JP2024509930A

JP2024509930A - 脂肪酸からの大環状ムスクラクトンの生合成生成

Info

Publication number: JP2024509930A
Application number: JP2023555296A
Authority: JP
Inventors: チェン，フイ; ヴェネガス，マニュエル，ガルシア; ユー，オリバー; ナッザーロ，マイケル; スチュワート，アンドリュー
Original assignee: コナゲンインコーポレイテッド
Priority date: 2021-03-09
Filing date: 2022-03-09
Publication date: 2024-03-05
Also published as: WO2022192384A8; WO2022192384A1; EP4305184A1

Abstract

本明細書では、脂肪酸から大環状ラクトンなどのラクトンを生成するための生合成方法が提供される。生合成方法を使用して、及び／または生合成方法中に生成されるラクトンも提供される。【選択図】図１

Description

関連出願
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）に基づき、２０２１年３月９日に出願された、「ＢＩＯＳＹＮＴＨＥＴＩＣＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮＯＦＭＡＣＲＯＣＹＣＬＩＣＭＵＳＫＬＡＣＴＯＮＥＳＦＲＯＭＦＡＴＴＹＡＣＩＤＳ」と題する米国仮出願第号６３／１５８，８４３号、及び２０２１年４月３０日に出願された、「ＢＩＯＳＹＮＴＨＥＴＩＣＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮＯＦＭＡＣＲＯＣＹＣＬＩＣＭＵＳＫＬＡＣＴＯＮＥＳＦＲＯＭＦＡＴＴＹＡＣＩＤＳ」と題する米国仮出願第６３／１８２，２４２号の権益を主張し、これらのそれぞれの全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。

配列表の項目
本出願は、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩフォーマットで提出された配列表を含み、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。２０２２年３月９日に作成された上記ＡＳＣＩＩコピーは、Ｃ１４９７７００４７ＷＯ００－ＳＥＱ－ＺＪＧという名称であり、３０，２８６バイトのサイズである。

本発明の技術分野は、ラクトン化合物（例えば、香味または芳香を含有し得る大環状ラクトン化合物）の生成に有用な方法及びプロセスに関する。

ムスクラクトンは一般に希少で高価である。現在、限られた数の大環状ムスクラクトンのみが入手可能であり、限定された差別化されたムスキーノートのみが入手可能である。既存のムスクラクトンのほとんどは化学合成されており、天然のものはほとんどない。

本開示は、いくつかの態様において、脂肪酸から大環状ラクトンなどのラクトンを生成する方法（例えば、生合成方法）を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法を使用して生成される大環状ラクトンなどのラクトンは、差別化されたムスキーノートを有する。本明細書に記載されるように、ヒドロキシラーゼ活性を有するチトクロームＰ４５０酵素は、本明細書に記載される生合成方法の第１のステップ、すなわち、脂肪酸をω－１、ω－２、ω－３ヒドロキシル脂肪酸、またはそれらの組み合わせに変換することを実行することができる。本明細書に記載の生合成方法の第２のステップであるω－１、ω－２、ω－３ヒドロキシル脂肪酸のマクロラクトン化は、リパーゼによって実行することができる。大環状ラクトンなどの新規ラクトンも提供される。

したがって、本開示のいくつかの態様は、ラクトンを生成する方法であって、該方法が、
（ｉ）１つ以上の脂肪酸、シトクロムＰ４５０ヒドロキシラーゼ、及びＮＡＤＰＨを含む第１の反応混合物を調製することと；
（ｉｉ）第１の反応混合物を十分な時間インキュベートして、ω－１ヒドロキシル脂肪酸、ω－２ヒドロキシル脂肪酸、ω－３ヒドロキシル脂肪酸、及びそれらの組み合わせから選択されるヒドロキシル脂肪酸を生成することと；
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）で生成されたヒドロキシル脂肪酸及びリパーゼを含む第２の反応混合物を調製することと；
（ｉｖ）ラクトンを生成するのに十分な時間、第２の反応混合物をインキュベートすることと、
を含む、方法を提供する。

いくつかの実施形態では、ステップ（ｉｉ）は、第１の反応混合物からヒドロキシル脂肪酸を単離することをさらに含む。

いくつかの実施形態では、シトクロムＰ４５０ヒドロキシラーゼは、配列番号１または配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、シトクロムＰ４５０ヒドロキシラーゼは、配列番号１または配列番号３のアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、リパーゼは、Ｃａｎｄｉｄａａｎｔａｒｃｔｉｃａ由来のリパーゼＢである。いくつかの実施形態では、リパーゼは、配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、リパーゼは、配列番号５のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、リパーゼは固体支持体上に固定化される。いくつかの実施形態では、第２の反応混合物はさらに溶媒を含み、任意選択で溶媒はトルエンまたはジクロロエタンである。いくつかの実施形態では、第２の反応混合物中のヒドロキシル脂肪酸は、０．０２～０．１Ｍの総濃度であり、任意選択で、ヒドロキシル脂肪酸は、０．０２５～０．５Ｍの総濃度である。いくつかの実施形態では、第２の反応混合物中のリパーゼは、２０～１５０ｇ／Ｌの濃度であり、任意選択でリパーゼは５０～１００ｇ／Ｌの濃度である。いくつかの実施形態では、ステップ（ｉｖ）はラクトンを単離することをさらに含む。

いくつかの実施形態では、ステップ（ｉ）の１つ以上の脂肪酸は、１２～２８個の炭素原子を含む直鎖脂肪酸を含み、任意選択で、ステップ（ｉ）の１つ以上の脂肪酸は、１５、１６、１７、１８、または２０個の炭素原子を含む直鎖脂肪酸を含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｉ）の１つ以上の脂肪酸は飽和脂肪酸を含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｉ）の１つ以上の脂肪酸は不飽和脂肪酸を含み、任意選択で、不飽和脂肪酸は少なくとも１つの二重結合を含み、任意選択で、不飽和脂肪酸は少なくとも１つのＺ二重結合を含む。

いくつかの実施形態では、ステップ（ｉ）の１つ以上の脂肪酸は、以下からなる群から選択される：

及びそれらの組み合わせ。

及びそれらの組み合わせ。いくつかの実施形態では、ラクトンは、次式の１つ以上の化合物を含む：

（式中、
Ｒはメチル、エチル、またはｎ－プロピルであり、
それぞれの

は、原子価が許す限り、独立して単結合、Ｅ二重結合、Ｚ二重結合、または三重結合であり；
ｋは６～３０の整数である（両端を含む））。

いくつかの実施形態では、ラクトンは、次式の１つ以上の化合物を含む：

は、原子価が許す限り、独立して単結合、Ｅ二重結合、Ｚ二重結合、または三重結合であり；
ｎは６～２０の整数である（両端を含む））。

いくつかの実施形態では、ステップ（ｉ）の１つ以上の脂肪酸は、

を含み、ステップ（ｉｖ）で生成されるラクトンは、

及びそれらの組み合わせを含む。

（Ｃ１６：０、パルミチン酸）
を含み、ステップ（ｉｖ）で生成されるラクトンは、

及びそれらの組み合わせを含む。

を含み、ステップ（ｉｖ）で生成されるラクトンは、

及びそれらの組み合わせを含む。

を含み、ステップ（ｉｖ）で生成されるラクトンは、

及びそれらの組み合わせを含む。

を含み、ステップ（ｉｖ）で生成されるラクトンは、

及びそれらの組み合わせを含む。

を含み、ステップ（ｉｖ）で生成されるラクトンは、

及びそれらの組み合わせを含む。

を含み、ステップ（ｉｖ）で生成されるラクトンは、

及びそれらの組み合わせを含む。

を含み、ステップ（ｉｖ）で生成されるラクトンは、

及びそれらの組み合わせを含む。

いくつかの実施形態では、ステップ（ｉ）の第１の反応混合物中で基質として使用される１つ以上の脂肪酸は、

を含み、ステップ（ｉｖ）で生成されるラクトンは

を含む。

いくつかの実施形態では、ステップ（ｉ）の第１の反応混合物で基質として使用される１つ以上の脂肪酸は、

を含み、ステップ（ｉｖ）で生成されるラクトンは、

及びそれらの組み合わせを含む。

を含み、ステップ（ｉｖ）で生成されるラクトンは、

及びそれらの組み合わせを含む。

を含み、ステップ（ｉｖ）で生成されるラクトンは、

及びそれらの組み合わせを含む。

を含み、ステップ（ｉｖ）で生成されるラクトンは、

及びそれらの組み合わせを含む。

を含み、
ステップ（ｉｖ）で生成されるラクトンは、

を含む。

を含み、ステップ（ｉｖ）で生成されるラクトンは、

及びそれらの組み合わせを含む。

を含み、ステップ（ｉｖ）で生成されるラクトンは、

及びそれらの組み合わせを含む。

を含み、ステップ（ｉｖ）で生成されるラクトンは、

及びそれらの組み合わせを含む。

を含み、ステップ（ｉｖ）で生成されるラクトンは、

及びそれらの組み合わせを含む。

を含み、ステップ（ｉｖ）で生成されるラクトンは、

及びそれらの組み合わせを含む。

を含み、ステップ（ｉｖ）で生成されるラクトンは、

及びそれらの組み合わせを含む。

を含み、ステップ（ｉｖ）で生成されるラクトンは、

及びそれらの組み合わせを含む。

を含み、ステップ（ｉｖ）で生成されるラクトンは、

及びそれらの組み合わせを含む。

を含み、ステップ（ｉｖ）で生成されるラクトンは、

及びそれらの組み合わせを含む。

を含み、ステップ（ｉｖ）で生成されるラクトンは、

及びそれらの組み合わせを含む。

いくつかの実施形態では、第１の反応混合物はインビトロにある。いくつかの実施形態では、第１の反応混合物は細胞ベースの反応混合物である。いくつかの実施形態では、細胞ベースの反応混合物は、酵母、植物、藻類、真菌、及び細菌からなる群から選択される細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞ベースの反応混合物はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ；Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ；Ｂａｃｉｌｌｕｓ；Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ；Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ；Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ；Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ；Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ；Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ；Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ；Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉａ；Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ；Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ；Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ；Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ；Ｐａｎｔｏｅａ；Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ；Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ；及びＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍからなる群から選択される属の細菌細胞を含み、任意選択で、細胞ベースの反応混合物は、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞ベースの反応混合物は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ；Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ；Ｃａｎｄｉｄａ；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ；Ｈａｎｓｅｎｕｌａ；Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ；Ｍｕｃｏｒ；Ｐｉｃｈｉａ；Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ；Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ；及びＡｒｔｈｒｏｂｏｔｌｙｓからなる群から選択される属の真菌を含む。

いくつかの実施形態では、ステップ（ｉｖ）で生成されるラクトンは、少なくとも７０％の純度を有する。いくつかの実施形態では、ステップ（ｉｖ）で生成されるラクトンはムスクノートを有する。

本開示の他の態様は、次式のラクトンを提供する：

は、原子価が許す限り、独立して単結合、Ｅ二重結合、Ｚ二重結合、または三重結合であり；
ｋは６～３０の整数である（両端を含む）が；
ただし、ラクトンが次の式のものではないという条件である：

いくつかの実施形態では、ラクトンは次式のものである：

（式中、
Ｒはメチル、エチル、またはｎ－プロピルであり；
それぞれの

は、原子価が許す限り、独立して単結合またはＺ二重結合であり、０、１、２、または４個の

が、Ｚ二重結合であり；
ｍは４～１１の整数である（両端を含む）が；
ただし、ラクトンが次の式のものではないという条件である：

いくつかの実施形態では、それぞれの

は、単結合である。いくつかの実施形態では、１つの

は、ＥまたはＺ二重結合であり、残りの

は単結合である。いくつかの実施形態では、２つの

は独立してＥまたはＺ二重結合であり、残りの

は単結合である。いくつかの実施形態では、３つの

は独立してＥまたはＺ二重結合であり、残りの

は単結合である。いくつかの実施形態では、４つの

は独立してＥまたはＺ二重結合であり、残りの

は単結合である。いくつかの実施形態では、それぞれの二重結合は、存在する場合、Ｚ二重結合である。いくつかの実施形態では、それぞれの二重結合は、存在する場合、Ｅ二重結合である。いくつかの実施形態では、ラクトンは、Ｃ＝Ｃ＝Ｃ、Ｃ＝Ｃ≡Ｃ、及びＣ≡Ｃ＝Ｃのいずれも含まない。いくつかの実施形態では、ｋは、８、９、１０、１１、１２、１３、または１５である。

いくつかの実施形態では、ラクトンは次式のものである：

いくつかの実施形態では、ラクトンは次式のものである：

いくつかの実施形態では、ラクトンは次式のものである：

いくつかの実施形態では、キラル炭素原子はＳ配置である。いくつかの実施形態では、キラル炭素原子はＲ配置である。

本明細書に記載の２つ以上のラクトンの混合物、及び本明細書に記載のラクトンまたは２つ以上のラクトンの混合物を含む組成物も提供される。いくつかの実施形態では、本組成物は、化粧品として許容される賦形剤をさらに含む。

また、本明細書では、本明細書に記載の方法のいずれか１つによって生成されるラクトンも提供される。

本開示は、さまざまな修正及び代替形態を受け入れるが、具体的な実施形態を図面中の例として示し、本明細書で詳細に説明する。しかしながら、本明細書で提供される図面及び詳細な説明は、本開示を特定の開示される実施形態を特定に限定することを意図しておらず、逆に、その意図は、添付の特許請求の範囲によって定義される本開示の趣旨及び範囲内にあるすべての修正物、均等物、及び代替物を包含することに留意されたい。

本発明の他の利点及び特徴は、添付の図面を参照して以下の本発明の好ましい実施形態の詳細な説明から明らかになるであろう。

添付の図面は正確な縮尺であることを意図していない。図面では、さまざまな図に示されているそれぞれの同一またはほぼ同一の構成要素は、同様の数字で表されている。明確にするために、すべての図面ですべての構成要素にラベルが付けられているわけではない。

脂肪酸ヒドロキシル化反応（プロセス１）とマクロラクトンを得る反応（プロセス２）とを示す全体合成スキーム。リパーゼによって触媒された反応生成物のＧＣ／ＭＳ分析。数字は、さまざまな脂肪酸からのムスクラクトンのピークを示す。これらのムスキーラクトンの分子量は、計算された分子量と一致する。オレイン酸の脂肪酸ヒドロキシル化及び閉環を示す反応スキーム。リノール酸の脂肪酸ヒドロキシル化及び閉環を示す反応スキーム。アラキドン酸の脂肪酸ヒドロキシル化及び閉環を示す反応スキーム。パルミチン酸の脂肪酸ヒドロキシル化及び閉環を示す反応スキーム。ヘプタデカン酸の脂肪酸ヒドロキシル化及び閉環を示す反応スキーム。オクタデカン酸の脂肪酸ヒドロキシル化及び閉環を示す反応スキーム。パルミチン酸ヒドロキシル化（プロセス１）及び対応するムスクラクトン生成物を得る反応（プロセス２）を示す全体的な合成スキーム。ヒドロキシルオレイン酸が環化して対応するムスクラクトン生成物が得られることを示す反応（プロセス２）。オレイン酸マクロラクトン化生成物の分析を示すクロマトグラム及びスペクトル。リノール酸ヒドロキシル化（プロセス１）及び対応するムスクラクトン生成物を得る反応（プロセス２）を示す全体的な合成スキームを図６に示す。リノール酸マクロラクトン化生成物の分析を示すＧＣ／ＭＳ。ヒドロキシγ－リノレン酸（ＧＬＡ、Ｃ１８：３）からのムスクラクトンの生成。ヒドロキシＧＬＡ（分子量：２７６）由来のムスクラクトンのＧＣ／ＭＳ分析。 α－リノレン酸（ＡＬＡ、Ｃ１８：３）からのムスキーラクトンの生成。ヒドロキシＡＬＡ（分子量：２７６）由来のムスクラクトンのＧＣ／ＭＳ分析。８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ－エイコサトリエン酸、ジホモ－γ－リノレン酸（ＤＧＬＡ、Ｃ２０：３）からのムスクラクトンの生成。ヒドロキシＤＧＬＡ（分子量：３０４）由来のムスクラクトンのＧＣ／ＭＳ分析。対応するムスクラクトン生成物を得るためのシス－１０－ヘプタデセン酸（Ｃ１７：１ｃｉｓ－１０）ヒドロキシル化及び環化を示す反応。対応するムスクラクトン生成物を得るためのトランス－１０－ヘプタデセン酸（Ｃ１７：１ｔｒａｎｓ－１０）ヒドロキシル化及び環化を示す反応。対応するムスクラクトン生成物を得るためのシス－１０－ノナデセン酸（Ｃ１９：１ｃｉｓ－１０）ヒドロキシル化及び環化を示す反応。対応するムスクラクトン生成物を得るためのシス－１１－エイコセン酸（Ｃ２０：１ｃｉｓ－１１）ヒドロキシル化及び環化を示す反応。シス－１０－ヘプタデセン酸（Ｃ１７：１ｃｉｓ－１０）由来のムスクラクトンのＧＣ／ＭＳ分析。トランス－１０－ヘプタデセン酸（Ｃ１７：１ｔｒａｎｓ－１０）由来のムスクラクトンのＧＣ／ＭＳ分析。シス－１０－ノナデセン酸（Ｃ１９：１ｃｉｓ－１０）由来のムスクラクトンのＧＣ／ＭＳ分析。シス－１１－エイコセン酸（Ｃ２０：１ｃｉｓ－１１）由来のムスクラクトンのＧＭ／ＭＳ分析。

定義
「アルキル」という用語は、分岐または非分岐の、飽和非環式炭化水素基のラジカルを指す。特定の実施形態では、アルキルはＣ_３－３６アルキルである。特定の実施形態では、アルキルはＣ_{１０－３６}アルキルである。特定の実施形態では、アルキルはＣ_{１１－２７}アルキルである。特に断りのない限り、アルキルはＣ_３－２９アルキルである。

「アルケニル」という用語は、原子価が許す限り、１つ以上の炭素－炭素二重結合（Ｃ＝Ｃ結合；例えば、１、２、３、４、５、または６個のＣ＝Ｃ結合）を有する、分岐または非分岐の、非環式炭化水素基のラジカルを指す。アルケニル基において、

はＥ二重結合、

はＺ二重結合である。ＥまたはＺ二重結合が関与する他の状況は、当該技術分野で知られているとおりである。アルケニル基において、立体化学が特定されていないＣ＝Ｃ結合（例えば、－ＣＨ＝ＣＨ－または

は、ＥまたはＺ二重結合であり得る。特定の実施形態では、アルケニルはＣ_３－３６アルケニルである。特定の実施形態では、アルケニルはＣ_{１０－３６}アルケニルである。特定の実施形態では、アルケニルはＣ_{１１－２７}アルケニルである。特に断りのない限り、アルケニルはＣ_３－２９アルケニルである。

「アルキニル」という用語は、原子価が許す限り、１つ以上の炭素－炭素三重結合（Ｃ≡Ｃ結合；例えば、１、２、３、または４個の三重結合）を有する、分岐または非分岐の、非環式炭化水素基のラジカルを指す。特定の実施形態では、アルキニルはＣ_３－３６アルキニルである。特定の実施形態では、アルキニルはＣ_{１０－３６}アルキニルである。特定の実施形態では、アルキニルはＣ_{１１－２７}アルキニルである。特に断りのない限り、アルキニルはＣ_３－２９アルキニルである。

基に接尾辞「エン」を付けることは、その基が二価部分であることを示す。例えば、アルキレンは、アルキル（例えば、Ｃ_３－３６アルキル、Ｃ_{１０－３６}アルキル、Ｃ_{１１－２７}アルキル、またはＣ_３－２９アルキル）の二価部分であり、アルケニレンはアルケニル（例えば、Ｃ_３－３６アルケニル、Ｃ_{１０－３６}アルケニル、Ｃ_{１１－２７}アルケニル、またはＣ_３－２９アルケニル）の二価部分であり、アルキニレンはアルキニル（例えば、Ｃ_３－３６アルキニル、Ｃ_{１０－３６}アルキニル、Ｃ_{１１－２７}アルキニル、またはＣ_３－２９アルキニル）の二価部分である。

「脂肪酸」は、式：Ｒ^Ａ－Ｃ（＝Ｏ）ＯＨのカルボン酸であり、式中、Ｒ^Ａは、Ｃ_３－３６アルキル、Ｃ_３－３６アルケニル、またはＣ_３－３６アルキニル（例えば、Ｃ_３－２９アルキル、Ｃ_３－２９アルケニル、またはＣ_３－２９アルキニル）である。カルボキシル部分に最も遠いＲ^Ａ内の炭素原子（例えばＣ１）は、ω（オメガ）として標識される。Ｃ１の隣の炭素原子（例えばＣ２）はω－１と標識される。Ｃ２の隣にあり、Ｃ１ではない炭素原子（例えばＣ３）は、ω－２と標識される。Ｃ３の隣にあり、Ｃ２ではない炭素原子（例えばＣ４）は、ω－３と標識される。１５：０脂肪酸とは、炭素原子数が１５、Ｃ＝Ｃ及びＣ≡Ｃ結合の数が０である脂肪酸である。１６：０脂肪酸とは、炭素原子数が１６、Ｃ＝Ｃ及びＣ≡Ｃ結合の数が０である脂肪酸である。１６：１脂肪酸とは、炭素原子の数が１６、Ｃ＝Ｃ結合の数が１、Ｃ≡Ｃ結合の数がで０である脂肪酸である。１６：３脂肪酸とは、炭素原子の数が１６、Ｃ＝Ｃ結合の数が３、Ｃ≡Ｃ結合の数が０である脂肪酸である。１７：０脂肪酸とは、炭素原子の数が１７、Ｃ＝Ｃ及びＣ≡Ｃ結合の数が０である脂肪酸である。１８：０脂肪酸とは、炭素原子の数が１８、Ｃ＝Ｃ及びＣ≡Ｃ結合の数が０である脂肪酸である。１８：１脂肪酸とは、炭素原子の数が１８、Ｃ＝Ｃ結合の数が１、Ｃ≡Ｃ結合の数が０である脂肪酸である。１８：２脂肪酸とは、炭素原子の数が１８、Ｃ＝Ｃ結合の数が２、Ｃ≡Ｃの数が０である脂肪酸である。１８：３脂肪酸とは、炭素原子の数が１８、Ｃ＝Ｃ結合の数が３、Ｃ≡Ｃ結合の数が０である脂肪酸である。２０：３脂肪酸とは、炭素原子の数が２０、Ｃ＝Ｃ結合の数が３、Ｃ≡Ｃ結合の数が０である脂肪酸である。２０：４脂肪酸は、炭素原子の数が２０、Ｃ＝Ｃ結合の数が４、Ｃ≡Ｃ結合の数が０である脂肪酸である。他の脂肪酸もこの方法で命名できる。

「飽和脂肪酸」は、Ｒ^ＡがＣ_３－３６アルキル（例えば、Ｃ_３－２９アルキル）である脂肪酸である。

「不飽和脂肪酸」は、Ｒ^ＡがＣ_３－３６アルケニルまたはＣ_３－３６アルキニル（例えば、Ｃ_３－２９アルケニルまたはＣ_３－２９アルキニル）である脂肪酸である。

「ヒドロキシル」または「ヒドロキシ」という用語は、－ＯＨ基を指す。

「ヒドロキシル脂肪酸」、「ヒドロキシ脂肪酸」、または「ヒドロキシル化脂肪酸」は、１つ以上の水素原子がヒドロキシルで置換された脂肪酸である。いくつかの実施形態では、ヒドロキシル脂肪酸は、１つの水素原子がヒドロキシルで置換された脂肪酸（モノヒドロキシル脂肪酸）である。いくつかの実施形態では、ヒドロキシル脂肪酸は、１つを超える（例えば、２、３、またはそれ以上の）水素原子がヒドロキシルで置換された脂肪酸（ポリヒドロキシル脂肪酸）である。

「ラクトン」は、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－部分が単環の一部であり、単環式化合物の残りの部分がアルキレン、アルケニレン、またはアルキニレンである単環式化合物である。アルキレン、アルケニレン、またはアルキニレンが分岐している場合、ラクトンにはアルキレン、アルケニレン、またはアルキニレンの分岐（複数可）も含まれる。

「細胞系」とは、異所性タンパク質の発現を提供する任意の細胞である。これには、細菌、酵母、植物細胞、動物細胞が含まれる。これには、組換えタンパク質を発現するように改変され、適切な培地で培養される原核生物または真核生物の宿主細胞が含まれ得る。リボソームなどの細胞成分に基づくタンパク質のインビトロ発現も含まれる。

「コード配列」は、当業者にその通常かつ慣例的な意味が与えられるべきであり、特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を指すために限定なく使用される。

「細胞系の増殖」。増殖には、細胞の増殖と分裂を可能にして細胞培養物を形成する適切な培地を提供することが含まれる。これには、細胞または細胞成分が翻訳して組換えタンパク質を作成できるように供給源を提供することも含まれる。

「タンパク質発現」。タンパク質の産生は遺伝子発現後に発生し得る。ＤＮＡがメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に転写された後の段階で構成される。次いで、ｍＲＮＡはポリペプチド鎖に翻訳され、最終的にタンパク質にフォールディングされる。ＤＮＡまたはＲＮＡは、核酸を細胞に意図的に導入するプロセスであるトランスフェクションを通じて細胞内に存在し得る。この用語は、真核細胞における非ウイルス法によく使用される。また、他の方法や細胞型を指す場合もあるが、他の用語の方が好まれる。「形質転換」は、細菌、植物細胞を含む非動物の真核細胞における非ウイルスＤＮＡ移入を説明するためによく使用される。動物細胞では、形質転換がこれらの細胞におけるがん性状態（発がん）への進行を指すのにも使用されるため、トランスフェクションが好まれる用語である。形質導入は、ウイルスを介したＤＮＡ移入を説明するためによく使用される。形質転換、形質導入、及びウイルス感染は、この用途のトランスフェクションの定義に含まれる。

「酵母」。本開示によれば、酵母は、真菌界のメンバーとして分類される真核性の単細胞微生物である。酵母は、多細胞の祖先から進化したと考えられている単細胞生物である。

本明細書で使用されるとき、単数形「ａ、ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、その内容が別のものを明確に指示しない限り、複数の指示対象を包む。

「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「有する」などの用語が説明または特許請求の範囲で使用される限り、そのような用語は、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」が請求項の移行用語として使用される場合に解釈されるように、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語と同様に包括的であることが意図されている。

「例示的な」という言葉は、本明細書では「例、事例、または実例として機能する」という意味で使用される。本明細書で「例示的」として説明される任意の実施形態は、必ずしも他の実施形態より好ましいまたは有利であると解釈されるべきではない。

「相補的」という用語は、当業者にその通常の慣例的な意味が与えられるべきであり、互いにハイブリダイズできるヌクレオチド塩基間の関係を説明するために限定なく使用される。例えば、ＤＮＡに関しては、アデノシンはチミンに相補的であり、シトシンはグアニンに相補的である。したがって、本課題の技術には、添付の配列表に報告される完全な配列及びそれらの実質的に類似の核酸配列に相補的な単離された核酸断片も含まれる。

「核酸」及び「ヌクレオチド」という用語は、当業者にそれぞれの通常の慣用的な意味が与えられるべきであり、非限定的に、一本鎖または二本鎖の形態のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド及びそれらのポリマーを指すために使用される。特に限定しない限り、この用語は、参照核酸と同様の結合特性を有し、天然に存在するヌクレオチドと同様の様式で代謝される天然ヌクレオチドの既知の類似体を含む核酸を包含する。特に示されない限り、特定の核酸配列はまた、明示的に示された配列だけでなく、それらの保存的に改変されたバリアントまたは縮重バリアント（例えば、縮重コドン置換）、及び相補配列も暗示的に包含する。

「単離された」という用語は、当業者に通常の慣用的な意味が与えられるべきであり、単離された核酸または単離されたポリペプチドの文脈で使用される場合、人工的に本来の環境から離れて存在し、したがって自然の産物ではない、核酸またはポリペプチドを指すために非限定的に使用される。単離された核酸またはポリペプチドは、精製された形態で存在してもよいし、または例えばトランスジェニック宿主細胞などの非天然環境に存在してもよい。

本明細書で使用される場合、「インキュベートする」及び「インキュベーション」という用語は、２つ以上の化学的または生物学的な実体（化合物と酵素など）を混合し、δ－ラクトン組成物の生成に好ましい条件下でそれらを相互作用させるプロセスを意味する。

「縮重バリアント」という用語は、１つ以上の縮重コドン置換によって参照核酸配列とは異なる残基配列を有する核酸配列を指す。縮重コドン置換は、１つ以上の選択された（またはすべての）コドンの３番目の位置が混合塩基及び／またはデオキシイノシン残基で置換される配列を生成することによって達成できる。核酸配列とその縮重バリアントのすべては、同じアミノ酸またはポリペプチドを発現する。

「ポリペプチド」、「タンパク質」、及び「ペプチド」という用語には、当業者にとってそれぞれの通常の慣用的な意味が与えられるべきである。これら３つの用語はしばしば交換可能に使用され、そのサイズや機能に関係なく、アミノ酸のポリマーまたはアミノ酸類似体を指すために制限なく使用される。「タンパク質」は比較的大きなポリペプチドに関して使用されることが多く、「ペプチド」は小さなポリペプチドに関して使用されることが多いが、当該技術分野におけるこれらの用語の使用は重複しており、変動する。本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」という用語は、特に断りのない限り、ペプチド、ポリペプチド、及びタンパク質を指す。「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」という用語は、ポリアミノ酸生成物を指す場合に、本明細書で交換可能に使用される。したがって、例示的なポリペプチドには、ポリアミノ酸生成物、天然に存在するタンパク質、ホモログ、オルソログ、パラログ、断片、ならびに前述のものの他の等価物、バリアント、及び類似体が含まれる。

「ポリペプチド断片」及び「断片」という用語は、参照ポリペプチドに関して使用される場合、当業者に通常の慣用的な意味が与えられるべきであり、非限定的に、参照ポリペプチド自体と比較してアミノ酸残基が欠失しているが、残りのアミノ酸配列は典型的には、参照ポリペプチド内の対応する位置と同一であるポリペプチドを指すために使用される。このような欠失は、参照ポリペプチドのアミノ末端もしくはカルボキシ末端、またはその両方で起こり得る。

ポリペプチドまたはタンパク質の「機能的断片」という用語は、全長ポリペプチドまたはタンパク質の一部であり、全長ポリペプチドまたはタンパク質と実質的に同じ生物学的活性を有するか、または実質的に同じ機能を実行する（例えば、同じ酵素反応を実行する）ペプチド断片を指す。

「バリアントポリペプチド」、「改変されたアミノ酸配列」または「改変されたポリペプチド」という用語は、交換可能に使用され、参照ポリペプチドとは１つ以上のアミノ酸が異なる、例えば１つ以上のアミノ酸の置換、欠失、及び／または付加で異なる、アミノ酸配列を指す。一態様では、バリアントは、参照ポリペプチドの能力の一部またはすべてを保持する「機能的バリアント」である。

「機能的バリアント」という用語には、保存的置換バリアントもさらに含まれる。「保存的置換バリアント」という用語は、１つ以上の保存的アミノ酸置換によって参照ペプチドとは異なり、参照ペプチドの活性の一部またはすべてを維持するアミノ酸配列を有するペプチドを指す。「保存的アミノ酸置換」は、機能的に類似した残基によるアミノ酸残基の置換である。保存的置換の例には、イソロイシン、バリン、ロイシン、メチオニンなどの１つの非極性（疎水性）残基を別の残基に置換すること；アルギニンとリジンの間、グルタミンとアスパラギンの間、トレオニンとセリンの間など、ある荷電または極性（親水性）残基を別の残基に置換すること；リジンもしくはアルギニンなどの１つの塩基性残基を別の残基に置換すること；または、アスパラギン酸もしくはグルタミン酸などの１つの酸性残基を別の残基に置換すること；または、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファンなどの１つの芳香族残基を別の残基に置換することが含まれる。このような置換は、タンパク質またはポリペプチドの見かけの分子量または等電点にほとんどまたはまったく影響を及ぼさないと予想される。「保存的置換バリアント」という語句には、得られたペプチドが本明細書に記載の参照ペプチドの活性の一部またはすべてを維持するという条件で、残基が化学的に誘導体化された残基で置換されたペプチドも含まれる。

本課題の技術のポリペプチドに関連する「バリアント」という用語には、参照ポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、さらには１００％同一であるアミノ酸配列を有する機能的に活性なポリペプチドがさらに含まれる。

「相同な」という用語は、すべての文法的形式及び綴りのバリエーションにおいて、スーパーファミリー由来のポリヌクレオチドまたはポリペプチドと、異なる種由来の相同なポリヌクレオチドまたはタンパク質を含む、「共通の進化的起源」を有するポリヌクレオチドまたはポリペプチドの間の関係を指す（Ｒｅｅｃｋｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ５０：６６７，１９８７）。このようなポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、同一性パーセントまたは保存された位置での特定のアミノ酸もしくはモチーフの存在のいずれに関しても、それらの配列類似性に反映されるように、配列相同性を有する。例えば、２つの相同なポリペプチドは、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９００少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、さらには１００％同一である。

「適切な調節配列」は、当業者にその通常かつ慣例的な意味が与えられるべきであり、コード配列の上流（５’非コード配列）、内部、または下流（３’非コード配列）に位置し、関連するコード配列の転写、ＲＮＡプロセシング、もしくは安定性、または翻訳に影響を及ぼすヌクレオチド配列を指すのに非限定的に使用される。調節配列には、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、及びポリアデニル化認識配列が含まれ得る。

「プロモーター」は、当業者にその通常の慣用的な意味が与えられるべきであり、コード配列または機能的ＲＮＡの発現を制御することができるＤＮＡ配列を指すのに非限定的に使用される。一般に、コード配列はプロモーター配列の３’側に位置する。プロモーターは、その全体が天然遺伝子に由来し得るか、自然界に見出される異なるプロモーターに由来する異なるエレメントから構成され得るか、あるいは合成ＤＮＡセグメントを含むものでもあり得る。異なるプロモーターが、異なる組織または細胞型において、または異なる発生段階において、または異なる環境条件に応答して遺伝子の発現を指示し得ることは、当業者には理解される。ほとんどの細胞型でほとんどの場合に遺伝子の発現を引き起こすプロモーターは、一般に「構成的プロモーター」と呼ばれる。ほとんどの場合、調節配列の正確な境界が完全に定義されていないため、異なる長さのＤＮＡ断片が同一のプロモーター活性を有する可能性があることがさらに認識されている。

「作動可能に連結された」という用語は、一方の機能が他方の機能に影響されるような、単一の核酸断片上の核酸配列の結合を指す。例えば、プロモーターは、そのコード配列の発現に影響を及ぼすことができる場合（すなわち、コード配列がプロモーターの転写制御下にある場合）、コード配列と作動可能に連結されている。コード配列は、センス方向またはアンチセンス方向で制御配列に作動可能に連結することができる。

本明細書で使用される場合、「発現」という用語は、当業者にその通常かつ慣例的な意味が与えられるべきであり、非限定的に、本課題の技術の核酸断片に由来するセンス（ｍＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡの転写及び安定な蓄積を指すために使用される。本明細書で使用される場合、「過剰発現」は、正常な生物または非形質転換生物における産生のレベルを超える、遺伝子導入された生物または組換え生物における遺伝子産物の産生を指す。

「形質転換」は、当業者にその通常かつ慣例的な意味が与えられるべきであり、標的細胞によるさらなる発現のための標的細胞へのポリヌクレオチドの移入を指すために非限定的に使用される。移入されたポリヌクレオチドは、標的細胞のゲノムまたは染色体ＤＮＡに組み込まれて遺伝的に安定した遺伝をもたらすことができ、あるいは宿主染色体ＤＮＡとは独立して複製することもできる。形質転換された核酸断片を含む宿主生物は、「トランスジェニック」または「組換え」または「形質転換された」生物と呼ばれる。

「形質転換された」、「トランスジェニック」、及び「組換え」という用語は、宿主細胞と関連して本明細書で使用される場合、それぞれの通常の慣用的な意味が当業者に与えられるべきであり、異種核酸分子が導入された、植物または微生物細胞などの宿主生物の細胞を指すのに非限定的に使用される。核酸分子は宿主細胞のゲノムに安定して組み込まれることができ、または核酸分子は染色体外分子として存在することができる。このような染色体外分子は自動複製することができる。形質転換された細胞、組織、または対象は、形質転換プロセスの最終産物だけでなく、そのトランスジェニック子孫も包含すると理解される。

「組換え」、「異種」、及び「外来性」という用語は、ポリヌクレオチドに関連して本明細書で使用される場合、当業者に通常の慣用的な意味が与えられるべきであり、特定の宿主細胞にとって外来の供給源に由来する、または同じ供給源に由来する場合にはその元の形態から改変されたポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ配列または遺伝子）を指すのに非限定的に使用される。したがって、宿主細胞における異種遺伝子には、特定の宿主細胞にとって内在性であるが、例えば、部位特異的変異導入または他の組換え技術の使用を通じて改変された遺伝子が含まれる。この用語には、天然に存在するＤＮＡ配列の天然に存在しない複数のコピーも含まれる。したがって、これらの用語は、細胞にとって外来性もしくは異種であるか、または細胞に対して相同であるが、そのエレメントが通常見出されない宿主細胞内の位置または形態にあるＤＮＡセグメントを指す。

同様に、「組換え」、「異種」、及び「外来性」という用語は、ポリペプチドまたはアミノ酸配列に関連して本明細書で使用される場合、特定の宿主細胞にとって外来の供給源に由来するか、あるいは同じ供給源からのものであれば、元の形式から改変された、ポリペプチドまたはアミノ酸配列を意味する。したがって、組換えＤＮＡセグメントを宿主細胞内で発現させて、組換えポリペプチドを生成することができる。

「プラスミド」、「ベクター」、及び「カセット」という用語は、当業者にとってそれぞれの通常の慣用的な意味が与えられるべきであり、多くの場合、細胞の中心代謝の一部ではなく、通常は環状二本鎖ＤＮＡ分子の形態である遺伝子を保有する染色体外エレメントを指すのに非限定的に使用される。このようなエレメントは、任意の供給源に由来する一本鎖または二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡの自律的に複製する配列、ゲノム組み込み配列、ファージまたはヌクレオチド配列、直線状、または環状であり得、多くのヌクレオチド配列は、選択された遺伝子産物のプロモーター断片とＤＮＡ配列を、適切な３’非翻訳配列とともに細胞に導入できる独自の構築物に結合されているかまたは組換えられている。「形質転換カセット」とは、外来遺伝子を含み、外来遺伝子に加えて特定の宿主細胞の形質転換を促進するエレメントを有する特定のベクターを指す。「発現カセット」とは、外来遺伝子を含み、外来宿主におけるその遺伝子の発現の増強を可能にする外来遺伝子に加えてエレメントを有する特定のベクターを指す。

別途定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本開示の所属する技術分野における当業者によって一般に理解されるものと同一の意味を有する。本明細書に記載の方法及び物質と同様もしくは同等の任意の方法及び物質を本発明の実践または試験において使用することもできるが、好ましい方法及び物質は、以下に説明される。
発明を実施するための形態

本明細書では、いくつかの態様において、脂肪酸（例えば、直鎖脂肪酸）から大環状ラクトンなどのラクトンを生成するための方法（例えば、生合成方法）が提供される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法を使用して生成される大環状ラクトンなどのラクトンは、差別化されたムスキーノート（本明細書では「ムスクラクトン」または「ムスキーラクトン」とも呼ばれる）を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法を使用して生成される大環状ラクトンは、メチル、エチルまたはプロピルの側鎖を含む。いくつかの実施形態では、大環状ラクトンなどのラクトンは、本明細書に記載の方法を使用して、飽和脂肪酸（炭素－炭素二重結合を有しない）または不飽和脂肪酸（例えば、１つ以上の炭素－炭素二重結合を有する）から生成される。本明細書に記載されるように、ヒドロキシラーゼ活性を有するチトクロームＰ４５０酵素は、本明細書に記載される生合成方法の第１のステップ、すなわち、脂肪酸をω－１、ω－２、ω－３ヒドロキシル脂肪酸、またはそれらの組み合わせに変換することを実行することができる。本明細書に記載の生合成方法の第２のステップであるω－１、ω－２、ω－３ヒドロキシル脂肪酸のマクロラクトン化は、リパーゼによって実行することができる。

本開示の他の態様は、本明細書に記載の方法を使用して生成される、差別化されたムスキーノートを有する大環状ラクトンなどのラクトンを提供する。いくつかの実施形態では、本明細書で生成される大環状ラクトンなどのラクトンは、次式の１つ以上の化合物を含む：

いくつかの実施形態では、本明細書で生成される大環状ラクトンなどのラクトンは、以下の構造を含む：

ラクトンを生成するための生合成方法
本明細書に記載の生合成方法は、大環状ラクトン（例えば、差別化されたムスキーノートを有する大環状ラクトン）などのラクトンの酵素的生成のための基質として脂肪酸（例えば、直鎖脂肪酸）を利用する。本明細書に記載の方法は、２つの酵素変換ステップを含む。第１のステップでは、脂肪酸は、ヒドロキシラーゼ活性を有するシトクロムＰ４５０酵素またはその機能的バリアントによって、ω－１、ω－２、またはω－３の位置でヒドロキシル化され、ヒドロキシル脂肪酸（例えば、ω－１ヒドロキシル脂肪酸、ω－２ヒドロキシル脂肪酸、ω－３ヒドロキシル脂肪酸、及びそれらの組み合わせ））が生成される。第２のステップでは、ヒドロキシル脂肪酸をリパーゼ（例えば、Ｎｏｖｏｚｙｍｅ４３５）により大環状化して、メチル、エチル、またはプロピルの側鎖を有する大環状ラクトンなどのラクトンを生成する。特定の理論に束縛されるものではないが、大環状環もしくは側鎖のいずれか、またはその両方の部分が、工業用途に有用なムスキーノートを与えると考えられている。本明細書に記載の方法を使用して生成され、ムスキーノートを有する大環状ラクトンなどのラクトンは、「ムスクラクトン」と呼ばれる。

いくつかの実施形態では、ラクトン（例えば、大環状ラクトン）を生成する生合成方法は：
（ｉ）１つ以上の脂肪酸、シトクロムＰ４５０ヒドロキシラーゼ、及びＮＡＤＰＨを含む第１の反応混合物を調製することと；
（ｉｉ）第１の反応混合物を十分な時間インキュベートして、ω－１ヒドロキシル脂肪酸、ω－２ヒドロキシル脂肪酸、ω－３ヒドロキシル脂肪酸、及びそれらの組み合わせから選択されるヒドロキシル脂肪酸を生成することと；
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）で生成されたヒドロキシル脂肪酸及びリパーゼを含む第２の反応混合物を調製することと；
（ｉｖ）第２の反応混合物を、ムスクラクトンを生成するのに十分な時間インキュベートすることと、
を含む。

第１の反応混合物では、脂肪酸は、ＮＡＤＰＨの存在下でシトクロムＰ４５０ヒドロキシラーゼによってヒドロキシル脂肪酸に変換できる基質である。いくつかの実施形態では、ステップ（ｉ）の第１の反応混合物中の１つ以上の脂肪酸は、少なくとも１２個の炭素（例えば、少なくとも１２個の炭素、少なくとも１３個の炭素、少なくとも１４個の炭素、少なくとも１５個の炭素、少なくとも１６個の炭素、少なくとも１７個の炭素、少なくとも１８個の炭素、少なくとも１９個の炭素、少なくとも２０個の炭素、または少なくとも２５個の炭素）を含む直鎖脂肪酸を含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｉ）の第１の反応混合物中の１つ以上の脂肪酸は、１２～２８（１２～２８、１２～２５、１２～２０、１２～１５、１５～２８、１５～２５、１５～２０、２０～２８、２０～２５、または２５～２８）個の炭素を含む直鎖脂肪酸を含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｉ）の第１の反応混合物中の１つ以上の脂肪酸は、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、または２８個の炭素、またはそれらの組み合わせを含む直鎖脂肪酸を含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｉ）の第１の反応混合物中の１つ以上の脂肪酸は、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の炭素、またはそれらの組み合わせを含む直鎖脂肪酸を含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｉ）の第１の反応混合物中の１つ以上の脂肪酸は、異なる数の炭素を含む直鎖脂肪酸の混合物、例えば、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の炭素を含む脂肪酸の混合物を含む。

いくつかの実施形態では、ステップ（ｉ）の第１の反応混合物中の１つ以上の脂肪酸は、飽和脂肪酸を含む（すなわち、任意の２つの炭素間に二重結合がない）。いくつかの実施形態では、ステップ（ｉ）の第１の反応混合物中の１つ以上の脂肪酸は、不飽和脂肪酸を含む。いくつかの実施形態では、不飽和脂肪酸は、少なくとも１個（例えば、１、２、３、４、５個、またはそれ以上）の二重結合を含む。いくつかの実施形態では、不飽和脂肪酸は、少なくとも１個（例えば、１、２、３、４、５個、またはそれ以上）のＺ二重結合を含む。

いくつかの実施形態では、ステップ（ｉ）の第１の反応混合物中の１つ以上の脂肪酸は、以下からなる群から選択される：

及びそれらの組み合わせ。

及びそれらの組み合わせ。

及びそれらの組み合わせ。

第１の反応混合物中の脂肪酸基質をヒドロキシル化する酵素は、ヒドロキシラーゼ活性を有するシトクロムＰ４５０酵素（本明細書では「シトクロムＰ４５０ヒドロキシラーゼ」と呼ぶ）、またはその機能的バリアントである。いくつかの実施形態では、シトクロムＰ４５０ヒドロキシラーゼは細菌性シトクロムＰ４５０酵素である。本開示に従って使用され得るシトクロムＰ４５０酵素の例としては、非限定的に、Ｂａｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ由来のＣＹＰ１０２Ａ１；ＢａｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍＤＳＭ３１９由来のＣＹＰ１０６Ａ１；Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍＡＴＣＣ１３３６８由来のＣＹＰ１０６Ａ２；Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ１６８由来のＣＹＰ１０９Ｂ１；Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍＤＳＭ１９由来のＣＹＰ１０９Ｅ１；ＮｏｃａｒｄｉａｆａｒｃｉｎｉｃａＩＦＭ１０１５２由来のＣＹＰ１５４Ｃ５；ＳｏｒａｎｇｉｕｍｃｅｌｌｕｌｏｓｕｍＳｏｃｅ５６由来のＣＹＰ２６０Ａ１及びＣＹＰ２６０Ｂ１；ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｇｒｉｓｅｕｓＳＧＲ１０８５由来のＣＹＰ１５４Ｃ３；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｓｐ．Ｗ２２３３－ＳＭ由来のＣＹＰ１５４Ｃ８、及びＮｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍａｒｏｍａｔｉｃｉｖｏｒａｎｓＤＳＭ１２４４４（ｓａｒｏ０３０７）由来のＣＹＰ２１９Ａ、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｇｒｉｓｅｏｌｕｓＡＴＣＣ１１７９６由来のＣＹＰ１０５Ａ１、Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａｇｒｉｓｅｏｒｕｂｉｄａ由来のＣＹＰ１０７Ｅ１、ＭｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍｌｏｔｉＭＡＦＦ３０３０９９（ｍｌｒ５８７６）由来のＣＹＰ１０７Ｄ１及びＣＹＰ１２７Ａ３、Ｎｏｓｔｏｃｓｐ．ＰＣＣ７１２０由来のＣＹＰ１１０Ａ１、ＣＹＰ１１０Ｃ１、ＣＹＰ１１０Ｄ１、及びＣＹＰ１１０Ｅ１；ＢｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍｊａｐｏｎｉｃｕｍＵＳＤＡ１１０由来のＣＹＰ２００Ａ１；極性Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．ＰＡＭＣ２５０３４及びＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．ＰＡＭＣ２２７２４のそれぞれ由来のＣＹＰ１０２Ａ１５及びＣＹＰ１０２Ａ１７０；小麦（Ｔｒｉｔｉｃｕｍａｅｓｔｉｖｕｍ）由来のＣＹＰ７０９Ｃ１；Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｍａｒｉｎｕｍ由来のＣＹＰ１４７Ｇ１；白色腐朽菌Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ由来のＣＹＰ５０５Ｄ６；ならびにＢａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓＤＳＭ７由来のＣＹＰ１０２ファミリー酵素（ｂａｍｆ２５２２及びｂａｍｆ０６９５）が挙げられる。

本明細書では、Ｂａｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ由来のシトクロムＰ４５０酵素（ＣＹＰ１０２Ａ１、例えば、Ｍｉｕｒａｅｔａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．３８８：３０５－３１７，１９７５に記載されるようなもの、参照により本明細書に組み込まれる）、及びＭｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅ由来のシトクロムＰ４５０酵素（ＣＹＰ５０５Ａ３０、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号：Ｇ２ＱＤＺ３）は、本明細書に記載される生合成方法の第１のステップを実行することができ、すなわち、脂肪酸を、ω－１、ω－２、またはω－３の位置のうちの１つでヒドロキシル化されたモノヒドロキシル脂肪酸、またはそれらのモノヒドロキシル脂肪酸の組み合わせに変換できることが示された。ＣＹＰ１０２Ａ１のアミノ酸配列は配列番号１として提供される。ＣＹＰ５０５Ａ３０のアミノ酸配列は配列番号３として提供される。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の生合成方法で使用されるシトクロムＰ４５０ヒドロキシラーゼは、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも７０％（例えば、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％）同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の生合成方法で使用されるシトクロムＰ４５０ヒドロキシラーゼは、配列番号１のアミノ酸と７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の生合成方法に使用されるシトクロムＰ４５０ヒドロキシラーゼは、配列番号１のアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の生合成方法で使用されるシトクロムＰ４５０ヒドロキシラーゼは、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも７０％（例えば、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％）同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の生合成方法で使用されるシトクロムＰ４５０ヒドロキシラーゼは、配列番号３のアミノ酸配列と７０％、７５％、８０％、８５％９０％、９５％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の生合成方法に使用されるシトクロムＰ４５０ヒドロキシラーゼは、配列番号３のアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、ステップ（ｉ）の第１の反応混合物は、例えば、単離された組換え生産されたシトクロムＰ４５０ヒドロキシラーゼを使用するインビトロ反応混合物である。いくつかの実施形態では、ステップ（ｉ）の第１の反応混合物は細胞ベースの反応混合物である。いくつかの実施形態では、細胞ベースの反応混合物は、酵母、植物、藻類、真菌、及び細菌からなる群から選択される細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞ベースの反応混合物はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ；Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ；Ｂａｃｉｌｌｕｓ；Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ；Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ；Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ；Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ；Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ；Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ；Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ；Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉａ；Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ；Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ；Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ；Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ；Ｐａｎｔｏｅａ；Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ；Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ；及びＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍからなる群から選択される属の細菌細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞ベースの反応混合物は、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞ベースの反応混合物は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ；Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ；Ｃａｎｄｉｄａ；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ；Ｈａｎｓｅｎｕｌａ；Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ；Ｍｕｃｏｒ；Ｐｉｃｈｉａ；Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ；Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ；及びＡｒｔｈｒｏｂｏｔｌｙｓからなる群から選択される属の真菌を含む。

いくつかの実施形態では、細胞ベースの反応混合物で使用される細胞は、シトクロムＰ４５０ヒドロキシラーゼを組換え発現する。例えば、細胞ベースの反応混合物で使用される細胞は、シトクロムＰ４５０ヒドロキシラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子（例えば、発現ベクターなどのベクター）で形質転換され得る。いくつかの実施形態では、シトクロムＰ４５０ヒドロキシラーゼをコードするヌクレオチド配列は、プロモーター（例えば、誘導性プロモーターまたは構成的プロモーター）に作動可能に連結される。形質転換細胞は、シトクロムＰ４５０ヒドロキシラーゼの発現を可能にする条件下で培養できる。発現されたシトクロムＰ４５０ヒドロキシラーゼを含む細胞を収集し、細胞ベースの反応混合物に使用できる。ＣＹＰ１０２Ａ１（配列番号１）をコードするヌクレオチド配列は、配列番号２として提供される。ＣＹＰ５０５Ａ３０（配列番号３）をコードするヌクレオチド配列は、配列番号４として提供される。

いくつかの実施形態では、細胞ベースの反応混合物で使用される細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉまたはＢａｃｉｌｌｕｓ細胞などの細菌細胞）は、配列番号２または配列番号４のヌクレオチド配列と少なくとも７０％（例えば、７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％）であるヌクレオチド配列を含む核酸分子で形質転換される。いくつかの実施形態では、細胞ベースの反応混合物で使用される細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉまたはＢａｃｉｌｌｕｓ細胞などの細菌細胞）は、配列番号２または配列番号４のヌクレオチド配列と７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％であるヌクレオチド配列を含む核酸分子で形質転換される。いくつかの実施形態では、細胞ベースの反応混合物で使用される細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉまたはＢａｃｉｌｌｕｓ細胞などの細菌細胞）は、配列番号２または配列番号４のヌクレオチド配列を含む核酸分子で形質転換される。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される生合成方法のステップ（ｉｉ）において、第１の反応混合物は、ヒドロキシル脂肪酸を生成するのに十分な時間インキュベートされる。いくつかの実施形態では、第１の反応混合物は少なくとも１時間（例えば、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも５時間、少なくとも１０時間、またはそれ以上）インキュベートされる。いくつかの実施形態では、インキュベーションは３７℃未満である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の生合成方法のステップ（ｉｉ）で生成されるヒドロキシル脂肪酸は、ω－１、ω－２、またはω－３の位置のうちのいずれか１つでヒドロキシル化されたモノヒドロキシル脂肪酸である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される生合成方法のステップ（ｉｉ）で生成されるヒドロキシル脂肪酸は、ω－１ヒドロキシル脂肪酸、ω－２ヒドロキシル脂肪酸、ω－３ヒドロキシル脂肪酸、及びそれらの組み合わせ、及びそれらの任意の組み合わせを含む。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の生合成方法のステップ（ｉｉ）は、反応混合物からヒドロキシル脂肪酸を単離することをさらに含む。任意の適切な抽出方法を使用することができる。例えば、ヒドロキシル脂肪酸は、炭化水素系有機溶媒（例えば、ヘキサン）と非水溶性極性溶媒（例えば、酢酸エチル）の混合物を使用する液液抽出によって抽出することができる。

ステップ（ｉｉ）で生成されたヒドロキシル脂肪酸は、リパーゼによって触媒されるマクロラクトン化を介してラクトンにさらに変換することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される生合成方法のステップ（ｉｉｉ）として、第２の反応混合物が調製され、第２の反応混合物は、ステップ（ｉｉ）で生成されたヒドロキシル脂肪酸及びリパーゼを含む。当業者は、この反応に使用するのに適したリパーゼを同定することができる。いくつかの実施形態では、第２の反応混合物で使用されるリパーゼは、Ｃａｎｄｉｄａａｎｔａｒｃｔｉｃａ由来のリパーゼＢ（Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号：Ｐ４１３６５）である。Ｃａｎｄｉｄａａｎｔａｒｃｔｉｃａ由来のリパーゼＢのアミノ酸配列は、配列番号５として提供される。この点に関して、Ｋｒｉｓｈｎａｅｔａｌ．（ＣａｔａｌｙｓｉｓＲｅｖｉｅｗｓ，Ｖｏｌ．４４，ｐｐ．４９９－５９１，２００２）は、有機溶媒中でのリパーゼ触媒によるエステル化の概要を提供する。それぞれのリパーゼをさまざまな溶媒で試験して、ムスクラクトンを生成するヒドロキシ脂肪酸のラクトン化に最適な組み合わせを同定できる。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の生合成方法で使用されるリパーゼは、配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも７０％（例えば、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％）同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の生合成方法で使用されるリパーゼは、配列番号５のアミノ酸配列と７０％、７５％、８０％、８５％９０％、９５％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の生合成方法に使用されるリパーゼは、配列番号５のアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の生合成方法のステップ（ｉｉｉ）における第２の反応混合物で使用されるリパーゼは、固体支持体（例えば、アクリル樹脂）上に固定化される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される生合成方法のステップ（ｉｉｉ）における第２の反応混合物で使用されるリパーゼは、Ｎｏｖｏｚｙｍｅ４３５（アクリル樹脂上に固定化されたＣａｎｄｉｄａａｎｔａｒｃｔｉｃａ由来のリパーゼＢ、Ｓｉｇｍａから入手可能、カタログ番号Ｌ４７７７）である。いくつかの実施形態では、第２の反応混合物は溶媒をさらに含む。任意の適切な溶媒を使用することができる。いくつかの実施形態では、溶媒は、トルエンまたはジクロロエタンである。

いくつかの実施形態では、第２の反応混合物において、ヒドロキシル脂肪酸は、０．０２～０．１Ｍ（例えば、０．０２Ｍ、０．０３Ｍ、０．０４Ｍ、０．０５Ｍ、０．０６Ｍ、０．０７Ｍ、０．０８Ｍ、０．０９Ｍ、または０．１Ｍ）の総濃度である。いくつかの実施形態では、第２の反応混合物において、ヒドロキシル脂肪酸は、０．０２５～０．０５Ｍ（例えば、０．０２５Ｍ、０．０３Ｍ、０．０３５Ｍ、０．０４Ｍ、０．０４５Ｍ、または０．０５Ｍ）の総濃度である。いくつかの実施形態では、第２の反応混合物において、リパーゼは２０～１５０ｇ／Ｌ（例えば、２０～１５０ｇ／Ｌ、２０～１００ｇ／Ｌ、２０～５０ｇ／Ｌ、５０～１５０ｇ／Ｌ、５０～１００ｇ／Ｌ、または１００～１５０ｇ／Ｌ）の濃度である。いくつかの実施形態では、第２の反応混合物において、リパーゼは５０～１００ｇ／Ｌ（例えば、５０ｇ／Ｌ、６０ｇ／Ｌ、７０ｇ／Ｌ、８０ｇ／Ｌ、９０ｇ／Ｌ、または１００ｇ／Ｌ）の濃度である。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される生合成方法のステップ（ｉｖ）として、第２の反応混合物が、ヒドロキシル脂肪酸を生成するのに十分な時間インキュベートされる。いくつかの実施形態では、第２の反応混合物は少なくとも１０時間（例えば、少なくとも１０時間、少なくとも１５時間、少なくとも２０時間、少なくとも２４時間、またはそれ以上）インキュベートされる。いくつかの実施形態では、第２の反応混合物は、１５～２４時間（例えば、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４時間）インキュベートされる。いくつかの実施形態では、インキュベーションは４０～６０℃未満（例えば、４０～６０℃、４０～５５℃、４０～５０℃、４０～４５℃、４５～６０℃、４５～５５℃、５０～６０℃、５０～５５℃、または５５～６０℃）である。いくつかの実施形態では、インキュベーションは４０℃、４５℃、５０℃、５５℃、または６０℃未満である。

いくつかの実施形態では、第２の反応混合物のインキュベーションに続いて、ステップ（ｉｖ）は、反応混合物からラクトン化合物を単離することをさらに含む。反応混合物からラクトン化合物を単離する既知の方法を使用することができ、これには濾過及び／またはクロマトグラフィー法が挙げられるがこれらに限定されない。いくつかの実施形態では、単離されたラクトン化合物は乾燥することに供される。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される生合成方法によって生成されるラクトン化合物は、少なくとも５０％ｗ／ｗ（例えば、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％（ｗ／ｗ））の純度を有する。純度は、生成されるすべてのラクトン化合物に関係し、いくつかの実施形態では、異なる構造のラクトン化合物を含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｉｖ）で生成されるラクトン化合物はムスクノートを有する。

ラクトン
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の生合成方法を使用して生成されるラクトン（例えば、大環状ラクトン）は、次式の１つ以上の化合物を含む：

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の生合成方法を使用して生成されるラクトン（例えば、大環状ラクトン）は、次式の１つ以上の化合物を含む：

特定の実施形態では、Ｒはメチルである。特定の実施形態では、Ｒはエチルである。特定の実施形態では、Ｒはｎ－プロピルである。

特定の実施形態では、それぞれの

は単結合である。特定の実施形態では、少なくとも１つ（例えば、１、２、３、または４つ）の

は、ＥまたはＺ二重結合である。特定の実施形態では、少なくとも１つ（例えば、１、２、３、または４つ）の

は、Ｅ二重結合である。特定の実施形態では、少なくとも１つ（例えば、１、２、３、または４つ）の

は、Ｚ二重結合である。特定の実施形態では、それぞれの

は独立して、単結合、Ｅ二重結合、またはＺ二重結合である。特定の実施形態では、それぞれの

は独立して、単結合またはＺ二重結合である。特定の実施形態では、１つの

はＺ二重結合であり、残りのそれぞれの

は単結合である。特定の実施形態では、２つの

はＺ二重結合であり、残りのそれぞれの

は単結合である。特定の実施形態では、３つの

はＺ二重結合であり、残りのそれぞれの

は単結合である。特定の実施形態では、４つの

はＺ二重結合であり、残りのそれぞれの

は単結合である。特定の実施形態では、少なくとも１つ（例えば、１つ、２つ、または３つ）の

が三重結合である。特定の実施形態では、任意の２つの隣接する

のうちの少なくとも１つは単結合である。

特定の実施形態では、１つの

は、ＥまたはＺ二重結合であり、残りの

は単結合である。特定の実施形態では、２つの

は独立してＥまたはＺ二重結合であり、残りの

は単結合である。特定の実施形態では、３つの

は独立してＥまたはＺ二重結合であり、残りの

は単結合である。特定の実施形態では、４つの

は独立してＥまたはＺ二重結合であり、残りの

は単結合である。特定の実施形態では、それぞれの二重結合は、存在する場合、Ｚ二重結合である。特定の実施形態では、それぞれの二重結合は、存在する場合、Ｅ二重結合である。特定の実施形態では、ラクトンは、Ｃ＝Ｃ＝Ｃ、Ｃ＝Ｃ≡Ｃ、及びＣ≡Ｃ＝Ｃのいずれも含まない。

特定の実施形態では、ｋは６である。特定の実施形態では、ｋは７である。特定の実施形態では、ｋは８である。特定の実施形態では、ｋは９である。特定の実施形態では、ｋは１０である。特定の実施形態では、ｋは１１である。特定の実施形態では、ｋは１２である。特定の実施形態では、ｋは１３である。特定の実施形態では、ｋは１４である。特定の実施形態では、ｋは１５である。特定の実施形態では、ｋは１６である。特定の実施形態では、ｋは、８、９、１０、１１、１２、１３、または１５である。特定の実施形態では、ｋは、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５である。特定の実施形態では、ｋは１７と２０の間の整数である（両端を含む）。特定の実施形態では、ｋは２１と２５の間の整数である（両端を含む）。特定の実施形態では、ｋは２６と３０の間の整数である（両端を含む）。

特定の実施形態では、ｎは６である。特定の実施形態では、ｎは７である。特定の実施形態では、ｎは８である。特定の実施形態では、ｎは９である。特定の実施形態では、ｎは１０である。特定の実施形態では、ｎは１１である。特定の実施形態では、ｎは１２である。特定の実施形態では、ｎは１３である。特定の実施形態では、ｎは１４である。特定の実施形態では、ｎは、１５、１６、１７、１８、１９、または２０である。特定の実施形態では、ｎは７と１４の間の整数である（両端を含む）。

特定の実施形態では、本明細書に記載の生合成方法を使用して生成されるラクトンは、式：

において＊で標識された炭素原子であるキラル炭素原子を含む。特定の実施形態では、本明細書に記載の生合成方法を使用して生成されるラクトンは、式：

において＊で標識された炭素原子であるキラル炭素原子を含む。特定の実施形態では、キラル炭素原子はＳ配置である。特定の実施形態では、キラル炭素原子はＲ配置である。

特定の実施形態では、本明細書に記載の生合成方法を使用して生成されるラクトンは、ラクトンの混合物である。特定の実施形態では、本明細書に記載される生合成方法を使用して生成されるラクトンは、存在する場合には、Ｒ／Ｓ配置の違いが無視される場合、異なるｎ値及び異なるＲ部分を有する（例えば、２つまたは３つの）ラクトンの混合物である。特定の実施形態では、本明細書に記載の生合成方法を使用して生成されるラクトンは、同じＲ／Ｓ配置を有するが、異なるｎ値及び異なるＲ部分を有するラクトンの混合物である。特定の実施形態では、本明細書に記載の生合成方法を使用して生成されるラクトンは、異なるＲ／Ｓ配置を有するが、同じｎ値及び同じＲ部分を有するラクトンの混合物である。特定の実施形態では、本明細書に記載の生合成方法を使用して生成されるラクトンは、異なるＲ／Ｓ配置を有し、異なるｎ値を有し、異なるＲ部分を有するラクトンの混合物である。特定の実施形態では、本明細書に記載の生合成方法を使用して生成されるラクトンは、実質的に（例えば、モルで、９０％～９５％、９５％～９７％、９７％～９９％の間、または９９％～９９．９％の間（両端を含む））のラクトンのラセミ混合物である。

特定の実施形態では、本明細書に記載の生合成方法を使用して生成されるラクトンは、実質的に（例えば、モルで、９０％～９５％、９５％～９７％、９７％～９９％の間、または９９％～９９．９％の間（両端を含む））１種類のラクトンである（例えば、１種類のラクトンの反対のエナンチオマーを含む、他の種類のラクトンを実質的に含まない）。特定の実施形態では、本明細書に記載の生合成方法を使用して生成されるラクトンは、実質的に（モルで、９０％～９５％、９５％～９７％、９７％～９９％の間、または９９％～９９．９％の間（両端を含む））互いに反対のエナンチオマーである２種類のラクトンである（例えば、他の種類のラクトンを実質的に含まない）。

を含み、ステップ（ｉｖ）で生成されるラクトンは、

及びそれらの組み合わせを含む。

を含み、ステップ（ｉｖ）で生成されるラクトンは、

及びそれらの組み合わせを含む。

を含み、ステップ（ｉｖ）で生成されるラクトンは、

及びそれらの組み合わせを含む。

を含み、ステップ（ｉｖ）で生成されるラクトンは、

及びそれらの組み合わせを含む。

を含み、ステップ（ｉｖ）で生成されるラクトンは、

及びそれらの組み合わせを含む。

を含み、ステップ（ｉｖ）で生成されるラクトンは、

及びそれらの組み合わせを含む。

いくつかの実施形態では、ステップ（ｉ）の第２の反応混合物で基質として使用される１つ以上の脂肪酸は、

を含み、ステップ（ｉｖ）で生成されるラクトンは、

及びそれらの組み合わせを含む。

いくつかの実施形態では、ステップ（ｉ）の第４の反応混合物で基質として使用される１つ以上の脂肪酸は、

を含み、ステップ（ｉｖ）で生成されるラクトンは、

及びそれらの組み合わせを含む。

を含み、ステップ（ｉｖ）で生成されるラクトンは、

を含む。

を含み、ステップ（ｉｖ）で生成されるラクトンは、

及びそれらの組み合わせを含む。

を含み、ステップ（ｉｖ）で生成されるラクトンは、

及びそれらの組み合わせを含む。

を含み、ステップ（ｉｖ）で生成されるラクトンは、

及びそれらの組み合わせを含む。

を含み、ステップ（ｉｖ）で生成されるラクトンは、

及びそれらの組み合わせを含む。

を含み、ステップ（ｉｖ）で生成されるラクトンは、

を含む。

を含み、ステップ（ｉｖ）で生成されるラクトンは、

及びそれらの組み合わせを含む。

を含み、ステップ（ｉｖ）で生成されるラクトンは、

及びそれらの組み合わせを含む。

を含み、ステップ（ｉｖ）で生成されるラクトンは、

及びそれらの組み合わせを含む。

を含み、ステップ（ｉｖ）で生成されるラクトンは、

及びそれらの組み合わせを含む。

を含み、ステップ（ｉｖ）で生成されるラクトンは、

及びそれらの組み合わせを含む。

を含み、ステップ（ｉｖ）で生成されるラクトンは、

及びそれらの組み合わせを含む。

を含み、ステップ（ｉｖ）で生成されるラクトンは、

及びそれらの組み合わせを含む。

を含み、ステップ（ｉｖ）で生成されるラクトンは、

及びそれらの組み合わせを含む。

を含み、ステップ（ｉｖ）で生成されるラクトンは、

及びそれらの組み合わせを含む。

を含み、ステップ（ｉｖ）で生成されるラクトンは、

及びそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される生合成方法を使用して生成されるラクトンは、表１に提供されるラクトンのうちの任意の１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４）を含む。本明細書に提供される生合成方法を使用して生成されるラクトンは、表２に提供されるラクトンのうちの任意の１つ以上（例えば、２５、２６、２７、２８、２９、３０、または３１）を含む。

本開示の他の態様は、次式の新規のラクトンを提供する：

本開示の他の態様は、次式の新規のラクトンを提供する：

特定の実施形態では、新規のラクトンは次式のものである：

特定の実施形態では、それぞれの

は単結合である。特定の実施形態では、１つの

は、Ｚ二重結合であり、残りの

は単結合である。特定の実施形態では、２つの

はＺ二重結合であり、残りの

は単結合である。特定の実施形態では、４つの

はＺ二重結合であり、残りの

は単結合である。

特定の実施形態では、１つの

は、ＥまたはＺ二重結合であり、残りの

は単結合である。特定の実施形態では、２つの

は独立してＥまたはＺ二重結合であり、残りの

は単結合である。特定の実施形態では、３つの

は独立してＥまたはＺ二重結合であり、残りの

は単結合である。特定の実施形態では、４つの

は独立してＥまたはＺ二重結合であり、残りの

変数ｋは本明細書で記載したとおりである。

特定の実施形態では、ｍは４である。特定の実施形態では、ｍは５である。特定の実施形態では、ｍは６である。特定の実施形態では、ｍは７である。特定の実施形態では、ｍは８である。特定の実施形態では、ｍは９である。特定の実施形態では、ｍは１０である。特定な実施形態では、ｍは１１である。

特定の実施形態では、新規のラクトンのキラル炭素原子はＳ配置である。特定の実施形態では、新規のラクトンのキラル炭素原子はＲ配置である。

本開示の別の態様は、２つ以上の新規ラクトンの混合物を提供する。特定の実施形態では、２つ以上の新規ラクトンの混合物は、

の反対のエナンチオマーの混合物である。特定の実施形態では、２つ以上の新規ラクトンの混合物は、

の反対のエナンチオマー、

の反対のエナンチオマー、及び

の反対のエナンチオマー、及び

の反対のエナンチオマー、及び

の反対のエナンチオマー、

の反対のエナンチオマー、及び

の反対のエナンチオマーの混合物である。

特定の実施形態では、２つ以上の新規ラクトンの混合物は、
の反対のエナンチオマーの混合物である。特定の実施形態では、２つ以上の新規ラクトンの混合物は、

の反対のエナンチオマー、及び

の反対のエナンチオマー、

の反対のエナンチオマー、及び

の反対のエナンチオマー、

の反対のエナンチオマー、及び

の反対のエナンチオマー、

の反対のエナンチオマー、及び

の反対のエナンチオマー、

の反対のエナンチオマー、及び

の反対のエナンチオマー、

の反対のエナンチオマー、及び

の反対のエナンチオマー、

の反対のエナンチオマー、及び

の反対のエナンチオマー、

の反対のエナンチオマー、及び

の反対のエナンチオマー、

の反対のエナンチオマー、及び

の反対のエナンチオマー、

の反対のエナンチオマー、及び

の反対のエナンチオマー、

の反対のエナンチオマー、及び

の反対のエナンチオマー、

の反対のエナンチオマー、及び

の反対のエナンチオマー、

の反対のエナンチオマー、及び

の反対のエナンチオマー、

の反対のエナンチオマー、及び

の反対のエナンチオマーの混合物である。

合成生物学
本明細書で使用される標準的な組換えＤＮＡ及び分子クローニング技術は当該技術分野で周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，２ｎｄｅｄ．；ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ：ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９（以下「Ｍａｎｉａｔｉｓ」）によって、及びＳｉｌｈａｖｙ，Ｔ．Ｊ．，Ｂｅｎｎａｎ，Ｍ．Ｌ．ａｎｄＥｎｑｕｉｓｔ，Ｌ．Ｗ．ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓｗｉｔｈＧｅｎｅＦｕｓｉｏｎｓ；ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ：ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８４によって；及びＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔａｌ．，ＩｎＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄｂｙＧｒｅｅｎｅＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇａｎｄＷｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，１９８７によって記載される（それぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる）。

別途定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本開示の所属する技術分野における当業者によって一般に理解されるものと同一の意味を有する。本明細書に記載の方法及び物質と同様もしくは同等の任意の方法及び物質を本発明の実践または試験において使用することもできるが、好ましい物質及び方法は、以下に説明される。

本開示は、以下の非限定的な実施例によりさらに理解される。これらの実施例は、本課題の技術の好ましい実施形態を示すが、例示としてのみ提供されることが理解されるべきである。上述の説明及びこれらの実施例から、当業者であれば、本課題の技術の本質的な特徴を確認することができ、その趣旨及び範囲を逸脱することなく、種々の用途及び状況に適合するように、本課題の技術に種々の変更及び修正を行うことができる。

細菌生産システム
原核生物におけるタンパク質の発現は、ほとんどの場合、融合タンパク質または非融合タンパク質の発現を指示する構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターを含むベクターによって細菌宿主細胞内で行われる。融合ベクターは、その中にコードされているタンパク質、通常は組換えタンパク質のアミノ末端に多数のアミノ酸を付加する。このような融合ベクターは通常、次の３つの目的に役立つ：（ｌ）組換えタンパク質の発現を増加させること；（２）組換えタンパク質の溶解度を高めること；（３）アフィニティー精製においてリガンドとして作用することにより、組換えタンパク質の精製を補助すること。多くの場合、融合タンパク質の精製後に融合部分から組換えタンパク質を分離できるように、融合部分と組換えタンパク質との接合部にタンパク質分解切断部位が導入される。他の変形もまた本開示の範囲内である。

一実施形態では、発現ベクターは、細菌細胞における組換えポリペプチドの発現のための遺伝的エレメントを含む。細菌細胞における転写及び翻訳のためのエレメントには、プロモーター、タンパク質複合体のコード領域、及び転写ターミネーターが含まれ得る。この概念実証作業では、標準的なＥ．ｃｏｌｉ発現系を１つだけ使用した。さらなる修正と最適化が進行中である。

当業者であれば、発現ベクターの調製に利用できる分子生物学技術を知っているであろう。上述のように、本課題の技術の発現ベクターに組み込むために使用されるポリヌクレオチドは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの日常的な技術によって調製することができる。

相補的な付着末端を介してＤＮＡをベクターに作動可能に連結するための多くの分子生物学技術が開発されてきた。一実施形態では、相補的ホモポリマートラクトを、ベクターＤＮＡに挿入される核酸分子に付加することができる。次いで、ベクターと核酸分子は相補的なホモポリマー尾部間の水素結合によって接続され、組換えＤＮＡ分子が形成される。

別の実施形態では、１つ以上の制限部位を含む合成リンカーが、本課題の技術のポリヌクレオチドを発現ベクターに作動可能に連結するために使用される。一実施形態では、ポリヌクレオチドは制限エンドヌクレアーゼ消化によって生成される。一実施形態では、核酸分子は、バクテリオファージＴ４ＤＮＡポリメラーゼまたはＥ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼＩ、すなわち、３’－５’－エキソヌクレオチド分解活性を有する突出３’－一本鎖末端を除去し、陥凹３’末端をそれらの重合活性によって埋め、それによって平滑末端のＤＮＡセグメントが生成される。次いで、平滑末端化されたセグメントを、平滑末端化されたＤＮＡ分子のライゲーションを触媒できる酵素（バクテリオファージＴ４ＤＮＡリガーゼなど）の存在下で大過剰のリンカー分子とともにインキュベートする。したがって、反応の生成物は、その末端にポリマーリンカー配列を有するポリヌクレオチドである。次いで、これらのポリヌクレオチドを適切な制限酵素で切断し、ポリヌクレオチドの末端と適合する末端を生成する酵素で切断された発現ベクターにライゲーションする。

代替的に、ライゲーション非依存性クローニング（ＬＩＣ）部位を有するベクターを使用することもできる。次いで、必要なＰＣＲ増幅ポリヌクレオチドを、制限消化またはライゲーションを行わずにＬＩＣベクターにクローン化することができる（ＡｓｌａｎｉｄｉｓａｎｄｄｅＪｏｎｇ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１８６０６９－７４，（１９９０），Ｈａｕｎ，ｅｔａｌ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ１３，５１５－１８（１９９２）、これは、本明細書と矛盾しない範囲で参照により本明細書に組み込まれる）。

一実施形態では、選択されたプラスミドに挿入するために目的のポリヌクレオチドを単離及び／または改変するために、ＰＣＲを使用することが適切である。配列のＰＣＲ調製に使用する適切なプライマーを設計して、核酸分子の必要なコード領域を単離し、制限エンドヌクレアーゼ部位またはＬＩＣ部位を付加し、コード領域を所望の読み取りフレームに配置する。

一実施形態では、本課題の技術の発現ベクターに組み込むためのポリヌクレオチドは、適切なオリゴヌクレオチドプライマーを使用するＰＣＲの使用によって調製される。コード領域が増幅されると同時に、プライマー自体が増幅された配列産物に組み込まれる。一実施形態では、増幅プライマーは、増幅された配列産物を適切なベクターにクローニングできるようにする制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含む。

発現ベクターは、従来の形質転換またはトランスフェクション技法によって、植物または細菌の宿主細胞に導入することができる。本課題の技術の発現ベクターによる適切な細胞の形質転換は、当該技術分野で知られている方法によって達成され、典型的にはベクターと細胞の両方の種類に依存する。適切な技術としては、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウムの共沈、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクション、ケモポレーション、またはエレクトロポレーションが挙げられる。

形質転換に成功した細胞、すなわち発現ベクターを含む細胞は、当該技術分野で周知の技術によって同定することができる。例えば、本課題の技術の発現ベクターでトランスフェクトされた細胞を培養して、本明細書に記載のポリペプチドを産生することができる。細胞は、当該技術分野で周知の技術によって発現ベクターＤＮＡの存在について調べることができる。

宿主細胞は、前述の発現ベクターの単一コピー、または代替的に、発現ベクターの複数のコピーを含むことができる。

いくつかの実施形態では、形質転換細胞は、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、藻類細胞、真菌細胞、または酵母細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、キャノーラ植物細胞、ナタネ植物細胞、ヤシ植物細胞、ヒマワリ植物細胞、ワタ植物細胞、トウモロコシ植物細胞、ピーナッツ植物細胞、亜麻植物細胞、ゴマ植物細胞、大豆植物細胞、及びペチュニア植物細胞からなる群から選択される植物細胞である。

外来タンパク質の高レベル発現を指示する調節配列を含む微生物宿主細胞発現系及び発現ベクターは、当業者によく知られている。これらのいずれも、微生物宿主細胞内で本課題の技術の組換えポリペプチドを発現させるためのベクターを構築するために使用することができる。次いで、これらのベクターを形質転換を介して適切な微生物に導入して、本課題の技術の組換えポリペプチドの高レベルの発現を可能にすることができる。

適切な微生物宿主細胞の形質転換に有用なベクターまたはカセットは、当該技術分野でよく知られている。典型的には、ベクターまたはカセットは、関連するポリヌクレオチドの転写及び翻訳を指示する配列、選択マーカー、及び自律複製または染色体組込みを可能にする配列を含む。適切なベクターは、転写開始制御を有するポリヌクレオチドの領域５’と、転写終結を制御するＤＮＡ断片の領域３’とを含む。両方の制御領域が形質転換宿主細胞に相同な遺伝子に由来することが好ましいが、そのような制御領域が宿主として選択された特定の種に固有の遺伝子に由来する必要はないことが理解されるべきである。

所望の微生物宿主細胞において組換えポリペプチドの発現を駆動するのに有用な開始制御領域またはプロモーターは多数あり、当業者にはよく知られている。これらの遺伝子を駆動できる実質的に任意のプロモーターが本課題の技術に適しており、ＣＹＣＩ、ＨＩＳ３、ＧＡＬＩ、ＧＡＬＩＯ、ＡＤＨＩ、ＰＧＫ、ＰＨ０５、ＧＡＰＤＨ、ＡＤＣＩ、ＴＲＰＩ、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＥＮＯ、ＴＰＩ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓでの発現に有用）；ＡＯＸＩ（Ｐｉｃｈｉａでの発現に有用）；及びｌａｃ、ｔｒｐ、ＪＰＬ、ＩＰＲ、Ｔ７、ｔａｃ、及びｔｒｃ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉでの発現に有用）が挙げられるが、これらに限定されない。

終結制御領域は、微生物宿主に固有のさまざまな遺伝子に由来してもよい。任意選択で、終結部位は本明細書に記載される微生物宿主に対して含まれてもよい。

植物細胞において、本課題の技術の発現ベクターは、所望の発生段階における所望の組織において本課題の技術の組換えポリペプチドの発現を指示できるプロモーターに作動可能に連結されたコード領域を含むことができる。便宜上の理由から、発現されるポリヌクレオチドは、同じポリヌクレオチドに由来するプロモーター配列及び翻訳リーダー配列を含み得る。転写終結シグナルをコードする３’非コード配列も存在する必要がある。発現ベクターは、ポリヌクレオチドの発現を促進するために、１つまたは複数のイントロンを含むこともできる。

植物宿主細胞の場合、コード領域の発現を誘導できる任意のプロモーター及び任意のターミネーターの任意の組み合わせを、本課題の技術のベクター配列において使用することができる。プロモーター及びターミネーターのいくつかの適切な例としては、ノパリンシンターゼ（ｎｏｓ）、オクトピンシンターゼ（ｏｃｓ）、及びカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）遺伝子由来のプロモーター及びターミネーターが挙げられる。使用され得る効率的な植物プロモーターの１つの種類は、高レベル植物プロモーターである。このようなプロモーターは、本課題の技術の発現ベクターと作動可能に連結して、ベクターの発現を促進できなければならない。本課題の技術において使用され得る高レベル植物プロモーターとしては、例えば大豆由来のリブロース－１，５－二リン酸カルボキシラーゼの小サブユニット（複数可）のプロモーター（Ｂｅｒｒｙ－Ｌｏｗｅｅｔａｌ．，Ｊ．ＭｏｌｅｃｕｌａｒａｎｄＡｐｐ．Ｇｅｎ．，１：４８３４９８（１９８２）、その全体が本明細書と矛盾しない範囲で本明細書に組み込まれる）、及びクロロフィル結合タンパク質のプロモーターが挙げられる。これらの２つのプロモーターは、植物細胞において光誘導されることが知られている（例えば、ＧｅｎｅｔｉｃＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｏｆＰｌａｎｔｓ，ａｎＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＰｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ，Ａ．Ｃａｓｈｍｏｒｅ，Ｐｌｅｎｕｍ，Ｎ．Ｙ．（１９８３），ｐａｇｅｓ２９３８；Ｃｏｒｕｚｚｉ，Ｇ．ｅｔａｌ．，ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，２５８：１３９９（１９８３），ａｎｄＤｕｎｓｍｕｉｒ，Ｐ．ｅｔａｌ．，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒａｎｄＡｐｐｌｉｅｄＧｅｎｅｔｉｃｓ，２：２８５（１９８３）を参照されたい。これらのそれぞれは、本明細書と矛盾しない範囲で参照によりその範囲で本明細書に組み込まれる）。

当業者であれば、本明細書に記載の方法によって生成されたラクトン組成物（複数可）をさらに精製し、他のラクトン、香味剤、または香料と混合して、さまざまな消費者製品または食品に使用するための所望の組成物を得ることができることを認識するであろう。

同一性スコアリングを使用した配列類似性の分析
本明細書で使用する場合、「配列同一性」とは、最適に整列した２つのポリヌクレオチドまたはペプチド配列が、成分、例えばヌクレオチドまたはアミノ酸の整列ウィンドウ全体にわたって不変である程度を指す。試験配列と参照配列の整列したセグメントの「同一性画分」は、２つの整列した配列によって共有される同一の成分の数を、参照配列セグメント、すなわち参照配列全体または参照配列のより小さい定義された部分の成分の総数で割ったものである。

本明細書で使用される場合、「配列同一性パーセント」または「同一性パーセント」という用語は、２つの配列が最適にアライメントされている場合（適切なヌクレオチドの挿入、欠失、またはギャップの合計が比較ウィンドウ全体で参照配列の２０パーセント未満である場合）の、試験（「対象」）のポリヌクレオチド分子（またはその相補鎖）と比較したときの、参照（「クエリ」）ポリヌクレオチド分子（またはその相補鎖）の直鎖ポリヌクレオチド配列における同一ヌクレオチドのパーセンテージを指す。比較ウィンドウを整列させるための配列の最適なアライメントは当業者によく知られており、ＳｍｉｔｈとＷａｔｅｒｍａｎの局所相同性アルゴリズム、ＮｅｅｄｌｅｍａｎとＷｕｎｓｃｈの相同性アライメントアルゴリズム、ＰｅａｒｓｏｎとＬｉｐｍａｎの類似性検索法などのツールによって行うことができる。好ましくは、ＧＣＧ（登録商標）ＷｉｓｃｏｎｓｉｎＰａｃｋａｇｅ（登録商標）（ＡｃｃｅｌｒｙｓＩｎｃ．，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）の一部として利用可能なＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡなどのこれらのアルゴリズムのコンピュータ化された実装による。試験配列と参照配列の整列したセグメントの「同一性画分」は、２つの整列した配列によって共有される同一の成分の数を、参照配列セグメント、すなわち参照配列全体または参照配列のより小さい定義された部分の成分の総数で割ったものである。配列同一性パーセントは、同一性の割合に１００を掛けたものとして表される。１つ以上のポリヌクレオチド配列の比較は、全長ポリヌクレオチド配列もしくはその一部、またはより長いポリヌクレオチド配列に対するものであり得る。本開示の目的のために、「同一性パーセント」は、翻訳されたヌクレオチド配列についてはＢＬＡＳＴＸバージョン２．０を使用し、ポリヌクレオチド配列についてはＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を使用して決定することもできる。

配列同一性のパーセントは、好ましくは、ＳｅｑｕｅｎｃｅＡｎａｌｙｓｉｓＳｏｆｔｗａｒｅＰａｃｋａｇｅ（商標）（Ｖｅｒｓｉｏｎ１０；ＧｅｎｅｔｉｃｓＣｏｍｐｕｔｅｒＧｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）の「ＢｅｓｔＦｉｔ」または「Ｇａｐ」プログラムを使用して決定される。「Ｇａｐ」は、ＮｅｅｄｌｅｍａｎとＷｕｎｓｃｈのアルゴリズム（ＮｅｅｄｌｅｍａｎａｎｄＷｕｎｓｃｈ，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ４８：４４３－４５３，１９７０）を利用して、一致の数を最大化し、ギャップの数を最小化する２つの配列のアライメントを見つける。「ＢｅｓｔＦｉｔ」は、ＳｍｉｔｈとＷａｔｅｒｍａｎの局所相同性アルゴリズム（ＳｍｉｔｈａｎｄＷａｔｅｒｍａｎ，ＡｄｖａｎｃｅｓｉｎＡｐｐｌｉｅｄＭａｔｈｅｍａｔｉｃｓ，２：４８２－４８９，１９８１，Ｓｍｉｔｈｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ１１：２２０５－２２２０，１９８３）を使用して、２つの配列間の類似性が最も高いセグメントの最適なアライメントを実行し、ギャップを挿入して一致数を最大化する。同一性パーセントは、「ＢｅｓｔＦｉｔ」プログラムを使用して決定することが最も好ましい。

配列同一性を決定するための有用な方法は、メリーランド州ベセスダＭｄ．２０８９４の国立衛生研究所の国立医学図書館にある国立センター生物工学情報（ＮＣＢＩ）から公的に入手可能なＢａｓｉｃＬｏｃａｌＡｌｉｇｎｍｅｎｔＳｅａｒｃｈＴｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）プログラムにも開示されている。ＢＬＡＳＴＭａｎｕａｌ，Ａｌｔｓｃｈｕｌｅｔａｌ．，ＮＣＢＩ，ＮＬＭ，ＮＩＨ；Ａｌｔｓｃｈｕｌｅｔａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０（１９９０）を参照されたい。ＢＬＡＳＴプログラムのバージョン２．０以降では、アライメントへのギャップ（欠失及び挿入）の導入が可能である。ペプチド配列の場合、ＢＬＡＳＴＸを使用して配列同一性を決定できる。ポリヌクレオチド配列については、ＢＬＡＳＴＮを使用して配列同一性を決定することができる。

本明細書で使用される場合、「実質的な配列同一性パーセント」という用語は、少なくとも約７０％の配列同一性、少なくとも約８０％の配列同一性、少なくとも約８５％の配列同一性、少なくとも約９０％の配列同一性、またはさらに大きな配列同一性、例えば約９８％または約９９％の配列同一性の配列同一性パーセントを指す。したがって、本開示の一実施形態は、本明細書に記載のポリヌクレオチド配列との少なくとも約７０％の配列同一性、少なくとも約８０％の配列同一性、少なくとも約８５％の配列同一性、少なくとも約９０％の配列同一性、またはさらに大きな配列同一性、例えば約９８％または約９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチド分子である。本開示のＢｌｕ１遺伝子及びシトクロムＰ４５０遺伝子の活性を有するポリヌクレオチド分子は、大環状ラクトンなどのさまざまなラクトンの生成を指示することができ、本明細書に提供されるポリヌクレオチド配列と実質的なパーセントの配列同一性を有し、本開示の範囲内に包含される。

同一性とは、配列のアライメント後の一対の配列間で同一であるアミノ酸の割合である（これは配列情報、構造情報、またはその他の情報のみを使用して行うことができるが、通常は配列情報のみに基づいている）。類似性は、何らかの類似性マトリックスを使用したアライメントに基づいて割り当てられたスコアである。類似性インデックスは、以下のＢＬＯＳＵＭ６２、ＰＡＭ２５０、またはＧＯＮＮＥＴのいずれか１つ、またはタンパク質の配列アライメントのために当業者によって使用される任意のマトリックスであり得る。

同一性は、２つのサブ配列間の一致の度合いである（配列間にギャップがない）。２５％以上の同一性は機能の類似性を意味し、１８～２５％は構造または機能の類似性を意味する。２つの完全に無関係な配列またはランダムな配列（１００残基を超える配列）は２０％を超える同一性を有する可能性があることに留意されたい。類似度は、２つの配列を比較した場合の類似の度合いである。これはそれらの同一性に依存する。

前述の説明から明らかなように、本開示の特定の態様は、本明細書に示される実施例の特定の詳細によって限定されず、したがって、当業者であれば他の修正及び応用、またはそれらの均等物を思いつくことが考えられる。したがって、特許請求の範囲は、本開示の趣旨及び範囲から逸脱しないすべてのそのような修正及び応用を網羅するものとすることが意図される。

さらに、別途定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本開示の所属する技術分野における当業者によって一般に理解されるものと同一の意味を有する。本明細書に記載の方法及び物質と同様もしくは同等の任意の方法及び物質を本発明の実践または試験において使用することもできるが、好ましい方法及び物質は、上述される。

実施例１：
このプロセスでは、脂肪酸末端付近ヒドロキシラーゼ活性を有するシトクロムＰ４５０酵素、例えばＰ４５０ＢＭ３（ＭｉｕｒａａｎｄＦｕｌｃｏ，１９７５）を使用して、ω－１、ω－２、またはω－３ヒドロキシル脂肪酸またはそれらの混合物を生成した（プロセス１、ＭｉｕｒａＹ，ＦｕｌｃｏＡＪ．（１９７５）Ｏｍｅｇａ－１，Ｏｍｅｇａ－２ａｎｄＯｍｅｇａ－３ｈｙｄｒｏｘｙｌａｔｉｏｎｏｆｌｏｎｇ－ｃｈａｉｎｆａｔｔｙａｃｉｄｓ，ａｍｉｄｅｓａｎｄａｌｃｏｈｏｌｓｂｙａｓｏｌｕｂｌｅｅｎｚｙｍｅｓｙｓｔｅｍｆｒｏｍＢａｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．３８８：３０５－３１７）。

ヒドロキシル脂肪酸生成物は、有機溶媒中でリパーゼ触媒による閉環反応によってさらに処理され、分枝鎖ムスキーマクロラクトンが形成される（プロセス２）。全体的な合成スキームを図１に示す。

プロセス１には、飽和または不飽和脂肪酸を発酵培地中に存在する生物学的触媒（ヒドロキシラーゼ）の作用に供することによる脂肪酸のヒドロキシル化が含まれる。プロセス１から得られるヒドロキシル脂肪酸は、発酵ブロスから単離することができる（例えば、ヘキサンなどの炭化水素系有機溶媒と酢酸エチルなどの非水溶性極性溶媒の混合物を使用する液液抽出によって）。

プロセス２には、ヒドロキシル脂肪酸をリパーゼ酵素を触媒とする分子内マクロラクトン化反応に供してマクロラクトンを得る反応が含まれる。リパーゼ酵素は固体支持体上に固定化され、マクロラクロン化プロセスに使用され得る。固定化されたリパーゼは簡単に回収でき、長期にわたって繰り返し再利用できる。

プロセス２は、トルエンまたはジクロロエタンなどの溶媒中、Ｎｏｖｏｚｙｍｅ４３５などの固定化リパーゼ触媒の存在下で行うことができる。ヒドロキシル脂肪酸の濃度は０．０５～０．０２５モルとなるように調整する。固定化リパーゼ酵素の濃度は、反応速度を低下させない範囲で適宜選択できる。Ｎｏｖｏｚｙｍｅ４３５を使用する場合には、１リットル当たり５０～１００グラムの濃度に調整することが好ましい。反応物は通常、４０～６０℃で約１５～２４時間振とう及び撹拌される。

ろ過、クロマトグラフィー、及び乾燥などの通常の精製手法を適切に組み合わせて使用して、反応混合物から目的のマクロラクトンを単離することができる。

実施例２：
ムスクラクトンの生成には、合計８種類の脂肪酸が使用された。

ヒドロキシル化及び閉環後、図２に示すように、これら８種類の脂肪酸からそれぞれ８つの異なるムスクラクトン混合物が生成された。８種類の脂肪酸及び対応するムスクラクトン生成物を表１に示す。脂肪酸ヒドロキシル化及び閉環を示す反応スキームを、オレイン酸、リノール酸、アラキドン酸、パルミチン酸、ヘプタデカン酸、及びオクタデカン酸について、それぞれ図３Ａ～３Ｆに示す。

脂肪酸ヒドロキシル化
ＭｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅのＢＭ３ホモログ（ＣＹＰ５０５Ａ３０）のアミノ酸配列はＵｎｉＰｒｏｔ（ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｇ２ＱＤＺ３．ｆａｓｔａ）から取得し、対応する遺伝子はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉでの発現用にコドン最適化され、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）によって合成された。

得られた遺伝子産物を、ＮｄｅＩ及びＸｈｏＩ部位を介してｐＥＴＤｕｅｔ－１ベクター（ＡＭＰ＋、Ｎｏｖａｇｅｎ）にクローニングした。この構築物を発現のためにＢＬ２１（ＤＥ３）細胞に形質転換した。

典型的な実験では、一晩培養したものを、１００ｍｇ／Ｌのカルベニシリンと０．４ｍＭの５－アミノレブリン酸を含む液体ＬＢ培地（２％）に接種した。培養物をまず３７℃でＯＤ６００が０．６になるまで増殖させ、１６℃まで冷却した。次いで、１ｍＭのＩＰＴＧを添加してタンパク質発現を誘導した。１６℃で１６時間インキュベートした後、遠心分離によって細胞を回収した。

採取した細胞ペレットを、０．１％のＴｗｅｅｎ４０及び１０ｍＭのＮＡＤＰＨを含む１００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中に１００ｇ／Ｌの新鮮重量の濃度で再懸濁した。次いで、１ｇ／Ｌの脂肪酸基質を添加した。混合物を振とう機中３７℃で振とうした。

パルミチン酸からの分枝鎖ムスキーマクロラクトンの生成
パルミチン酸ヒドロキシル化及び対応するムスクラクトン生成物を得る反応を示す全体的な合成スキームを図４に示す。採取した細胞ペレットを、０．１％のＴｗｅｅｎ４０及び１０ｍＭのＮＡＤＰＨを含む１００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に１００ｇ／Ｌの新鮮重量の濃度で再懸濁した。次いで、１ｇ／Ｌのパルミチン酸（Ｃ１６：０）を添加した。混合物を振とう機中３７℃で振とうした。

ヒドロキシル化パルミチン酸を酢酸エチルで抽出し、酢酸エチル相をＳｐｅｅｄＶａｃ（商標）真空濃縮器で乾燥させた。次いで、アクリル樹脂の形態のＮｏｖｏｚｙｍ４３５（Ｓｉｇｍａ）を、６０℃で振とうしながら、閉環反応のための溶媒としてのトルエンとともに添加した。ヒドロキシルパルミチン酸からの生成物をＧＣ／ＭＳで分析した。

ＧＣ／ＭＳ分析は、ＧＣＭＳ－ＱＰ２０１０Ｓ検出器と組み合わせたＳｈｉｍａｄｚｕＧＣ－２０１０システムで実施された。分析カラムはＳＨＲＸＩ－５ＭＳ（厚さ０．２５μｍ、長さ３０ｍ、直径０．２５ｍｍ）で、注入温度はスプリットモードで２６５℃である。温度勾配は０～３分で１５０℃；３～６．７分で１５０℃から２６０℃、勾配３０；６．７～１５．７分で２６０℃である。

オレイン酸からの分枝鎖ムスキーマクロラクトンの生成
まず、実施例１のプロセス１で概説したように、オレイン酸をヒドロキシル化してヒドロキシル脂肪酸を形成した。その後、図５に示すようにヒドロキシル脂肪酸を環化した（プロセス２）。

ヒドロキシルオレイン酸類似体を含む発酵ブロス３リットルを、１リットルのバッチで１１リットルの５０％酢酸エチル－ヘキサンで抽出した。溶媒を減圧留去し、粗抽出物１１．５０ｇを赤みがかった油状物として得た。粗抽出物を、２０～５０％酢酸エチル－ヘキサンで溶出するシリカゲルでのカラムクロマトグラフィーによって精製して、１．４０ｇのヒドロキシルオレイン酸異性体を得た。

１．４０ｇ（４．６６ｍｍｏｌ）のヒドロキシルオレイン酸類似体を２００ｍｌのトルエンに溶解した。２０ｇのＮｏｖｏｚｙｍｅ４３５をこの溶液に添加した。反応混合物を５５℃に加熱し、１５時間撹拌し、次いで室温まで冷却した。固定化されたリパーゼ酵素を濾過により分離し、ジクロロメタンですすいだ。揮発性物質を減圧下で蒸留して除去し、１．５０ｇの粗生成物を黄色の油状物として得た。粗生成物を、５％酢酸エチル－ヘキサンで溶出するシリカゲルでのカラムクロマトグラフィーによって精製して、１．１０ｇ（３．９２ｍｍｏｌ、単離収率６２．７％、３つの異性体の合計純度９８％）の対応するマクロラクトン化生成物を得た。

官能評価により、３成分の混合物は高級感のある新規のムスクの香りを有することが確認された。

ヘキサン中の１ｍｇ／ｍｌの精製物の溶液を、３０ｍ×０．２５ｍｍ０．２５μｍＲｔｘ－５ＭＳ（Ｒｅｓｔｅｋ製）を用いたキャピラリーガスクロマトグラフ質量分析計ＧＣＭＳ－ＱＰ２０２０ＮＸ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ製）で分析した。分析は、移動相に高純度ヘリウムを使用し、流速１ｍＬ／ｍｉｎで実行された。使用した温度プログラムは、１５０℃で３分間、５０℃／分の２６０℃までの温度勾配、及び２６０℃で９分間の等温であった。結果を図６に示す。

リノール酸からの分枝鎖ムスキーマクロラクトンの生成
リノール酸のヒドロキシル化（プロセス１）及び対応するムスクラクトン生成物を得る反応（プロセス２）を示す全体的な合成スキームを図７に示す。ヒドロキシルリノール酸類似体を含む発酵ブロス２リットルを、０．７リットルのバッチで７リットルの５０％酢酸エチル－ヘキサンで抽出した。溶媒を減圧留去し、粗抽出物１８．５ｇを赤みがかった油状物として得た。粗抽出物を、２０～５０％酢酸エチル－ヘキサンで溶出するシリカゲルでのカラムクロマトグラフィーによって精製して、１．２ｇのヒドロキシルリノール酸異性体を得た。

１．２ｇ（４．０５ｍｍｏｌ）のヒドロキシルリノール酸類似体を１６０ｍｌのトルエンに溶解した。１６ｇのＮｏｖｏｚｙｍｅ４３５（１００ｇ／Ｌ）をこの溶液に添加した。反応混合物を５０℃に加熱し、１７時間撹拌し、次いで室温まで冷却した。固定化されたリパーゼ酵素を濾過により分離し、ジクロロメタンですすいだ。揮発性物質を減圧下で蒸留して除去し、１．１０ｇの粗生成物を黄色の油状物として得た。

粗生成物を、５％酢酸エチル－ヘキサンで溶出するシリカゲルでのカラムクロマトグラフィーによって精製して、０．７０ｇ（２．５２ｍｍｏｌ、単離収率６２．２％、３つの異性体の合計純度９５％）の対応するマクロラクトン化生成物を得た。

ヘキサン中の１ｍｇ／ｍｌの精製物の溶液を、３０ｍ×０．２５ｍｍ０．２５μｍＲｔｘ－５ＭＳ（Ｒｅｓｔｅｋ製）を用いたキャピラリーガスクロマトグラフ質量分析計ＧＣＭＳ－ＱＰ２０２０ＮＸ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ製）で分析した。分析は、移動相に高純度ヘリウムを使用し、流速１ｍＬ／ｍｉｎで実行された。使用した温度プログラムは、１５０℃で３分間、５０℃／分の２６０℃までの温度勾配、及び２６０℃で９分間の等温であった。結果を図８に示す。

実施例３
このプロセスでは、脂肪酸末端付近ヒドロキシラーゼ活性を有し、ω－１、ω－２、またはω－３ヒドロキシル脂肪酸またはそれらの混合物を生成するシトクロムＰ４５０酵素、例えばＰ４５０ＢＭ３（ＭｉｕｒａａｎｄＦｕｌｃｏ，１９７５；ＷｅｎａｎｄＦｕｌｃｏ，１９８７）またはそのホモログ（Ｂａｋｅｒｅｔ．ａｌ，２０１７）を使用した。抽出及び精製後、ヒドロキシ脂肪酸を有機溶媒中でリパーゼ触媒による閉環反応に供し、分枝鎖ムスキーマクロラクトンを形成した（図９）。

ＭｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅのＢＭ３ホモログ（ＣＹＰ５０５Ａ３０）のアミノ酸配列はＵｎｉＰｒｏｔ（ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｇ２ＱＤＺ３．ｆａｓｔａ）から取得し、対応する遺伝子はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉでの発現用にコドン最適化され、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）によって合成された。

採取した細胞ペレットを、０．１％のＴｗｅｅｎ４０及び１０ｍＭのＮＡＤＰＨを含む１００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中に１００ｇ／Ｌの新鮮重量の濃度で再懸濁した。次いで、１ｇ／Ｌのγ－リノレン酸（ＧＬＡ、Ｃ１８：３）を添加した。混合物を振とう機中３７℃で振とうした。ヒドロキシＧＬＡ由来のムスキーラクトン（分子量２７６）のＧＣ／ＭＳ分析結果を図１０に示す。

使用できる追加の脂肪酸基質及びラクトン生成物を以下に提供し、表２に示す。

α－リノレン酸（ＡＬＡ）からの分枝鎖ムスキーマクロラクトンの生成
採取した細胞ペレットを、０．１％のＴｗｅｅｎ４０及び１０ｍＭのＮＡＤＰＨを含む１００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中に１００ｇ／Ｌの新鮮重量の濃度で再懸濁した。次いで、１ｇ／Ｌのα－リノレン酸（ＡＬＡ、Ｃ１８：３）を添加した。混合物を振とう機中３７℃で５時間振とうした。

ヒドロキシル化α－リノレン酸を酢酸エチルで抽出し、酢酸エチル相をＳｐｅｅｄＶａｃ（商標）真空濃縮器で乾燥させた。次いで、アクリル樹脂の形態のＮｏｖｏｚｙｍ４３５（Ｓｉｇｍａ）を、６０℃で振とうしながら、閉環反応のための溶媒としてのトルエンとともに添加した。ヒドロキシα－リノレン酸からの生成物をＧＣ／ＭＳで分析した。図１１及び図１２を参照されたい。

Ｃ２０：３（８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ－エイコサトリエン酸、ジホモ－γ－リノレン酸、ＤＧＬＡ）からの分岐鎖ムスキーマクロラクトンの生成
採取した細胞ペレットを、０．１％のＴｗｅｅｎ４０及び１０ｍＭのＮＡＤＰＨを含む１００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中に１００ｇ／Ｌの新鮮重量の濃度で再懸濁した。次いで、１ｇ／Ｌのジホモ－γ－リノレン酸（ＤＧＬＡ、Ｃ２０：３）を添加した。混合物を振とう機中３７℃で５時間振とうした。

ヒドロキシル化ＤＧＬＡを酢酸エチルで抽出し、酢酸エチル相をＳｐｅｅｄＶａｃ（商標）真空濃縮器で乾燥させた。次いで、アクリル樹脂の形態のＮｏｖｏｚｙｍ４３５（Ｓｉｇｍａ）を、６０℃で振とうしながら、閉環反応のための溶媒としてのトルエンとともに添加した。ヒドロキシルＤＧＬＡからの生成物をＧＣ／ＭＳで分析した。図１３及び図１４を参照されたい。

実施例４
ムスクラクトンの生成には、合計４種類の一価不飽和脂肪酸が使用された。生合成プロセスを図１５～１８に示す。一価不飽和脂肪酸と得られるラクトンの構造を表３に示す。

使用されたラクトン生成プロセスには、Ｐ４５０ヒドロキシラーゼとリパーゼを使用した一価不飽和脂肪酸の生合成変換が含まれていた。ＭｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅのＢＭ３ホモログ（ＣＹＰ５０５Ａ３０）のアミノ酸配列はＵｎｉＰｒｏｔ（ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｇ２ＱＤＺ３．ｆａｓｔａ）から取得した。対応する遺伝子は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉでの発現のためにコドン最適化され、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）によって合成された。次いで、得られた遺伝子産物を、ＮｄｅＩ及びＸｈｏＩ部位を介してｐＥＴＤｕｅｔ－１ベクター（ＡＭＰ＋、Ｎｏｖａｇｅｎ）にクローニングした。次いで、得られた構築物を発現のためにＢＬ２１（ＤＥ３）細胞に形質転換した。

ヒドロキシル化脂肪酸を生成するために、一晩培養したものを、１００ｍｇ／Ｌのカルベニシリン及び０．４ｍＭの５－アミノレブリン酸を含む液体ＬＢ培地（２％）に接種した。培養物をまず３７℃でＯＤ_６００が０．６になるまで増殖させ、１６℃まで冷却した。次いで、１ｍＭのＩＰＴＧを添加してタンパク質発現を誘導した。１６℃で１６時間インキュベートした後、遠心分離によって細胞を回収した。採取した細胞ペレットを、０．１％のＴｗｅｅｎ４０及び１０ｍＭのＮＡＤＰＨを含む１００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中に１００ｇ／Ｌの新鮮重量の濃度にまで再懸濁した。次いで、１ｇ／Ｌまたは３ｇ／Ｌの種々の脂肪酸を添加した。混合物を振とう機中３７℃で振とうした。

ヒドロキシル化脂肪酸を酢酸エチルで抽出した。酢酸エチル相をＳｐｅｅｄＶａｃ（商標）真空濃縮器で乾燥させた。閉環反応を行うために、アクリル樹脂の形態のＮｏｖｏｚｙｍ４３５（Ｓｉｇｍａ）に溶媒としてのトルエンを加え、振とうしながら６０℃でインキュベートした。

次いで、ラクトン生成物をＧＣ／ＭＳによって分析した。図１９～２２を参照されたい。ＧＣ／ＭＳ分析は、ＧＣＭＳ－ＱＰ２０２０ＮＸ検出器と組み合わせたＳｈｉｍａｄｚｕＧＣ－２０３０システムで実施された。分析カラムはＳＨＲＸＩ－５ＭＳ（厚さ０．２５μｍ、長さ３０ｍ、直径０．２ｍｍ）で、注入温度はスプリットモードで２６５℃である。温度勾配は、０～３分で１５０℃；３～６．７分で１５０℃から２６０℃、勾配３０；６．７～１５．７分で２６０℃である。

参考文献
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アミノ酸及びヌクレオチド配列
配列番号１－Ｂａｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ由来のシトクロムＰ４５０ＣＹＰ１０２Ａ１のアミノ酸配列
ＭＴＩＫＥＭＰＱＰＫＴＦＧＥＬＫＮＬＰＬＬＮＴＤＫＰＶＱＡＬＭＫＩＡＤＥＬＧＥＩＦＫＦＥＡＰＧＲＶＴＲＹＬＳＳＱＲＬＩＫＥＡＣＤＥＳＲＦＤＫＮＬＳＱＡＬＫＦＶＲＤＦＡＧＤＧＬＦＴＳＷＴＨＥＫＮＷＫＫＡＨＮＩＬＬＰＳＦＳＱＱＡＭＫＧＹＨＡＭＭＶＤＩＡＶＱＬＶＱＫＷＥＲＬＮＡＤＥＨＩＥＶＰＥＤＭＴＲＬＴＬＤＴＩＧＬＣＧＦＮＹＲＦＮＳＦＹＲＤＱＰＨＰＦＩＴＳＭＶＲＡＬＤＥＡＭＮＫＬＱＲＡＮＰＤＤＰＡＹＤＥＮＫＲＱＦＱＥＤＩＫＶＭＮＤＬＶＤＫＩＩＡＤＲＫＡＳＧＥＱＳＤＤＬＬＴＨＭＬＮＧＫＤＰＥＴＧＥＰＬＤＤＥＮＩＲＹＱＩＩＴＦＬＩＡＧＨＥＴＴＳＧＬＬＳＦＡＬＹＦＬＶＫＮＰＨＶＬＱＫＡＡＥＥＡＡＲＶＬＶＤＰＶＰＳＹＫＱＶＫＱＬＫＹＶＧＭＶＬＮＥＡＬＲＬＷＰＴＡＰＡＦＳＬＹＡＫＥＤＴＶＬＧＧＥＹＰＬＥＫＧＤＥＬＭＶＬＩＰＱＬＨＲＤＫＴＩＷＧＤＤＶＥＥＦＲＰＥＲＦＥＮＰＳＡＩＰＱＨＡＦＫＰＦＧＮＧＱＲＡＣＩＧＱＱＦＡＬＨＥＡＴＬＶＬＧＭＭＬＫＨＦＤＦＥＤＨＴＮＹＥＬＤＩＫＥＴＬＴＬＫＰＥＧＦＶＶＫＡＫＳＫＫＩＰＬＧＧＩＰＳＰＳＴＥＱＳＡＫＫＶＲＫＫＡＥＮＡＨＮＴＰＬＬＶＬＹＧＳＮＭＧＴＡＥＧＴＡＲＤＬＡＤＩＡＭＳＫＧＦＡＰＱＶＡＴＬＤＳＨＡＧＮＬＰＲＥＧＡＶＬＩＶＴＡＳＹＮＧＨＰＰＤＮＡＫＱＦＶＤＷＬＤＱＡＳＡＤＥＶＫＧＶＲＹＳＶＦＧＣＧＤＫＮＷＡＴＴＹＱＫＶＰＡＦＩＤＥＴＬＡＡＫＧＡＥＮＩＡＤＲＧＥＡＤＡＳＤＤＦＥＧＴＹＥＥＷＲＥＨＭＷＳＤＶＡＡＹＦＮＬＤＩＥＮＳＥＤＮＫＳＴＬＳＬＱＦＶＤＳＡＡＤＭＰＬＡＫＭＨＧＡＦＳＴＮＶＶＡＳＫＥＬＱＱＰＧＳＡＲＳＴＲＨＬＥＩＥＬＰＫＥＡＳＹＱＥＧＤＨＬＧＶＩＰＲＮＹＥＧＩＶＮＲＶＴＡＲＦＧＬＤＡＳＱＱＩＲＬＥＡＥＥＥＫＬＡＨＬＰＬＡＫＴＶＳＶＥＥＬＬＱＹＶＥＬＱＤＰＶＴＲＴＱＬＲＡＭＡＡＫＴＶＣＰＰＨＫＶＥＬＥＡＬＬＥＫＱＡＹＫＥＱＶＬＡＫＲＬＴＭＬＥＬＬＥＫＹＰＡＣＥＭＫＦＳＥＦＩＡＬＬＰＳＩＲＰＲＹＹＳＩＳＳＳＰＲＶＤＥＫＱＡＳＩＴＶＳＶＶＳＧＥＡＷＳＧＹＧＥＹＫＧＩＡＳＮＹＬＡＥＬＱＥＧＤＴＩＴＣＦＩＳＴＰＱＳＥＦＴＬＰＫＤＰＥＴＰＬＩＭＶＧＰＧＴＧＶＡＰＦＲＧＦＶＱＡＲＫＱＬＫＥＱＧＱＳＬＧＥＡＨＬＹＦＧＣＲＳＰＨＥＤＹＬＹＱＥＥＬＥＮＡＱＳＥＧＩＩＴＬＨＴＡＦＳＲＭＰＮＱＰＫＴＹＶＱＨＶＭＥＱＤＧＫＫＬＩＥＬＬＤＱＧＡＨＦＹＩＣＧＤＧＳＱＭＡＰＡＶＥＡＴＬＭＫＳＹＡＤＶＨＱＶＳＥＡＤＡＲＬＷＬＱＱＬＥＥＫＧＲＹＡＫＤＶＷＡＧ
配列番号２－Ｂａｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ由来のシトクロムＰ４５０ＣＹＰ１０２Ａ１のヌクレオチド配列
ＡＴＧＡＣＡＡＴＴＡＡＡＧＡＡＡＴＧＣＣＴＣＡＧＣＣＡＡＡＡＡＣＧＴＴＴＧＧＡＧＡＧＣＴＴＡＡＡＡＡＴＴＴＡＣＣＧＴＴＡＴＴＡＡＡＣＡＣＡＧＡＴＡＡＡＣＣＧＧＴＴＣＡＡＧＣＴＴＴＧＡＴＧＡＡＡＡＴＴＧＣＧＧＡＴＧＡＡＴＴＡＧＧＡＧＡＡＡＴＣＴＴＴＡＡＡＴＴＣＧＡＧＧＣＧＣＣＴＧＧＴＣＧＴＧＴＡＡＣＧＣＧＣＴＡＣＴＴＡＴＣＡＡＧＴＣＡＧＣＧＴＣＴＡＡＴＴＡＡＡＧＡＡＧＣＡＴＧＣＧＡＴＧＡＡＴＣＡＣＧＣＴＴＴＧＡＴＡＡＡＡＡＣＴＴＡＡＧＴＣＡＡＧＣＧＣＴＴＡＡＡＴＴＴＧＴＡＣＧＴＧＡＴＴＴＴＧＣＡＧＧＡＧＡＣＧＧＧＴＴＡＴＴＴＡＣＡＡＧＣＴＧＧＡＣＧＣＡＴＧＡＡＡＡＡＡＡＴＴＧＧＡＡＡＡＡＡＧＣＧＣＡＴＡＡＴＡＴＣＴＴＡＣＴＴＣＣＡＡＧＣＴＴＣＡＧＴＣＡＧＣＡＧＧＣＡＡＴＧＡＡＡＧＧＣＴＡＴＣＡＴＧＣＧＡＴＧＡＴＧＧＴＣＧＡＴＡＴＣＧＣＣＧＴＧＣＡＧＣＴＴＧＴＴＣＡＡＡＡＧＴＧＧＧＡＧＣＧＴＣＴＡＡＡＴＧＣＡＧＡＴＧＡＧＣＡＴＡＴＴＧＡＡＧＴＡＣＣＧＧＡＡＧＡＣＡＴＧＡＣＡＣＧＴＴＴＡＡＣＧＣＴＴＧＡＴＡＣＡＡＴＴＧＧＴＣＴＴＴＧＣＧＧＣＴＴＴＡＡＣＴＡＴＣＧＣＴＴＴＡＡＣＡＧＣＴＴＴＴＡＣＣＧＡＧＡＴＣＡＧＣＣＴＣＡＴＣＣＡＴＴＴＡＴＴＡＣＡＡＧＴＡＴＧＧＴＣＣＧＴＧＣＡＣＴＧＧＡＴＧＡＡＧＣＡＡＴＧＡＡＣＡＡＧＣＴＧＣＡＧＣＧＡＧＣＡＡＡＴＣＣＡＧＡＣＧＡＣＣＣＡＧＣＴＴＡＴＧＡＴＧＡＡＡＡＣＡＡＧＣＧＣＣＡＧＴＴＴＣＡＡＧＡＡＧＡＴＡＴＣＡＡＧＧＴＧＡＴＧＡＡＣＧＡＣＣＴＡＧＴＡＧＡＴＡＡＡＡＴＴＡＴＴＧＣＡＧＡＴＣＧＣＡＡＡＧＣＡＡＧＣＧＧＴＧＡＡＣＡＡＡＧＣＧＡＴＧＡＴＴＴＡＴＴＡＡＣＧＣＡＴＡＴＧＣＴＡＡＡＣＧＧＡＡＡＡＧＡＴＣＣＡＧＡＡＡＣＧＧＧＴＧＡＧＣＣＧＣＴＴＧＡＴＧＡＣＧＡＧＡＡＣＡＴＴＣＧＣＴＡＴＣＡＡＡＴＴＡＴＴＡＣＡＴＴＣＴＴＡＡＴＴＧＣＧＧＧＡＣＡＣＧＡＡＡＣＡＡＣＡＡＧＴＧＧＴＣＴＴＴＴＡＴＣＡＴＴＴＧＣＧＣＴＧＴＡＴＴＴＣＴＴＡＧＴＧＡＡＡＡＡＴＣＣＡＣＡＴＧＴＡＴＴＡＣＡＡＡＡＡＧＣＡＧＣＡＧＡＡＧＡＡＧＣＡＧＣＡＣＧＡＧＴＴＣＴＡＧＴＡＧＡＴＣＣＴＧＴＴＣＣＡＡＧＣＴＡＣＡＡＡＣＡＡＧＴＣＡＡＡＣＡＧＣＴＴＡＡＡＴＡＴＧＴＣＧＧＣＡＴＧＧＴＣＴＴＡＡＡＣＧＡＡＧＣＧＣＴＧＣＧＣＴＴＡＴＧＧＣＣＡＡＣＴＧＣＴＣＣＴＧＣＧＴＴＴＴＣＣＣＴＡＴＡＴＧＣＡＡＡＡＧＡＡＧＡＴＡＣＧＧＴＧＣＴＴＧＧＡＧＧＡＧＡＡＴＡＴＣＣＴＴＴＡＧＡＡＡＡＡＧＧＣＧＡＣＧＡＡＣＴＡＡＴＧＧＴＴＣＴＧＡＴＴＣＣＴＣＡＧＣＴＴＣＡＣＣＧＴＧＡＴＡＡＡＡＣＡＡＴＴＴＧＧＧＧＡＧＡＣＧＡＴＧＴＧＧＡＡＧＡＧＴＴＣＣＧＴＣＣＡＧＡＧＣＧＴＴＴＴＧＡＡＡＡＴＣＣＡＡＧＴＧＣＧＡＴＴＣＣＧＣＡＧＣＡＴＧＣＧＴＴＴＡＡＡＣＣＧＴＴＴＧＧＡＡＡＣＧＧＴＣＡＧＣＧＴＧＣＧＴＧＴＡＴＣＧＧＴＣＡＧＣＡＧＴＴＣＧＣＴＣＴＴＣＡＴＧＡＡＧＣＡＡＣＧＣＴＧＧＴＡＣＴＴＧＧＴＡＴＧＡＴＧＣＴＡＡＡＡＣＡＣＴＴＴＧＡＣＴＴＴＧＡＡＧＡＴＣＡＴＡＣＡＡＡＣＴＡＣＧＡＧＣＴＧＧＡＴＡＴＴＡＡＡＧＡＡＡＣＴＴＴＡＡＣＧＴＴＡＡＡＡＣＣＴＧＡＡＧＧＣＴＴＴＧＴＧＧＴＡＡＡＡＧＣＡＡＡＡＴＣＧＡＡＡＡＡＡＡＴＴＣＣＧＣＴＴＧＧＣＧＧＴＡＴＴＣＣＴＴＣＡＣＣＴＡＧＣＡＣＴＧＡＡＣＡＧＴＣＴＧＣＴＡＡＡＡＡＡＧＴＡＣＧＣＡＡＡＡＡＧＧＣＡＧＡＡＡＡＣＧＣＴＣＡＴＡＡＴＡＣＧＣＣＧＣＴＧＣＴＴＧＴＧＣＴＡＴＡＣＧＧＴＴＣＡＡＡＴＡＴＧＧＧＡＡＣＡＧＣＴＧＡＡＧＧＡＡＣＧＧＣＧＣＧＴＧＡＴＴＴＡＧＣＡＧＡＴＡＴＴＧＣＡＡＴＧＡＧＣＡＡＡＧＧＡＴＴＴＧＣＡＣＣＧＣＡＧＧＴＣＧＣＡＡＣＧＣＴＴＧＡＴＴＣＡＣＡＣＧＣＣＧＧＡＡＡＴＣＴＴＣＣＧＣＧＣＧＡＡＧＧＡＧＣＴＧＴＡＴＴＡＡＴＴＧＴＡＡＣＧＧＣＧＴＣＴＴＡＴＡＡＣＧＧＴＣＡＴＣＣＧＣＣＴＧＡＴＡＡＣＧＣＡＡＡＧＣＡＡＴＴＴＧＴＣＧＡＣＴＧＧＴＴＡＧＡＣＣＡＡＧＣＧＴＣＴＧＣＴＧＡＴＧＡＡＧＴＡＡＡＡＧＧＣＧＴＴＣＧＣＴＡＣＴＣＣＧＴＡＴＴＴＧＧＡＴＧＣＧＧＣＧＡＴＡＡＡＡＡＣＴＧＧＧＣＴＡＣＴＡＣＧＴＡＴＣＡＡＡＡＡＧＴＧＣＣＴＧＣＴＴＴＴＡＴＣＧＡＴＧＡＡＡＣＧＣＴＴＧＣＣＧＣＴＡＡＡＧＧＧＧＣＡＧＡＡＡＡＣＡＴＣＧＣＴＧＡＣＣＧＣＧＧＴＧＡＡＧＣＡＧＡＴＧＣＡＡＧＣＧＡＣＧＡＣＴＴＴＧＡＡＧＧＣＡＣＡＴＡＴＧＡＡＧＡＡＴＧＧＣＧＴＧＡＡＣＡＴＡＴＧＴＧＧＡＧＴＧＡＣＧＴＡＧＣＡＧＣＣＴＡＣＴＴＴＡＡＣＣＴＣＧＡＣＡＴＴＧＡＡＡＡＣＡＧＴＧＡＡＧＡＴＡＡＴＡＡＡＴＣＴＡＣＴＣＴＴＴＣＡＣＴＴＣＡＡＴＴＴＧＴＣＧＡＣＡＧＣＧＣＣＧＣＧＧＡＴＡＴＧＣＣＧＣＴＴＧＣＧＡＡＡＡＴＧＣＡＣＧＧＴＧＣＧＴＴＴＴＣＡＡＣＧＡＡＣＧＴＣＧＴＡＧＣＡＡＧＣＡＡＡＧＡＡＣＴＴＣＡＡＣＡＧＣＣＡＧＧＣＡＧＴＧＣＡＣＧＡＡＧＣＡＣＧＣＧＡＣＡＴＣＴＴＧＡＡＡＴＴＧＡＡＣＴＴＣＣＡＡＡＡＧＡＡＧＣＴＴＣＴＴＡＴＣＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＣＡＴＴＴＡＧＧＴＧＴＴＡＴＴＣＣＴＣＧＣＡＡＣＴＡＴＧＡＡＧＧＡＡＴＡＧＴＡＡＡＣＣＧＴＧＴＡＡＣＡＧＣＡＡＧＧＴＴＣＧＧＣＣＴＡＧＡＴＧＣＡＴＣＡＣＡＧＣＡＡＡＴＣＣＧＴＣＴＧＧＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＡＡＡＴＴＡＧＣＴＣＡＴＴＴＧＣＣＡＣＴＣＧＣＴＡＡＡＡＣＡＧＴＡＴＣＣＧＴＡＧＡＡＧＡＧＣＴＴＣＴＧＣＡＡＴＡＣＧＴＧＧＡＧＣＴＴＣＡＡＧＡＴＣＣＴＧＴＴＡＣＧＣＧＣＡＣＧＣＡＧＣＴＴＣＧＣＧＣＡＡＴＧＧＣＴＧＣＴＡＡＡＡＣＧＧＴＣＴＧＣＣＣＧＣＣＧＣＡＴＡＡＡＧＴＡＧＡＧＣＴＴＧＡＡＧＣＣＴＴＧＣＴＴＧＡＡＡＡＧＣＡＡＧＣＣＴＡＣＡＡＡＧＡＡＣＡＡＧＴＧＣＴＧＧＣＡＡＡＡＣＧＴＴＴＡＡＣＡＡＴＧＣＴＴＧＡＡＣＴＧＣＴＴＧＡＡＡＡＡＴＡＣＣＣＧＧＣＧＴＧＴＧＡＡＡＴＧＡＡＡＴＴＣＡＧＣＧＡＡＴＴＴＡＴＣＧＣＣＣＴＴＣＴＧＣＣＡＡＧＣＡＴＡＣＧＣＣＣＧＣＧＣＴＡＴＴＡＣＴＣＧＡＴＴＴＣＴＴＣＡＴＣＡＣＣＴＣＧＴＧＴＣＧＡＴＧＡＡＡＡＡＣＡＡＧＣＡＡＧＣＡＴＣＡＣＧＧＴＣＡＧＣＧＴＴＧＴＣＴＣＡＧＧＡＧＡＡＧＣＧＴＧＧＡＧＣＧＧＡＴＡＴＧＧＡＧＡＡＴＡＴＡＡＡＧＧＡＡＴＴＧＣＧＴＣＧＡＡＣＴＡＴＣＴＴＧＣＣＧＡＧＣＴＧＣＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＣＧＡＴＴＡＣＧＴＧＣＴＴＴＡＴＴＴＣＣＡＣＡＣＣＧＣＡＧＴＣＡＧＡＡＴＴＴＡＣＧＣＴＧＣＣＡＡＡＡＧＡＣＣＣＴＧＡＡＡＣＧＣＣＧＣＴＴＡＴＣＡＴＧＧＴＣＧＧＡＣＣＧＧＧＡＡＣＡＧＧＣＧＴＣＧＣＧＣＣＧＴＴＴＡＧＡＧＧＣＴＴＴＧＴＧＣＡＧＧＣＧＣＧＣＡＡＡＣＡＧＣＴＡＡＡＡＧＡＡＣＡＡＧＧＡＣＡＧＴＣＡＣＴＴＧＧＡＧＡＡＧＣＡＣＡＴＴＴＡＴＡＣＴＴＣＧＧＣＴＧＣＣＧＴＴＣＡＣＣＴＣＡＴＧＡＡＧＡＣＴＡＴＣＴＧＴＡＴＣＡＡＧＡＡＧＡＧＣＴＴＧＡＡＡＡＣＧＣＣＣＡＡＡＧＣＧＡＡＧＧＣＡＴＣＡＴＴＡＣＧＣＴＴＣＡＴＡＣＣＧＣＴＴＴＴＴＣＴＣＧＣＡＴＧＣＣＡＡＡＴＣＡＧＣＣＧＡＡＡＡＣＡＴＡＣＧＴＴＣＡＧＣＡＣＧＴＡＡＴＧＧＡＡＣＡＡＧＡＣＧＧＣＡＡＧＡＡＡＴＴＧＡＴＴＧＡＡＣＴＴＣＴＴＧＡＴＣＡＡＧＧＡＧＣＧＣＡＣＴＴＣＴＡＴＡＴＴＴＧＣＧＧＡＧＡＣＧＧＡＡＧＣＣＡＡＡＴＧＧＣＡＣＣＴＧＣＣＧＴＴＧＡＡＧＣＡＡＣＧＣＴＴＡＴＧＡＡＡＡＧＣＴＡＴＧＣＴＧＡＣＧＴＴＣＡＣＣＡＡＧＴＧＡＧＴＧＡＡＧＣＡＧＡＣＧＣＴＣＧＣＴＴＡＴＧＧＣＴＧＣＡＧＣＡＧＣＴＡＧＡＡＧＡＡＡＡＡＧＧＣＣＧＡＴＡＣＧＣＡＡＡＡＧＡＣＧＴＧＴＧＧＧＣＴＧＧＧＴＡＡ
配列番号３－Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅ由来のシトクロムＰ４５０ＣＹＰ５０５Ａ３０のアミノ酸配列
ＭＡＤＫＴＴＥＴＶＰＩＰＧＰＰＧＬＰＬＶＧＮＡＬＡＦＤＳＥＬＰＬＲＴＦＱＥＦＡＥＥＹＧＥＩＹＲＬＴＬＰＴＧＴＴＬＶＶＳＳＱＡＬＶＨＥＬＣＤＤＫＲＦＫＫＰＶＡＡＡＬＡＥＶＲＮＧＶＮＤＧＬＦＴＡＲＥＥＥＰＮＷＧＩＡＨＲＩＬＭＰＡＦＧＰＡＳＩＱＧＭＦＴＥＭＨＥＩＡＳＱＬＡＬＫＷＡＲＨＧＰＤＴＰＩＦＶＴＤＤＦＴＲＬＴＬＤＴＬＡＬＣＴＭＮＦＲＦＮＳＹＹＨＤＥＬＨＰＦＩＮＡＭＧＮＦＬＴＥＳＧＡＲＡＭＲＰＡＩＴＳＩＦＨＱＡＡＮＲＫＹＷＥＤＩＥＶＬＲＫＴＡＱＧＶＬＤＴＲＲＫＨＰＴＮＲＫＤＬＬＳＡＭＬＤＧＶＤＡＫＴＧＱＫＬＳＤＳＳＩＩＤＮＬＩＴＦＬＩＡＧＨＥＴＴＳＧＬＬＳＦＡＦＹＬＬＩＫＨＱＤＡＹＲＫＡＱＥＥＶＤＲＶＩＧＫＧＰＩＫＶＥＨＩＫＫＬＰＹＩＡＡＶＬＲＥＴＬＲＬＣＰＴＩＰＩＩＮＲＡＡＫＱＤＥＶＩＧＧＫＹＡＶＡＫＤＱＲＬＡＬＬＬＡＱＳＨＬＤＰＡＶＹＧＥＴＡＫＱＦＩＰＥＲＭＬＤＥＮＦＥＲＬＮＲＥＹＰＤＣＷＫＰＦＧＴＧＭＲＡＣＩＧＲＰＦＡＷＱＥＡＶＬＶＭＡＭＬＬＱＮＦＤＦＶＬＨＤＰＹＹＥＬＨＹＫＱＴＬＴＴＫＰＫＤＦＹＭＲＡＩＬＲＤＧＬＴＡＴＥＬＥＨＲＬＡＧＮＡＡＳＶＡＲＳＧＧＧＧＧＧＰＳＫＰＴＡＱＫＴＳＰＡＥＡＫＰＭＳＩＦＹＧＳＮＴＧＴＣＥＳＬＡＱＲＬＡＴＤＡＡＳＨＧＹＡＡＡＡＶＥＰＬＤＴＡＴＥＫＬＰＴＤＲＰＶＶＩＩＴＡＳＦＥＧＱＰＰＤＮＡＡＫＦＣＧＷＬＫＮＬＥＧＤＥＬＫＮＶＳＹＡＶＦＧＣＧＨＨＤＷＳＱＴＦＨＲＩＰＫＬＶＨＱＴＭＫＡＨＧＡＳＰＩＣＤＥＧＬＴＤＶＡＥＧＮＭＦＴＤＦＥＱＷＥＤＤＶＦＷＰＡＶＲＡＲＹＧＡＡＧＡＶＡＥＴＥＤＡＰＧＳＤＧＬＮＩＨＦＳＳＰＲＳＳＴＬＲＱＤＶＲＥＡＴＶＶＧＥＡＬＬＴＡＰＤＡＰＰＫＫＨＩＥＶＱＬＰＤＧＡＴＹＫＶＧＤＹＬＡＶＬＰＶＮＳＫＥＳＩＧＲＶＭＲＫＦＱＬＳＷＤＳＨＶＴＩＡＳＤＲＷＴＡＬＰＴＧＴＰＶＰＡＹＤＶＬＧＳＹＶＥＬＳＱＰＡＴＫＲＧＩＬＲＬＡＤＡＡＥＤＥＡＴＫＡＥＬＱＫＬＡＧＤＬＹＴＳＥＩＳＬＫＲＡＳＶＬＤＬＬＤＲＦＰＳＩＳＬＰＦＧＴＦＬＳＬＬＰＰＩＲＰＲＱＹＳＩＳＳＳＰＬＮＤＰＳＲＡＴＬＴＹＳＬＬＤＳＰＳＬＡＮＰＳＲＲＦＶＧＶＡＴＳＹＬＳＳＬＶＲＧＤＫＬＬＶＳＶＲＰＴＨＴＡＦＲＬＰＤＥＤＫＭＧＥＴＡＩＩＣＶＧＡＧＳＧＬＡＰＦＲＧＦＩＱＥＲＡＡＬＬＡＫＧＴＱＬＡＡＡＬＬＦＹＧＣＲＳＰＥＫＤＤＬＹＲＤＥＦＤＫＷＱＥＳＧＡＶＤＶＲＲＡＦＳＲＶＤＳＤＤＴＥＡＲＧＣＲＨＶＱＤＲＬＷＨＤＲＥＥＶＫＡＬＷＤＲＧＡＲＶＹＶＣＧＳＲＱＶＧＥＧＶＫＴＡＭＧＲＩＶＬＧＥＥＤＡＥＤＡＩＳＫＷＹＥＴＶＲＮＤＲＹＡＴＤＶＦＤ
配列番号４－Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅ由来のシトクロムＰ４５０ＣＹＰ５０５Ａ３０のコドン最適化ヌクレオチド配列
ＡＴＧＧＣＧＧＡＴＡＡＧＡＣＣＡＣＣＧＡＡＡＣＣＧＴＧＣＣＧＡＴＴＣＣＧＧＧＴＣＣＧＣＣＧＧＧＣＣＴＧＣＣＧＣＴＧＧＴＴＧＧＴＡＡＴＧＣＧＣＴＧＧＣＧＴＴＴＧＡＴＡＧＣＧＡＡＣＴＧＣＣＧＣＴＧＣＧＴＡＣＣＴＴＣＣＡＧＧＡＡＴＴＴＧＣＧＧＡＧＧＡＡＴＡＣＧＧＣＧＡＧＡＴＣＴＡＴＣＧＴＣＴＧＡＣＣＣＴＧＣＣＧＡＣＣＧＧＴＡＣＣＡＣＣＣＴＧＧＴＧＧＴＴＡＧＣＡＧＣＣＡＡＧＣＧＣＴＧＧＴＴＣＡＣＧＡＡＣＴＧＴＧＣＧＡＣＧＡＴＡＡＧＣＧＴＴＴＣＡＡＧＡＡＧＣＣＧＧＴＴＧＣＴＧＣＧＧＣＧＣＴＧＧＣＧＧＡＡＧＴＧＣＧＴＡＡＣＧＧＣＧＴＴＡＡＣＧＡＣＧＧＴＣＴＧＴＴＴＡＣＣＧＣＧＣＧＴＧＡＡＧＡＧＧＡＧＣＣＧＡＡＣＴＧＧＧＧＣＡＴＣＧＣＧＣＡＣＣＧＴＡＴＴＣＴＧＡＴＧＣＣＧＧＣＧＴＴＴＧＧＴＣＣＧＧＣＧＡＧＣＡＴＴＣＡＧＧＧＣＡＴＧＴＴＴＡＣＣＧＡＡＡＴＧＣＡＣＧＡＧＡＴＣＧＣＧＡＧＣＣＡＡＣＴＧＧＣＧＣＴＧＡＡＡＴＧＧＧＣＧＣＧＴＣＡＣＧＧＴＣＣＧＧＡＣＡＣＣＣＣＧＡＴＴＴＴＣＧＴＴＡＣＣＧＡＣＧＡＴＴＴＴＡＣＣＣＧＴＣＴＧＡＣＣＣＴＧＧＡＴＡＣＣＣＴＧＧＣＧＣＴＧＴＧＣＡＣＣＡＴＧＡＡＣＴＴＣＣＧＴＴＴＴＡＡＣＡＧＣＴＡＣＴＡＴＣＡＣＧＡＣＧＡＡＣＴＧＣＡＣＣＣＧＴＴＣＡＴＣＡＡＣＧＣＧＡＴＧＧＧＣＡＡＣＴＴＴＣＴＧＡＣＣＧＡＧＡＧＣＧＧＴＧＣＧＣＧＴＧＣＧＡＴＧＣＧＴＣＣＧＧＣＧＡＴＣＡＣＣＡＧＣＡＴＴＴＴＣＣＡＣＣＡＧＧＣＧＧＣＧＡＡＣＣＧＴＡＡＧＴＡＣＴＧＧＧＡＡＧＡＴＡＴＴＧＡＧＧＴＴＣＴＧＣＧＴＡＡＡＡＣＣＧＣＧＣＡＡＧＧＴＧＴＧＣＴＧＧＡＣＡＣＣＣＧＴＣＧＴＡＡＧＣＡＣＣＣＧＡＣＣＡＡＣＣＧＴＡＡＡＧＡＴＣＴＧＣＴＧＡＧＣＧＣＧＡＴＧＣＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＴＧＣＧＡＡＡＡＣＣＧＧＴＣＡＧＡＡＡＣＴＧＡＧＣＧＡＣＡＧＣＡＧＣＡＴＣＡＴＴＧＡＴＡＡＣＣＴＧＡＴＣＡＣＣＴＴＴＣＴＧＡＴＴＧＣＧＧＧＣＣＡＣＧＡＡＡＣＣＡＣＣＡＧＣＧＧＴＣＴＧＣＴＧＡＧＣＴＴＣＧＣＧＴＴＴＴＡＣＣＴＧＣＴＧＡＴＴＡＡＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＧＣＧＴＡＴＣＧＴＡＡＡＧＣＧＣＡＡＧＡＡＧＡＧＧＴＧＧＡＴＣＧＴＧＴＴＡＴＣＧＧＣＡＡＧＧＧＣＣＣＧＡＴＴＡＡＡＧＴＴＧＡＡＣＡＣＡＴＣＡＡＧＡＡＡＣＴＧＣＣＧＴＡＣＡＴＣＧＣＧＧＣＧＧＴＧＣＴＧＣＧＴＧＡＡＡＣＣＣＴＧＣＧＴＣＴＧＴＧＣＣＣＧＡＣＣＡＴＴＣＣＧＡＴＣＡＴＴＡＡＣＣＧＴＧＣＧＧＣＧＡＡＧＣＡＧＧＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴＣＧＧＴＧＧＣＡＡＧＴＡＣＧＣＧＧＴＧＧＣＧＡＡＡＧＡＴＣＡＧＣＧＴＣＴＧＧＣＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧＣＧＣＡＡＡＧＣＣＡＣＣＴＧＧＡＣＣＣＧＧＣＧＧＴＴＴＡＴＧＧＣＧＡＡＡＣＣＧＣＧＡＡＧＣＡＡＴＴＣＡＴＴＣＣＧＧＡＧＣＧＴＡＴＧＣＴＧＧＡＣＧＡＡＡＡＣＴＴＴＧＡＧＣＧＴＣＴＧＡＡＣＣＧＴＧＡＧＴＡＴＣＣＧＧＡＴＴＧＣＴＧＧＡＡＡＣＣＧＴＴＣＧＧＴＡＣＣＧＧＣＡＴＧＣＧＴＧＣＧＴＧＣＡＴＣＧＧＴＣＧＴＣＣＧＴＴＴＧＣＧＴＧＧＣＡＧＧＡＡＧＣＧＧＴＧＣＴＧＧＴＴＡＴＧＧＣＧＡＴＧＣＴＧＣＴＧＣＡＡＡＡＣＴＴＣＧＡＣＴＴＴＧＴＴＣＴＧＣＡＣＧＡＴＣＣＧＴＡＣＴＡＴＧＡＧＣＴＧＣＡＣＴＡＣＡＡＧＣＡＧＡＣＣＣＴＧＡＣＣＡＣＣＡＡＧＣＣＧＡＡＡＧＡＣＴＴＣＴＡＴＡＴＧＣＧＴＧＣＧＡＴＣＣＴＧＣＧＴＧＡＴＧＧＣＣＴＧＡＣＣＧＣＧＡＣＣＧＡＡＣＴＧＧＡＧＣＡＣＣＧＴＣＴＧＧＣＧＧＧＴＡＡＣＧＣＧＧＣＧＡＧＣＧＴＧＧＣＧＣＧＴＡＧＣＧＧＴＧＧＣＧＧＴＧＧＣＧＧＴＧＧＣＣＣＧＡＧＣＡＡＡＣＣＧＡＣＣＧＣＧＣＡＧＡＡＡＡＣＣＡＧＣＣＣＧＧＣＧＧＡＡＧＣＧＡＡＡＣＣＧＡＴＧＡＧＣＡＴＣＴＴＣＴＡＣＧＧＣＡＧＣＡＡＣＡＣＣＧＧＴＡＣＣＴＧＣＧＡＧＡＧＣＣＴＧＧＣＧＣＡＡＣＧＴＣＴＧＧＣＧＡＣＣＧＡＴＧＣＧＧＣＧＡＧＣＣＡＣＧＧＴＴＡＴＧＣＴＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＴＧＧＡＡＣＣＧＣＴＧＧＡＣＡＣＣＧＣＧＡＣＣＧＡＧＡＡＧＣＴＧＣＣＧＡＣＣＧＡＴＣＧＴＣＣＧＧＴＧＧＴＴＡＴＣＡＴＴＡＣＣＧＣＧＡＧＣＴＴＣＧＡＧＧＧＴＣＡＧＣＣＧＣＣＧＧＡＣＡＡＣＧＣＧＧＣＧＡＡＧＴＴＴＴＧＣＧＧＣＴＧＧＣＴＧＡＡＡＡＡＣＣＴＧＧＡＡＧＧＴＧＡＴＧＡＧＣＴＧＡＡＡＡＡＣＧＴＧＡＧＣＴＡＣＧＣＧＧＴＴＴＴＣＧＧＴＴＧＣＧＧＣＣＡＣＣＡＣＧＡＣＴＧＧＡＧＣＣＡＧＡＣＣＴＴＴＣＡＣＣＧＴＡＴＴＣＣＧＡＡＧＣＴＧＧＴＴＣＡＣＣＡＡＡＣＣＡＴＧＡＡＡＧＣＧＣＡＣＧＧＴＧＣＧＡＧＣＣＣＧＡＴＣＴＧＣＧＡＣＧＡＡＧＧＣＣＴＧＡＣＣＧＡＴＧＴＧＧＣＧＧＡＧＧＧＴＡＡＣＡＴＧＴＴＣＡＣＣＧＡＴＴＴＴＧＡＡＣＡＡＴＧＧＧＡＧＧＡＣＧＡＴＧＴＧＴＴＣＴＧＧＣＣＧＧＣＧＧＴＴＣＧＴＧＣＧＣＧＴＴＡＴＧＧＣＧＣＧＧＣＧＧＧＴＧＣＧＧＴＴＧＣＧＧＡＡＡＣＣＧＡＧＧＡＣＧＣＧＣＣＧＧＧＴＡＧＣＧＡＴＧＧＴＣＴＧＡＡＣＡＴＣＣＡＣＴＴＴＡＧＣＡＧＣＣＣＧＣＧＴＡＧＣＡＧＣＡＣＣＣＴＧＣＧＴＣＡＧＧＡＣＧＴＧＣＧＴＧＡＡＧＣＧＡＣＣＧＴＧＧＴＴＧＧＴＧＡＡＧＣＧＣＴＧＣＴＧＡＣＣＧＣＧＣＣＧＧＡＴＧＣＧＣＣＧＣＣＧＡＡＧＡＡＡＣＡＣＡＴＴＧＡＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＣＣＧＧＡＣＧＧＣＧＣＧＡＣＣＴＡＣＡＡＡＧＴＧＧＧＴＧＡＴＴＡＴＣＴＧＧＣＧＧＴＧＣＴＧＣＣＧＧＴＴＡＡＣＡＧＣＡＡＧＧＡＧＡＧＣＡＴＴＧＧＴＣＧＴＧＴＴＡＴＧＣＧＴＡＡＡＴＴＣＣＡＧＣＴＧＡＧＣＴＧＧＧＡＣＡＧＣＣＡＣＧＴＧＡＣＣＡＴＣＧＣＧＡＧＣＧＡＴＣＧＴＴＧＧＡＣＣＧＣＧＣＴＧＣＣＧＡＣＣＧＧＴＡＣＣＣＣＧＧＴＧＣＣＧＧＣＧＴＡＣＧＡＣＧＴＴＣＴＧＧＧＴＡＧＣＴＡＴＧＴＧＧＡＧＣＴＧＡＧＣＣＡＡＣＣＧＧＣＧＡＣＣＡＡＡＣＧＴＧＧＴＡＴＣＣＴＧＣＧＴＣＴＧＧＣＧＧＡＴＧＣＧＧＣＧＧＡＡＧＡＴＧＡＧＧＣＧＡＣＣＡＡＧＧＣＧＧＡＡＣＴＧＣＡＡＡＡＡＣＴＧＧＣＧＧＧＴＧＡＴＣＴＧＴＡＣＡＣＣＡＧＣＧＡＧＡＴＴＡＧＣＣＴＧＡＡＡＣＧＴＧＣＧＡＧＣＧＴＴＣＴＧＧＡＣＣＴＧＣＴＧＧＡＴＣＧＴＴＴＣＣＣＧＡＧＣＡＴＣＡＧＣＣＴＧＣＣＧＴＴＣＧＧＴＡＣＣＴＴＴＣＴＧＡＧＣＣＴＧＣＴＧＣＣＧＣＣＧＡＴＴＣＧＴＣＣＧＣＧＴＣＡＡＴＡＣＡＧＣＡＴＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＣＣＧＣＴＧＡＡＣＧＡＣＣＣＧＡＧＣＣＧＴＧＣＧＡＣＣＣＴＧＡＣＣＴＡＴＡＧＣＣＴＧＣＴＧＧＡＴＡＧＣＣＣＧＡＧＣＣＴＧＧＣＧＡＡＣＣＣＧＡＧＣＣＧＴＣＧＴＴＴＣＧＴＧＧＧＣＧＴＴＧＣＧＡＣＣＡＧＣＴＡＣＣＴＧＡＧＣＡＧＣＣＴＧＧＴＴＣＧＴＧＧＴＧＡＣＡＡＧＣＴＧＣＴＧＧＴＧＡＧＣＧＴＴＣＧＴＣＣＧＡＣＣＣＡＣＡＣＣＧＣＧＴＴＴＣＧＴＣＴＧＣＣＧＧＡＣＧＡＡＧＡＴＡＡＡＡＴＧＧＧＴＧＡＡＡＣＣＧＣＧＡＴＣＡＴＴＴＧＣＧＴＧＧＧＴＧＣＧＧＧＴＡＧＣＧＧＴＣＴＧＧＣＧＣＣＧＴＴＣＣＧＴＧＧＴＴＴＴＡＴＣＣＡＧＧＡＡＣＧＴＧＣＧＧＣＧＣＴＧＣＴＧＧＣＧＡＡＡＧＧＴＡＣＣＣＡＡＣＴＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＣＴＧＣＴＧＴＴＣＴＡＣＧＧＴＴＧＣＣＧＴＡＧＣＣＣＧＧＡＧＡＡＧＧＡＣＧＡＴＣＴＧＴＡＴＣＧＴＧＡＣＧＡＡＴＴＣＧＡＴＡＡＡＴＧＧＣＡＡＧＡＧＡＧＣＧＧＴＧＣＧＧＴＧＧＡＴＧＴＴＣＧＴＣＧＴＧＣＧＴＴＴＡＧＣＣＧＴＧＴＴＧＡＴＡＧＣＧＡＣＧＡＴＡＣＣＧＡＧＧＣＧＣＧＴＧＧＴＴＧＣＣＧＴＣＡＣＧＴＴＣＡＧＧＡＣＣＧＴＣＴＧＴＧＧＣＡＣＧＡＴＣＧＴＧＡＡＧＡＧＧＴＧＡＡＧＧＣＧＣＴＧＴＧＧＧＡＣＣＧＴＧＧＣＧＣＧＣＧＴＧＴＧＴＡＣＧＴＴＴＧＣＧＧＴＡＧＣＣＧＴＣＡＡＧＴＧＧＧＣＧＡＡＧＧＴＧＴＴＡＡＡＡＣＣＧＣＧＡＴＧＧＧＣＣＧＴＡＴＣＧＴＧＣＴＧＧＧＴＧＡＡＧＡＧＧＡＣＧＣＧＧＡＧＧＡＴＧＣＧＡＴＣＡＧＣＡＡＧＴＧＧＴＡＴＧＡＡＡＣＣＧＴＧＣＧＴＡＡＴＧＡＣＣＧＴＴＡＴＧＣＧＡＣＣＧＡＴＧＴＧＴＴＣＧＡＣＴＡＡ
配列番号５－Ｃａｎｄｉｄａａｎｔａｒｃｔｉｃａ由来のリパーゼＢのアミノ酸配列
ＭＫＬＬＳＬＴＧＶＡＧＶＬＡＴＣＶＡＡＴＰＬＶＫＲＬＰＳＧＳＤＰＡＦＳＱＰＫＳＶＬＤＡＧＬＴＣＱＧＡＳＰＳＳＶＳＫＰＩＬＬＶＰＧＴＧＴＴＧＰＱＳＦＤＳＮＷＩＰＬＳＴＱＬＧＹＴＰＣＷＩＳＰＰＰＦＭＬＮＤＴＱＶＮＴＥＹＭＶＮＡＩＴＡＬＹＡＧＳＧＮＮＫＬＰＶＬＴＷＳＱＧＧＬＶＡＱＷＧＬＴＦＦＰＳＩＲＳＫＶＤＲＬＭＡＦＡＰＤＹＫＧＴＶＬＡＧＰＬＤＡＬＡＶＳＡＰＳＶＷＱＱＴＴＧＳＡＬＴＴＡＬＲＮＡＧＧＬＴＱＩＶＰＴＴＮＬＹＳＡＴＤＥＩＶＱＰＱＶＳＮＳＰＬＤＳＳＹＬＦＮＧＫＮＶＱＡＱＡＶＣＧＰＬＦＶＩＤＨＡＧＳＬＴＳＱＦＳＹＶＶＧＲＳＡＬＲＳＴＴＧＱＡＲＳＡＤＹＧＩＴＤＣＮＰＬＰＡＮＤＬＴＰＥＱＫＶＡＡＡＡＬＬＡＰＡＡＡＡＩＶＡＧＰＫＱＮＣＥＰＤＬＭＰＹＡＲＰＦＡＶＧＫＲＴＣＳＧＩＶＴＰ

Claims

ラクトンを生成するための方法であって、前記方法が、
（ｉ）１つ以上の脂肪酸、シトクロムＰ４５０ヒドロキシラーゼ、及びＮＡＤＰＨを含む第１の反応混合物を調製することと；
（ｉｉ）前記第１の反応混合物を十分な時間インキュベートして、ω－１ヒドロキシル脂肪酸、ω－２ヒドロキシル脂肪酸、ω－３ヒドロキシル脂肪酸、及びそれらの組み合わせから選択されるヒドロキシル脂肪酸を生成することと；
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）で生成された前記ヒドロキシル脂肪酸及びリパーゼを含む第２の反応混合物を調製することと；
（ｉｖ）前記ラクトンを生成するのに十分な時間、前記第２の反応混合物をインキュベートすることと、
を含む、前記方法。
ステップ（ｉｉ）が、前記第１の反応混合物から前記ヒドロキシル脂肪酸を単離することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
前記シトクロムＰ４５０ヒドロキシラーゼが、配列番号１または配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１または請求項２に記載の方法。
前記シトクロムＰ４５０ヒドロキシラーゼが、配列番号１または配列番号３のアミノ酸配列を含む、請求項３に記載の方法。
前記リパーゼがＣａｎｄｉｄａａｎｔａｒｃｔｉｃａ由来のリパーゼＢである、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
前記リパーゼが、配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項５に記載の方法。
前記リパーゼが配列番号５のアミノ酸配列を含む、請求項６に記載の方法。
前記リパーゼが固体支持体上に固定化されている、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
前記第２の反応混合物が溶媒をさらに含み、任意選択で前記溶媒がトルエンまたはジクロロエタンである、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
前記第２の反応混合物中の前記ヒドロキシル脂肪酸が０．０２～０．１Ｍの総濃度であり、任意選択で前記ヒドロキシル脂肪酸が０．０２５～０．５Ｍの総濃度である、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
前記第２の反応混合物中の前記リパーゼが２０～１５０ｇ／Ｌの濃度であり、任意選択で前記リパーゼが５０～１００ｇ／Ｌの濃度である、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。
前記ステップ（ｉｖ）が前記ラクトンを単離することをさらに含む、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。
ステップ（ｉ）の前記１つ以上の脂肪酸が、１２～２８個の炭素原子を含む直鎖脂肪酸を含み、任意選択で、ステップ（ｉ）の前記１つ以上の脂肪酸が、１５、１６、１７、１８、または２０個の炭素原子を含む直鎖脂肪酸を含む、請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。
ステップ（ｉ）の前記１つ以上の脂肪酸が飽和脂肪酸を含む、請求項１～１３のいずれか１項に記載の方法。
ステップ（ｉ）の前記１つ以上の脂肪酸が不飽和脂肪酸を含み、任意選択で、前記不飽和脂肪酸が少なくとも１つの二重結合を含み、任意選択で、前記不飽和脂肪酸が少なくとも１つのＺ二重結合を含む、請求項１～１３のいずれか１項に記載の方法。
ステップ（ｉ）の前記１つ以上の脂肪酸が、以下からなる群から選択される、請求項１～１５のいずれか１項に記載の方法：

及びそれらの組み合わせ。
ステップ（ｉ）の前記１つ以上の脂肪酸が、以下からなる群から選択される、請求項１～１５のいずれか１項に記載の方法：

及びそれらの組み合わせ。
前記ラクトンが、次式の１つ以上の化合物を含む、請求項１～１７のいずれか１項に記載の方法：

（式中、
Ｒはメチル、エチル、またはｎ－プロピルであり；
それぞれの

は、原子価が許す限り、独立して単結合、Ｅ二重結合、Ｚ二重結合、または三重結合であり；
ｋは６～３０の整数である（両端を含む））。
前記ラクトンが、次式の１つ以上の化合物を含む、請求項１～１７のいずれか１項に記載の方法：

（式中、
Ｒはメチル、エチル、またはｎ－プロピルであり；
それぞれの

は、原子価が許す限り、独立して単結合、Ｅ二重結合、Ｚ二重結合、または三重結合であり；
ｎは６～２０の整数である（両端を含む））。
ステップ（ｉ）の前記１つ以上の脂肪酸が、

を含み、ステップ（ｉｖ）で生成される前記ラクトンが、

及びそれらの組み合わせを含む、請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。
ステップ（ｉ）の前記１つ以上の脂肪酸が、

を含み、ステップ（ｉｖ）で生成される前記ラクトンが、

及びそれらの組み合わせを含む、
請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。
ステップ（ｉ）の前記１つ以上の脂肪酸が、

を含み、ステップ（ｉｖ）で生成される前記ラクトンが、

及びそれらの組み合わせを含む、
請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。
ステップ（ｉ）の前記１つ以上の脂肪酸が、

を含み、ステップ（ｉｖ）で生成される前記ラクトンが、

及びそれらの組み合わせを含む、
請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。
ステップ（ｉ）の前記１つ以上の脂肪酸が、

を含み、ステップ（ｉｖ）で生成される前記ラクトンが、

及びそれらの組み合わせを含む、
請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。
ステップ（ｉ）の前記１つ以上の脂肪酸が、

を含み、ステップ（ｉｖ）で生成される前記ラクトンが、

及びそれらの組み合わせを含む、
請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。
ステップ（ｉ）の前記１つ以上の脂肪酸が、

を含み、ステップ（ｉｖ）で生成される前記ラクトンが、

及びそれらの組み合わせを含む、
請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。
ステップ（ｉ）の前記１つ以上の脂肪酸が、

を含み、ステップ（ｉｖ）で生成される前記ラクトンが、

及びそれらの組み合わせを含む、
請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。
ステップ（ｉ）の前記第１の反応混合物中で基質として使用される前記１つ以上の脂肪酸が、

を含み、ステップ（ｉｖ）で生成される前記ラクトンが、

を含む、
請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。
ステップ（ｉ）の前記第１の反応混合物で基質として使用される前記１つ以上の脂肪酸が、

を含み、ステップ（ｉｖ）で生成される前記ラクトンが、

及びそれらの組み合わせを含む、
請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。
ステップ（ｉ）の前記第１の反応混合物で基質として使用される前記１つ以上の脂肪酸が、

を含み、ステップ（ｉｖ）で生成される前記ラクトンが、

及びそれらの組み合わせを含む、
請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。
ステップ（ｉ）の前記第１の反応混合物で基質として使用される前記１つ以上の脂肪酸が、

を含み、ステップ（ｉｖ）で生成される前記ラクトンが、

及びそれらの組み合わせを含む、
請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。
ステップ（ｉ）の前記第１の反応混合物で基質として使用される前記１つ以上の脂肪酸が、

を含み、ステップ（ｉｖ）で生成される前記ラクトンが、

及びそれらの組み合わせを含む、
請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。
ステップ（ｉ）の前記第１の反応混合物で基質として使用される前記１つ以上の脂肪酸が、

を含み、ステップ（ｉｖ）で生成される前記ラクトンが、

を含む、
請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。
ステップ（ｉ）の前記第１の反応混合物で基質として使用される前記１つ以上の脂肪酸が、

を含み、ステップ（ｉｖ）で生成される前記ラクトンが、

及びそれらの組み合わせを含む、
請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。
ステップ（ｉ）の前記第１の反応混合物で基質として使用される前記１つ以上の脂肪酸が、

を含み、ステップ（ｉｖ）で生成される前記ラクトンが、

及びそれらの組み合わせを含む、
請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。
ステップ（ｉ）の前記第１の反応混合物で基質として使用される前記１つ以上の脂肪酸が、

を含み、ステップ（ｉｖ）で生成される前記ラクトンが、

及びそれらの組み合わせを含む、
請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。
ステップ（ｉ）の前記第１の反応混合物で基質として使用される前記１つ以上の脂肪酸が、

を含み、ステップ（ｉｖ）で生成される前記ラクトンが、

及びそれらの組み合わせを含む、
請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。
ステップ（ｉ）の前記第１の反応混合物で基質として使用される前記１つ以上の脂肪酸が、

を含み、ステップ（ｉｖ）で生成される前記ラクトンが、

及びそれらの組み合わせを含む、
請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。
ステップ（ｉ）の前記第１の反応混合物で基質として使用される前記１つ以上の脂肪酸が、

を含み、ステップ（ｉｖ）で生成される前記ラクトンが、

及びそれらの組み合わせを含む、請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。
ステップ（ｉ）の前記第１の反応混合物で基質として使用される前記１つ以上の脂肪酸が、

で生成される前記ラクトンが、

及びそれらの組み合わせを含む、
請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。
ステップ（ｉ）の前記第１の反応混合物で基質として使用される前記１つ以上の脂肪酸が、

を含み、ステップ（ｉｖ）で生成される前記ラクトンが、

及びそれらの組み合わせを含む、
請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。
ステップ（ｉ）の前記第１の反応混合物で基質として使用される前記１つ以上の脂肪酸が、

を含み、ステップ（ｉｖ）で生成される前記ラクトンが、

及びそれらの組み合わせを含む、
請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。
ステップ（ｉ）の前記第１の反応混合物で基質として使用される前記１つ以上の脂肪酸が、

を含み、ステップ（ｉｖ）で生成される前記ラクトンが、

及びそれらの組み合わせを含む、
請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。
前記第１の反応混合物がインビトロにある、請求項１～４３のいずれか１項に記載の方法。
前記第１の反応混合物が細胞ベースの反応混合物である、請求項１～４４のいずれか１項に記載の方法。
前記細胞ベースの反応混合物が、酵母、植物、藻類、真菌、及び細菌からなる群から選択される細胞を含む、請求項４５に記載の方法。
前記細胞ベースの反応混合物が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ；Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ；Ｂａｃｉｌｌｕｓ；Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ；Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ；Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ；Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ；Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ；Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ；Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ；Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉａ；Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ；Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ；Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ；Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ；Ｐａｎｔｏｅａ；Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ；Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ；及びＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍからなる群から選択される属の細菌細胞を含み、任意選択で、前記細胞ベースの反応混合物が、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を含む、請求項４５に記載の方法。
前記胞ベースの反応混合物が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ；Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ；Ｃａｎｄｉｄａ；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ；Ｈａｎｓｅｎｕｌａ；Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ；Ｍｕｃｏｒ；Ｐｉｃｈｉａ；Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ；Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ；及びＡｒｔｈｒｏｂｏｔｌｙｓからなる群から選択される属の真菌を含む、請求項４５に記載の方法。
ステップ（ｉｖ）で生成される前記ラクトンが少なくとも７０％の純度を有する、請求項１～４８のいずれか１項に記載の方法。
ステップ（ｉｖ）で生成される前記ラクトンがムスクノートを有する、請求項１～４９のいずれか１項に記載の方法。
次式のラクトン：

（式中、
Ｒはメチル、エチル、またはｎ－プロピルであり；
それぞれの

は、原子価が許す限り、独立して単結合、Ｅ二重結合、Ｚ二重結合、または三重結合であり；
ｋは６～３０の整数である（両端を含む）が；
ただし、前記ラクトンが次の式のものではないという条件である：
前記ラクトンが次式のものである請求項５１に記載のラクトン：

（式中、
Ｒはメチル、エチル、またはｎ－プロピルであり；
それぞれの

は、原子価が許す限り、独立して単結合またはＺ二重結合であり、０、１、２、または４個の

が、Ｚ二重結合であり；
ｍは４～１１の整数である（両端を含む）が；
ただし、前記ラクトンが次の式のものではないという条件である：
それぞれの

が単結合である、請求項１８～１９のいずれか１項に記載の方法、または請求項５１～５２のいずれか１項に記載のラクトン。
１つの

がＥまたはＺ二重結合であり、残りの

が単結合である、請求項１８～１９のいずれか１項に記載の方法、または請求項５１～５２のいずれか１項に記載のラクトン。
２つの

が独立してＥまたはＺ二重結合であり、残りの

が単結合である、請求項１８～１９のいずれか１項に記載の方法、または請求項５１～５２のいずれか１項に記載のラクトン。
３つの

が独立してＥまたはＺ二重結合であり、残りの

が単結合である、請求項１８～１９のいずれか１項に記載の方法、または請求項５１～５２のいずれか１項に記載のラクトン。
４つの

が独立してＥまたはＺ二重結合であり、残りの

が単結合である、請求項１８～１９のいずれか１項に記載の方法、または請求項５１～５２のいずれか１項に記載のラクトン。
それぞれの二重結合が、存在する場合には、Ｚ二重結合である、請求項１８～１９及び５４～５７のいずれか１項に記載の方法、または請求項５１～５２及び５４～５７のいずれか１項に記載のラクトン。
それぞれの二重結合が、存在する場合には、Ｅ二重結合である、請求項１８～１９及び５４～５７のいずれか１項に記載の方法、または請求項５１～５２及び５４～５７のいずれか１項に記載のラクトン。
前記ラクトンがＣ＝Ｃ＝Ｃ、Ｃ＝Ｃ≡Ｃ、及びＣ≡Ｃ＝Ｃのいずれも含まない、請求項１８～１９及び５４～５９のいずれか１項に記載の方法、または請求項５１～５２及び５４～５９のいずれか１項に記載のラクトン。
ｋが８、９、１０、１１、１２、１３、または１５である、請求項１８～１９及び５３～６０のいずれか１項に記載の方法、または請求項５１～６０のいずれか１項に記載のラクトン。
前記ラクトンが次式のものである、請求項１～６１のいずれか１項に記載の方法、または請求項５１～６０のいずれか１項に記載のラクトン：
前記ラクトンが次式のものである、請求項１～６１のいずれか１項に記載の方法、または請求項５１～６０のいずれか１項に記載のラクトン：
前記ラクトンが次式のものである、請求項１～６１のいずれか１項に記載の方法、または請求項５１～６０のいずれか１項に記載のラクトン：
前記キラル炭素原子がＳ配置である、請求項１８～６４のいずれか１項に記載の方法、または請求項５１～６４のいずれか１項に記載のラクトン。
前記キラル炭素原子がＲ配置である、請求項１８～６３のいずれか１項に記載の方法、または請求項５１～６４のいずれか１項に記載のラクトン。
請求項５１～６６のいずれか１項に記載のうちの２つ以上のラクトンの混合物。
請求項５１～６６のいずれか１項に記載のラクトンまたは請求項６７に記載の混合物を含む組成物。
化粧品として許容される賦形剤をさらに含む、請求項６８に記載の組成物。
請求項１～６６のいずれか１項に記載の方法により生成されるラクトン。