Cys Phe Gly Ala Arg Thr Val Glu Arg Asp Glu 50 55 60 Cys Gln Arg Leu Pro Pro Met Glu Ile Asp Thr Pro Leu Arg Leu Ala 65 70 75 80 Ser Ala Thr Lys Leu Leu Thr Thr Ile Met Ala Leu Gln Cys Met Glu 85 90 95 Gln Gly Leu Val Asp Leu Asp Glu Asn Val Asn Arg Leu Leu Pro Asp 100 105 110 Leu Ser Asp Met Gln Val Leu Thr Gly Phe Asp Ala Ala Gly Asn Ala 115 120 125 Ile Met Arg Asp Arg Glu Gly Ile Ile Lys Leu Arg His Leu Leu Thr 130 135 140 His Thr Ser Gly Leu Ser Tyr Ala Phe Leu His Pro Leu Leu Gln Glu 145 150 155 160 Tyr Met Ala Lys Gly Tyr Leu Lys Thr Ala Glu Lys Phe Gly Ile Gln 165 170 175 Ser Arg Leu Ala Pro Pro Ala Ile Asn Asp Pro Gly Val Glu Trp Ile 180 185 190 Tyr Gly Ala Asn Leu Asp Trp Ala Gly Lys Leu Ile Glu Arg Ala Thr 195 200 205 Gly Val Asp Leu Glu Glu Phe Met Gln Lys Asn Ile Cys Glu Pro Leu 210 215 220 Gly Ile Thr Asp Met Thr Phe Lys Leu Gln Gln Arg Pro Asp Met Leu 225 230 235 240 Ala Arg Arg Ser Asp Gln Thr Arg Arg Asn Glu Asn Gly Ser Leu Arg 245 250 255 Tyr Asp Asp Ser Val Tyr Phe Arg His Asp Gly Glu Glu Cys Phe Gly 260 265 270 Gly Gln Gly Val Phe Cys Gly Pro Glu Ser Tyr Met Lys Val Leu Asn 275 280 285 Ser Leu Met Lys His Asp Gly Leu Leu Leu Lys Lys Asp Thr Ile Glu 290 295 300 Leu Met Phe Gln Pro Ala Leu Asp Ala Glu Leu Glu Lys Lys Met Asn 305 310 315 320 Asp His Met Asp Thr Thr Pro His Ile Asn Tyr Gly Ala Ala Leu Pro 325 330 335 Pro Val Met Arg Arg Asn Phe Gly Leu Gly Gly Ile Ile Ala Met Gly 340 345 350 Asp Leu Asp Gly His Asn Trp Arg Arg Glu Gly Ser Leu Thr Phe Gly 355 360 365 Gly Gly Pro Asn Ile Val Trp Gln Ile Asp Pro Thr Val Gly Leu Cys 370 375 380 Thr Leu Val Val Phe Gln Leu Glu Pro Trp Asn Asp Pro Ile Cys Lys 385 390 395 400 Asp Leu Thr Arg Lys Phe Glu Lys Ala Met Tyr Ser Gln Val Lys Cys 405 410 415 Arg Asn <210> 3 <211> 2532 <212> PRT <213> Aspergillus terreus LOVF Polyketide Synthase <400> 3 Met Thr Pro Leu Asp Ala Pro Gly Ala Pro Ala Pro Ile Ala Met Val 1 5 10 15 Gly Met Gly Cys Arg Phe Gly Gly Gly Ala Thr Asp Pro Gln Lys Leu 20 25 30 Trp Lys Leu Leu Glu Glu Gly Gly Ser Ala Trp Ser Lys Ile Pro Pro 35 40 45 Ser Arg Phe Asn Val Gly Gly Val Tyr His Pro Asn Gly Gln Arg Val 50 55 60 Gly Ser Met His Val Arg Gly Gly His Phe Leu Asp Glu Asp Pro Ala 65 70 75 80 Leu Phe Asp Ala Ser Phe Phe Asn Met Ser Thr Glu Val Ala Ser Cys 85 90 95 Met Asp Pro Gln Tyr Arg Leu Ile Leu Glu Val Val Tyr Glu Ala Leu 100 105 110 Glu Ala Ala Gly Ile Pro Leu Glu Gln Val Ser Gly Ser Lys Thr Gly 115 120 125 Val Phe Ala Gly Thr Met Tyr His Asp Tyr Gln Gly Ser Phe Gln Arg 130 135 140 Gln Pro Glu Ala Leu Pro Arg Tyr Phe Ile Thr Gly Asn Ala Gly Thr 145 150 155 160 Met Leu Ala Asn Arg Val Ser His Phe Tyr Asp Leu Arg Gly Pro Ser 165 170 175 Val Ser Ile Asp Thr Ala Cys Ser Thr Thr Leu Thr Ala Leu His Leu 180 185 190 Ala Ile Gln Ser Leu Arg Ala Gly Glu Ser Asp Met Ala Ile Val Ala 195 200 205 Gly Ala Asn Leu Leu Leu Asn Pro Asp Val Phe Thr Thr Met Ser Asn 210 215 220 Leu Gly Phe Leu Ser Ser Asp Gly Ile Ser Tyr Ser Phe Asp Ser Arg 225 230 235 240 Ala Asp Gly Tyr Gly Arg Gly Glu Gly Val Ala Ala Ile Val Leu Lys 245 250 255 Thr Leu Pro Asp Ala Val Arg Asp Gly Asp Pro Ile Arg Leu Ile Val 260 265 270 Arg Glu Thr Ala Ile Asn Gln Asp Gly Arg Thr Pro Ala Ile Ser Thr 275 280 285 Pro Ser Gly Glu Ala Gln Glu Cys Leu Ile Gln Asp Cys Tyr Gln Lys 290 295 300 Ala Gln Leu Asp Pro Lys Gln Thr Ser Tyr Val Glu Ala His Gly Thr 305 310 315 320 Gly Thr Arg Ala Gly Asp Pro Leu Glu Leu Ala Val Ile Ser Ala Ala 325 330 335 Phe Pro Gly Gln Gln Ile Gln Val Gly Ser Val Lys Ala Asn Ile Gly 340 345 350 His Thr Glu Ala Val Ser Gly Leu Ala Ser Leu Ile Lys Val Ala Leu 355 360 365 Ala Val Glu Lys Gly Val Ile Pro Pro Asn Ala Arg Phe Leu Gln Pro 370 375 380 Ser Lys Lys Leu Leu Lys Asp Thr His Ile Gln Ile Pro Leu Cys Ser 385 390 395 400 Gln Ser Trp Ile Pro Thr Asp Gly Val Arg Arg Ala Ser Ile Asn Asn 405 410 415 Phe Gly Phe Gly Gly Ala Asn Ala His Ala Ile Val Glu Gln Tyr Gly 420 425 430 Pro Phe Ala Glu Thr Ser Ile Cys Pro Pro Asn Gly Tyr Ser Gly Asn 435 440 445 Tyr Asp Gly Asn Leu Gly Thr Asp Gln Ala His Ile Tyr Val Leu Ser 450 455 460 Ala Lys Asp Glu Asn Ser Cys Met Arg Met Val Ser Arg Leu Cys Asp 465 470 475 480 Tyr Ala Thr His Ala Arg Pro Ala Asp Asp Leu Gln Leu Leu Ala Asn 485 490 495 Ile Ala Tyr Thr Leu Gly Ser Arg Arg Ser Asn Phe Arg Trp Lys Ala 500 505 510 Val Cys Thr Ala His Ser Leu Thr Gly Leu Ala Gln Asn Leu Ala Gly 515 520 525 Glu Gly Met Arg Pro Ser Lys Ser Ala Asp Gln Val Arg Leu Gly Trp 530 535 540 Val Phe Thr Gly Gln Gly Ala Gln Trp Phe Ala Met Gly Arg Glu Leu 545 550 555 560 Ile Glu Met Tyr Pro Val Phe Lys Glu Ala Leu Leu Glu Cys Asp Gly 565 570 575 Tyr Ile Lys Glu Met Gly Ser Thr Trp Ser Ile Ile Glu Glu Leu Ser 580 585 590 Arg Pro Glu Thr Glu Ser Arg Val Asp Gln Ala Glu Phe Ser Leu Pro 595 600 605 Leu Ser Thr Ala Leu Gln Ile Ala Leu Val Arg Leu Leu Trp Ser Trp 610 615 620 Asn Ile Gln Pro Val Ala Val Thr Ser His Ser Ser Gly Glu Ala Ala 625 630 635 640 Ala Ala Tyr Ala Ile Gly Ala Leu Thr Ala Arg Ser Ala Ile Gly Ile 645 650 655 Ser Tyr Ile Arg Gly Ala Leu Thr Ala Arg Asp Arg Leu Ala Ser Val 660 665 670 His Lys Gly Gly Met Leu Ala Val Gly Leu Ser Arg Ser Glu Val Gly 675 680 685 Ile Tyr Ile Arg Gln Val Pro Leu Gln Ser Glu Glu Cys Leu Val Val 690 695 700 Gly Cys Val Asn Ser Pro Ser Ser Val Thr Val Ser Gly Asp Leu Ser 705 710 715 720 Ala Ile Ala Lys Leu Glu Glu Leu Leu His Ala Asp Arg Ile Phe Ala 725 730 735 Arg Arg Leu Lys Val Thr Gln Ala Phe His Ser Ser His Met Asn Ser 740 745 750 Met Thr Asp Ala Phe Arg Ala Gly Leu Thr Glu Leu Phe Gly Ala Asp 755 760 765 Pro Ser Asp Ala Ala Asn Ala Ser Lys Asp Val Ile Tyr Ala Ser Pro 770 775 780 Arg Thr Gly Ala Arg Leu His Asp Met Asn Arg Leu Arg Asp Pro Ile 785 790 795 800 His Trp Val Glu Cys Met Leu His Pro Val Glu Phe Glu Ser Ala Phe 805 810 815 Arg Arg Met Cys Leu Asp Glu Asn Asp His Met Pro Lys Val Asp Arg 820 825 830 Val Ile Glu Ile Gly Pro His Gly Ala Leu Gly Gly Pro Ile Lys Gln 835 840 845 Ile Met Gln Leu Pro Glu Leu Ala Thr Cys Asp Ile Pro Tyr Leu Ser 850 855 860 Cys Leu Ser Arg Gly Lys Ser Ser Leu Ser Thr Leu Arg Leu Leu Ala 865 870 875 880 Ser Glu Leu Ile Arg Ala Gly Phe Pro Val Asp Leu Asn Ala Ile Asn 885 890 895 Phe Pro Arg Gly Cys Glu Ala Ala Arg Val Gln Val Leu Ser Asp Leu 900 905 910 Pro Pro Tyr Pro Trp Asn His Glu Thr Arg Tyr Trp Lys Glu Pro Arg 915 920 925 Ile Ser Gln Ser Ala Arg Gln Arg Lys Gly Pro Val His Asp Leu Ile 930 935 940 Gly Leu Gln Glu Pro Leu Asn Leu Pro Leu Ala Arg Ser Trp His Asn 945 950 955 960 Val Leu Arg Val Ser Asp Leu Pro Trp Leu Arg Asp His Val Val Gly 965 970 975 Ser His Ile Val Phe Pro Gly Ala Gly Phe Val Cys Met Ala Val Met 980 985 990 Gly Ile Ser Thr Leu Cys Ser Ser Asp His Glu Ser Asp Asp Ile Ser 995 1000 1005 Tyr Ile Leu Arg Asp Val Asn Phe Ala Gln Ala Leu Ile Leu Pro Ala 1010 1015 1020 Asp Gly Glu Glu Gly Ile Asp Leu Arg Leu Thr Ile Cys Ala Pro Asp 1025 1030 1035 1040 Gln Ser Leu Gly Ser Gln Asp Trp Gln Arg Phe Leu Val His Ser Ile 1045 1050 1055 Thr Ala Asp Lys Asn Asp Trp Thr Glu His Cys Thr Gly Leu Val Arg 1060 1065 1070 Ala Glu Met Asp Gln Pro Pro Ser Ser Leu Ser Asn Gln Gln Arg Ile 1075 1080 1085 Asp Pro Arg Pro Trp Ser Arg Lys Thr Ala Pro Gln Glu Leu Trp Asp 1090 1095 1100 Ser Leu His Arg Val Gly Ile Arg His Gly Pro Phe Phe Arg Asn Ile 1105 1110 1115 1120 Thr Cys Ile Glu Ser Asp Gly Arg Gly Ser Trp Cys Thr Phe Ala Ile 1125 1130 1135 Ala Asp Thr Ala Ser Ala Met Pro His Ala Tyr Glu Ser Gln His Ile 1140 1145 1150 Val His Pro Thr Thr Leu Asp Ser Ala Val Gln Ala Ala Tyr Thr Thr 1155 1160 1165 Leu Pro Phe Ala Gly Ser Arg Ile Lys Ser Ala Met Val Pro Ala Arg 1170 1175 1180 Val Gly Cys Met Lys Ile Ser Ser Arg Leu Ala Asp Leu Glu Ala Arg 1185 1190 1195 1200 Asp Met Leu Arg Ala Gln Ala Lys Met His Ser Gln Ser Pro Ser Ala 1205 1210 1215 Leu Val Thr Asp Val Ala Val Phe Asp Glu Ala Asp Pro Val Gly Gly 1220 1225 1230 Pro Val Met Glu Leu Glu Gly Leu Val Phe Gln Ser Leu Gly Ala Ser 1235 1240 1245 Leu Gly Thr Ser Asp Arg Asp Ser Thr Asp Pro Gly Asn Thr Cys Ser 1250 1255 1260 Ser Trp His Trp Ala Pro Asp Ile Ser Leu Val Asn Pro Gly Trp Leu 1265 1270 1275 1280 Glu Lys Thr Leu Gly Thr Gly Ile Gln Glu His Glu Ile Ser Leu Ile 1285 1290 1295 Leu Glu Leu Arg Arg Cys Ser Val His Phe Ile Gln Glu Ala Met Glu 1300 1305 1310 Ser Leu Ser Val Gly Asp Val Glu Arg Leu Ser Gly His Leu Ala Lys 1315 1320 1325 Phe Tyr Ala Trp Met Gln Lys Gln Leu Ala Cys Ala Gln Asn Gly Glu 1330 1335 1340 Leu Gly Pro Glu Ser Ser Ser Trp Thr Arg Asp Ser Glu Gln Ala Arg 1345 1350 1355 1360 Cys Ser Leu Arg Ser Arg Val Val Ala Gly Ser Thr Asn Gly Glu Met 1365 1370 1375 Ile Cys Arg Leu Gly Ser Val Leu Pro Ala Ile Leu Arg Arg Glu Val 1380 1385 1390 Asp Pro Leu Glu Val Met Met Asp Gly His Leu Leu Ser Arg Tyr Tyr 1395 1400 1405 Val Asp Ala Leu Lys Trp Ser Arg Ser Asn Ala Gln Ala Ser Glu Leu 1410 1415 1420 Val Arg Leu Cys Cys His Lys Asn Pro Arg Ala Arg Ile Leu Glu Ile 1425 1430 1435 1440 Gly Gly Gly Thr Gly Gly Cys Thr Gln Leu Val Val Asp Ser Leu Gly 1445 1450 1455 Pro Asn Pro Pro Val Gly Arg Tyr Asp Phe Thr Asp Val Ser Ala Gly 1460 1465 1470 Phe Phe Glu Ala Ala Arg Lys Arg Phe Ala Gly Trp Gln Asn Val Met 1475 1480 1485 Asp Phe Arg Lys Leu Asp Ile Glu Asp Asp Pro Glu Ala Gln Gly Phe 1490 1495 1500 Val Cys Gly Ser Tyr Asp Val Val Leu Ala Cys Gln Val Leu His Ala 1505 1510 1515 1520 Thr Ser Asn Met Gln Arg Thr Leu Thr Asn Val Arg Lys Leu Leu Lys 1525 1530 1535 Pro Gly Gly Lys Leu Ile Leu Val Glu Thr Thr Arg Asp Glu Leu Asp 1540 1545 1550 Leu Phe Phe Thr Phe Gly Leu Leu Pro Gly Trp Trp Leu Ser Glu Glu 1555 1560 1565 Pro Glu Arg Gln Ser Thr Pro Ser Leu Ser Pro Thr Met Trp Arg Ser 1570 1575 1580 Met Leu His Thr Thr Gly Phe Asn Gly Val Glu Val Glu Ala Arg Asp 1585 1590 1595 1600 Cys Asp Ser His Glu Phe Tyr Met Ile Ser Thr Met Met Ser Thr Ala 1605 1610 1615 Val Gln Ala Thr Pro Met Ser Cys Ser Val Lys Leu Pro Glu Val Leu 1620 1625 1630 Leu Val Tyr Val Asp Ser Ser Thr Pro Met Ser Trp Ile Ser Asp Leu 1635 1640 1645 Gln Gly Glu Ile Arg Gly Arg Asn Cys Ser Val Thr Ser Leu Gln Ala 1650 1655 1660 Leu Arg Gln Val Pro Pro Thr Glu Gly Gln Ile Cys Val Phe Leu Gly 1665 1670 1675 1680 Glu Val Glu His Ser Met Leu Gly Ser Val Thr Asn Asp Asp Phe Thr 1685 1690 1695 Leu Leu Thr Ser Met Leu Gln Leu Ala Gly Gly Thr Leu Trp Val Thr 1700 1705 1710 Gln Gly Ala Thr Met Lys Ser Asp Asp Pro Leu Lys Ala Leu His Leu 1715 1720 1725 Gly Leu Leu Arg Thr Met Arg Asn Glu Ser His Gly Lys Arg Phe Val 1730 1735 1740 Ser Leu Asp Leu Asp Pro Ser Arg Asn Pro Trp Thr Gly Asp Ser Arg 1745 1750 1755 1760 Asp Ala Ile Val Ser Val Leu Asp Leu Ile Ser Met Ser Asp Glu Lys 1765 1770 1775 Glu Phe Asp Tyr Ala Glu Arg Asp Gly Val Ile His Val Pro Arg Ala 1780 1785 1790 Phe Ser Asp Ser Ile Asn Gly Gly Glu Glu Asp Gly Tyr Ala Leu Glu 1795 1800 1805 Pro Phe Gln Asp Ser Gln His Leu Leu Arg Leu Asp Ile Gln Thr Pro 1810 1815 1820 Gly Leu Leu Asp Ser Leu His Phe Thr Lys Arg Asn Val Asp Thr Tyr 1825 1830 1835 1840 Glu Pro Asp Lys Leu Pro Asp Asp Trp Val Glu Ile Glu Pro Arg Ala 1845 1850 1855 Phe Gly Leu Asn Phe Arg Asp Ile Met Val Ala Met Gly Gln Leu Glu 1860 1865 1870 Ser Asn Val Met Gly Phe Glu Cys Ala Gly Val Val Thr Ser Leu Ser 1875 1880 1885 Glu Thr Ala Arg Thr Ile Ala Pro Gly Leu Ala Val Gly Asp Arg Val 1890 1895 1900 Cys Ala Leu Met Asn Gly His Trp Ala Ser Arg Val Thr Thr Ser Arg 1905 1910 1915 1920 Thr Asn Val Val Arg Ile Pro Glu Thr Leu Ser Phe Pro His Ala Ala 1925 1930 1935 Ser Ile Pro Leu Ala Phe Thr Thr Ala Tyr Ile Ser Leu Tyr Thr Val 1940 1945 1950 Ala Arg Ile Leu Pro Gly Glu Thr Val Leu Ile His Ala Gly Ala Gly 1955 1960 1965 Gly Val Gly Gln Ala Ala Ile Ile Leu Ala Gln Leu Thr Gly Ala Glu 1970 1975 1980 Val Phe Thr Thr Ala Gly Ser Glu Thr Lys Arg Asn Leu Leu Ile Asp 1985 1990 1995 2000 Lys Phe His Leu Asp Pro Asp His Val Phe Ser Ser Arg Asp Ser Ser 2005 2010 2015 Phe Val Asp Gly Ile Lys Thr Arg Thr Arg Gly Lys Gly Val Asp Val 2020 2025 2030 Val Leu Asn Ser Leu Ala Gly Pro Leu Leu Gln Lys Ser Phe Asp Cys 2035 2040 2045 Leu Ala Arg Phe Gly Arg Phe Val Glu Ile Gly Lys Lys Asp Leu Glu 2050 2055 2060 Gln Asn Ser Arg Leu Asp Met Ser Thr Phe Val Arg Asn Val Ser Phe 2065 2070 2075 2080 Ser Ser Val Asp Ile Leu Tyr Trp Gln Gln Ala Lys Pro Ala Glu Ile 2085 2090 2095 Phe Gln Ala Met Ser Glu Val Ile Leu Leu Trp Glu Arg Thr Ala Ile 2100 2105 2110 Gly Leu Ile His Pro Ile Ser Glu Tyr Pro Met Ser Ala Leu Glu Lys 2115 2120 2125 Ala Phe Arg Thr Met Gln Ser Gly Gln His Val Gly Lys Ile Val Val 2130 2135 2140 Thr Val Ala Pro Asp Asp Ala Val Leu Val Arg Gln Glu Arg Met Pro 2145 2150 2155 2160 Leu Phe Leu Lys Pro Asn Val Ser Tyr Leu Val Ala Gly Gly Leu Gly 2165 2170 2175 Gly Ile Gly Arg Arg Ile Cys Glu Trp Leu Val Asp Arg Gly Ala Arg 2180 2185 2190 Tyr Leu Ile Ile Leu Ser Arg Thr Ala Arg Val Asp Pro Val Val Thr 2195 2200 2205 Ser Leu Gln Glu Arg Gly Cys Thr Val Ser Val Gln Ala Cys Asp Val 2210 2215 2220 Ala Asp Glu Ser Gln Leu Glu Ala Ala Leu Gln Gln Cys Arg Ala Glu 2225 2230 2235 2240 Glu Met Pro Pro Ile Arg Gly Val Ile Gln Gly Ala Met Val Leu Lys 2245 2250 2255 Asp Ala Leu Val Ser Gln Met Thr Ala Asp Gly Phe His Ala Ala Leu 2260 2265 2270 Arg Pro Lys Val Gln Gly Ser Trp Asn Leu His Arg Ile Ala Ser Asp 2275 2280 2285 Val Asp Phe Phe Val Met Leu Ser Ser Leu Val Gly Val Met Gly Gly 2290 2295 2300 Ala Gly Gln Ala Asn Tyr Ala Ala Ala Gly Ala Phe Gln Asp Ala Leu 2305 2310 2315 2320 Ala Glu His Arg Met Ala His Asn Gln Pro Ala Val Thr Ile Asp Leu 2325 2330 2335 Gly Met Val Gln Ser Ile Gly Tyr Val Ala Glu Thr Asp Ser Ala Val 2340 2345 2350 Ala Glu Arg Leu Gln Arg Ile Gly Tyr Gln Pro Leu His Glu Glu Glu 2355 2360 2365 Val Leu Asp Val Leu Glu Gln Ala Ile Ser Pro Val Cys Ser Pro Ala 2370 2375 2380 Ala Pro Thr Arg Pro Ala Val Ile Val Thr Gly Ile Asn Thr Arg Pro 2385 2390 2395 2400 Gly Pro His Trp Ala His Ala Asp Trp Met Gln Glu Ala Arg Phe Ala 2405 2410 2415 Gly Ile Lys Tyr Arg Asp Pro Leu Arg Asp Asn His Gly Ala Leu Ser 2420 2425 2430 Leu Thr Pro Ala Glu Asp Asp Asn Leu His Ala Arg Leu Asn Arg Ala 2435 2440 2445 Ile Ser Gln Gln Glu Ser Ile Ala Val Ile Met Glu Ala Met Ser Cys 2450 2455 2460 Lys Leu Ile Ser Met Phe Gly Leu Thr Asp Ser Glu Met Ser Ala Thr 2465 2470 2475 2480 Gln Thr Leu Ala Gly Ile Gly Val Asp Ser Leu Val Ala Ile Glu Leu 2485 2490 2495 Arg Asn Trp Ile Thr Ala Lys Phe Asn Val Asp Ile Ser Val Phe Glu 2500 2505 2510 Leu Met Glu Gly Arg Thr Ile Ala Lys Val Ala Glu Val Val Leu Gln 2515 2520 2525 Arg Tyr Lys Ala 2530 <210> 4 <211> 256 <212> PRT <213> Escherichia coli Carboxylesterase bioH <400> 4 Met Asn Asn Ile Trp Trp Gln Thr Lys Gly Gln Gly Asn Val His Leu 1 5 10 15 Val Leu Leu His Gly Trp Gly Leu Asn Ala Glu Val Trp Arg Cys Ile 20 25 30 Asp Glu Glu Leu Ser Ser His Phe Thr Leu His Leu Val Asp Leu Pro 35 40 45 Gly Phe Gly Arg Ser Arg Gly Phe Gly Ala Leu Ser Leu Ala Asp Met 50 55 60 Ala Glu Ala Val Leu Gln Gln Ala Pro Asp Lys Ala Ile Trp Leu Gly 65 70 75 80 Trp Ser Leu Gly Gly Leu Val Ala Ser Gln Ile Ala Leu Thr His Pro 85 90 95 Glu Arg Val Gln Ala Leu Val Thr Val Ala Ser Ser Pro Cys Phe Ser 100 105 110 Ala Arg Asp Glu Trp Pro Gly Ile Lys Pro Asp Val Leu Ala Gly Phe 115 120 125 Gln Gln Gln Leu Ser Asp Asp Phe Gln Arg Thr Val Glu Arg Phe Leu 130 135 140 Ala Leu Gln Thr Met Gly Thr Glu Thr Ala Arg Gln Asp Ala Arg Ala 145 150 155 160 Leu Lys Lys Thr Val Leu Ala Leu Pro Met Pro Glu Val Asp Val Leu 165 170 175 Asn Gly Gly Leu Glu Ile Leu Lys Thr Val Asp Leu Arg Gln Pro Leu 180 185 190 Gln Asn Val Ser Met Pro Phe Leu Arg Leu Tyr Gly Tyr Leu Asp Gly 195 200 205 Leu Val Pro Arg Lys Val Val Pro Met Leu Asp Lys Leu Trp Pro His 210 215 220 Ser Glu Ser Tyr Ile Phe Ala Lys Ala Ala His Ala Pro Phe Ile Ser 225 230 235 240 His Pro Ala Glu Phe Cys His Leu Leu Val Ala Leu Lys Gln Arg Val 245 250 255 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 5 aacatatgaa taacatctgg tggca 25 <210> 6 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 6 aagaattcta caccctctgc ttcaacg 27 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 7 tgacggcttc gctatcccat 20 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 8 tacaccctct gcttcaacg 19 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 9 gctggattgt ttcgccgatc 20

Claims (21)

1. 심바스타틴을 제조하는 방법으로서:

   (1) 모나콜린 J, LovD 아실트랜스퍼라아제의 존재 하에 디메틸부티릴 모이어티를 모나콜린 J의 C8 히드록시기에 공여하는 아실 티오에스테르, 및 LovD 아실트랜스퍼라아제를 조합하는 단계 및

   (2) 상기 LovD 아실트랜스퍼라아제가 상기 아실 티오에스테르로부터 디메틸부티릴기를 이전시켜 상기 모나콜린 J의 C8 히드록시기를 위치선택적으로(regioselectively) 아실화시켜, 심바스타틴을 생성하는 단계를 포함하는 것인 심바스타틴을 제조하는 방법.
2. 청구항 1에 있어서, 심바스타틴은 단리된 개체의 부재 하에 인 비트로에서 제조되는 것인 방법.
3. 청구항 1에 있어서, 상기 모나콜린 J, 상기 아실 티오에스테르 및 상기 LovD 아실트랜스퍼라아제가 상기 LovD 아실트랜스퍼라아제를 생성하는 단리된 개체의 존재 하에 발효 배지에서 조합되고, 상기 단리된 개체는 대장균(Escherichia coli), 아스퍼길러스 테레우스(Aspergillus terreus), 모나스쿠스 루버(Monascus ruber), 모나스쿠스 푸르푸레우스(Monascus purpureus), 모나스쿠스 필로수스(Monascus pilosus), 모나스쿠스 비트레우스(Monascus vitreus), 모나스쿠스 푸비게루스(Monascus pubigerus), 칸디다 카리오실로그니콜라(Candida cariosilognicola), 아스퍼길러스 오리제아(Aspergillus oryzea), 도라토미세스 스테모니티스(Doratomyces stemonitis), 파에실로미세스 비리오티(Paecilomyces virioti), 페니실룸 시트리눔(Penicillum citrinum), 페니실린 크리소게눔(Penicillin chrysogenum), 스코풀라리옵시스 브레비카울리스(Scopulariopsis brevicaulis) 또는 트리코더마 비리데(Trichoderma viride)인 것인 방법.
4. 청구항 3에 있어서, 상기 단리된 개체는:

   (a) 서열번호 1의 LovD 폴리펩티드를 발현하는 아스퍼길러스 테레우스,

   (b) 서열번호 3의 LovF 폴리펩티드를 발현하지 않는 아스퍼길러스 테레우스,

   (c) 서열번호 1의 LovD 폴리펩티드를 발현하는 대장균, 또는

   (d) 서열번호 4의 bioH 폴리펩티드를 발현하지 않는 대장균 중 하나 이상인 것인 방법.
5. 청구항 1에 있어서, 상기 LovD 아실트랜스퍼라아제는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 것인 방법.
6. 청구항 1에 있어서, 상기 아실 티오에스테르는 하기의 특성 중 하나 이상을 갖도록 선택되는 것인 방법:

   (a) 발효 배지 내에서 성장하는 대장균 또는 아스퍼길러스 테레우스의 세포막을 통과할 수 있거나, 또는

   (b) α-디메틸부티릴-S-메틸-머캅토프로피오네이트(DMB-S-MMP), 디메틸부티릴-S-에틸 머캅토프로피오네이트(DMB-S-EMP) 및 디메틸부티릴-S-메틸 티오글리콜레이트(DMB-S-MTG) 및 디메틸부티릴-S-메틸 머캅토부티레이트(DMB-S-MMB)로 구성된 군으로부터 선택된다.
7. 청구항 3에 있어서, 상기 아실 티오에스테르는 α-디메틸부티릴-S-메틸-머캅토프로피오네이트이고, 상기 α-디메틸부티릴-S-메틸-머캅토프로피오네이트는 상기 발효 배지 내에 1mM 내지 1OOmM의 농도 범위로 존재하는 것인 방법.
8. 청구항 3에 있어서, 상기 모나콜린 J는 상기 발효 배지 내의 단리된 개체에 의해 생산되는 것인 방법.
9. 청구항 3에 있어서, 상기 단리된 개체는 하나 이상의 하기 조건 하에서 배양되는 것인 방법:

   (a) 30-40℃의 온도,

   (b) 4시간 이상 내지 48시간 이상의 기간,

   (c) pH 7-8; 또는

   (d) LB, Fl 또는 TB 배지를 포함하는 발효 배지.
10. 청구항 1에 있어서, 하기를 포함하는 하나 이상의 정제 단계에 의해 상기 방법에 의해 제조된 심바스타틴을 정제하는 단계를 더 포함하는 것인 방법:

    (a) 상기 조합 내에 존재하는 단리된 개체의 세포의 용해,

    (b) 원심분리,

    (c) 심바스타틴의 유리산 형태의 침전,

    (d) 심바스타틴의 유리산 형태의 심바스타틴 염으로의 전환,

    (e) 여과, 또는

    (f) HPLC(high performance liquid chromatography).
11. 청구항 1에 있어서, 상기 방법은:

    (a) LovD 아실트랜스퍼라아제의 존재 하에 모나콜린 J의 C8 히드록시기에 디메틸부티릴 모이어티를 공여하는 상기 아실 티오에스테르와 최초에 조합된 모나콜린 J의 1% 이하를 포함하는 조성물을 생성하거나; 또는

    (b) 상기 조합에 첨가된 모나콜린 J의 95% 이상의 심바스타틴으로의 전환을 초래하는 것인 방법.
12. 모나콜린 J,

    LovD 아실트랜스퍼라아제의 존재 하에 모나콜린 J의 C8 히드록시기에 디메틸부티릴 모이어티를 공여하는 아실 티오에스테르로서, 상기 아실 티오에스테르는 발효 배지 내에서 성장하는 대장균 또는 아스퍼길러스 테레우스 세포의 세포막을 통과할 수 있는 것인 아실 티오에스테르,

    LovD 아실트랜스퍼라아제, 및

    심바스타틴을 포함하는 조성물(composition of matter).
13. 청구항 12에 있어서, 단리된 개체를 더 포함하고, 상기 단리된 개체는 대장균, 아스퍼길러스 테레우스, 모나스쿠스 루버, 모나스쿠스 푸르푸레우스, 모나스쿠스 필로수스, 모나스쿠스 비트레우스, 모나스쿠스 푸비게루스, 칸디다 카리오실로그니콜라, 아스퍼길러스 오리제아, 도라토미세스 스테모니티스, 파에실로미세스 비리오티, 페니실룸 시트리눔, 페니실린 크리소게눔, 스코풀라리옵시스 브레비카울리스 또는 트리코더마 비리데인 것인 조성물.
14. 청구항 13에 있어서, 상기 단리된 개체는:

    (a) 서열번호 1의 LovD 폴리펩티드를 발현하는 아스퍼길러스 테레우스,

    (b) 서열번호 3의 LovF 폴리펩티드를 발현하지 않는 아스퍼길러스 테레우스,

    (c) 서열번호 1의 LovD 폴리펩티드를 발현하는 대장균, 또는

    (d) 서열번호 4의 bioH 폴리펩티드를 발현하지 않는 대장균 중 하나 이상인 것인 조성물.
15. 청구항 12에 있어서, 상기 아실 티오에스테르는 α-디메틸부티릴-S-메틸-머캅토프로피오네이트(DMB-S-MMP), 디메틸부티릴-S-에틸 머캅토프로피오네이트(DMB-S-EMP) 및 디메틸부티릴-S-메틸 티오글리콜레이트(DMB-S-MTG) 및 디메틸부티릴-S-메틸 머캅토부티레이트(DMB-S-MMB)로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
16. 청구항 12에 있어서, 서열번호 1의 아스퍼길러스 테레우스 LovD를 코딩하는 발현 벡터에 의해 형질전환된 단리된 개체를 더 포함하는 것인 조성물.
17. 청구항 12에 있어서, 상기 조성물은 로바스타틴을 더 포함하고, 상기 조성물 내의 심바스타틴의 양은 상기 조성물 내의 로바스타틴의 양보다 많은 것인 조성물.
18. 심바스타틴을 제조하는 방법으로서:

    (1) 로바스타틴, LovD 아실트랜스퍼라아제의 존재 하에 디메틸부티릴 모이어티를 모나콜린 J의 C8 히드록시기에 공여하는 아실 티오에스테르, 및 LovD 아실트랜스퍼라아제를 조합하는 단계, 및

    (2) 상기 LovD 아실트랜스퍼라아제가

    (a) 로바스타틴을 모나콜린 J로 가수분해시키고, 및

    (b) 상기 아실 티오에스테르로부터 디메틸부티릴기를 이전시켜 상기 모나콜린 J의 C8 히드록시기를 위치선택적으로 아실화시켜, 심바스타틴을 생성하는 단계를 포함하는 것인 심바스타틴을 제조하는 방법.
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