BRPI0711889B1 - método para produção de sinvastatina, composição de matéria, método para fabricação de huvastatina, método para fabricação de sinvastatina, e método para fabricação de uma composição de matéria de sinvastatina ou huvastatina - Google Patents

Abstract

método para produção de sinvastatina, composição de matéria, método para fabricação de huvastatina, método para fabricação de sinvastatina, e método para fabricação de uma composição de materia de sinvastatina ou huvastatina a invenção aqui divulgada refere-se a métodos e materiais para produção de sinvastatiria e compostos associados tal como huvastatina.

Description

MÉTODO PARA PRODUÇÃO DE SINVASTATINA, COMPOSIÇÃO DE MATÉRIA, MÉTODO PARA FABRICAÇÃO DE HUVASTÃTINA, MÉTODO PARA FABRICAÇÃO DE SINVASTATINA, E MÉTODO PARA FABRICAÇÃO DE UMA COMPOSIÇÃO DE MATÉRIA DE SINVASTATINA OU HUVASTATINA

CAMPO DA INVENÇÃO

A invenção refere-se a métodos e material para biosintese de compostos tais como sinvastatina incluindo procedimentos com utilização de hospedeiros microbianos. ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

A sinvastatina é um derivado semi-sintético do produto natural lovastatina, que pode ser isolada do caldo de fermentação de Aspergillus terreus. Tanto a lovastatina quanto a sinvastatina são drogas redutoras de colesterol que reduzem substancialmente o risco de doenças cardíacas em adultos. A lovastatina e a sinvastatina são comercializadas pela empresa Merck & Co. com as designações Mevacor e Zocor, respectivamente. A sinvastatina é um derivado mais potente da lovastatina e foi a segunda droga mais vendida nos Estados Unidos da América em 2005, com uma expectativa de vendas de 4,5 bilhões de dólares norteamericanos somente nos Estados Unidos da América.

O agrupamento genético para bio-síntese de lovastatina em A. terreus (vide, por exemplo, J. Kennedy, K. e outros, Science, 1999, 284, 1368-1372; e C. R. Hutchinson, J. e outros, Antonie Van Leeuwenhoek 2000, 78, 287-295) foi descrito anteriormente (vide, por exemplo, a

287-295) foi descrito anteriormente (vide, por exemplo, a patente norte-americana US 6.391.583, cujo conteúdo se encontra aqui incorporado a título de referência). No agrupamento genético encontra-se codificada uma proteína LovD de 4 6 kD, que foi inicialmente identificada como um homólogo de esterase. A monacolina J, o precursor biosintético imediato da lovastatina, é construída pela LovB megasintase de montante (vide, por exemplo, L. Hendrickson, C. R. e outros, Chem. Biol. 1999, 6, 429-439), (também conhecida como lovastatina nonacetídeo sintase [Lovastatin Nonaketide Synthase], LNKS), LovC enoilreductase e CYP450 oxigenases. A cadeia lateral de cinco unidades de carbono é sintetizada por LovF (lovastatina dicetídeo sintase [Lovastatin Diketide Synthase], LDKS) mediante condensação entre uma acetil-CoA e uma malonil-CoA. O dicetídeo condensado sofre metilação e conformação redutora pelos domínios LovF individuais para produzir um a-Smetilbutiril tioéster acoplado covalentemente à ramificação fosfopanteteína no domínio de proteína transportadora de acila (Acyl Carrier Protein - ACP) da LovF (vide, por exemplo, J. Kennedy, K. e outros, Science, 1999, 284, 13681372; e C. R. Hutchinson, J. e outros, Antonie Van Leeuwenhoek 2000, 78, 287-295), e a Lovastatina é subsequentemente produzida da monacolina J. A inativação alternativamente de LovD ou de LovF em A. terreus causa acumulação do precursor monacolina (vide, por exemplo, J. Kennedy, K. e outros, Science, 1999, 284, 1368-1372; e C.

R. Hutchinson, J. e outros, Antonie Van Leeuwenhoek 2000, 18, 287-295).

Após a lovastatina ser produzida através de fermentação em um hospedeiro A. terreus, por exemplo, a sinvastatina pode ser produzida da lovastatina. Atualmente, a sinvastatina é um derivado semi-sintético da lovastatina. A lovastatina é obtida através de fermentação do hospedeiro A. terreus. Após a purificação do composto, a semi-sintese pode prosseguir da seguinte forma: 1) a ramificação do lado 2-metilbutirato pode ser hidrolisada na presença de uma base para produção da monacolina J intermediária; 2) lactonização do ácido livre; 3) o grupo funcional álcool em C13 é protegido com um grupo de proteção (tal como tercbtildimetilsilil) ; 4) Esterificação do álcool C8 exposto com um substrato acila tal como cloreto de 2-dimetilbutiril para obtenção de uma versão protegida C13 de sinvastatina; e 5) Desproteção de OH C13 para obtenção de sinvastatina (Figura 3).

Foram anteriormente descritas diversas sínteses de múltiplas etapas de sinvastatina (vide, por exemplo, o documento PCT WO 2005/066150 e os pedidos de patente norteamericanos n° 20050080275 e 20040068123, cujos conteúdos são aqui incorporados a título de referência). Por exemplo, um processo amplamente utilizado tem início com a hidrólise do éster C8 em lovastatina para obtenção do triol monacolina J, seguido pela sililação seletiva do álcool

C13, esterificação do álcool C8 com cloreto de dimetilbutiril e desproteção do álcool C13 para obtenção de sinvastatina (vide, por exemplo, W. F. Hoffman, e outros,

J. Med. Chem. 1986, 29, 849-852). As transformações enzimáticas com utilização de lipases e esterases foram investigadas como alternativas à derivação quimica (vide, por exemplo, os documentos PCT WO 2005/040107, PCT WO 94/26920 e T. G. Schimmel, e outros, Appl. Environ. Microbiol. 1997, 63, 1307-1311, cujos conteúdos são aqui incorporados a titulo de referência). Entretanto, o requisito de esterificação regioseletiva envolve invariavelmente a proteção de outros grupos álcool e causa frequentemente uma redução de rendimento geral. Portanto, um reagente especifico capaz de acilar seletivamente C8 de monacolina J é importante para uma síntese eficiente de sinvastatina e análogos adicionais de estatina.

As variações dos esquemas acima são comuns, entretanto a maioria dos procedimentos irá invariavelmente envolver a isolação da lovastatina em primeiro lugar, hidrólise da cadeia lateral de metilbutirato, proteção do álcool livre, reação com um substrato de acila, e desproteção. Muito embora as transformações químicas envolvidas sejam relativamente simples, elas são ineficazes e envolvem múltiplas etapas e portanto contribuem para o atualmente elevado custo de fabricação da sinvastatina (US$ 3 por pílula).

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção proporciona métodos e materiais para aproveitamento das vantagens de processo biológico de fabricação de lovastatina para produção do derivado de lovastatina designado como sinvastatina. A presente invenção também proporciona métodos e materiais destinados ao aproveitamento das vantagens de processos biológicos de fabricação de lovastatina para produção de compostos associados tal como o derivado de pravastatina designado como huvastatina. Conforme foi observado acima, os processos biológicos para produção de lovastatina a partir da fermentação de A. terreus são bem conhecidos na técnica. Em processos típicos para produção de lovastatina, o núcleo de decalina e as frações HMG-CoA que mimetizam porções do composto lovastatina são sintetizados pela lovastatina nonacetídeo sintase (LNKS) e três enzimas acessórias in vivo. A cadeia lateral de 2-metilbutirato é sintetizada por lovastatina dicetídeo sintase (LDKS) in vivo. O 2metilbutirato é acoplado covalentemente ao domínio transportador de acila de LovF através de uma interligação tioéster (Figura 6). Uma aciltransferase, LovD, é então capaz de transferir o 2-metilbutirato seletivamente para o grupo hidroxila C8 de LDKS em uma etapa para obtenção de lovastatina. Conforme é discutido detalhadamente abaixo, é agora possível gerar sinvastatina e compostos associados tanto in vitro quanto in vivo mediante manipulação destes processos.

As configurações da invenção incluem métodos para geração de sinvastatina sem as múltiplas etapas de síntese química que são atualmente empregadas para geração deste composto. As configurações típicas da invenção não requerem a purificação de lovastatina como primeira etapa, seguida pelos procedimentos semi-sintéticos adicionais, utilizando ao invés disso uma única etapa de fermentação para produção de sinvastatina. Os processos aqui divulgados são projetados de tal forma que as instalações de fermentação que produzem atualmente lovastatina possam ser convertidos para produção de sinvastatina e compostos associados com um minimo de modificações. Os materiais utilizados nos processo aqui divulgados são relativamente pouco dispendiosos e as etapas de purificação são bem conhecidas na técnica e fáceis de praticar.

Aqueles que são versados na técnica poderão entender que a divulgação aqui proporcionada permite a produção de uma ampla variedade de configurações da invenção. Uma configuração tipica da invenção consiste em um método de produção de sinvastatina mediante combinação de monacolina J; um tioéster de acila doador de uma fração acila ao grupo hidroxila C8 da monacolina J na presença de LovD aciltransferase; e LovD aciltransferase; permitindo-se subsequentemente que a LovD aciltransferase utilize um grupo acila do tioéster de acila para acilar regioseletivamente o grupo hidroxila C8 da monacolina J; sendo assim obtida sinvastatina. Em configurações típicas da invenção, a LovD aciltransferase tem a seqüência de aminoácidos SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2. Uma configuração associada da invenção consiste em um método de fabricação de sinvastatina compreendendo as etapas de combinação de lovastatina; um tioéster de acila doador de uma fração acila ao grupo hidroxila C8 da monacolina J na presença de LovD aciltransferase; e LovD aciltransferase. Nesta configuração do método, é então permitido que a LovD aciltransferase hidrólise lovastatina para monacolina J; sendo então permitido a utilização de um grupo acila do tioéster de acila para acilar regioseletivamente o grupo hidroxila C8 da monacolina J; sendo assim obtida sinvastatina. Em certas configurações, a sinvastatina é produzida in vitro na ausência de um organismo isolado.

Conforme é discutido detalhadamente mais abaixo, os métodos e materiais da invenção que são utilizados para fabricação de sinvastatina podem ser adaptados para produção de compostos que são estruturalmente similares à sinvastatina, por exemplo huvastatina. Neste contexto, uma configuração da invenção consiste em um método de produção de huvastatina compreendendo as etapas de combinação de tetraol de pravastatina hidrolisada; um tioéster de acila doador de uma fração acila ao grupo hidroxila C8 do tetraol de pravastatina hidrolisada na presença de LovD aciltransferase; e LovD aciltransferase; permitindo-se subsequentemente que a LovD aciltransferase utilize um grupo acila do tioéster de acila para acilar regioseletivamente o grupo hidroxila C8 do tetraol de pravastatina hidrolisada, sendo assim obtida huvastatina.

Uma configuração associada da invenção consiste em uma composição de matéria compreendendo: tetraol de pravastatina hidrolisada; um tioéster de acila doador de uma fração acila ao grupo hidroxila C8 do tetraol de pravastatina hidrolisada na presença de LovD aciltransferase; LovD aciltransferase; e huvastatina. Consequentemente, as configurações da invenção incluem processos para fabricação de composições de matéria de sinvastatina ou huvastatina substancialmente conforme aqui divulgados e exemplificados.

Em algumas configurações da invenção, a monacolina J; o tioéster de acila e a LovD aciltransf erase são combinados em uma midia de fermentação na presença de um organismo isolado que produz a LovD aciltransferase e em que adicionalmente o organismo consiste em Escherichia coli, Aspergillus terreus, Monascus ruber, Monascus purpureus, Monascus pilosus, Monascus vitreus, Monascus pubigerus, Candida cariosilognicola, Aspergillus oryzea, Doratomyces stemonitis, Paecilomyces virioti, Penicillum citrinum, Penicillum chrysogenum, Scopulariopsis brevicaulis ou Trichoderma viride. Opcionalmente, o organismo isolado é Aspergillus terreus que expressa polipeptídeo LovD de SEQ ID NO:1. Em certas configurações, o Aspergillus terreus não expressa polipeptídeo LovF de SEQ ID NO: 3. Alternativamente, o organismo pode consistir em Escherichia coli que expressa polipeptídeo LovD de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2. Em certas configurações, o

Escherichia coli não expressa polipeptídeo bíoH de SEQ ID NO: 4. Conforme é discutido detalhadamente mais abaixo, o organismo isolado pode ser cultivado em uma de uma variedade de condições de fermentação conhecidas na técnica e as condições exatas podem ser selecionadas, por exemplo, com base nos requisitos de fermentação do organismo específico que é utilizado. Em configurações típicas da invenção, o organismo é cultivado a uma temperatura entre 30-40° C, durante um período de tempo de entre pelo menos 4 até pelo menos 48 horas e a um pH entre 6,5-8,5. Em configurações ilustrativas, o organismo é cultivado em uma mídia de fermentação compreendendo mídia LB, El ou TB.

Opcionalmente, a monacolina J que é combinada com os outros constituintes nos métodos da invenção é produzida por um organismo isolado dentro da mídia de fermentação, por exemplo um dos organismos listados acima que também produz a LovD aciltransferase. Alternativamente, a monacolina J que é combinada com os outros constituintes nos métodos de acordo com a invenção é produzida por um organismo diferente que produz este composto que é adicionado à mídia de fermentação e cultivado juntamente com o organismo que produz a LovD aciltransferase. Neste contexto um certo número de organismos conhecidos na técnica para produção de monacolina J podem ser adaptados para utilização com estas configurações da invenção (vide, por exemplo, Endo e outros, J Antibiot (Tokyo) . 1985 Mar; 38(3):420-2. E Kennedy e outros, 1999 Maio

21,-284(5418):1368-72). Em uma outra configuração da invenção, a monacolina J é derivada de uma fonte exógena alternativa (por exemplo, um processo de síntese química) e é adicionada à mistura de fermentação.

Em configurações típicas da invenção, o tioéster de acila capaz de doar uma fração acila ao grupo hidroxila C8 da monacolina J na presença de LovD aciltransferase é derivado de uma fonte exógena (por exemplo, um processo de síntese química) e é adicionado à mistura de fermentação. São aqui divulgados vários desses tioéster de acila. Tipicamente o tioéster de acila é um tioéster de butirlila, um tioéster de N-acetilcisteamina ou um tioéster de metiltioglicolato. Opcionalmente, o tioéster de acila compreende frações de grupo acila de extensão média de cadeia (C3-C6). Em certas configurações da invenção, o tioéster de acila é capaz de cruzar as membranas celulares de células de Escherichia coli ou Aspergillus terreus cultivadas dentro de uma mídia de fermentação. Tipicamente, o tioéster de acila é selecionado do grupo que consiste em adimetilbutiril-S-metil-mercaptopropionato (DMB-S-MMP), dimetilbutiril-S-etil mercaptopropionato (DMB-S-EMP) e dimetilbutiril-S-metil tioglicolato (DMB-S-MTG) e dimetilbutiril-S-metil mercaptobutirato (DMB-S-MMB). Em uma configuração ilustrativa, o tioéster de acila é um adimetilbutiril-S-metil-mercaptopropionato que é combinado em uma mídia de fermentação em uma faixa de concentração de mM-100 mM.

Em certas configurações da invenção, o método tem como resultado a conversão em sinvastatina de pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% da monacolina J adicionada à combinação. Opcionalmente, o método de acordo com a invenção produz uma composição de matéria compreendendo 0%1% da monacolina J que foi inicialmente adicionada à combinação. Certas configurações dos métodos para produção de sinvastatina e compostos associados incluem etapas adicionais para purificação destes compostos. Por exemplo, as configurações da invenção podem incluir pelo menos uma etapa de purificação compreendendo lise de células de um organismo isolado presente na combinação. As configurações podem também incluir pelo menos uma etapa de purificação compreendendo centrifugação de células ou lisados de células de um organismo isolado presente na combinação. Adicionalmente, as configurações podem incluir pelo menos uma etapa de purificação compreendendo precipitação de um ou mais compostos presentes na combinação. Uma configuração de uma etapa de precipitação compreende a precipitação de uma forma de ácido livre da sinvastatina. Opcionalmente nessas configurações, é então possível converter esta forma de ácido livre da sinvastatina em um sal de sinvastatina. As configurações da invenção podem igualmente incluir pelo menos uma etapa de purificação compreendendo filtração de um ou mais compostos presentes na combinação. Adicionalmente, as configurações podem incluir pelo menos uma etapa de purificação compreendendo uma análise de cromatografia líquida de alto desempenho (High Performance Liquid Chromatography - HPLC) de um ou mais compostos presentes na combinação.

As configurações da invenção incluem composições de matéria úteis para produção e/ou produzidas pelos processos aqui divulgados. Por exemplo, uma configuração da invenção consiste em uma composição de matéria compreendendo: monacolina J; um tioéster de acila doador de uma fração acila ao grupo hidroxila C8 da monacolina J na presença de LovD aciltransferase; LovD aciltransferase; e sinvastatina. Opcionalmente, a composição compreende adicionalmente um organismo isolado tal como Escherichia coli, Aspergillus terreus, Monascus ruber, Monascus purpureus, Monascus pilosus, Monascus vitreus, Monascus pubigerus, Candida cariosilognicola, Aspergillus oryzea, Doratomyces stemonitis, Paecilomyces virioti, Penicillum citrinum, Penicillum chrysogenum, Scopulariopsis brevicaulis ou Trichoderma viride. Em configurações típicas, o organismo na composição é Aspergillus terreus ou Escherichia coli que expressa polipeptídeo LovD de SEQ ID NO:1. Em uma configuração da invenção, o organismo é Aspergillus terreus que não expressa polipeptídeo LovF de SEQ ID NO: 3. Em uma outra configuração da invenção, o organismo é Escherichia coli que não expressa polipeptídeo bioH de SEQ ID NO: 4. Em certas configurações da invenção, um organismo isolado dentro da composição foi transduzido com um vetor de expressão que codifica LovD de Arpergillus terreus (SEQ ID

NO: 1).

São aqui divulgados vários tioésteres de acila que podem ser utilizados nas composições de acordo com a invenção. Tipicamente, o tioéster de acila é um tioéster de butirlila, um tioéster de N-acetilcisteamina ou um tioéster de metil-tioglicolato. Opcionalmente, o tioéster de acila compreende frações de grupo acila de extensão de cadeia média (C3-C6). Em certas configurações da invenção, o tioéster de acila é capaz de atravessar as membranas celulares de células de Escherichia coli ou Aspergillus terreus cultivadas dentro de uma midia de fermentação. Tipicamente, o tioéster de acila é selecionado do grupo que consiste em α-dimetilbutiril-S-metil-mercaptopropionato (DMB-S-MMP), dimetilbutiril-S-etil mercaptopropionato (DMBS-EMP) e dimetilbutiril-S-metil tioglicolato (DMB-S-MTG) e dimetilbutiril-S-metil mercaptobutirato (DMB-S-MMB). Em uma configuração ilustrativa, o tioéster de acila é um adimetilbutiril-S-metil-mercaptopropionato que é combinado em uma midia de fermentação em uma faixa de concentração de 1 mM-100 mM. Em algumas configurações da invenção, a composição compreende adicionalmente lovastatina e a quantidade de sinvastatina na composição é maior que a quantidade de lovastatina na composição.

Em certas configurações da invenção, componentes adicionais e/ou etapas metodológicas adicionais podem ser combinados com um ou mais dos métodos e materiais discutidos acima. Por exemplo, o método pode compreender adicionalmente a utilização de fermentação de alta densidade de células para aumentar a concentração efetiva de LovD aciltransferase e otimizar as condições de fermentação ou aumentar as eficiências catalíticas de LovD aciltransferase para engenharia de proteínas dos um ou mais tioésteres. Muitos outros componentes ou métodos podem ser utilizados para aumento da produção de sinvastatina ou de um composto intermediário ou associado que facilite a produção de sinvastatina.

As configurações da invenção também incluem artigos de manufatura e/ou kits destinados a facilitarem os métodos da invenção. Tipicamente esses kits incluem instruções para utilização de seus elementos de acordo com os métodos da presente invenção. Esses kits podem compreender um dispositivo de transporte dividido em compartimentos para acolher em confinamento um ou mais dispositivos recipientes tais como frascos, tubos, e similares, cada um dos dispositivos recipientes compreendendo um dos elementos separados para utilização no método. Um dos recipientes pode compreender um frasco, por exemplo, contendo LovD aciltransferase e/ou A. terreus e um outro frasco contendo um composto de tioéster ou similar, ambos os quais podem ser adicionados a uma mistura de fermentação para produção de sinvastatina e/ou huvastatina ou similares.

São discutidas abaixo configurações adicionais da invenção.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Figura 1. A. Lovastatina. B. Sinvastatina. Os dois componentes diferem em uma substituição metila na posição

a.

Figura 2. Lovastatina (1), Sinvastatina (2),

Pravastatina (5), Huvastatina (6) e compostos associados.

Figura 3. Método atual de produção de sinvastatina.

Figura 4. Reação de transferência de acila de acordo com a invenção em A. terreus. O nucleófilo de sítio ativo pode ser Serina 76.

Figura 5. A) Resultado de análise HPLC (238 nm) ilustrando a formação de 4 por transferência de acila mediada por LovD. Gradiente: 60%B-95%B, 5 min; 95%B, 15 min; A: H₂O+0,l% TFA; B: acetonitrilo + 0,1% TFA; a) LovD + monacolina J + butiril-CoA decurso de tempo (0, 1, 3, 6 e 10 horas); b) LovD S76A + monacolina J + butiril-CoA, 10 hrs; c) LovD + butiril-SNAC, 10 hrs; d) LovD + butirilSMTG, 10 hrs. Condições de ensaio: 1 mM de monacolina J, 4 mM de butiril-CoA, 10μ LovD, 50 mM HEPES, pH 7,9, 25 graus C. (B) Conversão como função de tempo para (0) butiril-CoA (♦) butiril-SNAC, () butiril-SMTG. Os valores K_cat aparentes relatados de princípio a fim do texto são taxas de conversão iniciais na escala linear. (C) Gráfico de Michaelis-Menten de hidrólise de lovastatina catalisada por LovD para monacolina J. O progresso da reação é monitorado por HPLC. K_cat: 0,21 ± 0,01 min’¹; K_m: 0,56 ± 0,05 mM.

Figura 6. A LovD catalisa a transferência de acila para produção de lovastatina. O doador de acila encontra-se acoplado a LDKS.

Figura 7. Acila-SNAC. 0 circulo sombreado indica qualquer grupo funcional.

Figura 8. Resultado de análise HPLC (238 nm) ilustrando a formação de sinvastatina e lovastatina por transferência de acila mediada por LovD. O gradiente é idêntico àquele descrito na Figura 1; a) padrões autênticos de lovastatina e sinvastatina; b) monacolina J + a-Smetilbutiril-SNAC; c) monacolina J + a-dimetilbutiril-SNAC. Condições de ensaio: 1 mM de monacolina J, 10 mM de acilSNAC, 100 μΜ de LovD, 50 mM de HEPES, pH 7,9, 25° C, 6 hrs.

Figura 9. Resultados de análise de HPLC (238 nm) ilustrando a formação de pravastatina e huvastatina por acilação mediada por LovD do tetraol 7. Gradiente: 5% B95%B, 5 min; 95%B, 15 min; A: H₂O+0,l% TFA; B: acetonitrila + 0,1% TFA; a) padrões autênticos de pravastatina e 7; b) 7 + α-3-metilbutiril-SNAC; c) 7 + a-dimetilbutiril-SNAC. Condições de ensaio: 1 mM de monacolina J, 10 mM de acilSNAC, 100 μΜ de LovD, 50 mM de HEPES, pH 7,9, 25 graus C, 6 hrs.

Figura 10. Conversão microbiana de monacolina J em sinvastatina.

Figura 11. Hidrólise catalisada por LovD e acilação catalisada por LovD. A Figura 11 abrange configurações da invenção incluindo composições de matéria que produz huvastatina ou sinvastatina na presença de LovD e um doador de acila. A Figura 11 também ilustra um método de produção de sinvastatina compreendendo a hidrólise de lovastatina na presença de LovD para produção de monacolina J. A monacolina J é dessa forma convertida em sinvastatina na presença de um doador de acila. Similarmente, a Figura 11 ilustra também um método de produção de huvastatina que compreende a hidrólise de pravastatina na presença de LovD para produção de pravastatina hidrolisada. A pravastatina hidrolisada é dessa forma convertida em huvastatina na presença de um doador de acila.

Figura 12. Produção de huvastatina em um microorganismo expressando LovD. A Figura 12 proporciona ilustrações de configurações da invenção incluindo a produção de huvastatina em um organismo expressando LovD.

Figura 13. (A) Conversão bio-catalitica de célula inteira de ácido de sinvastatina a partir de ácido de monacolina J e DMB-S-MMP. A cepa E. coli super-expressa a LovD aciltransferase. A hidrólise de DMB-S-MMP para produção de DMB-S-MPA é uma reação competitiva. (B) resultado do topo: perfil típico de reagentes e produtos do experimento de conversão de célula inteira. Resultados do fundo: padrões para DMB-S-MMP e DMB-S-MPA. Os espectros foram obtidos a 238 nm.

Figura 14. (A) Cromatografia de camada fina ilustrando os extratos orgânicos de sessenta cepas E. coli suplementados com DMB-S-MMP. As identificações das cepas podem ser encontradas na Tabela 2. A placa de cromatografia TLC foi desenvolvida com 20% EA em hexano para separação de DMB-S-MMP (topo) e DMB-S-MPA (fundo) . O ponto do meio é um composto desconhecido. Em todas as cepas com exceção da #56, o DMB-S-MMP foi hidrolisado para DMB-S-MPA após 10 horas de incubação. A cepa AbioH não hidrolisou o DMB-SMMP. (B) Confirmação dos resultados de cromatografia TLC com utilização de cromatografia HPLC. Não foi possível detectar DMB-S-MPA no extrato de cepa AbioH. Os espectros foram obtidos a 234 nm.

Figura 15. (A) Cinética de Michaelis-Menten de BioH para DMB-S-MMP. Os resultados foram ponderados para três ensaios

Os valores kcat e Km são 260 ± seg-1 e 229 ± 26 μΜ, respectivamente. O elevado valor de desvio padrão observado em concentrações elevadas de DMB-S-MMP pode ser devido à fraca solubilidade do substrato em tampão (50 mM de HEPES, pH 7,9, 10% DMSO) . (B) Comparação de taxas de hidrólise para três diferentes tioésteres de dimetilbutiril. As reações foram realizadas com 1 mM de tioéster e 10 nM de BioH.

Figura 16. (A) Comparação de taxas de crescimento e densidade celular final para BL21(DE3)/pAW31 (0 cinzento) e YT2/pAW31 (sem biotina: o; com 0,15 mg/L de biotina: ·) em mídia El mínima. As células foram cultivadas para OD600 ~

0,5, induzidas com 100 μΜ de IPTG e deslocadas para um agitador a 20° C durante 12 horas. A cepa YT2 de AbioH requer a adição de biotina exógena para manter um crescimento celular robusto em mídia sintética. (B) Comparação de conversão de sinvastatina em função de tempo (15 mM de MJ, 25 mM de DMB-S-MMP) . YT2/pAW31 (o) é significativamente mais rápido que BL21(DE3)/pAW31 (·) (dados obtidos de Xie e outros, (2007) Appl Environ Microbiol 73: 2054-2060) para alcançar 99% de conversão. Ambas as cepas apresentaram uma fase de intervalo (lag phase) após a adição do substrato (0 hora) e uma fase de intervalo perto da completação da reação. As velocidades de reação entre as fases de intervalo são lineares. A taxa de conversão para YT2/pAW31 (1,5 mM/hr) foi duas vezes mais rápida que a taxa de conversão para BL21(DE3) (0,75 mM/hr).

Figura 17. Análise de cromatograf ia HPLC (238 nm) de etapas de purificação de sinvastatina. O ácido de sinvastatina é lactonizado para sinvastatina anteriormente à injeção. Resultado a: extrato cru (extrato de células e caldo de cultura combinado) de YT2/pAW31 após completação da reação (99% de conversão de ácido de MJ para ácido de sinvastatina). 0 pico a 6,80 é o DMB-S-MMP; Resultado b: Amostra crua após lavagem com volume igual de hexano para remoção de DMB-S-MMP não reagido e precipitação; Resultado c: Sinvastatina purificada após lavagem com dH₂O e solubilização em ACN. O pequeno pico observado aos 6, 7 minutos é ácido de sinvastatina que não foi totalmente lactonizado (~ 1%) .

Figura 18. As estruturas químicas de ácido de lovastatina, ácido de monacolina J e ácido de sinvastatina. A reação bio-catalítica estudada é a conversão enzimática de monacolina J para sinvastatina (seta cheia). A LovD é capaz de acilar regioseletivamente o grupo hidroxila C8. Dois processos semi-sintéticos de utilização comum são ilustrados com setas tracejadas.

Figura 19. Análise cinética de acilação catalisada por LovD de monacolina J para obtenção de sinvastatina com utilização de DMB-S-MMP como o tioéster de acila. O eixo de ordenadas (eixo-y) é expressado como conversão catalítica (V/Eo) (A) Cinética Michaelis-Menten de LovD como função de concentração de monacolina J, a uma concentração fixa de DMB-SMMP de 2 mM. Não foi observada inibição de substrato. Km (monacolina J) = 0,78 ± 0,12 mM. (B) Cinética MichaelisMenten de LovD como função de concentração de DMB-S-MMP, com uma concentração fixa de monacolina J de 2 mM. Km (DMBS-MMP) = 0,67 ± 0,04 mM. Em ambos os ensaios, o valor Kcat é estimado em 0,66 ± 0,03 min-1.

Figura 20. Fermentação de baixa densidade e biocatálise. A cepa de E. coli BL21(DE3)/pAW31 expressando LovD durante a noite foi concentrada 10X para um valor final OD600 de 22. Os substratos monacolina J e DMB-S-MMP foram adicionados para um concentrado final de 15 e 40 mM, respectivamente. A conversão foi acompanhada como função de tempo por análise de cromatografia HPLC. (A) Resultados de análise de cromatografia HPLC do estudo de decurso de tempo. Os picos marcados são 1: monacolina J (forma lactonizada); 2: DMB-S-MPA como resultado de hidrólise de DMB-S-MMP; 3: DMB-S-MMP; e 4: sinvastatina (forma lactonizada). (B) Conversão de monacolina J para sinvastatina em função do tempo. A conversão final às 24 horas foi de 99%. Os pontos de dados são valores ponderados de dois experimentos.

Figura 21. Fermentação de alta densidade e biocatálise. (A) Fermentação de lote alimentado (500 mL) com mídia F1 mínima. A um valor OD600 (círculos) de 5,93 (I), a temperatura da fermentação é reduzida para e mantida em RT. É adicionado IPPG para uma concentração final de 200 μΜ e a alimentação é iniciada e mantida a 0,08 mL/min. As concentrações efetivas de LovD em diferentes pontos da fermentação são medidas (quadrados) . (B) A taxa de conversão de monacolina J para sinvastatina por células em quatro diferentes pontos durante a fermentação (indicados por 1, 2, 3 e 4) na Figura 21A. As células são alternativamente feitas repousar mediante o deslocamento para 50 mM de HEPES, pH 7,9, ou não repousar sem alteração da mídia.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

As técnicas e procedimentos aqui descritos ou referidos são geralmente bem entendidos e de emprego comum com utilização de uma metodologia convencional por aqueles que são versados na técnica, tal como, por exemplo, as amplamente utilizadas metodologias de clonagem molecular descritas por Ausubel e outros em Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995). Conforme apropriado, os procedimentos envolvendo utilização de kits e reagentes disponíveis comercialmente são geralmente realizados de acordo com protocolos e/ou parâmetros definidos pelos fabricantes salvo indicação em contrário. Salvo quando definido de outra forma, todos os termos da técnica, notações e outra terminologia científica aqui utilizados deverão ter os significados normalmente entendidos por aqueles que são versados na técnica à qual esta invenção pertence. Em alguns casos, termos com significados de entendimento comum são aqui definidos para maior clareza e/ou para pronta referência, e a inclusão dessas definições não deverá ser necessariamente interpretada como representando uma diferença substancial relativamente ao que é geralmente entendido na técnica.

As definições de certos termos são fornecidas abaixo.

Lovastatina (Mevacor) é um policetídeo fúngico produzido por Aspergillus terreus (vide, por exemplo, A. W. Alberts, J. e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. , 1980, 77, 3957-3961 e A. Endo, J. Antibiot. 1980, 33, 334336; e J. K. Chan, e outros, <J. Am. Chem. Soe. 1983, 105, 3334-3336; Y. Yoshizawa, e outros, J. Am. Chem. Soc. 1994, 116, 2693-2694). É um composto farmaceuticamente importante devido a suas potentes atividades inibidoras de hidroximetilglutarii coenzima A reductase (HMGR), a etapa de limitação de taxa de bio-sintese de colesterol, sendo portanto amplamente utilizada no tratamento de hiperlipidemia, hipercolesterolemia, e similares. A lovastatina é igualmente referida como Mevacor.

Sinvastatina é um análogo de lovastatina. É preferida relativamente à lovastatina devido à ausência de efeitos colaterais adversos e sua elevada absorção no estômago. Além disso, foi relatado que a sinvastatina previne e reduz o risco de doença de Alzheimer (AD) mediante retardo da produção de proteína β-amilóide Ab42 associada à AD. É conhecido na técnica que a sinvastatina pode ser preparada sinteticamente por metilação direta da cadeia lateral de 8'-metilbutirilóxi de lovastatina de fórmula utilizando um haleto de metila na presença de uma base de amida metálica. A etapa de C-metilação tem que ser realizada em temperaturas extremamente baixas (-75 até -30° ) com utilização de uma base forte sob condição anidra o que é difícil de realizar na produção em massa (vide, por exemplo, a patente norte-americana n° US 5.393.893, a patente norte-americana n° US 4.582.915, a patente norteamericana n° US 5.763.646, a patente norte-americana n° US 5.763.653, a patente européia n° EP 299.656 e a Publicação de Patente Internacional n° WO 99/45003, cujos conteúdos são aqui incorporados a título de referência) . Outros métodos de produção sintética de sinvastatina são igualmente conhecidos na técnica. Por exemplo, a lovastatina pode ser hidrolisada com uma quantidade excessiva de hidróxido de litio para remoção da cadeia lateral de 2-metilbutiril e para simultaneamente abrir seu anel de lactona de 6 elementos para produção de um ácido de triol. 0 composto de ácido de triol pode então ser aquecido para obtenção de uma lactona de diol. O grupo hidróxi no anel de lactona da lactona de diol pode ser protegido para obtenção de um éter de terc-butildimetilsilil e em seguida o grupo hidróxi em C8 do sistema de anel de hexahidronaftaleno pode ser acilado com ácido 2,2dimetilbutaônico na presença de diciclohexil carbodiimida, ou 2,2-dimetil cloreto para produção de um composto. O grupo protetor de t-butildimetilsilil do composto pode então ser removido na etapa final com utilização de fluoreto de tetrabutilamônio para produção de sinvastatina (vide, por exemplo, a patente norte-americana n° US 4.444.784, cujo conteúdo é aqui incorporado a titulo de referência).

Derivados de lovastatina conforme aqui indicados compreendem derivados de lovastatina ou precursores, por exemplo, pravastatina, huvastatina, sinvastatina, ou tetraol de pravastatina hidrolisada. Variantes de monacolina J significa variantes de monacolina J divulgadas na técnica, por exemplo, tetraol de pravastatina hidrolisada ou 6-hidroxil-6-desmetilmonacolina J e similares. Em certas configurações da invenção Variantes de monacolina J refere-se a compostos de monacolina J com substituições na posição C6 na Figura 2. Na descrição de compostos tais como sinvastatina, pravastatina, monacolina J e variantes, etc., aqueles que são versados na técnica poderão entender que esta linguagem pretende abranger estes compostos bem como os sais destes compostos (por exemplo, sais farmaceuticamente aceitáveis conhecidos na técnica). Por exemplo, conforme é sabido na técnica, a sinvastatina pode ocorrer tanto em uma forma de ácido livre quanto na forma de sais de sódio, potássio ou amônio de sinvastatina, e outros sais derivados de elementos alcalinos terrosos ou outros sais metálicos.

Aspergillus terreus ou A. terreus é um ascomiceto filamentoso normalmente encontrado no solo. São conhecidas na técnica várias cepas de A. terreus, por exemplo aquelas depositadas por exemplo com os números de depósito ATCC 20542 e ATCC 20541.

Conforme é conhecido na técnica, os genes relacionados com a bio-sintese de metabólicos secundários de fungos filamentosos podem formar um agrupamento no genoma fúngico e são referidos como agrupamentos genéticos (gene clusters). Por exemplo, um agrupamento genético produtor de lovastatina pode referir um grupo de genes que produzem lovastatina, o grupo de genes compreendendo, LovA, um P450I, LovC, uma deshidrogenase; LovD, uma esterase e aciltransferase; e LovF, um ScPKS ou LDKS. Foi anteriormente determinado que cada um destes quatro genes (LovA, LovC, LovD, e LovF) é requerido para a síntese de lovastatina (vide, por exemplo, a patente norte americana n° US 6.943.017, cujo conteúdo é aqui incorporado a título de referência). O LovF (gene de LDKS) é caracterizado como um gene de policetídeo sintase. LovD é um gene semelhante a esterase putativa/carbóxipeptidase. A perturbação do gene LovF foi realizada anteriormente (vide, por exemplo, a patente norte-americana n° US 6.943.017, cujo conteúdo é aqui incorporado a título de referência). O LovD interage com LovF para produzir lovastatina; entretanto, a interação LovD-LovF não é necessária para produção de sinvastatina. Adicionalmente, um outro gene no agrupamento de genes produtores de lovastatina é o LovE, que é um dedo de Zn que pode regular a transcrição dos outros genes. 0 agrupamento genético produtor de lovastatina compreende igualmente LovB (gene de NPKS).

LDKS ou gene de LDKS refere-se à proteína codificada pelo gene LovF, um membro do agrupamento de genes produtores de lovastatina. LDKS significa lovastatina dicetídeo sintase. LovF é o gene que produz LDKS. LovF é também o gene que produz proteína LovF. Gene de LDKS também se refere ao gene que produz LDKS. Na síntese de lovastatina, a LDKS sintetiza a cadeia lateral de cinco unidades de carbono de monacolina J mediante condensação entre uma acetil-CoA e uma malonil-CoA. O dicetídeo condensado sofre metilação e conformação redutora pelos domínios de LovF individuais para produzir como resultado um tioéster de a-S-metilbutiril ligado covalentemente à ramificação de fosfopanteteina nos domínios de proteína transportadora de acila (ACP) do LovF.

LovD aciltransferase conforme é aqui utilizado refere-se a polipeptídeos tais como o polipeptídeo LovD de A. terreus (por exemplo, SEQ ID NO: 1) capazes de utilizar um tioéster de acila para acilar regioespecificamente o grupo hidroxila C8 da monacolina J para produção de sinvastatina. Conforme é igualmente aqui divulgado, esta enzima LovD pode adicionalmente utilizar um tioéster de acila para acilar regioespecificamente o grupo hidroxila C8 de tetraol de pravastatina hidrolisada para produção de huvastatina.

As LovD aciltransferases incluem enzimas homólogas de LovD polipeptídeo de A. terreus (por exemplo, SEQ ID NO: 1) que podem ser encontradas por exemplo, mas não limitativamente, em agrupamentos genéticos de policetídeos fúngicos. Por exemplo, a técnica comprova que Mlc na via de bio-síntese de compactina catalisa a reação de transacilação idêntica (vide, por exemplo, Y. Abe, T. e outros, Mol Genet Genomics. 2002, 261, 636-646), ao passo que uma aciltransferase na via de squalestatina pode catalisar uma reação similar entre um tioéster de tetracetídeo com ligação a ACP e um aglicon (vide, por exemplo, R. J. Cox, F. e outros, Chem Commun (Camb) 2004, 20, 2260-2261) . A seqüência de aminoácidos de LovD polipeptídeo de A. terreus (por exemplo, SEQ ID NO: 1) assemelha-se às enzimas de β-lactamase tipo C, que catalisa a inativação hidrolítica da classe de β-lactama de antibióticos (vide, por exemplo, E. Lobkovsky, E. M. e outros, Biochemistry, 1994, 33, 6762-6772 e A. Dubus, D. e outros, Biochem. <J. 1993, 292, 537-543) . O alinhamento do LovD polipeptídeo de A. terreus (por exemplo, SEQ ID NO: 1) com a P99 lactamse de enterobacter cloacae (vide, por exemplo, S. D. Goldberg, e outros, Protein Sei. 2003, 12, 1633-1645) demonstra uma moderada homologia de sequência, incluindo resíduos de sítios ativos potencialmente conservados, tais como os catalíticos Ser76, Lys79, Tyrl88, e Lys315 (vide, por exemplo, S. D. Goldberg, e outros, Protein Sei. 2003, 12, 1633-1645).

As LovD aciltransferases podem igualmente referirse tanto a enzimas obtidas por engenharia genética quanto enzimas de ocorrência natural que são relacionadas com o LovD polipeptídeo de A. terreus (por exemplo, SEQ ID NO: 1) em termos de sequência porém contendo leves diferenças de aminoácidos (por exemplo, mutações de substituição de 1-10 aminoácidos). A sinvastatina, por exemplo, pode ser produzida de enzimas de ocorrência natural que são similares ao LovD polipeptídeo de A. terreus (por exemplo, SEQ ID NO: 1) em termos de sequência (por exemplo, a M1CH do agrupamento de compactina). “LovD aciltransferases pode igualmente referir mutantes de LovD polipeptídeo de A. terreus (SEQ ID NO: 1) . É conhecido na técnica que podem ser criados mutantes por técnicas convencionais de biologia molecular para produção, por exemplo, de mutantes de SEQ ID NO: 1 que aperfeiçoam eficiências catalíticas ou similares.

Por exemplo, os presentes requerentes utilizam atualmente abordagens racionais e orientadas para evolução para aperfeiçoamento das taxas de produção catalítica de LovD de A. terreus. Tipicamente esses mutantes apresentarão uma similaridade de seqüência de 50%-99% relativamente à SEQ ID NO: 1. Neste contexto, a expressão enzima homóloga de LovD inclui um LovD polipeptídeo possuindo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% ou 99% de identidade de seqüência com a seqüência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 1, em que o polipeptídeo tem capacidade para utilizar um tioéster de acila para acilar regioespecificamente o grupo hidroxila 08 da monacolina J para produzir sinvastatina e/ou utilizar um tioéster de acila para acilar regioespecificamente o grupo hidroxila C8 de tetraol de pravastatina hidrolisada para produção de huvastatina. Esses mutantes são prontamente produzidos e são então identificados em ensaios gue observam a produção de um composto desejado tal como a sinvastatina (tipicamente utilizando LovD polipeptídeo de A. terreus (por exemplo, SEQ ID NO: 1) como controle) . Estes mutantes podem ser utilizados de acordo com os métodos da presente invenção para produção de sinvastatina ou huvastatina, por exemplo.

O termo heterólogas relacionado com seqüências de ácido nucléico tais como seqüências de codificação e seqüências de controle indica seqüências que não são normalmente associadas com uma região de um constructo recombinante, e/ou não são normalmente associadas com uma célula especifica. Desta forma, uma região heteróloga de um constructo de ácido nucléico pode ser um segmento identificável de ácido nucléico contido ou acoplado a uma outra molécula de ácido nucléico que não é encontrado em associação com a outra molécula na natureza. Por exemplo, uma região heteróloga de um constructo pode incluir uma seqüência de codificação flanqueada por seqüências não encontradas em associação com a seqüência de codificação na natureza. Similarmente, uma célula hospedeira transformada com um constructo, que não se encontra normalmente presente na célula hospedeira, pode ser considerada heteróloga (vide, por exemplo, as patentes norte-americanas de números US 5.712.146, US 6.558.942, US 6.627.427, US 5.849.541, cujos conteúdos são aqui incorporados a título de referência). Por exemplo, um constructo com genes Lov pode ser isolado e expressado em células hospedeiras de fermentos ou fungos não produtores de lovastatina, e pode dessa forma ser produzida lovastatina (vide, por exemplo, as patentes norte americanas de números US 6.391.583 e US 6.943.017, cujos conteúdos são aqui incorporados a título de referência). Como outro exemplo, procariotos tais como bactérias podem igualmente ser células hospedeiras, conforme é conhecido na técnica. Os genes de fungos podem também ser clonados para um vetor de expressão para expressão em procariotos (vide, por exemplo, a patente norte-americana n° US 5.849.541, cujo conteúdo é aqui incorporado a título de referência).

Um procarioto tal como E. coli pode ser utilizado como hospedeiro heterólogo. Um plasmídeo pode ser construído com um gene de interesse e o plasmídeo pode ser transformado em E. coli. O gene de interesse pode ser traduzido (translated) e a proteína derivada do gene de interesse pode ser subseqüentemente purificada. Este método de expressão e purificação de proteína é conhecido na técnica. Por exemplo, éxons de LovD de A. terreus podem ser individualmente amplificados do DNA genômico de A. terreus e ligados entre si (spliced) para obtenção de uma fase de leitura aberta contínua utilizando PCR de extensão de sobreposição de ligação splice. Podem ser introduzidos sítios de restrição, e a cassete genética pode ser ligada a um vetor para obtenção de um constructo de expressão que pode ser transformado em E. coli. Dessa forma, o E. coli pode ser utilizado como hospedeiro heterólogo para expressão de genes de A. terreus. O E. coli pode ser cocultivado com uma outra cepa que produz um outro substrato de interesse. Adicionalmente, podem ser adicionados substratos a esta cultura ou co-cultura. A expressão heteróloga dos genes de bio-síntese de lovastatina é conhecida na técnica (vide, por exemplo, as patentes norteamericanas de números US 6.391.583 e US 6.943.017, cujos conteúdos são aqui incorporados a título de referência).

Como outro exemplo, certos policetídeos, tais como policetídeos de fungos, ou outros organismos, podem ser expressados heterologamente em E. coli, fermento, e outros organismos hospedeiros. Estes organismos hospedeiros podem ser suplementados com outros substratos, visto que podem requerer tanto a expressão heteróloga de um PKS desejado quanto as enzimas que produzem pelo menos algumas das moléculas de substrato requeridas pelo PKS (vide, por exemplo, a patente norte-americana n° US 7.011.959, cujo conteúdo é aqui incorporado a título de referência). Similarmente, genes de Lov de fungos podem ser expressados em E. coli ou outra bactéria, e estas bactérias hospedeiras podem ser suplementadas com outros substratos, tal como acila-SNAC ou outros grupos doadores de acila. Estes grupos doadores de acila podem ser permeáveis para células, e podem ingressar na célula bacteriana.

Vetor de expressão refere-se a um ácido nucléico que pode ser introduzido em uma célula hospedeira. Conforme é conhecido na técnica, um vetor de expressão pode ser mantido em uma célula de forma permanente ou transiente, alternativamente como parte do DNA cromossômico ou outro DNA na célula ou em qualquer compartimento celular, tal como um vetor de replicação no citoplasma. Um vetor de expressão também compreende um promotor que aciona a expressão de um RNA, que é tipicamente traduzido para um polipeptídeo na célula ou extrato celular. Por exemplo, promotores adequados para inclusão nos vetores de expressão de acordo com a invenção incluem aqueles que funcionam em células hospedeiras eucarióticas ou procarióticas. Os promotores podem compreender seqüências regulatórias que permitem a regulação de expressão relativa ao crescimento da célula hospedeira ou que causam a ativação ou desativação da expressão de um gene em resposta a um estimulo químico ou físico. Para E. coli e certas outras células hospedeiras bacterianas, os promotores derivados de genes para enzimas bio-sintéticas, enzimas que conferem resistência a antibióticos, e proteínas de fagos podem ser utilizados e incluem, por exemplo, os promotores de galactose, lactose (lac), maltose, triptofan (trp), betalactamase (b/a) , bacteriófago lambda PL, e T5. Adicionalmente, podem igualmente ser utilizados promotores sintéticos tais como o promotor tac (patente norteamericana n° US 4.551.433). Para vetores de expressão de E. coli, é útil incluir uma origem de replicação de E. coli, tal como de pUC, plP, pll, e pBR. Para tradução eficiente de RNA para proteína, o vetor de expressão também contém tipicamente uma seqüência de sítio de ligação de ribossomo posicionada a montante do códon de início da seqüência de codificação do gene a ser expressado. Outros elementos, tais como intensificadores, seqüências de sinal de secreção, seqüências de término de transcrição, e um ou mais genes marcadores mediante os quais as células hospedeiras contendo os vetores podem ser identificadas e/ou selecionadas, podem igualmente encontrar-se presentes em um vetor de expressão. Os marcadores selecionáveis, isto é, genes que conferem sensibilidade ou resistência a antibióticos, podem ser utilizados e conferem um fenótipo selecionável em células transformadas quando as células são cultivadas em uma mídia seletiva apropriada. Por exemplo, um vetor de expressão contendo o agrupamento genético Lov ou partes do mesmo pode ser introduzido em um hospedeiro heterólogo, tal como E. coli. Assim, os vetores de expressão recombinantes podem conter pelo menos um sistema de expressão, que por sua vez pode ser composto de pelo menos uma parte de seqüências de Lov e/ou outras seqüências de codificação genética bio-sintética operacionalmente ligadas a um promotor e opcionalmente seqüências de término que operam para efetuar a expressão da seqüência de codificação em células hospedeiras compatíveis.

Uma seqüência de codificação pode ser uma seqüência que codifica um gene específico, tal como um gene do agrupamento genético Lov, por exemplo. Uma seqüência de codificação é uma seqüência de ácido nucléico que é transcrita (no caso de DNA) e traduzida (no caso de mRNA) para um polipeptídeo in vitro ou in vivo quando sob controle de seqüências regulatórias apropriadas. Os limites da seqüência de codificação são determinados por um códon de início na terminação 5' (amino) e um códon de final de tradução na terminação 3' (carbóxi). Uma seqüência de término de transcrição será normalmente localizada em 3' para a seqüência de codificação.

As seqüências de controle de DNA referem coletivamente seqüências promotoras, sítios de ligação de ribossomos, sinais de poliadenilação, seqüências de término de transcrição, domínios regulatórios de montante, intensificadores, e similares, que proporcionam coletivamente a transcrição e tradução de uma seqüência de codificação em uma célula hospedeira.

Ligado operacionalmente refere-se a um arranjo de elementos em que os componentes assim descritos são configurados para realizarem sua função usual. Desta forma, as seqüências de controle ligadas operacionalmente a uma seqüência de codificação são capazes de efetuar a expressão da seqüência de codificação. Não é necessário que as seqüências de controle sejam contíguas à seqüência de codificação, desde que funcionem dirigindo a expressão das mesmas.

Organismo produtor de lovastatina refere-se a uma ampla variedade de diferentes organismos conhecidos na técnica como produzindo lovastatina. Estes organismos que produzem lovastatina podem ser modificados para produção de sinvastatina de acordo com os métodos da presente invenção. A. terreus constitui um exemplo de um organismo produtor de lovastatina. Microorganismos diversos de A. terreus que foram relatados como produtores de lovastatina (mevinolina) incluem espécies de Monascus, por exemplo, M. ruber, M. purpureus, M. pilosus, M. vitreus, M. pubigerus, bem como as espécies Penicillium, Hypomyces, Doratomyces, Phorna, Eupenicillium, Gymnoascus, e Trichoderma, Pichia labacensis, Candida cariosilognicola, Aspergillus oryzea, Doratomyces stemonitis, Paecilomyces virioti, Penicillum citrinum, Penicillum chrysogenum, Scopulariopsis brevicaulis e Trichoderma viride (vide, por exemplo, a patente norte-americana n° US 6.391.583; e os trabalhos de Juzlova e outros, J. Ind. Microbiol. 16:163-170; GundeCimerman e outros, FEMS Microbiol. Lett. 132:39-43 (1995); e Shindia e outros, Folio Microbiol. 42:477-480 (1977), cujos conteúdos são aqui incorporados a título de referência).

Organismos não produtores de lovastatina, conforme a expressão é aqui utilizada, refere um número de organismos que não produzem lovastatina na ausência de manipulação humana (por exemplo, E. coli). Estes organismos podem ser induzidos a produzir LovD, ou podem ser cultivados na presença de LovD para produção de lovastatina ou sinvastatina pelos métodos da presente invenção, por exemplo.

A. terreus possuindo uma perturbação no gene de LDKS compreende um A. terreus sem o gene de LDKS, possuindo um gene de LDKS que sofreu mutação, possuindo um gene de LDKS inativado (knocked-out) , possuindo um gene de LDKS deletado, possuindo um gene de LDKS cuja expressão foi perturbada, ou possuindo um gene de LDKS perturbado. A. terreus possuindo uma perturbação no gene de LDKS compreende um A. terreus possuindo um gene de LDKS que foi silenciado por métodos conhecidos na técnica. A terreus possuindo uma perturbação no gene de LDKS refere-se a um A. terreus que não pode produzir LDKS funcional. A terreus possuindo uma perturbação no gene de LDKS pode igualmente referir-se a um A. terreus que produz LDKS funcional. O LDKS pode ser inativado ou inibido por métodos conhecidos na técnica tais como protocolos de inativação (“knock out) de genes. A quantidade de LDKS presente pode ser reduzida por métodos conhecidos na técnica. Outros métodos de inibição, inativação, ou perturbação da proteína ou gene de LDKS incluem, sem limitações, antisense, siRNA, RNAi ou interferência de RNA conforme é conhecido na técnica. “Gene de LDKS, conforme é aqui utilizado pode igualmente referir-se ao gene de LovF. A perturbação do gene de LovF é conhecida na técnica (vide, por exemplo, a patente norteamericana n° US 6.391.583, cujo conteúdo é aqui incorporado a título de referência. “A. terreus possuindo uma perturbação no gene de LDKS é tipicamente um organismo geneticamente manipulado. A manipulação genética de A. terreus é conhecida na técnica. A perturbação genética dos genes de Lov em A. terreus foi realizada anteriormente (vide, por exemplo, as patentes norte-americanas de números US 6.391.583 e US 6.943.017, cujos conteúdos são aqui incorporados a título de referência). A perturbação específica do gene de LovF (produzindo LDKS) em A. terreus foi realizada anteriormente (vide, por exemplo, a patente norte-americana n° US 6.943.017, cujo conteúdo é aqui incorporado a título de referência). A perturbação do gene de LovF pode ocorrer por outros métodos conforme é conhecido na técnica. O A. terreus possuindo uma perturbação no gene de LDKS pode encontrar-se em uma mistura de fermentação. Podem ser adicionados substratos à mistura de fermentação de um A. terreus possuindo uma perturbação no gene de LDKS para produção de análogos de lovastatina.

Um componente ou método para aumento da produção de sinvastatina conforme é aqui utilizado refere-se a um composto ou substrato, sintético ou natural, que aumenta a produção de certos intermediários para aumentar a quantidade de sinvastatina produzida para aumento de escala de síntese e síntese de larga escala de sinvastatina. Os componentes e métodos para aumento da produção de certos intermediários são conhecidos na técnica. Por exemplo, são conhecidos na técnica compostos que são adicionados à mistura de fermentação para aumento da quantidade de intermediários, tal como monacolina J, na produção de lovastatina (vide, por exemplo, a patente norte-americana n° US 6.943.017, cujo conteúdo é aqui incorporado a título de referência). Alguns destes intermediários, tal como a monacolina J, podem igualmente ser utilizados na produção de sinvastatina. Compostos para aumento da produção de monacolina J podem ser assim adicionados para aumentarem a produção de sinvastatina. Por exemplo, compostos para aumento da produção de monacolina J podem ser adicionados diretamente à mistura de fermentação para aumento da quantidade de sinvastatina produzida. Um exemplo de um componente para aumento da produção de sinvastatina é um clone contendo o segmento D4B do agrupamento de genes de produção de lovastatina que se encontra depositado com o número de acesso ATCC 98876. Este clone pode ser transformado em um organismo não produtor de lovastatina para produção de monacolina J conforme é conhecido na técnica. Este clone pode igualmente ser transformado em um organismo produtor de lovastatina para aumento da produção de monacolina J com consequente aumento da produção de sinvastatina. Adicionalmente, um outro exemplo de um componente para aumento da produção de sinvastatina é o gene de dedo-de-zinco/LovE, que pode ser transformado em um organismo produtor de lovastatina para aumento da produção de sinvastatina. Preferencialmente, este organismo produtor de lovastatina terá uma perturbação no gene de LDKS (vide, por exemplo, a patente norte-americana n° US 6.391.583, cujo conteúdo é aqui incorporado a titulo de referência). Os componentes e métodos para aumento da produção de sinvastatina podem referir-se a muitos outros e não se encontram limitados aos exemplos listados acima.

Conforme é aqui divulgado, um doador de acila ou transportador de acila é um composto possuindo um grupo acila que pode ser transferido para sinvastatina e/ou um precursor de sinvastatina ou um composto associado. Tipicamente, doador de acila ou transportador de acila é um tioéster de acila que doa uma fração acila ao grupo hidroxila C8 da monacolina J. Uma ampla variedade desses agentes são conhecidos na técnica sendo aqui adicionalmente demonstrados como tendo esta atividade (vide, por exemplo, os tioésteres de acila ilustrativos na Tabela 1) . Adicionalmente àqueles que são conhecidos na técnica e adicionalmente ilustrados pela presente divulgação como tendo esta atividade, qualquer potencial transportador/doador de acila conhecido na técnica (ou sintetizado de novo) possuindo uma capacidade para acilar C8 de monacolina J para produzir sinvastatina poderá ser facilmente identificado por experimentos comparativos com os doadores de acila aqui divulgados (por exemplo, acilaSNAC). Conforme é conhecido na técnica, um grupo acila pode ter a fórmula RCON; em que R pode ser uma alquila ou arila e N pode ser -Cl, -OOCR, -NH2, -OR, ou similar. Compostos que possuem um grupo acila incluem, sem limitação, cloretos de ácidos, ésteres, amidas, ou anidridos e similares. Estes compostos podem ser alifáticos ou aromáticos, substituídos ou não substituídos. Exemplos dos mesmos incluem, sem limitações, cloreto de benzoíla, anidrido benzoico, benzamida, ou benzoato de etila, e similares. Outros exemplos de doadores de acila incluem, sem limitações, adimetilbutiril-SNAC, tioésteres de acila, acila-CoA, butiril-CoA, benzoil-CoA, acetoacetil-CoA, βhidroxilbutiril-CoA, malonil-CoA, palmitoil-CoA, tioésteres de butirila, tioésteres de N-acetilcisteamina (SNAC), metil-tioglicolato (SMTG), benzoil-SNAC, benzoil-SMTG, ou a-S-metilbutiril-SNAC). Estes compostos podem ser produzidos naturalmente ou sinteticamente, e em alguns casos podem penetrar a membrana celular. Alguns destes compostos podem ser adicionados a LovD na presença de monacolina J para produção de sinvastatina, por exemplo.

Acila-SNAC conforme é aqui utilizado refere-se a cc-dimetilbutiril-SNAC. Conforme é conhecido na técnica, a acila-SNAC pode penetrar em membrana celular em condições in vivo. A LovD pode utilizar acila-SNAC como substrato para iniciar a reação de monacolina J para sinvastatina para acilar regioespecificamente o grupo hidroxila C8 da monacolina J. A acila-SNAC pode doar seu grupo acila para a LovD.

CONFIGURAÇÕES TÍPICAS DA INVENÇÃO

Aqueles que são versados na técnica poderão entender que a divulgação aqui proporcionada permite que pessoas versadas na técnica produzam uma ampla variedade de configurações da invenção. Uma configuração tipica da invenção consiste em um método de produção de sinvastatina mediante combinação mútua de monacolina J; um tioéster de acila doador de uma fração acila para o grupo hidroxila C8 de monacolina J na presença de LovD aciltransferase; e LovD aciltransferase; deixando-se subsequentemente a LovD aciltransferase utilizar um grupo acila do tioéster de acila para acilar regioseletivamente o grupo hidroxila C8 da monacolina J; sendo dessa forma produzida sinvastatina. Em configurações ilustrativas da invenção, a LovD aciltransferase tem a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2. Uma configuração associada da invenção consiste em um método de produção de sinvastatina compreendendo as etapas de combinação mútua de lovastatina; um tioéster de acila doador de uma fração acila ao grupo hidroxila C8 de monacolina J na presença de LovD aciltransferase; e LovD aciltransferase. Neste método associado, a LovD aciltransferase é então deixada hidrolisar lovastatina para monacolina J; e subsequentemente utilizar um grupo acila do tioéster de acila para acilar regioseletivamente o grupo hidroxila C8 da monacolina J; sendo dessa forma produzida sinvastatina. Em certas configurações, a sinvastatina é produzida in vitro na ausência de um organismo isolado.

Em algumas configurações da invenção, a monacolina J; o tioéster de acila e a LovD aciltransferase são combinados em uma mídia de fermentação na presença de um organismo isolado que produz a LovD aciltransferase e em que adicionalmente o organismo é Escherichia coli, Aspergillus terreus, Monascus ruber, Monascus purpureus, Monascus pilosus, Monascus vitreus, Monascus pubigerus, Candida cariosilognicola, Aspergillus oryzea, Doratomyces stemonitis, Paecilomyces virioti, Penicillum citrinum, Penicillum chrysogenum, Scopulariopsis brevicaulis ou Trichoderma viride. Opcionalmente, o organismo isolado é Aspergillus terreus que expressa polipeptídeo de LovD de SEQ ID NO: 1. Em certas configurações, o Aspergillus terreus não expressa polipeptídeo de LovF de SEQ ID NO: 3. Em certas configurações da invenção, os polipeptídeos de expressão tais como aqueles das SEQ ID NOs: 3 e 4 são reduzidos para pelo menos 90, 95, ou 99% de sua atividade endógena. Alternativamente, o organismo pode consistir em Escherichia coli que expressa polipeptídeo de LovD de SEQ LD NO: 1. Em certas configurações, a Escherichia coli não expressa polipeptídeo bioH de SEQ ID NO: 4. Conseqüentemente, o hospedeiro pode alternativamente ser um hospedeiro que produz uma LovD aciltransferase endogenamente ou alternativamente um hospedeiro heterólogo em que o gene de LovD aciltransferase foi introduzido no organismo, por exemplo, através de uma tecnologia de clonagem conhecida na técnica e aqui adicionalmente discutida. em uma configuração típica, o hospedeiro heterólogo que expressa LovD aciltransferase é uma bactéria, um fermento, ou um fungo conhecido na técnica como sendo útil para tais propósitos.

Conforme é discutido mais detalhadamente abaixo, o organismo isolado pode ser cultivado em uma de uma variedade de condições de fermentação conhecidas na técnica, e as condições exatas são selecionadas, por exemplo, com base em parâmetros de fermentação associados a um crescimento otimizado de um organismo específico utilizado em uma configuração da invenção (vide, por exemplo, Miyake e outros, Biosci. Biotechnol. Biochem., 70(5): 1154-1159 (2006) e Hajjaj e outros, Applied and Environmental Microbiology, 67: 2596-2602 (2001), cujos conteúdos são aqui incorporados a título de referência) .

Tipicamente, o organismo é cultivado a uma temperatura entre 30-40° C, durante um periodo de tempo de entre pelo menos 4 até pelo menos 48 horas. Tipicamente, os organismos são cultivados com um pH entre 6,5-8,5. Em certas configurações da invenção, o pH da midia de fermentação pode ser 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8,0 ou 8,1. Em configurações ilustrativas, o organismo é cultivado em uma midia de fermentação compreendendo midia LB, El ou TB.

Opcionalmente, a monacolina J que é combinada com os outros constituintes nos métodos de acordo com a invenção é produzida por um organismo isolado dentro da midia de fermentação, por exemplo, um dos organismos listados acima que também produz a LovD aciltransferase. Alternativamente, a monacolina J que é combinada com os outros constituintes nos métodos de acordo com a invenção é produzida por um organismo diferente que produz este composto que é adicionado à midia de fermentação e cultivado juntamente com o organismo que produz a LovD aciltransferase. Em uma outra configuração da invenção, a monacolina J é derivada de uma fonte exógena e é adicionada à mistura de fermentação. Opcionalmente, o método de acordo com a invenção produz uma composição de matéria compreendendo 0%-l% da monacolina J que foi inicialmente adicionada à combinação. Em certas configurações da invenção, o método produz como resultado uma conversão para sinvastatina de pelo menos 95% da monacolina J adicionada à combinação .

Em configurações típicas da invenção, o tioéster de acila que pode doar uma fração acila para o grupo hidroxila C8 da monacolina J na presença de LovD aciltransferase é derivado de uma fonte exógena (por exemplo, um processo de síntese química) e é adicionado à mistura de fermentação. São aqui divulgados uma variedade desses tioésteres de acila. Tipicamente, o tioéster de acila é um tioéster de butirlila, um tioéster de M-acetilcisteamina ou um tioéster de metil-tioglicolato. Opcionalmente, o tioéster de acila compreende frações de grupo acila de extensão de cadeia média (C3-C6). Em certas configurações da invenção, o tioéster de acila é capaz de cruzar as membranas celulares de células de Escherichia coli ou Aspergillus terreus cultivadas em uma mídia de fermentação. Tipicamente, o tioéster de acila é selecionado do grupo que consiste em adimetilbutiril-S-metil-mercaptopropionato (DMB-S-MMP), dimetilbutiril-S-etil mercaptopropionato (DMB-S-EMP) e dimetilbutiril-S-metil tioglicolato (DMB-S-MTG) e dimetilbutiril-S-metil mercaptobutirato (DMB-S-MMB). Em uma configuração ilustrativa, o tioéster de acila é um adimetilbutiril-S-metil-mercaptopropionato que é combinado em mídia de fermentação em uma faixa de concentração de 1 mM-100 mM.

Certas configurações dos métodos para produção de sinvastatina incluem adicionalmente etapas para purificação de sinvastatina pela combinação. Por exemplo, algumas configurações da invenção incluem pelo menos uma etapa de purificação compreendendo lise de células de um organismo isolado presente na combinação. As configurações podem incluir pelo menos uma etapa de purificação compreendendo centrifugação de células ou lisados de células de um organismo isolado presente na combinação. As configurações podem incluir pelo menos uma etapa de purificação compreendendo precipitação de um ou mais compostos presentes na combinação. As configurações podem incluir pelo menos uma etapa de purificação compreendendo filtração de um ou mais compostos presentes na combinação. As configurações podem incluir pelo menos uma etapa de purificação compreendendo uma análise de cromatografia liquida de alto desempenho (High Performance Liquid Chromatography - HPLC) de um ou mais compostos presentes na combinação.

A divulgação aqui provida ilustra que uma variedade de permutações destes métodos podem ser utilizadas para produção de sinvastatina e huvastatina e similares. Em certas configurações da invenção, por exemplo, o organismo hospedeiro produz o tioéster de acila e/ou a monacolina J. Alternativamente, o tioéster de acila e/ou a monacolina J é/são adicionados ao organismo como parte do processo para produção de sinvastatina. Os métodos podem compreender adicionalmente a adição de um vetor de expressão possuindo um ou mais genes de A terreus que são conhecidos como facilitadores da produção de sinvastatina e/ou huvastatina ou similares, tais como os genes que codificam a SEQ ID NO: 1 ou a SEQ ID NO: 2 e transformação do mesmo em um hospedeiro heterólogo, em que o polipeptídeo com atividade aciltransferase é assim expressado. Em uma outra configuração, a monacolina J pode ser produzida de um hospedeiro heterólogo.

Uma outra configuração da invenção consiste em um método de produção de sinvastatina a partir de monacolina J em um organismo que expressa um gene de LovD aciltransferase compreendendo a co-cultura deste primeiro organismo que expressa a LovD aciltransferase com um segundo organismo (por exemplo, em uma mistura de fermentação) que produz o tioéster de acila e/ou a monacolina J, em que o tioéster de acila interage com o produto de gene de LovD aciltransf erase na presença de monacolina J para produção de sinvastatina. Opcionalmente, o primeiro organismo é um organismo que não produz lovastatina naturalmente (por exemplo, E. coli transduzido com o gene de LovD aciltransferase) . Alternativamente, o primeiro organismo é um organismo produtor de lovastatina tal como A. terreus (por exemplo, A. terreus possuindo um gene de LDKS/LovF inativado). O método pode compreender adicionalmente a adição de um ou mais componentes exógenos à mistura de fermentação para aumentar a produção de precursores de sinvastatina tal como monacolina J para dessa forma aumentar a produção de sinvastatina.

Os métodos de acordo com a invenção podem adicionalmente compreender a adição de componentes adicionais à mistura de fermentação para aumentar a produção de monacolina J e para dessa forma aumentar a produção de sinvastatina e/ou huvastatina. Como uma configuração ilustrativa deste método, o componente pode ser um clone com o gene de LovE, em que o organismo é transformado com o clone e a LovE é traduzida e dessa forma a produção de sinvastatina é aumentada. Como outra configuração ilustrativa deste método, o componente pode ser um clone contendo o segmento D4B do genoma de A. terreus (número de acesso ATCC 98876), em que o organismo é transformado com o clone para dessa forma ser aumentada a produção de monacolina J.

Uma outra configuração ainda da invenção consiste em um método para conversão de monacolina J em sinvastatina in vitro ou in vivo na presença de um tioéster de acila exógeno. Preferencialmente, o tioéster de acila é capaz de penetrar a membrana celular. Uma outra configuração ainda da invenção consiste em um método de conversão de monacolina J em sinvastatina diretamente dentro do organismo na presença do tioéster de acila em que o organismo produz LovD. Em uma configuração ilustrativa da invenção, o organismo é um A. terreus possuindo um gene LDKS perturbado.

Uma outra configuração ainda da invenção consiste em um produto de sinvastatina obtido por um processo que compreende as etapas de combinação entre si de monacolina

J; um tioéster de acila que doa uma fração acila ao grupo hidroxila C8 da monacolina J na presença de LovD aciltransferase; e LovD aciltransferase; permitindo-se que a LovD aciltransferase utilize um grupo acila do tioéster de acila para acilar regioseletivamente o grupo hidroxila C8 da monacolina J para produção do produto de sinvastatina. Uma configuração associada da invenção consiste em um produto de huvastatina produzido por um processo que compreende as etapas de combinação entre si de tetraol de pravastatina hidrolisada; um tioéster de acila doador de uma fração acila ao grupo hidroxila C8 do tetraol de pravastatina hidrolisada na presença de LovD aciltransferase; e LovD aciltransferase; e permitindo-se que a LovD aciltransferase utilize um grupo acila do tioéster de acila para acilar regioseletivamente o grupo hidroxila C8 do tetraol de pravastatina hidrolisada; sendo dessa forma obtido o produto de huvastatina.

Uma outra configuração da invenção consiste em um método de produção de sinvastatina compreendendo a hidrólise de lovastatina para monacolina J na presença de LovD de SEQ ID NO: 1 ou homólogo de LovD e acilação da monacolina J, em que as referidas hidrólise e acilação produzem sinvastatina. Uma outra configuração associada da invenção consiste em um método de produção de huvastatina compreendendo pravastatina para pravastatina hidrolisada na presença de LovD de SEQ ID NO: 1 ou um homólogo de LovD e acilação de uma variante de monacolina J, em que as referidas hidrólise e acilação produzem huvastatina.

* As configurações da invenção incluem composições de * matéria utilizadas para produção ou feitas pelos processos aqui divulgados. Por exemplo, uma configuração da invenção consiste em uma composição de matéria compreendendo monacolina J; um tioéster de acila que doa uma fração acila ao grupo hidroxila C8 da monacolina J na presença de LovD aciltransferase. Certas configurações destas composições de matéria compreendem adicionalmente LovD aciltransferase.

Certas configurações destas composições de matéria compreendem adicionalmente sinvastatina. Opcionalmente, a composição compreende adicionalmente um organismo isolado tal como Escherichia coli, Aspergillus terreus, Monascus ruber, Monascus purpureus, Monascus pilosus, Monascus vitreus, Monascus pubigerus, Candida cariosilognicola,

Aspergillus oryzea, Doratomyces stemonitis, Paecilomyces virioti, Penicillum citrinum, Penicillum chrysogenum, Scopulariopsis brevicaulis ou Trichoderma viride. Em

configurações	típicas,	o organismo	na	composição é
20 Aspergillus	terreus ou	Escherichia	coli	que expressa
polipeptídeo	de LovD de	SEQ ID NO:	1.	Em uma outra

configuração da invenção o organismo é Aspergillus terreus que não expressa polipeptídeo de LovF de SEQ ID NO: 3. Em uma outra configuração da invenção o organismo é 25 Escherichia coli que não expressa polipeptídeo bioU de SEQ

ID NO: 4. Em certas configurações da invenção, o organismo isolado dentro da composição foi transduzido com um vetor de expressão codificando polipeptideo LovD de Aspergillus terreus de SEQ ID NO: 1.

É aqui divulgada uma variedade de tioésteres de acila que podem ser utilizados nas composições da invenção. Tipicamente, o tioéster de acila é um butirlil-tioéster, um tioéster de N-acetilcisteamina ou um tioéster de metiltioglicolato. Opcionaimente, o tioéster de acila compreende frações de grupo acila de extensão de cadeia média (C3-C6). Em certas configurações da invenção, o tioéster de acila é capaz de cruzar as membranas celulares de células de Escherichia coli ou Aspergillus terreus cultivadas dentro de uma mídia de fermentação. Tipicamente, o tioéster de acila é selecionado do grupo que consiste em adimetilbutiril-S-metil-mercaptopropionato (DMB-S-MMP), dimetilbutiril-S-etil mercaptopropionato (DMB-S-EMP) e dimetilbutiril-S-metil tioglicolato (DMB-S-MTG) e dimetilbutiril-S-metil mercaptobutirato (DMB-S-MMB). Em uma configuração ilustrativa, o tioéster de acila é um adimetilbutiril-S-metil-mercaptopropionato que é combinado em mídia de fermentação em uma faixa de concentração de 1 mM-100 mM e pode ser tipicamente de cerca de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 ou 90 mM. Em algumas configurações da invenção, a composição compreende adicionalmente lovastatina e a quantidade de sinvastatina na composição é superior à quantidade de lovastatina na composição.

Conforme se encontra discutido detalhadamente abaixo, os métodos e materiais da invenção que são utilizados para produção de sinvastatina podem ser adaptados para produção de compostos que são estruturalmente similares à sinvastatina, por exemplo huvastatina. Neste contexto, uma configuração da invenção consiste em um método de produção de huvastatina compreendendo as etapas de combinação mútua de tetraol de pravastatina hidrolisada; um tioéster de acila que doa uma fração acila ao grupo hidroxila C8 do tetraol de pravastatina hidrolisada na presença de LovD aciltransferase; e LovD aciltransferase; permitindo-se subseqüentemente que a LovD aciltransferase utilize um grupo acila do tioéster de acila para acilar regioseletivamente o grupo hidroxila C8 do tetraol de pravastatina hidrolisada, sendo assim obtida huvastatina. Uma configuração associada da invenção consiste em uma composição de matéria compreendendo: tetraol de pravastatina hidrolisada; um tioéster de acila que doa uma fração acila ao grupo hidroxila C8 do tetraol de pravastatina hidrolisada na presença de LovD aciltransferase; LovD aciltransferase; e huvastatina.

Uma outra configuração ainda da invenção consiste em uma composição de matéria compreendendo um ou mais dos precursores de huvastatina, por exemplo, tetraol de pravastatina hidrolisada ou 6-hidroxil-6-desmetilmonacolina J na presença de tioéster selecionado por sua capacidade para acilar o grupo hidroxila C8 da monacolina J ou uma variante de monacolina J tal como tetraol de pravastatina hidrolisada. Tipicamente, essas composições podem incluir adicionalmente um organismo conforme discutido acima. Conseqüentemente, as configurações da invenção incluem processos para produção de composições de matéria de sinvastatina ou huvastatina substancialmente conforme aqui divulgados e exemplificados.

Em situações em que um organismo modificado que produz sinvastatina (por exemplo, A. terreus com uma perturbação no gene de LDKS) também produz lovastatina (por exemplo, alguma quantidade residual mínima), os métodos e materiais aqui divulgados permitem a manipulação de processos/vias bioquímicas no organismo de tal forma que a sinvastatina ou um composto associado tal como huvastatina seja o produto dominante nestas vias. Uma configuração associada consiste em uma composição de matéria compreendendo um organismo e sinvastatina e/ou huvastatina produzida(s) por esse organismo, em que a quantidade de sinvastatina e/ou huvastatina na composição é superior à quantidade de lovastatina na composição.

Uma configuração associada da invenção consiste em uma composição de matéria compreendendo LovD, pravastatina hidrolisada, e um tioéster de acila. Em configurações ilustrativas, a composição de matéria compreende um E coli que produz huvastatina. Em configurações associadas, a composição de matéria consiste em um A. terreus (por exemplo, A. terreus com uma perturbação no gene de LDKS) que produz huvastatina. Em situações em que um organismo modificado que produz huvastatina (por exemplo, A. terreus com uma perturbação no gene de LDKS) também produz lovastatina (por exemplo, alguma quantidade residual minima), os métodos e materiais aqui divulgados permitem a manipulação de processos/vias bioquímicas no organismo de tal forma que a huvastatina seja o produto dominante nestas vias. Uma configuração associada consiste em uma composição de matéria compreendendo um organismo e huvastatina produzida por esse organismo, em que a quantidade de huvastatina na composição é superior à quantidade de lovastatina na composição

Em certas configurações da invenção, componentes e/ou etapas metodológicas adicionais podem ser combinados com um ou mais dos métodos ou materiais discutidos acima. Por exemplo, os métodos podem compreender adicionalmente a utilização de fermentação de alta densidade celular para aumentar a concentração efetiva de LovD aciltransferase e otimizar as condições de fermentação e/ou aumentar as eficiências catalíticas de LovD aciltransferase para o(s) um ou mais tioésteres de acila através de engenharia de proteína. Muitos outros componentes ou métodos podem ser utilizados para aumento da produção de sinvastatina ou de um composto intermediário que facilita a produção de sinvastatina.

Conforme foi observado acima, a produção de lovastatina (que requer atividade de LovD aciltransferase) é observada em vários organismos tais como Aspergillus terreus, Monascus ruber, Monascus purpureus, Monascus pilosus, Monascus vitreus, Monascus pubigerus, Candida cariosilognicola, Aspergillus oryzea, Doratomyces stemonitis, Paecilomyces virioti, Penicillum citrinum, Penicillum chrysogenum, Scopulariopsis brevicaulis ou Trichoderma viride. Tendo em vista a natureza da invenção aqui divulgada, mediante utilização de métodos e materiais conhecidos em combinação com a divulgação aqui provida, uma pessoa versada na técnica pode combinar uma cultura de um ou mais destes organismos (ou qualquer outro organismo conhecido como produzindo lovastatina) com monacolina J e tioéster de acila que doa uma fração acila ao grupo hidroxila C8 de monacolina J na presença de LovD aciltransferase (por exemplo, a-dimetilbutiril-SNAC) para utilizar LovD aciltransferase para produção de sinvastatina. Conforme é ilustrado pela presente divulgação, por exemplo, a natureza da presente invenção permite produzir sinvastatina e compostos associados na ampla variedade de organismos produtores de lovastatina conhecidos na técnica, sem nenhum conhecimento específico relativo às características da LovD aciltransferase específica expressada nestes organismos.

Em um procedimento ilustrativo para produção de sinvastatina em um novo organismo (por exemplo, uma espécie de fungo relacionada com A. terreus) e/ou para teste do organismo quanto a sua capacidade para tal, uma primeira etapa consiste em fazer uma mistura de monacolina J e tioéster de acila que doa uma fração acila ao grupo hidroxila C8 da monacolina J. Em uma segunda etapa, a mistura é então combinada com o organismo (por exemplo, um organismo produtor de lovastatina) em uma mistura de fermentação e deixada em cultura. Em uma terceira etapa, a mistura é testada quanto à presença de sinvastatina, por exemplo, mediante utilização de uma análise de cromatografia HPLC conforme se encontra discutido nos exemplos abaixo. Tendo em vista as metodologias de triagem de alto rendimento conhecidas na técnica (vide, por exemplo, Kittel e outros, Metab. Eng. 2005; 7(1): 53-58, aqui incorporado a titulo de referência), esses métodos podem ser realizados em um grande número de amostras de teste tal como o imenso número de culturas de fungos conhecidas na técnica e prontamente disponíveis para uma pessoa versada na técnica para uma fácil determinação de onde e quais espécies de organismos expressam polipeptídeos que possuem uma atividade de LovD aciltransferase que permite a utilização dos mesmos nas configurações da invenção aqui divulgadas.

Os métodos aqui divulgados também permitem que pessoas versadas na técnica isolem e clonem configurações adicionais de LovD aciltransferase, por exemplo, as combinações que podem ter qualidades desejáveis adicionais tais como maior estabilidade em diversas condições de reação e/ou características cinéticas enzimáticas favoráveis em diversas condições de reação. Neste contexto, uma outra configuração da invenção consiste em um método para identificação de configurações adicionais de LovD aciltransferase de acordo com a invenção, em que o método compreende as simples etapas de combinação de um organismo com probabilidade de expressar LovD aciltransferase (por exemplo, um organismo produtor de lovastatina) ou um extrato celular desse organismo com um tioéster de acila que doa uma fração acila ao grupo hidroxila C8 da monacolina J na presença de LovD aciltransferase (por exemplo, a-dimetilbutiril-SNAC) e subsequente teste desta combinação quanto à presença de sinvastatina. A presença de sinvastatina indica a presença da atividade desejada de LovD aciltransferase. Tendo em vista os métodos aqui divulgados bem como as metodologias de triagem de alto rendimento conhecidas na técnica (vide, por exemplo, Kittel e outros, Metab. Eng. 2005; 7(1): 53-58, aqui incorporado a titulo de referência) , esses métodos podem ser realizados em um grande número de amostras de teste tal como o imenso número de culturas de fungos conhecidas na técnica e prontamente disponíveis para uma pessoa versada na técnica (por exemplo, culturas produtoras de lovastatina) com somente uma quantidade mínima de experimentação. Consequentemente, o grande número de organismos produtores de lovastatina conhecidos na técnica, as metodologias de triagem de alto rendimento conhecidas nesta técnica e a presente divulgação guiam um técnico para permitir que o mesmo determine facilmente onde e quais espécies de polipeptideos possuem uma atividade de LovD aciltransferase que permite a utilização dos mesmos nas combinações da invenção aqui divulgadas.

Após a atividade de LovD aciltransferase ter sido observada com utilização destes métodos, podem então ser utilizados na técnica métodos para clonagem do gene que codifica a proteína que tem esta atividade. Alternativamente, uma biblioteca nos genes de um organismo pode ser criada com utilização de uma sequência de polinucleotídeos de LovD aciltransferase (por exemplo, de Ά. terreus) seja isoladamente, seja em combinação com estudos funcionais conforme discutidos acima para identificação de uma nova sequência de polinucleotídeos de LovD aciltransferase com homologia relativamente à SEQ ID NO: 1 ou à SEQ ID NO: 2) . Neste contexto, as enzimas homólogas para LovD podem ser encontradas, por exemplo, mas não limitativamente, em agrupamentos de genes de policetídeos fúngicos. Por exemplo, a Mlc na via de biosíntese de compactina está implicada na catálise da reação de transacilação idêntica (vide, por exemplo, Y. Abe, T. e outros, Mol Genet Genomics. 2002, 267, 636-646), ao passo que uma aciltransferase na via de squalestatina pode catalisar uma reação similar entre um tioéster de tetracetídeo ligado a ACP e um aglicon (vide, por exemplo, R. J. Cox, F. e outros, Chem Commun (Camb) 2004, 20, 22602261) . A sequência de aminoácidos de LovD assemelha-se às enzimas de β-lactamase de tipo C, que catalisam a inativação hidrolitica da classe de antibióticos de βlactama (vide, por exemplo, E. Lobkovsky, E. M. e outros, Biochemistry, 1994, 33, 6762-6772 e A. Dubus, D. e outros, Biochem. J. 1993, 292, 537-543). O alinhamento de LovD com a lactamse P99 de enterobacter cloacae (vide, por exemplo, S. D. Goldberg e outros, Protein Sci. 2003, 12, 1633-1645) apresenta uma homologia moderada de seqüência, incluindo resíduos de sítios ativos potencialmente conservados, tais como os catalíticos Ser76, Lys79, Tyrl88, e Lys315 (vide, por exemplo, S. D. Goldberg e outros, Protein Sci. 2003, 12, 1633-1645). Tendo em vista estes métodos, uma outra configuração ainda da invenção consiste em um polipeptídeo de LovD aciltransferase isolado possuindo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de seqüência com a seqüência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 1, em que o polipeptídeo tem capacidade para acilar o grupo hidroxila C8 da monacolina J na presença de um doador de tioéster de acila apropriado (por exemplo, adimetilbutiril-SNAC).

Conforme é aqui divulgado, um tioéster de acila para acilar regioseletivamente o grupo hidroxila C8 da monacolina J é um composto possuindo um grupo acila que pode ser transferido para monacolina J ou um composto associado para produção de sinvastatina ou um composto associado conforme aqui divulgado. É conhecida na técnica uma ampla variedade desses agentes que são aqui adicionalmente aqui apresentados como tendo esta atividade (vide, por exemplo, os tioésteres de acila ilustrativos da Tabela 1) . Adicionalmente àqueles conhecidos na técnica e adicionalmente ilustrados pela presente divulgação como tendo esta atividade, qualquer potencial transportador/doador de acila conhecido na técnica (ou sintetizado de novo) que tenha adicionalmente uma capacidade para acilar C8 de monacolina J para produção de sinvastatina poderá ser facilmente identificado por experimentos comparativos com os doadores de acila aqui divulqados (por exemplo, acila-SNAC). Tipicamente nesses experimentos, o tioéster de acila é um tioéster de butirlila, um tioéster de N-acetilcisteamina ou um tioéster de metil-tioqlicolato. Opcionalmente, o tioéster de acila compreende frações de grupo acila de extensão de cadeia média (C3-C6). Em certas configurações da invenção, o tioéster de acila é capaz de transpor as membranas celulares de Escherichia coli ou Aspergillus terreus cultivados em uma midia de fermentação. Tipicamente, o tioéster de acila é selecionado do grupo que consiste em adimetilbutiril-S-metil-mercaptopropionato (DMB-S-MMP), dimetilbutiril-S-etil mercaptopropionato (DMB-S-EMP) e dimetilbutiril-S-metil tioglicolato (DMB-S-MTG) e dimetilbutiril-S-metil mercaptobutirato (DMB-S-MMB).

Conforme é demonstrado pela presente divulgação, a natureza da presente invenção permite que um técnico identifique prontamente um composto como um tioéster de acila para acilar regioseletivamente o grupo hidroxila C8 de monacolina J com um mínimo de experimentação. Em urn procedimento ilustrativo para identificação de um composto como um tioéster de acila para acilar regioseletivamente o grupo hidroxila C8 de monacolina J, uma primeira etapa consiste na obtenção de uma mistura de monacolina J e A. terreus. Em uma segunda etapa, esta mistura é então combinada com um composto de teste em uma mistura de fermentação e é deixada em cultura. Em uma terceira etapa a mistura é então testada quanto à presença de sinvastatina, por exemplo mediante utilização de uma análise de cromatografia HPLC conforme se discute nos exemplos abaixo, em que a presença de sinvastatina identifica o composto como tendo esta atividade. Tendo em vista as metodologias de triagem de alto rendimento conhecidas na técnica (vide, por exemplo, Kittel e outros, Metab. Eng. 2005, 7(1): 5358, aqui incorporado a titulo de referência), esses métodos podem ser realizados em um grande número de amostras de teste para determinar facilmente onde e quais espécies de compostos doadores de acila possuem uma utilidade que permite a utilização dos mesmos nas configurações da invenção aqui divulgadas.

As configurações da invenção também incluem artigos de manufatura e/ou kits destinados a facilitarem os métodos da invenção. Tipicamente esses kits incluem instruções para utilização dos elementos contidos nos mesmos de acordo com os métodos da presente invenção. Esses kits podem compreender um meio transportador dividido em compartimentos para acolher em confinamento um ou mais meios recipientes tais como frascos, tubos, e similares, cada um dos meios recipientes compreendendo um dos elementos separados a serem utilizados no método. Por exemplo, um dos recipientes pode compreender um frasco, por exemplo, contendo A. terreus possuindo uma perturbação no gene de LDKS e um outro frasco contendo um composto acilaSNAC ou similar, em gue ambos podem ser adicionados a uma mistura de fermentação para produção de sinvastatina.

Em uma configuração tipica da invenção, é provido um artigo de manufatura contendo materiais úteis para produção de sinvastatina. O artigo de manufatura compreende um recipiente e um rótulo. Os recipientes adequados incluem, por exemplo, garrafas, frascos, seringas, e tubos de ensaio. Os recipientes podem ser formados de uma variedade de materiais tais como vidro ou plástico. O recipiente pode conter uma composição de matéria (por exemplo, um transportador de acila e um organismo) que pode produzir sinvastatina, por exemplo. O rótulo no recipiente ou associado ao mesmo indica que a composição é utilizada para exame de polipeptideos celulares. O artigo de manufatura pode compreender adicionalmente um segundo recipiente compreendendo um outro composto ou substrato para adição à mistura de fermentação, por exemplo. Este composto ou substrato, por exemplo, poderá ser utilizado para aumentar a produção de certos intermediários na produção de sinvastatina, tal como monacolina J. Ele pode incluir adicionalmente outros materiais desejáveis do ponto de vista comercial e do ponto de vista do usuário, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas, seringas, e insertos de embalagem com instruções de utilização.

Aspectos biológicos adicionais da invenção são discutidos nas seções a seguir.

ASPECTOS BIOQUÍMICOS DE CONFIGURAÇÕES DA INVENÇÃO

Uma apreciação de certos aspectos da invenção será facilitada por uma discussão de aspectos bioquímicos da invenção. Nas seções a seguir e nos exemplos do relatório descritivo, a LovD aciltransferase é o polipeptídeo de LovD de A. terreus ilustrado na SEQ ID NO: 1, sendo tipicamente referida como LovD ou a enzima de LovD.

A promiscuidade da enzima de LovD para doadores de acila alternativos foi examinada. Os presentes requerentes descobriram que não é necessário que o doador/transportador de acila se encontre acoplado à LDKS. Transportadores alternativos contendo tiol são adequados, incluindo acilaCoA (coenzima A) e mais importantemente, a acila-SNAC permeável em membrana (Figura 7). Os presentes requerentes descobriram que não é necessário que a LovD interaja com a LovF e que a mesma pode aceitar um grupo acila de uma variedade de diferentes doadores. Também foi descoberto que a LovD pode transferir uma variedade de substratos de acila para o grupo hidroxila C8 da monacolina J para produção de uma variedade de análogos de lovastatina. Os presentes requerentes descobriram que a LovD pode acilar regioseletivamente a posição hidroxila C8 na monacolina J com uma variedade de substratos de acila. Entre os grupos acila que obtêm êxito encontra-se a a-dimetilbutiril-SNAC, que produz sinvastatina na presença de LovD e monacolina J. Os presentes requerentes também descobriram que a atividade de transacilação de LovD pode ser confirmada in vitro e pode ser reconstituída em um hospedeiro heterólogo. Os presentes requerentes descobriram que a LovD acila diretamente a monacolina J com um a-dimetilbutirato produzindo a farmaceuticamente importante sinvastatina. A α-dimetilbutiril-SNAC é permeável em células. As propriedades de permeabilidade celular da a-dimetilbutirilSNAC possuem uma importante implicação: o composto pode ser fornecido como precursor in vivo para um organismo, tal como um procarioto ou um eucarioto, expressando LovD. O procarioto ou eucarioto, quando fermentado na presença de monacolina J (seja produzido endogenamente ou fornecido exogenamente à midia de fermentação) pode proporcionar diretamente sinvastatina. O E. coli, por exemplo, foi examinado como hospedeiro microbiano para a bio-conversão de monacolina J para sinvastatina. Tanto monacolina J quanto dimetilbutiril-SNAC foram adicionados a uma cultura de uma cepa de E. coli sobre-expressando a enzima LovD (Figura 10). A sinvastatina foi isolada do caldo de fermentação da cultura em bom rendimento de produção. Esta técnica pode ser utilizada no produtor de lovastatina nativa Aspergillus terreus. Pode ser construída uma cepa deficiente em LDKS para não ser capaz de sintetizar a cadeia lateral de 2-metibutirato. A α-dimetilbutiril-SNAC pode ser adicionada à mídia de fermentação. A sinvastatina pode ser sintetizada durante esta fermentação de etapa única.

Conforme foi observado acima, a LovD pode catalisar a etapa final de transferência de acila durante a biosíntese de lovastatina e pode acilar regioespecificamente o grupo hidroxila C8 na monacolina J. A LovD pode apresentar uma ampla especificidade de substrato para o aglicon de decalina, o transportador de acila, e o grupo acila. Quando suplementada com o substrato não natural de adimetilbutiril-SNAC, a LovD pode produzir a farmaceuticamente importante sinvastatina tanto in vitro quanto in vivo. Quando o precursor de cc-dimetilbutiriltioéster é fornecido a uma cepa de A. terreus deficiente em LovF, a via de bio-síntese de lovastatina pode ser redirecionada para produzir diretamente sinvastatina. A presente invenção permite: 1) Conversão microbiana de monacolina J em sinvastatina (Figura 10); 2) Co-cultura da cepa de sobre-expressão de LovD com uma cepa que produz monacolina J; e 3) Fermentação de etapa única de Aspergillus terreus (ALDKS) para obtenção de sinvastatina. Em cada caso, o substrato de acila a-dimetilbutiril-SNAC pode ser sintetizado quimicamente e ser adicionado ao caldo de fermentação.

NÃO É NECESSÁRIO QUE A LOVD INTERAJA COM A LOVF, E A LOVD PODE CATALISAR A REAÇÃO DE TRANSACILAÇÃO DE ACILA-COA E OUTROS TRANSPORTADORES ALTERNATIVOS CONTENDO TIOL (FIGURA 5)

Os presentes requerentes examinaram em primeiro lugar se uma acila-CoA pode ser utilizada como substrato para a reação de transacilação. O gene ininterrupto de LovD foi amplificado de DNA genômico de A. terreus mediante utilização de splice por cromatografia PCR de extensão de sobreposição e foi inserido no vetor de expressão pET28a. A sobre-expressão de LovD de fusão 6xHis de terminal-N solúvel foi realizada na cepa de E. coli BL21(DE3)/pAW31. A LovD foi purificada por coluna de afinidade Niquel-NTA para obtenção de homogeneidade (rendimento final ~ 40 mg/L). O substrato de monacolina J (1 mM) foi preparado mediante hidrólise de LiOH de lovastatina e foi adicionado à mistura de reação contendo LovD pura (10 μΜ) e butiril-CoA (4 mM) , que é a acila-CoA disponível comercialmente que mimetiza melhor a cadeia lateral natural de α-dimetilbutirato. A mistura de reação foi incubada à temperatura ambiente, extraída com acetato de etila e analisada por cromatografia HPLC e LC-MS (Figura 5).

Um composto simples mais hidrofóbico com uma absorvência de UV idêntica à lovastatina foi formado na mistura de reação, em combinação com o desaparecimento da monacolina J (Figura 5, indicação a). Foi determinado que a massa do novo composto era 391 (M+H) , de acordo com a adição de um grupo butirila à monacolina J. A esterificação seletiva do grupo hidroxila C8 da monacolina J para obtenção de 4 foi confirmada por espectroscopia de NMR de próton (CDC1₃, 500 MHz) . A análise de NMR de próton de 4 (forma lactonizada) é praticamente idêntica à da lovastatina com exceção dos sinais alifáticos da cadeia lateral de acila linear. O diagnóstico H8 multiplet (atribuído com utilização de ¹H-¹H COSY, ¹H-¹³C HMQC e ¹H-¹³C HMBC) em 4 é deslocado no campo no sentido descendente para δ 5,38, em comparação com δ 4,23 observado para o mesmo próton na monacolina J. Isto é consistente com o efeito de desproteção da substituição acilóxi em C8. Os prótons Hll e H13 de carbonos portadores de outros grupos hidroxila foram deslocados de δ 4,71 e δ 4,38 na monacolina J para δ 4,51 e δ 4,36 em 4, respectivamente.

Conforme se encontra ilustrado na Figura 5A (indicação a), foi observada 87% de conversão de monacolina J para 4 após 10 horas com utilização de butiril-CoA como doador de acila. Um estudo de decurso de tempo revelou uma taxa de conversão aparente de 0,18 min^-1 (Figura 5B) . A conversão observada de 87% aproxima-se provavelmente do equilíbrio conforme é apresentado na Figura 5B. Para exame da natureza bioquímica da conversão de equilíbrio, os presentes requerentes realizaram ensaios para determinar se a LovD também catalisa a reação inversa de hidrólise. De fato, quando a lovastatina foi utilizada como o único substrato, a formação de monacolina J foi prontamente detectada com valores k_cat e K_m de 0,21 ± 0,01 min-1 e 0,56 ± 0,05 mM, respectivamente (Figura 5C) . Quando a serina de sítio ativo putativo em LovD (Ser76) foi mutada para uma alanina, não foi possível detectar a formação de 4 ou a hidrólise de lovastatina (Figura 5A, indicação b) .

A síntese enzimática de 4 confirma que a LovD catalisa de fato a reação de transferência de acila ilustrada na Figura 4. Adicionalmente, este resultado indica que não é necessária uma associação direta entre domínios de LovF e LovD para conversão catalítica, em contraste com o modo previamente suposto de catálise de LovD (vide, por exemplo, J. Kennedy, K. e outros, Science, 1999, 284, 1368-1372 e C. R. Hutchinson, J. e outros, Antonie Van Leeuwenhoek 2000, 78, 287-295). A acila-S-CoA pode substituir a acila-S-LovF, muito embora provavelmente com um valor K_m significativamente mais elevado devido à perda de interações potenciais proteína-proteína.

ENSAIOS DE TRANSACILAÇÃO COM VÁRIOS SUBSTITUINTES DE ACILA DIFERENTES DISPONÍVEIS COMERCIALMENTE REVELARAM A PREFERÊNCIA DA LOVD POR GRUPOS ACILA DE EXTENSÃO DE CADEIA MÉDIA (C3-C6)

Os presentes requerentes realizaram ensaios para determinação da tolerância de LovD relativamente a diferentes substituintes de acila mediante realização do ensaio de transacilação com diversas acila-CoA's disponíveis comercialmente (Tabela IA) . Todos os ensaios foram realizados com 1 mM de monacolina J, 4 mM de acilaCoA e 10 uM de LovD durante 10 horas. Os resultados dos presentes requerentes indicam claramente que a LovD demonstra uma preferência por grupos acila de extensão de cadeia média (C3-C6) com a butiril-CoA constituindo o substrato ideal de alquilacila-CoA. Surpreendentemente, a benzoila-CoA, mais volumosa, foi um dos melhores substratos de acila examinados, com perto de 70% de conversão de sinvastatina para o correspondente análogo de 8-benzóxilovastatina (valor k_cat aparente = 0,16 min^-1). A introdução de insaturação α-β reduziu significativamente a taxa de reação, conforme pode ser observado na acilação de 6% da monacolina J na presença de crotonila-CoA. A acetoacetilaCoA e a β-hidroxilbutirila-CoA foram ambas excelentes substratos de LovD, de forma concordante com a isolação de monacolina X (vide, por exemplo, A. Endo, K. e outros, J. Antibiot, 1986, 38, 321-327) e monacolina M (vide, por exemplo, A. Endo, K. e outros, J. Antibiot, 1986, 39, 321327) do hospedeiro natural, respectivamente. Entre os substratos de CoA submetidos a ensaio, a LovD foi inativa para malonila-CoA e palmitoila-CoA.

ENSAIOS ADICIONAIS DE TRANSACILAÇÃO COM UM TRANSPORTADOR DE ACILA ALTERNATIVO, ACILA-SNAC, QUE É MAIS SIMPLES DE PREPARAR SINTETICAMENTE E PODE PENETRAR A MEMBRANA CELULAR EM CONDIÇÕES IN VIVO, REVELARAM QUE A ACILA-SNAC CONSTITUI UM SUBSTRATO COMPETENTE PARA LOVD

Para examinar adicionalmente as especificidades de substrato de LovD para transportadores de acila alternativos, particularmente aqueles que são mais simples de preparar sinteticamente, e podem penetrar a membrana celular em condições in vivo, os presentes requerentes realizaram ensaios com duas variantes de butiril-tioésteres como substratos de LovD (Figura 5) . Os tioésteres de Nacetilcisteamina (SNAC) foram utilizados extensivamente como sondas e precursores em estudos de bioquímica de produtos naturais (vide, por exemplo, Auclair e outros, Science, 1997, 211, 367-369). Foi recentemente determinado que o metil-tioglicolato (SMTG) constitui um substituto econômico para o SNAC na bio-sintese dirigida a precursor

da eritromicina (vide,	por exemplo, S.	Murli, K. S.	e
outros,	Appl. Environ.	Microbiol. 2005,	11, 4503-4509) .	A
Figura	5 (indicações	c e d) ilustra	a conversão	de

monacolina J para 4 quando estes butiril-tioésteres foram utilizados como doadores de acila. Tanto os tioésteres SNAC quanto SMTG substituiram eficientemente a butirila-CoA, com valores k_cat aparentes de 0,09 min¹ e 0,23 min”¹ (Figura 5B) , respectivamente, exemplificando adicionalmente que as interações proteina-proteina entre LovD e LovF, bem como as interações entre LovD e o braço de fosfopanteteina não são necessárias para transferência de acila. O butiriltioetano, entretanto, não constituiu um substrato competente de LovD e suportou somente 4% de conversão de monacolina J para 4. Similarmente, a benzoila-SNAC e a benzoila-SMTG substituiram eficientemente a benzila-CoA, com valores k_cat aparentes de 0,12 min ¹ e 0,15 min ^x, respectivamente (Tabela ΙΑ).

ENSAIO PARA SÍNTESE QUIMIO-ENZIMÁTICA IN VITRO DE LOVASTATINA E SINVASTATINA COM UTILIZAÇÃO DE A-SMETILBUTIRIL-SNAC E A-DIMETILBUTIRIL-SNAC REVELA QUE A MONACOLINA J É CONVERTIDA EM SINVASTATINA NA PRESENÇA DE ACILA-SNAC

Os presentes requerentes sintetizaram então a-Sdimetilbutiril-SNAC e α-dimetilbutiril-SNAC e realizaram ensaios de síntese quimio-enzimática in vitro de lovastatina e sinvastatina, respectivamente, os resultados encontram-se ilustrados na Figura 8 e na Tabela 1A. Foram utilizadas amostras autênticas de lovastatina e sinvastatina como referências para a detecção de HPLC (Figura 8, indicação a) . A cadeia lateral de a-Sdimetilbutirato natural constituiu surpreendentemente um substrato mais deficiente em comparação com butiril-, pentanoil-, e hexanoil-SNAC. O valor k_cat aparente (~ 0,04 min^-1) da síntese de lovastatina é mais de 50% mais lento que o de LovD para butiril-SNAC. Isto sugeriu que a LovD de tipo natural não foi otimizada para transferência do substrato ramificado. A adição de um segundo substituinte de metila à posição-α atenuou adicionalmente a taxa de acilação, com provável atribuição ao aumento de impedimento estérico da fração dimetila. Em condições de ensaio convencionais, aproximadamente 10% da monacolina J foi convertida em sinvastatina quando foi utilizada uma adimetilbutiril-SNAC como substrato (valor k_cat aparente = 0,02 min'¹). Foi possível obter conversões de equilíbrio > 7 0% quando 100 uM de LovD e um excesso de 10 vezes de adimetil-SNAC ou a-dimetil-SMTG foram adicionados à mistura de reação in vitro (Figura 8, indicações b e c).

A LOVD, IN VITRO, PODE TRANSFERIR UMA VARIEDADE DE SUBSTRATOS DE ACILA (NÃO SOMENTE LDKS) PARA O GRUPO HIDROXILA C8 DA MONACOLINA J PARA OBTENÇÃO DE UMA VARIEDADE DE ANÁLOGOS DE LOVASTATINA

Para teste da especificidade de substrato da LovD para variantes de monacolina J, os presentes requerentes realizaram ensaios de conversão de tetraol 7 para 8, pravastatina (5) e huvastatina (6) (Figura 9). Foi anteriormente demonstrado que quando é fornecida 8desmetil-monacolina J a um mutante de A. terreus bloqueado em bio-síntese de monacolina J, pode ser prontamente isolada compactina (vide, por exemplo, J. L. Sorensen, K. e outros, Org. Biomol. Chem. 2003, 1, 50-59). Isto indica que possivelmente a LovD tolera substituições na posição C6 do núcleo de decalina. De fato, a LovD apresenta uma especificidade relaxada para a substituição de hidroxila em C6, e catalisa a acilação de 7 com mais eficiência. As taxas de conversão aparentes para a síntese de 8, pravastatina, ou huvastatina utilizando os acil-tioésteres correspondentes foram de 0,18, 0,11, 0,03 min ¹, respectivamente. O tempo de retenção da pravastatina autêntica foi idêntico ao do composto sintetizado enzimaticamente. A massa dos compostos recém formados foi confirmada por LC-MS. Não foram detectados quaisquer produtos di-acilados na mistura de reação.

OS DADOS IN VIVO DEMONSTRAM QUE A LOVD PODE SER UTILIZADA PARA BIO-SÍNTESE DE PREPARAÇÃO DE ANÁLOGOS DE LOVASTATINA

Para demonstrar que a LovD pode ser utilizada para bio-sintese de preparação de análogos de lovastatina, os presentes requerentes tentaram em primeiro lugar realizar a reação de benzilação in vivo utilizando E. coli como hospedeiro heterólogo. A cepa de sobre-expressão de BL21(de3)/pAW31 foi cultivada em um frasco de agitação (200 mL) com um valor ODgoo de 1,0, e nessa ocasião foram adicionados à cultura 1 mM de IPTG, 0,8 mM de monacolina J e 4 mM de alternativamente benzolla-SNAC ou benzoila-SMTG. A expressão de LovD e bio-conversão foram realizadas a 18° C. A cultura foi extraída e analisada quanto à formação de 8-benzoil-monacolina J. Quando suplementada com benzoílaSNAC, foi detectada 84% de conversão de monacolina J no prazo de 20 horas pós-indução. O produto foi lactonizado e purificado por uma única etapa de cromatografia de sílicagel. Os espectros de ressonância NMR confirmaram a benzoilação regioseletiva do grupo hidroxila C8 quando o diagnóstico H8 multiplet é deslocado no sentido descendente do campo para δ 5,61. Em contraste, foi observado somente 40% de benzoilação para a cultura que foi suplementada com benzoíla-SMTG. Ά benzoíla-SMTG foi rapidamente degradada por E. coli e não pôde ser detectado nenhum residue no meio de cultura após 24 horas.

UM SUBSTRATO DE ACILA, a-DIMETILBUTIRIL-SNAC, PRODUZIU SINVASTATINA NA PRESENÇA DE LOVD PURIFICADA E MONACOLINA J

Os presentes requerentes realizaram fermentação de baixa densidade celular com α-dimetilbutiril-SNAC como precursor para obtenção de sinvastatina a partir de monacolina J em uma única etapa de bio-sintese. Após dois dias de cultura, foi observada uma conversão de ~ 90% de monacolina J para sinvastatina (vide, por exemplo, condições de fermentação, listadas abaixo). O produto foi purificado e os espectros de ressonância NMR de carbono e próton foram idênticos aos do composto adquirido comercialmente. O menor rendimento de produção de sinvastatina é consistente com a taxa de conversão mais lenta observada in vitro, que pode ser adicionalmente reduzida em uma concentração intracelular mais baixa do precursor SNAC. Outros fatores, tal como a hidrólise reversível da sinvastatina (os presentes requerentes observaram hidrólise de sinvastatina na presença de LovD o valor k_cat (0,02 min^-1) da hidrólise é ~ 10 vezes mais lento que o da hidrólise de lovastatina ilustrada na Figura 5C) e a inativação de LovD após fermentação prolongada podem causar a conversão observada. Os presentes requerentes prevêem que o rendimento de produção pode ser significativamente aperfeiçoado por vários meios, tais como

1) utilização de fermentação de alta densidade celular para aumento da concentração efetiva de LovD e otimização das condições de fermentação; 2) aumento das eficiências catalíticas de LovD para o precursor não natural mediante engenharia de proteína.

De princípio a fim do presente pedido de patente são feitas referências a diversas publicações. As divulgações destas publicações são aqui incorporadas na integra a título de referência.

EXEMPLOS

Os Exemplos abaixo proporcionam métodos e materiais ilustrativos que podem ser utilizados na prática das diversas configurações da invenção aqui divulgadas.

EXEMPLO 1: CLONAGEM, EXPRESSÃO E PURIFICAÇÃO DE LOVD ACILTRANSFERASE ILUSTRATIVA

Os três éxons de LovD de A. terreus foram amplificados individualmente do DNA genômico de A. terreus e foram submetidos a splicing para obtenção de uma fase de leitura aberta contínua com utilização de PCR de extensão de sobreposição para splice. Os sítios de restrição Ndel e HindIII foram introduzidos nos primers externos 5' e 3', respectivamente. A cassete de gene foi ligada em pET28 (Novagen) para obtenção do constructo de expressão pAW31. A cepa de E. coli BL21(DE3) transformada com pAW31 foi cultivada em mídia LB a 37° C para um valor OD₆oo de 0,5, e nessa ocasião foi adicionado à cultura 1 mM de IPTG e a expressão foi realizada a 18° C durante 24 horas. As células foram colhidas por centrifugação, resuspensas em tampão Buffer A (50 mM Tris, pH 8,0, 2 mM de DTT, 2 mM de EDTA) e foram lisadas por sonicação. Os detritos de células e proteínas insolúveis foram removidos por centrifugação (17.000 g, 4^o C, 1 hora). Foram adicionados ao lisado clarificado 2 mL de resina de Ni-NTA (Qiagen) . A LovD foi purificada com utilização de um gradiente de etapa de tampão A com concentração crescente de imidazol. Proteínas de LovD puras (> 95%) foram eluídas em tampão A contendo 250 mM de imidazol, tampão substituído por Tampão A sem imidazol, e foram concentradas, divididas em alíquotas e submetidas a congelamento instantâneo. As alíquotas de LovD congeladas foram de utilização de instância única. Os presentes requerentes observaram um decréscimo significativo de atividade enzimática após ciclos repetidos de congelamento-descongelamento.

EXEMPLO 2: CONDIÇÕES DE FERMENTAÇÃO ILUSTRATIVAS

Condições de fermentação: 500 mL de cultura com mídia LB com 30 mg/L de kanamicina. Em ODeoo de 1,0, as células foram concentradas para um valor final ODg₀o de 5,0 e induzidas com 1 mM de IPTG. Os substratos monacolina J e oc-dimetilbutiril-SNAC foram adicionados em uma concentração final de 1 mM e 4 mM. Em pontos diferentes no tempo, amostras de cultura foram colhidas, centrifugadas, filtradas e injetadas para HPLC (20 μΕ) . Condições de extração: Quando foi alcançada a conversão máxima, o caldo foi acidificado para um pH de 2,0, extraído com acetato de etila, submetido a secagem, e re-dissolvido em tolueno. A forma de lactona de monacolina J foi obtida mediante refluxo com utilização de um aparelho soxhlet conforme discutido anteriormente (vide, por exemplo, J. L. Sorensen,

K. e outros, Org. Biomol. Chem. 2003, 1, 50-59).

Uma variedade de mídias de fermentação tais como as midias LB, Fl ou TB são bem conhecidas na técnica podendo ser utilizadas ou adaptadas para utilização com configurações da invenção aqui divulgadas incluindo midia LB, TB e F1. Midias adicionais especificamente adaptadas para cultura de organismos tais como A. terreus e M. pilosus são igualmente bem conhecidas na técnica (vide, por exemplo, Miyake e outros, Biosci. Biotechnol. Biochem., 70(5): 1154-1159 (2006) e Hajjaj e outros, Applied and

Environmental Microbiology, 67: 2596-2602 (2001), cujos conteúdos são aqui incorporados a titulo de referência).

Uma receita típica de caldo Luria Bertani (LB) é a seguinte:

• 10 g de Triptona • 5 g de Extrato de Levedura • 10 g de NaCl • 1 L de água destilada pH para ~ 7,3-7,5.

Uma receita TB típica é a seguinte:

• 3 g Pipes (10 mM) • 2,2 g de CaC12 H20 (15 mM) • 18,6 KC1 (250 mM) • 10,9 g de MnC12 (55 mM) • 1 L de água destilada pH para 6,7-6,8 com KOH

Uma midia Fl típica pode ser encontrada na patente norte-americana n° US 5.064.856, cujo conteúdo é aqui incorporado a título de referência.

Tipicamente essas mídias são esterilizadas após a preparação mediante procedimentos tais como filtração ou processamento em autoclave.

EXEMPLO 3: APERFEIÇOAMENTO DE BIO-CONVERSÃO DE SINVASTATINA EM ESCHERICHIA COLI MEDIANTE DELEÇÃO DE BIOH

Este exemplo caracteriza adicionalmente o polipeptídeo de LovD codificado no agrupamento genético de lovastatina (vide igualmente Xie e outros, (2006) Chem Biol 13: 1161-1169). A LovD catalisa a última etapa da biosintese de lovastatina e é responsável por transferir a cadeia lateral de 2-metilbutirato da LovF megasintase para o precursor bio-sintético imediato, ácido de monacolina J (MJ) (vide, por exemplo, Kennedy e outros, (1999) Science 284: 1368-1372). Os presentes requerentes demonstraram que a LovD apresenta uma ampla especificidade de substrato para o núcleo de decalina, a unidade de acila de tioéster e o transportador de acila de tioéster. Mediante utilização de uma cepa de Escherichia coli sobre-expressando LovD e um tioéster dimetilbutiril-S-metil mercaptopropionato (DMB-SMMP) permeável para membrana celular (Figura 13A), os presentes requerentes desenvolveram um processo bio catalítico de célula total capaz de converter ácido de MJ em ácido de sinvastatina em uma etapa com elevados rendimentos (vide, por exemplo, Xie e outros, (2007) Appl Environ Microbiol 73: 2054-2060). O processo de fermentação pode constituir uma alternativa economicamente competitiva para as atuais rotas de síntese.

O tioéster DBM-S-MMP é um componente integral da bio-conversão de sinvastatina. Este tioéster encontra-se entre os doadores de acila mais eficientes cataliticamente que foram examinados para a reação de transferência de acila, sendo simultaneamente o menos dispendioso de sintetizar. Uma desvantagem significativa associada a este composto consiste na hidrólise da ligação metil éster em DMB-S-MMP que produz ácido dimetilbutiril mercaptopropiônico (DMB-S-MPA) (Figura 13). A reação de hidrólise é enzimática visto não ter sido observada nenhuma degradação na ausência de E. coli, e é extraordinariamente elevada durante a fermentação de alta densidade celular. A reação colateral é indesejável por três motivos: 1) A hidrólise do substrato subtrai DMB-S-MMP disponível para a transacilação catalisada por LovD, requerendo que o tioéster seja adicionado em grande excesso molar e seja freqüentemente reabastecido durante a fermentação; 2) Devido ao fato de o DMB-S-MPA ser menos eficiente em comparação com o DMB-S-MMP como doador de dimetilbutirato (~ 10 vezes mais lento) (vide, por exemplo, Xie e outros, (2007) Appl Environ Microbiol 73: 2054-2060), a acumulação do DMB-S-MPA que é mais solúvel pode servir como substrato de acila competidor para LovD. Isto reduz efetivamente a velocidade da reação e tem sido demonstrado in vitro com utilização de LovD purificada. Desta forma, a duração geral da bio-conversão é prolongada desnecessariamente; e 3) A fração ácido carboxílico de DMB-S-MPA interfere na purificação do ácido de sinvastatina da mídia de cultura na completação da bio-conversão. Ambos os compostos precipitam-se do caldo de cultura após a acidificação da mídia e são necessárias etapas de separação adicionais anteriormente à cristalização da sinvastatina. Muito embora o DMB-S-MPA possa ser removido mediante lavagem do filtrado com uma quantidade excessiva de água, uma quantidade apreciável de ácido de sinvastatina é perdida durante as etapas de lavagem, com um resultante decréscimo de recuperação em geral.

A eliminação da indesejável reação colateral de hidrólise pode portanto aperfeiçoar as características econômicas do processo bio-catalítico de célula inteira e as etapas de purificação de jusante. O objetivo mais imediato consiste portanto em determinar a(s) enzima(s) responsável(eis) pela reação colateral indesejável. Neste caso, os presentes requerentes ensinam a identificação de BioH como carboxilesterase de E. coli que hidrolisa DMB-SMMP para DMB-S-MPA. Mediante construção de um derivado AbioH da cepa de sobre-expressão de LovD, os presentes requerentes eliminaram totalmente a reação competidora e aperfeiçoaram adicionalmente a robustez da síntese biocatalítica de célula inteira de ácido de sinvastatina.

MATERIAIS, CEPAS E PLASMÍDEOS

Foram preparados monacolina J e DMB-S-MMP conforme foi anteriormente descrito (vide, por exemplo, Xie e outros, (2007) Appl Environ Microbiol 73: 2054-2060). Todos os reagentes foram adquiridos de fontes convencionais. A cepa BL21(DE3) [F- omp hsdSB (rB- mB-) gal dem À(DE3)] foi obtida da empresa Novagen. A coleção Keio foi obtida do National Institute of Genetics, Japão (vide, por exemplo, Baba e outros, (2006) Mol Syst Biol 2: 2006 0008) . Os mutantes de knockout de gene único foram derivados da cepa BW25113 [rrnB3DElacZ4787 hsdR514 DE(araBAD)567 DE (rhaBAD) 568rph-l] . A cepa WA837 (rB-, mB+, gal met), uma cepa de E. coli B que é menos-restrição e mais-modificação, foi obtida do The Coli Genetic Stock Center (CGSC) (vide, por exemplo, Wood, W. B. (1966) . J Mol Biol 16: 118-133) . Os plasmídeos pAW31(kanr) e pXK8(kanr) foram derivados de pET28a e contêm o gene de LovD de A. terreus e o gene bioH de E. coli, respectivamente.

ENSAIO DE HIDRÓLISE BASEADO EM CÉLULA INTEIRA

Os 57 mutantes selecionados da coleção Keio juntamente com BW25113, BL21(DE3) e BL21(DE3)/pAW31 foram cultivados até a saturação em uma placa de 96 receptáculos profundos em 1 mL de mídia LB a 37° C. Foi adicionado a cada cultura DMB-S-MMP (5 μΐ) puro com uma concentração final de 20 mN. Após agitação (20° C, 300 rpm) durante 10 horas, cada cultura foi extraída com um volume igual de acetato de etila (EA)/1% de ácido acético (AcOH). A fase orgânica foi submetida a secagem, re-dissolvida em 20 μΣ de acetonitrila (CH3CN), e 1 μΐ foi pingado sobre uma placa de TLC (silica gel 60 F254). As placas de TLC foram reveladas com 20% de EA em hexano e visualizadas com iodo.

A análise dos compostos foi igualmente realizada com HPLC com utilização de uma coluna C18 analítica (Alltech Apollo 5u, 150 mm X 4,6 mm); gradiente linear: 60% CH3CN em água (0,1% de ácido trifluoroacético [TEA]) para 95% CH3CN em água (0,1% TEA) durante 5 min, 95% CH3CN em água (0,1% TEA) durante 10 minutos, com uma taxa de fluxo de 1 mL/min. Os tempos de retenção (tR) de HPLC foram os seguintes: forma de lactona de MJ: 3,40 min; DMB-S-MPA: 3,82 min; DMB-S-MMP: 6,80 min; forma de lactona de sinvastatina: 8,45 min. Tanto os ácidos de MJ quanto de sinvastatina foram lactonizados anteriormente à análise de

HPLC.

PURIFICAÇÃO DE BIOH E ENSAIO ENZIMÁTICO

O gene de bioH foi amplificado de DNA genômico de

E. coli por PCR com sítios de restrição de flanco Ndel e EcoRI com utilização dos primers 5'AACATATGAATAACATCTGGTGGCA-3' (SEQ ID NO: 5) e 5'AAGAATTCTACACCCTCTGCTTCAACG-3' (SEQ ID NO: 6) . A cassete de gene foi digerida e ligada a pET28a para obtenção do constructo de expressão pXK8. A cepa BL21(DE3) de E. coli transformada com pXK8 foi cultivada em mídia LB a 37° C com um ODgoo de 0,5, e nessa ocasião foi adicionado à cultura 0,1 mM de IPTG e a expressão foi realizada a 20° C durante 16 horas. As células foram re-suspensas em tampão Buffer A (50 mM de Tris-HCl, pH 8,0, 2 mM de DTT, 2 mM de EDTA) e foram lisadas com sonicação. A purificação de BioH foi facilitada pelo marcador 6xHis de terminal-N e resina NiNTA (Qiagen) . O BioH praticamente puro (> 95%) foi eluido em tampão Buffer A contendo 250 mM de imidazol, sendo o tampão substituído pelo tampão Buffer A, concentrado, dividido em alíquotas, e submetido a congelamento instantâneo.

Os ensaios de hidrólise foram realizados à temperatura ambiente em 50 mM de HEPES, pH 7,9. O substrato de tioéster DMB-S-MMP foi adicionado para concentração final entre 0,1 mM e 1,0 mM. Para facilitar a solubilização do DMB-S-MMP, foi adicionado DMSO para uma concentração final de 10% para todas as amostras. A reação foi iniciada com a adição de BioH (0,01 μΜ) com têmpera em pontos de tempo desejados (10, 20, 30 minutos) mediante adição de um volume igual de EA/1% AcOH. A fase orgânica foi separada, submetida a secagem, e re-dissolvida em 20 μΙ. de ACN e submetida a análise por HPLC. As conversões de DMB-S-MMP para DMB-S-MPA foram quantificadas mediante integração dos picos a 234 nm. A comparação da eficiência catalítica de BioH para os três dimetilbutiril tioésteres foi realizada com uma concentração de substrato de 1 mM e uma concentração de BioH de 10 nM.

TRANSDUÇÃO DE Pl

De acordo com protocolos convencionais (vide, por exemplo, Miller, J. H. (1992) A short course in bacterial genetics: A laboratory manual and handbook for Escherichia coli and related bacteria. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Press), foi utilizada transdução de Pl para construção do mutante de deleção AbioH de BL21(DE3). Devido ao sistema de restrição diferente entre a cepa K de E. coli (BW25113) e a cepa B (BL21), a cepa B WA837 (rB-, mB+) foi utilizada como hospedeiro intermediário para transdução. O marcador AbioH::FRT-kan-FRT foi em primeiro lugar transduzido de JW3375 para WA837 para obtenção de YTO (WA837 AbioH::FRT-kan-FRT). Utilizando-se BL21(DE3) como recipiente e YTO como doador, a cepa YT1 (BL21 AbioH::FRTkan-FRT X(DE3)) foi construído. A cepa YT1 foi transformada com o plasmídeo auxiliar pCP20 que contém um gene FLP induzível termicamente e replicação sensível à temperatura (vide, por exemplo, Datsenko e outros, (2000) Proc Natl Acad Sei U S A 97: 6640-6645; e Wanner, 2000) . A remoção do marcador kan para obtenção de YT2 ((BL21 AbioH::FRT λ(ΏΕ3)) foi feita de acordo com procedimentos publicados (vide, por exemplo, Datzenko e outros, (2000) Proc Natl Acad Sei USA 97: 6640-6645; e Wanner, 2000).

Foi utilizado PCR para determinação das alterações genéticas de YT2. Foram atribuídos três primers. Os primers Bl: 5’-TGACGGCTTCGCTATCCCAT-3' (SEQ ID NO: 7); B2: 5'-TACACCCTCTGCTTCAACG-3' (SEQ ID NO: 8); e B3: 5'GCTGGATTGTTTCGCCGATC-3' (SEQ ID NO: 9) associam-se ao gene de montante yhgA, a extremidade 3' do bioH que foi deixada intacta, e ao gene de jusante gntX, respectivamente. Os produtos previstos para reação PCR com utilização de DNA genômico de YT2 como gabarito são: B1/B2: 602 bp; B1/B3: 1002 bp. Os produtos previstos para reação PCR com utilização de DNA genômico de BL21(DE3) como gabarito são: B1/B2: 1271 bp; B1/B3: 1771 bp. Os produtos de PCR previstos foram observados para cada cepa.

BIO-CATÁLISE DE CÉLULA INTEIRA

A síntese catalítica de célula inteira de ácido de sinvastatina a partir de ácido de MJ e DMB-S-MMP foi realizada conforme descrito (vide, por exemplo, Xie e outros, (2007) Appl Environ Microbiol 73: 2054-2060). As cepas de E. coli BL21 (DE3)/pAW31 e YT2/pAW31 foram cultivadas lado a lado para comparação. Uma única colônia das cepas recém-transformadas foi utilizada para inocular uma cultura de 5 mL de LB suplementada com 35 mg/L de kanamicina com cultura durante a noite a 37° C. Na manhã seguinte, 100 μΕ da cultura noturna foram inoculados em 50 mL de culturas contendo caldo de LB, midia minima de Fl, e mídia de Fl suplementada com 0,15 mg/L de biotina. As taxas de cultivo foram monitoradas mediante medição periódica da leitura OD600. Quando o valor OD₆₀o alcançou ~ 0,5, foram adicionados 100 μΜ de IPTG à cultura e foi realizada expressão de LovD a 20° C durante 16 horas. Para mimetizar condições de fermentação de alta densidade, as células foram concentradas 10 vezes anteriormente à adição de substratos. Tipicamente, uma alíquota de 14 mL da cultura foi transferida para um tubo de centrifugação de 15 mL e as células foram colhidas por centrifugação (4^o C), 4000 g, 10 minutos). A pelota de células foi suavemente re-suspensa em 1316 μΐ do sobrenadante, com subsequente adição de 84 μΐ de uma solução de ácido de MJ (250 mM em H2O) (concentração final 15 mM) . A cultura concentrada foi então separada em sete amostras de 200 μΕ e foram adicionados a cada amostra 1,2 μΕ de DMB-S-MMP puro (concentração final ~ 25 mM) . A cultura foi então submetida a agitação a 300 rpm à temperatura ambiente. Em cada ponto no tempo, foi realizada uma extração total mediante adição de 10 μΕ de 20% SDS para lisar as células, com subsequente extração líquido-líquido com 500 μΕ de EA/1% de AcOH. A fase orgânica foi removida, evaporada, e re-dissolvida em 50 μΕ de ACN para análise de HPLC. Para a amostra de BL21(DE3), foi adicionada uma alíquota adicional de 1,2 μΕ de DMB-S-MMP após 12 horas para reabastecimento dos substratos hidrolisados.

IDENTIFICAÇÃO DE BIOH COMO A ESTERASE DE DMB-S-MMP

Os presentes requerentes pretenderam em primeiro lugar identificar a enzima de E. coli responsável pela hidrólise observada de DMB-S-MMP para DMB-S-MPA durante a fermentação. Quando foram utilizados como substrato de tioéster diferentes transportadores de acila tais como dimetilbutiril-S-etil mercaptopropionato (DMB-S-EMP) e dimetilbutiril-S-metil tioglicolato (DMB-S-MTG), os presentes requerentes observaram os correspondentes ácidos carboxílicos hidrolisados no caldo de fermentação. Isto sugere que a enzima responsável é uma esterase ou hidrolase com especificidade de substrato relaxada para funcionalidades éster.

Os presentes requerentes utilizaram uma abordagem de alto rendimento para identificação da enzima responsável, utilizando a biblioteca de mutantes de knockout de gene único em-fase K-12 de E. coli (Coleção Keio) (vide, por exemplo, Baba e outros, (2006) Mol Syst Biol 2: 2006 0008). Os presentes requerentes consideraram que qualquer cepa mutante incapaz de hidrolisar DMB-S-MMP é diretamente devida à deleção de gene especifico. O exame de anotações de genoma de E. coli (vide, por exemplo, Blattner e outros, (1977) Science 277: 1453-1474) revela 23 esterases/enzimas semelhantes a esterase, 94 hidrolases/enzimas semelhantes a hidrolase, e 16 aciltransferases (133 genes candidatos no total). As enzimas com atividades confirmadas e substratos provavelmente envolvidos na hidrólise de DMB-S-MMP não foram examinados na primeira rodada de ensaios. A lista de 57 cepas mutantes BW25113 examinadas encontra-se ilustrada na Tabela 2.

Os mutantes, tipo natural de BW21113 e BL21(DE3) foram cultivados até a saturação em caldo de LB em uma placa de 96 receptáculos. Os presentes requerentes adicionaram 5 μΕ de DMB-S-MMP puro a cada cultura (1 mL) e a placa foi agitada vigorosamente durante 10 horas adicionais à temperatura ambiente. As culturas foram acidifiçadas, extraídas com acetato de etila, e as fases orgânicas foram analisadas por cromatografia de camada fina (Thin Layer Chromatography - TLC) com utilização de uma fase móvel (20% de acetato de etila em hexano) que permitiu a separação de DMB-S-MMP e DMB-S-MPA (Figura 14A) . Cada um dos tipos naturais de BW25113 (pista 58) e BL21(DE3) (pista 59) apresentou um nível comparável de hidrólise de substrato e acumulação de DMB-S-MPA. Todos os mutantes examinados apresentaram atividade hidrolítica para DMB-SMMP, com exceção de ÃbioH (pista 56, cepa JW3357) . Esta descoberta surpreendente sugere que o BioH (vide, por exemplo, O'Regan e outros, (1989) Nucleic Acids Res 17: 8004), que está envolvido na bio-síntese da biotina (vitamina H) poderá ser a única enzima responsável pela hidrólise observada in vivo. Um exame adicional com utilização de HPLC confirmou adicionalmente que o DMB-S-MPA não pode ser detectado no extrato orgânico do mutante ÃbioH, enquanto que aproximadamente 30% foi hidrolisado em cepas bioH+ (Figura 14B) .

CONFIRMAÇÃO DE PROPRIEDADES DE BIOH IN VITRO

Para comprovar que o BioH se encontra diretamente envolvido na hidrólise de DMB-S-MMP durante a fermentação, os presentes requerentes clonaram o gene bioH e expressaram o mesmo como uma proteína com marcação N-his de BL21(DE3) (vide, por exemplo, Tomczyk e outros, (2002) FEBS Lett 513: 299-304). A proteína foi purificada para homogeneização com utilização de cromatografia de afinidade Ni-NTA com um rendimento final de 9 mg/L. As propriedades catalíticas de BioH para DMB-S-MMP foram submetidas a ensaio e a magnitude da hidrólise foi medida por HPLC (234 nm) . O BioH apresentou cinética de Michaelis-Menten para DMB-S-MMP e os valores kcat e Km foram determinados como sendo 260 ± 45 seg-1 e 229 ± 26 μΜ, respectivamente (Figura 15A) .

As atividades de BioH para outros dimetilbutiril tioésteres foram igualmente examinadas com utilização do ensaio de HPLC e encontram-se ilustradas na Figura 15B. Em condições de reação idênticas (1 mM de substrato, 10 nM de BioH), os presentes requerentes observaram que o BioH apresentou a maior parte da potente atividade de esterase para DMB-S-MMP. O decréscimo de um átomo de carbono da extensão de infra-estrutura de ácido carboxílico causou um decréscimo de 2,5 vezes na taxa de hidrólise (DMB-S-MTG, ao passo que um acréscimo do tamanho da fração éster para um etil éster atenuou significativamente a taxa de hidrólise de substrato (DMB-S-EMP). Estas observações são consistentes com o resultado in vivo, em que ambos os substratos foram hidrolisados na presença de células, embora menos substancialmente que DMB-S-MMP.

O BioH é uma enzima essencial na bio-síntese de biotina em E. coli (vide, por exemplo, Lemoine e outros, (1996) Mol Microbiol 19: 645-647). Foi proposto que o BioH seja responsável pela síntese de pimeloil-CoA (vide, por exemplo, Guillen-Navarro e outros, (2005) FEMS Microbiol Lett 246: 159-165), porém sua função bioquímica exata não foi confirmada. Interessantemente, a estrutura cristalina de BioH de E. coli foi determinada com uma resolução de 1,7 Â em um esforço para prever a função de proteína de características estruturais (vide, por exemplo, Sanishvili e outros, (2003) J Biol Chem 278: 26039-26045). Uma análise estrutural de alto rendimento desvendou uma tríade catalítica em BioH que é igualmente encontrada em hidrolases conhecidas, o que apontou a possibilidade de o BioH possuir atividade hidrolítica. Ensaios com utilização de ésteres de p-nitrofenol demonstraram que o BioH apresenta atividades de carboxilesterase com preferência para ésteres de ácidos graxos de cadeia curta (vide, por exemplo, Sanishvili e outros, (2003) J Biol Chem 278: 26039-26045). O trabalho dos presentes requerentes, tanto in vivo quanto in vitro, elabora adicionalmente as propriedades bioquímicas do BioH e demonstra que a enzima tem uma especificidade de substrato muito ampla para frações éster. Em contraste, o BioH não apresentou atividades de tioesterase para a ligação tioéster presente nos substratos analisados neste trabalho. Não foi observada degradação adicional dos ácidos de tioésteres hidrolisados.

CONSTRUÇÃO DE MUTANTE ΔΒΙΟΗ YT2 DE BL21(DE3)

Após identificação e confirmação de BioH como a enzima responsável pela hidrólise de DMB-S-MMP durante a fermentação, ficou evidente que uma cepa de E. coli deficiente em BioH deveria ser utilizada como hospedeiro para a bio-sintese de célula inteira de ácido de sinvastatina. Os presentes requerentes construiram diversos vetores de expressão de LovD que não requerem a polimerase T7 e transformaram os mesmos em JW3357. A avaliação das taxas de bio-conversão de ácido de sinvastatina nestas cepas demonstraram que a atividade de LovD é significativamente menor que a de BL21(DE3)/pAW31. As velocidades de reação mais lentas são substancialmente atribuídas ao níveis de expressão reduzidos de LovD nestas combinações de hospedeiro/vetor, conforme foi determinado por análise SDS-PAGE. Como resultado, os presentes requerentes concluíram que é necessário um derivado ÁbioH de BL21(DE3) para obtenção de taxas de conversão máximas, com simultânea eliminação de hidrólise de substrato.

Cada um dos mutantes de knockout de gene único da Coleção Keio continha um gene de resistência à kanamicina ao invés do gene alvo (vide, por exemplo, Baba e outros, (2006) Mol Syst Biol 2: 2006 0008). O marcador é flanqueado por sítios FRT que facilitam a remoção do marcador pela enzima FLP. Os presentes requerentes utilizaram transdução de PI para deslocar o marcador AbioH::FRT-kan-FRT de JW3357 para BL21(DE3). Devido às diferenças de restrição entre a cepa K doadora e a cepa B recipiente, os presentes requerentes utilizaram WA837 de E. coli (menos-restrição, mais-modificação) como hospedeiro intermediário para transdução de PI (vide, por exemplo, Dien e outros, (2001) J Ind Microbiol Biotechnol 27: 259-264). Após transplante do marcador para BL21(DE3) para obtenção de YT1, o plasmídeo auxiliar pCP20 que contém um replicon sensível à temperatura e um gene de FLP induzível termicamente (vide, por exemplo, Datsenko e outros, (2000) Proc Natl Acad Sei U S A 97: 6640-6645; e Wanner, 2000), foi utilizado para remoção do gene de kan para obtenção de YT2 (BL21(DE3) AbioH::FRT). Uma análise de PCR com utilização de primers com associação às regiões de montante e de jusante confirmou a deleção de bioH, bem como a remoção do marcador kan (dados não ilustrados).

Ο YT2 foi então cultivado em mídia LB e foi realizado o ensaio de hidrólise de DMB-S-MMP. Conforme previsto, a nova cepa não catalisou nenhuma hidrólise detectável do tioéster e não pôde ser encontrado nenhum resíduo de DMB-S-MPA no caldo de cultura. O DMB-S-MMP pode ser recuperado quase quantitativamente da cultura saturada que foi cultivada durante > 24 horas, reassegurando que o substrato pode permanecer intacto durante uma fermentação prolongada com utilização desta cepa.

BIOCATÁLISE DE CÉLULA INTEIRA UTILIZANDO YT2

Os presentes requerentes examinaram em primeiro lugar a viabilidade de YT2 como hospedeiro para a síntese bio-catalitica de célula inteira de ácido de sinvastatina. O plasmídeo de expressão pAW31 foi transformado em YT2 através de eletroporação para obtenção de YT2/pAW31. Foram individualmente cultivados BL21(DE3)/pAW31 e YT2/pAW31 para OD₆oo de 0,5, com subseqüente indução de síntese de proteína com 100 μΜ de IPTG a 20° C durante até 16 horas. As duas cepas apresentaram cinéticas de crescimento idênticas quando foi utilizada mídia LB, alcançando o mesmo valor OD₆qo (3,9 ~ 4,0) ao final do período de expressão de proteína. Quando foi utilizada mídia mínima Fl, as duas cepas cresceram comparavelmente antes da indução (Figura 16A) . Em contraste, o YT2/pAW31 cresceu consideravelmente mais devagar que o BL21(DE3)/pAW31 em mídia sem suplementação de biotina após a indução. A densidade celular pós-indução para a cepa mutante foi de ~ 60% da cepa parental. Os presentes requerentes atribuíram a taxa de crescimento retardada a incapacidade do YT2/pAW31 para sintetizar biotina e suportar um crescimento robusto de células na mídia mínima. Quando a cepa YT2/pAW31 foi cultivada em mídia Fl suplementada com 0,15 mg/L de biotina, a cinética de crescimento da cepa mutante não foi distinta da cinética de BL21(DE3)/pAW31.

Os presentes requerentes compararam então a eficiência de YT2/pAW31 com BL21(DE3)/pAW31 no ensaio celular inteiro. Ambas as cepas foram cultivadas em mídia LB e foram concentradas dez vezes para mimetizarem um ambiente de densidade celular elevada após 12 horas de expressão de LovD. Foram adicionados ácido de MJ e DMB-SMMP para concentrações finais de 15 mM e 25 mM respectivamente, para inicio da bio-conversão. A Figura 16B mostra que o YT2/pAW31 foi significativamente mais eficiente no ensaio em resultado da deleção de bioH. A conversão completa (> 99%) foi observada para a cepa mutante em menos de 12 horas de incubação sem sinais de hidrólise de DMB-S-MMP. Em contraste, o BL21(DE3)/pAW31 obteve a mesma conversão em 24 horas, requerendo simultaneamente adição de mais 25 mM de DMB-S-MMP durante a fermentação como resultado da hidrólise do substrato. Durante a faixa linear da reação, o YT2/pAW31 sintetizou ácido de sinvastatina a uma taxa de 1,5 mM/hora, significativamente maior que a taxa de 0,75 mM/hora medida para BL21(DE3)/pAW31 (vide, por exemplo, Xie e outros, (2007) Appl Environ Microbiol 73: 2054-2060) . Com utilização de YT2/pAW31, os presentes requerentes foram igualmente capazes de reduzir a concentração minima de DMBS-MMP necessária para levar a reação até o final. A conversão completa para ácido de sinvastatina pode ser obtida com taxas idênticas com uma razão molar inicial de DMB-S-MMP (18 mM) para ácido de MJ (15 mM) tão baixa quanto 1,2 .

A melhoria da taxa é substancialmente devida ao acréscimo de concentração intracelular de DMB-S-MMP na ausência de BioH. Com base nos estudos in vitro, os presentes requerentes demonstraram que o bioH hidrolisa

DMB-S-MMP com extrema rapidez. Desta forma, mesmo em baixas concentrações intracelulares de BioH, a reação de hidrólise de substrato pode competir para o conjunto de substratos que se encontram presentes no citoplasma. A manutenção de uma concentração intracelular elevada de DMB-S-MMP é crítica, particularmente considerando que a LovD pode

catalisar a	reação	reversível	em	que o	ácido	de
sinvastatina	pode ser	hidrolisado	para ácido	de MJ	na
ausência de	doadores	de tioéster	de	acila (	: vide,	por
exemplo, Xie	e outros,	(2006) Chem Biol	13: 1161-	1169) .

A purificação do ácido de sinvastatina após bioconversão foi igualmente aperfeiçoada conforme é demonstrado mediante realização de uma fermentação de escala aumentada de YT2/pAW31 (200 mL, 15 mM de MJ, 18 mM de DMB-S-MMP). Após confirmação da conversão completa de ácido de MJ para ácido de sinvastatina mediante utilização de análise HPLC (Figura 17, indicação a), a combinação de caldo de fermentação e extrato de células foi lavada com hexano, acidificada com 6 M de HCI e filtrada para colheita do ácido de sinvastatina precipitado (indicação b) . Após lavagem da torta de filtragem com 1 volume de dH2O, o ácido de sinvastatina foi solubilizado em ACN, filtrado e analisado por HPLC (indicação c) . Não foram necessárias etapas de lavagem adicionais para remoção do DMB-S-MPA que se encontrava presente no BL21(DE3)/pAW31. A recuperação final de ácido de sinvastatina com utilização desta abordagem foi de 94%.

CONCLUSÃO

Conforme foi ilustrado acima, os presentes requerentes utilizaram uma biblioteca de knockout de gene único Keio para identificação BioH como a carboxilesterase que hidrolisa DMB-S-MMP durante a conversão bio-catalitica de célula inteira de ácido de sinvastatina a partir de ácido de MJ. O BioH apresenta taxas de hidrólise muito rápidas, esgotando a concentração intracelular de DMB-S-MMP disponível como doador de acila na transesterificação catalisada por LovD. Utilizando a cepa YT2 de expressão de bioH, os presentes requerentes puderam eliminar completamente a degradação de DMB-S-MMP e aumentar significativamente a robustez do biocatalisador de célula inteira. Esta cepa pode constituir um hospedeiro útil em outras aplicações de bio-catálise e bio-síntese orientadas a precursor quando um ou mais substratos utilizados contêm uma ligação éster lábil (vide, por exemplo, Murli e outros, (2005) Ãppl Environ Microbiol 71: 4503-4509).

EXEMPLO 4: SÍNTESE EFICIENTE DE SINVASTATINA UTILIZANDO BIOCATÁLISE DE CÉLULA INTEIRA

Este exemplo descreve um processo bio-catalítico de célula inteira, de uma etapa, para síntese de sinvastatina a partir de monacolina J. Conforme é discutido detalhadamente mais abaixo, utilizando uma cepa de Escherichia coli sob-expressando LovD de A terreus, os presentes requerentes puderam alcançar uma conversão de > 99% de monacolina J para sinvastatina sem utilização de quaisquer etapas químicas de proteção. Uma descoberta fundamental consistiu em um substrato com permeabilidade para membrana, a-dimetilbutiril-S-metil-mercaptopropionato (DMB-S-MMP), que foi utilizado com eficiência pela LovD como doador de acila. O processo foi aumentado em escala para síntese de sinvastatina em uma escala em gramas. Os presentes requerentes também demonstram que a sinvastatina sintetizada por este método pode ser prontamente purificada do caldo de fermentação com > 90% de recuperação e > 98% de pureza conforme determinados por HPLC. Foi igualmente examinada a bio-conversão com utilização de fermentação de alimentação em lotes, de elevada densidade celular. A biocatálise de célula inteira pode constituir portanto uma alternativa atraente para as atuais transformações semisintéticas de múltiplas etapas.

Atualmente, dois processos semi-sintéticos (vide, por exemplo, Askin e outros, 1991, J. Org. Chem. 56; e Hoffman e outros, 1986 J Med Chem 29: 849-52) são amplamente utilizados para síntese de sinvastatina a partir de lovastatina (Figura 18). Um processo adaptado comum (vide, por exemplo, Hoffman e outros, 1986 J Med Chem 29: 849-52) começa com a hidrólise da lovastatina para obtenção do principal intermediário monacolina J, seguida pela lactonização do ácido para proteção do grupo hidroxila Cll, e proteção de trimetilsililação da hidroxila C13. A monacolina J protegida é então submetida a acilação por cloreto de α-dimetilbutiril para obtenção da forma protegida de sinvastatina, que é subsequentemente desprotegida para obtenção de sinvastatina. Ambos os processos de múltiplas etapas ilustrados na Figura 18 são laboriosos, contribuindo assim para o fato de a sinvastatina ser quase cinco vezes mais dispendiosa que a lovastatina. Desta forma, um novo esquema semi-sintético capaz de reduzir o número de transformações químicas e aumentar a eficiência em geral da conversão poderá ter uma utilidade significativa.

Os presentes requerentes descreveram anteriormente a clonagem e caracterização de uma aciltransferase dedicada do agrupamento genético bio-sintético de lovastatina que transfere regioseletivamente o grupo a-metilbutiril da lovastatina dicetídeo sintase (LDKS) para o grupo hidroxila C8 da monacolina J para obtenção de lovastatina (vide, por exemplo, Xie e outros, 2006, Chem Biol 13: 1161-1169). Os presentes requerentes demonstraram que a LovD tem uma especificidade de substrato ampla para o transportador de acila, o grupo acila e o núcleo de decalina. Mais notavelmente, a LovD foi capaz de catalisar a acilação direta da monacolina J por uma a-dimetilbutiril-S-Nacetilcisteamina (DMB-S-NAC) para obtenção de sinvastatina. A reação é altamente regioespecífica para o álcool C8 apenas, e constitui portanto um potencial processo de uma etapa para produção de sinvastatina a partir de monacolina J sem emprego de química protetora.

Neste Exemplo, descrevemos o desenvolvimento de um processo bio-catalítico de célula inteira capaz de converter monacolina J em sinvastatina de uma forma altamente eficiente. Utilizando um novo tioéster como doador de acila, os presentes requerentes puderam obter uma conversão > 99% de sinvastatina a partir de monacolina J em uma única etapa. 0 processo de fermentação pode facilmente ter sua escala aumentada para produção de sinvastatina com rendimento de escala industrial.

SÍNTESE DE a-DIMETILBUTIRIL-S-METIL 3-MERCAPTOPROPIONATO (DMB-S-MMP):

Cloreto de dimetilbutiril (1,76 mL, 12 mmol) foi adicionado lentamente a uma solução de 50 mL de metil-3mercaptopropionato (1,30 mL, 12 mmmol) e trietilamina (3,340 mL, 24 mmol) em dietil éter a 0° C e a solução foi submetida a agitação durante 2 horas. A reação foi temperada com NH4C1 aquoso e foi extraída duas vezes com 100 mL de acetato de etila. A camada orgânica é combinada, submetida a secagem e evaporada para obtenção de um líquido incolor (2,6 g). O resíduo foi purificado com cromatografia de sílica-gel (EA/hexano, 20/80) para obtenção de DMB-S-MMP puro (2,25 g, 90% de rendimento). 1H NMR: δ 3,87 (s, 3H), 3,09 (t, 2H, 7,1 Hz), 2,58 (t, 2H, 7,0 Hz), 1,59 (q, 2H, 7,5 Hz), 1,18 (s, 6H) , 0,83 (t, 3H, 7,4 Hz) , 13C NMR: δ 206,16, 172,26, 51,81, 50,04, 34,38, 33,73, 24,71, 23,60, 8,92.

ENSAIO CINÉTICO DE ENSAIO DE LOVD:

100

A expressão e purificação de LovD foram anteriormente descritas detalhadamente (vide, por exemplo, Xie e outros, 2006, Chem Biol 13: 1161-1169) . Os ensaios foram realizados à temperatura ambiente em 50 mM de HEPES, pH 7,9. As velocidades iniciais (ki) dos substratos de acila foram determinadas com 10 μΜ de LovD, 1 mM de monacolina J e 4 mM do tioéster. A mistura de reação em diferentes pontos no tempo foi temperada por ácido trifluoroacético (TEA), extraída com acetato de etila, evaporada até secar e re-dissolvida em acetonitrilo. A porcentagem de conversão de monacolina J para sinvastatina foi determinada por análise de cromatografia HPLC (C18). A faixa limiar da taxa de conversão é relatada como ki na Tabela 1B. Para determinação do valor Km de DMB-S-MMP, a concentração de monacolina J tem um valor fixo de 2 mM, enquanto que a concentração de DMB-S-MMP foi variada de 0,2 mM até 10 mM. Foi adicionado DMSO até uma concentração final de 5% para facilitar a solubilização do DMB-S-MMP. Para obtenção do valor Km da monacolina J, a concentração de DMB-S-MMP tem um valor fixo de 2 mM, enquanto que a concentração de monacolina J foi variada de 0,2 mM até 5 mM.

ENSAIO DE ATIVIDADE DE LISADO DE CÉLULA INTEIRA

Foi utilizado um ensaio de lisado de célula inteira para determinação do nível de atividade de LovD em diferentes condições de fermentação. Por exemplo, a cepa

101

BL21(DE3) de E. coli transformada com pAW31 foi cultivada em midia LB a 37° C com um valor OD600 de 0,5, e nessa ocasião foram adicionadas à cultura 100 μΜ de IPTG e a expressão foi realizada à temperatura ambiente (Room Temperature - RT) durante 16 horas. Foi então colhida por centrifugação (4000 g, 20 minutos) uma alíquota de 70 ml da cultura. 0 sobrenadante foi removido, e a pelota de células foi re-suspensa em 7 ml de tampão de lise (20 mM de trisHC1, pH 7,9, 500 mM de NaCl). As células foram lisadas por sonicação em gelo e os detritos de células foram removidos por centrifugação (13.000 rpm, 10 minutos, 4^o C) . O lisado foi então adicionado diretamente ao ensaio in vitro. Condição final do ensaio: 50 mM de HEPES, pH 7,9, 1 mM de monacolina J, 4 mM de DMB-S-MMP, 5 μΐ de lisado de células, 25 μΐ de volume final. A concentração efetiva de LovD no caldo de fermentação foi então calculada da velocidade inicial utilizando-se 0,6 min-1 como taxa de conversão.

FERMENTAÇÃO DE BAIXA DENSIDADE

A cepa de E. coli BL21 (DE3) /pAW31 foi cultivada em midia LB a 37° C com um valor OD600 de 0,5, e nessa ocasião foram adicionadas à cultura 100 μΜ de IPTG e a expressão foi realizada à temperatura ambiente (RT) durante 16 horas. Uma cultura de 10 ml foi transferida para um tubo de centrifugação de 15 mL. As células foram colhidas por centrifugação (4000 g, 10 minutos). A pelota de células foi re-suspensa em 957 μΐ do sobrenadante. O pH foi ajustado

102 para pH 7,9 com 1,0 N de NaOH, com subsequente adição de 33 μΐ de MJ a 450 mM (concentração final 15 mM) e 6 μΐ de DMBS-MMP puro (concentração final ~ 25 mM) . A cultura foi então submetida a agitação a 300 rpm à temperatura ambiente. Em cada ponto no tempo foi removida uma alíquota de 4 μΐ da mistura de reação, temperada em 300 μΐ de acetato de etila contendo 1% de TEA. A fase orgânica foi removida, evaporada, e re-dissolvida em acetonitrilo para análise de cromatografia HPLC.

Para síntese de sinvastatina em maior escala, o procedimento acima teve sua escala aumentada com início com uma cultura da cepa de E. coli BL21(DE3)/pAW31 em um frasco de agitação de 2xlL. Após 16 horas de expressão com temperatura RT, o volume da cultura foi concentrado para 200 mL para um valor final OD600 de 22. Monacolina J (forma de sal de sódio) e DMB-S-MMP foram adicionados para uma concentração final de 15 mM e 25 mM, respectivamente. As células foram agitadas à temperatura ambiente e foi utilizada cromatografia HPLC para monitoração do progresso da reação. Para purificação da sinvastatina da fermentação após a reação ter sido completada (> 99% de conversão conforme a avaliação feita com cromatografia HPLC), foi utilizado o procedimento descrito a seguir. As células foram removidas por centrifugação. A sinvastatina intracelular foi extraída mediante agitação da pelota de células em acetona. A acetona foi então removida sob pressão reduzida e o resíduo foi dissolvido em dH2O e

103 filtrado. O filtrado e o caldo de fermentação transparente foram combinados, lavados duas vezes com volume igual de nhexano, e acidif içados para pH 2,0 com 6N HC1. O precipitado branco foi recuperado por filtração e foi lavado excessivamente com dH2O gelada para remoção do DMBS-MPA co-precipitado. Após secagem da torta de filtração sob vácuo, os sólidos foram agitados em 200 mL de acetonitrilo durante 1 hora, com subsequente filtração para remoção de materiais insolúveis. O filtrado foi evaporado até secar sob pressão reduzida para obtenção da forma ácida de sinvastatina.

FERMENTAÇÃO DE ALIMENTAÇÃO EM LOTES DE Fl DE ALTA DENSIDADE

A fermentação de alimentação em lotes de Fl e composição de midia foram adotados das técnicas de Pfeifer e outros (vide, por exemplo, Pfeifer e outros, 2002, Appl Environ Microbiol 68:3287-92). Os presentes requerentes excluiram a solução de vitamina tanto da midia de fermentação quanto da midia de alimentação. Uma cultura inicial foi cultivada durante a noite em 5 ml de midia LB (com 35 mg/L de kanamicina) a 37° C e 250 rpm e foi utilizado 1 mL para inocular um frasco de agitação de 100 ml de semeadura com midia Fl (com 35 mg/L de kanamicina) . Foram utilizados 10 mL da cultura de semeadura de Fl para inocular um recipiente Applikon Biobundle de 2 litros contendo 1 L de midia Fl. Foi realizada fermentação a 37° C e o pH foi mantido em 7,1 durante todo o experimento com 1 M de H2SO4 e NH4OH semi-concentrado. A aeração foi

104 controlada a 0,2 até 0,4 L/min e a agitação foi mantida a 900 rpm. Quando a leitura QD600 alcançou um valor entre 5 e 10, a temperatura da fermentação foi reduzida para RT, com subsequente adição de 200 μΜ de IPTG para indução de expressão de proteína. Simultaneamente, uma bomba peristáltica forneceu 0,08 mL/min da solução de alimentação para o fermentador.

Os valores efetivos de atividade e concentração de LovD em diferentes estágios da fermentação foram medidos conforme descrito acima. Para preparação de células em repouso para estudos de bio-conversão, as células foram centrifugadas a 5000 g durante 10 minutos, com subsequente re-suspensão suave no mesmo volume de tampão PBS, pH 7,4.

Foram então	adicionados	monacolina J	e	DMB-S-MMP	às
alíquotas de sinvastatina.	células	para início	da	síntese	de

RESULTADOS

IDENTIFICAÇÃO DE UM DOADOR DE ACILA CINETICAMENTE SUPERIOR

Foi anteriormente demonstrado que a LovD pode utilizar tioésteres permeadores de membrana como doadores de acila na reação de transesterificação (vide, por exemplo, Xie e outros, 2006, Chem Biol 13: 1161-1169). Foi constatado que tanto DMB-S-NAC quanto DMB-S-MTG (Tabela 1B) são substratos de LovD. Os dois substratos, entretanto, proporcionaram conversões deficientes na síntese de sinvastatina, com valores ki aparentes de ~ 0,02 por minuto. Adicionalmente, quando qualquer um dos substrato é

105 utilizado, a reação sofre uma grave inibição de substrato com concentrações crescentes de monacolina J. Desta forma, a principal prioridade no desenvolvimento de LovD para obtenção de um catalisador industrialmente útil para a quimio-bio-sintese de sinvastatina consiste na identificação de melhores substratos que possam superar estas duas limitações.

Os presentes requerentes sintetizaram diversas variantes adicionais de DMB-S-MTG e realizaram ensaios quanto a propriedades catalíticas in vitro. Foram individualmente sintetizados DMB-S-metil mercaptopropionato (DMB-S-MMP), DMB-S-etil mercaptopropionato (DMB-S-EMP) e DMB-S-metil mercaptobutirato (DMB-S-MMB) mediante reação de cloreto de a-dimetilbutiril com os correspondentes tióis livres. As taxas de conversão iniciais são comparadas na Tabela 1B. Surpreendentemente, o aumento da extensão do transportador de tioéster em um carbono (de C2 em S-MTG para C3 em S-MMP e S-EMP) aumentou significativamente a taxa de conversão da reação. A inserção de um carbono adicional em S-MMB (C4) produziu como resultado um aumento adicional da taxa de transesterificação. Na condição de reação padrão (1 mM de MJ, 4 mM de substrato de acila, 10 μΜ de LovD, 50 mM de HEPES, pH 7,9), as taxas de conversão iniciais de esterificação são 0,6, 0,7, 0,78 min-1 para DMB-S-MMP, DMB-S-EMP e DMB-S-MMB respectivamente. Os aumentos de > 30 vezes nas taxas refletem que a posição relativa dos grupos carbonila com relação à ligação

106 tioéster é critica para ligação à LovD. Em contraste, quando foi utilizado DMB-S-MPA como doador de acila, a taxa de conversão inicial decresceu significativamente para 0,08 por minuto, indicando que o ácido livre (provavelmente um sal de sódio) se liga deficientemente ao sitio ativo de LovD.

Os presentes requerentes selecionaram DMB-S-MMP como o tioéster de acila mais adequado para bio-catálise devido ao fato de o tiol precursor (metil mercaptopropionato) ser significativamente menos dispendioso que outros materiais de partida. Os parâmetros cinéticos da reação de acilação quando foi utilizado DMB-SMMP como doador de acila foram determinados e encontram-se ilustrados na Figura 19. Para obtenção dos valores Km de cada substrato na reação de transacilação, os presentes requerentes fixaram a concentração de um substrato, simultaneamente variando a concentração do outro substrato para obtenção de uma curva de cinética de Michaelis-Menten. A Figura 19A ilustra a taxa de conversão da reação (V/Eo) como função de concentração de monacolina J. Em contraste com substratos anteriormente ensaiados, não foi observada inibição de substrato por monacolina J e o valor Km foi determinado como sendo 0,78 ± 0,12 mM. A taxa de conversão de LovD em quantidades variáveis de DMB-S-MMP é similarmente determinada fixando-se a concentração de monacolina J em 2 mM (Figura 19B) . O valor Km de DMB-S-MMP é ilustrado como sendo 0,67 ± 0,04 mM. Em ambas as

107 titulações o valor kcat da reação foi determinado como sendo 0,66 ± 0,03 min-1. A análise cinética realizada pelos presentes requerentes demonstra claramente que o DMB-S-MMP é um substrato cineticamente superior em comparação com

tioésteres	anteriormente	relatados. 0	nível de	inibição	de
substrato	em uma	reação	Ping	Pong Bi	Bi depende do valor
relativo	Km dos	dois	substratos.	Quando	DMB-S-MMP	é
utilizado	como	substrato	de acila, seu	valor	Km

relativamente mais baixo permite que o mesmo se ligue a LovD prontamente e não seja portanto inibido por concentrações crescentes de monacolina J. Esta importante propriedade permite portanto o desenvolvimento de um processo bio-catalitico em lotes em contraste com um processo de alimentação em lotes em que é necessário fornecer continuamente a monacolina J para manter sua concentração baixa e minimizar a inibição de substrato.

Os presentes requerentes observaram anteriormente que a acila-S-MTG era rapidamente hidrolisada quando adicionada a uma reação de caldo de fermentação de E. coli (vide, por exemplo, Xie e outros, 2006, Chem Biol 13: 11611169). Para testar a estabilidade do doador de acila agora identificado em condições in vivo, foi adicionado DMB-S-MMP puro a mídia LB inoculada com células de E. coli BL21(DE3) e a cultura foi cultivada a 37° C durante a noite (16 horas) . Foi observada uma degradação de ~ 20% do substrato para um composto predominantemente mais polar. Em comparação com compostos conhecidos utilizando

108 cromatografia HPLC, os presentes requerentes identificaram o principal produto de degradação como sendo DMB-S-MPA, que pode surgir através da ação de lipases de E. coli endógenas. Os presentes requerentes concluíram que quando o DMB-S-MMP é fornecido em excesso para a reação em lotes, a baixa degradação não limitará a bio-conversão de monacolina J para sinvastatina.

BIO-CATÁLISE DE CÉLULA INTEIRA

Equipados com o significativamente mais eficiente tioéster DMB-S-MMP, os presentes requerentes estudaram a conversão de monacolina J para sinvastatina utilizando E. coli como um bio-catalisador de célula inteira. Uma cepa BL21(DE3) transformada com o plasmídeo de expressão pAW31 derivado de pET28a foi utilizada como hospedeiro microbiano. A expressão de LovD foi realizada durante 16 horas à temperatura ambiente e o nível de expressão foi visualizado com SDS-PAGE. Para quantificação da quantidade ativa de LovD expressada em diferentes condições de cultura e mídias, os presentes requerentes empregaram um ensaio de atividade em que o lisado de célula inteira foi diretamente adicionado a um ensaio de reação contendo 1 mM de monacolina J, 4 mM de DMB-S-MMP em 50 mM de HEPES, pH 7,9. A conversão de monacolina J para sinvastatina foi quantificada por cromatografia HPLC e a concentração aparente de LovD foi estimada com utilização do valor ki de 0,6 min-1 (Tabela 1B). Em condições de baixa densidade de células, a expressão de LovD é quase três vezes maior com

109 mídia LB do que com mídia mínima Fl (Tabela 3).

Os presentes requerentes testaram então a quimiobio-síntese de sinvastatina em mídia LB. Após expressão de LovD durante a noite, uma alíquota de 10 mL das células foi concentrada dez vezes para 1 mL em LB. A etapa de concentração foi realizada para obtenção de um ambiente de alta densidade celular mimetizando condições de fermentação e para obtenção de uma concentração efetiva mais elevada de LovD (concentração final de aproximadamente 20 μΜ). A forma de sal de sódio de monacolina J foi adicionada para uma concentração final de 15 mM (de um material de 450 mM em água) e foi adicionado DMB-S-MMP puro para um concentrado final de 25 mM. A mistura de reação foi então agitada vigorosamente à temperatura ambiente. Foram tomados periodicamente pontos no tempo para verificação da conversão de monacolina J em sinvastatina (Figura 20A).

Conforme se encontra ilustrado na Fig. 20B, a cultura simples de baixa densidade de BL21(DE3)/pAW31 constituiu um bio-catalisador robusto de célula inteira para síntese de sinvastatina. Uma fase de intervalo inicial de 2 horas foi observada no início da adição dos dois substratos, seguida por uma rápida conversão com uma velocidade de reação linear de ~ 0,73 nm por hora. A taxa de reação torna-se mais lenta em conversões mais elevadas (> 95%) em resultado do esgotamento de monacolina J. Em 24 horas, 99% da monacolina J foi convertida em sinvastatina. Com base na análise de cromatografia HPLC, não foi

110 observada degradação de monacolina J nem de sinvastatina por metabolismo celular. Os presentes requerentes observaram uma redução de ~ 20% nas leituras OD600 da cultura após 24 horas, sugerindo que o processo de célula inteira pode ser mantido para catálise prolongada.

Os presentes requerentes relataram que a LovD é capaz de hidrolisar lovastatina para monacolina J in vitro com um valor kcat de 0,21 min-1 de reação (vide, por exemplo, Xie e outros, 2006, Chem Biol 13: 1161-1169). Para examinar se é possível acoplar a etapa de hidrólise à etapa de acilação em uma única etapa de fermentação, os presentes requerentes ensaiaram a taxa de hidrólise de lovastatina por BL21(DE3)/pAW31. Nas mesmas condições in vivo referidas acima, foi observada uma baixa taxa de formação de monacolina J. Começando com 0,5 mM de lovastatina (forma de sal de sódio) , os presentes requerentes alcançaram 91% de hidrólise em 48 horas, com uma taxa de conversão de ~ 0,01 mM por hora, quase 75 vezes mais lenta que a taxa da reação de acilação. Isto contrasta vivamente com os resultados cinéticos in vitro, em que a taxa de hidrólise é apenas três vezes mais lenta que a reação de acilação. A significativa atenuação da taxa de hidrólise de lovastatina in vivo é provavelmente devida à barreira de permeação das membranas celulares para a lovastatina que é mais hidrofóbica. Os presentes requerentes tentaram aliviar a barreira de permeabilidade de membrana utilizando uma cepa alternativa BL21(DE3)/pXXK2, em que a LovD é clonada com

111 uma seqüência de sinal pelB de terminal N para localização no espaço periplásmico. Não foi observado nenhum aperfeiçoamento de atividade hidrolitica para esta cepa, indicando que a impermeabilidade da membrana de plasma externa constitui o principal obstáculo de transporte.

RECUPERAÇÃO E PURIFICAÇÃO DE SINVASTATINA

Para obter acesso ao rendimento de recuperação de sinvastatina do processo bio-catalitico de célula inteira, os presentes requerentes aumentaram a escala da bioconversão para um volume final de 200 mL. Isto foi obtido mediante concentração de 2 x IL da cepa de expressão em mídia LB após expressão de LovD durante a noite. A forma de sal de sódio de monacolina J e DMB-S-MMP foram adicionados para uma concentração final de 15 mM e 25 mM respectivamente e o progresso da reação foi monitorado por cromatografia HPLC. Os presentes requerentes observaram uma cinética de conversão idêntica no processo de escala maior e foi obtida uma conversão de > 99% 24 horas após a adição de substrato. A sinvastatina obtida da via quimio-biosintética pode ser prontamente purificada do caldo de fermentação sem utilização de etapas de cromatografia. Uma etapa de centrifugação foi utilizada para separar as células e o caldo de fermentação. A sinvastatina intracelular foi recuperada mediante agitação da pelota de células em acetona, seguida por evaporação, e re-dissolução em dH2O. A solução aquosa contendo a sinvastatina intracelular foi combinada com o caldo de fermentação e foi

112 lavada com n-hexano para remoção de DMB-S-MMP. A solução aquosa foi então acidificada com 6N HCI para pH 2,0, resultando em precipitação das formas de ácido livre de sinvastatina e DMB-S-MPA. Conforme é conhecido na técnica, as formas de ácido livre de sinvastatina podem ser convertidas em sódio, potássio, amônio, ou qualquer outro sal derivado de elementos alcalinos terrosos ou outros sais metálicos. Estes sais podem então ser convertidos em sinvastatina pura, por exemplo mediante utilização de metodologias comuns conhecidas na técnica. O contaminante DMB-S-MPA pode ser removido por filtração e lavagem da placa de filtração com excesso de dH2O. O filtrado acidificado continha < 1% das quantidades totais de sinvastatina recuperadas. A sinvastatina quase pura pode ser recuperada mediante lavagem da torta de filtração com acetronitrilo, seguida por evaporação do filtrado (Recuperação final: 1,13 g, 90%; pureza final conforme determinada por cromatografia HPLC: 98%).

FERMENTAÇÃO DE ALTA DENSIDADE DE CÉLULAS

Os presentes requerentes exploraram a atividade do biocatalisador de célula inteira utilizando um fermentador de alta densidade de célula. A concentração efetiva de LovD medida de um fermentador de lote utilizando TB como midia e a de um processo de alimentação em lotes utilizando midia minima Fl encontram-se ilustradas na Tabela 3. Com utilização do processo de alimentação em lotes adotado daquele relatado por Pfeifer e outros (vide, por exemplo,

113

Pfeifer e outros, 2002, Appl Environ Microbiol 68: 328792), os presentes requerentes foram capazes de obter culturas com densidades celulares e atividades de LovD muito elevadas (Figura 21A) . Os presentes requerentes puderam obter ~ 1,5 g/L de expressão de LovD ativa com um valor OD600 de 75, 40 horas após a inoculação (Figura 21A).

Devido ao elevado custo dos materiais de partida, os presentes requerentes não puderam realizar uma bioconversão utilizando o caldo de fermentação inteiro. Ao invés disso, foram obtidas alíquotas de amostras da cultura em diversos pontos durante o processo de fermentação (Figura 21A) . As atividades de LovD em cada ponto no tempo foram determinadas com utilização do ensaio de lisado de célula inteira descrito em Materiais e Métodos. Os presentes requerentes realizaram então a bio-conversão utilizando 1 mL da cultura diretamente e mediram a taxa de formação de sinvastatina (Células não repousantes, Figura 21B). Alternativamente, foram igualmente examinadas as propriedades do biocatalisador de célula inteira após resuspensão das pelotas de células em PBS, pH 7,4 (Células em repouso). Conforme pode ser observado na Figura 21B, em cada ponto no tempo puderam ser obtidas altas taxas de conversão quando as células são dispostas em um ambiente de repouso. Adicionalmente, a atividade total de LovD na cultura não é correlacionada linearmente com a taxa de conversão. Por exemplo, as células em repouso do ponto 3 no tempo apresentaram a taxa mais elevada de conversão em

114 sinvastatina de aproximadamente 1 g/L/hora, apesar de a atividade de LovD total ser menor em comparação com as células obtidas do ponto 4 no tempo. A excepcional robustez destas células foi capaz de completar a conversão de 15 mM de monacolina J para sinvastatina em menos de 8 horas.

Uma descoberta importante neste exemplo consiste na identificação de um outro tioéster de acila adicional que doa uma fração acila ao grupo hidroxila C8 da monacolina J na presença de LovD aciltransferase, que é significativamente mais eficiente nesta reação de acilação. Os presentes requerentes identificaram anteriormente o DMBS-NAC como um substrato de LovD (vide, por exemplo, Xie e outros, 2006, Chem Biol 13: 1161-1169). Entretanto, a reação de acilação ocorreu com uma conversão menos que ideal, e como resultado da fraca ligação de substrato a LovD, o segundo substrato monacolina J tornou-se um inibidor competitivo de DMB-S-NAC. Esta última propriedade é particularmente prejudicial devido ao fato de forçar a concentração de monacolina J a ser mantida em um nível mínimo durante a bio-conversão. Tanto DMB-S-MMP quanto DMBS-MMB são superiores a DMB-S-NAC como doadores de acila. O valor kcat de DMB-S-MMP é aproximadamente 30 vezes mais elevado através de uma sutil alteração estrutural do transportador de acila, ao passo que o valor Km é agora comparável ao da monacolina J, dessa forma eliminando a inibição de substrato da monacolina J. Adicionalmente, o precursor de tiol S-MMP é significativamente menos

115 dispendioso em comparação com S-NAC. Considerando que os tioésteres S-NAC de acila são utilizados predominantemente na bio-sintese orientada para precursor de produtos naturais (vide, por exemplo, Jacobsen e outros, 1977, Science 277:367-9), os transportadores de tioéster de acila descritos neste trabalho podem ser também muito importantes em outras aplicações de bio-sintese de engenharia.

Os presentes requerentes tentaram desenvolver um processo bio-catalitico in vitro para conversão de monacolina J em sinvastatina. Partiu-se do princípio de que uma LovD basicamente purificada poderia ser útil para superar quaisquer dificuldades de transporte e purificação associadas com a fermentação de célula inteira. A LovD pode ser prontamente fracionada de uma maioria de outras proteínas celulares através de uma única etapa de precipitação de 30% de sulfato de amônio. Mais de 98% da atividade de LovD medida do lisado de célula inteira pode ser reconstituída mediante ressolubilização da pelota precipitada em 50 mM de HEPES, pH 7,9. Entretanto, a LovD precipita-se prontamente (horas) em elevadas concentrações de proteína (~ 100 μΜ) , e lentamente (dias) em concentrações mais baixas (~ 10 μΜ) em condições de ensaio a temperatura ambiente. Interessantemente, a proteína LovD precipitada pode ser ressolubilizada após diluição no mesmo tampão e recupera praticamente toda a atividade.

Quando quantidades moderadas de monacolina J (> 5 mM) foram utilizadas em um processo in vitro em lote, os

116 presentes requerentes não conseguiram obter > 60% de conversão de equilíbrio de monacolina J para sinvastatina, mesmo após uma incubação prolongada. Isto é provavelmente devido a uma reação de competição em que a sinvastatina é novamente hidrolisada para monacolina J por LovD. Quando a concentração de sinvastatina alcança a faixa milimolar, a velocidade da reação de hidrólise alcança o valor máximo (kcat = 0,3 min-1) e portanto impede significativamente a taxa líquida geral de acilação.

Interessantemente, a reação inversa não constituiu um fator limitativo em condições in vivo quando a concentração de estatina era de entre 10 e 15 mM (4 g/L - 6 g/L) , conforme fica evidente na elevada conversão (> 99%) de monacolina J para sinvastatina obtida neste estudo. Pensa-se que após a monacolina J ter sido convertida em sinvastatina, exportadores multidrogas tais como o complexo tripartite AcrAB-TolC são capazes de extrudar a sinvastatina da membrana interna ou do periplasma para a mídia (vide, por exemplo, Murakami e outros, 2006, Nature 443:173-9). A impermeabilidade da membrana externa de E. coli impede o reingresso da sinvastatina hidrofóbica. A mais polar monacolina J é capaz de se difundir continuamente através da membrana e servir como um substrato de LovD. Em conjunto, a membrana externa de E. coli e suas bombas de efluxo reduzem efetivamente a concentração intracelular de sinvastatina disponível para hidrólise, dessa forma atenuando a taxa da reação inversa

117 indesejável, e maximizando a conversão da reação desejada. Entretanto, as bombas de efluxo normalmente expressadas por E. coli podem ser sobrecarregadas quando a concentração de substrato é aumentada para > 20 mM. Em concentrações elevadas de monacolina J (e portanto de sinvastatina) e DMB-S-MMP, os presentes requerentes puderam obter uma conversão máxima de 85 ~ 90%. O exame da distribuição de sinvastatina na cultura revelou que uma quantidade significativa (> 20%) se encontra localizada dentro das células, dessa forma causando provavelmente niveis aumentados de hidrólise de produto. Não é sabido se a sinvastatina foi particionada na membrana interna, no citoplasma ou no periplasma. Os presentes requerentes examinam atualmente métodos para aumento da taxa de exportação de sinvastatina mediante super-expressão de bombas de efluxo multidrogas selecionadas (vide, por exemplo, Masi e outros, 2003, J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sei 786:197-205).

Neste exemplo, os presentes requerentes desenvolveram um processo bio-catalitico de célula inteira altamente robusto para síntese de sinvastatina a partir de monacolina J. Utilizando E. coli como hospedeiro, foi implementado um processo de escala laboratorial capaz de síntese em escala de gramas. Adicionalmente, foi criado um esquema de purificação de jusante simples para fácil recuperação e purificação do produto. Os presentes requerentes utilizam atualmente abordagens racionais e

118 orientadas para evolução para aperfeiçoamento das taxas de conversão catalítica de LovD. Com otimização das propriedades de LovD, bem como engenharia metabólica do hospedeiro para aperfeiçoamento do rendimento de produção da conversão, a via quimio-bio-sintética de obtenção de sinvastatina pode constituir uma alternativa competitiva e atraente para as vias sintéticas ilustradas na Figura 18.

A presente invenção não tem seu escopo limitado pelas configurações aqui divulgadas, que pretendem constituir simples ilustrações de aspectos individuais da invenção, e quaisquer configurações funcionalmente equivalentes são abrangidas no escopo da invenção. Diversas modificações dos modelos e métodos da invenção, adicionalmente àquelas aqui descritas, irão tornar-se aparentes para aqueles que são versados na técnica a partir dos ensinamentos e da descrição acima, e situam-se similarmente dentro do escopo da invenção. Essas modificações ou outras configurações podem ser praticadas sem afastamento do verdadeiro escopo e espirito da invenção.

119

TABELAS

Tabela IA. Tioésteres de acila como substratos de LovD^[al

Substrato de Conversão¹⁰¹,

Tioéster de Acila RT (min)^[C1

Substrato de Conversão, RT Tioéster de Acila (min)

7%, 5,1

35%, 6,0

52%, 6,8

87%, 6,8

32%, 8,7

7%, 10,6

OH 0

AA_s-coa

HO

s'^CoA

89%, 4,6

35%, 4,2

6%, 6,5

N.R.^lal

N.R.

69%, 7,6

50%, 6,8

22%, 7,6

52%, 7,8

33%, 8,7

2%, 7,5

58%, 7,6

10%, 8,5

92%, 6,8

70%, 7,6

17%, 8,5 [a] Os produtos das reações foram verificados por LC-MS.

Condições de reação: 10 μΜ de LovD, 1 mM de monacolina J, 4 mM de tioéster de acila, 50 mM de HEPES, pH 7,9, 25° C, 10 horas. [b] A conversão é medida pela porcentagem de monacolina J convertida para o correspondente análogo de lovastatina com utilização de cromatografia HPLC (238 nm) .

[c] Tempo de retenção da forma de ácido livre do produto 10 medida por HPLC (C18 fase reversa) . O Gradiente de HPLC é idêntico àquele descrito na Figura 5.

120

Tabela IB: Comparação de velocidades iniciais de substratos de tioéster.

Substrato de Tioéster Abreviação

Velocidade Inicial ( k_if min ⁱ) ^a o

DMB-S-NAC

0.02

O

H s—^N

O

DMB-S-MTG

DMB-S-MMP

0.03

0.60

O

DMB-S-EMP

0.70

S

Ό'

O

DMB-S-MMB

0.78

O

O

OH

DMB-S-MPA

0.08 ^a Condições de reação: 1 mM de

MJ, 4 mM de substrato de tioéster uM de LovD pura mM de HEPES, pH 7,9; a velocidade é definida como a taxa de conversão faixa linear.

121

Tabela 2. Lista de mutantes de E. coli BW25113 triados neste trabalho. Os números correspondem às pistas de TLC ilustradas na Figura 14A. A BioH foi demonstrada ser a única enzima responsável pela hidrólise de DMB-S-MMP.

N°	Deleção de Gene	N°	Deleção de Gene	N°	Deleção de Gene	N°	Deleção de Gene
1	AgloB	16	AyegU	31	Apaal	46	AyidA
2	AmhpC	17	AlpxL	32	AyegX	47	AyieH
3	AybhA	18	AlpxM	33	AyfbT	48	AyigB
4	AybiV	19	AyedL	34	AypfH	49	AyigL
5	AycaC	20	Addg	35	Aypfí	50	AysgA
6	ArarA	21	AcaiE	36	AygaP	51	AeptA
7	AymdC	22	AwbbJ	37	AyqaB	52	AyjfP
8	AycfH	23	AwcaF	38	AyghX	53	AcheB
9	AycgM	24	AwcaB	39	AyghY	54	AyeiG
10	AyciA	25	AfrmB	40	AygjP	55	AyqiA
11	AycJT	26	AtesB	41	AuxaA	56	AbioH
12	AycJY	27	Aaes	42	AyheT	57	AyjjU
13	AynbC	28	AtesA	43	Aphp	58	BW25113
14	AyniC	29	AybgC	44	AyrfG	59	BL21(DE3)
15	AyecD	30	AybhC	45	AeptB	60	BL21/pAW31

122

Tabela 3: Comparação de rendimento de proteínas de diferentes condições de expressão³

Condição	de Fermentação	Concentração de LovD (mg/L)O
LB baixa	densidade	96
F1 baixa	densidade	34
TB alta	densidade	980
F1 alimentação por lotes alta densidade	1500

^a Os rendimentos relatados representam o rendimento mais elevado que foi observado nas respectivas condições.

0 rendimento de proteína é estimado do ensaio in vitro utilizando lisado de célula inteira conforme descrito em Materiais e Métodos. A conversão observada é utilizada para estimar a concentração de LovD utilizando uma taxa de conversão de 0.6 min^-1.

123

Tabela 4: Informação de Seqüência de Polipeptídeos

LOVD transesterase de Aspergillus terreus. N° de Acesso AAD34555

Kennedy e outros. Science. 21 de maio de 1999; 284(5418): 1368-72

MGS 11DAAAAADPVVLMETAFRKAVKSRQIPGAVIMARDCSGNLNYTRCFGARTVRRDE CNQLPPLQVDTPCRLASATKLLTTIMALQCMERGLVDLDETVDRLLPDLSAMPVLEGFD DAGNARLRERRGKITLRHLLTHTSGLSYVFLHPLLREYMAQGHLQSAEKFGIQSRLAPP AVNDPGAEWIYGANLDWAGKLVERATGLDLEQYLQENICAPLGITDMTFKLQQRPDMLA RRADQTHRNSADGRLRYDDSVYFRADGEECFGGQGVFSGPGSYMKVLHSLLKRDGLLLQ PQTVDLMFQPALEPRLEEQMNQHMDASPHINYGGPMPMVLRRSFGLGGIIALEDLDGEN WRRKGSLTFGGGPNIVWQIDPKAGLCTLAFFQLEPWNDPVCRDLTRTFEHAIYAQYQQG (SEQ ID NO: 1).

MlcH transesterase de Penicillium citrinum. N° de ACCESSO BAC20561

Abe e outros, Mol. Genet. Genomics 267 (5), 636-646 (2002)

MAPS IDVIPTAASTAAGMISDMEAAFKSAVKLKQIPGAVVMARSMNGDIDYTRCFGART

VERDECQRLPPMEIDTPLRLASATKLLTTIMALQCMEQGLVDLDENVNRLLPDLSDMQV LTGFDAAGNAIMRDREGIIKLRHLLTHTSGLSYAFLHPLLQEYMAKGYLKTAEKFGIQS RLAPPAINDPGVEWIYGANLDWAGKLIERATGVDLEEFMQKNICEPLGITDMTFKLQQR PDMLARRSDQTRRNENGSLRYDDSVYFRHDGEECFGGQGVFCGPESYMKVLNSLMKHDG LLLKKDTIELMFQPALDAELEKKMNDHMDTTPHINYGAALPPVMRRNFGLGGIIAMGDL DGHNWRREGSLTFGGGPNIVWQIDPTVGLCTLVVFQLEPWNDPICKDLTRKFEKAMYSQ VKCRN (SEQ ID NO: 2) .

LOVF Policetideo Sintase de Aspergillus terreus. AAD34559

Kennedy e outros. Science 21 de maio de 1999; 284(5418) :

124

1368-72

MTPLDAPGAPAPIAMVGMGCRFGGGATDPQKLWKLLEEGGSAWSKIPPSRFNVGGVYHP NGQRVGSMHVRGGHFLDEDPALFDASFFNMSTEVASCMDPQYRLILEVVYEALEAAGIP LEQVSGSKTGVFAGTMYHDYQGSFQRQPEALPRYFITGNAGTMLANRVSHFYDLRGPSV SIDTACSTTLTALHLAIQSLRAGESDMAIVAGANLLLNPDVFTTMSNLGFLSSDGISYS FDSRADGYGRGEGVAAIVLKTLPDAVRDGDPIRLIVRETAINQDGRTPAISTPSGEAQE CLIQDCYQKAQLDPKQTSYVEAHGTGTRAGDPLELAVISAAFPGQQIQVGSVKANIGHT EAVSGLASLIKVALAVEKGVIPPNARFLQPSKKLLKDTHIQIPLCSQSWIPTDGVRRAS INNFGFGGANAHAIVEQYGPFAETSICPPNGYSGNYDGNLGTDQAHIYVLSAKDENSCM RMVSRLCDYATHARPADDLQLLANIAYTLGSRRSNFRWKAVCTAHSLTGLAQNLAGEGM RPSKSADQVRLGWVFTGQGAQWFAMGRELIEMYPVFKEALLECDGYIKEMGSTWSIIEE LSRPETESRVDQAEFSLPLSTALQIALVRLLWSWNIQPVAVTSHSSGEAAAAYAIGALT ARSAIGISYIRGALTARDRLASVHKGGMLAVGLSRSEVGIYIRQVPLQSEECLVVGCVN SPSSVTVSGDLSAIAKLEELLHADRIFARRLKVTQAFHSSHMNSMTDAFRAGLTELFGA DPSDAANASKDVIYASPRTGARLHDMNRLRDPIHWVECMLHPVEFESAFRRMCLDENDH MPKVDRVIEIGPHGALGGPIKQIMQLPELATCDIPYLSCLSRGKSSLSTLRLLASELIR AGFPVDLNAINFPRGCEAARVQVLSDLPPYPWNHETRYWKEPRISQSARQRKGPVHDLI GLQEPLNLPLARSWHNVLRVSDLPWLRDHVVGSHIVFPGAGFVCMAVMGISTLCSSDHE SDDISYILRDVNFAQALILPADGEEGIDLRLTICAPDQSLGSQDWQRFLVHSITADKND WTEHCTGLVRAEMDQPPSSLSNQQRIDPRPWSRKTAPQELWDSLHRVGIRHGPFFRNIT CIESDGRGSWCTFAIADTASAMPHAYESQHIVHPTTLDSAVQAAYTTLPFAGSRIKSAM VPARVGCMKISSRLADLEARDMLRAQAKMHSQSPSALVTDVAVFDEADPVGGPVMELEG LVFQSLGASLGTSDRDSTDPGNTCSSWHWAPDISLVNPGWLEKTLGTGIQEHEISLILE LRRCSVHFIQEAMESLSVGDVERLSGHLAKFYAWMQKQLACAQNGELGPESSSWTRDSE QARCSLRSRVVAGSTNGEMICRLGSVLPAILRREVDPLEVMMDGHLLSRYYVDALKWSR SNAQASELVRLCCHKNPRARILEIGGGTGGCTQLVVDSLGPNPPVGRYDFTDVSAGFFE AARKRFAGWQNVMDFRKLDIEDDPEAQGFVCGSYDVVLACQVLHATSNMQRTLTNVRKL

125

LKPGGKLILVETTRDELDLFFTFGLLPGWWLSEEPERQSTPSLSPTMWRSMLHTTGFNG VEVEARDCDSHEFYMISTMMSTAVQATPMSCSVKLPEVLLVYVDSSTPMSWISDLQGEI RGRNCSVTSLQALRQVPPTEGQICVFLGEVEHSMLGSVTNDDFTLLTSMLQLAGGTLWV TQGATMKSDDPLKALHLGLLRTMRNESHGKRFVSLDLDPSRNPWTGDSRDAIVSVLDLI SMSDEKEFDYAERDGVIHVPRAFSDSINGGEEDGYALEPFQDSQHLLRLDIQTPGLLDS LHFTKRNVDTYEPDKLPDDWVEIEPRAFGLNFRDIMVAMGQLESNVMGFECAGVVTSLS ETARTIAPGLAVGDRVCALMNGHWAS RVTT SRTNVVRIPETLS FPHAASIPLAFTTAYI SLYTVARILPGETVLIHAGAGGVGQAAIILAQLTGAEVFTTAGSETKRNLLIDKFHLDP DHVFSSRDSSFVDGIKTRTRGKGVDVVLNSLAGPLLQKSFDCLARFGRFVEIGKKDLEQ NSRLDMSTFVRNVSFSSVDILYWQQAKPAEIFQAMSEVILLWERTAIGLIHPISEYPMS ALEKAFRTMQSGQHVGKIVVTVAPDDAVLVRQERMPLFLKPNVSYLVAGGLGGIGRRIC EWLVDRGARYLIILSRTARVDPVVTSLQERGCTVSVQACDVADESQLEAALQQCRAEEM PPIRGVIQGAMVLKDALVSQMTADGFHAALRPKVQGSWNLHRIASDVDFFVMLSSLVGV MGGAGQANYAAAGAFQDALAEHRMAHNQPAVTIDLGMVQSIGYVAETDSAVAERLQRIG YQPLHEEEVLDVLEQAISPVCSPAAPTRPAVIVTGINTRPGPHWAHADWMQEARFAGIK YRDPLRDNHGALSLTPAEDDNLHARLNRAISQQESIAVIMEAMSCKLISMFGLTDSEMS ATQTLAGIGVDSLVAIELRNWITAKFNVDISVFELMEGRTIAKVAEVVLQRYKA (SEQ ID NO: 3).

Carboxilesterase bioH de Escherichia coli. ACESSO Q8FCT4 Welsch e outros, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (26), 17020-17024 (2002)

MNNIWWQTKGQGNVHLVLLHGWGLNAEVWRCIDEELSSHFTLHLVDLPGFGRSRGFGAL SLADMAEAVLQQAPDKAIWLGWSLGGLVASQIALTHPERVQALVTVASSPCFSARDEWP GIKPDVLAGFQQQLSDDFQRTVERFLALQTMGTETARQDARALKKTVLALPMPEVDVLN GGLEILKTVDLRQPLQNVSMPFLRLYGYLDGLVPRKVVPMLDKLWPHSESYIFAKAAHA PFISHPAEFCHLLVALKQRV

Claims (13)

1. MÉTODO PARA PRODUÇÃO DE SINVASTATINA, compreendendo as etapas de:

(1) combinação entre si de monacolina J; um tioéster de acila doador de uma fração acila para o grupo hidroxila C8 da monacolina J na presença de LovD aciltransferase; e LovD aciltransferase; e (2) deixando-se a LovD aciltransferase utilizar um grupo acila do tioéster de acila para acilar regioseletivamente o grupo hidroxila C8 da monacolina J;

a) a sinvastatina ser produzida in vitro na ausência de um organismo isolado; ou

b) a sinvastatina ser produzida in vivo em uma mídia de fermentação na presença de um organismo isolado, e o tioéster de acila ser derivado de uma fonte exógena e adicionado à mídia de fermentação, sendo dessa forma produzida sinvastatina, caracterizado por a LovD aciltransferase ter a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 ou da SEQ ID NO: 2., em que (3) o tioéster de acila é selecionado de adimetilbutiril-S-metil-mercaptopropionato (DMB-S-MMP), dimetilbutiril-S-etil mercaptopropionato (DMB-S-EMP), dimetilbutiril-S-metil tioglicolato (DMB-S-MTG) e dimetilbutiril-S-metil mercaptobutirato (DMB-S-MMB).

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a monacolina J; o tioéster de acila e a LovD aciltransferase serem combinados em uma mídia de

Petição 870190097940, de 30/09/2019, pág. 5/13 fermentação na presença de um organismo isolado que produz LovD aciltransferase e em que adicionalmente o organismo consiste em Escherichia coli, Aspergillus terreus, Monascus ruber, Monascus purpureus, Monascus pilosus, Monascus vitreus, Monascus pubigerus, Candida cariosilognicola, Aspergillus oryzea, Doratomyces stemonitis, Paecilomyces virioti, Penicillum citrinum, Penicillum chrysogenum, Scopulariopsis brevicaulis ou Trichoderma viride, particularmente (i)em que o organismo isolado é pelo menos um de:

(a) Aspergillus terreus que expressa polipeptídeo

LovD da SEQ ID NO: 1;

(b) Aspergillus terreus que não expressa polipeptídeo LovF da SEQ ID NO: 3;

(c) Escherichia coli que expressa polipeptídeo LovD da SEQ ID NO: 1; ou (d) Escherichia coli que não expressa polipeptídeo bioH da SEQ ID NO: 4.

(ii) em que o tioéster de acila é a-dimetilbutiril-S-metil- mercaptopropionato, e por o a-dimetilbutiril-S-metilmercaptopropionato se encontrar presente na mídia de fermentação em uma faixa de concentração de 1 mM-100 mM;

(iii) a monacolina J é produzida por um organismo isolado em uma mídia de fermentação; ou (iv) em que o organismo isolado é cultivado em pelo menos uma das seguintes condições:

(a) a uma temperatura entre 30-40° C;

Petição 870190097940, de 30/09/2019, pág. 6/13 (b) por um período de tempo de entre pelo menos 4 e pelo menos 48 horas;

(c) a um pH entre 7-8; ou (d) em uma mídia de fermentação compreendendo mídia

LB, F1 ou TB.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o tioéster de acila ser selecionado de forma a possuir pelo menos uma das seguintes propriedades:

(a) ser um tioéster de butirlila, um tioéster de N- acetilcisteamina ou um tioéster de metil-tioglicolato;

(b) compreender frações de grupo acila de extensão de cadeia média (C3-C6);

(c) ser capaz de transpor as membranas celulares de células de Escherichia coli ou Aspergillus terreus cultivadas em uma mídia de fermentação; ou (d) ser selecionado do grupo que consiste em a- dimetilbutiril-S-metil-mercaptopropionato (DMB-S-MMP), dimetilbutiril-S-etil mercaptopropionato (DMB-S-EMP) e dimetilbutiril-S-metil tioglicolato (DMB-S-MTG) e dimetilbutiril-S-metil mercaptobutirato (DMB-S-MMB).

4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender adicionalmente a purificação da sinvastatina obtida pelo método por meio de pelo menos uma etapa de purificação compreendendo:

(a) lise de células de um organismo isolado presente na combinação;

(b) centrifugação;

Petição 870190097940, de 30/09/2019, pág. 7/13 (c) precipitação de uma forma de ácido livre de sinvastatina;

(d) conversão de uma forma de ácido livre de sinvastatina em um sal de sinvastatina;

(e) filtração; ou (f) cromatografia líquida de alto desempenho ) “High Performance Liquid Chromatography” - HPLC).

5. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o método:

(a) produzir uma composição de matéria compreendendo 0%-1% da monacolina J que foi inicialmente combinada com o tioéster de acila doador de uma fração acila para o grupo hidroxila C8 de monacolina J na presença de LovD aciltransferase; e/ou (b) resultar em pelo menos 95% da monacolina J adicionada à combinação sendo convertida em sinvastatina.

6. COMPOSIÇÃO DE MATÉRIA, compreendendo:

monacolina J;

um tioéster de acila

LovD aciltransferase; e

Sinvastatina, em que o tioéster de acila que doa uma fração acila ao grupo hidroxila C8 da monacolina J na presença de LovD aciltransferase, em que o o tioéster de acila é capaz de transpor as membranas celulares de células de Escherichia coli ou Aspergillus terreus cultivadas em uma mídia de fermentação, o tioéster de acila adicionalmente possuindo

Petição 870190097940, de 30/09/2019, pág. 8/13 pelo menos uma das seguintes propriedades:

(a) ser um tioéster de butirlila, um tioéster de N- acetilcisteamina ou um tioéster de metil-tioglicolato;

(b) compreender frações de grupo acila de extensão de cadeia média (C3-C6);

caracterizada por a LovD aciltransferase ter a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 ou da SEQ ID NO:

2., e o tioéster de acila ser selecionado de a- dimetilbutiril-S-metil-mercaptopropionato (DMB-S-MMP), dimetilbutiril-S-etil mercaptopropionato (DMB-S-EMP), dimetilbutiril-S-metil tioglicolato (DMB-S-MTG) e dimetilbutiril-S-metil mercaptobutirato (DMB-S-MMB).

7. Composição, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada por compreender adicionalmente um organismo isolado, em que o organismo consiste em Escherichia coli, Aspergillus terreus, Monascus ruber, Monascus purpureus, Monascus pilosus, Monascus vitreus, Monascus pubigerus, Candida cariosilognicola, Aspergillus oryzea, Doratomyces stemonitis, Paecilomyces virioti, Penicillum citrinum, Penicillum chrysogenum, Scopulariopsis brevicaulis ou Trichoderma viride particularmente em que o organismo isolado é pelo menos um de:

(a) Aspergillus terreus que expressa polipeptídeo

LovD da SEQ ID NO: 1;

(b) Aspergillus terreus que não expressa polipeptídeo LovF da SEQ ID NO: 3;

(c) Escherichia coli que expressa polipeptídeo LovD

Petição 870190097940, de 30/09/2019, pág. 9/13 da SEQ ID NO: 1; ou (d) Escherichia coli que não expressa polipeptídeo bioH da SEQ ID NO: 4.

8. Composição, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada por o tioéster de acila possuir pelo menos uma das seguintes propriedades:

(a) ser um tioéster de butirlila, um tioéster de N- acetilcisteamina ou um tioéster de metil-tioglicolato;

(b) compreender frações de grupo acila de extensão de cadeia média (C3-C6);

(c) ser selecionado do grupo que consiste em a- dimetilbutiril-S-metil-mercaptopropionato (DMB-S-MMP), dimetilbutiril-S-etil mercaptopropionato (DMB-S-EMP) e dimetilbutiril-S-metil tioglicolato (DMB-S-MTG) e dimetilbutiril-S-metil mercaptobutirato (DMB-S-MMB).

9. Composição, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada por compreender adicionalmente um organismo isolado transduzido com um vetor de expressão que codifica

LovD de Aspergillus terreus (SEQ ID NO: 1).

10. Composição, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada por a composição compreender adicionalmente lovastatina e a quantidade de sinvastatina na composição ser maior que a quantidade de lovastatina na composição.

11. COMPOSIÇÃO DE MATÉRIA, compreendendo:

tetra-ol de pravastatina hidrolisado;

um tioéster de acila que doa uma fração acila para o grupo hidroxila C8 do tetra-ol de pravastatina

Petição 870190097940, de 30/09/2019, pág. 10/13 hidrolisado na presença de LovD aciltransferase;

LovD aciltransferase; e

Huvastatina, caracterizada por a LovD aciltransferase ter a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 ou da SEQ ID NO:

2., e o tioéster de acila ser selecionado de a- dimetilbutiril-S-metil-mercaptopropionato (DMB-S-MMP), dimetilbutiril-S-etil mercaptopropionato (DMB-S-EMP), dimetilbutiril-S-metil tioglicolato (DMB-S-MTG) e dimetilbutiril-S-metil mercaptobutirato (DMB-S-MMB).

12. MÉTODO PARA FABRICAÇÃO DE HUVASTATINA, compreendendo as etapas de:

(1) inter-combinação de tetra-ol de pravastatina hidrolisado; um tioéster de acila que doa uma fração acila para o grupo hidroxila C8 do tetra-ol de pravastatina hidrolisado na presença de LovD aciltransferase; e LovD aciltransferase; e (2) deixando-se a LovD aciltransferase utilizar um grupo do tioéster de para regioseletivamente o grupo hidroxila C8 do tetra-ol de pravastatina hidrolisado;

sendo dessa forma produzida huvastatina caracterizado por a LovD aciltransferase ter a seqüência de aminoácidos da SEQ ID

NO: 1 ou da SEQ

ID NO:

2., em que (3) o tioéster de acila é selecionado de adimetilbutiril-S-metil-mercaptopropionato

DMB-S-MMP),

Petição 870190097940, de 30/09/2019, pág. 11/13 dimetilbutiril-S-etil mercaptopropionato (DMB-S-EMP), dimetilbutiril-S-metil tioglicolato (DMB-S-MTG) e dimetilbutiril-S-metil mercaptobutirato (DMB-S-MMB).

13. MÉTODO PARA FABRICAÇÃO DE SINVASTATINA, compreendendo as etapas de:

(1) inter-combinação de lovastatina; um tioéster de acila que doa uma fração acila para o grupo hidroxila C8 da monacolina J na presença de LovD aciltransferase; e LovD aciltransferase; e (2) deixando-se a LovD aciltransferase:

(a) hidrolisar lovastatina para monacolina

J; e (b) utilizar um grupo acila do tioéster de acila para acilar regioseletivamente o grupo hidroxila C8 da monacolina J;

sendo dessa forma produzida sinvastatina, caracterizado por a LovD aciltransferase ter a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 ou da SEQ ID NO:

2., em que (3) o tioéster de acila é selecionado de adimetilbutiril-S-metil-mercaptopropionato (DMB-S-MMP), dimetilbutiril-S-etil mercaptopropionato (DMB-S-EMP), dimetilbutiril-S-metil tioglicolato (DMB-S-MTG) e dimetilbutiril-S-metil mercaptobutirato (DMB-S-MMB).