CN101490271B - 制备辛伐他汀和相关化合物的方法和材料 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生产辛伐他汀和诸如胡伐他汀等相关化合物的方法和材料。

Description

制备辛伐他汀和相关化合物的方法和材料
相关申请的互相参见
本申请要求2006年5月24日申请的美国临时专利申请号60/808,088的权利，在此引入其全部内容以供参考。
本发明的领域
本发明涉及包括使用微生物宿主步骤的生物合成诸如辛伐他汀(simvastatin)的化合物的方法和材料。
本发明的背景
辛伐他汀是可从土曲霉(Aspergillus terreus)发酵液分离的天然产物洛伐他汀(lovastatin，LOV)的半合成衍生物。洛伐他汀和辛伐他汀都是降胆固醇药物，它们显著降低成年人的心脏病风险。洛伐他汀和辛伐他汀由默克公司分别以Mevacor和Zocor上市。辛伐他汀是洛伐他汀更有效的衍生物，是美国2005年的第二畅销药，仅在美国的预期销售额为45亿美元。
土曲霉的洛伐他汀生物合成基因簇(参见，例如，J.Kennedy，K.等，Science，1999，284，1368-1372；和C.R.Hutchinson，J.等，Antonie VanLeeuwenhoek 2000，78，287-295)以前就有描述(参见，例如，美国专利号6,391,583，在此引入其内容以供参考)。该基因簇编码一个46 kD的蛋白质LovD，它最初被鉴定为酯酶同源物。莫那可林J(Monacolin J)是洛伐他汀的直接生物合成前体，它由上游大合成酶(megasynthase)LovB(参见，例如，L.Hendrickson，C.R.等，Chem.Biol.1999，6，429-439)，(也称为洛伐他汀九酮合成酶，LNKS)，烯酰还原酶(enoylreductase)LovC和CYP450加氧酶装配而成。5碳单元的侧链由LovF(洛伐他汀二酮合成酶，LDKS)通过缩合乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A合成。缩合的二酮由单独的LovF结构域进行甲基化和还原性裁剪产生α-S-甲基丁酰硫酯，它在LovF的酰基载体蛋白(ACP)结构域上与磷酸泛酰巯基乙胺臂共价连接(参见，例如，J.Kennedy，K.等，Science，1999，284，1368-1372和C.R.Hutchinson，J.等，Antonie VanLeeuwenhoek 2000，78，287-295)，随后从莫那可林J产生洛伐他汀。土曲霉中LovD或LovF的失活导致积聚前体莫那可林J(参见，例如，J.Kennedy，K.等，Science，1999，284，1368-1372和C.R.Hutchinson，J.等，Antonie VanLeeuwenhoek 2000，78，287-295)。
在诸如土曲霉的宿主中通过发酵一旦产生洛伐他汀，就可从洛伐他汀生产辛伐他汀。通常，辛伐他汀是洛伐他汀的半合成衍生物。洛伐他汀通过发酵土曲霉宿主获得。纯化该化合物后，按如下方法进行半合成：1)可用碱水解2-甲基丁酸酯(methyl butyrate)侧链产生中间体莫那可林J；2)内酯化(lactonize)游离酸；3)用保护基团(例如，叔丁基二甲基甲硅烷基)保护C13上的醇官能团；4)用诸如2-二甲基丁酰氯的酰基底物酯化暴露的C8醇产生辛伐他汀的C13保护形式，和5)C13OH去保护产生辛伐他汀(图3)。
辛伐他汀的各种多步合成法以前就有描述(参见，例如，PCT WO2005/066150和美国申请号20050080275和20040068123，在此引入其内容以供参考)。例如，广泛使用的方法以水解洛伐他汀的C8酯产生三元醇莫那可林J开始，接着选择性甲硅烷基化C13醇，用二甲基丁酰氯酯化C8醇并去保护C13醇产生辛伐他汀(参见，例如，W.F.Hoffman，等，J.Med.Chem.1986，29，849-852)。已经研究了使用脂肪酶和酯酶的酶转化法作为化学生成的替代方法(参见，例如，PCT WO 2005/040107，PCT WO 94/26920和T.G.Schimmel，等，Appl.Environ.Microbiol.1997，63，1307-1311，其内容在此引入以供参考)。然而，区域选择性酯化的要求必然包括其它醇基的保护且通常导致总产量的降低。因此，能够选择性地酰化莫那可林J的特效试剂对于有效合成辛伐他汀和其它他汀类似物是重要的。
上述各种方法都是通用的，然而，大多数方法必然会包括首先分离洛伐他汀，水解甲基丁酸酯侧链，保护游离醇，与酰基底物反应，和去保护。尽管涉及的化学转化相对简单，但是它们效率低且包括多个步骤，由此导致目前生产辛伐他汀的成本高(每片3美元)。
本发明的小结
本发明提供了设计成利用生物学方法制备洛伐他汀以生产洛伐他汀衍生物，即辛伐他汀的方法和材料。本发明还提供了设计成利用生物学方法制备洛伐他汀以生产诸如普伐他汀(pravastatin)衍生物，即胡伐他汀(huvastatin)的相关化合物的方法和材料。如上所述，从发酵土曲霉生产洛伐他汀的生物学方法是本领域熟知的。在生产洛伐他汀的典型方法中，类似洛伐他汀化合物部分的十氢化萘(decalin)核心和HMG-CoA部分通过洛伐他汀九酮合成酶(LNKS)和三个辅助酶体内合成。2-甲基丁酸酯侧链由洛伐他汀二酮合成酶(LDKS)体内合成。2-甲基丁酸通过硫酯键共价连接到LovF的酰基载体域上(图6)。然后酰基转移酶LovD可从LDKS一步将2-甲基丁酸选择性地转移到C8羟基上。正如下文的详细描述，通过操作这些过程现在在体外或体内都可产生辛伐他汀和相关化合物。
本发明的实施方案包括产生辛伐他汀的方法，它无需目前用于产生该化合物的多个化学合成步骤。本发明的典型实施方案不需要第一步的洛伐他汀纯化，随后的进一步半合成过程而代替使用单个发酵步骤来生产辛伐他汀。设计了本文公开的方法以便可用最小的修改将目前生产洛伐他汀的发酵设备转用于生产辛伐他汀和相关化合物。本文公开的方法中使用的材料相对便宜且纯化步骤是本领域熟知和容易实施的。
本领域的技术人员将会理解本文提供的公开内容将导致技术人员产生各种各样的本发明的实施方案。本发明的一个典型实施方案是制备辛伐他汀的方法，通过将莫那可林J；在LovD酰基转移酶存在时将酰基基团贡献给莫那可林J C8羟基的酰基硫酯；和LovD酰基转移酶混合起来；然后使得LovD酰基转移酶使用酰基硫酯的酰基基团区域选择性酰基化莫那可林JC8羟基；由此制备辛伐他汀。在本发明的典型实施方案中，LovD酰基转移酶具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的氨基酸序列。本发明的一个相关实施方案是制备辛伐他汀的方法，包括将洛伐他汀；在LovD酰基转移酶存在时将酰基基团贡献给莫那可林J C8羟基的酰基硫酯；和LovD酰基转移酶混合起来的步骤。在该方法的该实施方案中，LovD酰基转移酶允许将洛伐他汀水解成莫那可林J；然后使用酰基硫酯的酰基基团区域选择性酰基化莫那可林J C8羟基；由此制备辛伐他汀。在某些实施方案中，辛伐他汀在不存在分离的生物体的条件下体外制备。
正如下文的详细论述，用于制备辛伐他汀的本发明的方法和材料可修改为生产结构上类似于辛伐他汀的化合物，例如胡伐他汀。在本文中，本发明的一个实施方案是制备胡伐他汀的方法，包括将水解的普伐他汀四元醇；在LovD酰基转移酶存在时将酰基基团贡献给水解的普伐他汀四元醇C8羟基基团的酰基硫酯；和LovD酰基转移酶混合起来的步骤；然后允许LovD酰基转移酶使用酰基硫酯的酰基基团区域选择性酰基化水解的普伐他汀四元醇C8羟基，由此制备胡伐他汀。本发明的一个相关实施方案是包含下列成份的组合物：水解的普伐他汀四元醇；在LovD酰基转移酶存在时将酰基基团贡献给水解的普伐他汀四元醇C8羟基基团的酰基硫酯；LovD酰基转移酶；和胡伐他汀。因此，本发明的实施方案包括制备基本上为本文公开和举例成份的辛伐他汀或胡伐他汀组合物的方法。
在本发明的一些实施方案中，莫那可林J；酰基硫酯和LovD酰基转移酶在产生LovD酰基转移酶的分离的生物体存在时在发酵培养基中混合，且其中该生物体是大肠杆菌(Escherichia coli)，土曲霉，红色红曲霉(Monascusruber)，紫色红曲霉(Monascus purpureus)，丛毛红曲霉(Monascus pilosus)，Monascus vitreus，Monascus pubigerus，Candida cariosilognicola，米曲霉(Aspergillus oryzea)，Doratomyces stemonitis，多变拟青霉(Paecilomycesvirioti)，桔青霉(Penicillum citrinum)，产黄青霉(Penicillin chrysogenum)，短尾帚霉(Scopulariopsis brevicaulis)或绿色木霉(Trichoderma viride)。任选该分离的生物体是表达SEQ ID NO：1的LovD多肽的土曲霉。在某些实施方案中，土曲霉不表达SEQ ID NO：3的LovF多肽。作为选择，该生物体可以是表达SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的LovD多肽的大肠杆菌。在某些实施方案中，该大肠杆菌不表达SEQ ID NO：4的bioH多肽。如下文的详细论述，该分离的生物体可在本领域已知的各种发酵条件之一下生长且可根据例如，所用的具体生物体的发酵要求选择确切的条件。在本发明的典型实施方案中，该生物体在30-40℃的温度下在pH为6.5-8.5之间生长至少4到至少48小时的时间。在举例性的实施方案中，该生物体在包含LB，F1或TB培养基的发酵培养基中生长。
任选的是，与本发明方法中的其它成份混合的莫那可林J可通过发酵培养基内的分离的生物体生产，例如也可产生LovD酰基转移酶的上述生物体之一。作为选择，与本发明方法中的其它成份混合的莫那可林J可通过加入到发酵培养基中并与产生LovD酰基转移酶的生物体一起培养的产生该化合物的不同生物体来生产。在本文中，本领域已知生产莫那可林J的许多生物体可适用于本发明的这些实施方案(参见，例如，Endo等，J Antibiot(Tokyo).1985 Mar；38(3)：420-2.和Kennedy等，1999 May21；284(5418)：1368-72)。在本发明的另一实施方案中，莫那可林J可来源于任选的外源性来源(例如，化学合成方法)并加入发酵混合物中。
在本发明的典型实施方案中，在LovD酰基转移酶存在时可将酰基基团贡献给莫那可林J C8羟基的酰基硫酯来源于外源性来源(例如，化学合成方法)并加入发酵混合物中。本文公开了各种这类酰基硫酯。典型的酰基硫酯是丁酰硫酯，N-乙酰基半胱胺硫酯或甲基巯基乙酸硫酯。任选的是，酰基硫酯包含中等链长(C3-C6)的酰基部分。在本发明的某些实施方案中，酰基硫酯能够穿过在发酵培养基内生长的大肠杆菌或土曲霉细胞的细胞膜。典型的是，酰基硫酯选自由α-二甲基丁酰-S-甲基巯基丙酸酯(dimethylbutyryl-S-methyl-mercaptopropionate，DMB-S-MMP)，二甲基丁酰-S-乙基巯基丙酸酯(dimethylbutyryl-S-ethyl mercaptopropionate，DMB-S-EMP)和二甲基丁酰-S-甲基巯基乙酸酯(dimethylbutyryl-S-methyl thioglycolate，DMB-S-MTG)和二甲基丁酰-S-甲基巯基丁酸酯(dimethylbutyryl-S-methylmercaptobutyrate，DMB-S-MMB)组成的组中。在举例性的实施方案，酰基硫酯是α-二甲基丁酰-S-甲基-巯基丙酸酯，它在发酵培养基中以1mM-100mM的浓度范围混合。
在本发明的某些实施方案中，该方法导致加入混合物中的至少95％，96％，97％，98％或99％的莫那可林J转化成辛伐他汀。任选的是，本发明的方法产生包含起始加入混合物中的0％-1％的莫那可林J成份的组合物。制备辛伐他汀和相关化合物的方法的某些实施方案还包括纯化这些化合物的步骤。例如，本发明的实施方案可包括至少一个纯化步骤，该步骤包括裂解存在于混合物中的分离的生物体的细胞。该实施方案也可包括至少一个纯化步骤，该步骤包括离心存在于混合物中的分离的生物体的细胞或细胞裂解产物。另外，该实施方案可包括至少一个纯化步骤，该步骤包括沉淀存在于混合物中的一种或多种化合物。沉淀步骤的一个实施方案包括沉淀辛伐他汀的游离酸形式。在该实施方案中任选的是，可随后将该辛伐他汀的游离酸形式转化成辛伐他汀盐。本发明的实施方案也可包括至少一个纯化步骤，该步骤包括过滤存在于混合物中的一种或多种化合物。另外，该实施方案可包括至少一个纯化步骤，该步骤包括对存在于混合物中的一种或多种化合物进行高效液相层析(HPLC)分析。
本发明的实施方案包括以本文公开的方法用于制备和/或制备而成的成份的组合物。例如，本发明的一个实施方案是包含下列成份的组合物：莫那可林J；在LovD酰基转移酶存在时将酰基基团贡献给莫那可林J C8羟基的酰基硫酯；LovD酰基转移酶；和辛伐他汀。任选的是，该组合物还包括分离的生物体，例如大肠杆菌，土曲霉，红色红曲霉，紫色红曲霉，丛毛红曲霉，Monascus vitreus，Monascus pubigerus，Candida cariosilognicola，米曲霉，Doratomyces stemonitis，多变拟青霉，桔青霉，产黄青霉，短尾帚霉或绿色木霉。在典型的实施方案中，该组合物中的生物体是表达SEQ ID NO：1的LovD多肽的土曲霉或大肠杆菌。在本发明的一个实施方案中，该生物体是不表达SEQ ID NO：3的LovF多肽的土曲霉。在本发明的另一实施方案中，该生物体是不表达SEQ ID NO：4的bioH多肽的大肠杆菌。在本发明的某些实施方案中，组合物中分离的生物体已用编码土曲霉LovD(SEQ ID NO：1)的表达载体转导。
本文公开了可用于本发明的组合物中的各种酰基硫酯。典型的酰基硫酯是丁酰硫酯，N-乙酰基半胱胺硫酯或甲基巯基乙酸硫酯。任选的是，酰基硫酯包含中等链长(C3-C6)的酰基部分。在本发明的某些实施方案中，酰基硫酯能够穿过在发酵培养基内生长的大肠杆菌或土曲霉细胞的细胞膜。典型的是，酰基硫酯选自由α-二甲基丁酰-S-甲基巯基丙酸酯(DMB-S-MMP)，二甲基丁酰-S-乙基巯基丙酸酯(DMB-S-EMP)和二甲基丁酰-S-甲基巯基乙酸酯(DMB-S-MTG)和二甲基丁酰-S-甲基巯基丁酸酯(DMB-S-MMB)组成的组中。在举例性的实施方案，酰基硫酯是α-二甲基丁酰-S-甲基-巯基丙酸酯，它在发酵培养基中以1mM-100mM的浓度范围混合。在本发明的一些实施方案中，该组合物还包括洛伐他汀且该组合物中辛伐他汀的量大于组合物中洛伐他汀的量。
在本发明的某些实施方案中，其它组份和/或方法步骤可与一种或多种上文论述的方法和材料结合。例如，该方法还可包含使用高细胞密度发酵以增加LovD酰基转移酶的有效浓度和最优化发酵条件或增加LovD酰基转移酶对一种或多种硫酯进行蛋白加工的催化效率。可使用许多其它组份或方法以增加辛伐他汀或有助于辛伐他汀生产的中间体或相关化合物的生产。
本发明的实施方案还包括设计成有利于本发明方法的生产物品和/或试剂盒。典型的该试剂盒包括根据本发明方法在其中使用其成份的说明书。该试剂盒可包含被隔开的载体以便封闭地容纳一个或多个容器，例如小瓶，试管，等等，每个容器中包含用于该方法的一个单独成份。一个容器可包含装有诸如LovD酰基转移酶和/或土曲霉的一个小瓶和装有硫酯化合物或类似物的另一小瓶，两个小瓶都可加入发酵混合物中以产生辛伐他汀和/或胡伐他汀或类似物。
本发明的其它实施方案在下文中论述。
附图的简要描述
图1.A.洛伐他汀。B.辛伐他汀。两种化合物的区别在于α位置有一个甲基取代。
图2.洛伐他汀(1)，辛伐他汀(2)，普伐他汀(5)，胡伐他汀(6)和相关化合物。
图3.生产辛伐他汀的常规方法。
图4.土曲霉中本发明的酰基转移反应。76位丝氨酸可能是活性位点亲核体。
图5.A)HPLC(238nm)痕迹表明由LovD介导的酰基转移形成4。梯度：60％B-95％B，5分钟；95％B，15分钟；A：H2O+0.1％TFA；B：乙腈+0.1％TFA；a)LovD+莫那可林J+丁酰-CoA时间进程(0，1，3，6和10小时)；b)LovD S76A+莫那可林J+丁酰-CoA，10小时；c)LovD+丁酰基-SNAC，10小时；d)LovD+丁酰基-SMTG，10小时。测定条件：1mM莫那可林J，4mM丁酰-CoA，10μLovD，50mM HEPES，pH7.9，25℃。(B)以时间为函数的转化(◇)丁酰-CoA(◆)丁酰-SNAC，(■)丁酰-SMTG。本文中报道的表观kcat值为线性范围内的初始转化率。(C)LovD催化水解洛伐他汀成莫那可林J的Michaelis-Menten图。反应进程通过HPLC监测。kcat：0.21±0.01min-1；Km：0.56±0.05mM。
图6.LovD催化酰基转移，产生洛伐他汀。酰基供体连接到LDKS上。
图7.酰基-SNAC。阴影圈表示任意官能团。
图8.HPLC(238nm)痕迹表明通过LovD介导的酰基转移形成辛伐他汀和洛伐他汀。梯度与图1所述相同；a)洛伐他汀和辛伐他汀的可信标准；b)莫那可林J+α-S-甲基丁酰-SNAC；c)莫那可林J+α-二甲基丁酰-SNAC。测定条件：1mM莫那可林J，10mM酰基-SNAC，100μM LovD，50mMHEPES，pH7.9，25℃，6小时。
图9.HPLC(238nm)痕迹显示通过LovD介导的四元醇7酰基化形成普伐他汀和胡伐他汀。梯度：5％B-95％B，5分钟；95％B，15分钟；A：H2O+0.1％TFA；B：乙腈+0.1％TFA；a)普伐他汀和7的可信标准；b)7+α-S-甲基丁酰-SNAC；c)7+α-二甲基丁酰-SNAC。测定条件：1mM莫那可林J，10mM酰基-SNAC，100uM LovD，50mM HEPES，pH7.9，25℃，6小时。
图10.微生物转化莫那可林J成辛伐他汀。
图11.LovD催化的水解和LovD催化的酰基化。图11包含的本发明的实施方案包括在LovD和酰基供体存在时产生胡伐他汀或辛伐他汀的成份的组合物。图11也举例说明了包括在LovD存在时水解洛伐他汀产生莫那可林J的生产辛伐他汀的方法。莫那可林J在酰基供体存在时由此转化成辛伐他汀。同样，图11还举例说明了生产胡伐他汀的方法，包括在LovD存在时水解普伐他汀，产生水解的普伐他汀。水解的普伐他汀在酰基供体存在时由此转化成胡伐他汀。
图12.在表达LovD的微生物中生产胡伐他汀。图12提供了本发明实施方案的举例说明，包括在表达LovD的生物体中生产胡伐他汀。
图13.(A)从莫那可林J酸和DMB-S-MMP到辛伐他汀酸的全细胞生物催化转化。该大肠杆菌菌株过表达酰基转移酶LovD。DMB-S-MMP水解产生DMB-S-MPA是一个竞争性反应。(B)顶端痕迹：完全细胞转化实验中反应物和产物的典型图。底端痕迹：DMB-S-MMP和DMB-S-MPA标准。光谱在238nm处收集。
图14.(A)薄层层析显示了添加DMB-S-MMP后6个大肠杆菌菌株的有机提取物。菌株的特征鉴定可参见表2。TLC板用含20％EA的己烷层析以分离DMB-S-MMP(顶端)和DMB-S-MPA(底端)。中间的斑点为未知化合物。在除#56的所有菌株中，培养10小时后DMB-S-MMP水解为DMB-S-MPA。ΔbioH菌株不水解DMB-S-MMP。(B)使用HPLC证实TLC的结果。在ΔbioH菌株的提取物中未检测到DMB-S-MPA。光谱在234nm处收集。
图15.(A)BioH对DMB-S-MMP的Michaelis-Menten动力学。该结果为三轮反应的平均。Kcat和Km值分别为260±45sec-1和229±26μM。在高DMB-S-MMP浓度下观察到的高标准偏差可能是由于缓冲液(50mMHEPES，pH7.9，10％DMSO)中底物的溶解性低引起的。(B)三个不同二甲基丁酰硫酯水解率的比较。用1mM硫酯和10nM BioH进行反应。
图16.(A)BL21(DE3)/pAW31(灰色◇)和YT2/pAW31(无生物素：○；含0.15mg/L生物素：●)在F1基础培养基中的生长率和最终细胞密度的比较。细胞生长到OD600～0.5，用100μM IPTG诱导并转换到20℃摇床上12小时。ΔbioH菌株YT2需要加入外源性生物素以便在合成培养基中维持旺盛的细胞生长。(B)以时间为函数的辛伐他汀转化比较(15mM MJ，25mMDMB-S-MMP)。YT2/pAW31(○)比BL21(DE3)/pAW31(●)明显更快(数据来自Xie等，(2007)Appl Environ Microbiol 73：2054-2060)达到99％的转化率。两个菌株在加入底物后立即(0小时)表现为延迟期且延迟期接近反应完成。延迟期期间的反应速率呈线型。YT2/pAW31的转化率(1.5mM/hr)是BL21(DE3)(0.75mM/hr)的两倍。
图17.辛伐他汀纯化步骤的HPLC分析(238nm)。辛伐他汀酸在注射前内酯化为辛伐他汀。痕迹a：反应完成后YT2/pAW31的粗提物(混合有培养液和细胞提取物)(99％MJ酸转化成辛伐他汀酸)。在6.80处的峰为DMB-S-MMP；痕迹b：用等体积己烷洗涤去掉未反应的DMB-S-MMP并沉淀后的粗样品；痕迹c：用dH2O洗涤并溶于ACN后的纯化辛伐他汀。在6.7分钟处见到的小峰是未完全内酯化的辛伐他汀酸(～1％)。
图18.洛伐他汀酸，莫那可林J酸和辛伐他汀酸的化学结构。研究的生物催化反应是莫那可林J经酶转化成辛伐他汀(黑色箭头)。LovD能够区域选择性地酰基化C8羟基。两个常用的半合成方法以虚线箭头显示。
图19.使用DMB-S-MMP作为酰基硫酯经LovD催化莫那可林J酰基化产生辛伐他汀的动力学分析。y-轴表示为催化转化率(V/Eo)(A)以莫那可林J浓度为函数的LovD的Michaelis-menten动力学，固定的DMB-SMMP浓度为2mM。未观察到底物抑制。Km(莫那可林J)＝0.78±0.12mM。(B)以DMB-S-MMP浓度为函数的LovD的Michaelis-menten动力学，固定的莫那可林J浓度为2mM。Km(DMB-S-MMP)＝0.67±0.04mM。在两个试验中，kcat估计为0.66±0.03min-1。
图20.低密度发酵和生物催化。将过夜表达LovD的大肠杆菌菌株BL21(DE3)/pAW31浓缩10倍至最终OD600为22。加入底物莫那可林J和DMB-S-MMP至终浓度分别为15和40mM。通过HPLC分析记录转化随时间的函数。(A)研究随时间进程中的HPLC痕迹。标记的峰值为1：莫那可林J(内酯化形式)；2：DMB-S-MMP水解产生的DMB-S-MPA；3：DMB-S-MMP；和4：辛伐他汀(内酯化形式)。(B)莫那可林J转化成辛伐他汀随时间的函数。24小时的最终转化率为99％。数据值为两轮试验的平均值。
图21.高密度发酵和生物催化。(A)用F1基础培养基进行补料分批发酵(500mL)。OD600(圆环)为5.93(I)，降低发酵温度并维持在RT。加入IPTG至终浓度为200μM并开始补料且维持在0.08mL/分钟。测量在发酵的不同时间点LovD的有效浓度(方块)。(B)图21A显示了发酵期间在4个不同时间点(以1，2，3和4表示)由细胞将莫那可林J转化成辛伐他汀的转化率。细胞可通过更换成50mM HEPES，pH7.9使其“静息”，或者不更换培养基使其“非静息”。
本发明的详细描述
本文描述或引用的技术和方法一般是容易理解的，且是本领域的技术人员使用常规方法，例如，在Ausubel等，Current Protocols in MolecularBiology，Wiley Interscience Publishers，(1995)中描述的广泛使用的分子克隆方法通常采用的。如果合适，包含使用商品试剂盒和试剂的方法一般按厂家限定的方案和/或参数进行，除非另有说明。除非另有说明，本文使用的所有技术术语，符号和其它科学术语设定具有与本发明所属领域的技术人员通常理解的含义。在一些情况下，具有通常理解含义的术语为了清楚和/或便于参考在本文中进行了定义，本文中该定义的内涵不应必然解释成表示它与本领域通常的理解有实质性区别。
下文提供了某些术语的定义。
“洛伐他汀”(Mevacor)是由土曲霉产生的真菌聚酮化合物(参见，例如，A.W Alberts，J.等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，1980，77，3957-3961和A.Endo，J.Antibiot.1980，33，334-336；和J.K.Chan，等，J.Am.Chem.Soc.1983，105，3334-3336；Y.Yoshizawa，等，J.Am.Chem.Soc.1994，116，2693-2694)。它是一种药学上重要的化合物，因为它对作为胆固醇生物合成限速步骤的羟甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)具有有效抑制活性，且因此广泛用于治疗高脂血症，高胆固醇血症，等等。洛伐他汀也称为Mevacor。
“辛伐他汀”是洛伐他汀的类似物。它优于洛伐他汀，因为其不存在有害副作用且胃内吸收率高。另外，已报道了辛伐他汀通过阻止Ab42，即与AD相关的β-淀粉样蛋白的生产来预防和减少阿尔茨海默氏病(AD)。本领域已知辛伐他汀可在金属氨化物碱(metal amide base)存在时使用甲基卤经由直接甲基化洛伐他汀分子式上的8′-甲基丁酰氧基侧链以合成法来制备。C-甲基化步骤必需在极低温度下(-75至-30°)使用强碱在无水条件下进行，其在大规模生产中难以操作(参见，例如，美国专利号5,393,893，美国专利号4,582,915，美国专利号5,763,646，美国专利号5,763,653，EP专利号299,656和国际专利申请号WO 99/45003，其内容在此引入以供参考)。以合成法生产辛伐他汀的其它方法也是本领域已知的。例如，洛伐他汀可用过量氢氧化锂水解以去掉2-甲基丁酰侧链并同时打开其6-元内酯环以产生三元醇酸。然后加热三元醇酸化合物以获得二醇内酯。可保护二醇内酯的内酯环上的羟基以获得叔丁基二甲基甲硅烷基醚，然后六氢化萘环系统的C8羟基可用2，2-二甲基丁酸在双环己基碳二亚胺，或2，2-二甲基氯存在时酰基化产生一个化合物。然后该化合物的叔丁基二甲基甲硅烷基保护基团可在最后步骤中使用氟化四丁铵去掉以产生辛伐他汀(参见，例如，美国专利号4,444,784，其内容在此引用以供参考)。
本文使用的“洛伐他汀衍生物”包含洛伐他汀衍生物或前体，例如普伐他汀，胡伐他汀，辛伐他汀，或水解的普伐他汀四元醇。“莫那可林J变体”是指本领域公开的莫那可林J变体，例如水解的普伐他汀四元醇或6-羟基-6-去甲基莫娜可林J等等。在本发明的某些实施方案中，“莫那可林J变体”是指在图2中C6位置具有取代的莫那可林J化合物。在描述诸如辛伐他汀，普伐他汀，莫那可林J和变体等的化合物时，本领域的技术人员明白该术语试图包含这些化合物以及这些化合物的盐(例如，本领域已知的药用上可接受的盐)。例如，正如本领域已知的，辛伐他汀可出现游离酸形式以及辛伐他汀钠，钾或铵盐，和来自碱土金属的其它盐或其它金属盐类。
“土曲霉(Aspergillus terreus)”或“A.terreus”是土壤中常见的丝状子囊菌。各种土曲霉菌株是本领域已知，例如以诸如ATCC 20542和ATCC 20541保藏的菌株。
正如本领域已知的，与丝状真菌次生代谢产物的生物合成相关的基因可在真菌基因组上形成一簇且称为“基因簇”。例如，“洛伐他汀生产基因簇”是指产生洛伐他汀的一组基因，这组基因包括，LovA，即P450I；LovC，即脱氢酶；LovD，即，酯酶和酰基转移酶；和LovF，即ScPKS或LDKS。以前已经确定这四个基因(LovA，LovC，LovD，和LovF)中的每一个都是洛伐他汀合成所必需的(参见，例如，美国专利号6,943,017，其内容在此引入以供参考)。LovF(LDKS基因)被鉴定为聚酮合成酶基因。LovD是推定的酯酶/羧肽酶样基因。以前曾实施了LovF基因的破坏(参见，例如，美国专利号6,943,017，其内容在此引入以供参考)。LovD与LovF相互作用产生洛伐他汀；然而，LovD-LovF的相互作用不是生产辛伐他汀所必需的。另外，洛伐他汀生产基因簇中的另一基因是LovE，它是可调控其它基因转录的Zn指基因。洛伐他汀生产基因簇还包含LovB(NPKS基因)。
“LDKS”或“LDKS基因”是指LovF基因，即洛伐他汀生产基因簇的一员所编码的蛋白质。LDKS代表洛伐他汀二酮合成酶。LovF是产生LDKS的基因。LovF也是产生LovF蛋白的基因。“LDKS基因”也指产生LDKS的基因。在洛伐他汀合成中，LDKS通过缩合乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A合成莫那可林J的5碳单元侧链。缩合的二酮由单独的LovF结构域进行甲基化和还原性裁剪产生α-S-甲基丁酰硫酯，它在LovF的酰基载体蛋白(ACP)结构域上与磷酸泛酰巯基乙胺臂共价连接。
本文使用的“LovD酰基转移酶”是指诸如土曲霉LovD多肽(例如SEQID NO：1)的那些多肽，它们可使用酰基硫酯区域特异性地酰基化莫那可林J的C8羟基以产生辛伐他汀。也正如本文所公开的，LovD酶可进一步利用酰基硫酯区域特异性地酰基化水解的普伐他汀四元醇的C8羟基以产生胡伐他汀。
LovD酰基转移酶包括可在例如，但不限于真菌聚酮基因簇中发现的土曲霉LovD多肽(例如，SEQ ID NO：1)的同源酶。例如，本领域提供了密实菌素生物合成途径的Mlc催化相同转酰基反应的证据(参见，例如，Y.Abe，T.等，Mol Genet Genomics.2002，267，636-646)，而squalestatin途径中的酰基转移酶可催化ACP-结合的四酮硫酯和糖苷配基之间的类似反应(参见，例如，R.J.Cox，F.等，Chem Commun(Camb)2004，20，2260-2261)。土曲霉LovD多肽的氨基酸序列(例如，SEQ ID NO：1)类似于催化β-内酰胺型抗生素水解失活的C型β-内酰胺酶(参见，例如，E.Lobkovsky，E.M.等，Biochemistry，1994，33，6762-6772和A.Dubus，D.等，Biochem.J.1993，292，537-543)。土曲霉LovD多肽(例如，SEQ ID NO：1)与enterobacter cloacae P99内酰胺酶(参见，例如，S.D.Goldberg，等，Protein Sci.2003，12，1633-1645)的序列对比显示出中等序列同源性，包括潜在的保守活性位点残基，例如催化性Ser76，Lys79，Tyr188，和Lys315(参见，例如，S.D.Goldberg，等，Protein Sci.2003，12，1633-1645)。
LovD酰基转移酶也可指与土曲霉LovD多肽(例如，SEQ ID NO：1)在序列上相关但含有轻微氨基酸差异(例如，1-10个氨基酸取代突变)的遗传改造和天然存在的酶。例如，辛伐他汀可由在序列上相似于土曲霉LovD多肽(例如，SEQ ID NO：1)的天然存在的酶(例如，来自密实菌素基因簇的M1CH)产生。“LovD酰基转移酶”也可指土曲霉LovD多肽(SEQ ID NO：1)的突变体。本领域已知该突变体可用标准分子生物学技术来制备，以便产生例如改进催化效率或类似特征的SEQ ID NO：1的突变体。例如，我们目前使用合理和定向的进化方法来改进土曲霉LovD的催化转化率。一般来说，该突变体与SEQ ID NO：1具有50％-99％的序列相似性。在本文中，术语“LovD同源性酶”包括与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列具有至少80％，85％，90％，95％，97％，98％或99％序列相同性的LovD多肽，其中该多肽具有利用酰基硫酯区域特异性地酰基化莫那可林J的C8羟基以产生辛伐他汀和/或利用酰基硫酯区域特异性地酰基化水解的普伐他汀四元醇的C8羟基以产生胡伐他汀的能力。该突变体容易制备且随后在观察诸如辛伐他汀的目的化合物生产的试验中可得到鉴定(一般使用土曲霉LovD多肽(例如，SEQ ID NO：1)作为对照)。例如，这些突变体可用于本发明的方法以制备辛伐他汀或胡伐他汀。
“异源性”在涉及诸如编码序列和调控序列的核酸序列时表示在正常情况下与重组构建体的区域不相连，和/或在正常情况下与特定细胞无关的序列。因此，核酸构建体的“异源性”区域可以是在天然情况下未发现与另一核酸分子相连的位于该另一核酸分子内部或与其连接的可鉴定的核酸片段。例如，构建体的异源性区域可包括一个编码区，其侧翼为在天然情况下未发现与该编码区相连的序列。同样，用正常情况下在宿主细胞中不存在的构建体转化的宿主细胞可认为是异源的(参见，例如，美国专利号5,712,146，6,558,942，6,627,427，5,849,541，在此引用其内容以供参考)。例如，可分离含Lov基因的构建体并在不产洛伐他汀的真菌或酵母宿主细胞中表达，从而可生产洛伐他汀(参见，例如，美国专利号6,391,583和6,943,017，在此引入其内容以供参考)。作为另一实施例，正如本领域所知，诸如细菌的原核细胞也可以作宿主细胞。也可将真菌基因克隆进表达载体中用于在原核生物中表达(参见，例如，美国专利号5,849,541，在此引入其内容以供参考)。
可使用诸如大肠杆菌的原核生物作为异源性宿主。可用目的基因构建质粒并将质粒转化进大肠杆菌。翻译目的基因，此后可纯化该目的基因产生的蛋白质。该表达和蛋白质纯化的方法是本领域已知的。例如，土曲霉的LovD外显子可从土曲霉基因组DNA逐个扩增并使用重叠延伸PCR进行剪接以产生连续的阅读框。可导入限制性位点，且可将基因盒与载体连接以产生可转化进大肠杆菌的表达构建体。因此，大肠杆菌可用作异源性宿主以表达土曲霉基因。大肠杆菌可与产生另一目的底物的另一菌株共培养。另外，可向该培养物或共培养物中加入底物。洛伐他汀生物合成基因的异源性表达是本领域已知的(参见，例如，美国专利号6,391,583和6,943,017，其内容在此引入以供参考)。
作为另一实施例，某些聚酮化合物，例如来自真菌或其它生物体的聚酮化合物可在大肠杆菌，酵母，和其它宿主生物体中进行异源性表达。可向这些宿主生物中添加其它底物，因为它们同时需要异源性表达所需的PKS和可产生PKS所需要的至少一些底物分子的酶(参见，例如，美国专利号7,011,959，其内容在此引入以供参考)。同样，真菌Lov基因可在大肠杆菌或其它细菌中表达，可向这些宿主细菌中添加其它底物，例如酰基-SNAC或其它酰基供体基团。这些酰基供体基团具有细胞通透性，且可进入该细菌细胞。
“表达载体”是指可导入宿主细胞的核酸。正如本领域所知，表达载体可作为染色体的一部分或在细胞或任何细胞区室中的其它DNA，例如在细胞质中的复制载体在细胞中永久或瞬时维持。表达载体还包含驱动RNA表达的启动子，该RNA一般在细胞或细胞提取物中翻译成多肽。例如，本发明的表达载体中包含的合适启动子包括在真核或原核宿主细胞中起作用的合适启动子。启动子可包含的调控序列允许调控与宿主细胞的生长相关的表达或者导致响应化学或物理刺激打开或关闭基因的表达。对于大肠杆菌和某些其它细菌宿主细胞，可使用来自生物合成酶，赋予抗生素抗性的酶，和噬菌体蛋白的基因的启动子且包括，例如，半乳糖，乳糖(lac)，麦芽糖，色氨酸(trp)，β-内酰胺酶(b/a)，噬菌体λPL，和T5启动子。另外，也可使用合成启动子，例如tac启动子(美国专利号4,551,433)。对于大肠杆菌表达载体，有用的是包含大肠杆菌复制起点，例如来自pUC，p1P，p1I，和pBR的复制起点。为了将RNA有效翻译成蛋白质，该表达载体一般也含有位于待表达基因编码序列起始密码子上游的核糖体结合位点序列。其它元件，例如增强子，分泌信号序列，转录终止序列，和可用其鉴定和/或选择含有该载体的宿主细胞的一个或多个标记基因，也可存在于表达载体中。可使用选择标记，即赋予抗生素抗性或敏感性的基因且当细胞在合适的选择培养基中生长时它赋予转化细胞可选择的表型。例如，可将含Lov基因簇或其部分的表达载体导入异源性宿主，例如大肠杆菌中。因此，重组表达载体可含有至少一个表达系统，而后者又可由Lov的至少一部分和/或与可引起编码序列在相容宿主细胞中有效表达的启动子和任选的终止序列可操作相连的其它生物合成基因编码序列组成。
“编码序列”可以是“编码”特定基因的序列，例如来自Lov基因簇的基因。编码序列是当置于合适调控序列控制下时在体外或体内转录(对于DNA)或翻译(对于mRNA)成多肽的核酸序列。编码序列的边界由5’(氨基)端和3′(羧基)端翻译终止密码子确定。转录终止序列通常位于编码序列的3’端。
DNA“调控序列”集中指启动子序列，核糖体结合位点，多聚腺苷化信号，转录终止序列，上游调控区，增强子，等等，它集中保证编码序列在宿主细胞中的转录和翻译。
“可操作地连接”是指元件的排列，其中配置所述组件以便完成其通常的功能。因此，与编码序列可操作地连接的调控序列能够实现编码序列的表达。调控序列不必与编码序列相邻，只要它们对于指导其表达起作用。
“产洛伐他汀生物体”是指本领域已知生产洛伐他汀的各种不同生物体。产洛伐他汀的这些生物体可用本发明的方法改造成生产辛伐他汀。土曲霉是产洛伐他汀生物体的例子。已报道产洛伐他汀(mevinolin)的非土曲霉的微生物包括Monascus种类，例如红色红曲霉，紫色红曲霉，丛毛红曲霉，M.vitreus，M.pubigerus，以及青霉属(Penicillium)，菌寄生属(Hypomyces)，Doratomyces，茎点霉属(Phoma)，正青霉属(Eupenicillium)，裸子囊菌属(Gymnoascus)，和木霉属(Trichoderma)种类，Pichia labacensis，Candida cariosilognicola，米曲霉，Doratomyces stemonitis，多变拟青霉，桔青霉，产黄青霉，短尾帚霉和绿色木霉(参见，例如，美国专利号6,391,583；Juzlova等，J.Ind.Microbiol.16：163-170；Gunde-Cimerman等，FEMSMicrobiol.Lett.132：39-43(1995)；和Shindia等，Folio Microbiol.42：477-480(1997)，其内容在此引入以供参考)。
本文使用的“不产洛伐他汀的生物体”是指没有人工操作时不产生洛伐他汀的许多生物体(例如，大肠杆菌)。例如，这些生物体可通过本发明的方法诱导生产LovD，或在LovD存在时培养以便生产洛伐他汀或辛伐他汀。
“LDKS基因被破坏的土曲霉”包括无LDKS基因，具有突变的LDKS基因，LDKS基因被敲除，LDKS基因缺失，LDKS基因的表达被破坏，或LDKS基因被破坏的土曲霉。“LDKS基因被破坏的土曲霉”包括通过本领域已知的方法静默LDKS基因的土曲霉。“LDKS基因被破坏的土曲霉”是指不能产生有功能的LDKS的土曲霉。“LDKS基因被破坏的土曲霉”也可指生产有功能的LDKS的土曲霉。该LDKS可通过本领域已知的方法，例如基因敲除方法来失活或抑制。存在的LDKS的量可通过本领域已知的方法减少。抑制，失活，或破坏LDKS基因或蛋白质的其它方法包括，但不限于，反义，siRNA，RNAi，或RNA干扰，正如本领域所知。本文使用的“LDKS基因”也可指LovF基因。破坏LovF基因是本领域已知的(参见，例如，美国专利号6,391,583，其内容在此引入以供参考)。“LDKS基因被破坏的土曲霉”一般是遗传改造的生物体。土曲霉的遗传改造是本领域已知的。土曲霉Lov基因的基因破坏以前已经实现(参见，例如，美国专利号6,391,583和6,943,017，其内容在此引入以供参考)。在土曲霉中特异性破坏LovF基因(产生LDKS)以前已经实现(参见，例如。美国专利号6,943,017，其内容在此引入以供参考)。LovF基因的破坏可通过本领域已知的其它方法实现。LDKS基因被破坏的土曲霉可存在于发酵混合物中。可向LDKS基因被破坏的土曲霉的发酵混合物中加入底物以产生洛伐他汀类似物。
本文使用的“增加辛伐他汀生产的成份或方法”是指一种合成或天然的化合物或底物，它增加某些中间体的生产以便增加产生的辛伐他汀量用于扩大和大规模合成辛伐他汀。增加某些中间体生产的成份或方法是本领域已知的。例如，在洛伐他汀生产中向发酵混合物中加入化合物以增加诸如莫那可林J的中间体的量是本领域已知的(参见，例如，美国专利号6,943,017，其内容在此引入以供参考)。诸如莫那可林J的一些中间体也可用于生产辛伐他汀。因此可加入增加莫那可林J生产的化合物以增加辛伐他汀的生产。例如，可向发酵混合物中直接加入增加莫那可林J生产的化合物以增加所产生的辛伐他汀的量。增加辛伐他汀生产的成份的例子是以ATCC保藏号98876保藏的含洛伐他汀生产基因簇D4B片段的克隆。该克隆可转化进不产洛伐他汀的生物体以产生莫那可林J，正如本领域所知的。该克隆也可转化进产洛伐他汀的生物体以增加莫那可林J的生产，从而增加辛伐他汀的生产。另外，增加辛伐他汀生产的成份的另一例子是LovE/锌指基因，它可转化进产洛伐他汀的生物体以增加辛伐他汀的生产。优选的是，该产洛伐他汀的生物体在LDKS基因上有破坏(参见，例如，美国专利号6,391,583，其内容在此引入以供参考)。增加辛伐他汀生产的成份和方法可指许多其它成份和方法，不限于上述的例子。
本文公开的“酰基供体”或“酰基载体”是具有可转移到辛伐他汀和/或辛伐他汀前体或相关化合物上的酰基的化合物。一般来说，“酰基供体”或“酰基载体”是将酰基基团贡献给莫那可林J C8羟基的酰基硫酯。各种这类试剂是本领域已知的，本文进一步显示其具有该活性(参见，例如，表1举例说明的酰基硫酯)。除了本领域已知且通过本说明书显示具有该活性的那些外，本领域已知具有酰基化莫那可林J C8的能力以产生辛伐他汀的任何潜在的酰基供体/载体可通过与本文公开的酰基供体(例如，酰基-SNAC)的比较实验容易地鉴定。正如本领域所知，酰基基团具有分子式RCON；其中R可以是烷基或芳基，N可以是-Cl，-OOCR，-NH2，-OR等等。具有酰基基团的化合物包括，但不限于，酰基氯，酯，酰胺，或酸酐等等。这些化合物可以是脂肪族或芳族，取代或未取代的。例子包括，但不限于，苯甲酰氯，苯甲酸酐，苯甲酰胺，或苯甲酸乙酯等等。酰基供体的其它例子包括，但不限于，α-二甲基丁酰-SNAC，酰基硫酯，乙酰-CoA，丁酰-CoA，苯甲酰-CoA，乙酰乙酰-CoA，β-羟基丁酰-CoA，丙二酰-CoA，棕榈酰-CoA，丁酰硫酯，N-乙酰基半胱胺硫酯(acetylcyteamine thioesters，SNAC)，甲基巯基乙酸酯(methyl-thioglycolate，SMTG)，苯甲酰-SNAC，苯甲酰-SMTG，或α-S-甲基丁酰-SNAC。这些化合物可天然或合成产生，且在一些情况下，它们可穿透细胞膜。例如，许多这类化合物可在莫那可林J存在时加入LovD中以生产辛伐他汀。
本文使用的“酰基-SNAC”是指α-二甲基丁酰-SNAC。正如本领域所知，酰基-SNAC在体内条件下可穿透细胞膜。LovD可使用酰基-SNAC作底物通过区域特异性地酰基化莫那可林J的C8羟基开始从莫那可林J到辛伐他汀的反应。酰基-SNAC可将其酰基基团贡献给LovD。
本发明的典型实施方案
本领域的技术人员将理解本文提供的说明使得技术人员可产生各种本发明的实施方案。本发明的一个典型实施方案是制备辛伐他汀的方法，通过将莫那可林J；在LovD酰基转移酶存在时将酰基部分贡献给莫那可林JC8羟基的酰基硫酯；和LovD酰基转移酶混合起来；然后使得LovD酰基转移酶使用酰基硫酯的酰基区域选择性地酰基化莫那可林J的C8羟基；由此制备辛伐他汀。在本发明的典型实施方案中，LovD酰基转移酶具有SEQID NO：1或SEQ ID NO：2的氨基酸序列。本发明的一个相关实施方案是制备辛伐他汀的方法，包括将洛伐他汀；在LovD酰基转移酶存在时将酰基基团贡献给莫那可林J的C8羟基的酰基硫酯；和LovD酰基转移酶混合起来的步骤。在该相关方法中，LovD酰基转移酶允许将洛伐他汀水解成莫那可林J；然后使用酰基硫酯的酰基区域选择性酰基化莫那可林J的C8羟基；由此制备辛伐他汀。在某些实施方案中，辛伐他汀在不存在分离的生物体的条件下体外制备。
在本发明的一些实施方案中，莫那可林J；酰基硫酯和LovD酰基转移酶在产生LovD酰基转移酶的分离的生物体存在时在发酵培养基中混合，且其中该生物体是大肠杆菌，土曲霉，红色红曲霉，紫色红曲霉，丛毛红曲霉，Monascus vitreus，Monascus pubigerus，Candida cariosilognicola，米曲霉，Doratomyces stemonitis，多变拟青霉，桔青霉，产黄青霉，短尾帚霉或绿色木霉。任选该分离的生物体是表达SEQ ID NO：1的LovD多肽的土曲霉。在某些实施方案中，土曲霉不表达SEQ ID NO：3的LovF多肽。在本发明的某些实施方案中，诸如SEQ ID NOs：3和4的那些多肽的表达减少到其内源性活性的至少90，95或99％。作为选择，该生物体可以是表达SEQ ID NO：1的LovD多肽的大肠杆菌。在某些实施方案中，该大肠杆菌不表达SEQ IDNO：4的bioH多肽。因此，该宿主可以是内源性产生LovD酰基转移酶的宿主或者任选是通过例如，本领域已知且在本文中进一步论述的克隆技术将LovD酰基转移酶基因导入该生物体的异源性宿主。在一个典型的实施方案中，表达LovD酰基转移酶的异源性宿主是本领域已知用于该用途的细菌，酵母，或真菌。
正如下文的详细讨论，该分离的生物体可在本领域已知的各种发酵条件之一下生长且可根据例如，本发明的实施方案中所用的具体生物体的最优化生长相关的发酵参数选择确切的条件(参见，例如Miyake等，Biosci.Biotechnol.Biochem.，70(5)：1154-1159(2006)和Hajjaj等，Applied andEnvironmental Microbiology，67：2596-2602(2001)，引入其内容以供参考)。一般来说，该生物体在30-40℃的温度下生长至少4到至少48小时的时间。一般来说，该生物体在pH为6.5-8.5之间生长。在本发明的某些实施方案中，发酵培养基的pH可以是6.9，7.0，7.1，7.2，7.3，7.4，7.5，7.6，7.7，7.8，7.9，8.0或8.1。在举例性的实施方案中，该生物体在包含LB，F1或TB培养基的发酵培养基中生长。
任选的是，与本发明方法中的其它成份混合的莫那可林J通过发酵培养基内的分离的生物体，例如，也产生LovD酰基转移酶的上述生物体之一来生产。任选的是，与本发明方法中的其它成份混合的莫那可林J可通过加入到发酵培养基中并与产生LovD酰基转移酶的生物体一起培养的产生该化合物的不同生物体来生产。在本发明的另一实施方案中，莫那可林J来自外源性来源并加入发酵混合物中。任选的是，本发明的方法产生含0％-1％莫那可林J的成份的组合物，该莫那可林J在开始时加入到混合物中。在本发明的某些实施方案中，该方法导致加入混合物中的至少95％的莫那可林J转化成辛伐他汀。
在本发明的典型实施方案中，在LovD酰基转移酶存在时将酰基基团贡献给莫那可林J C8羟基的酰基硫酯可来源于外源性来源(例如，化学合成方法)并加入发酵混合物中。本文公开了各种这类酰基硫酯。典型的酰基硫酯是丁酰硫酯，N-乙酰基半胱胺硫酯或甲基巯基乙酸硫酯。任选的是，酰基硫酯包含中等链长(C3-C6)的酰基部分。在本发明的某些实施方案中，酰基硫酯能够穿过在发酵培养基内生长的大肠杆菌或土曲霉细胞的细胞膜。典型的是，酰基硫酯选自由α-二甲基丁酰-S-甲基巯基丙酸酯(DMB-S-MMP)，二甲基丁酰-S-乙基巯基丙酸酯(DMB-S-EMP)和二甲基丁酰-S-甲基巯基乙酸酯(DMB-S-MTG)和二甲基丁酰-S-甲基巯基丁酸酯(DMB-S-MMB)组成的组中。在举例性的实施方案，酰基硫酯是α-二甲基丁酰-S-甲基-巯基丙酸酯，它在发酵培养基中以1mM-100mM的浓度范围混合。
制备辛伐他汀的方法的某些实施方案还包括从混合物中纯化辛伐他汀的步骤。例如，本发明的某些实施方案可包括至少一个纯化步骤，该步骤包括裂解存在于混合物中的分离的生物体的细胞。该实施方案也可包括至少一个纯化步骤，该步骤包括离心存在于混合物中的分离的生物体的细胞或细胞裂解产物。该实施方案可包括至少一个纯化步骤，该步骤包括沉淀存在于混合物中的一种或多种化合物。该实施方案可包括至少一个纯化步骤，该步骤包括过滤存在于混合物中的一种或多种化合物。该实施方案可包括至少一个纯化步骤，该步骤包括对存在于混合物中的一种或多种化合物进行高效液相层析(HPLC)分析。
本文提供的说明书表明可使用这些方法的各种改变形式制备辛伐他汀和胡伐他汀等。在本发明的某些实施方案中，例如宿主生物体产生酰基硫酯和/或莫那可林J。作为选择，可向该生物体中加入酰基硫酯和/或莫那可林J作为辛伐他汀生产方法的组成部分。该方法可进一步包括加入具有诸如编码SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的基因的已知有利于辛伐他汀和/或胡伐他汀或类似物生产的一个或多个土曲霉基因的表达载体并将其转化进异源性宿主中，其中由此表达具有酰基转移酶活性的多肽。在另一实施方案中，莫那可林J可从异源性宿主中产生。
本发明的另一实施方案是在表达LovD酰基转移酶基因的生物体中从莫那可林J生产辛伐他汀的方法，包括共培养表达LovD酰基转移酶的第一生物体与产生酰基硫酯和/或莫那可林J的第二生物体(例如，在发酵混合物中)，其中该酰基硫酯在莫那可林J存在时与LovD酰基转移酶基因产物相互作用产生辛伐他汀。任选的是，该第一生物体是天然不产生洛伐他汀的生物体(例如，用LovD酰基转移酶基因转导的大肠杆菌)。作为选择，该第一生物体是诸如土曲霉(例如，LovF/LDKS基因失活的土曲霉)的产洛伐他汀生物体。该方法可进一步包含向发酵混合物中加入一种或多种外源性成份以增加诸如莫那可林J的辛伐他汀前体的生产，从而增加辛伐他汀的生产。
本发明的方法还可包括向发酵混合物中加入其它成份以增加莫那可林J的生产且因此增加辛伐他汀和/或胡伐他汀的生产。作为该方法的一个举例说明的实施方案，该成份可以是具有LovE基因的克隆，其中该生物体用该克隆转化且翻译LovE，从而增加辛伐他汀的生产。作为该方法的另一举例说明的实施方案，该成份可以是含有土曲霉基因组D4B片段的克隆(ATCC保藏号98876)，其中用该克隆转化该生物体以增加莫那可林J的生产。
本发明的另一实施方案是在外源性酰基硫酯存在时体外或体内将莫那可林J转化成辛伐他汀的方法。优选的是，该酰基硫酯能够穿透细胞膜。本发明的另一实施方案是在酰基硫酯存在时在产生LovD的生物体中直接在该生物体内将莫那可林J转化成辛伐他汀的方法。在本发明的一个举例说明的实施方案中，该生物体是LDKS基因被破坏的土曲霉。
本发明的另一实施方案是由这样的一种方法制备的辛伐他汀产品，该方法包括将莫那可林J；在LovD酰基转移酶存在时将酰基基团贡献给莫那可林J的C8羟基的酰基硫酯；和LovD酰基转移酶混合起来的步骤；并使得LovD酰基转移酶使用酰基硫酯的酰基区域选择性地酰基化莫那可林J的C8羟基；由此制备辛伐他汀产品。本发明的一个相关实施方案是由这样的一种方法生产的胡伐他汀产品，该方法包括将水解的普伐他汀四元醇；在LovD酰基转移酶存在时将酰基基团贡献给水解的普伐他汀四元醇C8羟基基团的酰基硫酯；和LovD酰基转移酶混合起来的步骤；并允许LovD酰基转移酶使用酰基硫酯的酰基区域选择性地酰基化水解的普伐他汀四元醇C8羟基，由此制备胡伐他汀产品。
本发明的另一实施方案是生产辛伐他汀的方法，包括在SEQ ID NO：1的LovD或LovD同源物存在时将洛伐他汀水解成莫那可林J并酰基化莫那可林J，其中所述的水解和酰基化产生辛伐他汀。本发明的另一相关实施方案是生产胡伐他汀的方法，包括在SEQ ID NO：1的LovD或LovD同源物存在时将普伐他汀变成水解的普伐他汀并酰基化莫那可林J变体，其中所述的水解和酰基化产生胡伐他汀。
本发明的实施方案包括以本文公开的方法用于制备和/或制备而成的成份的组合物。例如，本发明的一个实施方案是包含下列成份的组合物：莫那可林J；在LovD酰基转移酶存在时将酰基基团贡献给莫那可林J C8羟基的酰基硫酯。这些组合物的某些实施方案中的成份还包括LovD酰基转移酶。这些组合物的某些实施方案中的成份还包括辛伐他汀。任选的是，该组合物还包括分离的生物体，例如大肠杆菌，土曲霉，红色红曲霉，紫色红曲霉，丛毛红曲霉，Monascus vitreus，Monascus pubigerus，Candidacariosilognicola，米曲霉，Doratomyces stemonitis，多变拟青霉，桔青霉，产黄青霉，短尾帚霉或绿色木霉。在典型的实施方案中，该组合物中的生物体是表达SEQ ID NO：1的LovD多肽的土曲霉或大肠杆菌。在本发明的一个实施方案中，该生物体是不表达SEQ ID NO：3的LovF多肽的土曲霉。在本发明的另一实施方案中，该生物体是不表达SEQ ID NO：4的bioH多肽的大肠杆菌。在本发明的某些实施方案中，组合物中分离的生物体已用编码SEQ ID NO：1的土曲霉LovD多肽的表达载体转导。
本文公开了可用于本发明的组合物中的各种酰基硫酯。典型的酰基硫酯是丁酰硫酯，N-乙酰基半胱胺硫酯或甲基巯基乙酸硫酯。任选的是，酰基硫酯包含中等链长(C3-C6)的酰基部分。在本发明的某些实施方案中，酰基硫酯能够穿过在发酵培养基内生长的大肠杆菌或土曲霉细胞的细胞膜。典型的是，酰基硫酯选自由α-二甲基丁酰-S-甲基巯基丙酸酯(DMB-S-MMP)，二甲基丁酰-S-乙基巯基丙酸酯(DMB-S-EMP)和二甲基丁酰-S-甲基巯基乙酸酯(DMB-S-MTG)和二甲基丁酰-S-甲基巯基丁酸酯(DMB-S-MMB)组成的组中。在举例性的实施方案中，酰基硫酯是α-二甲基丁酰-S-甲基巯基丙酸酯，它在发酵培养基中以1mM-100mM的浓度范围混合且一般可以是大约10，20，30，40，50，60，70，80或90mM。在本发明的一些实施方案中，该组合物还包括洛伐他汀且该组合物中辛伐他汀的量大于组合物中洛伐他汀的量。
正如下文所详细讨论的，用于制备辛伐他汀的本发明的方法和材料可修改为生产结构上类似于辛伐他汀的化合物，例如胡伐他汀。在本文中，本发明的一个实施方案是制备胡伐他汀的方法，包括将水解的普伐他汀四元醇；在LovD酰基转移酶存在时将酰基基团贡献给水解的普伐他汀四元醇C8羟基基团的酰基硫酯；和LovD酰基转移酶混合起来的步骤；然后允许LovD酰基转移酶使用酰基硫酯的酰基区域选择性地酰基化水解的普伐他汀四元醇C8羟基，由此制备胡伐他汀。本发明的一个相关实施方案是包含下列成份的组合物：水解的普伐他汀四元醇；在LovD酰基转移酶存在时将酰基基团贡献给水解的普伐他汀四元醇C8羟基基团的酰基硫酯；LovD酰基转移酶；和胡伐他汀。
本发明的另一实施方案是包含一或多种胡伐他汀前体的组合物，例如，在硫酯存在时水解的普伐他汀四元醇或6-羟基-6-去甲基莫娜可林J，其中该硫酯的选择在于其具有酰基化莫那可林J或诸如水解的普伐他汀四元醇的莫那可林变体的C8羟基基团的能力。一般来说，该组合物还可包括上述生物体。因此，本发明的实施方案包括制备基本上为本文公开和举例成份的辛伐他汀或胡伐他汀组合物的方法。
如果生产辛伐他汀的改造生物体(例如，LDKS基因破坏的土曲霉)也产生洛伐他汀(例如，一点最小残留量)，本文公开的方法和材料允许改造生物体中的生化途径/过程以便辛伐他汀或诸如胡伐他汀的相关化合物是这些途径的主要产物。一个相关实施方案是包含生物体和由该生物体产生的辛伐他汀和/或胡伐他汀的成份的组合物，其中该组合物中辛伐他汀和/或胡伐他汀的量大于组合物中洛伐他汀的量。
本发明的一个相关实施方案是包含LovD，水解的普伐他汀，和酰基硫酯的成份的组合物。在举例性的实施方案中，组合物的成份包含产生胡伐他汀的大肠杆菌。在有关实施方案中，该组合物的成份是产生胡伐他汀的土曲霉(例如，LDKS基因破坏的土曲霉)。如果生产胡伐他汀的改造生物体(例如，LDKS基因破坏的土曲霉)也产生洛伐他汀(例如，一点最小残留量)，本文公开的方法和材料允许改造生物体中的生化途径/过程以便胡伐他汀是这些途径的主要产物。一个相关实施方案是包含生物体和由该生物体产生的胡伐他汀的成份的组合物，其中该组合物中胡伐他汀的量大于组合物中洛伐他汀的量。
在本发明的某些实施方案中，其它的成份和/或方法步骤可与上述一种或多种方法和材料组合。例如，该方法还可包括使用高细胞密度发酵以增加LovD酰基转移酶的有效浓度和优化发酵条件和/或通过蛋白质工程增加LovD酰基转移酶对一种或多种酰基硫酯的催化效率。可使用许多其它的成份或方法增加辛伐他汀的生产或有利于辛伐他汀生产的中间化合物的生产。
如上所述，在许多生物体中观察到洛伐他汀的生产(需要LovD酰基转移酶活性)，例如土曲霉，红色红曲霉，紫色红曲霉，丛毛红曲霉，Monascusvitreus，Monascus pubigerus，Candida cariosilognicola，米曲霉，Doratomycesstemonitis，多变拟青霉，桔青霉，产黄青霉，短尾帚霉或绿色木霉。鉴于本文公开的本发明的特性，使用已知方法和材料与本文提供的说明书相结合，本领域的技术人员可将一种或多种这些生物体的培养物(或已知产生洛伐他汀的任何其它生物体)与莫那可林J和在LovD酰基转移酶存在时将酰基基团贡献给莫那可林J的C8羟基基团的酰基硫酯(例如，α-二甲基丁酰-SNAC)混合以使用LovD酰基转移酶制备辛伐他汀。例如，正如本说明书所示，本发明的特性允许人们在本领域已知的各种产洛伐他汀生物体中制备辛伐他汀和相关化合物，而不需要关于这些生物体中表达的具体LovD酰基转移酶特征的任何具体知识。
在新生物体(例如，与土曲霉相关的真菌种类)中制备辛伐他汀和/或检测该生物体的该生产能力的举例性方法中，第一个步骤是制备莫那可林J和将酰基基团贡献给莫那可林J的C8羟基基团的酰基硫酯的混合物。在第二个步骤中，将该混合物随后与该生物体(例如，产洛伐他汀生物体)在发酵混合物中混合并使其生长。在第三个步骤中，接着通过例如，使用下面实施例中所述的HPLC分析检测该混合物中存在的辛伐他汀。由于高通量筛选方法是本领域已知的(参见，例如Kittel等，Metab.Eng.2005，7(1)：53-58，在此引入以供参考)，该方法可在大量测试样品，例如本领域已知且技术人员容易得到的巨量真菌培养物上进行以便容易地确定是否有和哪一种生物体表达具有LovD酰基转移酶活性的多肽，使其可用于本文公开的本发明的实施方案。
本文公开的方法也允许技术人员分离和复制出其它的LovD酰基转移酶实施方案，例如具有诸如在各种反应条件下稳定性增强和/或在各种反应条件下酶动力学良好的其它所需特性的那些实施方案。在本文中，本发明的另一实施方案是鉴定本发明的其它LovD酰基转移酶的实施方案，该方法包括将可能表达LovD酰基转移酶的生物体(例如，产洛伐他汀的生物体)或来自该生物体的细胞提取物与在LovD酰基转移酶存在时将酰基基团贡献给莫那可林J的C8羟基的酰基硫酯(例如，α-二甲基丁酰-SNAC)混合且随后检测该混合物中存在的辛伐他汀的简单步骤。存在辛伐他汀表示存在所需的LovD酰基转移酶活性。由于有本文公开的方法以及本领域已知的高通量筛选方法(参见，例如，Kittel等，Metab.Eng.2005，7(1)：53-58，在此引入以供参考)，该方法可在大量测试样品，例如本领域已知且技术人员容易得到的巨量真菌培养物(例如，产洛伐他汀的培养物)上仅用最少量的实验来实施。因此，本领域已知的许多产洛伐他汀的生物体，本领域已知的高通量筛选方法和本说明书可指导人们容易地确定是否有和哪一种多肽具有LovD酰基转移酶活性，使得它们可用于本文公开的本发明的实施方案。
一旦使用这些方法观察到LovD酰基转移酶活性，它随后可用于本领域可接受的方法中以克隆编码具有该活性的蛋白质的基因。作为选择，随后可单独使用LovD酰基转移酶多核苷酸序列(例如，来自土曲霉)或与上述功能性研究结合筛选生物体的基因文库以鉴定与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2具有同源性的新LovD酰基转移酶多核苷酸序列)。在本文中，LovD的同源性酶可在例如，但不限于，真菌聚酮基因簇中找到。例如，密实菌素生物合成途径中的Mlc涉及催化相同的转酰基反应(参见，例如，Y.Abe，T.等，Mol Genet Genomics.2002，267，636-646)，而squalestatin途径中的酰基转移酶看催化ACP-结合的四酮硫酯和糖苷配基(参见，例如，R.J.Cox，F.等，Chem Commun(Camb)2004，20，2260-2261)之间的类似反应。LovD的氨基酸序列类似于C型β-内酰胺酶，它催化β-内酰胺型抗生素的水解失活(参见，例如，E.Lobkovsky，E.M.等，Biochemistry，1994，33，6762-6772和A.Dubus，D.等，Biochem.J.1993，292，537-543)。LovD与enterobacter cloacae P99内酰胺酶(参见，例如，S.D.Goldberg，等，Protein Sci.2003，12，1633-1645)的序列对比显示出中等序列同源性，包括潜在保守的活性位点残基，例如催化性Ser76，Lys79，Tyr188，和Lys315(参见，例如，S.D.Goldberg，等，ProteinSci.2003，12，1633-1645)。由于这些方法，本发明的另一实施方案是与SEQID NO：1所示的氨基酸序列具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，或99％的序列相同性的分离LovD酰基转移酶多肽，其中该多肽在合适酰基硫酯供体(例如，α-二甲基丁酰-SNAC)存在时具有酰基化莫那可林J C8羟基的能力。
如本文所述，“区域选择性地酰基化(regioselectively acylate)莫那可林JC8羟基的酰基硫酯”是具有可转移到莫那可林J或相关化合物上以便按本文所述制备辛伐他汀或相关化合物的酰基基团的化合物。各种该试剂是本领域已知的且本文进一步显示具有该活性(参见，例如，表1中举例的酰基硫酯)。除了本领域已知且通过本说明书显示具有该活性的那些外，本领域已知(或从头合成)具有酰基化莫那可林J C8的能力以产生辛伐他汀的任何潜在的酰基供体/载体可通过与本文公开的酰基供体(例如，酰基-SNAC)的比较实验容易地鉴定。一般在该实验中，酰基硫酯是丁酰硫酯，N-乙酰基半胱胺硫酯或甲基巯基乙酸硫酯。任选的是，酰基硫酯包含中等链长(C3-C6)的酰基部分。在本发明的某些实施方案中，酰基硫酯能够穿过在发酵培养基内生长的大肠杆菌或土曲霉细胞的细胞膜。典型的是，酰基硫酯选自由α-二甲基丁酰-S-甲基巯基丙酸酯(DMB-S-MMP)，二甲基丁酰-S-乙基巯基丙酸酯(DMB-S-EMP)和二甲基丁酰-S-甲基巯基乙酸酯(DMB-S-MTG)和二甲基丁酰-S-甲基巯基丁酸酯(DMB-S-MMB)组成的组中。
如本说明书所示，本发明的特性允许人们能够以最少量实验容易地鉴定一个化合物是“区域选择性地酰基化莫那可林J的C8羟基的酰基硫酯”。在鉴定一个化合物是“区域选择性地酰基化莫那可林J的C8羟基的酰基硫酯”的一个举例性方法中，第一步是制备莫那可林J和土曲霉的混合物。在第二步中，随后将该混合物与待测化合物在发酵混合物中混合并使其生长。在第三步中，随后通过例如，使用在下面实施例中所讨论的HPLC分析检测该混合物中存在的辛伐他汀，其中存在辛伐他汀鉴定该化合物具有该活性。根据本领域已知的高通量筛选方法(参见，例如，Kittel等，Metab.Eng.2005，7(1)：53-58，在此引入以供参考)，该方法可在大量待测样品上进行以便容易地测定是否有和哪一种酰基供体化合物具有使其可用于本文公开的本发明的实施方案中的效用。
本发明的实施方案还包括设计成有利于本发明方法的生产物品和/或试剂盒。典型的该试剂盒包括根据本发明方法在其中使用其成份的说明书。该试剂盒可包含被分区的载体装置以便封闭地容纳一个或多个容器装置，例如小瓶，试管，等等，每个容器装置中包含用于该方法的一个单独成份。例如，一个容器可包含例如，装有LDKS基因破坏的土曲霉的一个小瓶和装有酰基-SNAC化合物或类似物的另一小瓶，两个小瓶都可加入发酵混合物中以产生辛伐他汀。
在本发明的一个典型实施方案中，提供了含有用于生产辛伐他汀的材料的生产物品。该生产物品包括容器和标签。合适的容器包括，例如，瓶子，小瓶，注射器，和试管。该容器可由诸如玻璃或塑料的各种材料构成。例如，该容器可容纳产生辛伐他汀的成份的组合物(例如，酰基载体和生物体)。容器上或与其相连的标签表明该组合物用于检查细胞多肽。例如，生产物品还可包含第二容器，该容器包含用于加入发酵混合物中的另一化合物或底物。例如，该化合物或底物可用于增加辛伐他汀生产中某些中间体，例如莫那可林J的生产。它还可包括从商品和用户角度所需的其它材料，包括其它缓冲液，稀释剂，滤器，针头，注射器，和带有使用说明的包装插件。
本发明的其它生物学特性在下面部分讨论。
本发明实施方案的生物化学特性
通过讨论本发明的生化特性有利于预期本发明的某些特性。在本说明书的下面部分和实施例中，LovD酰基转移酶是SEQ ID NO：1所示的土曲霉LovD多肽，且一般称为“LovD”或“LovD酶”。
检查了LovD酶与可供选择的酰基供体的搭配。我们发现酰基载体/供体不必与LDKS连接。可供选择的含巯基载体是合适的，包括酰基-CoA(辅酶A)且更重要的是，膜通透性酰基-SNAC(图7)。我们发现LovD不必与LovF相互作用且可接受各种不同供体的酰基基团。我们还发现LovD可转移各种酰基底物到莫那可林J的C8-羟基上产生一种类型的洛伐他汀类似物。我们发现LovD可用各种酰基底物区域选择性地酰基化莫那可林J C8羟基位置。其中成功的酰基是α-二甲基丁酰-SNAC，它在LovD和莫那可林J存在时产生辛伐他汀。我们还发现LovD的转酰基化活性可在体外证实并在异源性宿主中重建。我们发现LovD用α-二甲基丁酰直接酰基化莫那可林J以产生药学上重要的辛伐他汀。α-二甲基丁酰-SNAC是细胞可通透的。α-二甲基丁酰-SNAC的细胞可通透特性具有重要含义：该化合物可作为体内前体提供给生物体，例如表达LovD的原核生物或真核生物。当在莫那可林J存在时(内源性制备，或外源性加入发酵培养基中)发酵时，原核生物或真核生物可直接提供辛伐他汀。例如，检查了大肠杆菌作为微生物宿主将莫那可林J生物转化为辛伐他汀。莫那可林J和二甲基丁酰-SNAC都可加入过表达LovD酶的大肠杆菌菌株的生长培养基中(图10)。从产量良好的发酵培养液中分离了辛伐他汀。该技术可用于天然洛伐他汀生产者土曲霉中。可构建LDKS缺陷型菌株使其不能合成2-甲基丁酸酯侧链。α-二甲基丁酰-SNAC可加入发酵培养基中。辛伐他汀可在该单步骤发酵期间合成。
如上所述，LovD可催化洛伐他汀生物合成期间最后的酰基转移步骤且可区域特异性乙酰化莫那可林J中的C8羟基基团。LovD显示出对十氢化萘糖苷配基，酰基载体和酰基基团的广阔底物特异性。当添加非天然底物α-二甲基丁酰-SNAC时，LovD在体外和体内都可产生药用上重要的辛伐他汀。当α-二甲基丁酰硫酯前体供应给土曲霉的LovF-缺陷型菌株时，可改道洛伐他汀生物合成途径直接产生辛伐他汀。本发明允许：1)微生物转化莫那可林J成为辛伐他汀(图10)；2)共培养LovD过表达菌株与产生莫那可林J的菌株；和3)单步发酵土曲霉(ΔLDKS)产生辛伐他汀。在每一情况下，酰基底物a-二甲基丁酰-SNAC可以是化学合成的并加入到发酵液中。
LOVD不需与LOvF相互作用，且LOVD可催化酰基-COA和其它可供选择的含巯基载体的转酰基反应(图5)
我们首先检查了酰基-CoA是否可用作转酰基反应的底物。LovD的连续基因通过重叠延伸PCR使用剪接从土曲霉基因组DNA扩增并插入pET28a表达载体中。过表达可溶的，N-末端6xHis融合的LovD在大肠杆菌菌株BL21(DE3)/pAW31中进行。LovD使用镍-NTA亲和柱纯化到同质(最终产量～40mg/L)。底物莫那可林J(1mM)通过LiOH水解洛伐他汀来制备并加入含纯LovD(10μM)和丁酰-CoA(4mM)的反应混合物中，丁酰-CoA是最好地模拟天然α-甲基丁酸酯侧链的商业上可获得的酰基-CoA。该反应混合物在室温下温育，用乙酸乙酯提取并通过HPLC和LC-MS分析(图5)。
在反应混合物中形成与洛伐他汀具有相同紫外吸收的单一更疏水的化合物，它与莫那可林J的消失相关联(图5，痕迹a)。发现新化合物的质量为391(M+H)，与丁酰基团添加到莫那可林J上一致。莫那可林J的C8羟基选择性酯化产生4通过质子NMR光谱法(CDCl3，500MHz)证实。4(内酯化形式)的质子NMR除了线性酰基侧链的脂肪族信号外几乎与洛伐他汀相同。4中诊断性H8多重谱线(指定使用1H-1H COSY，1H-13C HMQC和1H-13CHMBC)前移为δ5.38，相比较在莫那可林J中相同质子观察到δ4.23。这与C8酰氧基取代的去屏蔽效应一致。携带其它羟基基团的碳的质子H11和H13分别从莫那可林J上的δ4.71和δ4.38改变为4中的δ4.51和δ4.36。
正如图5A所示(痕迹a)，使用丁酰-CoA作为酰基供体在10小时后观察到87％的莫那可林J转化成4。时间-过程研究揭示出0.18分-1的表观转化率(图5B)。观察到的87％转化很可能接近平衡，正如图5B所证实。为了检查转化平衡的生化特性，我们测定了LovD是否也催化反向的水解反应。事实上，当洛伐他汀用作唯一底物时，容易检测到莫那可林J的形成，其kcat和Km值分别为0.21±0.01分-1和0.56±0.05mM(图5C)。当LovD上推定的活性位点丝氨酸(Ser76)突变成丙氨酸时，检测不到4的形成或洛伐他汀的水解(图5A，痕迹b)。
4的酶合成证实了LovD确实催化图4所示的酰基转移反应。另外，该结果表明催化转化不需要LovF与LovD结构域之间的直接相连，与以前假定的LovD催化模式相反(参见，例如，J.Kennedy，K.等，Science，1999，284，1368-1372和C.R.Hutchinson，J.等，Antonie Van Leeuwenhoek 2000，78，287-295)。酰基-S-CoA可取代酰基-S-LovF，虽然由于丧失潜在的蛋白质-蛋白质相互作用很可能具有明显更高的Km。
用一些不同的商业上可获得的酰基取代基进行转酰基试验揭示了LOVD对中等链长(C3-C6)的酰基有偏好
我们通过用各种商业上可获得的酰基-CoAs进行转酰基试验测定了LovD对不同酰基取代基的耐受性(表1A)。所有试验用1mM莫那可林J，4mM酰基-CoA和10uM LovD进行10小时。我们的结果清楚地表明LovD对中等链长(C3-C6)的酰基显示出偏好性，以丁酰-CoA为最佳烷酰基-CoA底物。令人惊奇的是，更大体量的苯甲酰-CoA是所检查的最佳酰基底物之一，将几乎70％的辛伐他汀转化成相应的8-苯酰氧基-洛伐他汀类似物(表观kcat＝0.16分-1)。导入α-β不饱和显著降低反应率，正如在巴豆酰-CoA存在时可见6％的莫那可林J酰基化。乙酰乙酰-CoA和β-羟基丁酰-CoA都是LovD的优秀底物，与分别来自天然宿主的莫那可林X(参见，例如，A.Endo，K.等，J.Antibiot，1986，38，321-327)和莫那可林M(参见，例如，A.Endo，D.等，J.Antibiot.1986，39，1670-1673)的分离良好吻合。在所测定的CoA底物中，LovD对丙二酰-和棕榈酰-CoA无活性。
酰基-SNAC更便于合成制备且在体内条件下可穿透细胞膜，换用这种酰基载体进行另外的转酰基化试验，揭示了酰基-SNAC是LOVD的有效底物
为了进一步检查LovD对备选酰基载体，特别是那些更便于合成制备、且在体内条件下可穿透细胞膜的酰基载体的底物特异性，我们测定了丁酰-硫酯的两个变体作为LovD的底物(图5)。N-乙酰基半胱胺硫酯(SNAC)已被广泛用作探针和研究天然产物生物化学的前体(参见，例如，Auclair等，Science，1997，277，367-369)。最近表明甲基巯基乙酸硫酯(SMTG)是红霉素的前体定向生物合成中SNAC的廉价替代物(参见，例如，S.Murli，K.S.等，Appl.Environ.Microbiol.2005，71，4503-4509)。图5(痕迹c和d)显示了当这些丁酰硫酯用作酰基供体时将莫那可林J转化成4。SNAC和SMTG硫酯都能有效代替丁酰-CoA，其表观kcat值分别为0.09分-1和0.23分-1(图5B)，进一步表明LovD与LovF之间的蛋白-蛋白相互作用，以及LovD与磷酸泛酰巯基乙胺臂之间的相互作用不是酰基转移所必需的。然而，丁酰硫代乙烷不是LovD的有效底物且仅支持4％的莫那可林J转化成4。同样，苯甲酰-SNAC和苯甲酰-SMTG可有效替代苯甲基-CoA，其表观kcat值分别为0.12分-1和0.15分-1(表1A)。
使用α-S-甲基丁酰-SNAC和α-二甲基丁酰-SNAC测定洛伐他汀和辛伐他汀的体外化学酶法合成揭示了莫那可林J在酰基-SNAC存在时转化成辛伐他汀
随后我们合成了α-S-甲基丁酰-SNAC和α-二甲基丁酰-SNAC并分别测定了洛伐他汀和辛伐他汀的体外化学酶法合成。结果在图8和表1A中表示。洛伐他汀和辛伐他汀的可靠样品用作HPLC检测的参照(图8，痕迹a)。与丁酰-，戊酰-和己酰-SNAC相比，令人惊奇的是天然的α-S-甲基丁酸酯侧链是更差的底物。洛伐他汀合成的表观kcat(～0.04分-1)比LovD对丁酰-SNAC低50％以上。这表明野生型LovD对转移分支的底物不是最优选的。在α-位置加入第二个甲基取代进一步降低乙酰化率，很可能是由于增加了二甲基部分的空间位阻。在标准测定条件下，当α-二甲基丁酰-SNAC用作底物时，大约10％的莫那可林J转化成辛伐他汀(表观kcat＝0.02分-1)。当100uMLovD和过量10倍的α-二甲基-SNAC或α-二甲基-SMTG加入体外反应混合物中时我们能够达到的平衡转化率＞70％(图8，痕迹b和c)。
LOVD能够体外转移各种酰基底物(不仅是LDKS)到莫那可林J的C-8-羟基基团以产生一类洛伐他汀类似物
为了测试LovD对莫那可林J变异体的底物特异性，我们试验了四元醇7转化成8，普伐他汀(5)和胡伐他汀(6)(图9)。以前已显示了当给莫那可林J生物合成阻断的土曲霉突变体供应8-desmethyl-莫那可林J时，可容易地分离密实菌素(参见，例如，J.L.Sorensen，K.等，Org.Biomol.Chem.2003，1，50-59)。这暗示LovD可耐受十氢化萘核心C6位置的取代。事实上，LovD对C6羟基取代显示出不严格的特异性并以更高效率催化7的酰基化。使用相应的酰基硫酯合成8，普伐他汀，或胡伐他汀的表观转化率分别为0.18，0.11，0.03分-1。可信的普伐他汀的滞留时间与酶合成的化合物相同。通过LC-MS证实了新形成的化合物的质量。我们在反应混合物中未检测到任何二酰基化产物。
体内数据表明LOVD可用于洛伐他汀类似物的制备型生物合成
为了证实LovD可用于洛伐他汀类似物的制备型生物合成，我们首先尝试使用大肠杆菌作为异源性宿主进行体内苯甲基化反应。BL21(DE3)/pAW31过表达菌株在摇瓶(200mL)中生长至OD600为1.0，此时向培养基中加入1mM IPTG，0.8mM莫那可林J和4mM苯甲酰-SNAC或苯甲酰-SMTG。LovD的表达和生物转化在18℃下进行。提取培养物并分析8-苯甲酰-莫那可林J的形成。当添加苯甲酰-SNAC时，在诱导后20小时内检测到84％的莫那可林J转化。该产物经内酯化并通过单硅胶层析步骤纯化。NMR光谱证实C8羟基的区域选择性苯甲酰化，因为诊断性H8多重谱线前移到δ5.61。相反，添加苯甲酰-SMTG的培养基观察到仅40％苯甲酰化。苯甲酰-SMTG被大肠杆菌迅速降解且在24小时后的培养基中检测不到痕迹。
在纯化的LOVD和莫那可林J存在时酰基底物，α-二甲基丁酰-SNAC产生辛伐他汀
我们用(α-二甲基丁酰-SNAC作底物进行低细胞密度发酵以便以单个生物合成步骤从莫那可林J产生辛伐他汀。培养2天后，我们观察到～90％的莫那可林J转化成辛伐他汀(参见，例如下面列出的“发酵条件”)。纯化该产物且质子和碳NMR光谱与以商品购买的化合物相同。辛伐他汀的产量较低与体外观察到的转化率较慢一致，在SNAC前体细胞内浓度较低时产量进一步减少。其它因素，例如辛伐他汀的可逆水解(我们观察到在LovD存在时的辛伐他汀水解，即水解kcat(0.02分-1)比图5C所示的洛伐他汀水解慢～10倍)和延长发酵后LovD的失活可导致观察到的转化。我们预期通过一些方法可明显提高该产量，例如1)使用高细胞密度发酵增加LovD的有效浓度和最优化发酵条件；2)通过蛋白质工程增加LovD对非天然前体的催化效率。
本申请全文中引用了各种出版物。这些出版物的公开内容以其整体在此引入以供参考。
实施例
下面的实施例提供了可用于实施本文公开的本发明的各种实施方案的举例性的方法和材料。
实施例1：举例性的LOVD酰基转移酶的克隆，表达和纯化
土曲霉LovD的三个外显子可从土曲霉基因组DNA逐个扩增并通过重叠延伸PCR使用剪接法产生连续的阅读框。分别在5’和3’外侧引物上引入限制性位点NdeI和HindIII。将该基因盒连接进pET28(Novagen)以产生表达构建体pAW31。用pAW31转化的大肠杆菌BL21(DE3)菌株在LB培养基中在37℃下生长到OD600为0.5，此时向培养基中加入1mM IPTG且在18℃下进行表达24小时。离心收集细胞，重悬于缓冲液A(50mM Tris，pH.8.0，2mM DTT，2mM EDTA)中并通过超声裂解。离心去掉细胞碎片和不溶性蛋白(17,000g，4℃，1小时)。为了清除裂解物，加入2mL的Ni-NTA树脂(Qiagen)。使用咪唑浓度增加的缓冲液A的梯度纯化LovD。纯化的(＞95％)LovD蛋白质在含250mM咪唑的缓冲液A中洗脱，将缓冲液更换成不含咪唑的缓冲液A，浓缩，分成等分试样并迅速冷冻。冷冻的LovD等分试样仅单次使用。我们观察到在重复冷冻-解冻循环后酶活性明显降低。
实施例2：举例性的发酵条件
发酵条件：500mL培养物中含带有30mg/L卡那霉素的LB培养基。在OD600为1.0时，将细胞浓缩至最终OD600为5.0并用1mM IPTG诱导。加入底物莫那可林J和α-二甲基丁酰-SNAC至终浓度为1mM和4mM。在不同时间点，收集培养基样品，离心，过滤并注射到HPLC(20μL)上。提取条件：当达到最大转化时，酸化培养液至pH为2.0，用乙酸乙酯提取，干燥并重溶于甲苯中。莫那可林J的内酯形式使用以前所述的soxhlet装置通过回流获得(参见，例如，J.L.Sorensen，K.等，Org.Biomol.Chem.2003，1，50-59)。
诸如LB，F1或TB发酵培养基的各种发酵培养基是本领域熟知的，它们可用于或改良用于本文公开的本发明的实施方案，包括LB，TB和F1培养基。改良用于培养诸如土曲霉和丛毛红曲霉的生物体的其它培养基也是本领域熟知的(参见，例如，Miyake等，Biosci.Biotechnol.Biochem.，70(5)：1154-1159(2006)和Hajjaj等，Applied and Environmental Microbiology，67：2596-2602(2001)，引入其内容以供参考)。
典型的Luria Bertani培养基(LB)配方如下：
●10g胰蛋白胨
●5g酵母提取物
●10g NaCl
●1L蒸馏水
pH至～7.3-7.5。
典型的TB配方如下：
●3g Pipes(10mM)
●2.2g CaCl2H20(15mM)
●18.6KCl(250mM)
●10.9g MnCl2(55mM)
●1L蒸馏水
用KOH调pH至6.7-6.8。
典型的F1培养基可参见美国专利号5,064,856，其内容在此引入以供参考。
一般地，所述培养基在配制后通过诸如过滤或高压灭菌的方法灭菌。
实施例3：通过缺失BIOH在大肠杆菌中提高辛伐他汀的生物转化
本实施例进一步鉴定了洛伐他汀基因簇中编码的LovD多肽(也参见Xie等，(2006)Chem Biol 13：1161-1169)。LovD催化洛伐他汀生物合成的最后一步并负责将大合成酶LovF的2-甲基丁酸酯侧链转移到直接生物合成前体，即莫那可林J(MJ)酸上(参见，例如，Kennedy等，(1999)Science 284：1368-1372)。我们证实了LovD对十氢化萘核心，硫酯酰基单元和硫酯酰基载体表现出宽广的底物特异性。使用过表达LovD的大肠杆菌菌株和可穿透细胞膜的硫酯二甲基丁酰-S-甲基巯基丙酸酯(DMB-S-MMP)(图13A)，我们开发了在一步法中以高产率将MJ酸转化为辛伐他汀酸的全细胞生物催化方法(参见，例如，Xie等，(2007)Appl Environ Microbiol 73：2054-2060)。该发酵方法相对于目前的合成途径在经济上是有竞争力的选择。
硫酯DMB-S-MMP是辛伐他汀生物转化的整合成份。它是检查的酰基转移反应中催化效率最高的酰基供体之一，而其合成成本最低。与该化合物相关的一个明显的缺点是DMB-S-MMP中甲酯键的水解产生二甲基丁酰巯基丙酸(dimethylbutyryl mercaptopropionic acid，DMB-S-MPA)(图13)。该水解反应是酶促反应，因为在不存在大肠杆菌时没有观察到降解，且该反应在高细胞密度发酵期间显著提高。鉴于如下三个原因该副反应是不希望发生的：1)该底物的水解消耗了LovD-催化的转酰基化中可利用的DMB-S-MMP，需要以高摩尔过量地加入硫酯且在发酵期间需频繁补充；2)由于DMB-S-MPA与DMB-S-MMP相比作为二甲基丁酸供体的效率更低(慢大约10倍)(参见，例如，Xie等，(2007)Appl Environ Microbiol 73：2054-2060)，更可溶的DMB-S-MPA积聚可用作LovD的竞争性酰基底物。这有效降低了反应速度且被体外使用纯化的LovD证实。因此，生物转化的总时间被不必要地延长；和3)DMB-S-MPA的羧酸部分干扰了生物转化完成时培养基中辛伐他汀酸的纯化。酸化培养基时两种化合物都从培养液中沉淀出来且在辛伐他汀结晶前需要其它分离步骤。尽管用过量水洗涤过滤物可去掉DMB-S-MPA，但在洗涤步骤期间损失了相当量的辛伐他汀，导致总回收率降低。
因此消除不需要的水解副反应可提高全细胞生物催化过程和下游纯化步骤的经济效率。因此最直接的目标是查明负责该不需要的副反应的酶。在此我们教导了将BioH鉴定为大肠杆菌羧酸酯酶，它将DMB-S-MMP水解成DMB-S-MPA。通过构建LovD过表达菌株的ΔbioH衍生物，我们完全消除了该竞争性反应且进一步提高了辛伐他汀酸全细胞生物催化合成的稳健性(robustness)。
材料，菌株和质粒
莫那可林J和DMB-S-MMP按以前所述制备(参见，例如，Xie等，(2007)Appl Environ Microbiol 73：2054-2060)。所有试剂从标准来源购买。BL21(DE3)菌株[F-omp hsdSB(rB-mB-)gal dcmλ(DE3)]从Novagen获得。Keio集合物(collection)从日本国家遗传研究所获得(参见，例如，Baba等，(2006)Mol Syst Biol 2：20060008)。单基因敲除突变体衍生自BW25113菌株[rrnB3 DElacZ4787 hsdR514 DE(araBAD)567 DE(rhaBAD)568rph-1]。WA837(rB-，mB+，gal met)，即限制性-减型和改良性-加型大肠杆菌B菌株从TheColi Genetic Stock Center(CGSC)获得(参见，例如，Wood，W.B.(1966).J MolBiol 16：118-133)。质粒pAW31(kanr)和pXK8(kanr)从pET28a获得且含有分别来自土曲霉的lovD基因和来自大肠杆菌的bioH基因。
基于全细胞的水解试验
来自Keio集合物的选定57个突变体与BW25113，BL21(DE3)和BL21(DE3)/pAW31在96-孔深孔培养板上在1mL LB培养基中37℃下生长至饱和。向各培养物中加入纯净的DMB-S-MMP(5μL)至终浓度为20mM。摇动10小时(20℃，300rpm)后，各培养物用等体积的乙酸乙酯(EA)/1％乙酸(AcOH)提取。干燥有机相，重溶于20μL乙腈(CH3CN)中，取1μL点样到TLC板(硅胶60F254)上。TLC板用含20％EA的己烷走样并用碘显色。
化合物的分析还使用分析型C18柱(Alltech Apollo 5u，150mm X 4.6mm)以HPLC进行；线性梯度：在5分钟内从含60％CH3CN的水溶液(0.1％三氟乙酸[TFA])到含95％CH3CN的水溶液(0.1％TFA)，含95％CH3CN的水溶液(0.1％TFA)10分钟，流速为1mL/分钟。HPLC滞留时间(tR)如下：MJ内酯形式：3.40分钟；DMB-S-MPA：3.82分钟；DMB-S-MMP：6.80分钟；辛伐他汀内酯形式：8.45分钟。HPLC分析前MJ和辛伐他汀酸都被内酯化。
BIOH的纯化和酶试验
使用引物5’-AACATATGAATAACATCTGGTGGCA-3’(SEQ ID NO：5)和5’-AAGAATTCTACACCCTCTGCTTCAACG-3’(SEQ ID NO：6)通过含侧翼限制性位点NdeI和EcoRI的PCR从大肠杆菌基因组DNA扩增bioH基因。消化基因盒并连接进pET28a以产生表达构建体pXK8。用pXK8转化的大肠杆菌BL21(DE3)菌株在LB培养基中37℃下生长至OD600为0.5，此时向培养基中加入0.1mM IPTG并在20℃下表达16小时。细胞重悬于缓冲液A(50mM Tris-HCl，pH8.0，2mM DTT，2mM EDTA)中并用超声裂解。BioH的纯化借助于N-末端6xHis标记和Ni-NTA树脂(Qiagen)。几乎纯的(＞95％)BioH在含250mM咪唑的缓冲液A中洗脱，该缓冲液更换成缓冲液A，浓缩，分成等分试样并迅速冷冻。
水解试验在室温下在50mM HEPES，pH7.9中进行。加入硫酯底物DMB-S-MMP至终浓度在0.1mM和1.0mM之间。为了帮助溶解DMB-S-MMP，对于所有样品加入DMSO至终浓度为10％。加入BioH(0.01μM)开始反应且通过加入等体积的EA/1％AcOH在所需时间点(10，20，30分钟)结束反应。分离有机相，干燥并再溶于20μL的ACN中，以HPLC分析。通过整合234nm处的峰值，定量DMB-S-MMP向DMB-S-MPA的转化。BioH对三种二甲基丁酰硫酯的催化效率的比较在1mM底物浓度和10nM BioH浓度下进行。
P1转导
按标准方法(参见例如，Miller，J.H.(1992)细菌遗传学短期教程：大肠杆菌和相关细菌的实验室手册。Cold Spring Harbor，NY：Cold Spring HarborPress)，P1转导用于构建BL21(DE3)的ΔbioH缺失突变体。由于大肠杆菌K菌株(BW25113)和B菌株(BL21)之间存在不同的限制性系统，将B菌株WA837(rB-，mB+)用作转导的中间宿主。首先将ΔbioH::FRT-kan-FRT标记从JW3375转导至WA837以产生YT0(WA837ΔbioH::FRT-kan-FRT)。使用BL21(DE3)作受体和YT0作供体，构建菌株YT1(BL21ΔbioH::FRT-kan-FRTλ(DE3))。YT1菌株用含温度敏感性复制子和热诱导型FLP基因的辅助质粒pCP20转化(参见，例如，Datsenko等，(2000)Proc Natl Acad Sci U S A 97：6640-6645；和Wanner，2000)。按公开的方法(参见例如，Datsenko等，(2000)Proc Natl Acad Sci U S A 97：6640-6645；和Wanner，2000)去掉kan标记产生YT2((BL21 ΔbioH::FRTλ(DE3))。
使用PCR证实YT2的遗传改变。设计了三个引物。引物B1：
5’-TGACGGCTTCGCTATCCCAT-3’(SEQ ID NO：7)；B2：
5’-TACACCCTCTGCTTCAACG-3’(SEQ ID NO：8)；和B3：
5’-GCTGGATTGTTTCGCCGATC-3’(SEQ ID NO：9)分别退火到上游基因yhgA，保留完整的bioH3’端，和下游基因gntX上。使用YT2基因组DNA作模板的PCR反应中预期的产物是：B1/B2：602bp；B1/B3：1002bp。使用BL21(DE3)基因组DNA作模板的PCR反应中预期的产物是：B1/B2：1271bp；B1/B3：1771bp。观察各菌株预期的PCR产物。
全细胞的生物催化
从MJ酸和DMB-S-MMP完全细胞催化合成辛伐他汀酸按所述进行(参见，例如，Xie等，(2007)Appl Environ Microbiol 73：2054-2060)。平行培养大肠杆菌BL21(DE3)/pAW31和YT2/pAW31菌株用于比较。单个克隆的新转化菌株用于接种添加了35mg/L卡那霉素的5mL LB培养基并在37℃下生长过夜。第二天早晨，将100μL的过夜培养物接种进含LB培养基，F1基础培养基和添加0.15mg/L生物素的F1培养基的50mL培养液中。通过定期测量OD600读数监测生长率。当OD600达到～0.5时，向培养物中加入100μM IPTG且在20℃下进行LovD的表达16小时。为了模拟高密度发酵条件，在加入底物前将细胞浓缩10倍。一般来说，将该培养物的14mL等分试样转移到15mL离心管中并离心收集细胞(4℃，4000g，10分钟)。将细胞沉淀轻轻重悬于1316μl上清中，随后加入84μl MJ酸贮液(250mM的水溶液)(终浓度为15mM)。然后将浓缩培养物分成7个200μL样品并向各样品中加入1.2μL纯DMB-S-MMP(终浓度为～25mM)。然后培养物在室温下以300rpm摇动。在各时间点，通过加入10μL 20％SDS裂解细胞，接着用500μL EA/1％AcOH经液-液提取进行总提取。去掉有机相，蒸发，并再溶于50μL ACN中用于HPLC分析。对于BL21(DE3)样品，在12小时后再加入1.2μL等分试样的DMB-S-MMP以补充水解的底物。
BIOH鉴定为DMB-S-MMP酯酶
我们首先打算鉴定负责发酵期间观察到的将DMB-S-MMP水解成DMB-S-MPA的大肠杆菌酶。当诸如二甲基丁酰-S-乙基巯基丙酸酯(DMB-S-EMP)和二甲基丁酰-S-甲基巯基乙酸酯(DMB-S-MTG)的不同酰基载体用作硫酯底物时，我们在发酵培养基中观察到相应的水解羧酸。这表明负责的酶是酯酶或水解酶，它对酯官能团具有松散的底物特异性。
我们利用大肠杆菌K-12阅读框内单基因敲除突变体文库(Keio集合物)使用高通量法鉴定了负责的酶(参见例如，Baba等，(2006)Mol Syst Biol 2：2006 0008)。我们有理由认为不能水解DMB-S-MMP的任一突变菌株都是直接由于特定的基因缺失。检查大肠杆菌基因组图谱(参见，例如，Blattner等，(1997)Science 277：1453-1474)揭示了23个酯酶/酯酶样酶，94个水解酶/水解酶样酶，和16个酰基转移酶(133个总候选基因)。在第一轮试验中没有检查证实有活性和底物不可能涉及DMB-S-MMP水解的酶。检查的57个BW25113突变体菌株的目录在表2中显示。
突变体，野生型BW21113和BL21(DE3)在96-孔培养板的LB培养基中生长至饱和。我们向各培养物(1mL)中加入5μL纯的DMB-S-MMP并在室温下剧烈摇动培养板又10个小时。酸化培养物，用乙酸乙酯提取，通过薄层层析(TLC)使用能够分离DMB-S-MMP和DMB-S-MPA的流动相(含20％乙酸乙酯的己烷)分析有机相(图14A)。野生型BW25113(泳道58)和BL21(DE3)(泳道59)分别显示了可比水平的底物水解和DMB-S-MPA积聚。除了ΔbioH(泳道56，菌株JW3357)外，检查的所有突变体显示出对DMB-S-MMP的水解活性。这一惊人发现表明涉及生物素(维生素H)生物合成的BioH(参见例如，O′Regan等，(1989)Nucleic Acids Res 17：8004)可能是负责观察到的体内水解的唯一酶。使用HPLC的另外检查进一步证实了在ΔbioH突变体的有机提取物中不能检测到DMB-S-MPA，而在bioH+菌株中几乎30％水解(图14B)。
体外证实BIOH的特性
为了证实BioH直接涉及发酵期间水解DMB-S-MMP，我们克隆了bioH基因并作为BL21(DE3)中N-his-标记的蛋白质表达它(参见例如，Tomczyk等，(2002)FEBS Lett 513：299-304)。使用Ni-NTA亲和色谱法将该蛋白质纯化至同质得到9mg/L的最终产量。测定BioH对DMB-S-MMP的催化特性且通过HPLC(234nm)测量水解程度。BioH对DMB-S-MMP表现出Michaelis-Menten动力学且测定kcat和Km值分别为260±45秒-1和229±26μM(图15A)。
使用HPLC测定法也检查了BioH对其它二甲基丁酰硫酯的活性且在图15B中显示。在相同反应条件下(1mM底物，10nM BioH)，我们观察到BioH显示出对DMB-S-MMP的有效酯酶活性最大。将羧酸骨架长度减少1个碳导致水解率降低2.5倍(DMB-S-MTG)，而将酯部分的大小增加成乙基酯(ethyl ester)明显减小底物水解率(DMB-S-EMP)。这些观察结果与体内结果一致，其中在存在细胞时两种底物都水解，虽然程度比DMB-S-MMP更低。
BioH是大肠杆菌中生物素生物合成所必需的酶(参见例如，Lemoine等，(1996)Mol Microbiol 19：645-647)。已有建议BioH负责合成庚二酰基-CoA(参见例如，Guillen-Navarro等，(2005)FEMS Microbiol Lett 246：159-165)，但其确切的生化功能尚未证实。令人感兴趣的是，大肠杆菌BioH的晶体结构已测定至1.7
Figure G2007800274550D00391
的分辨率以致力于从结构特征预测蛋白质的功能(参见例如，Sanishviii等，(2003)J Biol Chem 278：26039-26045)。高通量结构分析法揭示了BioH中的催化三联体(catalytic triad)，它也见于已知的水解酶中，这暗示BioH可具有水解活性。使用对硝基酚酯的试验表明BioH显示出对短链脂肪酸酯有偏好的羧酸酯酶活性(参见例如，Sanishviii等，(2003)J Biol Chem 278：26039-26045)。我们进行的体内和体外的研究都进一步解释了BioH的生化特性且显示了该酶对酯基团具有极广阔的底物特异性。相反，BioH对本工作中分析的底物中存在的硫酯键没有显示出硫酯酶活性。没有观察到水解的硫酯酸的进一步降解。
BL21(DE3)ΔBIOH突变体YT2的构建
鉴定和证实BioH是发酵期间负责水解DMB-S-MMP的酶后，显然可将BioH缺陷型大肠杆菌用作辛伐他汀酸完全细胞生物合成的宿主。我们构建了不需要T7聚合酶的LovD的各种表达载体并将它们转化进JW3357。评估这些菌株中辛伐他汀酸的生物转化率表明LovD的活性明显低于BL21(DE3)/pAW31。反应速度减慢主要归因于在这些宿主/载体组合中通过SDS-PAGE测定的LovD表达水平降低。因此，我们推断BL21(DE3)的ΔbioH衍生物是实现最大转化率，同时消除底物水解所必需的。
每个Keio集合物的单基因敲除突变体都含有代替靶基因的卡那霉素抗性基因(参见例如，Baba等，(2006)Mol Syst Biol 2：2006 0008)。该标记的侧翼为有助于容易地通过FLP酶去掉该标记的FRT位点。我们使用P1转导从JW3357取出ΔbioH::FRT-kan-FRT标记移植进BL21(DE3)。由于供体K菌株和受体B菌株之间的限制性差异，我们使用大肠杆菌WA837(限制性-减型，改良性-加型)作为P1转导的中间宿主(参见例如，Dien等，(2001)J IndMicrobiol Biotechnol 27：259-264)。将该标记移植进BL21(DE3)后产生YT1，含有温度敏感性复制子和热诱导型FLP基因的辅助质粒pCP20(参见例如，Datsenko等，(2000)Proc Natl Acad Sci U S A 97：6640-6645；和Wanner，2000)用于去掉kan基因以产生YT2(BL21(DE3)ΔbioH::FRT)。使用与上游和下游区退火的引物进行的PCR分析证实删除了bioH，以及去掉了kan标记(数据未显示)。
随后在LB培养基中培养YT2且进行了DMB-S-MMP水解试验。正如预期，检测不到新菌株催化的硫酯水解且在培养液中没有发现DMB-S-MPA的痕迹。从生长＞24小时的饱和培养物可几乎全额回收DMB-S-MMP，再次确认使用该菌株通过延长发酵该底物可保持完整。
使用YT2进行全细胞生物催化
我们首先检查了作为辛伐他汀酸全细胞生物催化合成的宿主的YT2的活力。将表达质粒pAW31通过电穿孔转化进YT2以产生YT2/pAW31。BL21(DE3)/pAW31和YT2/pAW31分别生长至OD600为0.5，接着用100μMIPTG在20℃下诱导蛋白质合成达16小时。当使用LB培养基时两种菌株表现出相同的生长动力学，在蛋白表达期结束时达到相同的OD600(3.9～4.0)。当使用F1基础培养基时，两种菌株在诱导前生长情况相当(图16A)。相反，诱导后在没有添加生物素的培养基中YT2/pAW31比BL21(DE3)/pAW31生长慢得多。突变菌株诱导后的细胞密度是亲本菌株的～60％。我们将生长率延迟归因于YT2/pAW31缺乏合成生物素并在基础培养基中支持旺盛细胞生长的能力。当YT2/pAW31菌株在添加0.15mg/L生物素的F1培养基中生长时，突变菌株的生长动力学与BL21(DE3)/pAW31无区别。
随后，我们比较了YT2/pAW31与BL21(DE3)/pAW31在完全细胞试验中的效率。两种菌株都在LB培养基中生长并浓缩10倍以模拟LovD表达12小时后的高细胞密度环境。加入MJ酸和DMB-S-MMP至终浓度分别为15mM和25mM以开始生物转化。图16B显示了YT2/pAW31由于bioH缺失在该试验中明显效率更高。该突变体菌株在培养不超过12小时内观察到完全转化(＞99％)，没有DMB-S-MMP水解的迹象。相反，BL21(DE3)/pAW31在24小时内实现相同的转化，同时由于底物水解在发酵期间需要再次加入25mM的DMB-S-MMP。在线性范围的反应期间，YT2/pAW31以1.5mM/小时的速率合成辛伐他汀酸，比BL21(DE3)/pAW31测量的0.75mM/小时明显更高(参见例如，Xie等，(2007)Appl Environ Microbiol 73：2054-2060)。使用YT2/pAW31时，我们也能够减少驱动反应完成所需的DMB-S-MMP的最小浓度。当起始DMB-S-MMP(18mM)与MJ酸(15mM)的摩尔比低到1.2时可实现以相同的速率完全转化为辛伐他汀酸。
速率增大主要由于不存在BioH增加了DMB-S-MMP的细胞内浓度。从体外研究，我们显示了BioH非常迅速地水解DMB-S-MMP。因此，即时在BioH的细胞内浓度低时，底物水解反应仍可竞争细胞质中存在的总底物。维持DMB-S-MMP的细胞内浓度升高是关键的，特别是考虑到LovD催化的可逆反应中在没有酰基硫酯供体时辛伐他汀酸可水解为MJ酸(参见例如，Xie等，(2006)Chem Biol 13：1161-1169)。
通过逐步建立YT2/pAW31的扩大发酵(200mL，15mM MJ，18mMDMB-S-MMP)证实生物转化后辛伐他汀酸的纯化也有提高。通过HPLC证实MJ酸完全转化为辛伐他汀酸后(图17，痕迹a)，用己烷洗涤混合的发酵液和细胞提取物，用6M HCl酸化并过滤收集沉淀的辛伐他汀酸(痕迹b)。用1倍体积的dH2O洗涤滤饼后，将辛伐他汀酸溶于ACN中，过滤并通过HPLC分析(痕迹c)。不需要另外的洗涤步骤去掉在BL21(DE3)/pAW31中存在的DMB-S-MPA。使用该方法辛伐他汀酸的最终回收率为94％。
结论
如上所述，我们使用Keio单基因敲除文库鉴定了BioH是在从MJ酸全细胞生物催化转化为辛伐他汀酸期间水解DMB-S-MMP的羧酸酯酶。BioH表现出非常迅速的水解速率，它消耗了在LovD-催化的酯基转移中作为酰基供体可利用的DMB-S-MMP的细胞内浓度。使用bioH表达菌株YT2，我们能够完全消除DMB-S-MMP的降解并明显增加全细胞生物催化的效力。在所用的一或多种底物含有一个易变酯键的其它前体定向生物合成和生物催化应用中该菌株可以是有用的宿主(参见例如，Murli等，(2005)ApplEnviron Microbiol 71：4503-4509)。
实施例4：使用全细胞生物催化有效合成辛伐他汀
本实施例描述了一步法，即从莫那可林J合成辛伐他汀的全细胞生物催化方法。正如下文的详细描述，使用过表达土曲霉LovD的大肠杆菌菌株，我们能够实现＞99％的莫那可林J向辛伐他汀的转化而不需使用任何化学保护步骤。一个关键的发现是膜通透性底物α-二甲基丁酰-S-甲基巯基丙酸酯(DMB-S-MMP)，它作为酰基供体可被LovD有效利用。扩大使用该方法用于以克规模合成辛伐他汀。我们还证实了通过该方法合成的辛伐他汀可容易地从发酵液中纯化，以HPLC测定回收率大于90％且纯度大于98％。还检查了使用高细胞密度，补料分批发酵的生物转化。因此，该全细胞生物催化法可以是目前的多步半合成转化法的一个有吸引力的替代方法。
目前，两种半合成方法(参见，例如，Askin等，1991，J.Org.Chem.56；和Hoffman等，1986 J Med Chem 29：849-52)被广泛用于从洛伐他汀开始合成辛伐他汀(图18)。一个通常合适的方法(参见例如，Hoffman等，1986 J MedChem 29：849-52)以洛伐他汀的水解产生关键的中间体莫那可林J开始，接着将酸内酯化以保护C11羟基，并三甲硅烷基化保护C13羟基。然后用α-二甲基丁酰氯对保护的莫那可林J进行酰基化以产生辛伐他汀的保护形式，随后其去保护以产生辛伐他汀。图18中所示的两个多步法都是费力的，因此导致辛伐他汀比洛伐他汀几乎贵5倍。因此可减少化学转化的次数并增加转化的总体效率的新的半合成方案具有明显的实用性。
我们以前描述了从洛伐他汀生物合成基因簇克隆和鉴定所赋予的酰基转移酶，该酶将α-甲基丁酰基团从洛伐他汀二酮合成酶(LDKS)区域选择性转移给莫那可林J的C8羟基以产生洛伐他汀(参见，例如，Xie等，2006，ChemBiol 13：1161-1169)。我们证实了LovD对酰基载体，酰基和十氢化萘核心具有宽广的底物特异性。最显著的是，LovD能够催化以α-二甲基丁酰-S-N-乙酰基半胱胺(DMB-S-NAC)直接酰基化莫那可林J来提供辛伐他汀。该反应仅对C8醇具有高度区域特异性，因此是不用保护化学法从莫那可林J生产辛伐他汀的有效一步法。
在本实施例中，我们描述了建立能够以高效率方式将莫那可林J转化成辛伐他汀的全细胞生物催化方法。使用新硫酯作为酰基供体，我们能够在一步法中实现＞99％的莫那可林J转化为辛伐他汀。该发酵方法可容易地扩大化以生产工业规模产量的辛伐他汀。
合成α-二甲基丁酰-S-甲基3-巯基丙酸酯(DMB-S-MMP)：
将二甲基丁酰氯(1.76mL，12mmol)缓慢加入0℃的50mL含甲基-3-巯基丙酸酯(1.30mL，12mmol)和三乙胺(3.340mL，24mmol)的二乙醚溶液中且将该溶液搅拌2小时。反应用含水NH4Cl终止并用100mL乙酸乙酯提取两次。合并有机层，干燥，并蒸发产生无色液体(2.6g)。用硅胶层析(EA/己烷，20/80)纯化残留物以产生纯DMB-S-MMP(2.35g，90％产率)。1H NMR：δ3.87(s，3H)，3.09(t，2H，7.1Hz)，2.58(t，2H，7.0Hz)，1.59(q，2H，7.5Hz)，1.18(s，6H)，0.83(t，3H，7.4Hz)；13C NMR：δ206.16，172.26，51.81，50.04，34.38，33.73，24.71，23.60，8.92。
LOVD测定的动力学试验：
LovD的表达和纯化以前已有详细描述(参见，例如，Xie等，2006，ChemBiol 13：1161-1169)。该试验在室温下在50mM HEPES，pH7.9中进行。用10μM LovD，1mM莫那可林J和4mM硫酯测定酰基底物的起始速度(ki)。反应混合物在不同时间点用三氟乙酸(TFA)终止，用乙酸乙酯提取，蒸发至干燥并重溶于乙腈。通过HPLC分析测定莫那可林J转化为辛伐他汀的百分率(C18)。线性范围的转化率在表1B中以ki表示。为了测定DMB-S-MMP的Km，莫那可林J的浓度固定在2mM，而DMB-S-MMP的浓度从0.2mM变为10mM。加入DMSO至终浓度为5％以利于DMB-S-MMP的溶解。为了获得莫那可林J的Km，DMB-S-MMP浓度固定为2mM，而莫那可林J的浓度从0.2mM变为5mM。
全细胞裂解物的活性测定
全细胞裂解物试验用于测定在不同发酵条件下LovD的活性水平。例如，用pAW31转化的大肠杆菌BL21(DE3)菌株在LB培养基中37℃下生长至OD600为0.5，此时向培养物中加入100μM IPTG并在室温(RT)下进行表达16小时。然后通过离心(4000g，20分钟)收获70ml等分试样的培养物。去掉上清，将细胞沉淀重悬于7ml裂解缓冲液(20mM Tris-HCl，pH7.9，500mM NaCl)中。通过在冰上超声处理裂解细胞并通过离心(13,000rpm，10分钟，4℃)去掉细胞碎片。然后将裂解物直接加入到体外试验中。最终测定条件：50mM HEPES，pH7.9，1mM莫那可林J，4mM DMB-S-MMP，5μl细胞裂解物，25μl最终体积。然后使用0.6分-1作为转化率从起始速率计算发酵液中LovD的有效浓度。
低密度发酵
大肠杆菌BL21(DE3)/pAW31菌株在LB培养基中37℃下生长至OD600为0.5，此时向该培养物中加入100μM IPTG且在RT下进行表达16小时。将10ml培养物转移到15mL离心管中。离心(4000g，10分钟)收集细胞。将细胞沉淀重悬于957μl上清中。用1.0N NaOH将pH调节到pH7.9，接着加入33μl 450mM MJ(终浓度15mM)和6μl纯DMB-S-MMP(终浓度～25mM)。然后在室温下以300rpm摇动培养物。在各时间点，从反应混合物中取出4μL等分试样，用300μL含1％TFA的乙酸乙酯终止反应。去掉有机相，蒸发，并重溶于乙腈中用于HPLC分析。
为了更大规模合成辛伐他汀，将上述方法扩大化，从大肠杆菌BL21(DE3)/pAW31菌株的2x1L摇瓶培养物开始。室温下表达16小时后，将培养物体积浓缩到200mL至最终OD600为22。加入莫那可林J(钠盐形式)和DMB-S-MMP至终浓度分别为15mM和25mM。细胞在室温下摇动且使用HPLC监测反应进程。为了在反应完成(以HPLC判定＞99％转化)后从发酵物纯化辛伐他汀，使用下面的方法。离心取出细胞。通过在丙酮中搅拌细胞沉淀提取细胞内辛伐他汀。然后减压去掉丙酮并将残留物溶于dH2O并过滤。合并滤液和澄清的发酵液，用等体积的正己烷洗涤两次，并用6N HCl酸化至pH2.0。过滤回收白色沉淀并用冰冷的dH2O充分洗涤以去掉同时沉淀的DMB-S-MPA。真空干燥滤饼，将固体在200mL乙腈中搅拌1小时，接着过滤去掉不溶物。减压蒸发滤液至干燥以产生酸性形式的辛伐他汀。
高密度F1补料分批发酵
根据Pfeifer等(参见例如，Pfeifer等，2002，Appl Environ Microbiol68：3287-92)采用F1补料分批发酵和培养基组合物。我们去掉了发酵培养基和补料培养基中的维生素溶液。起始培养物在5ml LB培养基(含35mg/L卡那霉素)中37℃和250rpm下生长过夜并使用1mL接种装有F1培养基(含35mg/L卡那霉素)的100ml摇瓶。使用10mL种子F1培养物接种含1L F1培养基的2-升Applikon Biobundle容器。发酵在37℃下进行且在整个实验中用1M H2SO4和半浓NH4OH将pH维持在7.1。通气控制在0.2至0.4L/分钟且搅拌维持在900rpm。当OD600读数达到5和10之间时，将发酵温度降低到室温，接着加入200μM IPTG诱导蛋白质表达。同时，蠕动泵以0.08mL/分钟将补料溶液传递给发酵罐。
按上述测定不同发酵时期的有效LovD活性和浓度。为了制备用于生物转化试验的静息细胞，将细胞以5000g离心10分钟，接着轻轻重悬于相同体积的pH7.4的PBS缓冲液中。然后向细胞等分试样中加入莫那可林J和DMB-S-MMP起动辛伐他汀的合成。
结果
鉴定动力学优良的酰基供体
我们以前显示了LovD可使用能穿透膜的硫酯作为转酯基反应中的酰基供体(参见例如，Xie等，2006，Chem Biol 13：1161-1169)。DMB-S-NAC和DMB-S-MTG(表1B)都显示为LovD的底物。然而，这两种底物都导致在辛伐他汀合成中产生低转化率，其表观ki值为每分钟约0.02。而且，当使用任一底物时，在增加莫那可林J的浓度时反应受到严重的底物抑制。因此，将LovD开发成工业上有用的催化剂用于化学生物合成辛伐他汀时首要的任务是鉴定可克服这两个局限性的更好底物。
我们合成了DMB-S-MTG的几个其它变体并测定其体外催化特性。通过将α-二甲基丁酰氯与相应的游离硫醇反应分别合成DMB-S-甲基巯基丙酸酯(DMB-S-MMP)，DMB-S-乙基巯基丙酸酯(DMB-S-ethylmercaptopropionate，DMB-S-EMP)和DMB-S-甲基巯基丁酸酯(DMB-S-MMB)。起始转化率在表1B中比较。令人惊奇的是，硫酯载体的长度增加一个碳(从S-MTG中的C2到S-MMP和S-EMP中的C3)明显增加该反应的转化率。在S-MMB中插入另一个碳(C4)导致酯基转移率进一步增加。在标准反应条件(1mM MJ，4mM酰基底物，10μM LovD，50mMHEPES，pH7.9)下，DMB-S-MMP，DMB-S-EMP和DMB-S-MMB酯化的起始转化率分别为0.6，0.7，0.78分钟-1。转化率增加＞30倍反映了羰基基团与硫酯键的相对位置对于LovD的结合是关键的。相反，当DMB-S-MPA用作酰基供体时，起始转化率明显减小到每分钟0.08，表明游离酸(可能是其钠盐)与LovD活性位点的结合差。
我们选择DMB-S-MMP作为生物催化最合适的的酰基硫酯，因为该前体硫醇(甲基巯基丙酸酯)比其它起始原料明显更便宜。测定了当DMB-S-MMP用作酰基供体时酰基化反应的动力学参数且在图19中显示。为了获得转酰基反应中任一底物的Km值，我们固定一个底物的浓度，同时改变另一底物的浓度以获得Michaelis-Menten动力学曲线。图19A显示了反应转化率(V/Eo)作为莫那可林J浓度的函数。与以前试验的底物相反，没有观察到莫那可林J的底物抑制且Km测定为0.78±0.12mM。通过将莫那可林J浓度固定在2mM同样测定了在不同量DMB-S-MMP下LovD的转化率(图19B)。DMB-S-MMP的Km显示为0.67±0.04mM。在两次滴定中该反应的kcat测定为0.66±0.03分钟-1。我们的动力学分析明确地证实了与以前报道的硫酯相比DMB-S-MMP是动力学优秀的底物。在Ping Pong Bi Bi反应中的底物抑制水平取决于两种底物的相对Km。当DMB-S-MMP用作酰基底物时，其相对更低的Km使其容易结合LovD，因此增加莫那可林J的浓度不会受到抑制。因而该重要特性允许建立分批生物催化法，相反在补料分批法中必需持续供应莫那可林J以保持其低浓度且最小化底物抑制。
我们以前观察到当加入大肠杆菌发酵液反应时酰基-S-MTG迅速水解(参见例如，Xie等，2006，Chem Biol 13：1161-1169)。为了试验新鉴定的酰基供体在体内条件下的稳定性，将纯DMB-S-MMP加入用大肠杆菌BL21(DE3)细胞接种的LB培养基中，培养物在37℃下培养过夜(16小时)。我们观察到大约20％的底物主要降解为极性更大的化合物。使用HPLC与已知化合物进行比较，我们鉴定了主要降解产物是DMB-S-MPA，可能由内源性大肠杆菌脂肪酶的作用产生。我们推定当在批量反应中供应过量DMB-S-MMP时，低程度的水解不会限制莫那可林J生物转化为辛伐他汀。
全细胞生物催化
借助于明显更高效的DMB-S-MMP硫酯，我们研究了使用大肠杆菌作为全细胞生物催化剂将莫那可林J转化为辛伐他汀。用pET28a衍生的表达质粒pAW31转化的BL21(DE3)菌株用作微生物宿主。LovD的表达在室温下进行16小时且用SDS-PAGE观察表达水平。为了定量在不同生长条件和培养基的条件下表达的LovD的活性量，我们采用了将全细胞裂解物直接加入含1mM莫那可林J，4mM DMB-S-MMP的50mM HEPES，pH7.9的反应试验中的活性测定法。通过HPLC定量莫那可林J向辛伐他汀的转化且使用0.6分-1的ki值评估LovD的表观浓度(表1B)。在低细胞密度条件下，从LB培养基中表达的LovD比F1基础培养基几乎高3倍(表3)。
然后，我们试验了在LB培养基中辛伐他汀的化学生物合成。LovD表达过夜后，将10mL细胞等分试样浓缩10倍至1mL的LB。进行浓缩步骤是为了实现模拟发酵条件的高细胞密度环境并获得更高有效浓度的LovD(最终浓度大约为20μM)。加入莫那可林J的钠盐形式至终浓度为15mM(来自于450mM水溶液的贮液)并加入纯DMB-S-MMP至终浓度为25mM。随后室温下剧烈摇动反应混合物。取定期的时间点检查莫那可林J向辛伐他汀的转化(图20A)。
如图20B所示，BL21(DE3)/pAW31的单纯低密度培养物是辛伐他汀合成的有力全细胞生物催化剂。在开始加入两种底物时观察到起始延迟期为2小时，接着以每小时大约0.73mM的线性反应速度迅速转化。由于莫那可林J耗尽，在转化率更高(＞95％)时反应速度减慢。在24小时内，99％的莫那可林J转化为辛伐他汀。根据HPLC分析，没有观察到莫那可林J或辛伐他汀被细胞代谢所降解。我们观察到24小时后培养物的OD600读数减少大约20％，表明可维持全细胞加工以延长催化。
我们报道了LovD能够在体外以kcat为0.21分-1的反应将洛伐他汀水解成莫那可林J(参见例如，Xie等，2006，Chem Biol 13：1161-1169)。为了检查我们能否将水解步骤与酰基化步骤一起结合在单个发酵步骤中，我们用BL21(DE3)/pAW31测定了洛伐他汀的水解率。在与上述相同的体内条件下，我们观察到莫那可林J形成率缓慢。以0.5mM洛伐他汀(钠盐形式)开始，我们在48小时内实现91％水解，转化率为每小时大约0.01mM，比酰基化反应率慢几乎75倍。这与体外动力学结果明显相反，其中水解速率比酰基化反应仅慢3倍。体内洛伐他汀水解明显减弱可能是由于细胞膜对更疏水的洛伐他汀存在穿透障碍。我们通过使用另一菌株BL21(DE3)/pXXK2试图减小膜穿透性障碍，该菌株中LovD与定位于周质空间的N-末端pelB信号序列一起克隆。对于该菌株没有观察到水解活性提高，表明外质膜的不可穿透性是主要转运障碍。
辛伐他汀的回收和纯化
为了从全细胞生物催化法获得辛伐他汀的回收产量，我们将生物转化的规模增加到200mL的最终体积。这通过在表达LovD过夜后浓缩2x1L在LB培养基中的表达菌株来完成。加入莫那可林J的钠盐形式和DMB-S-MMP至终浓度分别为15mM和25mM且通过HPLC监测反应进程。在更大规模的处理中我们观察到相同的转化动力学，在加入底物后24小时获得大于99％的转化率。从化学生物合成途径获得的辛伐他汀可容易地从发酵培养基中纯化而不必使用色谱法步骤。使用离心步骤分离细胞和发酵液。通过在丙酮中搅拌细胞沉淀，接着蒸发，并重溶于dH2O中回收细胞内辛伐他汀。将含细胞内辛伐他汀的水溶液与发酵液混合并用正己烷洗涤以去掉DMB-S-MMP。然后该水溶液用6N HCl酸化至pH2.0，这导致游离酸形式的辛伐他汀和DMB-S-MPA沉淀。正如本领域所知，辛伐他汀的游离酸形式可转化为钠，钾，铵，或来自碱土元素的任何其它盐或其它金属盐。然后可使用例如，本领域已知的常规方法将这些盐转化成纯辛伐他汀。DMB-S-MPA污染可通过过滤和用过量dH2O洗涤滤饼去掉。酸化滤液含小于1％的回收的辛伐他汀总量。通过用乙腈洗涤滤饼，接着蒸发滤液可回收几乎纯的辛伐他汀(最终回收率：1.13g，90％；通过HPLC测定的最终纯度：98％)。
高细胞密度发酵
我们使用高细胞密度发酵罐研究了全细胞生物催化剂的活性。从使用TB作为培养基的分批发酵罐和从使用F1基础培养基的补料分批运行中测量的有效LovD浓度在表3中显示。使用从Pfeifer等报道的方法(参见例如，Pfeifer等，2002，Appl Environ Microbiol 68：3287-92)改良的补料分批法，我们能够获得具有极高细胞密度和LovD活性的培养物(图21A)。我们在接种后40小时能够达到大约1.5g/L的活性LovD表达，其OD600为75(图21A)。
由于起始原料的成本高，我们不能使用全发酵液进行生物转化。作为替代，我们在发酵运行期间在各时间点取样培养物的等分试样(图21A)。使用材料和方法部分所述的全细胞裂解物试验测定各时间点的LovD活性。然后我们使用1mL培养物直接进行生物转化并测量辛伐他汀的形成率(非静息细胞，图21B)。作为选择，在将细胞沉淀重悬于PBS，pH7.4中(静息细胞)后我们也测量了全细胞生物催化剂的特性。正如图21B所见，在各时间点，当细胞置于静息环境中时可获得高转化率。另外，培养物中LovD的总活性与转化率不是线性相关。例如，来自时间点3的静息细胞表现出几乎1g/L/小时的最高辛伐他汀转化率，尽管其与从时间点4获得的细胞相比具有较低的总LovD活性。这些细胞的异常活性能够在不超过8小时内完成将15mM莫那可林J转化成辛伐他汀。
在本实施例中的重要发现是鉴定了另一个在LovD酰基转移酶存在时将酰基基团贡献给莫那可林J的C8羟基基团的酰基硫酯，它在该酰基化反应中具有明显更高的效率。我们以前鉴定了DMB-S-NAC是LovD的底物(参见例如，Xie等，2006，Chem Biol 13：1161-1169)。然而，进行酰基化反应达不到理想转化率，且由于底物与LovD结合弱，第二底物莫那可林J成为DMB-S-NAC的竞争性抑制剂。后一特性特别有害，因为它迫使莫那可林J的浓度在生物转化期间需要维持最小值。DMB-S-MMP和DMB-S-MMB作为酰基供体都优于DMB-S-NAC。通过酰基载体的敏感结构改变DMB-S-MMP的kcat值大约高30倍，而此时Km值与莫那可林J相当，从而消除了莫那可林J的底物抑制。另外，S-MMP硫醇前体与S-NAC相比明显更便宜。考虑到酰基S-NAC硫酯普遍用于天然产物的前体定向生物合成(参见例如，Jacobsen等，1997，Science 277：367-9)，可发现本工作所述的硫酯酰基载体在其它工程生物合成应用中也有重要实用性。
我们尝试建立了将莫那可林J转化为辛伐他汀的体外生物催化法。我们阐明了粗纯化的LovD可用于克服与全细胞发酵相关的任何运输和纯化困难。LovD可通过单一30％硫酸铵沉淀步骤容易地从大部分其它细胞蛋白中分级分离。可通过将沉淀块重溶于50mM HEPES，pH7.9中恢复超过98％的从全细胞溶胞产物测量的LovD活性。然而，在室温试验条件下LovD在高蛋白浓度(～100μM)下容易沉淀(几小时)而在低浓度(～10μM)下沉淀缓慢(几天)。令人感兴趣的是，沉淀的LovD蛋白质在相同缓冲液中稀释时可再溶解并恢复几乎全部活性。
当中等量的莫那可林J(＞5mM)在分批体外方法中使用时，即使在延长培养后我们也没能达到大于60％的莫那可林J转化为辛伐他汀的平衡。这很可能是由于辛伐他汀被LovD水解回莫那可林J的竞争性反应。当辛伐他汀浓度达到毫摩尔范围时，水解反应的速度达到最大值(kcat＝0.3分-1)且因此明显阻止总的净酰基化率。
令人感兴趣的是，当他汀浓度在10至15mM之间(4g/L-6g/L)时在体内条件下逆反应不是限制性因素，其证据是在该研究中达到了高转化率(＞99％)的莫那可林J转化为辛伐他汀。我们阐明了在莫那可林J转化为辛伐他汀后，诸如AcrAB-TolC三重复合物的多药物输出器(multidrug exporters)能够将辛伐他汀从内膜或周质排入培养基中(参见例如，Murakami等，2006，Nature 443：173-9)。大肠杆菌外膜的不通透性可防止疏水的辛伐他汀再进入。极性更强的莫那可林J能够通过该膜不断扩散并用作LovD的底物。总之，大肠杆菌外膜及其流出泵有效减少了能被水解的辛伐他汀的细胞内浓度，从而削弱了不需要的逆反应率，并最大化所需反应的转化率。然而，当底物浓度增加到大于20mM时，通常由大肠杆菌表达的流出泵可能超负荷。在莫那可林J(和由此产生的辛伐他汀)和DMB-S-MMP浓度升高时，我们能够达到85～90％的最大转化率。检查培养物中辛伐他汀的分布揭示其大量(＞20％)位于细胞内，因此很可能导致产物水解的水平增加。辛伐他汀在内膜，细胞质或周质中是否分区还不知道。我们目前检查了通过过表达选定多药物流出泵增加辛伐他汀输出率的方法(参见例如，Masi等，2003，JChromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci 786：197-205)。
在本实施例中，我们建立了非常有效的全细胞生物催化法用于从莫那可林J合成辛伐他汀。使用大肠杆菌作宿主，实现了能以克规模合成的实验室规模的方法。另外，设计了简单的下游纯化程序以便于产物的回收和纯化。我们目前使用理性和定向的进化法来提高LovD的催化转化率。由于LovD特性的最优化，以及用于提高转化生产量的宿主代谢改造，该产生辛伐他汀的化学生物合成途径可成为图18所示的合成途径的有竞争力和吸引力的替代选择。
本发明不限于本文公开的实施方案的范围，所述实施方案试图作为本发明各个方面的单个例证，且功能上等价的任何实施方案都在本发明范围内。除了本文所述的那些外，对本发明的模型和方法的各种修改对本领域的技术人员而言根据前面的描述和教导将是显而易见的，且同样试图落在本发明的范围内。该修改或其它实施方案可以实施而不会偏离本发明的真实范围和精神。
表
表1A.酰基硫酯作为LovD的底物[a]
Figure G2007800274550D00521
[a]反应产物通过LC-MS证实。反应条件：10μM LovD，1mM莫那可林J，4mM酰基硫酯，50mM HEPES，pH7.9，25℃，10小时。[b]转化率使用HPLC(238nm)通过莫那可林J转化为相应洛伐他汀类似物的百分率来测量。[c]游离酸形式的产物的HPLC(C18反相)滞留时间。HPLC梯度与图5所述相同。
表1B：硫酯底物的初速度(initial velocities)比较
Figure G2007800274550D00522
Figure G2007800274550D00531
a反应条件：1mM MJ，4mM硫酯底物，10uM纯LovD，50mM HEPES，pH7.9；初速度定义为线性范围内的初始转化率。
表2.本工作中筛选的大肠杆菌BW25113突变体目录。编号相应于图14A所示的TLC泳道。BioH显示为负责DMB-S-MMP水解的单一酶。
Figure G2007800274550D00532
Figure G2007800274550D00541
表3：不同表达条件的蛋白质产量比较a
Figure G2007800274550D00542
a报道的产量代表在各自条件下的最高观察产量。
b蛋白质产量使用材料和方法部分所述的全细胞裂解物从体外测定法评估。观察到的转化用于使用0.6分-1的转化率评估LovD的浓度。
表4：多肽序列信息
土曲霉LOVD转酯酶。登录号AAD34555
Kennedy等，Science.1999May 21；284(5418)：1368-72
MGSIIDAAAAADPVVLMETAFRKAVKSRQIPGAVIMARDCSGNLNYTRCFGARTVRRDECNQLPPLQVDTPCRLASATKLLTTIMALQCMERGLVDLDETVDRLLPDLSAMPVLEGFDDAGNARLRERRGKITLRHLLTHTSGLSYVFLHPLLREYMAQGHLQSAEKFGIQSRLAPPAVNDPGAEWIYGANLDWAGKLVERATGLDLEQYLQENICAPLGITDMTFKLQQRPDMLARRADQTHRNSADGRLRYDDSVYFRADGEECFGGQGVFSGPGSYMKVLHSLLKRDGLLLQPQTVDLMFQPALEPRLEEQMNQHMDASPHINYGGPMPMVLRRSFGLGGIIALEDLDGENWRRKGSLTFGGGPNIVWQIDPKAGLCTLAFFQLEPWNDPVCRDLTRTFEHAIYAQYQQG
(SEQ ID NO：1).
桔青霉MlcH转酯酶。登录号BAC20561
Abe等，Mol.Genet.Genomics 267(5)，636-646(2002)
MAPSIDVIPTAASTAAGMISDMEAAFKSAVKLKQIPGAVVMARSMNGDIDYTRCFGARTVERDECQRLPPMEIDTPLRLASATKLLTTIMALQCMEQGLVDLDENVNRLLPDLSDMQVLTGFDAAGNAIMRDREGIIKLRHLLTHTSGLSYAFLHPLLQEYMAKGYLKTAEKFGIQSRLAPPAINDPGVEWIYGANLDWAGKLIERATGVDLEEFMQKNICEPLGITDMTFKLQQRPDMLARRSDQTRRNENGSLRYDDSVYFRHDGEECFGGQGVFCGPESYMKVLNSLMKHDGLLLKKDTIELMFQPALDAELEKKMNDHMDTTPHINYGAALPPVMRRNFGLGGIIAMGDLDGHNWRREGSLTFGGGPNIVWQIDPTVGLCTLVVFQLEPWNDPICKDLTRKFEKAMYSQVKCRN
(SEQ ID NO：2).
土曲霉LOVF聚酮合成酶。AAD34559
Kennedy等，Science.1999 May 21；284(5418)：1368-72
MTPLDAPGAPAPIAMVGMGCRFGGGATDPQKLWKLLEEGGSAWSKIPPSRFNVGGVYHPNGQRVGSMHVRGGHFLDEDPALFDASFFNMSTEVASCMDPQYRLILEVVYEALEAAGIPLEQVSGSKTGVFAGTMYHDYQGSFQRQPEALPRYFITGNAGTMLANRVSHFYDLRGPSVSIDTACSTTLTALHLAIQSLRAGESDMAIVAGANLLLNPDVFTTMSNLGFLSSDGISYSFDSRADGYGRGEGVAAIVLKTLPDAVRDGDPIRLIVRETAINQDGRTPAISTPSGEAQECLIQDCYQKAQLDPKQTSYVEAHGTGTRAGDPLELAVISAAFPGQQIQVGSVKANIGHTEAVSGLASLIKVALAVEKGVIPPNARFLQPSKKLLKDTHIQIPLCSQSWIPTDGVRRASINNFGFGGANAHAIVEQYGPFAETSICPPNGYSGNYDGNLGTDQAHIYVLSAKDENSCMRMVSRLCDYATHARPADDLQLLANIAYTLGSRRSNFRWKAVCTAHSLTGLAQNLAGEGMRPSKSADQVRLGWVFTGQGAQWFAMGRELIEMYPVFKEALLECDGYIKEMGSTWSIIEELSRPETESRVDQAEFSLPLSTALQIALVRLLWSWNIQPVAVTSHSSGEAAAAYAIGALTARSAIGISYIRGALTARDRLASVHKGGMLAVGLSRSEVGIYIRQVPLQSEECLVVGCVNSPSSVTVSGDLSAIAKLEELLHADRIFARRLKVTQAFHSSHMNSMTDAFRAGLTELFGADPSDAANASKDVIYASPRTGARLHDMNRLRDPIHWVECMLHPVEFESAFRRMCLDENDHMPKVDRVIEIGPHGALGGPIKQIMQLPELATCDIPYLSCLSRGKSSLSTLRLLASELIRAGFPVDLNAINFPRGCEAARVQVLSDLPPYPWNHETRYWKEPRISQSARQRKGPVHDLIGLQEPLNLPLARSWHNVLRVSDLPWLRDHVVGSHIVFPGAGFVCMAVMGISTLCSSDHESDDISYILRDVNFAQALILPADGEEGIDLRLTICAPDQSLGSQDWQRFLVHSITADKNDWTEHCTGLVRAEMDQPPSSLSNQQRIDPRPWSRKTAPQELWDSLHRVGIRHGPFFRNITCIESDGRGSWCTFAIADTASAMPHAYESQHIVHPTTLDSAVQAAYTTLPFAGSRIKSAMVPARVGCMKISSRLADLEARDMLRAQAKMHSQSPSALVTDVAVFDEADPVGGPVMELEGLVFQSLGASLGTSDRDSTDPGNTCSSWHWAPDISLVNPGWLEKTLGTGIQEHEISLILELRRCSVHFIQEAMESLSVGDVERLSGHLAKFYAWMQKQLACAQNGELGPESSSWTRDSEQARCSLRSRVVAGSTNGEMICRLGSVLPAILRREVDPLEVMMDGHLLSRYYVDALKWSRSNAQASELVRLCCHKNPRARILEIGGGTGGCTQLVVDSLGPNPPVGRYDFTDVSAGFFEAARKRFAGWQNVMDFRKLDIEDDPEAQGFVCGSYDVVLACQVLHATSNMQRTLTNVRKLLKPGGKLILVETTRDELDLFFTFGLLPGWWLSEEPERQSTPSLSPTMWRSMLHTTGFNGVEVEARDCDSHEFYMISTMMSTAVQATPMSCSVKLPEVLLVYVDSSTPMSWISDLQGEIRGRNCSVTSLQALRQVPPTEGQICVFLGEVEHSMLGSVTNDDFTLLTSMLQLAGGTLWVTQGATMKSDDPLKALHLGLLRTMRNESHGKRFVSLDLDPSRNPWTGDSRDAIVSVLDLISMSDEKEFDYAERDGVIHVPRAFSDSINGGEEDGYALEPFQDSQHLLRLDIQTPGLLDSLHFTKRNVDTYEPDKLPDDWVEIEPRAFGLNFRDIMVAMGQLESNVMGFECAGVVTSLSETARTIAPGLAVGDRVCALMNGHWASRVTTSRTNVVRIPETLSFPHAASIPLAFTTAYISLYTVARILPGETVLIHAGAGGVGQAAIILAQLTGAEVFTTAGSETKRNLLIDKFHLDPDHVFSSRDSSFVDGIKTRTRGKGVDVVLNSLAGPLLQKSFDCLARFGRFVEIGKKDLEQNSRLDMSTFVRNVSFSSVDILYWQQAKPAEIFQAMSEVILLWERTAIGLIHPISEYPMSALEKAFRTMQSGQHVGKIVVTVAPDDAVLVRQERMPLFLKPNVSYLVAGGLGGIGRRICEWLVDRGARYLIILSRTARVDPVVTSLQERGCTVSVQACDVADESQLEAALQQCRAEEMPPIRGVIQGAMVLKDALVSQMTADGFHAALRPKVQGSWNLHRIASDVDFFVMLSSLVGVMGGAGQANYAAAGAFQDALAEHRMAHNQPAVTIDLGMVQSIGYVAETDSAVAERLQRIGYQPLHEEEVLDVLEQAISPVCSPAAPTRPAVIVTGINTRPGPHWAHADWMQEARFAGIKYRDPLRDNHGALSLTPAEDDNLHARLNRAISQQESIAVIMEAMSCKLISMFGLTDSEMSATQTLAGIGVDSLVAIELRNWITAKFNVDISVFELMEGRTIAKVAEVVLQRYKA
(SEQ ID NO：3).
大肠杆菌羧酸酯酶bioH登录号Q8FCT4
Welsch等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99(26)，17020-17024(2002)
MNNIWWQTKGQGNVHLVLLHGWGLNAEVWRCIDEELSSHFTLHLVDLPGFGRSRGFGALSLADMAEAVLQQAPDKAIWLGWSLGGLVASQIALTHPERVQALVTVASSPCFSARDEWPGIKPDVLAGFQQQLSDDFQRTVERFLALQTMGTETARQDARALKKTVLALPMPEVDVLNGGLEILKTVDLRQPLQNVSMPFLRLYGYLDGLVPRKVVPMLDKLWPHSESYIFAKAAHAPFISHPAEFCHLLVALKQRV
(SEQ ID NO：4).
序列表
<110>加利福尼亚大学董事会(The Regents of the University of California)
<120>制备辛伐他汀和相关化合物的方法和材料
<130>30435187WOU1
<150>60/808,088
<151>2006-05-24
<160>9
<170>FastSEQ for Windows Version 4.0
<210>1
<211>413
<212>PRT
<213>土曲霉(Aspergillus terreus)LovD转酯酶
<400>1
Met Gly Ser Ile Ile Asp Ala Ala Ala Ala Ala Asp Pro Val Val Leu
 1               5                  10                  15
Met Glu Thr Ala Phe Arg Lys Ala Val Lys Ser Arg Gln Ile Pro Gly
            20                  25                  30
Ala Val Ile Met Ala Arg Asp Cys Ser Gly Asn Leu Asn Tyr Thr Arg
        35                  40                  45
Cys Phe Gly Ala Arg Thr Val Arg Arg Asp Glu Cys Asn Gln Leu Pro
    50                  55                  60
Pro Leu Gln Val Asp Thr Pro Cys Arg Leu Ala Ser Ala Thr Lys Leu
65                  70                  75                  80
Leu Thr Thr Ile Met Ala Leu Gln Cys Met Glu Arg Gly Leu Val Asp
                85                  90                  95
Leu Asp Glu Thr Val Asp Arg Leu Leu Pro Asp Leu Ser Ala Met Pro
            100                 105                 110
Val Leu Glu Gly Phe Asp Asp Ala Gly Asn Ala Arg Leu Arg Glu Arg
        115                 120                 125
Arg Gly Lys Ile Thr Leu Arg His Leu Leu Thr His Thr Ser Gly Leu
    130                 135                 140
Ser Tyr Val Phe Leu His Pro Leu Leu Arg Glu Tyr Met Ala Gln Gly
145                 150                 155                 160
His Leu Gln Ser Ala Glu Lys Phe Gly Ile Gln Ser Arg Leu Ala Pro
                165                 170                 175
Pro Ala Val Asn Asp Pro Gly Ala Glu Trp Ile Tyr Gly Ala Asn Leu
            180                 185                 190
Asp Trp Ala Gly Lys Leu Val Glu Arg Ala Thr Gly Leu Asp Leu Glu
        195                 200                 205
Gln Tyr Leu Gln Glu Asn Ile Cys Ala Pro Leu Gly Ile Thr Asp Met
    210                 215                 220
Thr Phe Lys Leu Gln Gln Arg Pro Asp Met Leu Ala Arg Arg Ala Asp
225                 230                 235                 240
Gln Thr His Arg Asn Ser Ala Asp Gly Arg Leu Arg Tyr Asp Asp Ser
                245                 250                 255
Val Tyr Phe Arg Ala Asp Gly Glu Glu Cys Phe Gly Gly Gln Gly Val
            260                 265                 270
Phe Ser Gly Pro Gly Ser Tyr Met Lys Val Leu His Ser Leu Leu Lys
        275                 280                 285
Arg Asp Gly Leu Leu Leu Gln Pro Gln Thr Val Asp Leu Met Phe Gln
    290                 295                 300
Pro Ala Leu Glu Pro Arg Leu Glu Glu Gln Met Asn Gln His Met Asp
305                 310                 315                 320
Ala Ser Pro His Ile Asn Tyr Gly Gly Pro Met Pro Met Val Leu Arg
                325                 330                 335
Arg Ser Phe Gly Leu Gly Gly Ile Ile Ala Leu Glu Asp Leu Asp Gly
            340                 345                 350
Glu Asn Trp Arg Arg Lys Gly Ser Leu Thr Phe Gly Gly Gly Pro Asn
        355                 360                 365
Ile Val Trp Gln Ile Asp Pro Lys Ala Gly Leu Cys Thr Leu Ala Phe
    370                 375                 380
Phe Gln Leu Glu Pro Trp Asn Asp Pro Val Cys Arg Asp Leu Thr Arg
385                 390                 395                 400
Thr Phe Glu His Ala Ile Tyr Ala Gln Tyr Gln Gln Gly
                405                 410
<210>2
<211>418
<212>PRT
<213>桔青霉(Penicillum citrinum)MlcH转酯酶
<400>2
Met Ala Pro Ser Ile Asp Val Ile Pro Thr Ala Ala Ser Thr Ala Ala
 1               5                  10                  15
Gly Met Ile Ser Asp Met Glu Ala Ala Phe Lys Ser Ala Val Lys Leu
            20                  25                  30
Lys Gln Ile Pro Gly Ala Val Val Met Ala Arg Ser Met Asn Gly Asp
        35                  40                  45
Ile Asp Tyr Thr Arg Cys Phe Gly Ala Arg Thr Val Glu Arg Asp Glu
    50                  55                  60
Cys Gln Arg Leu Pro Pro Met Glu Ile Asp Thr Pro Leu Arg Leu Ala
65                  70                  75                  80
Ser Ala Thr Lys Leu Leu Thr Thr Ile Met Ala Leu Gln Cys Met Glu
                85                  90                  95
Gln Gly Leu Val Asp Leu Asp Glu Asn Val Asn Arg Leu Leu Pro Asp
            100                 105                 110
Leu Ser Asp Met Gln Val Leu Thr Gly Phe Asp Ala Ala Gly Asn Ala
        115                 120                 125
Ile Met Arg Asp Arg Glu Gly Ile Ile Lys Leu Arg His Leu Leu Thr
    130                 135                 140
His Thr Ser Gly Leu Ser Tyr Ala Phe Leu His Pro Leu Leu Gln Glu
145                 150                 155                 160
Tyr Met Ala Lys Gly Tyr Leu Lys Thr Ala Glu Lys Phe Gly Ile Gln
                165                 170                 175
Ser Arg Leu Ala Pro Pro Ala Ile Asn Asp Pro Gly Val Glu Trp Ile
            180                 185                 190
Tyr Gly Ala Asn Leu Asp Trp Ala Gly Lys Leu Ile Glu Arg Ala Thr
        195                 200                 205
Gly Val Asp Leu Glu Glu Phe Met Gln Lys Asn Ile Cys Glu Pro Leu
    210                 215                 220
Gly Ile Thr Asp Met Thr Phe Lys Leu Gln Gln Arg Pro Asp Met Leu
225                 230                 235                 240
Ala Arg Arg Ser Asp Gln Thr Arg Arg Asn Glu Asn Gly Ser Leu Arg
                245                 250                 255
Tyr Asp Asp Ser Val Tyr PheArg Hi s Asp Gly Glu Glu Cys Phe Gly
            260                 265                 270
Gly Gln Gly Val Phe Cys Gly Pro Glu Ser Tyr Met Lys Val Leu Asn
        275                 280                 285
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    290                 295                 300
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Asp His Met Asp Thr Thr Pro His Ile Asn Tyr Gly Ala Ala Leu Pro
                325                 330                 335
Pro Val Met Arg Arg Asn Phe Gly Leu Gly Gly Ile Ile Ala Met Gly
            340                 345                 350
Asp Leu Asp Gly His Asn Trp Arg Arg Glu Gly Ser Leu Thr Phe Gly
        355                 360                 365
Gly Gly Pro Asn Ile Val Trp Gln Ile Asp Pro Thr Val Gly Leu Cys
    370                 375                 380
Thr Leu Val Val Phe Gln Leu Glu Pro Trp Asn Asp Pro Ile Cys Lys
385                 390                 395                 400
Asp Leu Thr Arg Lys Phe Glu Lys Ala Met Tyr Ser Gln Val Lys Cys
                405                 410                 415
Arg Asn
<210>3
<211>2532
<212>PRT
<213>土曲霉(A spergil lus terreus)LOVF聚酮合成酶
<400>3
Met Thr Pro Leu Asp Ala Pro Gly Ala ProAla Pro Ile Ala Met Val
 1               5                  10                  15
Gly Met Gly Cys Arg Phe Gly Gly Gly Ala Thr Asp Pro Gln Lys Leu
            20                  25                  30
Trp Lys Leu Leu Glu Glu Gly Gly Ser Ala Trp Ser Lys Ile Pro Pro
        35                  40                  45
Ser Arg Phe Asn Val Gly Gly Val Tyr His Pro Asn Gly Gln Arg Val
    50                  55                  60
Gly Ser Met His Val Arg Gly Gly His Phe Leu Asp Glu Asp Pro Ala
65                  70                  75                  80
Leu Phe Asp Ala Ser Phe Phe Asn Met Ser Thr Glu Val Ala Ser Cys
                85                  90                  95
Met Asp Pro Gln Tyr Arg Leu Ile Leu Glu Val Val Tyr Glu Ala Leu
            100                 105                 110
Glu Ala Ala Gly Ile Pro Leu Glu Gln Val Ser Gly Ser Lys Thr Gly
        115                 120                 125
Val Phe Ala Gly Thr Met Tyr His Asp Tyr Gln Gly Ser Phe Gln Arg
    130                 135                 140
Gln Pro Glu Ala Leu Pro Arg Tyr Phe Ile Thr Gly Asn Ala Gly Thr
145                 150                 155                 160
Met Leu Ala Asn Arg Val Ser His Phe Tyr Asp Leu Arg Gly Pro Ser
                165                 170                 175
Val Ser Ile Asp Thr Ala Cys Ser Thr Thr Leu Thr Ala Leu His Leu
            180                 185                 190
Ala Ile Gln Ser Leu Arg Ala Gly Glu Ser Asp Met Ala Ile Val Ala
        195                 200                 205
Gly Ala Asn Leu Leu Leu Asn Pro Asp Val Phe Thr Thr Met Ser Asn
    210                 215                 220
Leu Gly Phe Leu Ser Ser Asp Gly Ile Ser Tyr Ser Phe Asp Ser Arg
225                 230                 235                 240
Ala Asp Gly Tyr Gly Arg Gly Glu Gly Val Ala Ala Ile Val Leu Lys
                245                 250                 255
Thr Leu Pro Asp Ala Val Arg Asp Gly Asp Pro Ile Arg Leu Ile Val
            260                 265                 270
Arg Glu Thr Ala Ile Asn Gln Asp Gly Arg Thr Pro Ala Ile Ser Thr
        275                 280                 285
Pro Ser Gly Glu Ala Gln Glu Cys Leu Ile Gln Asp Cys Tyr Gln Lys
    290                 295                 300
Ala Gln Leu Asp Pro Lys Gln Thr Ser Tyr Val Glu Ala His Gly Thr
305                 310                 315                 320
Gly Thr Arg Ala Gly Asp Pro Leu Glu Leu Ala Val Ile Ser Ala Ala
                325                 330                 335
Phe Pro Gly Gln Gln Ile Gln Val Gly Ser Val Lys Ala Asn Ile Gly
            340                 345                 350
His Thr Glu Ala Val Ser Gly Leu Ala Ser Leu Ile Lys Val Ala Leu
        355                 360                 365
Ala Val Glu Lys Gly Val Ile Pro Pro Asn Ala Arg Phe Leu Gln Pro
    370                 375                 380
Ser Lys Lys Leu Leu Lys Asp Thr His Ile Gln Ile Pro Leu Cys Ser
385                 390                 395                 400
Gln Ser Trp Ile Pro Thr Asp Gly Val Arg Arg Ala Ser Ile Asn Asn
                405                 410                 415
Phe Gly Phe Gly Gly Ala Asn Ala His Ala Ile Val Glu Gln Tyr Gly
            420                 425                 430
Pro Phe Ala Glu Thr Ser Ile Cys Pro Pro Asn Gly Tyr Ser Gly Asn
        435                 440                 445
Tyr Asp Gly Asn Leu Gly Thr Asp Gln Ala His Ile Tyr Val Leu Ser
    450                 455                 460
Ala Lys Asp Glu Asn Ser Cys Met Arg Met Val Ser Arg Leu Cys Asp
465                 470                 475                 480
Tyr Ala Thr His Ala Arg Pro Ala Asp Asp Leu Gln Leu Leu Ala Asn
                485                 490                 495
Ile Ala Tyr Thr Leu Gly Ser Arg Arg Ser Asn Phe Arg Trp Lys Ala
            500                 505                 510
Val Cys Thr Ala His Ser Leu Thr Gly Leu Ala Gln Asn Leu Ala Gly
        515                 520                 525
Glu Gly Met Arg Pro Ser Lys Ser Ala Asp Gln Val Arg Leu Gly Trp
    530                 535                 540
Val Phe Thr Gly Gln Gly Ala Gln Trp Phe Ala Met Gly Arg Glu Leu
545                 550                 555                 560
Ile Glu Met Tyr Pro Val Phe Lys Glu Ala Leu Leu Glu Cys Asp Gly
                565                 570                 575
Tyr Ile Lys Glu Met Gly Ser Thr Trp Ser Ile Ile Glu Glu Leu Ser
            580                 585                 590
Arg Pro Glu Thr Glu Ser Arg Val Asp Gln Ala Glu Phe Ser Leu Pro
        595                 600                 605
Leu Ser Thr Ala Leu Gln Ile Ala Leu Val Arg Leu Leu Trp Ser Trp
    610                 615                 620
Asn Ile Gln Pro Val Ala Val Thr Ser His Ser Ser Gly Glu Ala Ala
625                 630                 635                 640
Ala Ala Tyr Ala Ile Gly Ala Leu Thr Ala Arg Ser Ala Ile Gly Ile
                645                 650                 655
Ser Tyr Ile Arg Gly Ala Leu Thr Ala Arg Asp Arg Leu Ala Ser Val
            660                 665                 670
His Lys Gly Gly Met Leu Ala Val Gly Leu Ser Arg Ser Glu Val Gly
        675                 680                 685
Ile Tyr Ile Arg Gln Val Pro Leu Gln Ser Glu Glu Cys Leu Val Val
    690                 695                 700
Gly Cys Val Asn Ser Pro Ser Ser Val Thr Val Ser Gly Asp Leu Ser
705                 710                 715                 720
Ala Ile Ala Lys Leu Glu Glu Leu Leu His Ala Asp Arg Ile Phe Ala
                725                 730                 735
Arg Arg Leu Lys Val Thr Gln Ala Phe His Ser Ser His Met Asn Ser
            740                 745                 750
Met Thr Asp Ala Phe Arg Ala Gly Leu Thr Glu Leu Phe Gly Ala Asp
        755                 760                 765
Pro Ser Asp Ala Ala Asn Ala Ser Lys Asp Val Ile Tyr Ala Ser Pro
    770                 775                 780
Arg Thr Gly Ala Arg Leu His Asp Met Asn Arg Leu Arg Asp Pro Ile
785                 790                 795                 800
His Trp Val Glu Cys Met Leu His Pro Val Glu Phe Glu Ser Ala Phe
                805                 810                 815
Arg Arg Met Cys Leu Asp Glu Asn Asp His Met Pro Lys Val Asp Arg
            820                 825                 830
Val Ile Glu Ile Gly Pro His Gly Ala Leu Gly Gly Pro Ile Lys Gln
        835                 840                 845
Ile Met Gln Leu Pro Glu Leu Ala Thr Cys Asp Ile Pro Tyr Leu Ser
    850                 855                 860
Cys Leu Ser Arg Gly Lys Ser Ser Leu Ser Thr Leu Arg Leu Leu Ala
865                 870                 875                 880
Ser Glu Leu Ile Arg Ala Gly Phe Pro Val Asp Leu Asn Ala Ile Asn
                885                 890                 895
Phe Pro Arg Gly Cys Glu Ala Ala Arg Val Gln Val Leu Ser Asp Leu
            900                 905                 910
Pro Pro Tyr Pro Trp Asn His Glu Thr Arg Tyr Trp Lys Glu Pro Arg
        915                 920                 925
Ile Ser Gln Ser Ala Arg Gln Arg Lys Gly Pro Val His Asp Leu Ile
    930                 935                 940
Gly Leu Gln Glu Pro Leu Asn Leu Pro Leu Ala Arg Ser Trp His Asn
945                 950                 955                 960
Val Leu Arg Val Ser Asp Leu Pro Trp Leu Arg Asp His Val Val Gly
                965                 970                 975
Ser His Ile Val Phe Pro Gly Ala Gly Phe Val Cys Met Ala Val Met
            980                 985                 990
Gly Ile Ser Thr Leu Cys Ser Ser Asp His Glu Ser Asp Asp Ile Ser
        995                1000                1005
Tyr Ile Leu Arg Asp Val Asn Phe Ala Gln Ala Leu Ile Leu Pro Ala
    1010                1015                1020
Asp Gly Glu Glu Gly Ile Asp Leu Arg Leu Thr Ile Cys Ala Pro Asp
1025                1030                1035                1040
Gln Ser Leu Gly Ser Gln Asp Trp Gln Arg Phe Leu Val His Ser Ile
                1045                1050                1055
Thr Ala Asp Lys Asn Asp Trp Thr Glu His Cys Thr Gly Leu Val Arg
            1060                1065                1070
Ala Glu Met Asp Gln Pro Pro Ser Ser Leu Ser Asn Gln Gln Arg Ile
        1075                1080                1085
Asp Pro Arg Pro Trp Ser Arg Lys Thr Ala Pro Gln Glu Leu Trp Asp
    1090                1095                1100
Ser Leu His Arg Val Gly Ile Arg His Gly Pro Phe Phe Arg Asn Ile
1105                1110                1115                1120
Thr Cys Ile Glu Ser Asp Gly Arg Gly Ser Trp Cys Thr Phe Ala Ile
                    1125                1130                1135
Ala Asp Thr Ala Ser Ala Met Pro His Ala Tyr Glu Ser Gln His Ile
                1140                1145                1150
Val His Pro Thr Thr Leu Asp Ser Ala Val Gln Ala Ala Tyr Thr Thr
        1155                1160                1165
Leu Pro Phe Ala Gly Ser Arg Ile Lys Ser Ala Met Val Pro Ala Arg
    1170                1175                1180
Val Gly Cys Met Lys Ile Ser Ser Arg Leu Ala Asp Leu Glu Ala Arg
1185                1190                1195                1200
Asp Met Leu Arg Ala Gln Ala Lys Met His Ser Gln Ser Pro Ser Ala
                1205                1210                1215
Leu Val Thr Asp Val Ala Val Phe Asp Glu Ala Asp Pro Val Gly Gly
            1220                1225                1230
Pro Val Met Glu Leu Glu Gly Leu Val Phe Gln Ser Leu Gly Ala Ser
        1235                1240                1245
Leu Gly Thr Ser Asp Arg Asp Ser Thr Asp Pro Gly Asn Thr Cys Ser
    1250                1255                1260
Ser Trp His Trp Ala Pro Asp Ile Ser Leu Val Asn Pro Gly Trp Leu
1265                1270                1275                1280
Glu Lys Thr Leu Gly Thr Gly Ile Gln Glu His Glu Ile Ser Leu Ile
                1285                1290                1295
Leu Glu Leu Arg Arg Cys Ser Val His Phe Ile Gln Glu Ala Met Glu
            1300                1305                1310
Ser Leu Ser Val Gly Asp Val Glu Arg Leu Ser Gly His Leu Ala Lys
        1315                1320                1325
Phe Tyr Ala Trp Met Gln Lys Gln Leu Ala Cys Ala Gln Asn Gly Glu
    1330                1335                1340
Leu Gly Pro Glu Ser Ser Ser Trp Thr Arg Asp Ser Glu Gln Ala Arg
1345                1350                1355                1360
Cys Ser Leu Arg Ser Arg Val Val Ala Gly Ser Thr Asn Gly Glu Met
                 1365                1370                1375
Ile Cys Arg Leu Gly Ser Val Leu Pro Ala Ile Leu Arg Arg Glu Val
            1380                1385                1390
Asp Pro Leu Glu Val Met Met Asp Gly His Leu Leu Ser Arg Tyr Tyr
        1395                1400                1405
Val Asp Ala Leu Lys Trp Ser Arg Ser Asn Ala Gln Ala Ser Glu Leu
    1410                1415                1420
Val Arg Leu Cys Cys His Lys Asn Pro Arg Ala Arg Ile Leu Glu Ile
1425                1430                1435                1440
Gly Gly Gly Thr Gly Gly Cys Thr Gln Leu Val Val Asp Ser Leu Gly
                1445                1450                1455
Pro Asn Pro Pro Val Gly Arg Tyr Asp Phe Thr Asp Val Ser Ala Gly
            1460                1465                1470
Phe Phe Glu Ala Ala Arg Lys Arg Phe Ala Gly Trp Gln Asn Val Met
        1475                1480                1485
Asp Phe Arg Lys Leu Asp Ile Glu Asp Asp Pro Glu Ala Gln Gly Phe
    1490                1495                1500
Val Cys Gly Ser Tyr Asp Val Val Leu Ala Cys Gln Val Leu His Ala
1505                1510                1515                1520
Thr Ser Asn Met Gln Arg Thr Leu Thr Asn Val Arg Lys Leu Leu Lys
                 1525                1530                1535
Pro Gly Gly Lys Leu Ile Leu Val Glu Thr Thr Arg Asp Glu Leu Asp
            1540                1545                1550
Leu Phe Phe Thr Phe Gly Leu Leu Pro Gly Trp Trp Leu Ser Glu Glu
        1555                1560                1565
Pro Glu Arg Gln Ser Thr Pro Ser Leu Ser Pro Thr Met Trp Arg Ser
    1570                1575                1580
Met Leu His Thr Thr Gly Phe Asn Gly Val Glu Val Glu Ala Arg Asp
1585                1590                1595                1600
Cys Asp Ser His Glu Phe Tyr Met Ile Ser Thr Met Met Ser Thr Ala
                1605                1610                1615
Val Gln Ala Thr Pro Met Ser Cys Ser Val Lys Leu Pro Glu Val Leu
            1620                1625                1630
Leu Val Tyr Val Asp Ser Ser Thr Pro Met Ser Trp Ile Ser Asp Leu
        1635                1640                1645
Gln Gly Glu Ile Arg Gly Arg Asn Cys Ser Val Thr Ser Leu Gln Ala
    1650                1655                1660
Leu Arg Gln Val Pro Pro Thr Glu Gly Gln Ile Cys Val Phe Leu Gly
1665                1670                1675                1680
Glu Val Glu His Ser Met Leu Gly Ser Val Thr Asn Asp Asp Phe Thr
                1685                1690                1695
Leu Leu Thr Ser Met Leu Gln Leu Ala Gly Gly Thr Leu Trp Val Thr
            1700                1705                1710
Gln Gly Ala Thr Met Lys Ser Asp Asp Pro Leu Lys Ala Leu His Leu
        1715                1720                1725
Gly Leu Leu Arg Thr Met Arg Asn Glu Ser His Gly Lys Arg Phe Val
    1730                1735                 1740
Ser Leu Asp Leu Asp Pro Ser Arg Asn Pro Trp Thr Gly Asp Ser Arg
1745                1750                 1755                1760
Asp Ala Ile Val Ser Val Leu Asp Leu Ile Ser Met Ser Asp Glu Lys
                1765                1770                1775
Glu Phe Asp Tyr Ala Glu Arg Asp Gly Val Ile His Val Pro Arg Ala
            1780                1785                1790
Phe Ser Asp Ser Ile Asn Gly Gly Glu Glu Asp Gly Tyr Ala Leu Glu
        1795                1800                1805
Pro Phe Gln Asp Ser Gln His Leu Leu Arg Leu Asp Ile Gln Thr Pro
    1810                1815                1820
Gly Leu Leu Asp Ser Leu His Phe Thr Lys Arg Asn Val Asp Thr Tyr
1825                1830                1835                1840
Glu Pro Asp Lys Leu Pro Asp Asp Trp Val Glu Ile Glu Pro Arg Ala
                1845                1850                1855
Phe Gly Leu Asn Phe Arg Asp Ile Met Val Ala Met Gly Gln Leu Glu
            1860                1865                1870
Ser Asn Val Met Gly Phe Glu Cys Ala Gly Val Val Thr Ser Leu Ser
        1875                1880                1885
Glu Thr Ala Arg Thr Ile Ala Pro Gly Leu Ala Val Gly Asp Arg Val
    1890                1895                1900
Cys Ala Leu Met Asn Gly His Trp Ala Ser Arg Val Thr Thr Ser Arg
1905                1910                1915                1920
Thr Asn Val Val Arg Ile Pro Glu Thr Leu Ser Phe Pro His Ala Ala
                1925                1930                1935
Ser Ile Pro Leu Ala Phe Thr Thr Ala Tyr Ile Ser Leu Tyr Thr Val
            1940                1945                1950
Ala Arg Ile Leu Pro Gly Glu Thr Val Leu Ile His Ala Gly Ala Gly
        1955                1960                1965
Gly Val Gly Gln Ala Ala Ile Ile Leu Ala Gln Leu Thr Gly Ala Glu
    1970                1975                1980
Val Phe Thr Thr Ala Gly Ser Glu Thr Lys Arg Asn Leu Leu Ile Asp
1985                1990                1995                2000
Lys Phe His Leu Asp Pro Asp His Val Phe Ser Ser Arg Asp Ser Ser
                2005                2010                2015
Phe Val Asp Gly Ile Lys Thr Arg Thr Arg Gly Lys Gly Val Asp Val
            2020                2025                2030
Val Leu Asn Ser Leu Ala Gly Pro Leu Leu Gln Lys Ser Phe Asp Cys
        2035                2040                2045
Leu Ala Arg Phe Gly Arg Phe Val Glu Ile Gly Lys Lys Asp Leu Glu
    2050                2055                2060
Gln Asn Ser Arg Leu Asp Met Ser Thr Phe Val Arg Asn Val Ser Phe
2065                2070                2075                2080
Ser Ser Val Asp Ile Leu Tyr Trp Gln Gln Ala Lys Pro Ala Glu Ile
                2085                2090                2095
Phe Gln Ala Met Ser Glu Val Ile Leu Leu Trp Glu Arg Thr Ala Ile
            2100                2105                2110
Gly Leu Ile His Pro Ile Ser Glu Tyr Pro Met Ser Ala Leu Glu Lys
        2115                2120                2125
Ala Phe Arg Thr Met Gln Ser Gly Gln His Val Gly Lys Ile Val Val
    2130                2135                2140
Thr Val Ala Pro Asp Asp Ala Val Leu Val Arg Gln Glu Arg Met Pro
2145                2150                2155                2160
Leu Phe Leu Lys Pro Asn Val Ser Tyr Leu Val Ala Gly Gly Leu Gly
                2165                2170                2175
Gly Ile Gly Arg Arg Ile Cys Glu Trp Leu Val Asp Arg Gly Ala Arg
            2180                2185                2190
Tyr Leu Ile Ile Leu Ser Arg Thr Ala Arg Val Asp Pro Val Val Thr
        2195                2200                2205
Ser Leu Gln Glu Arg Gly Cys Thr Val Ser Val Gln Ala Cys Asp Val
    2210                2215                2220
Ala Asp Glu Ser Gln Leu Glu Ala Ala Leu Gln Gln Cys Arg Ala Glu
2225                2230                2235                2240
Glu Met Pro Pro Ile Arg Gly Val Ile Gln Gly Ala Met Val Leu Lys
                2245                2250                2255
Asp Ala Leu Val Ser Gln Met Thr Ala Asp Gly Phe His Ala Ala Leu
            2260                2265                2270
Arg Pro Lys Val Gln Gly Ser Trp Asn Leu His Arg Ile Ala Ser Asp
        2275                2280                2285
Val Asp Phe Phe Val Met Leu Ser Ser Leu Val Gly Val Met Gly Gly
    2290                2295                2300
Ala Gly Gln Ala Asn Tyr Ala Ala Ala Gly Ala Phe Gln Asp Ala Leu
2305                2310                2315                2320
Ala Glu His Arg Met Ala His Asn Gln Pro Ala Val Thr Ile Asp Leu
                2325                2330                2335
Gly Met Val Gln Ser Ile Gly Tyr Val Ala Glu Thr Asp Ser Ala Val
            2340                2345                2350
Ala Glu Arg Leu Gln Arg Ile Gly Tyr Gln Pro Leu His Glu Glu Glu
        2355                2360                2365
Val Leu Asp Val Leu Glu Gln Ala Ile Ser Pro Val Cys Ser Pro Ala
    2370                2375                2380
Ala Pro Thr Arg Pro Ala Val Ile Val Thr Gly Ile Asn Thr Arg Pro
2385                2390                2395                2400
Gly Pro His Trp Ala His Ala Asp Trp Met Gln Glu Ala Arg Phe Ala
                2405                2410                2415
Gly Ile Lys Tyr Arg Asp Pro Leu Arg Asp Asn His Gly Ala Leu Ser
            2420                2425                2430
Leu Thr Pro Ala Glu Asp Asp Asn Leu His Ala Arg Leu Asn Arg Ala
        2435                2440                2445
Ile Ser Gln Gln Glu Ser Ile Ala Val Ile Met Glu Ala Met Ser Cys
    2450                2455                2460
Lys Leu Ile Ser Met Phe Gly Leu Thr Asp Ser Glu Met Ser Ala Thr
2465                2470                2475                2480
Gln Thr Leu Ala Gly Ile Gly Val Asp Ser Leu Val Ala Ile Glu Leu
                2485                2490                2495
Arg Asn Trp Ile Thr Ala Lys Phe Asn Val Asp Ile Ser Val Phe Glu
            2500                2505                2510
Leu Met Glu Gly Arg Thr Ile Ala Lys Val Ala Glu Val Val Leu Gln
        2515                2520                2525
Arg Tyr Lys Ala
    2530
<210>4
<211>256
<212>PRT
<213>大肠杆菌(Escherichia coli)羧酸酯酶bioH
<400>4
Met Asn Asn Ile Trp Trp Gln Thr Lys Gly Gln Gly Asn Val His Leu
 1               5                  10                  15
Val Leu Leu His Gly Trp Gly Leu Asn Ala Glu Val Trp Arg Cys Ile
            20                  25                  30
Asp Glu Glu Leu Ser Ser His Phe Thr Leu His Leu Val Asp Leu Pro
        35                  40                  45
Gly Phe Gly Arg Ser Arg Gly Phe Gly Ala Leu Ser Leu Ala Asp Met
    50                  55                  60
Ala Glu Ala Val Leu Gln Gln Ala Pro Asp Lys Ala Ile Trp Leu Gly
65                  70                  75                  80
Trp Ser Leu Gly Gly Leu Val Ala Ser Gln Ile Ala Leu Thr His Pro
                85                  90                  95
Glu Arg Val Gln Ala Leu Val Thr Val Ala Ser Ser Pro Cys Phe Ser
            100                 105                 110
Ala Arg Asp Glu Trp Pro Gly Ile Lys Pro Asp Val Leu Ala Gly Phe
        115                 120                 125
Gln Gln Gln Leu Ser Asp Asp Phe Gln Arg Thr Val Glu Arg Phe Leu
    130                 135                 140
Ala Leu Gln Thr Met Gly Thr Glu Thr Ala Arg Gln Asp Ala Arg Ala
145                 150                 155                 160
Leu Lys Lys Thr Val Leu Ala Leu Pro Met Pro Glu Val Asp Val Leu
                165                 170                 175
Asn Gly Gly Leu Glu Ile Leu Lys Thr Val Asp Leu Arg Gln Pro Leu
            180                 185                 190
Gln Asn Val Ser Met Pro Phe Leu Arg Leu Tyr Gly Tyr Leu Asp Gly
        195                 200                 205
Leu Val Pro Arg Lys Val Val Pro Met Leu Asp Lys Leu Trp Pro His
    210                 215                 220
Ser Glu Ser Tyr Ile Phe Ala Lys Ala Ala His Ala Pro Phe Ile Ser
225                 230                 235                 240
His Pro Ala Glu Phe Cys His Leu Leu Val Ala Leu Lys Gln Arg Val
                245                 250                 255
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
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<213>人工序列
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<211>19
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<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>9
gctggattgt ttcgccgatc    20

Claims (17)

1.一种制备辛伐他汀的方法，包括如下步骤：
(1)将莫那可林J、酰基硫酯、和LovD酰基转移酶混合在一起，所述酰基硫酯在LovD酰基转移酶存在时将二甲基丁酰基基团贡献给莫那可林J的C8羟基；所述LovD酰基转移酶如SEQ ID NO：1所示，和
(2、)使得LovD酰基转移酶使用酰基硫酯的酰基基团来区域选择性地酰基化莫那可林J的C8羟基；
由此制备辛伐他汀。
2.权利要求1的方法，其中在不存在分离的生物体的条件下体外制备辛伐他汀。
3.权利要求1的方法，其中莫那可林J、酰基硫酯和LovD酰基转移酶在产生LovD酰基转移酶的分离的生物体存在时在发酵培养基中混合，且其中该生物体是大肠杆菌(Escherichia coli)，土曲霉(Aspergillus terreus)，红色红曲霉(Monascus ruber)，紫色红曲霉(Monascus purpureus)，丛毛红曲霉(Monascus pilosus)，Monascus vitreus,Monascus pubigerus，Candidacariosilognicola，米曲霉(Aspergillus oryzea)，Doratomyces stemonitis，多变拟青霉(Paecilomyces virioti)，桔青霉(Penicillum citrinum)，产黄青霉(Penicillin chrysogenum)，短尾帚霉(Scopulariopsis brevicaulis)或绿色木霉(Trichoderma viride)。
4.权利要求3的方法，其中该分离的生物体是如下的至少一种：
(a)表达SEQ ID NO：1的LovD多肽的土曲霉；
(b)不表达SEQ ID NO：3的LovF多肽的土曲霉；
(c)表达SEQ ID NO：1的LovD多肽的大肠杆菌；或
(d)不表达SEQ ID NO：4的bioH多肽的大肠杆菌。
5.权利要求1的方法，其中所选的酰基硫酯具有至少一种下列特性：
(a)能够穿过在发酵培养基内生长的大肠杆菌或土曲霉细胞的细胞膜；或
(b、)选自由α-二甲基丁酰-S-甲基-巯基丙酸酯(DMB-S-MMP)，二甲基丁酰-s-乙基巯基丙酸酯(DMB-S-EMP)和二甲基丁酰-S-甲基巯基乙酸酯(DMB-S-MTG)和二甲基丁酰-S-甲基巯基丁酸酯(DMB-S-MMB)组成的组中。
6.权利要求3的方法，其中该酰基硫酯是α-二甲基丁酰-S-甲基-巯基丙酸酯，且其中该α-二甲基丁酰-S-甲基-巯基丙酸酯以lmM-100mM的浓度范围存在于发酵培养基中。
7.权利要求3的方法，其中莫那可林J由所述发酵培养基内的分离的生物体产生。
8.权利要求3的方法，其中该分离的生物体在至少一种下列条件下生长：
(a)在温度为30-40℃之间；
(b)生长时间为4到48小时之间；
(c)在pH为7-8之间；或
(d)在包含LB，F1或TB培养基的发酵培养基中。
9.权利要求1的方法，还包括将通过所述方法制备的辛伐他汀以至少一个纯化步骤来纯化，所述纯化步骤包括：
(a)裂解存在于混合物中的分离的生物体的细胞；
(b)离心；
(c)沉淀游离酸形式的辛伐他汀；
(d、)将游离酸形式的辛伐他汀转化为辛伐他汀盐；
(e、)过滤；或
(f)高效液相层析法(HPLC)。
10.权利要求1的方法，其中该方法：
(a)产生包含大于O％而小于或等于1％的莫那可林J的组合物，该莫那可林J最初与酰基硫酯混合在一起，该酰基硫酯在LovD酰基转移酶存在时将酰基基团贡献给莫那可林J的C8羟基；和／或
(b)使加入混合物中的至少95％的莫那可林J转化为辛伐他汀。
11.组合物，包含：
莫那可林J；
酰基硫酯，其在LovD酰基转移酶存在时将二甲基丁酰基基团贡献给莫那可林J的C8羟基，其中所述酰基硫脂能够穿过在发酵培养基内生长的大肠杆菌或土曲霉细胞的细胞膜；
LovD酰基转移酶，其如SEQ ID NO：1所示；和
辛伐他汀。
12.权利要求11的组合物，还包含分离的生物体，其中该生物体是大肠杆菌，土曲霉，红色红曲霉，紫色红曲霉，丛毛红曲霉，Monascus vitreus，Monascus pubigerius,Candida cariosilognicola，米曲霉，Doratomycesstemonitis，多变拟青霉，桔青霉，产黄青霉，短尾帚霉或绿色木霉。
13.权利要求12的组合物，其中该分离的生物体是下列至少一种：
(a)表达SEQ ID NO：1的LovD多肽的土曲霉；
(b)不表达SEQ ID NO：3的LovF多肽的土曲霉；
(c)表达SEQ ID NO：1的LovD多肽的大肠杆菌；或
(d)不表达SEQ ID NO：4的bioH多肽的大肠杆菌。
14.权利要求11的组合物，其中该酰基硫酯选自由α-二甲基丁酰-S-甲基-巯基丙酸酯(DMB-S-MMP)，二甲基丁酰-S-乙基巯基丙酸酯(DMB-S-EMP)和二甲基丁酰-S-甲基巯基乙酸酯(DMB-S-MTG)和二甲基丁酰-S-甲基巯基丁酸酯(DMB-S-MMB)组成的组中。
15.权利要求11的组合物，还包括用编码SEQ ID NO：1所示土曲霉LovD的表达载体转导的分离的生物体。
16.权利要求11的组合物，其中该组合物还包含洛伐他汀、且组合物中辛伐他汀的量大于组合物中洛伐他汀的量。
17.一种制备辛伐他汀的方法，包括以下步骤：
(1)将莫那可林J、酰基硫酯、和LovD酰基转移酶混合在一起，所述酰基硫酯在LovD酰基转移酶存在时将二甲基丁酰基基团贡献给莫那可林J的C8羟基，所述LovD酰基转移酶如SEQ ID NO：1所示；和
(2)使得LovD酰基转移酶使用酰基硫酯的酰基基团来区域选择性地酰基化莫那可林J的C8羟基；
其中在存在分离的生物体的条件下在发酵培养基中体内制备辛伐他汀，且酰基硫脂来自外源并被添加到所述发酵培养基中，
由此制备辛伐他汀。
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