JP2018537111A - 改良された特性を有するω−ヒドロキシラーゼ関連融合ポリペプチドバリアント - Google Patents

改良された特性を有するω−ヒドロキシラーゼ関連融合ポリペプチドバリアント Download PDF

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Abstract

本開示は、組換え宿主細胞で発現された場合に、改良されたω−ヒドロキシル化脂肪酸誘導体産生をもたらす、ω−ヒドロキシラーゼ関連融合ポリペプチドバリアントに関する。さらに本開示は、ω−ヒドロキシル化脂肪酸誘導体の産生のためのω−ヒドロキシラーゼ関連融合ポリペプチドを発現するための微生物に関する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年１２月１５日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＥＰ２０１５／０７９８３２号の一部継続であり、その開示全体は参照により本明細書に組み入れられる。
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出された配列表を含んでおり、その全体は参照により本明細書に組み入れられる。２０１６年１２月１２日に作成された当該ＡＳＣＩＩの写しは、ＬＳ０００５４ＰＣＴ３＿ＳＬ．ｔｘｔと名付けられ、サイズは９３６，４５１バイトである。
分野
本開示は、組換え宿主細胞で発現された場合に、改良されたω−ヒドロキシル化脂肪酸誘導体産生をもたらす、ω−ヒドロキシラーゼ関連融合ポリペプチド及びそのバリアントに関する。さらに本開示は、ω−ヒドロキシル化脂肪酸誘導体の産生のためのω−ヒドロキシラーゼ関連融合ポリペプチド及びそのバリアントを発現するための微生物に関する。
背景
チトクロームＰ４５０モノオキシゲナーゼ（Ｐ４５０）は多様な種類の酵素である。これらはファミリーとサブファミリーに分類される。これらが４０％以上のアミノ酸同一性を共有する場合、それらは同一のファミリーに属する。これらが５５％以上のアミノ酸同一性を共有する場合、それらは同一のサブファミリーに属する。Ｐ４５０は基質として脂肪酸を用い、ヒドロキシル化反応を触媒する。細菌は、アルカン分解及び脂肪酸改変に含まれるいくつかのＰ４５０系を有し、１０００を超える微生物Ｐ４５０がこれまで知られている。１つの特定のＰ４５０サブファミリーはｃｙｐ１５３Ａとして知られており、最初のものは２００１年にアシネトバクター・カルコアセティカス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）からクローンとして作製された。それ以来、類似の酵素が、スフィンゴモナス属の種（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＨＸＮ２００、マイコバクテリウム属の種（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）ＨＸＮ１５００、及びアルカニボラクス・ボルクメンシス（Ａｌｃａｎｉｖｏｒａｘ ｂｏｒｋｕｍｅｎｓｉｓ）（Ｖａｎ Ｂｏｇａｅｒｔ ｅｔ ａｌ．（２０１１）ＦＥＢＳ Ｊｏｕｒｎａｌ ２７８：２０６−２２1（非特許文献１））等の他のアルカン利用種においても同定されている。細菌ＣＹＰ１５３Ａサブファミリー由来のいくつかのＰ４５０は、高い末端位置選択性を有するアルカンω−ヒドロキシラーゼ（ω−ヒドロキシラーゼ、ω−オキシゲナーゼとも呼ばれる）である。ＣＹＰ１５３Ａはまた、第１級アルコール、ω−ヒドロキシル化脂肪酸、及び２官能脂肪酸誘導体（例、α，ω−ジカルボン酸及びα，ω−ジオール）等の工業的に関連するω−ヒドロキシル化（ω−ヒドロキシル化）脂肪族化合物の合成にも関連している（Ｈｏｎｄａ Ｍａｌｃａ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．４８：５１１５−５１１７（非特許文献２））。
Ｖａｎ Ｂｏｇａｅｒｔ ｅｔ ａｌ．（２０１１）ＦＥＢＳ Ｊｏｕｒｎａｌ ２７８：２０６−２２1 Ｈｏｎｄａ Ｍａｌｃａ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．４８：５１１５−５１１７
概要
本開示は、宿主細胞においてω−ヒドロキシル化及び二官能性脂肪酸誘導体を産生することができるω−ヒドロキシラーゼ関連融合ポリペプチド及びそのバリアントを提供する。さらに具体的には、本開示は、ω−ヒドロキシル化脂肪酸、ω−ヒドロキシル化脂肪酸エステル、α，ω−二酸、α，ω−ジエステル、α，ω−ジオール、及びこれら由来のマクロラクトン等の化学物質を含む、ω−ヒドロキシル化（ω−ヒドロキシル化）及び二官能性脂肪酸誘導体ならびにその組成物を産生するＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントを提供する。また、特定のＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合核酸及びタンパク質配列、ならびにこのような操作されたＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントを包含する組換え宿主細胞及び細胞培養物も提供する。本開示はまた、ω−ヒドロキシル化及び／または二官能性脂肪酸誘導体またはその組成物を作製するために、組換えＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアント発現宿主細胞を用いる方法も提供する。
本開示の１つの態様は、脂肪酸からω−ヒドロキシル化（ω−ＯＨ）脂肪酸または脂肪酸誘導体への変換を触媒するＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントであって、配列番号３８のＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチド配列に対して少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントを提供する。さらに、ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチド及びそのバリアントを発現する方法も含まれる。１つの態様において、ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは、配列番号３８に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有し、且つ組換え宿主細胞におけるＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドの発現が、野生型ＣＹＰ１５３Ａの発現、または配列番号６もしくは配列番号３８のＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドの発現により産生される力価に比べて、ω−ＯＨ脂肪酸またはω−ＯＨ脂肪酸誘導体或いはその組成物においてより高い力価をもたらす。１つの態様において、ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントの発現に有効な条件下、炭素源含有培地で培養された場合に、組換え宿主細胞は、対応する野生型ＣＹＰ１５３Ａを発現する宿主細胞、または配列番号６もしくは配列番号３８のＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドを発現する宿主細胞により産生されるω−ＯＨ脂肪酸またはω−ＯＨ脂肪酸誘導体或いはその組成物の力価よりも、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％または２０％上回る力価を有するω−ＯＨ脂肪酸またはω−ＯＨ脂肪酸誘導体或いはその組成物を産生する。別の態様では、ω−ＯＨ脂肪酸またはω−ＯＨ脂肪酸誘導体或いはその組成物は細胞外で産生される。
１つの態様において、本開示は、配列番号３８のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％または少なくとも９０％の配列同一性を備えるＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントであって、アミノ酸位置１２位における突然変異と、以下のアミノ酸位置：（ａ）配列番号３８の２７、１１９、１４０、１５７、１５９、２３３、及び２４４位；（ｂ）配列番号３８の２８、６１、１１９、２３１、３０９、４１３、及び４８０位；（ｃ）配列番号３８の１１９、２３１、及び４８０位；（ｄ）配列番号３８の２８、７７、１１９、１４１、２３１及び４０７位；（ｅ）配列番号３８の２８、６１、１４１、２３１、及び４０７位；（ｆ）配列番号３８の２８、１１９、２３１、及び２４４位；（ｇ）配列番号３８の２８、４０７、及び４８０位；（ｈ）配列番号３８の１４１、２３１、４１３、及び４８１位；（ｉ）配列番号３８の２８、１１１、２３１、及び４０７位；（ｊ）配列番号３８の２８、６１、１４０、及び１４９位；（ｋ）配列番号３８の２８、７７、１１９、１５９、２３１、２５４、４０７、及び４８０位；（ｌ）配列番号３８の２８、２５４、３０９、４０７、及び４５１位；（ｍ）配列番号３８の２８、２５４、３０９、４０７、及び４８０位；または（ｎ）配列番号３８の２８、３０９、４０７、４５１、及び４８０位の各々における突然変異とを含み、脂肪酸からω−ヒドロキシル化脂肪酸への変換を触媒する、ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントを提供する。様々な実施形態において、配列番号３８のアミノ酸位置１２、２７、１１９、１４０、１５７、１５９、２３３、及び２４４位における（ａ）の前記突然変異は、アミノ酸置換である。様々な実施形態において、配列番号３８のアミノ酸位置１２、２８、６１、１１９、２３１、３０９、４１３、及び４８０位における（ｂ）の前記突然変異は、アミノ酸置換である。様々な実施形態において、配列番号３８のアミノ酸位置１２、１１９、２３１、及び４８０位における（ｃ）の前記突然変異は、アミノ酸置換である。様々な実施形態において、配列番号３８のアミノ酸位置１２、２８、７７、１１９、１４１、２３１、及び４０７位における（ｄ）の前記突然変異は、アミノ酸置換である。様々な実施形態において、配列番号３８のアミノ酸位置１２、２８、６１、１４１、２３１、及び４０７位における（ｅ）の前記突然変異は、アミノ酸置換である。様々な実施形態において、配列番号３８のアミノ酸位置１２、２８、１１９、２３１、及び２４４位における（ｆ）の前記突然変異は、アミノ酸置換である。様々な実施形態において、配列番号３８のアミノ酸位置１２、２８、４０７、及び４８０位における（ｇ）の前記突然変異は、アミノ酸置換である。様々な実施形態において、配列番号３８のアミノ酸位置１２、１４１、２３１、４１３、及び４８１位における（ｈ）の前記突然変異は、アミノ酸置換である。様々な実施形態において、配列番号３８のアミノ酸位置１２、２８、１１１、２３１、及び４０７位における（ｉ）の前記突然変異は、アミノ酸置換である。様々な実施形態において、配列番号３８のアミノ酸位置１２、２８、６１、１４０、及び１４９位における（ｊ）の前記突然変異は、アミノ酸置換である。様々な実施形態において、アミノ酸位置１２、２８、７７、１１９、１５９、２３１、２５４、４０７、及び４８０位における（ｋ）の前記突然変異は、アミノ酸置換である。様々な実施形態において、配列番号３８のアミノ酸位置１２、２８、２５４、３０９、４０７、及び４５１位における（ｌ）の前記突然変異は、アミノ酸置換である。様々な実施形態において、配列番号３８のアミノ酸位置１２、２８、２５４、３０９、４０７、及び４８０位における（ｍ）の前記突然変異は、アミノ酸置換である。様々な実施形態において、配列番号３８のアミノ酸位置１２、２８、３０９、４０７、４５１、及び４８０位における（ｎ）の前記突然変異は、アミノ酸置換である。１つの実施形態において、配列番号３８のアミノ酸位置１２、２７、１１９、１４０、１５７、１５９、２３３、及び２４４位における（ａ）の前記突然変異は、それぞれ、Ｑ１２Ｗ、Ｒ２７Ｌ、Ｋ１１９Ｒ、Ｓ１４０Ｎ、Ｓ１５７Ｒ、Ｖ１５９Ｍ、Ｓ２３３Ｌ、及びＡ２４４Ｒである。１つの実施形態において、配列番号３８のアミノ酸位置１２、２８、６１、１１９、２３１、３０９、４１３、及び４８０位における（ｂ）の前記突然変異は、それぞれ、Ｑ１２Ｒ、Ｑ２８Ｍ、Ｎ６１Ｌ、Ｋ１１９Ｒ、Ａ２３１Ｖ、Ｎ３０９Ｓ、Ｙ４１３Ｒ、及びＩ４８０Ｇである。１つの実施形態において、配列番号３８のアミノ酸位置１２、１１９、２３１、及び４８０位における（ｃ）の前記突然変異は、それぞれ、Ｑ１２Ｒ、Ｋ１１９Ｒ、Ａ２３１Ｖ、及びＩ４８０Ｇである。１つの実施形態において、配列番号３８のアミノ酸位置１２、２８、７７、１１９、１４１、２３１、及び４０７位における（ｄ）の前記突然変異は、それぞれ、Ｑ１２Ｔ、Ｑ２８Ｍ、Ｒ７７Ｑ、Ｋ１１９Ｒ、Ｖ１４１Ｔ、Ａ２３１Ｗ、及びＮ４０７Ｇである。１つの実施形態において、配列番号３８のアミノ酸位置１２、２８、６１、１４１、２３１、及び４０７位における（ｅ）の前記突然変異は、それぞれ、Ｑ１２Ｒ、Ｑ２８Ｍ、Ｎ６１Ｌ、Ｖ１４１Ｔ、Ａ２３１Ｙ、及びＮ４０７Ｇである。１つの実施形態において、配列番号３８のアミノ酸位置１２、２８、１１９、２３１、及び２４４位における（ｆ）の前記突然変異は、それぞれ、Ｑ１２Ｗ、Ｑ２８Ｍ、Ｋ１１９Ｒ、Ａ２３１Ｙ、及びＡ２４４Ｒである。１つの実施形態において、配列番号３８のアミノ酸位置１２、２８、４０７、及び４８０位における（ｇ）の前記突然変異は、それぞれ、Ｑ１２Ｗ、Ｑ２８Ｔ、Ｎ４０７Ｇ、及びＩ４８０Ｇである。１つの実施形態において、配列番号３８のアミノ酸位置１２、１４１、２３１、４１３、及び４８１位における（ｈ）の前記突然変異は、それぞれ、Ｑ１２Ｒ、Ｖ１４１Ｔ、Ａ２３１Ｙ、Ｙ４１３Ｒ、及びＧ４８１Ｉである。１つの実施形態において、配列番号３８のアミノ酸位置１２、２８、１１１、２３１、及び４０７位における（ｉ）の前記突然変異は、それぞれ、Ｑ１２Ｔ、Ｑ２８Ｍ、Ｆ１１１Ａ、Ａ２３１Ｖ、及びＮ４０７Ｇである。１つの実施形態において、配列番号３８のアミノ酸位置１２、２８、６１、１４０、及び１４９位における（ｊ）の前記突然変異は、それぞれ、Ｑ１２Ｔ、Ｑ２８Ｍ、Ｎ６１Ｌ、Ｓ１４０Ｎ、及びＰ１４９Ｒである。１つの実施形態において、アミノ酸位置１２、２８、７７、１１９、１５９、２３１、２５４、４０７、及び４８０位における（ｋ）の前記突然変異は、それぞれ、Ｑ１２Ｗ、Ｑ２８Ｔ、Ｒ７７Ｑ、Ｋ１１９Ｒ、Ｖ１５９Ｍ、Ａ２３１Ｙ、Ｒ２５４Ｇ、Ｎ４０７Ｇ、及びＩ４８０Ｇである。１つの実施形態において、配列番号３８のアミノ酸位置１２、２８、２５４、３０９、４０７、及び４５１位における（ｌ）の前記突然変異は、それぞれ、Ｑ１２Ｗ、Ｑ２８Ｔ、Ｒ２５４Ｇ、Ｎ３０９Ｓ、Ｎ４０７Ｇ、及びＶ４５１Ｍである。１つの実施形態において、配列番号３８のアミノ酸位置１２、２８、２５４、３０９、４０７、及び４８０位における（ｍ）の前記突然変異は、それぞれ、Ｑ１２Ｗ、Ｑ２８Ｔ、Ｒ２５４Ｇ、Ｎ３０９Ｓ、Ｎ４０７Ｇ、及びＩ４８０Ｇである。１つの実施形態において、配列番号３８のアミノ酸位置１２、２８、３０９、４０７、４５１、及び４８０位における（ｎ）の前記突然変異は、それぞれ、Ｑ１２Ｗ、Ｑ２８Ｔ、Ｎ３０９Ｓ、Ｎ４０７Ｇ、Ｖ４５１Ｍ、及びＩ４８０Ｇである。１つの好ましい実施形態において、上記（ａ）のＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは、さらに、配列番号３８のアミノ酸位置１４１、２３１及び４０７の各々に、または配列番号３８のアミノ酸位置２３１、４０７、４５１、７５７、７７０及び７８４の各々に、または配列番号３８のアミノ酸位置２３１、４０７、５９１、６４３、７５７及び７８４の各々に、突然変異を含む。様々な実施形態において、配列番号３８のアミノ酸位置１４１、２３１、及び４０７の各々における前記さらなる突然変異は、アミノ酸置換である。また、様々な実施形態において、配列番号３８のアミノ酸位置２３１、４０７、４５１、７５７、７７０及び７８４の各々における前記さらなる突然変異は、アミノ酸置換である。また、様々な実施形態において、配列番号３８のアミノ酸位置２３１、４０７、５９１、６４３、７５７及び７８４の各々における前記さらなる突然変異は、アミノ酸置換である。好ましくは、配列番号３８のアミノ酸位置１４１、２３１及び４０７の各々における前記さらなる突然変異は、それぞれ、Ｖ１４１Ｔ、Ａ２３１Ｙ及びＮ４０７Ｇである。また、好ましくは、配列番号３８のアミノ酸位置２３１、４０７、４５１、７５７、７７０及び７８４の各々における前記突然変異は、それぞれ、Ａ２３１Ｙ、Ｎ４０７Ｇ、Ｖ４５１Ｍ、Ｅ７５７Ａ、Ｔ７７０Ｇ及びＭ７８４Ｉである。また、好ましくは、配列番号３８のアミノ酸位置２３１、４０７、５９１、６４３、７５７及び７８４の各々における前記突然変異は、それぞれ、Ａ２３１Ｙ、Ｎ４０７Ｇ、Ｅ５９１Ｑ、Ｒ６４３Ｈ、Ｅ７５７Ａ及びＭ７８４Ｉである。より好ましくは、本開示のＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは、配列番号１４６、配列番号１５０、または配列番号１６０のアミノ酸配列を含む。本開示の他の実施形態では、ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、配列番号１２２、及び配列番号１２４のうちいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
別の態様において、本開示は、配列番号３８のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％または少なくとも９０％の配列同一性を備えるＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントであって、ＲｈＦドメイン（またはＲｈＦレダクターゼドメイン、またはＲｅｄ４５０ＲｈＦドメイン、またはＲｅｄ４５０ＲｈＦレダクターゼドメイン、またはＰ４５０ＲｈＦドメイン、またはＰ４５０ＲｈＦレダクターゼドメイン）において、以下のアミノ酸位置：（ａ）配列番号３８の５２７、５４４、７１９、７５７、７７１、及び７８４位；（ｂ）配列番号３８の５２７、５４４、及び５５７位；（ｃ）配列番号３８の７７０及び７８４位；（ｄ）配列番号３８の５２７、５９１、６４８、７１９、７５７、７７１、及び７８４位；（ｅ）配列番号３８の５２７、５９１、６４８、７５７、及び７７１位；（ｆ）配列番号３８の５２７、５４４、７７０、及び７８４位；（ｇ）配列番号３８の５２７、５５７、７７０、及び７８４位；（ｈ）配列番号３８の５５７、７５７、及び７７０位；（ｉ）配列番号３８の５５７、７５７、及び７７１位；または（ｊ）配列番号３８の７５７及び７７０位の各々における突然変異を含み、脂肪酸からω−ヒドロキシル化脂肪酸への変換を触媒する、ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントを提供する。様々な実施形態において、配列番号３８のアミノ酸位置５２７、５４４、７１９、７５７、７７１、及び７８４位における（ａ）の前記突然変異は、アミノ酸置換である。様々な実施形態において、配列番号３８のアミノ酸位置５２７、５４４、及び５５７位における（ｂ）の前記突然変異は、アミノ酸置換である。様々な実施形態において、配列番号３８のアミノ酸位置７７０及び７８４位における（ｃ）の前記突然変異は、アミノ酸置換である。様々な実施形態において、配列番号３８のアミノ酸位置５２７、５９１、６４８、７１９、７５７、７７１、及び７８４位における（ｄ）の前記突然変異は、アミノ酸置換である。様々な実施形態において、配列番号３８のアミノ酸位置５２７、５９１、６４８、７５７、及び７７１位における（ｅ）の前記突然変異は、アミノ酸置換である。様々な実施形態において、配列番号３８のアミノ酸位置５２７、５４４、７７０、及び７８４位における（ｆ）の前記突然変異は、アミノ酸置換である。様々な実施形態において、配列番号３８のアミノ酸位置５２７、５５７、７７０、及び７８４位における（ｇ）の前記突然変異は、アミノ酸置換である。様々な実施形態において、配列番号３８のアミノ酸位置５５７、７５７、及び７７０位における（ｈ）の前記突然変異は、アミノ酸置換である。様々な実施形態において、配列番号３８のアミノ酸位置５５７、７５７、及び７７１位における（ｉ）の前記突然変異は、アミノ酸置換である。様々な実施形態において、配列番号３８のアミノ酸位置７５７及び７７０位における（ｊ）の前記突然変異は、アミノ酸置換である。１つの実施形態において、配列番号３８のアミノ酸位置５２７、５４４、７１９、７５７、７７１、及び７８４位における（ａ）の前記突然変異は、それぞれ、Ｄ５２７Ｅ、Ｄ５４４Ｎ、Ｒ７１９Ｗ、Ｅ７５７Ａ、Ｖ７７１Ｆ、及びＭ７８４Ｉである。１つの実施形態において、配列番号３８のアミノ酸位置５２７、５４４、及び５５７位における（ｂ）の前記突然変異は、それぞれ、Ｄ５２７Ｅ、Ｄ５４４Ｎ、及びＥ５５７Ｒである。１つの実施形態において、配列番号３８のアミノ酸位置７７０及び７８４位における（ｃ）の前記突然変異は、それぞれ、Ｔ７７０Ｇ及びＭ７８４Ｉである。１つの実施形態において、配列番号３８のアミノ酸位置５２７、５９１、６４８、７１９、７５７、７７１、及び７８４位における（ｄ）の前記突然変異は、それぞれ、Ｄ５２７Ｅ、Ｅ５９１Ｑ、Ｖ６４８Ｌ、Ｒ７１９Ｗ、Ｅ７５７Ａ、Ｖ７７１Ｆ、及びＭ７８４Ｉである。１つの実施形態において、配列番号３８のアミノ酸位置５２７、５９１、６４８、７５７、及び７７１位における（ｅ）の前記突然変異は、それぞれ、Ｄ５２７Ｅ、Ｅ５９１Ｑ、Ｖ６４８Ｌ、Ｅ７５７Ａ、及びＶ７７１Ｆである。１つの実施形態において、配列番号３８のアミノ酸位置５２７、５４４、７７０、及び７８４位における（ｆ）の前記突然変異は、それぞれ、Ｄ５２７Ｅ、Ｄ５４４Ｎ、Ｔ７７０Ｇ、及びＭ７８４Ｉである。１つの実施形態において、配列番号３８のアミノ酸位置５２７、５５７、７７０、及び７８４位における（ｇ）の前記突然変異は、それぞれ、Ｄ５２７Ｅ、Ｅ５５７Ｒ、Ｔ７７０Ｇ、及びＭ７８４Ｉである。１つの実施形態において、配列番号３８のアミノ酸位置５５７、７５７、及び７７０位における（ｈ）の前記突然変異は、それぞれ、Ｅ５５７Ｗ、Ｅ７５７Ａ、及びＴ７７０Ｇである。１つの実施形態において、配列番号３８のアミノ酸位置５５７、７５７、及び７７１位における（ｉ）の前記突然変異は、それぞれ、Ｅ５５７Ｒ、Ｅ７５７Ａ、及びＶ７７１Ｆである。１つの実施形態において、配列番号３８のアミノ酸位置７５７及び７７０位における（ｊ）の前記突然変異は、それぞれ、Ｅ７５７Ａ及びＴ７７０Ｇである。本開示のいくつかの好ましい実施形態では、ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４、配列番号１３６、配列番号１３８、配列番号１４０、配列番号１４２、及び配列番号１４４のうちいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
なお別の態様において、本開示は、配列番号３８のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％または少なくとも９０％の配列同一性を備えるＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントであって、以下の位置：（ａ）配列番号３８の１４１、２３１、２３３、及び２５４位；（ｂ）配列番号３８の１４１、２３１、２３３、及び２４４位；（ｃ）配列番号３８の１４１、２３１、２４４、４５１、５５７、７４９、及び７７０位；（ｄ）配列番号３８の２７、２８、６１、１４１、１４９、及び２３１位；（ｅ）配列番号３８の１４１、１５７、２３１、２３３、２４４、７５７、及び７８４位；（ｆ）配列番号３８の２８、６１、１４０、１４１、２３１、２３３、及び２７１位；または（ｇ）配列番号３８の２３１、２３３、２５４、及び５５７位の各々における突然変異を含み、脂肪酸からω−ヒドロキシル化脂肪酸への変換を触媒する、ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントを提供する。様々な実施形態において、配列番号３８のアミノ酸位置１４１、２３１、２３３、及び２５４位における（ａ）の前記突然変異は、アミノ酸置換である。様々な実施形態において、配列番号３８のアミノ酸位置１４１、２３１、２３３、及び２４４位における（ｂ）の前記突然変異は、アミノ酸置換である。様々な実施形態において、配列番号３８のアミノ酸位置１４１、２３１、２４４、４５１、５５７、７４９、及び７７０位における（ｃ）の前記突然変異は、アミノ酸置換である。様々な実施形態において、配列番号３８のアミノ酸位置２７、２８、６１、１４１、１４９、及び２３１位における（ｄ）の前記突然変異は、アミノ酸置換である。様々な実施形態において、配列番号３８のアミノ酸位置１４１、１５７、２３１、２３３、２４４、７５７、及び７８４位における（ｅ）の前記突然変異は、アミノ酸置換である。様々な実施形態において、配列番号３８のアミノ酸位置２８、６１、１４０、１４１、２３１、２３３、及び２７１位における（ｆ）の前記突然変異は、アミノ酸置換である。様々な実施形態において、配列番号３８のアミノ酸位置２３１、２３３、２５４、及び５５７位における（ｇ）の前記突然変異は、アミノ酸置換である。１つの実施形態において、配列番号３８のアミノ酸位置１４１、２３１、２３３、及び２５４位における（ａ）の前記突然変異は、それぞれ、Ｖ１４１Ｔ、Ａ２３１Ｙ、Ｌ２３３Ｓ、及びＲ２５４Ｇである。１つの実施形態において、配列番号３８のアミノ酸位置１４１、２３１、２３３、及び２４４位における（ｂ）の前記突然変異は、それぞれ、Ｖ１４１Ｔ、Ａ２３１Ｙ、Ｌ２３３Ｓ、及びＲ２４４Ａである。１つの実施形態において、配列番号３８のアミノ酸位置１４１、２３１、２４４、４５１、５５７、７４９、及び７７０位における（ｃ）の前記突然変異は、それぞれ、Ｖ１４１Ｔ、Ａ２３１Ｙ、Ｒ２４４Ａ、Ｖ４５１Ｍ、Ｅ５５７Ｗ、Ｅ７４９Ｌ、及びＴ７７０Ｇである。１つの実施形態において、配列番号３８のアミノ酸位置２７、２８、６１、１４１、１４９、及び２３１位における（ｄ）の前記突然変異は、それぞれ、Ｌ２７Ｒ、Ｑ２８Ｍ、Ｎ６１Ｌ、Ｖ１４１Ｔ、Ｐ１４９Ｇ、及びＡ２３１Ｙである。１つの実施形態において、配列番号３８のアミノ酸位置１４１、１５７、２３１、２３３、２４４、７５７、及び７８４位における（ｅ）の前記突然変異は、それぞれ、Ｖ１４１Ｔ、Ｒ１５７Ｓ、Ａ２３１Ｙ、Ｌ２３３Ｓ、Ｒ２４４Ａ、Ｅ７５７Ａ、及びＭ７８４Ｉである。１つの実施形態において、配列番号３８のアミノ酸位置２８、６１、１４０、１４１、２３１、２３３、及び２７１位における（ｆ）の前記突然変異は、それぞれ、Ｑ２８Ｍ、Ｎ６１Ｌ、Ｎ１４０Ｓ、Ｖ１４１Ｔ、Ａ２３１Ｙ、Ｌ２３３Ｓ、及びＥ２７１Ｄである。１つの実施形態において、配列番号３８のアミノ酸位置２３１、２３３、２５４、及び５５７位における（ｇ）の前記突然変異は、それぞれ、Ａ２３１Ｙ、Ｌ２３３Ｓ、Ｒ２５４Ｇ、及びＥ５５７Ｗである。本開示のいくつかの好ましい実施形態では、本開示のＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは、配列番号１４８、配列番号１５２、配列番号１５４、配列番号１５６、配列番号１５８、配列番号１６２、及び配列番号１６４のうちいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
なお別の態様において、本開示は、配列番号９８のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％または少なくとも９０％の配列同一性を備えるＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントであって、以下の位置：（ａ）配列番号９８の１４１、２３１、及び４０７位；（ｂ）配列番号９８の１４１、２３１、２３３、及び２５４位；（ｃ）配列番号９８の２３１、４０７、４５１、７５７、７７０、及び７８４位；（ｄ）配列番号９８の１４１、２３１、２３３、及び２４４位；（ｅ）配列番号９８の１４１、２３１、２４４、４５１、５５７、７４９、及び７７０位；（ｆ）配列番号９８の２７、２８、６１、１４１、１４９、及び２３１位；（ｇ）配列番号９８の２７、１１９、１４０、１４１、１５９、２３１、７５７、及び７８４位；（ｈ）配列番号９８の２３１、４０７、５９１、６４３、７５７、及び７８４位；（ｉ）配列番号９８の２８、６１、１４０、１４１、２３１、２３３、及び２７１位；または（ｊ）配列番号９８の２３１、２３３、及び２５４位の各々における突然変異を含み、脂肪酸からω−ヒドロキシル化脂肪酸への変換を触媒する、ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントを提供する。様々な実施形態において、配列番号９８のアミノ酸位置１４１、２３１、及び４０７位における（ａ）の前記突然変異は、アミノ酸置換である。様々な実施形態において、配列番号９８のアミノ酸位置１４１、２３１、２３３、及び２５４位における（ｂ）の前記突然変異は、アミノ酸置換である。様々な実施形態において、配列番号９８のアミノ酸位置２３１、４０７、４５１、７５７、７７０、及び７８４位における（ｃ）の前記突然変異は、アミノ酸置換である。様々な実施形態において、配列番号９８のアミノ酸位置１４１、２３１、２３３、及び２４４位における（ｄ）の前記突然変異は、アミノ酸置換である。様々な実施形態において、配列番号９８のアミノ酸位置１４１、２３１、２４４、４５１、５５７、７４９、及び７７０位における（ｅ）の前記突然変異は、アミノ酸置換である。様々な実施形態において、配列番号９８のアミノ酸位置２７、２８、６１、１４１、１４９、及び２３１位における（ｆ）の前記突然変異は、アミノ酸置換である。様々な実施形態において、配列番号９８のアミノ酸位置２７、１１９、１４０、１４１、１５９、２３１、７５７、及び７８４位における（ｇ）の前記突然変異は、アミノ酸置換である。様々な実施形態において、配列番号９８のアミノ酸位置２３１、４０７、５９１、６４３、７５７、及び７８４位における（ｈ）の前記突然変異は、アミノ酸置換である。様々な実施形態において、配列番号９８のアミノ酸位置２８、６１、１４０、１４１、２３１、２３３、及び２７１位における（ｉ）の前記突然変異は、アミノ酸置換である。様々な実施形態において、配列番号３８のアミノ酸位置２３１、２３３、及び２５４位における（ｊ）の前記突然変異は、アミノ酸置換である。１つの実施形態において、配列番号９８のアミノ酸位置１４１、２３１、及び４０７位における（ａ）の前記突然変異は、それぞれ、Ｖ１４１Ｔ、Ａ２３１Ｙ、及びＮ４０７Ｇである。１つの実施形態において、配列番号９８のアミノ酸位置１４１、２３１、２３３、及び２５４位における（ｂ）の前記突然変異は、それぞれ、Ｖ１４１Ｔ、Ａ２３１Ｙ、Ｌ２３３Ｓ、及びＲ２５４Ｇである。１つの実施形態において、配列番号９８のアミノ酸位置２３１、４０７、４５１、７５７、７７０、及び７８４位における（ｃ）の前記突然変異は、それぞれ、Ａ２３１Ｙ、Ｎ４０７Ｇ、Ｖ４５１Ｍ、Ｅ７５７Ａ、Ｔ７７０Ｇ、及びＭ７８４Ｉである。１つの実施形態において、配列番号９８のアミノ酸位置１４１、２３１、２３３、及び２４４位における（ｄ）の前記突然変異は、それぞれ、Ｖ１４１Ｔ、Ａ２３１Ｙ、Ｌ２３３Ｓ、及びＲ２４４Ａである。１つの実施形態において、配列番号９８のアミノ酸位置１４１、２３１、２４４、４５１、５５７、７４９、及び７７０位における（ｅ）の前記突然変異は、それぞれ、Ｖ１４１Ｔ、Ａ２３１Ｙ、Ｒ２４４Ａ、Ｖ４５１Ｍ、Ｅ５５７Ｗ、Ｅ７４９Ｌ、及びＴ７７０Ｇである。１つの実施形態において、配列番号９８のアミノ酸位置２７、２８、６１、１４１、１４９、及び２３１位における（ｆ）の前記突然変異は、それぞれ、Ｌ２７Ｒ、Ｑ２８Ｍ、Ｎ６１Ｌ、Ｖ１４１Ｔ、Ｐ１４９Ｇ、及びＡ２３１Ｙである。１つの実施形態において、配列番号９８のアミノ酸位置１４１、１５７、２３１、２３３、２４４、７５７、及び７８４位における（ｇ）の前記突然変異は、それぞれ、Ｖ１４１Ｔ、Ｒ１５７Ｓ、Ａ２３１Ｙ、Ｌ２３３Ｓ、Ｒ２４４Ａ、Ｅ７５７Ａ、及びＭ７８４Ｉである。１つの実施形態において、配列番号９８のアミノ酸位置２３１、４０７、５９１、６４３、７５７、及び７８４位における（ｈ）の前記突然変異は、それぞれ、Ａ２３１Ｙ、Ｎ４０７Ｇ、Ｅ５９１Ｑ、Ｒ６４３Ｈ、Ｅ７５７Ａ、及びＭ７８４Ｉである。１つの実施形態において、配列番号９８のアミノ酸位置２８、６１、１４０、１４１、２３１、２３３、及び２７１位における（ｉ）の前記突然変異は、それぞれ、Ｑ２８Ｍ、Ｎ６１Ｌ、Ｎ１４０Ｓ、Ｖ１４１Ｔ、Ａ２３１Ｙ、Ｌ２３３Ｓ、及びＥ２７１Ｄである。１つの実施形態において、配列番号９８のアミノ酸位置２３１、２３３、２５４、及び５５７位における（ｊ）の前記突然変異は、それぞれ、Ａ２３１Ｙ、Ｌ２３３Ｓ、Ｒ２５４Ｇ、及びＥ５５７Ｗである。本開示のいくつかの好ましい実施形態において、本開示のＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは、配列番号１４６、配列番号１４８、配列番号１５０、配列番号１５２、配列番号１５４、配列番号１５６、配列番号１５８、配列番号１６０、配列番号１６２、及び配列番号１６４のうちいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
本開示の様々な実施形態において、組換え宿主細胞における本開示により提供されるＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは、例えば、対応する宿主細胞における配列番号６または配列番号３８のＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドの発現により産生されるω−ヒドロキシル化脂肪酸の力価と比較して、より高い力価のω−ヒドロキシル化脂肪酸をもたらす。さらに、本開示の様々な実施形態において、本開示により提供されるＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは、ハイブリッドＣＹＰ１５３Ａ−ＲｅｄＲｈＦ融合ポリペプチドバリアントである。
１つの態様において、本開示は、本開示により提供されるＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントを発現する組換え宿主細胞を提供する。様々な実施形態において、組換え宿主細胞は、さらに、ＥＣ ３．１．２．−、ＥＣ ３．１．１．５またはＥＣ ３．１．２．１４のチオエステラーゼポリペプチドを発現する。また、様々な実施形態において、組換え宿主細胞は、炭素源含有培地において培養された場合において、配列番号３８または配列番号６を含む対応するＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドを発現する宿主細胞により産生されるω−ヒドロキシル化脂肪酸組成物の力価よりも、少なくとも１０％高い、少なくとも１５％高い、少なくとも２０％高い、少なくとも２５％高い、または少なくとも３０％高い力価を有するω−ヒドロキシル化脂肪酸組成物を産生する。
別の態様において、本開示は、本開示の組換え宿主細胞を含む細胞培養物を提供する。
別の態様において、本開示は、ω−ヒドロキシル化脂肪酸を産生する方法であって、（ｉ）本開示の組換え宿主細胞、または本開示の細胞培養物を、炭素源の存在下で培養することと、（ｉｉ）ω−ヒドロキシル化脂肪酸を採取することと、を含む方法を提供する。
別の態様において、本開示は、（ｉ）ＥＣ ３．１．２．−、ＥＣ ３．１．１．５またはＥＣ ３．１．２．１４のチオエステラーゼ；及び（ｉｉ）本開示のＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアント；を含むポリペプチドをコードする、少なくとも２つの核酸配列を発現するように操作された経路を含む、組換え微生物を提供する。
本開示の様々な実施形態において、ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは自給型ＣＹＰ１５３Ａ−ＲｅｄＲｈＦハイブリッド融合タンパク質バリアントである。
本開示の別の態様は、配列番号６に対して少なくとも約９０％、９１％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し、且つ７９６、１４１、２３１、２７、８２、１７８、３０９、４０７、４１５、５１６及び／または６６６の位置を含むアミノ酸位置において少なくとも１つの突然変異を有するＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントであって、脂肪酸からω−ＯＨ脂肪酸への変換を触媒するＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントを提供する。ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは、下記：アラニン（Ａ）がバリン（Ｖ）で置換されている（即ち、それと交換されている）位置Ａ７９６Ｖ；バリンがイソロイシン（Ｉ）で置換されている位置Ｖ１４１Ｉ；バリン（Ｖ）がグルタミン（Ｑ）で置換されている位置Ｖ１４１Ｑ；バリン（Ｖ）がグリシン（Ｇ）で置換されている位置Ｖ１４１Ｇ；バリン（Ｖ）がメチオニン（Ｍ）で置換されている位置Ｖ１４１Ｍ；バリン（Ｖ）がロイシン（Ｌ）で置換されている位置Ｖ１４１Ｌ；バリン（Ｖ）がスレオニン（Ｔ）で置換されている位置Ｖ１４１Ｔ；アラニン（Ａ）がスレオニン（Ｔ）で置換されている位置Ａ２３１Ｔ；アルギニン（Ｒ）がリジン（Ｌ）で置換されている位置Ｒ２７Ｌ；アルギニン（Ｒ）がアスパラギン酸（Ｄ）で置換されている位置Ｒ８２Ｄ；アルギニン（Ｒ）がアスパラギン（Ｎ）で置換されている位置Ｒ１７８Ｎ；アスパラギン（Ｎ）がアルギニン（Ｒ）で置換されている位置Ｎ３０９Ｒ；アスパラギン（Ｎ）がアラニン（Ａ）で置換されている位置Ｎ４０７Ａ；バリン（Ｖ）がアルギニン（Ｒ）で置換されている位置Ｖ４１５Ｒ；スレオニン（Ｔ）がバリン（Ｖ）で置換されている位置Ｔ５１６Ｖ；プロリン（Ｐ）がアラニン（Ａ）で置換されている位置Ｐ６６６Ａ；及びプロリン（Ｐ）がアスパラギン酸（Ｄ）で置換されている位置Ｐ６６６Ｄを含む位置のいずれか１つまたはそれ以上に突然変異を有する。ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントの例としては、配列の表Ａ（パラグラフ［０１４６］）に示すように、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８または配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、及び配列番号４６が挙げられる。１つの実施形態において、ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントはハイブリッドＣＹＰ１５３Ａ−ＲｅｄＲｈＦ−タイプ融合タンパク質バリアントである。別の実施形態では、組換え宿主細胞におけるＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは、対応する宿主細胞におけるＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチド（鋳型；例えば、配列番号６、配列番号３８、配列番号９８）の発現により産生されるω−ＯＨ脂肪酸またはω−ＯＨ脂肪酸誘導体或いはその組成物の力価と比較して、より高い力価のω−ＯＨ脂肪酸またはω−ＯＨ脂肪酸誘導体或いはその組成物をもたらす。別の実施形態において、ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは、Ａ７９６Ｖを含むアミノ酸位置７９６における突然変異を有する。別の実施形態において、ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは、Ａ２３１Ｔを含むアミノ酸位置２３１における突然変異を有する。別の実施形態において、ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは、Ｖ１４１ＩまたはＶ１４１Ｔを含むアミノ酸位置１４１における突然変異を有する。ここで、組換え宿主細胞における突然変異Ａ７９６Ｖ、Ｖ１４１ＩもしくはＶ１４１Ｔ、及び／またはＡ２３１Ｔを有するＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントの発現は、それぞれ、ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチド（鋳型；例えば、配列番号６、配列番号３８、配列番号９８）の発現により産生されるω−ＯＨ Ｃ１２またはＣ１６脂肪酸の力価と比較して、より高い力価のω−ＯＨ Ｃ１２またはＣ１６脂肪酸をもたらす。
本開示は、さらに、本開示により提供されるＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントを発現する組換え宿主細胞を有する細胞培養物を企図する。ω−ＯＨ脂肪酸または脂肪酸誘導体或いはその組成物は、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、Ｃ１５、Ｃ１６、Ｃ１７、Ｃ１８、Ｃ１９及びＣ２０ ω−ＯＨ脂肪酸または脂肪酸誘導体の１種以上を含むことができる。ω−ＯＨ脂肪酸または脂肪酸誘導体或いはその組成物は飽和または不飽和のω−ＯＨ脂肪酸または脂肪酸誘導体を含むことができる。別の実施形態において、ω−ＯＨ脂肪酸または脂肪酸誘導体或いはその組成物は、Ｃ８：１、Ｃ９：１、Ｃ１０：１、Ｃ１１：１、Ｃ１２：１、Ｃ１３：１、Ｃ１４：１、Ｃ１５：１、Ｃ１６：１、Ｃ１７：１、Ｃ１８：１、Ｃ１９：１及びＣ２０：１不飽和ω−ＯＨ脂肪酸または脂肪酸誘導体の１種以上を含むことができる。別の実施形態において、ω−ＯＨ脂肪酸または脂肪酸誘導体或いはその組成物はω−ＯＨ Ｃ１２及び／またはＣ１６及び／またはＣ１６：１脂肪酸または脂肪酸誘導体を含むことができる。
本開示の別の態様は、本開示のＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントを発現する宿主細胞を炭素源で培養すること、及びω−ＯＨ脂肪酸またはω−ＯＨ脂肪酸誘導体を採取することを含む、ω−ＯＨ脂肪酸または脂肪酸誘導体或いはその組成物を産生する方法を提供する。本方法は、ω−ＯＨ脂肪酸またはω−ＯＨ脂肪酸誘導体或いはその組成物の力価における増大／改良をもたらす。１つの態様において、ω−ＯＨ脂肪酸またはω−ＯＨ脂肪酸誘導体は、ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチド発現宿主細胞により、特に、例えば、配列番号６、配列番号３８、または配列番号９８のＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドを発現する宿主細胞により産出されるω−ＯＨ脂肪酸またはω−ＯＨ脂肪酸誘導体の力価よりも、少なくとも約２０％〜３０％高い。別の態様では、ω−ＯＨ脂肪酸または脂肪酸誘導体或いはその組成物は、炭素源、特に再生可能な原料由来の炭素源から、約１５ｇ／Ｌ〜約２５ｇ／Ｌの力価で産生される。様々な実施形態において、炭素系の再生可能な原料は、トウモロコシ、サトウキビ、モロコシ、ビート、スイッチグラス、貯蔵牧草、麦わら、材木、パルプ、下水、ごみ、都市廃棄物、煙道ガス（ｆｌｕ−ｇａｓ）、合成ガス、バイオマス加水分解物、及び二酸化炭素からなる群から選択される。
本開示の別の態様は、Ｖ１４１ＩまたはＡ２３１Ｔに突然変異を有する配列番号３２に対して、少なくとも約９０％、９１％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントであって、脂肪酸を、ω−ＯＨ Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、Ｃ１５、Ｃ１６、Ｃ１７、Ｃ１８、Ｃ１９、Ｃ２０、Ｃ８：１、Ｃ９：１、Ｃ１０：１、Ｃ１１：１、Ｃ１２：１、Ｃ１３：１、Ｃ１４：１、Ｃ１５：１、Ｃ１６：１、Ｃ１７：１、Ｃ１８：１、Ｃ１９：１及び／またはＣ２０：１脂肪酸または脂肪酸誘導体或いはその組成物に変換するのを触媒するＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントを提供する。本開示の別の態様は、Ｒ２７Ｌ、Ｒ８２Ｄ、Ｖ１４１Ｍ、Ｒ１７８Ｎ及びＮ４０７Ａに突然変異を有する配列番号３４に対して、少なくとも約９０％、９１％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントであって、脂肪酸を、ω−ＯＨ Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、Ｃ１５、Ｃ１６、Ｃ１７、Ｃ１８、Ｃ１９、Ｃ２０、Ｃ８：１、Ｃ９：１、Ｃ１０：１、Ｃ１１：１、Ｃ１２：１、Ｃ１３：１、Ｃ１４：１、Ｃ１５：１、Ｃ１６：１、Ｃ１７：１、Ｃ１８：１、Ｃ１９：１及び／またはＣ２０：１脂肪酸または脂肪酸誘導体或いはその組成物に変換するのを触媒するＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントを提供する。本開示の別の態様は、Ｐ６６６Ａに突然変異を有する配列番号３６に対して、少なくとも約９０％、９１％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントであって、脂肪酸を、ω−ＯＨ Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、Ｃ１５、Ｃ１６、Ｃ１７、Ｃ１８、Ｃ１９、Ｃ２０、Ｃ８：１、Ｃ９：１、Ｃ１０：１、Ｃ１１：１、Ｃ１２：１、Ｃ１３：１、Ｃ１４：１、Ｃ１５：１、Ｃ１６：１、Ｃ１７：１、Ｃ１８：１、Ｃ１９：１及び／またはＣ２０：１脂肪酸または脂肪酸誘導体或いはその組成物に変換するのを触媒するＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントを提供する。本開示の別の態様は、Ａ７９６Ｖに突然変異を有する配列番号３８に対して、少なくとも約９０％、９１％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントであって、脂肪酸を、ω−ＯＨ Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、Ｃ１５、Ｃ１６、Ｃ１７、Ｃ１８、Ｃ１９、Ｃ２０、Ｃ８：１、Ｃ９：１、Ｃ１０：１、Ｃ１１：１、Ｃ１２：１、Ｃ１３：１、Ｃ１４：１、Ｃ１５：１、Ｃ１６：１、Ｃ１７：１、Ｃ１８：１、Ｃ１９：１及び／またはＣ２０：１脂肪酸または脂肪酸誘導体或いはその組成物に変換するのを触媒するＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントを提供する。本開示の別の態様は、Ａ７９６Ｖ、Ｐ６６６Ｄ及びＴ５１６Ｖに突然変異を有する配列番号４０に対して、少なくとも約９０％、９１％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントであって、脂肪酸を、ω−ＯＨ Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、Ｃ１５、Ｃ１６、Ｃ１７、Ｃ１８、Ｃ１９、Ｃ２０、Ｃ８：１、Ｃ９：１、Ｃ１０：１、Ｃ１１：１、Ｃ１２：１、Ｃ１３：１、Ｃ１４：１、Ｃ１５：１、Ｃ１６：１、Ｃ１７：１、Ｃ１８：１、Ｃ１９：１及び／またはＣ２０：１脂肪酸または脂肪酸誘導体或いはその組成物に変換するのを触媒するＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントを提供する。本開示の別の態様は、Ｖ１４１Ｉ、Ａ２３１Ｔ及びＡ７９６Ｖに突然変異を有する配列番号４２に対して、少なくとも約９０％、９１％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントであって、脂肪酸を、ω−ＯＨ Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、Ｃ１５、Ｃ１６、Ｃ１７、Ｃ１８、Ｃ１９、Ｃ２０、Ｃ８：１、Ｃ９：１、Ｃ１０：１、Ｃ１１：１、Ｃ１２：１、Ｃ１３：１、Ｃ１４：１、Ｃ１５：１、Ｃ１６：１、Ｃ１７：１、Ｃ１８：１、Ｃ１９：１及び／またはＣ２０：１脂肪酸または脂肪酸誘導体或いはその組成物に変換するのを触媒するＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントを提供する。本開示の別の態様は、Ｒ２７Ｌ、Ｒ８２Ｄ、Ｖ１４１Ｍ、Ｒ１７８Ｎ、Ｎ４０７Ａ及びＡ７９６Ｖに突然変異を有する配列番号４４に対して、少なくとも約９０％、９１％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントであって、脂肪酸を、ω−ＯＨ Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、Ｃ１５、Ｃ１６、Ｃ１７、Ｃ１８、Ｃ１９、Ｃ２０、Ｃ８：１、Ｃ９：１、Ｃ１０：１、Ｃ１１：１、Ｃ１２：１、Ｃ１３：１、Ｃ１４：１、Ｃ１５：１、Ｃ１６：１、Ｃ１７：１、Ｃ１８：１、Ｃ１９：１及び／またはＣ２０：１脂肪酸または脂肪酸誘導体或いはその組成物に変換するのを触媒するＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントを提供する。本開示の別の態様は、Ｖ１４１Ｔ、Ａ２３１Ｔ及びＡ７９６Ｖに突然変異を有する配列番号４６に対して、少なくとも約９０％、９１％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントであって、脂肪酸を、ω−ＯＨ Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、Ｃ１５、Ｃ１６、Ｃ１７、Ｃ１８、Ｃ１９、Ｃ２０、Ｃ８：１、Ｃ９：１、Ｃ１０：１、Ｃ１１：１、Ｃ１２：１、Ｃ１３：１、Ｃ１４：１、Ｃ１５：１、Ｃ１６：１、Ｃ１７：１、Ｃ１８：１、Ｃ１９：１及び／またはＣ２０：１脂肪酸または脂肪酸誘導体或いはその組成物に変換するのを触媒するＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントを提供する。
本開示は、さらに、本開示により提供されるＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントを発現する組換え宿主細胞を企図する。１つの実施形態において、組換え宿主細胞は、本開示のＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアント（上記）、及びＥＣ ３．１．２．−またはＥＣ ３．１．１．５またはＥＣ ３．１．２．１４のチオエステラーゼポリペプチドを発現し、この組換え宿主細胞は、本開示のＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントを発現するために有効な条件下に炭素源含有培地において培養された場合において、対応するＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドを発現する、例えば、配列番号６または配列番号３８のＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドを発現する宿主細胞により産生されるω−ＯＨ脂肪酸またはその組成物の力価よりも、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、または少なくとも３０％上回る力価を有するω−ＯＨ脂肪酸またはその組成物を産生する。１つの実施形態において、ω−ＯＨ脂肪酸またはその組成物は、約１５ｇ／Ｌ〜約２５ｇ／Ｌの力価で産生されることができる。別の態様では、ω−ＯＨ脂肪酸またはその組成物は、細胞外で産生される。
１つの態様において、本開示は、本開示のＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントを発現するように操作された組換え微生物を提供する。様々な実施形態において、当該組換え微生物は、ω−ヒドロキシ脂肪酸またはω−ＯＨ脂肪酸誘導体、特にω−ヒドロキシ脂肪酸メチルエステルを産生する、または産生することができる。様々な実施形態において、当該組換え微生物は、ＥＣ １．１．１．１／２のアルコールデヒドロゲナーゼまたはＥＣ １．１．３．１３もしくはＥＣ １．１．３．２０のアルコールオキシダーゼを含むポリペプチドをコードする核酸配列をさらに発現するように操作され、好ましくは、このとき当該組換え微生物は、ω−オキソ脂肪酸及びω−オキソ脂肪酸メチルエステルからなる群から選択されるω−ヒドロキシ脂肪酸誘導体を産生する。この組換え微生物は、ＥＣ １．２．１．３／４／５のアルデヒドデヒドロゲナーゼまたはＥＣ １．２．３．１のアルデヒドオキシダーゼを含むポリペプチドをコードする核酸配列をさらに発現するように操作されてもよく、このとき当該組換え微生物は、α，ω−二酸またはω−カルボキシ脂肪酸メチルエステルであるω−ヒドロキシ脂肪酸誘導体を産生する。この組換え微生物は、ＥＣ ６．２．１．３のアシル−ＣｏＡリガーゼまたはＥＣ ２．８．３．６のアシル−ＣｏＡトランスフェラーゼを含むポリペプチドをコードする核酸配列をさらに発現するように操作されてもよく、このとき当該組換え微生物は、α，ω−ジエステルであるω−ヒドロキシ脂肪酸誘導体を産生する。様々な実施形態において、ＥＣ １．１．１．１／２のアルコールデヒドロゲナーゼまたはＥＣ １．１．３．１３もしくはＥＣ １．１．３．２０のアルコールオキシダーゼを含むポリペプチドをコードする核酸配列をさらに発現するように操作された上述の組換え微生物は、ＥＣ ２．６．１のアミノトランスフェラーゼまたはＥＣ １．４．９、ＥＣ １．４．９８もしくはＥＣ １．４．９９のアミンデヒドロゲナーゼを含むポリペプチドをコードする核酸配列さらに発現して、ω−アミノ脂肪酸及びω−アミノ脂肪酸メチルエステルからなる群から選択されるω−ヒドロキシ脂肪酸誘導体を産生するように操作されてもよい。様々な実施形態において、当該組換え微生物は、ＥＣ １．１．−．−のアルコールデヒドロゲナーゼ及び１．２．９９のカルボン酸レダクターゼを含むポリペプチドをコードする核酸配列をさらに発現するように操作されてもよく、このとき、産生されるω−ヒドロキシ脂肪酸誘導体はα，ω−ジオールである。別の態様において、本開示は、ＥＣ ３．１．２．−、ＥＣ ３．１．１．５またはＥＣ ３．１．２．１４のチオエステラーゼ；及び本開示のＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアント；を含むポリペプチドをコードする、少なくとも２つの核酸配列を発現するように操作された経路を有する、組換え微生物を包含する。当該組換え微生物は、再生可能な原料由来の炭素源の存在下、発酵ブロスで増殖させた場合に、インビボでのω−ＯＨ脂肪酸またはω−ＯＨ脂肪酸誘導体の産生に使用することができる。１つの実施形態では、ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは自給型ＣＹＰ１５３Ａ−ＲｅｄＲｈＦハイブリッド融合タンパク質バリアントである。
１つの態様において、本開示は、ω−ヒドロキシ脂肪酸誘導体を産生する方法であって、（ａ）本開示の組換え微生物を、炭素源を含有する再生可能な原料を含む培養培地で培養することと、（ｂ）ω−ヒドロキシ脂肪酸誘導体を、組換え微生物または培養培地から単離することと、を含む方法を提供する。好ましくは、前記再生可能な原料は炭素系であり、好ましくは、前記炭素系の再生可能な原料は、トウモロコシ、サトウキビ、モロコシ、ビート、スイッチグラス、貯蔵牧草、麦わら、材木、パルプ、下水、ごみ、都市廃棄物、煙道ガス、合成ガス、バイオマス加水分解物、及び二酸化炭素からなる群から選択される。
本開示の別の態様は、本開示の組換え宿主細胞を含む細胞培養物を提供する。本開示の細胞培養物は、ω−ＯＨ脂肪酸またはその組成物を産生する。１つの実施形態では、細胞培養物は、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、Ｃ１５、Ｃ１６、Ｃ１７、Ｃ１８、Ｃ１９、Ｃ２０、Ｃ８：１、Ｃ９：１、Ｃ１０：１、Ｃ１１：１、Ｃ１２：１、Ｃ１３：１、Ｃ１４：１、Ｃ１５：１、Ｃ１６：１、Ｃ１７：１、Ｃ１８：１、Ｃ１９：１及び／またはＣ２０：１脂肪酸または脂肪酸誘導体或いはその組成物の１種以上を含むω−ＯＨ脂肪酸を産生することができる。１つの実施形態において、細胞培養物は、不飽和ω−ＯＨ Ｃ１６：１脂肪酸またはその組成物を産生する。別の実施形態において、細胞培養物は、飽和ω−ＯＨ Ｃ１６脂肪酸またはその組成物を産生する。１つの実施形態において、細胞培養物は、不飽和ω−ＯＨ Ｃ１２：１脂肪酸またはその組成物を産生する。別の実施形態において、細胞培養物は、飽和ω−ＯＨ Ｃ１２脂肪酸またはその組成物を産生する。１つの実施形態において、細胞培養物は、不飽和ω−ＯＨ Ｃ１４：１脂肪酸またはその組成物を産生する。別の実施形態において、細胞培養物は、飽和ω−ＯＨ Ｃ１４脂肪酸またはその組成物を産生する。１つの実施形態において、細胞培養物は、不飽和ω−ＯＨ Ｃ１８：１脂肪酸またはその組成物を産生する。別の実施形態において、細胞培養物は、飽和ω−ＯＨ Ｃ１８脂肪酸またはその組成物を産生する。１つの実施形態において、細胞培養物は、不飽和ω−ＯＨ Ｃ１０：１脂肪酸またはその組成物を産生する。別の実施形態において、細胞培養物は、飽和ω−ＯＨ Ｃ１０脂肪酸またはその組成物を産生する。１つの実施形態において、細胞培養物は、不飽和ω−ＯＨ Ｃ８：１脂肪酸またはその組成物を産生する。別の実施形態において、細胞培養物は、飽和ω−ＯＨ Ｃ８脂肪酸またはその組成物を産生する。１つの実施形態において、細胞培養物は、不飽和ω−ＯＨ Ｃ２０：１脂肪酸またはその組成物を産生する。別の実施形態において、細胞培養物は、飽和ω−ＯＨ Ｃ２０脂肪酸またはその組成物を産生する。さらに別の実施形態において、追加の飽和または不飽和ω−ＯＨ脂肪酸またはその組成物が組換え宿主細胞により産生される。
本開示のなお別の態様は、ω−ＯＨ脂肪酸を産生する方法であって、本開示の宿主細胞を炭素源で培養し、ω−ＯＨ脂肪酸またはその組成物を採取することを含む方法を提供する。本方法は、産生されるω−ＯＨ脂肪酸の力価における増大/改良をもたらす。本方法は、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、Ｃ１５、Ｃ１６、Ｃ１７、Ｃ１８、Ｃ１９、Ｃ２０、Ｃ８：１、Ｃ９：１、Ｃ１０：１、Ｃ１１：１、Ｃ１２：１、Ｃ１３：１、Ｃ１４：１、Ｃ１５：１、Ｃ１６：１、Ｃ１７：１、Ｃ１８：１、Ｃ１９：１及び／またはＣ２０：１脂肪酸または脂肪酸誘導体或いはその組成物であるω−ＯＨ脂肪酸を採取することを企図している。１つの実施形態において、採取されるω−ＯＨ脂肪酸は、不飽和ω−ＯＨ Ｃ１６：１脂肪酸またはその組成物である。別の実施形態において、採取されるω−ＯＨ脂肪酸は、飽和ω−ＯＨ Ｃ１６脂肪酸またはその組成物である。１つの実施形態において、採取されるω−ＯＨ脂肪酸は、不飽和ω−ＯＨ Ｃ１２：１脂肪酸またはその組成物である。別の実施形態において、採取されるω−ＯＨ脂肪酸は、飽和ω−ＯＨ Ｃ１２脂肪酸またはその組成物である。１つの実施形態において、採取されるω−ＯＨ脂肪酸は、不飽和ω−ＯＨ Ｃ１４：１脂肪酸またはその組成物である。別の実施形態において、採取されるω−ＯＨ脂肪酸は、飽和ω−ＯＨ Ｃ１４脂肪酸またはその組成物である。１つの実施形態において、採取されるω−ＯＨ脂肪酸は、不飽和ω−ＯＨ Ｃ１８：１脂肪酸またはその組成物である。別の実施形態において、採取されるω−ＯＨ脂肪酸は、飽和ω−ＯＨ Ｃ１８脂肪酸またはその組成物である。１つの実施形態において、採取されるω−ＯＨ脂肪酸は、不飽和ω−ＯＨ Ｃ１０：１脂肪酸またはその組成物である。別の実施形態において、採取されるω−ＯＨ脂肪酸は、飽和ω−ＯＨ Ｃ１０脂肪酸またはその組成物である。１つの実施形態において、採取されるω−ＯＨ脂肪酸は、不飽和ω−ＯＨ Ｃ８：１脂肪酸またはその組成物である。別の実施形態において、採取されるω−ＯＨ脂肪酸は、飽和ω−ＯＨ Ｃ８脂肪酸またはその組成物である。１つの実施形態において、採取されるω−ＯＨ脂肪酸は、不飽和ω−ＯＨ Ｃ２０：１脂肪酸またはその組成物である。別の実施形態において、採取されるω−ＯＨ脂肪酸は、飽和ω−ＯＨ Ｃ２０脂肪酸またはその組成物である。さらに別の実施形態において、追加の飽和または不飽和ω−ＯＨ脂肪酸またはその組成物が本明細書に記載された方法により産生される。
本開示の別の態様は、配列番号３８に対して少なくとも約９０％、９１％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し、且つ９、１０、１１、１２、１３、１４、２７、２８、５６、６１、１１１、１１９、１４０、１４９、１５４、１５７、１６２、１６４、２０４、２３１、２３３、２４４、２５４、２７１、２７３、３０２、３０９、３２７、４０７、４１３、４７７、４８０、４８１、５２７、５４４、５４６、５５７、５６７、５９１、６４８、６４９、７０３、７０６、７０７、７０８、７０９、７１０、７１９、７２０、７３６、７４１、７４５、７４７、７４９、７５７、７７０、７７１、７８４の位置を含むアミノ酸位置において少なくとも１つ以上の突然変異を有するＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントであって、脂肪酸からω−ＯＨ脂肪酸またはその組成物への変換を触媒するＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントを提供する。ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは、下記：アスパラギン酸塩（Ｄ）がアスパラギン（Ｎ）で置換されている（即ち、それと交換されている）位置Ｄ９Ｎ；アスパラギン酸塩（Ｄ）がリジン（Ｋ）で置換されている位置Ｄ９Ｋ；アスパラギン酸（Ｄ）がチロシン（Ｙ）で置換されている位置Ｄ１０Ｙ；イソロイシン（Ｉ）がロイシン（Ｌ）で置換されている位置Ｉ１１Ｌ；グルタミン（Ｑ）がトリプトファン（Ｗ）で置換されている位置Ｑ１２Ｗ；グルタミン（Ｑ）がアルギニン（Ｒ）で置換されている位置Ｑ１２Ｒ；グルタミン（Ｑ）がスレオニン（Ｔ）で置換されている位置Ｑ１２Ｔ；セリン（Ｓ）がリジン（Ｋ）で置換されている位置Ｓ１３Ｋ；アルギニン（Ｒ）がフェニルアラニン（Ｆ）で置換されている位置Ｒ１４Ｆ；アルギニン（Ｒ）がロイシン（Ｌ）で置換されている位置Ｒ２７Ｌ；グルタミン（Ｑ）がメチオニン（Ｍ）で置換されている位置Ｑ２８Ｍ；グルタミン（Ｑ）がスレオニン（Ｔ）で置換されている位置Ｑ２８Ｔ；プロリン（Ｐ）がグルタミン（Ｑ）で置換されている位置Ｐ５６Ｑ；アスパラギン（Ｎ）がロイシン（Ｌ）で置換されている位置Ｎ６１Ｌ；フェニルアラニン（Ｆ）がアラニン（Ａ）で置換されている位置Ｆ１１１Ａ；リジン（Ｋ）がアルギニン（Ｒ）で置換されている位置Ｋ１１９Ｒ；セリン（Ｓ）がアスパラギン（Ｎ）で置換されている位置Ｓ１４０Ｎ；プロリン（Ｐ）がグリシン（Ｇ）で置換されている位置Ｐ１４９Ｇ；プロリン（Ｐ）がアルギニン（Ｒ）で置換されている位置Ｐ１４９Ｒ；バリン（Ｖ）がグリシン（Ｇ）で置換されている位置Ｖ１５４Ｇ；セリン（Ｓ）がアルギニン（Ｒ）で置換されている位置Ｓ１５７Ｒ；バリン（Ｖ）がシステイン（Ｃ）で置換されている位置Ｖ１６２Ｃ；アラニン（Ａ）がアスパラギン（Ｎ）で置換されている位置Ａ１６４Ｎ；グルシン（Ｇ）がバリン（Ｖ）で置換されている位置Ｇ２０４Ｖ；アラニン（Ａ）がトリプトファン（Ｗ）で置換されている位置Ａ２３１Ｗ；アラニン（Ａ）がチロシン（Ｙ）で置換されている位置Ａ２３１Ｙ；アラニン（Ａ）がバリン（Ｖ）で置換されている位置Ａ２３１Ｖ；セリン（Ｓ）がロイシン（Ｌ）で置換されている位置Ｓ２３３Ｌ；セリン（Ｓ）がバリン（Ｖ）で置換されている位置Ｓ２３３Ｖ；アラニン（Ａ）がアルギニン（Ｒ）で置換されている位置Ａ２４４Ｒ；アルギニン（Ｒ）がグリシン（Ｇ）で置換されている位置Ｒ２５４Ｇ；グルタミン酸塩（Ｅ）がアスパラギン酸塩（Ｄ）で置換されている位置Ｅ２７１Ｄ；プロリン（Ｐ）がメチオニン（Ｍ）で置換されている位置Ｐ２７３Ｍ；スレオニン（Ｔ）がメチオニン（Ｍ）で置換されている位置Ｔ３０２Ｍ；アスパラギン（Ｎ）がセリン（Ｓ）で置換されている位置Ｎ３０９Ｓ；プロリン（Ｐ）がアスパラギン酸塩（Ｄ）で置換されている位置Ｐ３２７Ｄ；アスパラギン（Ｎ）がグリシン（Ｇ）で置換されている位置Ｎ４０７Ｇ；チロシン（Ｙ）がアルギニン（Ｒ）で置換されている位置Ｙ４１３Ｒ；バリン（Ｖ）がメチオニン（Ｍ）で置換されている位置Ｖ４５１Ｍ；プロリン（Ｐ）がグリシン（Ｇ）で置換されている位置Ｐ４７７Ｇ；イソロイシン（Ｉ）がグリシン（Ｇ）で置換されている位置Ｉ４８０Ｇ；グリシン（Ｇ）がイソロイシン（Ｉ）で置換されている位置Ｇ４８１Ｉ；アスパラギン酸塩（Ｄ）がグルタミン酸塩（Ｅ）で置換されている位置Ｄ５２７Ｅ；アスパラギン酸塩（Ｄ）がアスパラギン（Ｎ）で置換されている位置Ｄ５４４Ｎ；プロリン（Ｐ）がグリシン（Ｇ）で置換されている位置Ｐ５４６Ｇ；グルタミン酸塩（Ｅ）がアルギニン（Ｒ）で置換されている位置Ｅ５５７Ｒ；グルタミン酸塩（Ｅ）がトリプトファン（Ｗ）で置換されている位置Ｅ５５７Ｗ；グルタミン酸塩（Ｅ）がセリン（Ｓ）で置換されている位置Ｅ５６７Ｓ；グルタミン酸塩（Ｅ）がグルタミン（Ｑ）で置換されている位置Ｅ５９１Ｑ；バリン（Ｖ）がロイシン（Ｌ）で置換されている位置Ｖ６４８Ｌ；セリン（Ｓ）がイソロイシン（Ｉ）で置換されている位置Ｓ６４９Ｉ；ロイシン（Ｌ）がグリシン（Ｇ）で置換されている位置Ｌ７０３Ｇ；ロイシン（Ｌ）がグルタミン酸塩（Ｅ）で置換されている位置Ｌ７０６Ｅ；ロイシン（Ｌ）がセリン（Ｓ）で置換されている位置Ｌ７０６Ｓ；ロイシン（Ｌ）がヒスチジン（Ｈ）で置換されている位置Ｌ７０６Ｈ；アスパラギン酸塩（Ｄ）がグルタミン酸塩（Ｅ）で置換されている位置Ｄ７０７Ｅ；プロリン（Ｐ）がセリン（Ｓ）で置換されている位置Ｐ７０８Ｓ；アスパラギン酸塩（Ｄ）がロイシン（Ｌ）で置換されている位置Ｄ７０９Ｌ；バリン（Ｖ）がシステイン（Ｃ）で置換されている位置Ｖ７１０Ｃ；バリン（Ｖ）がアルギニン（Ｒ）で置換されている位置Ｖ７１０Ｒ；バリン（Ｖ）がグルタミン（Ｑ）で置換されている位置Ｖ７１０Ｑ；アルギニン（Ｒ）がトリプトファン（Ｗ）で置換されている位置Ｒ７１９Ｗ；アスパラギン酸塩（Ｄ）がバリン（Ｖ）で置換されている位置Ｄ７２０Ｖ；アラニン（Ａ）がバリン（Ｖ）で置換されている位置Ａ７３６Ｖ；アスパラギン（Ｎ）がグリシン（Ｇ）で置換されている位置Ｎ７４１Ｇ；プロリン（Ｐ）がリジン（Ｋ）で置換されている位置Ｐ７４５Ｋ；プロリン（Ｐ）がアルギニン（Ｒ）で置換されている位置Ｐ７４５Ｒ；アスパラギン酸塩（Ｄ）がアスパラギン（Ｎ）で置換されている位置Ｄ７４７Ｎ；グルタミン酸塩（Ｅ）がロイシン（Ｌ）で置換されている位置Ｅ７４９Ｌ；グルタミン酸塩（Ｅ）がメチオニン（Ｍ）で置換されている位置Ｅ７４９Ｍ；グルタミン酸塩（Ｅ）がアラニン（Ａ）で置換されている位置Ｅ７５７Ａ；スレオニン（Ｔ）がグリシン（Ｇ）で置換されている位置Ｔ７７０Ｇ；バリン（Ｖ）がフェニルアラニン（Ｆ）で置換されている位置Ｖ７７１Ｆ；及びメチオニン（Ｍ）がイソロイシン（Ｉ）で置換されている位置Ｍ７８４Ｉを含む位置のいずれか１つ以上に突然変異を有する。１つの実施形態において、ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントはハイブリッドｃｙｐ１５３Ａ−ＲｅｄＲｈＦ−タイプ融合タンパク質バリアントである。別の実施形態において、組換え宿主細胞におけるＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは、対応する宿主細胞における鋳型ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチド、例えば、配列番号６または配列番号３８のＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドの発現により産生されるω−ＯＨ脂肪酸の力価と比較して、より高い力価のω−ＯＨ脂肪酸をもたらす。別の実施形態において、ω−ＯＨ脂肪酸はω−ＯＨ脂肪酸組成物である。
本開示のＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントの例は、配列の表Ｂ及びＣ（パラグラフ［００１４７］及び［００１４８］、後掲）に示される配列番号４７〜１６４である。
本開示の別の態様は、配列番号３８に対して少なくとも約９０％、９１％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し、且つ７４７、１２、３２７、１４、６１、２８、１３、７７１、１１９、１０、１１、２８、２３１、７４５、９、７７０、４１３、７８４、７４９、２３３、７５７、及び７０３の位置を含むアミノ酸位置において少なくとも１つの突然変異を有するＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントであって、脂肪酸からω−ＯＨ脂肪酸への変換を触媒するＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントを提供する。ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは、下記：アスパラギン酸塩（Ｄ）がアスパラギン（Ｎ）で置換されている位置Ｄ７４７Ｎ；グルタミン（Ｑ）がトリプトファン（Ｗ）で置換されている位置Ｑ１２Ｗ；グルタミン（Ｑ）がアルギニン（Ｒ）で置換されている位置Ｑ１２Ｒ；グルタミン（Ｑ）がスレオニン（Ｔ）で置換されている位置Ｑ１２Ｔ；プロリン（Ｐ）がアスパラギン酸塩（Ｄ）で置換されている位置Ｐ３２７Ｄ；アルギニン（Ｒ）がフェニルアラニン（Ｆ）で置換されている位置Ｒ１４Ｆ；アスパラギン（Ｎ）がロイシン（Ｌ）で置換されている位置Ｎ６１Ｌ；グルタミン（Ｑ）がメチオニン（Ｍ）で置換されている位置Ｑ２８Ｍ；セリン（Ｓ）がリジン（Ｋ）で置換されている位置Ｓ１３Ｋ；バリン（Ｖ）がフェニルアラニン（Ｆ）で置換されている位置Ｖ７７１Ｆ；リジン（Ｋ）がアルギニン（Ｒ）で置換されている位置Ｋ１１９Ｒ；アスパラギン酸（Ｄ）がチロシン（Ｙ）で置換されている位置Ｄ１０Ｙ；イソロイシン（Ｉ）がロイシン（Ｌ）で置換されている位置Ｉ１１Ｌ；グルタミン（Ｑ）がスレオニン（Ｔ）で置換されている位置Ｑ２８Ｔ；プロリン（Ｐ）がアルギニン（Ｒ）で置換されている位置Ｐ７４５Ｒ；アスパラギン酸塩（Ｄ）がアスパラギン（Ｎ）で置換されている位置Ｄ９Ｎ；アスパラギン酸塩（Ｄ）がリジン（Ｋ）で置換されている位置Ｄ９Ｋ；スレオニン（Ｔ）がグリシン（Ｇ）で置換されている位置Ｔ７７０Ｇ；チロシン（Ｙ）がアルギニン（Ｒ）で置換されている位置Ｙ４１３Ｒ；メチオニン（Ｍ）がイソロイシン（Ｉ）で置換されている位置Ｍ７８４Ｉ；グルタミン酸塩（Ｅ）がロイシン（Ｌ）で置換されている位置Ｅ７４９Ｌ；セリン（Ｓ）がロイシン（Ｌ）で置換されている位置Ｓ２３３Ｌ；グルタミン酸塩（Ｅ）がアラニン（Ａ）で置換されている位置Ｅ７５７Ａ；ロイシン（Ｌ）がグリシン（Ｇ）で置換されている位置Ｌ７０３Ｇ；及びアラニン（Ａ）がチロシン（Ｙ）で置換されている位置Ａ２３１Ｙ；を含む位置のいずれか１つ以上に突然変異を有する。１つの実施形態において、ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントはハイブリッドＣＹＰ１５３Ａ−ＲｅｄＲｈＦ−タイプ融合タンパク質バリアントである。別の実施形態において、組換え宿主細胞におけるＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは、対応する宿主細胞における鋳型ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチド、例えば、配列番号６または配列番号３８のＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドの発現により産生されるω−ＯＨ脂肪酸の力価と比較して、より高い力価のω−ＯＨ脂肪酸をもたらす。別の実施形態において、ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアント（及び対応するポリヌクレオチド配列）には、配列の表Ｂ及びＣに示される配列番号４７〜１６４が含まれる。別の実施形態において、ω−ＯＨ脂肪酸はω−ＯＨ脂肪酸組成物である。
本開示の別の態様は、配列番号９８に対して少なくとも約９０％、９１％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し、且つ１２、２７、１１９、１４０、１５７、１５９、２３３及び２４４の位置を含むアミノ酸位置において少なくとも１つの突然変異を有するＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントであって、脂肪酸からω−ＯＨ脂肪酸への変換を触媒するＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントを提供する。１つの実施形態において、ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは、グルタミン（Ｑ）がトリプトファン（Ｗ）で置換されている位置Ｑ１２Ｗ；アルギニン（Ｒ）がロイシン（Ｌ）で置換されている位置Ｒ２７Ｌ；リジン（Ｋ）がアルギニン（Ｒ）で置換されている位置Ｋ１１９Ｒ；セリン（Ｓ）がアスパラギン（Ｎ）で置換されている位置Ｓ１４０Ｎ；セリン（Ｓ）がアルギニン（Ｒ）で置換されている位置Ｓ１５７Ｒ；バリン（Ｖ）がメチオニン（Ｍ）で置換されている位置Ｖ１５９Ｍ；セリン（Ｓ）がロイシン（Ｌ）で置換されている位置Ｓ２３３Ｌ；及びアラニン（Ａ）がアルギニン（Ｒ）で置換されている位置Ａ２４４Ｒ；を含む位置のいずれか１つ以上に突然変異を有する。
本開示の別の態様は、配列番号１００に対して少なくとも約９０％、９１％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し、且つ１２、２８、６１、１１９、２３１、３０９、４１３及び４８０の位置を含むアミノ酸位置において少なくとも１つの突然変異を有するＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントであって、脂肪酸からω−ＯＨ脂肪酸への変換を触媒するＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントを提供する。ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは、グルタミン（Ｑ）がアルギニン（Ｒ）で置換されている位置Ｑ１２Ｒ；グルタミン（Ｑ）がメチオニン（Ｍ）で置換されている位置Ｑ２８Ｍ；アスパラギン（Ｎ）がロイシン（Ｌ）で置換されている位置Ｎ６１Ｌ；リジン（Ｋ）がアルギニン（Ｒ）で置換されている位置Ｋ１１９Ｒ；アラニン（Ａ）がバリン（Ｖ）で置換されている位置Ａ２３１Ｖ；アスパラギン（Ｎ）がセリン（Ｓ）で置換されている位置Ｎ３０９Ｓ；チロシン（Ｙ）がアルギニン（Ｒ）で置換されている位置Ｙ４１３Ｒ；及びイソロイシン（Ｉ）がグリシン（Ｇ）で置換されている位置Ｉ４８０Ｇ；を含む位置のいずれか１つ以上に突然変異を有する。
本開示の別の態様は、配列番号３８のアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、または８９％の配列同一性を有するＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントであって、アミノ酸位置１２位における突然変異と、以下のアミノ酸位置：（ａ）配列番号３８の２７、１１９、１４０、１５７、１５９、２３３、及び２４４位；（ｂ）配列番号３８の２８、６１、１１９、２３１、３０９、４１３、及び４８０位；（ｃ）配列番号３８の１１９、２３１、及び４８０位；（ｄ）配列番号３８の２８、７７、１１９、１４１、２３１及び４０７位；（ｅ）配列番号３８の２８、６１、１４１、２３１、及び４０７位；（ｆ）配列番号３８の２８、１１９、２３１、及び２４４位；（ｇ）配列番号３８の２８、４０７、及び４８０位；（ｈ）配列番号３８の１４１、２３１、４１３、及び４８１位；（ｉ）配列番号３８の２８、１１１、２３１、及び４０７位；（ｊ）配列番号３８の２８、６１、１４０、及び１４９位；（ｋ）配列番号３８の２８、７７、１１９、１５９、２３１、２５４、４０７、及び４８０位；（ｌ）配列番号３８の２８、２５４、３０９、４０７、及び４５１位；（ｍ）配列番号３８の２８、２５４、３０９、４０７、及び４８０位；または（ｎ）配列番号３８の２８、３０９、４０７、４５１、及び４８０位の各々における突然変異とを含み、脂肪酸からω−ヒドロキシル化脂肪酸への変換を触媒する、ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントを提供する。本開示の別の態様は、配列番号３８のアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントであって、アミノ酸位置１２位における突然変異と、以下のアミノ酸位置：（ａ）配列番号３８の２７、１１９、１４０、１５７、１５９、２３３、及び２４４位；（ｂ）配列番号３８の２８、６１、１１９、２３１、３０９、４１３、及び４８０位；（ｃ）配列番号３８の１１９、２３１、及び４８０位；（ｄ）配列番号３８の２８、７７、１１９、１４１、２３１及び４０７位；（ｅ）配列番号３８の２８、６１、１４１、２３１、及び４０７位；（ｆ）配列番号３８の２８、１１９、２３１、及び２４４位；（ｇ）配列番号３８の２８、４０７、及び４８０位；（ｈ）配列番号３８の１４１、２３１、４１３、及び４８１位；（ｉ）配列番号３８の２８、１１１、２３１、及び４０７位；（ｊ）配列番号３８の２８、６１、１４０、及び１４９位；（ｋ）配列番号３８の２８、７７、１１９、１５９、２３１、２５４、４０７、及び４８０位；（ｌ）配列番号３８の２８、２５４、３０９、４０７、及び４５１位；（ｍ）配列番号３８の２８、２５４、３０９、４０７、及び４８０位；または（ｎ）配列番号３８の２８、３０９、４０７、４５１、及び４８０位の各々における突然変異とを含み、脂肪酸からω−ヒドロキシル化脂肪酸への変換を触媒する、ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントを提供する。様々な実施形態において、配列番号３８のアミノ酸位置１２、２７、１１９、１４０、１５７、１５９、２３３、及び２４４位における（ａ）の前記突然変異は、アミノ酸置換である。様々な実施形態において、配列番号３８のアミノ酸位置１２、２８、６１、１１９、２３１、３０９、４１３、及び４８０位における（ｂ）の前記突然変異は、アミノ酸置換である。様々な実施形態において、配列番号３８のアミノ酸位置１２、１１９、２３１、及び４８０位における（ｃ）の前記突然変異は、アミノ酸置換である。様々な実施形態において、配列番号３８のアミノ酸位置１２、２８、７７、１１９、１４１、２３１、及び４０７位における（ｄ）の前記突然変異は、アミノ酸置換である。様々な実施形態において、配列番号３８のアミノ酸位置１２、２８、６１、１４１、２３１、及び４０７位における（ｅ）の前記突然変異は、アミノ酸置換である。様々な実施形態において、配列番号３８のアミノ酸位置１２、２８、１１９、２３１、及び２４４位における（ｆ）の前記突然変異は、アミノ酸置換である。様々な実施形態において、配列番号３８のアミノ酸位置１２、２８、４０７、及び４８０位における（ｇ）の前記突然変異は、アミノ酸置換である。様々な実施形態において、配列番号３８のアミノ酸位置１２、１４１、２３１、４１３、及び４８１位における（ｈ）の前記突然変異は、アミノ酸置換である。様々な実施形態において、配列番号３８のアミノ酸位置１２、２８、１１１、２３１、及び４０７位における（ｉ）の前記突然変異は、アミノ酸置換である。様々な実施形態において、配列番号３８のアミノ酸位置１２、２８、６１、１４０、及び１４９位における（ｊ）の前記突然変異は、アミノ酸置換である。様々な実施形態において、アミノ酸位置１２、２８、７７、１１９、１５９、２３１、２５４、４０７、及び４８０位における（ｋ）の前記突然変異は、アミノ酸置換である。様々な実施形態において、配列番号３８のアミノ酸位置１２、２８、２５４、３０９、４０７、及び４５１位における（ｌ）の前記突然変異は、アミノ酸置換である。様々な実施形態において、配列番号３８のアミノ酸位置１２、２８、２５４、３０９、４０７、及び４８０位における（ｍ）の前記突然変異は、アミノ酸置換である。様々な実施形態において、配列番号３８のアミノ酸位置１２、２８、３０９、４０７、４５１、及び４８０位における（ｎ）の前記突然変異は、アミノ酸置換である。１つの実施形態において、配列番号３８のアミノ酸位置１２、２７、１１９、１４０、１５７、１５９、２３３、及び２４４位における（ａ）の前記突然変異は、それぞれ、Ｑ１２Ｗ、Ｒ２７Ｌ、Ｋ１１９Ｒ、Ｓ１４０Ｎ、Ｓ１５７Ｒ、Ｖ１５９Ｍ、Ｓ２３３Ｌ、及びＡ２４４Ｒである。１つの実施形態において、配列番号３８のアミノ酸位置１２、２８、６１、１１９、２３１、３０９、４１３、及び４８０位における（ｂ）の前記突然変異は、それぞれ、Ｑ１２Ｒ、Ｑ２８Ｍ、Ｎ６１Ｌ、Ｋ１１９Ｒ、Ａ２３１Ｖ、Ｎ３０９Ｓ、Ｙ４１３Ｒ、及びＩ４８０Ｇである。１つの実施形態において、配列番号３８のアミノ酸位置１２、１１９、２３１、及び４８０位における（ｃ）の前記突然変異は、それぞれ、Ｑ１２Ｒ、Ｋ１１９Ｒ、Ａ２３１Ｖ、及びＩ４８０Ｇである。１つの実施形態において、配列番号３８のアミノ酸位置１２、２８、７７、１１９、１４１、２３１、及び４０７位における（ｄ）の前記突然変異は、それぞれ、Ｑ１２Ｔ、Ｑ２８Ｍ、Ｒ７７Ｑ、Ｋ１１９Ｒ、Ｖ１４１Ｔ、Ａ２３１Ｗ、及びＮ４０７Ｇである。１つの実施形態において、配列番号３８のアミノ酸位置１２、２８、６１、１４１、２３１、及び４０７位における（ｅ）の前記突然変異は、それぞれ、Ｑ１２Ｒ、Ｑ２８Ｍ、Ｎ６１Ｌ、Ｖ１４１Ｔ、Ａ２３１Ｙ、及びＮ４０７Ｇである。１つの実施形態において、配列番号３８のアミノ酸位置１２、２８、１１９、２３１、及び２４４位における（ｆ）の前記突然変異は、それぞれ、Ｑ１２Ｗ、Ｑ２８Ｍ、Ｋ１１９Ｒ、Ａ２３１Ｙ、及びＡ２４４Ｒである。１つの実施形態において、配列番号３８のアミノ酸位置１２、２８、４０７、及び４８０位における（ｇ）の前記突然変異は、それぞれ、Ｑ１２Ｗ、Ｑ２８Ｔ、Ｎ４０７Ｇ、及びＩ４８０Ｇである。１つの実施形態において、配列番号３８のアミノ酸位置１２、１４１、２３１、４１３、及び４８１位における（ｈ）の前記突然変異は、それぞれ、Ｑ１２Ｒ、Ｖ１４１Ｔ、Ａ２３１Ｙ、Ｙ４１３Ｒ、及びＧ４８１Ｉである。１つの実施形態において、配列番号３８のアミノ酸位置１２、２８、１１１、２３１、及び４０７位における（ｉ）の前記突然変異は、それぞれ、Ｑ１２Ｔ、Ｑ２８Ｍ、Ｆ１１１Ａ、Ａ２３１Ｖ、及びＮ４０７Ｇである。１つの実施形態において、配列番号３８のアミノ酸位置１２、２８、６１、１４０、及び１４９位における（ｊ）の前記突然変異は、それぞれ、Ｑ１２Ｔ、Ｑ２８Ｍ、Ｎ６１Ｌ、Ｓ１４０Ｎ、及びＰ１４９Ｒである。１つの実施形態において、アミノ酸位置１２、２８、７７、１１９、１５９、２３１、２５４、４０７、及び４８０位における（ｋ）の前記突然変異は、それぞれ、Ｑ１２Ｗ、Ｑ２８Ｔ、Ｒ７７Ｑ、Ｋ１１９Ｒ、Ｖ１５９Ｍ、Ａ２３１Ｙ、Ｒ２５４Ｇ、Ｎ４０７Ｇ、及びＩ４８０Ｇである。１つの実施形態において、配列番号３８のアミノ酸位置１２、２８、２５４、３０９、４０７、及び４５１位における（ｌ）の前記突然変異は、それぞれ、Ｑ１２Ｗ、Ｑ２８Ｔ、Ｒ２５４Ｇ、Ｎ３０９Ｓ、Ｎ４０７Ｇ、及びＶ４５１Ｍである。１つの実施形態において、配列番号３８のアミノ酸位置１２、２８、２５４、３０９、４０７、及び４８０位における（ｍ）の前記突然変異は、それぞれ、Ｑ１２Ｗ、Ｑ２８Ｔ、Ｒ２５４Ｇ、Ｎ３０９Ｓ、Ｎ４０７Ｇ、及びＩ４８０Ｇである。１つの実施形態において、配列番号３８のアミノ酸位置１２、２８、３０９、４０７、４５１、及び４８０位における（ｎ）の前記突然変異は、それぞれ、Ｑ１２Ｗ、Ｑ２８Ｔ、Ｎ３０９Ｓ、Ｎ４０７Ｇ、Ｖ４５１Ｍ、及びＩ４８０Ｇである。１つの好ましい実施形態において、上記（ａ）のＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは、さらに、配列番号３８のアミノ酸位置１４１、２３１及び４０７の各々に、または配列番号３８のアミノ酸位置２３１、４０７、４５１、７５７、７７０及び７８４の各々に、または配列番号３８のアミノ酸位置２３１、４０７、５９１、６４３、７５７及び７８４の各々に、突然変異を含む。様々な実施形態において、配列番号３８のアミノ酸位置１４１、２３１、及び４０７の各々における前記さらなる突然変異は、アミノ酸置換である。また、様々な実施形態において、配列番号３８のアミノ酸位置２３１、４０７、４５１、７５７、７７０及び７８４の各々における前記さらなる突然変異は、アミノ酸置換である。また、様々な実施形態において、配列番号３８のアミノ酸位置２３１、４０７、５９１、６４３、７５７及び７８４の各々における前記さらなる突然変異は、アミノ酸置換である。好ましくは、配列番号３８のアミノ酸位置１４１、２３１及び４０７の各々における前記さらなる突然変異は、それぞれ、Ｖ１４１Ｔ、Ａ２３１Ｙ及びＮ４０７Ｇである。また、好ましくは、配列番号３８のアミノ酸位置２３１、４０７、４５１、７５７、７７０及び７８４の各々における前記突然変異は、それぞれ、Ａ２３１Ｙ、Ｎ４０７Ｇ、Ｖ４５１Ｍ、Ｅ７５７Ａ、Ｔ７７０Ｇ及びＭ７８４Ｉである。また、好ましくは、配列番号３８のアミノ酸位置２３１、４０７、５９１、６４３、７５７及び７８４の各々における前記突然変異は、それぞれ、Ａ２３１Ｙ、Ｎ４０７Ｇ、Ｅ５９１Ｑ、Ｒ６４３Ｈ、Ｅ７５７Ａ及びＭ７８４Ｉである。より好ましくは、本開示のＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは、配列番号１４６、配列番号１５０、または配列番号１６０のアミノ酸配列を含む。本開示の他の実施形態では、ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、配列番号１２２、及び配列番号１２４のうちいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
別の態様において、本開示は、配列番号３８のアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、または８９％の配列同一性を備えるＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントであって、ＲｈＦドメイン（またはＲｈＦレダクターゼドメイン、またはＲｅｄ４５０ＲｈＦドメイン、またはＲｅｄ４５０ＲｈＦレダクターゼドメイン、またはＰ４５０ＲｈＦドメイン、またはＰ４５０ＲｈＦレダクターゼドメイン）において、以下のアミノ酸位置：（ａ）配列番号３８の５２７、５４４、７１９、７５７、７７１、及び７８４位；（ｂ）配列番号３８の５２７、５４４、及び５５７位；（ｃ）配列番号３８の７７０及び７８４位；（ｄ）配列番号３８の５２７、５９１、６４８、７１９、７５７、７７１、及び７８４位；（ｅ）配列番号３８の５２７、５９１、６４８、７５７、及び７７１位；（ｆ）配列番号３８の５２７、５４４、７７０、及び７８４位；（ｇ）配列番号３８の５２７、５５７、７７０、及び７８４位；（ｈ）配列番号３８の５５７、７５７、及び７７０位；（ｉ）配列番号３８の５５７、７５７、及び７７１位；または（ｊ）配列番号３８の７５７及び７７０位の各々における突然変異を含み、脂肪酸からω−ヒドロキシル化脂肪酸への変換を触媒する、ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントを提供する。別の態様において、本開示は、配列番号３８のアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を備えるＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントであって、ＲｈＦドメイン（またはＲｈＦレダクターゼドメイン、またはＲｅｄ４５０ＲｈＦドメイン、またはＲｅｄ４５０ＲｈＦレダクターゼドメイン、またはＰ４５０ＲｈＦドメイン、またはＰ４５０ＲｈＦレダクターゼドメイン）において、以下のアミノ酸位置：（ａ）配列番号３８の５２７、５４４、７１９、７５７、７７１、及び７８４位；（ｂ）配列番号３８の５２７、５４４、及び５５７位；（ｃ）配列番号３８の７７０及び７８４位；（ｄ）配列番号３８の５２７、５９１、６４８、７１９、７５７、７７１、及び７８４位；（ｅ）配列番号３８の５２７、５９１、６４８、７５７、及び７７１位；（ｆ）配列番号３８の５２７、５４４、７７０、及び７８４位；（ｇ）配列番号３８の５２７、５５７、７７０、及び７８４位；（ｈ）配列番号３８の５５７、７５７、及び７７０位；（ｉ）配列番号３８の５５７、７５７、及び７７１位；または（ｊ）配列番号３８の７５７及び７７０位の各々における突然変異を含み、脂肪酸からω−ヒドロキシル化脂肪酸への変換を触媒する、ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントを提供する。様々な実施形態において、配列番号３８のアミノ酸位置５２７、５４４、７１９、７５７、７７１、及び７８４位における（ａ）の前記突然変異は、アミノ酸置換である。様々な実施形態において、配列番号３８のアミノ酸位置５２７、５４４、及び５５７位における（ｂ）の前記突然変異は、アミノ酸置換である。様々な実施形態において、配列番号３８のアミノ酸位置７７０及び７８４位における（ｃ）の前記突然変異は、アミノ酸置換である。様々な実施形態において、配列番号３８のアミノ酸位置５２７、５９１、６４８、７１９、７５７、７７１、及び７８４位における（ｄ）の前記突然変異は、アミノ酸置換である。様々な実施形態において、配列番号３８のアミノ酸位置５２７、５９１、６４８、７５７、及び７７１位における（ｅ）の前記突然変異は、アミノ酸置換である。様々な実施形態において、配列番号３８のアミノ酸位置５２７、５４４、７７０、及び７８４位における（ｆ）の前記突然変異は、アミノ酸置換である。様々な実施形態において、配列番号３８のアミノ酸位置５２７、５５７、７７０、及び７８４位における（ｇ）の前記突然変異は、アミノ酸置換である。様々な実施形態において、配列番号３８のアミノ酸位置５５７、７５７、及び７７０位における（ｈ）の前記突然変異は、アミノ酸置換である。様々な実施形態において、配列番号３８のアミノ酸位置５５７、７５７、及び７７１位における（ｉ）の前記突然変異は、アミノ酸置換である。様々な実施形態において、配列番号３８のアミノ酸位置７５７及び７７０位における（ｊ）の前記突然変異は、アミノ酸置換である。１つの実施形態において、配列番号３８のアミノ酸位置５２７、５４４、７１９、７５７、７７１、及び７８４位における（ａ）の前記突然変異は、それぞれ、Ｄ５２７Ｅ、Ｄ５４４Ｎ、Ｒ７１９Ｗ、Ｅ７５７Ａ、Ｖ７７１Ｆ、及びＭ７８４Ｉである。１つの実施形態において、配列番号３８のアミノ酸位置５２７、５４４、及び５５７位における（ｂ）の前記突然変異は、それぞれ、Ｄ５２７Ｅ、Ｄ５４４Ｎ、及びＥ５５７Ｒである。１つの実施形態において、配列番号３８のアミノ酸位置７７０及び７８４位における（ｃ）の前記突然変異は、それぞれ、Ｔ７７０Ｇ及びＭ７８４Ｉである。１つの実施形態において、配列番号３８のアミノ酸位置５２７、５９１、６４８、７１９、７５７、７７１、及び７８４位における（ｄ）の前記突然変異は、それぞれ、Ｄ５２７Ｅ、Ｅ５９１Ｑ、Ｖ６４８Ｌ、Ｒ７１９Ｗ、Ｅ７５７Ａ、Ｖ７７１Ｆ、及びＭ７８４Ｉである。１つの実施形態において、配列番号３８のアミノ酸位置５２７、５９１、６４８、７５７、及び７７１位における（ｅ）の前記突然変異は、それぞれ、Ｄ５２７Ｅ、Ｅ５９１Ｑ、Ｖ６４８Ｌ、Ｅ７５７Ａ、及びＶ７７１Ｆである。１つの実施形態において、配列番号３８のアミノ酸位置５２７、５４４、７７０、及び７８４位における（ｆ）の前記突然変異は、それぞれ、Ｄ５２７Ｅ、Ｄ５４４Ｎ、Ｔ７７０Ｇ、及びＭ７８４Ｉである。１つの実施形態において、配列番号３８のアミノ酸位置５２７、５５７、７７０、及び７８４位における（ｇ）の前記突然変異は、それぞれ、Ｄ５２７Ｅ、Ｅ５５７Ｒ、Ｔ７７０Ｇ、及びＭ７８４Ｉである。１つの実施形態において、配列番号３８のアミノ酸位置５５７、７５７、及び７７０位における（ｈ）の前記突然変異は、それぞれ、Ｅ５５７Ｗ、Ｅ７５７Ａ、及びＴ７７０Ｇである。１つの実施形態において、配列番号３８のアミノ酸位置５５７、７５７、及び７７１位における（ｉ）の前記突然変異は、それぞれ、Ｅ５５７Ｒ、Ｅ７５７Ａ、及びＶ７７１Ｆである。１つの実施形態において、配列番号３８のアミノ酸位置７５７及び７７０位における（ｊ）の前記突然変異は、それぞれ、Ｅ７５７Ａ及びＴ７７０Ｇである。本開示のいくつかの好ましい実施形態では、ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４、配列番号１３６、配列番号１３８、配列番号１４０、配列番号１４２、及び配列番号１４４のうちいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
なお別の態様において、本開示は、配列番号３８のアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を備えるＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントであって、以下の位置：（ａ）配列番号３８の１４１、２３１、２３３、及び２５４位；（ｂ）配列番号３８の１４１、２３１、２３３、及び２４４位；（ｃ）配列番号３８の１４１、２３１、２４４、４５１、５５７、７４９、及び７７０位；（ｄ）配列番号３８の２７、２８、６１、１４１、１４９、及び２３１位；（ｅ）配列番号３８の１４１、１５７、２３１、２３３、２４４、７５７、及び７８４位；（ｆ）配列番号３８の２８、６１、１４０、１４１、２３１、２３３、及び２７１位；または（ｇ）配列番号３８の２３１、２３３、２５４、及び５５７位の各々における突然変異を含み、脂肪酸からω−ヒドロキシル化脂肪酸への変換を触媒する、ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントを提供する。なお別の態様において、本開示は、配列番号３８のアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、または８９％の配列同一性を備えるＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントであって、以下の位置：（ａ）配列番号３８の１４１、２３１、２３３、及び２５４位；（ｂ）配列番号３８の１４１、２３１、２３３、及び２４４位；（ｃ）配列番号３８の１４１、２３１、２４４、４５１、５５７、７４９、及び７７０位；（ｄ）配列番号３８の２７、２８、６１、１４１、１４９、及び２３１位；（ｅ）配列番号３８の１４１、１５７、２３１、２３３、２４４、７５７、及び７８４位；（ｆ）配列番号３８の２８、６１、１４０、１４１、２３１、２３３、及び２７１位；または（ｇ）配列番号３８の２３１、２３３、２５４、及び５５７位の各々における突然変異を含み、脂肪酸からω−ヒドロキシル化脂肪酸への変換を触媒する、ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントを提供する。様々な実施形態において、配列番号３８のアミノ酸位置１４１、２３１、２３３、及び２５４位における（ａ）の前記突然変異は、アミノ酸置換である。様々な実施形態において、配列番号３８のアミノ酸位置１４１、２３１、２３３、及び２４４位における（ｂ）の前記突然変異は、アミノ酸置換である。様々な実施形態において、配列番号３８のアミノ酸位置１４１、２３１、２４４、４５１、５５７、７４９、及び７７０位における（ｃ）の前記突然変異は、アミノ酸置換である。様々な実施形態において、配列番号３８のアミノ酸位置２７、２８、６１、１４１、１４９、及び２３１位における（ｄ）の前記突然変異は、アミノ酸置換である。様々な実施形態において、配列番号３８のアミノ酸位置１４１、１５７、２３１、２３３、２４４、７５７、及び７８４位における（ｅ）の前記突然変異は、アミノ酸置換である。様々な実施形態において、配列番号３８のアミノ酸位置２８、６１、１４０、１４１、２３１、２３３、及び２７１位における（ｆ）の前記突然変異は、アミノ酸置換である。様々な実施形態において、配列番号３８のアミノ酸位置２３１、２３３、２５４、及び５５７位における（ｇ）の前記突然変異は、アミノ酸置換である。１つの実施形態において、配列番号３８のアミノ酸位置１４１、２３１、２３３、及び２５４位における（ａ）の前記突然変異は、それぞれ、Ｖ１４１Ｔ、Ａ２３１Ｙ、Ｌ２３３Ｓ、及びＲ２５４Ｇである。１つの実施形態において、配列番号３８のアミノ酸位置１４１、２３１、２３３、及び２４４位における（ｂ）の前記突然変異は、それぞれ、Ｖ１４１Ｔ、Ａ２３１Ｙ、Ｌ２３３Ｓ、及びＲ２４４Ａである。１つの実施形態において、配列番号３８のアミノ酸位置１４１、２３１、２４４、４５１、５５７、７４９、及び７７０位における（ｃ）の前記突然変異は、それぞれ、Ｖ１４１Ｔ、Ａ２３１Ｙ、Ｒ２４４Ａ、Ｖ４５１Ｍ、Ｅ５５７Ｗ、Ｅ７４９Ｌ、及びＴ７７０Ｇである。１つの実施形態において、配列番号３８のアミノ酸位置２７、２８、６１、１４１、１４９、及び２３１位における（ｄ）の前記突然変異は、それぞれ、Ｌ２７Ｒ、Ｑ２８Ｍ、Ｎ６１Ｌ、Ｖ１４１Ｔ、Ｐ１４９Ｇ、及びＡ２３１Ｙである。１つの実施形態において、配列番号３８のアミノ酸位置１４１、１５７、２３１、２３３、２４４、７５７、及び７８４位における（ｅ）の前記突然変異は、それぞれ、Ｖ１４１Ｔ、Ｒ１５７Ｓ、Ａ２３１Ｙ、Ｌ２３３Ｓ、Ｒ２４４Ａ、Ｅ７５７Ａ、及びＭ７８４Ｉである。１つの実施形態において、配列番号３８のアミノ酸位置２８、６１、１４０、１４１、２３１、２３３、及び２７１位における（ｆ）の前記突然変異は、それぞれ、Ｑ２８Ｍ、Ｎ６１Ｌ、Ｎ１４０Ｓ、Ｖ１４１Ｔ、Ａ２３１Ｙ、Ｌ２３３Ｓ、及びＥ２７１Ｄである。１つの実施形態において、配列番号３８のアミノ酸位置２３１、２３３、２５４、及び５５７位における（ｇ）の前記突然変異は、それぞれ、Ａ２３１Ｙ、Ｌ２３３Ｓ、Ｒ２５４Ｇ、及びＥ５５７Ｗである。本開示のいくつかの好ましい実施形態では、本開示のＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは、配列番号１４８、配列番号１５２、配列番号１５４、配列番号１５６、配列番号１５８、配列番号１６２、及び配列番号１６４のうちいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
なお別の態様において、本開示は、配列番号９８のアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、または８９％の配列同一性を備えるＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントであって、以下のアミノ酸位置：（ａ）配列番号９８の１４１、２３１、及び４０７位；（ｂ）配列番号９８の１４１、２３１、２３３、及び２５４位；（ｃ）配列番号９８の２３１、４０７、４５１、７５７、７７０、及び７８４位；（ｄ）配列番号９８の１４１、２３１、２３３、及び２４４位；（ｅ）配列番号９８の１４１、２３１、２４４、４５１、５５７、７４９、及び７７０位；（ｆ）配列番号９８の２７、２８、６１、１４１、１４９、及び２３１位；（ｇ）配列番号９８の２７、１１９、１４０、１４１、１５９、２３１、７５７、及び７８４位；（ｈ）配列番号９８の２３１、４０７、５９１、６４３、７５７、及び７８４位；（ｉ）配列番号９８の２８、６１、１４０、１４１、２３１、２３３、及び２７１位；または（ｊ）配列番号９８の２３１、２３３、及び２５４位の各々における突然変異を含み、脂肪酸からω−ヒドロキシル化脂肪酸への変換を触媒する、ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントを提供する。なお別の態様において、本開示は、配列番号９８のアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を備えるＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントであって、以下のアミノ酸位置：（ａ）配列番号９８の１４１、２３１、及び４０７位；（ｂ）配列番号９８の１４１、２３１、２３３、及び２５４位；（ｃ）配列番号９８の２３１、４０７、４５１、７５７、７７０、及び７８４位；（ｄ）配列番号９８の１４１、２３１、２３３、及び２４４位；（ｅ）配列番号９８の１４１、２３１、２４４、４５１、５５７、７４９、及び７７０位；（ｆ）配列番号９８の２７、２８、６１、１４１、１４９、及び２３１位；（ｇ）配列番号９８の２７、１１９、１４０、１４１、１５９、２３１、７５７、及び７８４位；（ｈ）配列番号９８の２３１、４０７、５９１、６４３、７５７、及び７８４位；（ｉ）配列番号９８の２８、６１、１４０、１４１、２３１、２３３、及び２７１位；または（ｊ）配列番号９８の２３１、２３３、及び２５４位の各々における突然変異を含み、脂肪酸からω−ヒドロキシル化脂肪酸への変換を触媒する、ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントを提供する。様々な実施形態において、配列番号９８のアミノ酸位置１４１、２３１、及び４０７位における（ａ）の前記突然変異は、アミノ酸置換である。様々な実施形態において、配列番号９８のアミノ酸位置１４１、２３１、２３３、及び２５４位における（ｂ）の前記突然変異は、アミノ酸置換である。様々な実施形態において、配列番号９８のアミノ酸位置２３１、４０７、４５１、７５７、７７０、及び７８４位における（ｃ）の前記突然変異は、アミノ酸置換である。様々な実施形態において、配列番号９８のアミノ酸位置１４１、２３１、２３３、及び２４４位における（ｄ）の前記突然変異は、アミノ酸置換である。様々な実施形態において、配列番号９８のアミノ酸位置１４１、２３１、２４４、４５１、５５７、７４９、及び７７０位における（ｅ）の前記突然変異は、アミノ酸置換である。様々な実施形態において、配列番号９８のアミノ酸位置２７、２８、６１、１４１、１４９、及び２３１位における（ｆ）の前記突然変異は、アミノ酸置換である。様々な実施形態において、配列番号９８のアミノ酸位置２７、１１９、１４０、１４１、１５９、２３１、７５７、及び７８４位における（ｇ）の前記突然変異は、アミノ酸置換である。様々な実施形態において、配列番号９８のアミノ酸位置２３１、４０７、５９１、６４３、７５７、及び７８４位における（ｈ）の前記突然変異は、アミノ酸置換である。様々な実施形態において、配列番号９８のアミノ酸位置２８、６１、１４０、１４１、２３１、２３３、及び２７１位における（ｉ）の前記突然変異は、アミノ酸置換である。様々な実施形態において、配列番号３８のアミノ酸位置２３１、２３３、及び２５４位における（ｊ）の前記突然変異は、アミノ酸置換である。１つの実施形態において、配列番号９８のアミノ酸位置１４１、２３１、及び４０７位における（ａ）の前記突然変異は、それぞれ、Ｖ１４１Ｔ、Ａ２３１Ｙ、及びＮ４０７Ｇである。１つの実施形態において、配列番号９８のアミノ酸位置１４１、２３１、２３３、及び２５４位における（ｂ）の前記突然変異は、それぞれ、Ｖ１４１Ｔ、Ａ２３１Ｙ、Ｌ２３３Ｓ、及びＲ２５４Ｇである。１つの実施形態において、配列番号９８のアミノ酸位置２３１、４０７、４５１、７５７、７７０、及び７８４位における（ｃ）の前記突然変異は、それぞれ、Ａ２３１Ｙ、Ｎ４０７Ｇ、Ｖ４５１Ｍ、Ｅ７５７Ａ、Ｔ７７０Ｇ、及びＭ７８４Ｉである。１つの実施形態において、配列番号９８のアミノ酸位置１４１、２３１、２３３、及び２４４位における（ｄ）の前記突然変異は、それぞれ、Ｖ１４１Ｔ、Ａ２３１Ｙ、Ｌ２３３Ｓ、及びＲ２４４Ａである。１つの実施形態において、配列番号９８のアミノ酸位置１４１、２３１、２４４、４５１、５５７、７４９、及び７７０位における（ｅ）の前記突然変異は、それぞれ、Ｖ１４１Ｔ、Ａ２３１Ｙ、Ｒ２４４Ａ、Ｖ４５１Ｍ、Ｅ５５７Ｗ、Ｅ７４９Ｌ、及びＴ７７０Ｇである。１つの実施形態において、配列番号９８のアミノ酸位置２７、２８、６１、１４１、１４９、及び２３１位における（ｆ）の前記突然変異は、それぞれ、Ｌ２７Ｒ、Ｑ２８Ｍ、Ｎ６１Ｌ、Ｖ１４１Ｔ、Ｐ１４９Ｇ、及びＡ２３１Ｙである。１つの実施形態において、配列番号９８のアミノ酸位置１４１、１５７、２３１、２３３、２４４、７５７、及び７８４位における（ｇ）の前記突然変異は、それぞれ、Ｖ１４１Ｔ、Ｒ１５７Ｓ、Ａ２３１Ｙ、Ｌ２３３Ｓ、Ｒ２４４Ａ、Ｅ７５７Ａ、及びＭ７８４Ｉである。１つの実施形態において、配列番号９８のアミノ酸位置２３１、４０７、５９１、６４３、７５７、及び７８４位における（ｈ）の前記突然変異は、それぞれ、Ａ２３１Ｙ、Ｎ４０７Ｇ、Ｅ５９１Ｑ、Ｒ６４３Ｈ、Ｅ７５７Ａ、及びＭ７８４Ｉである。１つの実施形態において、配列番号９８のアミノ酸位置２８、６１、１４０、１４１、２３１、２３３、及び２７１位における（ｉ）の前記突然変異は、それぞれ、Ｑ２８Ｍ、Ｎ６１Ｌ、Ｎ１４０Ｓ、Ｖ１４１Ｔ、Ａ２３１Ｙ、Ｌ２３３Ｓ、及びＥ２７１Ｄである。１つの実施形態において、配列番号９８のアミノ酸位置２３１、２３３、２５４、及び５５７位における（ｊ）の前記突然変異は、それぞれ、Ａ２３１Ｙ、Ｌ２３３Ｓ、Ｒ２５４Ｇ、及びＥ５５７Ｗである。本開示のいくつかの好ましい実施形態において、本開示のＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは、配列番号１４６、配列番号１４８、配列番号１５０、配列番号１５２、配列番号１５４、配列番号１５６、配列番号１５８、配列番号１６０、配列番号１６２、及び配列番号１６４のうちいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
別の態様において、本開示は、配列番号３８または配列番号９８のアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を備えるＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントであって、１０、１１、１２、２７、２８、１１１、１１９、１４０、１４１、１４９、１５７、１５９、１９７、２３１、２３３、２４４、２５４、４０７、及び４７７の位置において１つ以上の突然変異（複数可）を含むＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントを提供する。当該ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは、脂肪酸からω−ヒドロキシル化脂肪酸への変換を触媒する。なお別の態様において、本開示は、配列番号３８または配列番号９８のアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、または８９％の配列同一性を備えるＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントであって、（ａ）Ｑ１２Ｗ、Ｒ２７Ｌ、Ｑ２８Ｍ、Ｋ１１９Ｒ、Ｖ１４１Ｔ、Ｓ１５７Ｒ、Ｖ１５９Ｍ、Ａ２３１Ｙ、Ｓ２３３Ｌ、Ａ２４４Ｒ（配列番号１６６）；（ｂ）Ｑ１２Ｗ、Ｑ２８Ｍ、Ｋ１１９Ｒ、Ｓ１４０Ｎ、Ｓ１５７Ｒ、Ｖ１５９Ｍ、Ｓ２３３Ｌ、Ａ２４４Ｒ、Ｒ２５４Ｇ、Ｎ４０７Ｇ（配列番号１６８）；（ｃ）Ｑ１２Ｗ、Ｒ２７Ｌ、Ｆ１１１Ａ、Ｋ１１９Ｒ、Ｖ１４１Ｔ、Ｓ１５７Ｒ、Ｖ１５９Ｍ、Ａ２３１Ｙ、Ｓ２３３Ｌ、Ａ２４４Ｒ、Ｒ２５４Ｇ（配列番号１７０）；（ｄ）Ｑ１２Ｗ、Ｑ２８Ｍ、Ｋ１１９Ｒ、Ｓ１４０Ｎ、Ｐ１４９Ｇ、Ｓ１５７Ｒ、Ｖ１５９Ｍ、Ａ２３１Ｙ、Ｓ２３３Ｌ、Ｎ４０７Ｇ（配列番号１７２）；（ｅ）Ｑ１２Ｗ、Ｒ２７Ｌ、Ｑ２８Ｍ、Ｋ１１９Ｒ、Ｓ１４０Ｎ、Ｓ１５７Ｒ、Ｖ１５９Ｍ、Ｓ２３３Ｌ、Ａ２４４Ｒ、Ｎ４０７Ｇ（配列番号１７４）；（ｆ）Ｄ１０Ｙ、Ｉ１１Ｌ、Ｑ１２Ｗ、Ｑ２８Ｍ、Ｋ１１９Ｒ、Ｖ１４１Ｔ、Ｖ１５９Ｍ、Ａ２３１Ｙ、Ｓ２３３Ｌ、Ａ２４４Ｒ、Ｎ４０７Ｇ（配列番号１７６）；（ｇ）Ｉ１１Ｌ、Ｑ１２Ｗ、Ｒ２７Ｌ、Ｑ２８Ｍ、Ｋ１１９Ｒ、Ｖ１４１Ｔ、Ｓ１５７Ｒ、Ｖ１５９Ｍ、Ａ１９７Ｔ、Ａ２３１Ｙ、Ｓ２３３Ｌ、Ａ２４４Ｒ、Ｎ４０７Ｇ、Ｐ４７７Ｇ（配列番号１７８）；（ｈ）Ｉ１１Ｌ、Ｑ１２Ｗ、Ｑ２８Ｍ、Ｋ１１９Ｒ、Ｖ１４１Ｔ、Ｓ１５７Ｒ、Ｖ１５９Ｍ、Ａ１９７Ｔ、Ａ２３１Ｙ、Ｓ２３３Ｌ、Ａ２４４Ｒ、Ｎ４０７Ｇ（配列番号１８０）；及び（ｉ）Ｉ１１Ｌ、Ｑ１２Ｗ、Ｒ２７Ｌ、Ｑ２８Ｍ、Ｋ１１９Ｒ、Ｖ１４１Ｔ、Ｐ１４９Ｇ、Ｓ１５７Ｒ、Ｖ１５９Ｍ、Ａ２３１Ｙ、Ｓ２３３Ｌ、Ｎ４０７Ｇ（配列番号１８２）を含む１つ以上の突然変異を含む、ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントを提供する。様々な実施形態において、（ａ）〜（ｉ）の前記突然変異は、アミノ酸置換である。本開示のいくつかの好ましい実施形態において、本開示のＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは、配列番号１６６、配列番号１６８、配列番号１７０、配列番号１７２、配列番号１７４、配列番号１７６、配列番号１７８、配列番号１８０、及び配列番号１８２のうちいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
本開示は、配列番号３８のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を備えるＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントであって、アミノ酸位置１２位における突然変異と、以下のアミノ酸位置：（ａ）配列番号３８の１２、２７、２８、１１９、１４１、１５７、１５９、２３１、２３３、及び２４４位；（ｂ）配列番号３８の１２、２８、１１９、１４０、１５７、１５９、２３３、２４４、２５４、及び４０７位；（ｃ）配列番号３８の１２、２７、１１１、１１９、１４１、１５７、１５９、２３１、２３３、２４４、及び２５４位；（ｄ）配列番号３８の１２、２８、１１９、１４０、１４９、１５７、１５９、２３１、２３３、及び４０７位；（ｅ）配列番号３８の１２、２７、２８、１１９、１４０、１５７、１５９、２３３、２４４、及び４０７位；（ｆ）配列番号３８の１０、１１、１２、２８、１１９、１４１、１５９、２３１、２３３、２４４、及び４０７位；（ｇ）配列番号３８の１１、１２、２７、２８、１１９、１４１、１５７、１５９、１９７、２３１、２３３、２４４、４０７、及び４７７位；（ｈ）配列番号３８の１１、１２、２８、１１９、１４１、１５７、１５９、１９７、２３１、２３３、２４４、及び４０７位；または（ｉ）配列番号３８の１１、１２、２７、２８、１１９、１４１、１４９、１５７、１５９、２３１、２３３、及び４０７位の各々における突然変異とを含み、脂肪酸からω−ヒドロキシル化脂肪酸への変換を触媒する、ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントを企図する。
１つの特定の態様において、本開示は、請求項１に記載のＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントであって、（ａ）配列番号３８のアミノ酸位置１２、２７、２８、１１９、１４１、１５７、１５９、２３１、２３３、及び２４４位における前記突然変異が、それぞれ、Ｑ１２Ｗ、Ｒ２７Ｌ、Ｑ２８Ｍ、Ｋ１１９Ｒ、Ｖ１４１Ｔ、Ｓ１５７Ｒ、Ｖ１５９Ｍ、Ａ２３１Ｙ、Ｓ２３３Ｌ、及びＡ２４４Ｒである；（ｂ）配列番号３８のアミノ酸位置１２、２８、１１９、１４０、１５７、１５９、２３３、２４４、２５４、及び４０７位における前記突然変異が、それぞれ、Ｑ１２Ｗ、Ｑ２８Ｍ、Ｋ１１９Ｒ、Ｓ１４０Ｎ、Ｓ１５７Ｒ、Ｖ１５９Ｍ、Ｓ２３３Ｌ、Ａ２４４Ｒ、Ｒ２５４Ｇ、及びＮ４０７Ｇである；（ｃ）配列番号３８のアミノ酸位置１２、２７、１１１、１１９、１４１、１５７、１５９、２３１、２３３、２４４、及び２５４位における前記突然変異が、それぞれ、Ｑ１２Ｗ、Ｒ２７Ｌ、Ｆ１１１Ａ、Ｋ１１９Ｒ、Ｖ１４１Ｔ、Ｓ１５７Ｒ、Ｖ１５９Ｍ、Ａ２３１Ｙ、Ｓ２３３Ｌ、Ａ２４４Ｒ、及びＲ２５４Ｇである；（ｄ）配列番号３８のアミノ酸位置１２、２８、１１９、１４０、１４９、１５７、１５９、２３１、２３３、及び４０７位における前記突然変異が、それぞれ、Ｑ１２Ｗ、Ｑ２８Ｍ、Ｋ１１９Ｒ、Ｓ１４０Ｎ、Ｐ１４９Ｇ、Ｓ１５７Ｒ、Ｖ１５９Ｍ、Ａ２３１Ｙ、Ｓ２３３Ｌ、及びＮ４０７Ｇである；（ｅ）配列番号３８のアミノ酸位置１２、２７、２８、１１９、１４０、１５７、１５９、２３３、２４４、及び４０７位における前記突然変異が、それぞれ、Ｑ１２Ｗ、Ｒ２７Ｌ、Ｑ２８Ｍ、Ｋ１１９Ｒ、Ｓ１４０Ｎ、Ｓ１５７Ｒ、Ｖ１５９Ｍ、Ｓ２３３Ｌ、Ａ２４４Ｒ、及びＮ４０７Ｇである；（ｆ）配列番号３８のアミノ酸位置１０、１１、１２、２８、１１９、１４１、１５９、２３１、２３３、２４４、及び４０７位における前記突然変異が、それぞれ、Ｄ１０Ｙ、Ｉ１１Ｌ、Ｑ１２Ｗ、Ｑ２８Ｍ、Ｋ１１９Ｒ、Ｖ１４１Ｔ、Ｖ１５９Ｍ、Ａ２３１Ｙ、Ｓ２３３Ｌ、Ａ２４４Ｒ、及びＮ４０７Ｇである；（ｇ）配列番号３８のアミノ酸位置１１、１２、２７、２８、１１９、１４１、１５７、１５９、１９７、２３１、２３３、２４４、４０７、及び４７７位における前記突然変異が、それぞれ、Ｉ１１Ｌ、Ｑ１２Ｗ、Ｒ２７Ｌ、Ｑ２８Ｍ、Ｋ１１９Ｒ、Ｖ１４１Ｔ、Ｓ１５７Ｒ、Ｖ１５９Ｍ、Ａ１９７Ｔ、Ａ２３１Ｙ、Ｓ２３３Ｌ、Ａ２４４Ｒ、Ｎ４０７Ｇ、及びＰ４７７Ｇである；（ｈ）配列番号３８のアミノ酸位置１１、１２、２８、１１９、１４１、１５７、１５９、１９７、２３１、２３３、２４４、及び４０７位における前記突然変異が、それぞれ、Ｉ１１Ｌ、Ｑ１２Ｗ、Ｑ２８Ｍ、Ｋ１１９Ｒ、Ｖ１４１Ｔ、Ｓ１５７Ｒ、Ｖ１５９Ｍ、Ａ１９７Ｔ、Ａ２３１Ｙ、Ｓ２３３Ｌ、Ａ２４４Ｒ、及びＮ４０７Ｇである；ならびに（ｉ）配列番号３８のアミノ酸位置１１、１２、２７、２８、１１９、１４１、１４９、１５７、１５９、２３１、２３３、及び４０７位における前記突然変異が、それぞれ、Ｉ１１Ｌ、Ｑ１２Ｗ、Ｒ２７Ｌ、Ｑ２８Ｍ、Ｋ１１９Ｒ、Ｖ１４１Ｔ、Ｐ１４９Ｇ、Ｓ１５７Ｒ、Ｖ１５９Ｍ、Ａ２３１Ｙ、Ｓ２３３Ｌ、及びＮ４０７Ｇである、ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントを提供する。
別の態様において、本開示は、請求項２に記載のＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントであって、（ａ）（ａ）のＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントが、配列番号１６６のアミノ酸配列を有する；（ｂ）（ｂ）のＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントが、配列番号１６８のアミノ酸配列を有する；（ｃ）（ｃ）のＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントが、配列番号１７０のアミノ酸配列を有する；（ｄ）（ｄ）のＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントが、配列番号１７２のアミノ酸配列を有する；（ｅ）（ｅ）のＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントが、配列番号１７４のアミノ酸配列を有する；（ｆ）（ｆ）のＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントが、配列番号１７６のアミノ酸配列を有する；（ｇ）（ｇ）のＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントが、配列番号１７８のアミノ酸配列を有する；（ｈ）（ｈ）のＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントが、配列番号１８０のアミノ酸配列を有する；及び（ｉ）（ｉ）のＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントが、配列番号１８２のアミノ酸配列を有する、ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントを提供する。
１つの実施形態において、ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントには、配列番号１６６、配列番号１６８、配列番号１７０、配列番号１７２、配列番号１７４、配列番号１７６、配列番号１７８、配列番号１８０、及び配列番号１８２が含まれるが、これらに限定されない。別の実施形態において、組換え宿主細胞におけるＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは、対応する宿主細胞における配列番号６または配列番号３８のＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドの発現により産生されるω−ヒドロキシル化脂肪酸の力価と比較して、より高い力価のω−ヒドロキシル化脂肪酸をもたらす。別の実施形態において、ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントはハイブリッドＣＹＰ１５３Ａ−ＲｅｄＲｈＦ融合タンパク質バリアントである。別の実施形態において、組換え宿主細胞は、本開示のＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントを発現する。なお別の実施形態において、組換え宿主細胞は、さらに、ＥＣ ３．１．２．−、ＥＣ ３．１．１．５またはＥＣ ３．１．２．１４のチオエステラーゼポリペプチドを発現する。なお別の実施形態において、組換え宿主細胞は、炭素源含有培地において培養された場合において、配列番号３８または配列番号６を有する対応するＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドを発現する宿主細胞により産生されるω−ヒドロキシル化脂肪酸組成物の力価よりも、少なくとも１０％高い、少なくとも１５％高い、少なくとも２０％高い、少なくとも２５％高い、または少なくとも３０％高い力価を有するω−ヒドロキシル化脂肪酸組成物を産生する。別の実施形態において、本開示は、上で企図する組換え宿主細胞を含む細胞培養物を提供する。
別の態様において、本開示は、ω−ヒドロキシル化脂肪酸を産生する方法であって、（ｉ）組換え宿主細胞または細胞培養物を、炭素源の存在下で培養するステップと、（ｉｉ）ω−ヒドロキシル化脂肪酸を採取するステップと、を含む方法を提供する。
本開示は、さらに、（ｉ）ＥＣ ３．１．２．−、ＥＣ ３．１．１．５またはＥＣ ３．１．２．１４のチオエステラーゼ；及び（ｉｉ）ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアント；を含むポリペプチドをコードする、少なくとも２つの核酸配列を発現するように操作された経路を含む、組換え微生物を企図する。
本開示のＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは、ＣＹＰ１５３Ａ ω−ヒドロキシラーゼドメイン及びＰ４５０ＲｈＦレダクターゼドメインを含む。この２つのドメインの順序は、図５に示す順序に限定されない。ＣＹＰ１５３Ａ ω−ヒドロキシラーゼドメインは、ハイブリッド融合ポリペプチドバリアントのＮ末端にあってもＣ末端にあってもよい。また、Ｐ４５０ＲｈＦレダクターゼドメインも、ハイブリッド融合ポリペプチドバリアントのＮ末端にあってもＣ末端にあってもよい。この２つのドメインは、直接連結していても、または図５に示すようにリンカーによって連結していてもよい。様々な実施形態において、当該リンカーはペプチドリンカーまたはポリペプチドリンカーである。当該リンカーのアミノ酸配列の長さは、実験により、または構造情報から導いて、またはこの２つのアプローチの組合せを使用することにより、選択することができる。当業者であれば、リンカーの役目を果たすことができる長さや組成の様々な配列が多数存在し、主な考慮点は配列が長すぎず短すぎないことであることを認識するであろう。
本開示のＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは、上述のようにＣＹＰ１５３Ａ ω−ヒドロキシラーゼドメイン及びＰ４５０ＲｈＦレダクターゼドメインを含む。配列番号６のＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドのアミノ酸配列は、１つの突然変異、即ち位置３０７（Ｇ３０７Ａ）における突然変異を有し、アラニン（Ａ）はグリシン（Ｇ）で置換された（即ち、置き換えられた）。配列番号３８のＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドのアミノ酸配列は、１つの追加の突然変異、即ち位置７９６（Ａ７９６Ｖ）における突然変異を有し、アラニン（Ａ）がバリン（Ｖ）で置換されている（即ち、置き換えられている）こと以外は、配列番号６のＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドのアミノ酸配列に対応している。
（鋳型）ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドとして、ω−ヒドロキシ脂肪酸誘導体を産生するためにＣＹＰ１５３Ａ Ｐ４５０オキシゲナーゼがレダクターゼドメインと融合しているハイブリッド融合タンパク質が考慮され得る。自給型チトクロームＰ４５０オキシゲナーゼは、レダクターゼパートナーがチトクロームＰ４５０触媒タンパク質に融合している酵素である。自給型細菌性チトクロームＰ４５０オキシゲナーゼの１つのクラスは、ロドコッカス属の種（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）ＮＣＩＭＢ ９７８４（Ｒｏｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：４８９１４；Ｈｕｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００５）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．５７９：２２１５）のＰ４５０ＲｈＦによって表され、「クラス−Ｉ Ｐ４５０−融合ＰＦＯＲ」（ＤｅＭｏｔ ａｎｄ Ｐａｒｒｅｔ（２００２） Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１０：５０２）と呼ばれている。したがって、（鋳型）ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドとして、（例えば、マリノバクター・アクアエオレイ（Ｍａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒ ａｑｕａｅｏｌｉ）由来の）ＣＹＰ１５３Ａ Ｐ４５０触媒タンパク質と、ロドコッカス属の種ＮＣＩＭＢ９７８４由来のＰ４５０ＲｈＦのｃ末端のＦＭＮ−及びＦｅ／Ｓ−含有レダクターゼドメインとを含む融合タンパク質が考慮され得る。
本開示の様々な実施形態において、当該ハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは自給型であり、脂肪酸（誘導体）からω−ＯＨ脂肪酸またはω−ＯＨ脂肪酸誘導体への反応を触媒するω−ヒドロキシラーゼ酵素活性を有する。
１つの態様において、本開示は、再生可能原料から炭素源の存在下、発酵ブロス中で増殖させた場合にインビボでω−ＯＨ脂肪酸またはω−ＯＨ脂肪酸誘導体を産生するための組換え微生物または組換え宿主細胞を包含し、この微生物は、ＥＣ ３．１．２．−またはＥＣ ３．１．１．５またはＥＣ ３．１．２．１４のチオエステラーゼ、及びＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントを含むポリペプチドをコードする少なくとも２種の核酸配列を発現するように操作された経路を有し、このＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、配列番号１２２、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４、配列番号１３６、配列番号１３８、配列番号１４０、配列番号１４２、配列番号１４４、配列番号１４６、配列番号１４８、配列番号１５０、配列番号１５２、配列番号１５４、配列番号１５６、配列番号１５８、配列番号１６０、配列番号１６２、及び配列番号１６４のいずれか１つに対して、少なくとも９０％、９１％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する。１つの実施形態では、ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは自給型ＣＹＰ１５３Ａ−ＲｅｄＲｈＦハイブリッド融合タンパク質バリアントである。
本開示の別の態様は、上で論じられた組換え宿主細胞（上記）を含む細胞培養物であって、ω−ＯＨ脂肪酸またはその組成物を産生する細胞培養物を提供する。１つの実施形態において、細胞培養物は、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、Ｃ１５、Ｃ１６、Ｃ１７、Ｃ１８、Ｃ１９、Ｃ２０、Ｃ８：１、Ｃ９：１、Ｃ１０：１、Ｃ１１：１、Ｃ１２：１、Ｃ１３：１、Ｃ１４：１、Ｃ１５：１、Ｃ１６：１、Ｃ１７：１、Ｃ１８：１、Ｃ１９：１及び／またはＣ２０：１脂肪酸または脂肪酸誘導体或いはその組成物の１種以上を含むω−ＯＨ脂肪酸を産生する。１つの実施形態において、細胞培養物は、不飽和ω−ＯＨ Ｃ１６：１脂肪酸またはその組成物を産生する。別の実施形態において、細胞培養物は、飽和ω−ＯＨ Ｃ１６脂肪酸またはその組成物を産生する。１つの実施形態において、細胞培養物は、不飽和ω−ＯＨ Ｃ１２：１脂肪酸またはその組成物を産生する。別の実施形態において、細胞培養物は、飽和ω−ＯＨ Ｃ１２脂肪酸またはその組成物を産生する。１つの実施形態において、細胞培養物は、不飽和ω−ＯＨ Ｃ１４：１脂肪酸またはその組成物を産生する。別の実施形態において、細胞培養物は、飽和ω−ＯＨ Ｃ１４脂肪酸またはその組成物を産生する。１つの実施形態において、細胞培養物は、不飽和ω−ＯＨ Ｃ１８：１脂肪酸またはその組成物を産生する。別の実施形態において、細胞培養物は、飽和ω−ＯＨ Ｃ１８脂肪酸またはその組成物を産生する。１つの実施形態において、細胞培養物は、不飽和ω−ＯＨ Ｃ１０：１脂肪酸またはその組成物を産生する。別の実施形態において、細胞培養物は、飽和ω−ＯＨ Ｃ１０脂肪酸またはその組成物を産生する。１つの実施形態において、細胞培養物は、不飽和ω−ＯＨ Ｃ８：１脂肪酸またはその組成物を産生する。別の実施形態において、細胞培養物は、飽和ω−ＯＨ Ｃ８脂肪酸またはその組成物を産生する。１つの実施形態において、細胞培養物は、不飽和ω−ＯＨ Ｃ２０：１脂肪酸またはその組成物を産生する。別の実施形態において、細胞培養物は、飽和ω−ＯＨ Ｃ２０脂肪酸またはその組成物を産生する。さらに別の実施形態において、追加の飽和または不飽和ω−ＯＨ脂肪酸またはその組成物は組換え宿主細胞により産生される。
本開示のなお別の態様は、力価の増大したω−ＯＨ脂肪酸を産生する方法であって、宿主細胞（上記）を炭素源で培養し、ω−ＯＨ脂肪酸またはその組成物を採取することを含む方法を提供する。特に、本方法は、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、Ｃ１５、Ｃ１６、Ｃ１７、Ｃ１８、Ｃ１９、Ｃ２０、Ｃ８：１、Ｃ９：１、Ｃ１０：１、Ｃ１１：１、Ｃ１２：１、Ｃ１３：１、Ｃ１４：１、Ｃ１５：１、Ｃ１６：１、Ｃ１７：１、Ｃ１８：１、Ｃ１９：１及び／またはＣ２０：１脂肪酸または脂肪酸誘導体或いはその組成物を産生することを包含する。１つの実施形態において、採取されるω−ＯＨ脂肪酸は、不飽和ω−ＯＨ Ｃ１６：１脂肪酸またはその組成物である。別の実施形態において、採取されるω−ＯＨ脂肪酸は、飽和ω−ＯＨ Ｃ１６脂肪酸またはその組成物である。１つの実施形態において、採取されるω−ＯＨ脂肪酸は、不飽和ω−ＯＨ Ｃ１２：１脂肪酸またはその組成物である。別の実施形態において、採取されるω−ＯＨ脂肪酸は、飽和ω−ＯＨ Ｃ１２脂肪酸またはその組成物である。１つの実施形態において、採取されるω−ＯＨ脂肪酸は、不飽和ω−ＯＨ Ｃ１４：１脂肪酸またはその組成物である。別の実施形態において、採取されるω−ＯＨ脂肪酸は、飽和ω−ＯＨ Ｃ１４脂肪酸またはその組成物である。１つの実施形態において、採取されるω−ＯＨ脂肪酸は、不飽和ω−ＯＨ Ｃ１８：１脂肪酸またはその組成物である。別の実施形態において、採取されるω−ＯＨ脂肪酸は、飽和ω−ＯＨ Ｃ１８脂肪酸またはその組成物である。１つの実施形態において、採取されるω−ＯＨ脂肪酸は、不飽和ω−ＯＨ Ｃ１０：１脂肪酸またはその組成物である。別の実施形態において、採取されるω−ＯＨ脂肪酸は、飽和ω−ＯＨ Ｃ１０脂肪酸またはその組成物である。１つの実施形態において、採取されるω−ＯＨ脂肪酸は、不飽和ω−ＯＨ Ｃ８：１脂肪酸またはその組成物である。別の実施形態において、採取されるω−ＯＨ脂肪酸は、飽和ω−ＯＨ Ｃ８脂肪酸またはその組成物である。１つの実施形態において、採取されるω−ＯＨ脂肪酸は、不飽和ω−ＯＨ Ｃ２０：１脂肪酸またはその組成物である。別の実施形態において、採取されるω−ＯＨ脂肪酸は、飽和ω−ＯＨ Ｃ２０脂肪酸またはその組成物である。１つの実施形態において、採取されるω−ＯＨ脂肪酸は、不飽和ω−ＯＨ Ｃ２２：１脂肪酸またはその組成物である。別の実施形態において、採取されるω−ＯＨ脂肪酸は、飽和ω−ＯＨ Ｃ２２脂肪酸またはその組成物である。
本開示は、いくつかの好ましい実施形態を示す役割を担う添付の図面を併用して読んだときに、最も良く理解される。しかしながら、本開示が、図面に記載された具体的な実施形態に限定されないことが理解される。
組換え微生物においてＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアント及びチオエステラーゼポリペプチドの発現の結果として、例えば、ω−ヒドロキシル化Ｃ１２脂肪酸（ω−ＯＨ Ｃ１２ ＦＦＡ）及び／またはω−ヒドロキシル化Ｃ１６：１脂肪酸（ω−ＯＨ Ｃ１６：１ ＦＦＡ）等のω−ヒドロキシル化脂肪酸誘導体を産生するための生合成経路の例を模式的に図示するものである。ＦＡＢは微生物中の脂肪酸生合成を示し；ｆａｔＢ１は、ウンベルラリア・カリフォルニカ（Ｕｍｂｅｌｌｕｌａｒｉａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）（カリフォルニア湾）由来の中鎖アシル−ＡＣＰチオエステラーゼを示し；そしてｆａｔＡ３はシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）由来の長鎖アシル−ＡＣＰチオエステラーゼを示す。 ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントの発現の結果としてω−ヒドロキシル化脂肪酸を産生する例を示している。バリアントによるω−ヒドロキシル化（ω−ＯＨ）脂肪酸の産生を示すために、部位飽和突然変異誘発を用いた。描かれたグラフは、ＣＹＰ１５３Ａ（Ｇ３０７Ａ、Ａ７９６Ｖ）−Ｒｅｄ４５０ＲｈＦのアミノ酸位置１４１及び３０９の部位飽和突然変異誘発のベストヒットを示す。図は、総脂肪酸種（総ＦＡＳ）（暗灰色バー参照）；ω−ヒドロキシヘキサデセン酸（ω−ＯＨ Ｃ１６：１）（薄い灰色バー参照）；及び％ω−ヒドロキシ脂肪酸（％ω−ＯＨ ＦＦＡ）（矢印参照）を示している。 配列の表Ａに示されるバリアントのための鋳型配列として使用されたハイブリッドチトクロームＰ４５０ Ｃｙｐ１５３Ａ（Ｇ３０７Ａ）−ＲｅｄＲｈＦ融合タンパク質（配列番号６）のポリペプチド配列を示している。 配列の表Ｂに示されるバリアントのための鋳型配列として使用されたハイブリッドチトクロームＰ４５０ Ｃｙｐ１５３Ａ（Ｇ３０７Ａ）−Ｒｅｄ４５０ＲｈＦ（Ａ７９６Ｖ）融合タンパク質（配列番号３８）のポリペプチド配列を示している。 ２つの別個のドメイン、即ち、リンカーポリペプチドによって接続している触媒ドメイン及びレダクターゼドメインを有する、配列番号３８のチトクロームＰ４５０ Ｃｙｐ１５３Ａ（Ｇ３０７Ａ）−ＲｅｄＲｈＦ（Ａ７９６Ｖ）ハイブリッド融合ポリペプチドバリアントの構造を示している。触媒ドメインはアミノ酸位置１〜４８６にわたるように示され、アミノ酸位置１〜４７０にわたるＰ４５０ Ｃｙｐ１５３Ａ（Ｇ３０７Ａ）及びアミノ酸位置４７１〜４８６にわたるリンカーポリペプチドを含む。Ｒｅｄ４５０ＲｈＦ（Ａ７９６Ｖ）として示されるレダクターゼドメインは、アミノ酸位置４８７〜７９９にわたる。配列番号３８は、追加のバリアントを作り出すための鋳型配列として使用される。 配列番号９８の３次元タンパク質構造を描写している。ボールは、突然変異した残基上の炭素原子、窒素原子及び酸素原子を描写するものである。また、中心付近には、中央の鉄原子の周囲にクラスター化されたヘム基も示されている。潜在的なリガンド結合部位は、灰色の面として図示されている。この画像から分かるように、全ての突然変異した残基は、潜在的なリガンド結合部位（即ち、活性部位）の外部にある。
詳細な説明
総括
我々の石油化学製品依存を削減する１つの方法は、小規模産生宿主として機能する環境に優しい微生物を介してω−ＯＨ脂肪酸等の脂肪酸誘導体の産生をすることである。このような細胞宿主（即ち、組換え宿主細胞または微生物）は、ω−ＯＨ脂肪酸誘導体及び二官能性脂肪酸誘導体を、再生可能な原料（例えば、発酵性糖質、バイオマス、セルロース、グリセロール、ＣＯ、ＣＯ２など）等の再生可能資源から産生するように操作される。これらのω−ＯＨ脂肪酸誘導体は、特殊化学製品、ポリマー及び香料等の工業製品の原材料である。
本開示は、組換え宿主細胞で発現される場合に、ω−ＯＨ脂肪酸誘導体組成物をより高い力価、収率及び／または生産性で得ることができるＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチド及びそのバリアントを包含するω−ヒドロキシラーゼ関連融合ポリペプチドに関する。本明細書では、向上したω−ＯＨ脂肪酸誘導体の生合成は、宿主細胞を、それらがＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチド及びそのバリアントを発現するように形質転換することにより行われる。このＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチド及びそのバリアントは、脂肪酸からω−ＯＨ脂肪酸、例えば、ω−ＯＨ Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、Ｃ１５、Ｃ１６、Ｃ１７、Ｃ１８、Ｃ１９、Ｃ２０、Ｃ８：１、Ｃ９：１、Ｃ１０：１、Ｃ１１：１、Ｃ１２：１、Ｃ１３：１、Ｃ１４：１、Ｃ１５：１、Ｃ１６：１、Ｃ１７：１、Ｃ１８：１、Ｃ１９：１及び／またはＣ２０：１脂肪酸または脂肪酸誘導体への反応を触媒する。本開示は、ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチド及びそのバリアントを発現する組換え宿主細胞または産生菌株を包含する。１態様において、本開示はＰ４５０サブファミリーｃｙｐ１５３Ａに関する。
定義
本明細書及び特許請求の範囲に使用されるとき、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」は、本文が特に明らかに断らない限り複数の指示対象も含む。したがって、例えば、「１つの宿主細胞」への言及は２つ以上のこのような宿主細胞を含み、「１つの脂肪酸エステル」への言及は１つ以上のこのような脂肪酸エステルまたはエステルの混合物を含み、「１つの核酸配列」への言及は１つ以上の核酸配列を含み、「１つの酵素」への言及は１つ以上の酵素を含む、などである。
「酵素分類（ＥＣ）番号」という用語は、特定の酵素活性を表す番号を言う。ＥＣ番号は、酵素命名システムの下、それらが触媒する反応に従って酵素を分類する。ＥＣ番号は酵素触媒反応を特定する。例えば、異なる生物からの異なる酵素が同じ反応を触媒する場合、それらは同じＥＣ番号を有する。さらに、異なるタンパク質の折り畳みが同一反応を触媒できるのなら、それらは同一のＥＣ番号に割り当てられるであろう（例、非相同同機能酵素、即ちＮＩＳＥ）。ＥＣ番号は、国際生化学・分子生物連合（ＩＵＢＭＢ）の命名委員会（その記述はワールド・ワイド・ウェブのＩＵＢＭＢ酵素命名ウェブサイトで入手できる）により確立されている。例えば、ω−ヒドロキシラーゼまたはω−オキシゲナーゼ酵素活性を含むチトクロームＰ４５０モノオキシゲナーゼ（Ｐ４５０）酵素活性は、ＥＣ１．１４．１５．３に分類される。Ｐ４５０酵素ファミリーに入る酵素の機能は、様々な種の大部分の原核生物において保存されている。したがって、異なる微生物種が、ＥＣ１．１４．１５．３に分類された同じ酵素活性を示すことができる。ＥＣ１．１４．１５．３により特徴付けられる酵素活性の例は、本明細書に記載のＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチド及びそのバリアント(上記)の酵素活性である。
用語「オメガ−ヒドロキシル化脂肪酸」または「ω−ヒドロキシル化脂肪酸」または「ω−ヒドロキシ脂肪酸」または「ω−ヒドロキシル脂肪酸」または「ω−ＯＨ脂肪酸」または「ωＯＨ脂肪酸」は、本明細書では区別なく使用され、そして脂肪酸代謝から生じ、少なくとも１つのＯＨ基をオメガ（ω）位に有する脂肪酸を指す。このようなω−ヒドロキシル化脂肪酸の例としては、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、Ｃ１５、Ｃ１６、Ｃ１７、Ｃ１８、Ｃ１９、Ｃ２０、Ｃ８：１、Ｃ９：１、Ｃ１０：１、Ｃ１１：１、Ｃ１２：１、Ｃ１３：１、Ｃ１４：１、Ｃ１５：１、Ｃ１６：１、Ｃ１７：１、Ｃ１８：１、Ｃ１９：１及び／またはＣ２０：１脂肪酸を挙げることができる。１つの実施形態において、このようなω−ヒドロキシル化脂肪酸は、ω−ＯＨ Ｃ８：０脂肪酸、ω−ＯＨ Ｃ１０：０脂肪酸、ω−ＯＨ Ｃ１２：０脂肪酸、ω−ＯＨ Ｃ１４：０脂肪酸、ω−ＯＨ Ｃ１６：０脂肪酸、ω−ＯＨ Ｃ１８：０脂肪酸、ω−ＯＨ Ｃ２０：０脂肪酸、ω−ＯＨ Ｃ８：１脂肪酸、ω−ＯＨ Ｃ１０：１脂肪酸、ω−ＯＨ Ｃ１２：１脂肪酸、ω−ＯＨ Ｃ１４：１脂肪酸、ω−ＯＨ Ｃ１６：１脂肪酸、ω−ＯＨ Ｃ１８：１脂肪酸、ω−ＯＨ Ｃ２０：１脂肪酸などである。微生物では、ω−ヒドロキシル化脂肪酸は、ω−ヒドロキシル化脂肪酸エステル等のω−ヒドロキシル化脂肪酸誘導体、ならびにα，ω−二酸、α，ω−ジエステル、及びα，ω−ジオール等の二官能性脂肪酸誘導体を産生するのに使用され得る。この意味で、用語「オメガ−ヒドロキシル化脂肪酸誘導体」及び「ω−ヒドロキシル化脂肪酸誘導体」及び「ω−ヒドロキシ脂肪酸誘導体」及び「ω−ヒドロキシル脂肪酸誘導体」及び「α，ω−二官能性脂肪酸誘導体」及び「ω−ＯＨ脂肪酸誘導体」は、脂肪酸代謝から生じ、且つ少なくとも１つのＯＨ基をオメガ（ω）位に有するかまたは少なくとも１つのＯＨ基をオメガ（ω）位に有する中間体から誘導された化学物質を言う。ここで、「オメガ（ω）位」は、脂肪酸誘導体の第１官能基に関して反対側の端部の末端炭素原子を言う。このようなω−ヒドロキシル化脂肪酸誘導体としては、限定されるものではないが、α，ω−二酸、α，ω−ジエステル、及びα，ω−ジオール、ならびにこれらから誘導された化学薬品（例、マクロラクトン）が挙げられる。
本明細書で言及される「ω−ヒドロキシル化脂肪酸組成物」または「ω−ＯＨ脂肪酸組成物」は組換え宿主細胞により産生され、一般に、様々な鎖長及び／または飽和及び／または分岐特徴を有するある特定の種類のω−ヒドロキシル化脂肪酸の混合物を含むものである。同様に、「ω−ヒドロキシル化脂肪酸誘導体組成物」は、組換え宿主細胞により産生され、一般に、様々な鎖長及び／または飽和及び／または分岐特徴を有するある特定の種類のω−ヒドロキシル化脂肪酸誘導体（例、様々な鎖長及び／または飽和及び／または分岐特徴を有するω−ヒドロキシル化脂肪酸、様々な鎖長及び／または飽和及び／または分岐特徴を有するω−ヒドロキシル化脂肪酸エステル、様々な鎖長及び／または飽和及び／または分岐特徴を有するα，ω−二酸、様々な鎖長及び／または飽和及び／または分岐特徴を有するα，ω−ジエステル、様々な鎖長及び／または飽和及び／または分岐特徴を有するα，ω−ジオール、など）の混合物を含むものである。いくつかの場合において、ω−ＯＨ脂肪酸誘導体組成物は、ほとんど１種のω−ＯＨ脂肪酸誘導体、例えば１，１２−ドデセンジオール、または１，１４−テトラデカンジオール、または１６−ヒドロキシヘキサデカン酸メチルエステル、または１６−ヒドロキシヘキサデセン酸、または１５−ヒドロキシペンタデカン酸、または１５−ヒドロキシペンタデセン酸、または１８−オクタセセン酸、またはこれらの脂肪酸誘導体のいずれかのメチルエステル、またはその他を含むものである。さらに他の場合において、ω−ＯＨ脂肪酸誘導体組成物は、特別に設計された組成物（例、同一組成物中における、約２０％の１２−ヒドロキシドデカン酸及び約８０％の１，１４−１４−ヒドロキシテトラデカン酸が、このような例を提供するであろう）を提供するために、１種を超えるω−ＯＨ脂肪酸誘導体の混合物を含むものである。
用語「アクセッション番号」または「ＮＣＢＩアクセッション番号」または「ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号」は、特定の核酸配列を表す番号を指している。この記載で考察される配列アクセッション番号は、アメリカ合衆国の国立衛生研究所で保持されているＮＣＢＩ（全米バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ））により提供されるデータベース、及びユニプロット知識ベース（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ）及びスイス・バイオインフォマティクス研究所により提供されるスイスプロットデータベースにより与えられたデータベースから得られた（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号とも呼ばれる）。
本明細書で使用されるとき、用語「ヌクレオチド」は、ヘテロ環塩基、糖、及び１個以上のホスフェート基からなるポリヌクレオチドのモノマー単位を指す。天然塩基（グアニン、（Ｇ）、アデニン、（Ａ）、シトシン、（Ｃ）、チミン、（Ｔ）、及びウラシル、（Ｕ））は一般にプリンまたはピリミジンの誘導体であるが、天然及び非天然塩基類似体も含まれることは理解されるべきである。天然糖は、ペントース（５個の炭素の糖）デオキシリボース（ＤＮＡを形成する）またはリボース（ＲＮＡを形成する）であるが、天然及び非天然糖類似体も含まれることは理解されるべきである。核酸は、一般にホスフェート結合を介してつながって、核酸またはポリヌクレオチドを形成するが、多くの他の結合が当該技術では知られている（例、ホスホロチオエート、ボラノホスフェート、など）。
用語「ポリヌクレオチド」は、１本鎖、或いは２本鎖であることができ、非天然のまたは変更されたヌクレオチドを含み得る、リボヌクレオチド（ＲＮＡ）またはデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）のポリマーを指す。用語「ポリヌクレオチド」、「核酸配列」、及び「ヌクレオチド配列」は、本明細書では区別することなく使用され、いかなる長さのヌクレオチドのポリマー形態、ＲＮＡまたはＤＮＡのどちらかを指す。これらの用語は、分子の一次構造を指し、それ故、１本鎖及び２本鎖のＤＮＡ及び１本鎖及び２本鎖のＲＮＡを含む。これらの用語は、同等のものとして、ヌクレオチド類似体から作られたＲＮＡまたはＤＮＡの類似体、及び、限定されないけれども、メチル化及び／またはキャップされたポリヌクレオチド等の修飾ポリヌクレオチドを含んでいる。ポリヌクレオチドは、これらに限定されるものではないが、プラスミド、ウイルス、染色体、ＥＳＴ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、及びｒＲＮＡ等のどのような形態でもあり得る。
本明細書で使用されるとき、用語「ポリペプチド」及び「タンパク質」は区別なく使用され、アミノ酸残基のポリマーを指す。用語「組換えポリペプチド」は、組換え技術により製造されるポリペプチドを指し、この組換え技術では、一般に、発現したタンパク質をコードするＤＮＡまたはＲＮＡは、順に、宿主細胞を形質転換してポリペプチドを産生するために使用される好適な発現ベクターに挿入される。同様に、用語「組換えポリペプチド」または「組換え核酸」または「組換えＤＮＡ」は当業者に公知の組換え技術により産生される。
用語「相同体」及び「相同の」は、対応するポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列と少なくとも約５０パーセント（％）同一である配列を含む同一のポリヌクレオチドまたはポリペプチドを指す。好ましくは、相同のポリヌクレオチドまたはポリペプチドが、対応するアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列と、少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または少なくとも約９９％の相同性を有するポリヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を有する。本明細書で使用されるとき、配列の「相同性」及び配列「同一性」という用語は区別することなく使用される。当業者は２個以上の配列の間の相同性を決定する方法を良く知っている。簡潔に言うと、２個の配列間の「相同性」の計算は以下のように行うことができる。配列は最適な比較目的のために整列される（例、ギャップは、最適なアラインメントのために第１と第２の一方または両方のアミノ酸または核酸の配列に設けられ、非相同配列を比較目的のために無視することができる）。１つの好ましい実施形態において、比較目的のために整列される第１の配列の長さは、第２の配列の長さの、少なくとも約３０％、好ましくは少なくとも約４０％、より好ましくは少なくとも約５０％、さらに好ましくは少なくとも約６０％、そして、さらに好ましくは少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％または約１００％である。第１と第２の配列における対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置でのアミノ酸残基またはヌクレオチドは、その後比較される。第１の配列の位置が、第２の配列の対応する位置のものと同じアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占められた場合、これらの分子はその位置で同一である。２個の配列間のパーセント相同性は、配列で共有された同一位置の数の関数である。この関数は、２つの配列の最適アラインメントに求められるギャップの数及び各ギャップの長さが考慮される。配列の比較及び２個の配列の間のパーセント相同性の決定は、数学アルゴリズム、例えばＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，２１５（３）：４０３−４１０)を用いて行うことができる。２個のアミノ酸配列間のパーセント相同性は、Ｂｌｏｓｓｕｍ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスを用い且つ１６、１４、１２、１０、８、６または４のギャップ重み及び１、２、３、４、５または６の長さ重みを用いて、ＧＣＧソフトウェアパッケージ内のＧＡＰプログラムに取り込まれているＮｅｅｄｌｅｍａｎとＷｕｎｓｃｈアルゴリズムを用いて決定することができる（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４−４５３)。２個のヌクレオチド配列間のパーセント相同性はまた、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックス及び４０、５０、６０、７０または８０のギャップ重み及び１、２、３、４、５または６の長さ重みを用い、ＧＣＧソフトウェアパッケージ内のＧＡＰプログラムを用いて決定することができる。当業者は、初期の相同性計算を行い、それに従ってアルゴリズムパラメータを調節することができる。好ましいセットのパラメータ（及び分子が特許請求の範囲の相同性限定内にあるかどうかを決定するためにどのパラメータを適用すべきかについて実行者が不確かな場合に使用されるべきもの）は、１２のギャップペナルティ、４のギャップ拡大ペナルティ及び５のフレームシフトギャップペナルティでマトリックスを記録するＢｌｏｓｓｕｍ６２である。さらなる配列アラインメントの方法は生物工学の分野において知られている（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ（２００５）ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ６：２７８；Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ.（２００５）ＦＥＢＳ Ｊ. ２７２（２０）：５１０１−５１０９を参照）。
用語「低いストリンジェンシー、中程度のストリンジェンシー、高いストリンジェンシーまたは極めて高いストリンジェンシー下にハイブリダイズする」は、ハイブリダイゼーション及び洗浄の条件を表している。ハイブリダイゼーション反応を行うガイダンスはＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９），６．３．１−６．３．６．に見ることができる。水溶液法及び非水溶液法は上記文献に記載されており、いずれの方法も使用することができる。ここで示される特定のハイブリダイゼーション条件は下記の通りである：（１）低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件：６Ｘ塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）を約４５℃で、次いで０．２ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で少なくとも５０℃にて２回洗浄（洗浄温度は低いストリンジェンシー条件では５５℃に増大することができる）；（２）中程度のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件：６ＸＳＳＣを約４５℃で、次いで０．２ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で６０℃にて１回以上の洗浄；（３）高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件：６ＸＳＳＣを約４５℃で、次いで０．２ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で６５℃にて１回以上の洗浄；及び（４）極めて高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件：０．５Ｍリン酸ナトリウム、７％ＳＤＳを６５℃で、次いで０．２ＸＳＳＣ、１％ＳＤＳ中で６５℃にて１回以上の洗浄。極めて高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件（４）は、特に断らない限り好ましい条件である。
「内因性」ポリペプチドとは、親細胞（または宿主細胞）のゲノムによってコードされる、またはその親細胞内から生じるもしくは発生するもしくは由来する、ポリペプチドのことを指す。「外因性」ポリペプチドとは、親細胞のゲノムによってコードされない、またはその親宿主細胞の外部から生じるポリペプチドのことを指す。バリアント、即ち、突然変異ポリペプチドは、外因性ポリペプチドの一例である。したがって、非天然核酸分子は、細胞に一度導入されると外因性であると考えられる。天然核酸分子はまた、特定の細胞に対して外因性であるともいえる。例えば、細胞Ｘから単離された全コード配列は、たとえＸとＹが同じ細胞のタイプであっても、コード配列が細胞Ｙに導入されたら細胞Ｙに対して外因性核酸である。
用語「過剰発現した」は、遺伝子が、その遺伝子の野生型または天然または内因性の転写速度に比べて大きい速度で転写されることを意味する。いくつかの例において、過剰発現は、遺伝子の野生型または天然または内因性の転写速度に比べて、その遺伝子において増大した転写速度も含む。過剰発現を試験する方法は当該技術で周知であり、例えば、転写ＲＮＡレベルは、ｒｔＰＣＲを用いて評価することができ、タンパク質レベルをＳＤＳ ＰＡＧＥゲル分析を用いて評価することができる。
用語「異種性」は、異なる生物、異なる細胞型、または異なる種に由来することを意味する。本明細書で使用されるとき、この用語は、所与の生物内に天然には存在しないヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはタンパク質の配列のことを指す。例えば、シアノバクテリアに天然に存在するポリヌクレオチド配列は、組換え法によって大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の宿主細胞に導入することができ、このとき、シアノバクテリア由来のポリヌクレオチドは大腸菌細胞（例、組換え細胞）に対して異種である。用語「異種性」は、非天然状態の組換え宿主細胞に存在するヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、またはタンパク質の配列に対して使用することもできる。例えば、「異種性」のヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、またはタンパク質の配列は、対応する野生型宿主細胞に天然に存在する野生型配列に対して改変されてもよい（例、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、またはタンパク質の発現レベルまたは配列における改変）。
本明細書で使用されるとき、ポリペプチドの「断片」という用語は、完全長ポリペプチドまたはタンパク質のより短い部分を言い、そのサイズは、２個のアミノ酸残基から、アミノ酸配列全体から１個のアミノ酸残基を差し引いたものまでの範囲にわたる。本開示のある特定の実施形態において、断片とは、ポリペプチドまたはタンパク質のドメイン（例えば、基質結合ドメインまたは触媒ドメイン）のアミノ酸配列全体を指す。
用語「突然変異誘発」は、生物の遺伝情報を安定的な様式で変化させる工程を指す。タンパク質をコードする核酸配列の突然変異誘発により、突然変異タンパク質が産生する。突然変異誘発は、またタンパク質活性の改変をもたらす非コード性核酸配列の変化も意味する。
本明細書で使用されるとき、「突然変異」は、遺伝子の核酸位置における永久変化、またはポリペプチドもしくはタンパク質のアミノ酸位置における永久変化を言う。突然変異は置換、付加、挿入及び欠失を含む。例えば、アミノ酸位置の突然変異はアミノ酸の１つのタイプをアミノ酸の別のタイプに置換することであり得る（例えば、セリン（Ｓ）をアラニン（Ａ）と置換することができる；リジン（Ｌ）をスレオニン（Ｔ）と置換することができる；など）。そのため、ポリペプチドまたはタンパク質は、１個のアミノ酸が別のアミノ酸で置換されている１つ以上の突然変異を有することができる。本開示により提供されるＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは、配列番号３８のアミノ酸配列内の特定のアミノ酸位置に突然変異を有する。例えば、本開示により提供されるのは、配列番号３８のアミノ酸位置１２、２７、１１９、１４０、１５７、１５９、２３３、及び２４４の各々に突然変異を有するＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントである。これら特定のアミノ酸位置の各々に突然変異を有するＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは、脂肪酸からω−ヒドロキシル化脂肪酸への変換を触媒する。好ましくは、これら特定のアミノ酸位置の各々に突然変異を有するＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは、例えば、配列番号３８のＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドと比較して、より高い力価でω−ＯＨ脂肪酸誘導体を産生することができる。そのため、特許請求対象のＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントの特定のアミノ酸位置における突然変異には、例えば、配列番号３８のＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドよりも高い力価でω−ＯＨ脂肪酸誘導体を産生するという特許請求対象の効果をもたらさない可能性のある突然変異が含まれないことが好ましい。本開示のＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは、その機能、例えば、野生型ＣＹＰ１５３Ａポリペプチド、または鋳型ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチド、または任意の他の参照ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドと比較して改良された機能（増大した触媒機能、増大した安定性、または低下した阻害性（例えば、低下したフィードバック阻害）を含むが、これらに限定されない）を、当技術分野で公知の方法を用いてスクリーニングすることができる。本開示の様々な実施形態において、請求項で定義される特定の位置における突然変異は、例えば、配列番号３８のＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドと比較して、ω−ヒドロキシ脂肪酸（ω−ＯＨ ＦＦＡ力価）の量の増大及び／または脂肪酸からω−ヒドロキシ脂肪酸への変換の増大をもたらす性質のものである。様々な実施形態において、請求項で定義される特定の位置における突然変異は、例えば、配列番号４２または配列番号４６のＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドと比較して、ω−ヒドロキシ脂肪酸（ω−ＯＨ ＦＦＡ力価）の量の増大及び／または脂肪酸からω−ヒドロキシ脂肪酸への変換の増大をもたらす性質のものである。様々な実施形態において、請求項で定義される特定の位置における突然変異は、例えば、配列番号９８のＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドと比較して、ω−ヒドロキシ脂肪酸（ω−ＯＨ ＦＦＡ力価）の量の増大及び／または脂肪酸からω−ヒドロキシ脂肪酸への変換の増大をもたらす性質のものである。本開示の様々な実施形態において、請求項で定義される特定の位置における突然変異の１つ以上は、１つ以上のアミノ酸置換及び／または欠失を意味する。好ましくは、請求項で定義される特定の位置における突然変異の１つ以上は、１つ以上のアミノ酸置換を意味する。より好ましくは、所与のＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントについて請求項で定義される、特定の位置における突然変異の全ては、アミノ酸置換である。ある位置におけるアミノ酸残基が欠失し、異なるアミノ酸残基がその位置に挿入される場合、これはある位置におけるアミノ酸残基の置換としてみなすことができる。本開示の様々な実施形態において、アミノ酸位置における突然変異は、（その位置における）サイレント置換ではないアミノ酸置換を意味する。
本明細書で使用されるとき、「遺伝子」は、ＲＮＡ産物またはタンパク質産物をコードする核酸配列、ならびにそのＲＮＡまたはタンパク質の発現に影響を及ぼす、機能的に接続された核酸配列（例えば、このような配列には、プロモーター配列またはエンハンサー配列が含まれるが、これに限定されない）、またはＲＮＡもしくはタンパク質の発現に影響を及ぼす配列をコードする、機能的に接続された核酸配列（例えば、このような配列には、リボソーム結合部位または翻訳制御配列が含まれるが、これに限定されない）を言う。
発現制御配列は当技術分野において公知であり、例えば、宿主細胞におけるポリヌクレオチド配列の発現をもたらす、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、転写終結因子、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）等を含んでいる。発現制御配列は、転写に関与する細胞タンパク質と特異的に相互作用する（Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３６：１２３７−１２４５）。発現制御配列の例は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ，Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ.（１９９０）に記載されている。本開示の方法において、発現制御配列は、ポリヌクレオチド配列と機能的に接続されている。「機能的に接続された」という用語は、適切な分子（例えば、転写活性化タンパク質）が発現制御配列に結合した際に遺伝子発現を可能にするように、ポリヌクレオチド配列と発現制御配列が接続されていることを意味する。機能的に接続されたプロモーターは、転写及び翻訳の方向に関して、選択されたポリヌクレオチド配列の上流に位置する。機能的に接続されたエンハンサーは、選択されたポリヌクレオチドの上流、内部または下流に位置することができる。
本明細書で使用されるとき、用語「ベクター」は、別の核酸、即ちそれに連結されたポリヌクレオチド配列を輸送しうる核酸分子を言う。有用なベクターの１種は、エピソーム（即ち、染色体外での複製が可能な核酸）である。有用なベクターは、それに連結された核酸の自律複製及び／または発現を可能にするものである。機能的に接続された遺伝子の発現を導くことができるベクターを、本明細書では「発現ベクター」と呼ぶ。一般に、組換えＤＮＡ手法において有用な発現ベクターは、ベクター形態では染色体に結合していない環状二本鎖ＤＮＡループを一般的に指す「プラスミド」の形態にあることが多い。他の有用な発現ベクターは線状形態で提供される。同等の機能の役割を果たし、後に当技術分野に知られることとなった他の形態の発現ベクターもまた含まれる。いくつかの実施形態において、組換えベクターは、ポリヌクレオチド配列に機能的に接続したプロモーターをさらに含む。いくつかの実施形態において、プロモーターは、発生段階調節性プロモーター、オルガネラ特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、誘導性プロモーター、構成性プロモーター、または細胞特異的プロモーターである。組換えベクターは一般に、以下から選択される少なくとも１つの配列を含む：ポリヌクレオチド配列と機能的に結合した発現制御配列；ポリヌクレオチド配列と機能的に結合した選択マーカー；ポリヌクレオチド配列と機能的に結合したマーカー配列；ポリヌクレオチド配列と機能的に結合した精製部分；ポリヌクレオチド配列と機能的に結合した分泌配列；及びポリヌクレオチド配列と機能的に結合したターゲティング配列。ある特定の実施形態において、ヌクレオチド配列は宿主細胞のゲノムＤＮＡに安定的に組み込まれており、ヌクレオチド配列の発現は、調節プロモーター領域の制御下にある。本明細書で使用される発現ベクターは、本明細書に記載の特定のポリヌクレオチド配列を、宿主細胞におけるポリヌクレオチド配列の発現に適した形態で含む。発現ベクターの設計が、形質転換させようとする宿主細胞の選択、所望のポリペプチドの発現レベル等の要因に依存しうることが、当業者に理解されるであろう。本明細書に記載された発現ベクターは、本明細書に記載されたポリヌクレオチド配列によってコードされる、融合ポリペプチドを含むポリペプチドを産生させるために宿主細胞に導入することができる。原核生物、例えば大腸菌におけるポリペプチドをコードする遺伝子の発現は、融合または非融合ポリペプチドの発現を導く構成性または誘導性プロモーターを含有するベクターを用いて実施されることが最も多い。融合ベクターは、その中にコードされたポリペプチド、通常は組換えポリペプチドのアミノ末端またはカルボキシ末端に、多くのアミノ酸を付加する。このような融合ベクターは、一般に、以下を含む３つの目的のうちの１以上に役立つ：組換えポリペプチドの発現を増大させること；組換えポリペプチドの溶解性を増大させること；及びアフィニティー精製においてリガンドとして作用することによって、組換えポリペプチドの精製を補助すること。融合発現ベクターでは、しばしば、融合部分と組換えポリペプチドの接合部にタンパク質開裂部位が導入される。これにより、融合ポリペプチドの精製後に、融合部分からの組換えポリペプチドの分離が可能となる。ある特定の実施形態において、本開示のポリヌクレオチド配列は、バクテリオファージＴ５由来のプロモーターと機能的に接続されている。
ある特定の実施形態において、宿主細胞は酵母細胞であり、発現ベクターは酵母発現ベクターである。酵母Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における発現のためのベクターの例としては、ｐＹｅｐＳｅｃ１（Ｂａｌｄａｒｉ ｅｔ ａｌ．（１９８７）ＥＭＢＯＪ．６：２２９−２３４）；ｐＭＦａ（Ｋｕｒｊａｎ ｅｔ ａｌ．（１９８２）Ｃｅｌｌ ３０：９３３−９４３）；ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｇｅｎｅ ５４：１１３−１２３）；ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）；及びｐｉｃＺ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）が挙げられる。他の実施形態において、宿主細胞は昆虫細胞であり、発現ベクターはバキュロウイルス発現ベクターである。培養昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９細胞）におけるタンパク質の発現のために利用し得るバキュロウイルスベクターとしては、例えば、ｐＡｃ系列（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，３：２１５６−２１６５）及びｐＶＬ系列（Ｌｕｃｋｌｏｗ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１７０：３１−３９）が挙げられる。さらに別の実施形態において、本明細書に記載のポリヌクレオチド配列を、哺乳動物発現ベクターを用いて哺乳動物細胞において発現させることができる。原核細胞及び真核細胞の両方に他の適した発現系が当技術分野において周知である；例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，”ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，（１９８９）を参照。
本明細書で使用されるとき、用語「ＣｏＡ」または「アシル-ＣｏＡ」は、アルキル鎖のカルボニル炭素と補酵素Ａ（ＣｏＡ）の４’−ホスホパンテチオニル部分のスルフヒドリル基との間に形成され、式Ｒ−Ｃ（Ｏ）Ｓ−ＣｏＡ（式中、Ｒは少なくとも４個の炭素原子を有する任意のアルキル基である）を有するアシルチオエステルを言う。
用語「ＡＣＰ」はアシルキャリアータンパク質を意味する。ＡＣＰは、脂肪酸生合成の間におけるアシル中間体の高度保存キャリアーで、その伸長鎖（ｇｒｏｗｉｎｇ ｃｈａｉｎ）は４’−ホスホパンテテイン（ｐｈｏｓｐｈｏｐａｎｔｅｔｈｅｉｎｅ）部分の末端チオールでチオールエステルとして合成中に結合される。タンパク質は、２つの形態、即ち、アポ−ＡＣＰ（脂肪酸の生合成において不活性）、及びＡＣＰまたはホロ−ＡＣＰ（脂肪酸の生合成において活性）で存在する。用語「ＡＣＰ」及び「ホロ−ＡＣＰ」は、本明細書では区別なく使用され、タンパク質の活性形態を言う。ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼと呼ばれる酵素は、不活性アポ−ＡＣＰから活性ホロ−ＡＣＰへの変換において関与する。より具体的には、ＡＣＰは、不活性アポ−ＡＣＰ形態で発現され、そして４’−ホスホパンテテイン部分は、ホロ−ＡＣＰを産生するために、ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼであるホロ−アシルキャリアータンパク質シンターゼ（ＡＣＰＳ）の作用によりＡＣＰ上の保存セリン残基に翻訳後結合されなければならない。
本明細書で使用されるとき、用語「アシル−ＡＣＰ」は、アルキル鎖のカルボニル炭素とアシルキャリアータンパク質（ＡＣＰ）のホスホパンテテイニル部分のスルフヒドリル基との間に形成されるアシルチオエステルを言う。いくつかの実施形態において、ＡＣＰは完全飽和のアシル−ＡＣＰの合成における中間体である。他の実施形態において、ＡＣＰは不飽和のアシル−ＡＣＰの合成における中間体である。いくつかの実施形態において、炭素鎖は、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５または２６個の炭素を有する。
本明細書で使用されるとき、用語「脂肪酸誘導体」は「脂肪酸」または「脂肪酸誘導体」を意味し、「脂肪酸または脂肪酸誘導体」と呼ぶことができる。用語「脂肪酸」は、式ＲＣＯＯＨ（式中、Ｒは脂肪族基、好ましくはアルキル基を表す）を有するカルボン酸を意味する。Ｒは、約４〜約２２個の炭素原子を含むことができる。脂肪酸は、飽和、モノ不飽和、またはポリ不飽和であり得る。「脂肪酸誘導体」は部分的に産生宿主生物（例、組換え宿主細胞または微生物）の脂肪酸生合成経路から作製された産物である。「脂肪酸誘導体」はＡＣＰ、アシル−ＡＣＰ、またはアシル−ＡＣＰ誘導体から部分的に作製された産物を含む。脂肪酸誘導体の例としては、例えばアシル−ＣｏＡ、脂肪酸、脂肪アルデヒド、短鎖及び長鎖アルコール、脂肪アルコール、炭化水素、エステル（例、ワックス、脂肪酸エステルまたは脂肪エステル）、末端オレフィン、内部オレフィン、ケトン、ならびにω−ＯＨ脂肪酸及びそのω−ＯＨ脂肪酸誘導体（例、α，ω−二酸）、及び他の二官能性化合物を挙げることができる。
本明細書で使用されるとき、用語「脂肪酸生合成経路」は、脂肪酸及び脂肪酸誘導体を産生する生合成経路を意味する。脂肪酸生合成経路は、所望の特性を有する脂肪酸誘導体を産生するための、付加的な酵素を含み得る。
脂肪酸のＲ基は、直鎖または分岐鎖であり得る。分岐鎖は、１個を超える分岐点を有することができ、環状分岐も含む。いくつかの実施形態において、分岐脂肪酸は、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、Ｃ１５、Ｃ１６、Ｃ１７、Ｃ１８、Ｃ１９、Ｃ２０、Ｃ２１、Ｃ２２、Ｃ２３、Ｃ２４、Ｃ２５またはＣ２６分岐脂肪酸である。他の実施形態において、分岐脂肪酸は、Ｃ６、Ｃ８、Ｃ１０、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、Ｃ１５、Ｃ１６、Ｃ１７、Ｃ１８、またはＣ２０分岐脂肪酸である。ある特定の実施形態において、分岐脂肪酸のヒドロキシ（ＯＨ）基は、オメガ（ω）位置にある。ある特定の実施形態において、分岐脂肪酸はイソ−脂肪酸またはアンテイソ−脂肪酸である。例示的な実施形態において、分岐脂肪酸は、イソ−Ｃ７：０−、イソ−Ｃ８：０−、イソ−Ｃ９：０−、イソ−Ｃ１０：０−、イソ−Ｃ１１：０−、イソ−Ｃ１２：０−、イソ−Ｃ１３：０−、イソ−Ｃ１４：０−、イソ−Ｃ１５：０−、イソ−Ｃ１６：０−、イソ−Ｃ１７：０−、イソ−Ｃ１８：０−、イソ−Ｃ１９：０−、イソ−Ｃ２０：０、アンテイソ−Ｃ７：０−、アンテイソ−Ｃ９：０−、アンテイソ−Ｃ１１：０−、アンテイソ−Ｃ１３：０−、アンテイソ−Ｃ１５：０−、アンテイソ−Ｃ１７：０−、及びアンテイソ−Ｃ１９：０分岐脂肪酸から選択される。
脂肪酸のＲ基は、飽和または不飽和であり得る。不飽和の場合、分岐鎖は、Ｒ基は１個以上の不飽和点を有することができる。いくつかの実施形態において、不飽和脂肪酸は、モノ不飽和脂肪酸である。ある特定の実施形態において、不飽和脂肪酸は、Ｃ８：１−、Ｃ９：１−、Ｃ１０：１−、Ｃ１１：１−、Ｃ１２：１−、Ｃ１３：１−、Ｃ１４：１−、Ｃ１５：１−、Ｃ１６：１−、Ｃ１７：１−、Ｃ１８：１−、Ｃ１９：１−、Ｃ２０：１−、Ｃ２１：１−、Ｃ２２：１−、Ｃ２３：１−、Ｃ２４：１−、Ｃ２５：１−またはＣ２６：１不飽和脂肪酸である。ある特定の実施形態において、不飽和脂肪酸は、Ｃ８：１、Ｃ１０：１、Ｃ１２：１、Ｃ１４：１、Ｃ１６：１、Ｃ１８：１、またはＣ２０：１である。さらなる他の実施形態において、不飽和脂肪酸はω−７位において不飽和である。ある特定の実施形態において、不飽和脂肪酸はシス二重結合を有する。
本明細書で用いられるとき、「組換え宿主細胞」または「操作された宿主細胞」は、宿主細胞、例えば、ω−ヒドロキシル化脂肪酸及び二官能性脂肪酸誘導体を含むω−ヒドロキシル化脂肪酸誘導体を産生するように改変されている微生物である。いくつかの実施形態において、組換え宿主細胞は、１つ以上のポリヌクレオチドを含み、それぞれのポリヌクレオチドは、ω−ヒドロキシラーゼ生合成酵素活性を有するＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドまたはそのバリアントをコードしており、且つこの組換え宿主細胞は、ポリヌクレオチドを発現するのに有効な条件下で炭素源の存在下で培養された場合、ω−ヒドロキシル化脂肪酸及び／またはω−ヒドロキシル化脂肪酸誘導体またはその組成物を産生する。
本明細書で用いられるとき、用語「クローン」は、一般に、単一の共通原種に子孫を有し且つ単一の共通原種に遺伝的に実質的に同一である細胞または細胞グループ、例えば単一の細菌細胞から現れたクローン細菌コロニーの細菌を言う。
本明細書で用いられるとき、用語「培養物」は、一般に生菌を含む液体培地を言う。１つの実施形態において、培養物は、制御された条件であらかじめ定められた培地で再生産する細胞を含み、例えば、選択された炭素源及び／または窒素を含む液体培地で増殖した組換え宿主細胞の培養物である。
用語「培養すること（ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ）」または「培養（ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ）」は、液体または固体培地において適当な条件下で細胞の集団（例、微生物細胞）を増殖させることを言う。特定の実施形態において、培養することは、基質の最終産物への発酵生物変換を言う。培養培地は周知であり、培養培地の個々の成分は販売元から（例えば、ＤＩＦＣＯ培地及びＢＢＬ培地として）入手可能である。１つの非限定例において、水性栄養培地は、窒素、塩及び炭素の複合的な供給源を含む「富栄養培地」、例えば、このような培地当たり１０ｇ／Ｌのペプトン及び１０ｇ／Ｌの酵母エキスを含むＹＰ培地である。加えて、宿主細胞は、例えば米国特許第５，０００，０００号；第５，０２８，５３９号；第５，４２４，２０２号；第５，４８２，８４６号；第５，６０２，０３０号；及びＷＯ２０１０１２７３１８に記載された方法に従い、炭素を効率的に同化し、セルロース系材料を炭素源として用いるよう操作され得る。さらに、いくつかの実施形態において、宿主細胞は、スクロースを炭素源として用いることができるようにインベルターゼを発現するよう操作される。
本明細書で用いられるとき、用語「当該異種性ヌクレオチド配列を発現するために有効な条件下」は、宿主細胞が所望の脂肪酸誘導体（例、ω−ＯＨ脂肪酸及び／またはω−ＯＨ脂肪酸誘導体）を産生することを可能にする任意の条件を意味する。適した条件としては、例えば、発酵条件が挙げられる。
本明細書で用いられるとき、組換え宿主細胞における、タンパク質（例、酵素）の「改変された」または「レベルが変更された」活性は、親または天然の宿主細胞を基準に決定された活性の１つ以上の特性が異なることを言う。活性の典型的な相違は、改変された活性を有する組換え宿主細胞と対応する野生型宿主細胞との間で決定される（例、野生型宿主細胞に対する組換え宿主細胞の培養物の比較）。改変活性は、例えば、組換え宿主細胞により発現されたタンパク質の量の改変（例、タンパク質をコードするＤＮＡ配列のコピー数の増大または減少、タンパク質をコードするｍＲＮＡ転写産物の数の増大または減少、及び／またはｍＲＮＡからのタンパク質のそのタンパク質翻訳の量の増大または減少の結果として）；タンパク質の構造の変化（例、１次構造に対する変化、例えば、基質特異性の変化、観察される動的パラメータの変化をもたらすタンパク質のコード配列に対する変化）；及びタンパク質安定性の変化（例、タンパク質の分解の増大または減少）の結果であり得る。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、本明細書に記載されたポリペプチドのいずれかの突然変異体またはバリアントである。ある特定の例では、本明細書に記載されたポリペプチドのコード配列は、特定の宿主細胞での発現についてコドン最適化されている。例えば、大腸菌での発現のため、１つ以上のコドンが最適化され得る（Ｇｒｏｓｊｅａｎ ｅｔ ａｌ．（１９８２）Ｇｅｎｅ １８：１９９−２０９）。
本明細書で用いられる用語「調節配列」は、一般に、タンパク質の発現を最終的に制御するこのタンパク質をコードするＤＮＡ配列と機能的に連結したＤＮＡの塩基の配列を言う。調節配列の例としては、ＲＮＡプロモーター配列、転写因子結合配列、転写終結配列、転写のモジュレーター（エンハンサーエレメント等）、ＲＮＡ安定性に影響を及ぼすヌクレオチド配列、及び翻訳調節配列（例、リボソーム結合部位（例、原核生物におけるＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列、または真核生物におけるＫｏｚａｋ配列）、開始コドン、終止コドンなど）が挙げられ、これらに限定するものではない。
本明細書で用いられるとき、「前記ヌクレオチド配列の発現は野生型ヌクレオチド配列を基準に改変される」という表現は、内因性ヌクレオチド配列の発現及び／または活性のレベルにおける増大または減少、或いは異種性または非天然ポリペプチドコードヌクレオチド配列の発現及び／または活性のレベルにおける増大または減少を意味する。
本明細書で用いられるとき、「ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチド配列バリアントの活性は、ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチド配列（即ち、ポリペプチド鋳型）の活性を基準に改変される」という表現は、発現したポリペプチド配列鋳型と比較した、発現したポリペプチド配列バリアントの活性レベルの増大または減少を意味する。ポリペプチド鋳型は核酸鋳型（即ち、ＤＮＡ鋳型配列）によりコードされる。ポリペプチド配列鋳型の例は、ｃｙｐ１５３Ａがレダクターゼドメインと融合したハイブリッドｃｙｐ１５３Ａ−ＲｅｄＲｈｆ融合タンパク質配列である。ポリペプチド配列鋳型の別の例は、配列番号６である。ポリペプチド配列鋳型の別の例は、配列番号３８である。ポリペプチド配列はどれもバリアントを含む鋳型として機能し得る。
本明細書で用いられるとき、ポリヌクレオチドに関する用語「発現する」は、ポリヌクレオチドを機能化することである。ポリペプチド（またはタンパク質）をコードするポリヌクレオチドは、発現されると、転写され、翻訳されてそのポリペプチド（またはタンパク質）を産生する。本明細書で用いられるとき、用語「過剰発現する」は、細胞内のポリヌクレオチドまたはポリペプチドを、同条件で対応する野生型細胞で通常発現されるより高濃度で、発現する（または発現させる）ことを意味する。別の実施形態では、用語「過剰発現する」は、細胞内のポリヌクレオチドまたはポリペプチドを、同条件で対応する鋳型ポリヌクレオチドまたは鋳型ポリペプチド配列を発現する対応する細胞において通常発現されるよりも、高濃度で発現する（または発現させる）ことを意味する。鋳型ポリペプチド配列の例はＣＹＰ１５３Ａ−ＲｅｄＲｈＦ−ハイブリッド融合ポリペプチドである。
用語「変更されたレベルの発現」及び「改変されたレベルの発現」は区別なく使用され、ポリヌクレオチド、ポリペプチドまたは脂肪酸誘導体が、操作された宿主細胞においては、同条件で対応する野生型細胞における濃度と比較して、異なる濃度で存在することを意味する。
本明細書で用いられるとき、用語「力価」は宿主細胞培養物の単位体積当たりで産生されるω−ＯＨ脂肪酸及び／またはω−ＯＨ脂肪酸誘導体の量を言う。本明細書で記載される組成物及び方法のどの態様においても、ω−ＯＨ脂肪酸及び／またはω−ＯＨ脂肪酸誘導体は、約２５ｍｇ／Ｌ、約５０ｍｇ／Ｌ、約７５ｍｇ／Ｌ、約１００ｍg/Ｌ、約１２５ｍｇ／Ｌ、約１５０ｍｇ／Ｌ、約１７５ｍｇ／Ｌ、約２００ｍｇ／Ｌ、約２２５ｍｇ／Ｌ、約２５０ｍｇ／Ｌ、約２７５ｍｇ／Ｌ、約３００ｍｇ／Ｌ、約３２５ｍｇ／Ｌ、約３５０ｍｇ／Ｌ、約３７５ｍｇ／Ｌ、約４００ｍｇ／Ｌ、約４２５ｍg/Ｌ、約４５０ｍｇ／Ｌ、約４７５ｍｇ／Ｌ、約５００ｍｇ／Ｌ、約５２５ｍｇ／Ｌ、約５５０ｍｇ／Ｌ、約５７５ｍｇ／Ｌ、約６００ｍｇ／Ｌ、約６２５ｍｇ／Ｌ、約６５０ｍｇ／Ｌ、約６７５ｍｇ／Ｌ、約７００ｍｇ／Ｌ、約７２５ｍｇ／Ｌ、約７５０ｍｇ／Ｌ、約７７５ｍｇ／Ｌ、約８００ｍｇ／Ｌ、約８２５ｍｇ／Ｌ、約８５０ｍｇ／Ｌ、約８７５ｍｇ／Ｌ、約９００ｍｇ／Ｌ、約９２５ｍｇ／Ｌ、約９５０ｍｇ／Ｌ、約９７５ｍｇ／Ｌ、約１０００ｍｇ／Ｌ、約１０５０ｍｇ／Ｌ、約１０７５ｍｇ／Ｌ、約１１００ｍｇ／Ｌ、約１１２５ｍｇ／Ｌ、約１１５０ｍｇ／Ｌ、約１１７５ｍｇ／Ｌ、約１２００ｍｇ/Ｌ、約１２２５ｍｇ／Ｌ、約１２５０ｍｇ／Ｌ、約１２７５ｍｇ／Ｌ、約１３００ｍｇ／Ｌ、約１３２５ｍｇ／Ｌ、約１３５０ｍｇ／Ｌ、約１３７５ｍｇ／Ｌ、約１４００ｍｇ／Ｌ、約１４２５ｍｇ／Ｌ、約１４５０ｍｇ／Ｌ、約１４７５ｍｇ／Ｌ、約１５００ｍｇ/Ｌ、約１５２５ｍｇ／Ｌ、約１５５０ｍｇ／Ｌ、約１５７５ｍｇ/Ｌ、約１６００ｍｇ／Ｌ、約１６２５ｍｇ／Ｌ、約１６５０ｍｇ/Ｌ、約１６７５ｍｇ／Ｌ、約１７００ｍｇ／Ｌ、約１７２５ｍｇ/Ｌ、約１７５０ｍｇ／Ｌ、約１７７５ｍｇ／Ｌ、約１８００ｍｇ/Ｌ、約１８２５ｍｇ／Ｌ、約１８５０ｍｇ／Ｌ、約１８７５ｍｇ/Ｌ、約１９００ｍｇ／Ｌ、約１９２５ｍｇ／Ｌ、約１９５０ｍｇ/Ｌ、約１９７５ｍｇ／Ｌ、約２０００ｍｇ／Ｌ（２ｇ／Ｌ）、３ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌ、ｌ０ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌ、３０ｇ／Ｌ、４０ｇ／Ｌ、５０ｇ／Ｌ、６０ｇ／Ｌ、７０ｇ／Ｌ、８０ｇ／Ｌ、９０ｇ／Ｌ、１００ｇ／Ｌ、またはこれらの値のいずれか２つによって囲まれる範囲の力価で産生される。他の実施形態では、ω−ＯＨ脂肪酸及び／またはω−ＯＨ脂肪酸誘導体は、１００ｇ／Ｌを超える、２００ｇ／Ｌを超える、３００ｇ／Ｌを超える、或いは、それより高い、例えば５００ｇ／Ｌ、７００ｇ／Ｌ、１０００ｇ／Ｌ、１２００ｇ／Ｌ、１５００ｇ／Ｌ、または２０００ｇ／Ｌの力価で産生される。１つの実施形態において、本開示の方法に従う組換え宿主細胞により産生されたω−ＯＨ脂肪酸及び／またはω−ＯＨ脂肪酸誘導体の力価は、５ｇ／Ｌ〜２００ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ〜１５０ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌ〜１２０ｇ／Ｌ、２５ｇ／Ｌ〜１１０ｇ／Ｌ、及び３０ｇ／Ｌ〜１００ｇ／Ｌである。
本明細書で用いられるとき、用語「宿主細胞により産生されるω−ＯＨ脂肪酸及び／またはω−ＯＨ脂肪酸誘導体の収率」は、宿主細胞において入力炭素源が産物（即ち、ω−ＯＨ脂肪酸及び／またはω−ＯＨ脂肪酸誘導体）に変換される効率を言う。本開示の方法に従うω−ＯＨ脂肪酸及び／またはω−ＯＨ脂肪酸誘導体を産生するように操作された宿主細胞は、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、少なくとも１０％、少なくとも１１％、少なくとも１２％、少なくとも１３％、少なくとも１４％、少なくとも１５％、少なくとも１６％、少なくとも１７％、少なくとも１８％、少なくとも１９％、少なくとも２０％、少なくとも２１％、少なくとも２２％、少なくとも２３％、少なくとも２４％、少なくとも２５％、少なくとも２６％、少なくとも２７％、少なくとも２８％、少なくとも２９％、または少なくとも３０％、或いはこれらの値のいずれか２つに囲まれた範囲の収率を有する。他の実施形態において、ω−ＯＨ脂肪酸及び／またはω−ＯＨ脂肪酸誘導体は、３０％を超える、４０％を超える、５０％を超える、６０％を超える、７０％を超える、８０％を超える、９０％を超える、またはこれを超える収率で産生される。或いは、またはさらに、収率は、約３０％以下、約２７％以下、約２５％以下、または約２２％以下である。したがって、収率は、上記終点のいずれか２つに囲まれることもできる。例えば、本開示の方法に従う組換え宿主細胞により産生されるω−ＯＨ脂肪酸及び／またはω−ＯＨ脂肪酸誘導体の収率は、５％〜１５％、１０％〜２５％、１０％〜２２％、１５％〜２７％、１８％〜２２％、２０％〜２８％、２０％〜３０％、２５％〜４０％、或いはより大きくあり得る。本開示の方法に従う組換え宿主細胞により産生されるω−ＯＨ脂肪酸及び／またはω−ＯＨ脂肪酸誘導体の好ましい収率の例は、１０％〜３０％である。本開示の方法に従う組換え宿主細胞により産生されるω−ＯＨ脂肪酸及び／またはω−ＯＨ脂肪酸誘導体の好ましい収率の別の例は、１０％〜４０％である。本開示の方法に従う組換え宿主細胞により産生されるω−ＯＨ脂肪酸及び／またはω−ＯＨ脂肪酸誘導体の好ましい収率の別の例は、１０％〜５０％である。
本明細書で用いられるとき、用語「生産性」は、単位時間当たり、宿主細胞培養物の単位体積当たりに産生されるω−ＯＨ脂肪酸及び／またはω−ＯＨ脂肪酸誘導体の量を言う。本明細書に記載された組成物及び方法のどの態様においても、組換え宿主細胞で産生されるω−ＯＨ脂肪酸及び／またはω−ＯＨ脂肪酸誘導体の生産性は、少なくとも１００ｍｇ／Ｌ／時間、少なくとも２００ｍｇ／Ｌ／時間０、少なくとも３００ｍｇ／Ｌ／時間、少なくとも４００ｍｇ／Ｌ／時間、少なくとも５００ｍｇ／Ｌ／時間、少なくとも６００ｍｇ／Ｌ／時間、少なくとも７００ｍｇ／Ｌ／時間、少なくとも８００ｍｇ／Ｌ／時間、少なくとも９００mｇ／Ｌ／時間、少なくとも１０００ｍｇ／Ｌ／時間、少なくとも１１００ｍｇ／Ｌ／時間、少なくとも１２００ｍｇ／Ｌ／時間、少なくとも１３００ｍｇ／Ｌ／時間、少なくとも１４００ｍｇ／Ｌ／時間、少なくとも１５００ｍｇ／Ｌ／時間、少なくとも１６００ｍｇ／Ｌ／時間、少なくとも１７００ｍｇ／Ｌ／時間、少なくとも１８００ｍｇ／Ｌ／時間、少なくとも１９００ｍｇ／Ｌ／時間、少なくとも２０００ｍｇ／Ｌ／時間、少なくとも２１００ｍｇ／Ｌ／時間、少なくとも２２００ｍｇ／Ｌ／時間、少なくとも２３００ｍｇ／Ｌ／時間、少なくとも２４００ｍｇ／Ｌ／時間、または少なくとも２５００ｍｇ／Ｌ／時間である。加えて、生産性は、２５００ｍｇ／Ｌ／時間以下、２０００ｍｇ／Ｌ／ＯＤ６００以下、１５００ｍｇ／Ｌ／ＯＤ６００以下、１２０ｍｇ／Ｌ／時間以下、１０００ｍｇ／Ｌ／時間以下、８００ｍｇ／Ｌ／時間以下、または６００ｍｇ／Ｌ／時間以下であり得る。したがって、生産性は、上記終点のいずれか２つに囲まれることもできる。例えば、生産性は、３〜３０ｍｇ／Ｌ／時間、６〜２０ｍｇ／Ｌ／時間、または１５〜３０ｍｇ／Ｌ／時間であり得る。本開示の方法に従い組換え宿主細胞で産生されるω−ＯＨ脂肪酸及び／またはω−ＯＨ脂肪酸誘導体の好ましい生産性は５００ｍｇ／Ｌ／時間〜２５００ｍｇ／Ｌ／時間、或いは７００ｍｇ／Ｌ／時間〜２０００ｍｇ／Ｌ／時間から選択される。
用語「総脂肪種（ＦＡＳ）」及び「総脂肪酸産物」は、国際特許出願公開第ＷＯ２００８／１１９０８２号に記載されているＧＣ−ＦＩＤにより評価されるサンプルに存在するω−ＯＨ脂肪酸及び脂肪酸の総量に関して本明細書中では区別なく使用され得る。
本明細書で用いられるとき、用語「グルコース利用速度」は、グラム/リットル/時間（ｇ／Ｌ／ｈｒ）として報告される、単位時間当たりの培養物により使用されるグルコース量を意味する。
独立して使用されるか、または供給源と関連して使用される、「再生可能原料からの炭素源」という用語は、油脂化学物質（即ち、プラント及び動物からの精製油、例えば、脂肪酸、脂肪酸エステル、ＴＡＧ、ヒドロキシ脂肪酸など）及び石油化学物質（即ち、石油から誘導される化学製品、例えば、アルカン、アルケンなど）を除く炭素の由来となる任意の生物材料（再生原料及び／またはバイオマス及び／または廃棄物を含む）を包含する。したがって、本明細書で使用されるとき、用語「再生可能原料からの炭素源」では、油脂化学物質及び石油化学物質由来の炭素は除外される。いくつかの実施形態において、炭素源は、糖、即ち炭水化物（例、モノサッカライド、ジサッカライド、またはポリサッカライド）を含んでいる。いくつかの実施形態において、炭素源は、グルコース及び／またはスクロースである。他の実施形態において、炭素源は、再生可能原料、例えばトウモロコシ、サトウキビまたはリグノセルロース系バイオマスからの炭水化物；または廃棄物、例えばグリセロール、煙道ガス、合成ガス；または有機材料、例えばバイオマスまたは天然ガスの改良品、に由来し；或いは光合成で固定される二酸化炭素である。他の実施形態において、バイオマスは炭素源に加工され、生物変換に好適である。さらに他の実施形態において、バイオマスは炭素源へのさらなる加工の必要はなく、炭素源として直接使用することができる。このようなバイオマスの例示的な源は、植物または草木、例えばスイッチグラスである。別の例示的な炭素源は、代謝廃棄物、例えば動物性物質（例、牛糞肥料）を含む。さらなる例示的な炭素源は、藻及び他の海草を含む。別の炭素源（バイオマスを含む）は、工業、農業、林業及び家庭からの廃棄物、例えば発酵廃液、発酵バイオマス、グリセロール／グリセリン、エンシレージ、わら、材木、下水、生ごみ、一般廃棄物、セルロース系都市廃棄物及び食べ残しを含むが、これらに限定されない。
本明細書で用いられるとき、ω−ＯＨ脂肪酸及びその誘導体等の産物についての、「単離された」との用語は、細胞成分、細胞培地、または化学もしくは合成前駆体から分離される産物を言う。本明細書に記載された方法により製造される脂肪酸及びその誘導体（例、ω−ＯＨ脂肪酸及び／またはω−ＯＨ脂肪酸誘導体）は、発酵ブロス、ならびに細胞質に比較的混合しないで存在し得る。このため、脂肪酸及びその誘導体は、細胞内または細胞外で有機相に集まることができる。
本明細書で用いられるとき、用語「精製する」、「精製された」、または「精製」は、例えば単離または分離による、分子のその環境からの除去または単離を意味する。「実質的に精製された」分子は、それらに付随する他の構成成分を少なくとも約６０％含まない（例えば、少なくとも約７０％含まない、少なくとも約７５％含まない、少なくとも約８５％含まない、少なくとも約９０％含まない、少なくとも約９５％含まない、少なくとも約９７％含まない、少なくとも約９９％含まない）。本明細書で使用されるとき、これらの用語はまた、試料からの混入物の除去も指す。例えば、混入物の除去により、試料中のω−ＯＨ脂肪酸及び／またはω−ＯＨ脂肪酸誘導体などのような脂肪酸誘導体のパーセンテージを増大させることができる。例えば、脂肪酸誘導体を組換え宿主細胞において産生した場合、脂肪酸誘導体は、宿主細胞タンパク質または他の宿主細胞材料の除去によって精製することができる。精製後に、試料中の脂肪酸誘導体のパーセンテージは増大する。「精製する」、「精製された」、及び「精製」という用語は、完全な純粋を必要としない相対的な用語である。したがって、例えば、脂肪酸誘導体が組換え宿主細胞において産生される場合、精製された脂肪酸誘導体は、他の細胞構成成分（例えば、核酸、ポリペプチド、脂質、炭水化物、または他の炭化水素）から実質的に分離された脂肪酸誘導体である。
細胞におけるＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアント発現の結果としての、ω−ヒドロキシル化脂肪酸及び脂肪酸誘導体の産生
触媒ドメインの飽和ライブラリー（実施例７）で特定される有益な突然変異を、ｃｙｐ１５３Ａ（Ｇ３０７Ａ）−Ｒｅｄ４５０ＲｈＦ（Ａ７９６Ｖ）融合タンパク質をさらに改良するための組合せライブラリーにおける基礎とした。ヒットの選択基準は、（１）ω−ヒドロキシ脂肪酸（ω−ＯＨ ＦＦＡ力価）の量の増大；及び／または（２）脂肪酸からω−ヒドロキシ脂肪酸への変換の増大とした。改良されたバリアント、特にω−ヒドロキシ脂肪酸形成を著しく改良したバリアントを表１２に示す。
（表１２）ｃｙｐ１５３Ａ（Ｇ３０７Ａ）−Ｒｅｄ４５０ＲｈＦ（Ａ７９６Ｖ）（配列番号３８）の触媒ドメインにおける組合せライブラリーからの改良されたバリアントの概要
Figure 2018537111
触媒ドメインのコンビナトリアルライブラリーで特定される有益な突然変異（上記の実施例８参照）を、ｃｙｐ１５３Ａ（Ｇ３０７Ａ）−Ｒｅｄ４５０ＲｈＦ（Ａ７９６Ｖ）融合タンパク質（高い発現レベルでのｃｙｐ１５３Ａ（Ｇ３０７Ａ）−Ｒｅｄ４５０ＲｈＦ（Ａ７９６Ｖ）融合タンパク質の触媒ドメインにおけるコンビナトリアルライブラリー）をさらに改良するための組合せライブラリーにおける次のラウンドの基礎とした。ヒットの選択基準は、（１）ω−ヒドロキシ脂肪酸（ω−ＯＨ ＦＦＡ力価）の量の増大；及び／または（２）脂肪酸からω−ヒドロキシ脂肪酸への変換の増大とした。改良されたバリアント、特にω−ヒドロキシ脂肪酸形成を著しく改良したバリアントを表１２に示す。
（表１３）ｃｙｐ１５３Ａ（Ｇ３０７Ａ）−Ｒｅｄ４５０ＲｈＦ（Ａ７９６Ｖ）の触媒ドメインにおける組合せライブラリーからの高い発現レベルでの改良されたバリアントの概要
Figure 2018537111
レダクターゼドメインの飽和ライブラリー（実施例７）で特定される有益な突然変異を、ｃｙｐ１５３Ａ（Ｇ３０７Ａ）−Ｒｅｄ４５０ＲｈＦ（Ａ７９６Ｖ）融合タンパク質をさらに改良するための組合せライブラリーにおける基礎とした。選択基準は、（１）ω−ヒドロキシ脂肪酸（ω−ＯＨ ＦＦＡ力価）の量の増大；及び／または（２）脂肪酸からω−ヒドロキシ脂肪酸への変換の増大とした。改良されたバリアントを表１４に示す。
（表１４）ｃｙｐ１５３Ａ（Ｇ３０７Ａ）−Ｒｅｄ４５０ＲｈＦ（Ａ７９６Ｖ）のレダクターゼドメインにおけるコンビナトリアルライブラリーからの改良されたバリアント
Figure 2018537111
触媒ドメイン及びレダクターゼドメインのコンビナトリアルライブラリーで特定される有益な突然変異（上記の実施例８〜１０参照）を、ｃｙｐ１５３Ａ（Ｑ１２Ｗ、Ｒ２７Ｌ、Ｋ１１９Ｒ、Ｓ１４０Ｎ、Ｓ１５７Ｒ、Ｖ１５９Ｍ、Ｓ２３３Ｌ、Ａ２４４Ｒ、Ｇ３０７Ａ）−Ｒｅｄ４５０ＲｈＦ（Ａ７９６Ｖ）融合タンパク質（ｃｙｐ１５３Ａ（Ｑ１２Ｗ、Ｒ２７Ｌ、Ｋ１１９Ｒ、Ｓ１４０Ｎ、Ｓ１５７Ｒ、Ｖ１５９Ｍ、Ｓ２３３Ｌ、Ａ２４４Ｒ、Ｇ３０７Ａ）−Ｒｅｄ４５０ＲｈＦ（Ａ７９６Ｖ）融合タンパク質（配列番号９８）の触媒ドメイン及びレダクターゼドメインのコンビナトリアルライブラリー）をさらに改良するための組合せライブラリーにおける基礎とした。選択基準は、（１）ω−ヒドロキシ脂肪酸（ω−ＯＨ ＦＦＡ力価）の量の増大；及び／または（２）脂肪酸からω−ヒドロキシ脂肪酸への変換の増大とした。改良されたバリアントを表１５に示す。
（表１５）ｃｙｐ１５３Ａ（Ｑ１２Ｗ、Ｒ２７Ｌ、Ｋ１１９Ｒ、Ｓ１４０Ｎ、Ｓ１５７Ｒ、Ｖ１５９Ｍ、Ｓ２３３Ｌ、Ａ２４４Ｒ、Ｇ３０７Ａ）−Ｒｅｄ４５０ＲｈＦ（Ａ７９６Ｖ）融合タンパク質（配列番号９８）の触媒ドメイン及びレダクターゼドメインのコンビナトリアルライブラリーからの改良されたバリアント
Figure 2018537111
表１２〜１５を考慮すると、様々な実施形態において、本開示のＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドは、脂肪酸（誘導体）からω−ヒドロキシル化脂肪酸またはω−ＯＨ脂肪酸誘導体への変換を触媒するときに、例えば、配列番号３８または配列番号９８のＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドと比較して、増大した量のω−ヒドロキシ脂肪酸（ω−ＯＨ ＦＦＡ力価）をもたらす。したがって、様々な実施形態において、本開示のＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは、例えば、配列番号３８または配列番号９８のＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドと比較して、脂肪酸（誘導体）からω−ヒドロキシ脂肪酸またはω−ＯＨ脂肪酸誘導体への変換の増大をもたらす。
本開示は、宿主細胞でω−ＯＨ脂肪酸及びω−ＯＨ脂肪酸誘導体の産生を提供する。ω−ＯＨ脂肪酸の産生は、ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントの発現の結果として向上させることができる。ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは、鋳型ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドと比較して、例えば、配列番号６または配列番号３８のＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドと比較して、より高い力価でω−ＯＨ脂肪酸誘導体を産生する。様々な実施形態において、本開示のＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは、例えば、配列番号４２及び／または配列番号４６のＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドと比較したときに、より高い力価でω−ＯＨ脂肪酸誘導体を産生する。様々な実施形態において、本開示のＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは、例えば、配列番号９８のＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドと比較したときに、より高い力価でω−ＯＨ脂肪酸誘導体を産生する。ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは、ω−ＯＨ脂肪酸誘導体の産生のための生合成経路に関与し、単独でまたは他の酵素と組み合わせて使用することができる。例えば、ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは、チオエステラーゼ（即ち、天然で、または異種的に／外因的に発現した）酵素がアシル−ＡＣＰまたはアシル−ＣｏＡを脂肪酸に変換する操作生合成経路で使用することができる。ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは、それから脂肪酸をω−ＯＨ脂肪酸に変換することができる（図１参照）。経路での追加の酵素は、ω−ＯＨ脂肪酸を他の二官能性脂肪酸誘導体（例、α，ω−二酸）に変換することができる。
さらに具体的には、ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドは、配列番号６に対して少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリペプチド配列であり、そしてω−ＯＨ脂肪酸及びω−ＯＨ脂肪酸誘導体の産生のための改良された酵素活性を有するバリアントを作り出すために、突然変異を導入するための鋳型配列として機能する。配列番号６のＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドは、触媒ドメインにおいて位置３０７に突然変異を有し、グリシンがアラニンで置換されている、Ｐ４５０ Ｃｙｐ１５３Ａ（Ｇ３０７Ａ）−ＲｅｄＲｈＦ融合タンパク質である（図３参照）。このタンパク質は自給型であり、脂肪酸からω−ＯＨ脂肪酸への反応を触媒するω−ヒドロキシラーゼ酵素活性を有する。
本開示の様々な実施形態において、本開示により提供されるＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは自給型であり、脂肪酸（誘導体）からω−ＯＨ脂肪酸（誘導体）への反応を触媒するω−ヒドロキシラーゼ酵素活性を有する。本開示の様々な実施形態において、本開示により提供されるＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは、脂肪酸（誘導体）からω−ＯＨ脂肪酸（誘導体）への反応を触媒するω−ヒドロキシラーゼ酵素活性を有し、この活性は、例えば、配列番号６または配列番号３８のＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドのω−ヒドロキシラーゼ酵素活性よりも高い。本開示の様々な実施形態において、本開示により提供されるＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは、脂肪酸（誘導体）からω−ＯＨ脂肪酸（誘導体）への反応を触媒するω−ヒドロキシラーゼ酵素活性を有し、この活性は、例えば、配列番号４２または配列番号４６のＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドのω−ヒドロキシラーゼ酵素活性よりも高い。本開示の様々な実施形態において、本開示により提供されるＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは、脂肪酸（誘導体）からω−ＯＨ脂肪酸（誘導体）への反応を触媒するω−ヒドロキシラーゼ酵素活性を有し、この活性は、例えば、配列番号９８のＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドのω−ヒドロキシラーゼ酵素活性よりも高い。
１つの実施形態において、ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは、そのレダクターゼドメインに少なくとも１つの追加の突然変異を有する改変ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドのことを指し、この突然変異は、アミノ酸位置７９６、１４１、２３１、２７、８２、１７８、３０９、４０７、４１５、５１６及び／もしくは６６６またはこれらの組合せにおける突然変異を含むが、これらに限定されない。組換え宿主細胞におけるＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントの発現は、対応する宿主細胞におけるＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドの発現と比較して、改良されたω−ＯＨ脂肪酸及び／またはω−ＯＨ脂肪酸誘導体またはその組成物の力価、収率及び／または生産性をもたらす。
ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントの一例は、レダクターゼドメインにおいて位置７９６に１つの追加の突然変異を有し、アラニンがバリンで置き換えられている、配列番号３８である（図４参照）。このＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは、配列番号３８に対して少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリペプチド配列を有し、そして追加の突然変異を作り出して追加のバリアントをもたらすための鋳型配列としての役目をさらに果たしている。配列番号３８のＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは、Ｐ４５０ Ｃｙｐ１５３Ａ（Ｇ３０７Ａ）−ＲｅｄＲｈＦ（Ａ７９６Ｖ）融合タンパク質であり（図５参照）、触媒ドメイン（Ｇ３０７Ａ）において１つの突然変異を有し、レダクターゼドメイン（Ａ７９６Ｖ）において１つの突然変異を有し、自給型であり、そして脂肪酸からω−ＯＨ脂肪酸への反応を触媒するω−ヒドロキシラーゼ酵素活性を有する。１つの実施形態において、ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは、その触媒ドメイン及び／またはレダクターゼドメインにおいてアミノ酸配列に少なくとも１つの突然変異を有する改変ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドであり、この突然変異は、アミノ酸位置９、１０、１１、１２、１３、１４、２７、２８、６１、７７、１１９、１４０、１４１、１４９、１５７、１５９、２３１、２３３、２４４、２５４、２７１、３０９、３２７、４０７、４１３、４５１、４８０、５２７、５４４、５５７、５６７、５９１、６４８、６４９、７０３、７０６、７１９、７４５、７４７、７４９、７５７、７７０、７７１、及び７８４またはこれらの組合せにおける突然変異を含むが、これらに限定されない（例えば、このようなＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントの核酸及びタンパク質の配列を意味する配列番号４７〜１６４を参照）。１つの実施形態において、組換え宿主細胞におけるＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントの発現は、対応する宿主細胞における配列番号３８のＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアント（即ち、鋳型バリアント）の発現と比較して、改良されたω−ＯＨ脂肪酸及び／またはω−ＯＨ脂肪酸誘導体の力価、収率及び／または生産性をもたらす。別の実施形態において、組換え宿主細胞におけるＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントの発現は、配列番号６のＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチド（即ち、鋳型ポリペプチド）の発現と比較して、改良されたω−ＯＨ脂肪酸及び／またはω−ＯＨ脂肪酸誘導体の力価、収率及び／または生産性をもたらす。１つの実施形態において、組換え宿主細胞におけるＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントの発現は、対応する宿主細胞における、例えば配列番号４２のＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドの発現と比較して、改良されたω−ＯＨ脂肪酸及び／またはω−ＯＨ脂肪酸誘導体の力価、収率及び／または生産性をもたらす。１つの実施形態において、組換え宿主細胞におけるＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントの発現は、対応する宿主細胞における、例えば配列番号４６のＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントの発現と比較して、改良されたω−ＯＨ脂肪酸及び／またはω−ＯＨ脂肪酸誘導体の力価、収率及び／または生産性をもたらす。１つの実施形態において、組換え宿主細胞におけるＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントの発現は、対応する宿主細胞における、例えば配列番号９８のＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントの発現と比較して、改良されたω−ＯＨ脂肪酸及び／またはω−ＯＨ脂肪酸誘導体の力価、収率及び／または生産性をもたらす。
細胞がＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントを用いて形質転換された場合、それはＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントを発現する細胞である（例、組換え細胞）。１つの実施形態において、ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントを発現する細胞により産生されるω−ＯＨ脂肪酸の力価及び／または収率は、ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドを発現する対応する細胞のものの少なくとも２倍である。別の実施形態において、本開示のＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントを発現する細胞により産生されるω−ＯＨ脂肪酸の力価及び／または収率は、ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチド鋳型バリアント、特に配列番号６または配列番号３８のＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドを発現する対応する細胞のものの少なくとも２倍である。別の実施形態において、本開示のＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントを発現する細胞により産生されるω−ＯＨ脂肪酸の力価及び／または収率は、例えば配列番号４２または配列番号４６のＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドを発現する対応する細胞のものの少なくとも２倍である。別の実施形態において、本開示のＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントを発現する細胞により産生されるω−ＯＨ脂肪酸の力価及び／または収率は、例えば配列番号９８のＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドを発現する対応する細胞のものの少なくとも２倍である。大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のような宿主において、ω−ＯＨ脂肪酸は、天然または異種発現した酵素により二官能性脂肪酸誘導体に変換され得る。別の実施形態において、ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントを発現する細胞によって産生されるω−ＯＨ脂肪酸またはその誘導体の力価及び／または収率は、ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドを発現する対応する細胞のものの、少なくとも約１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、または少なくとも約１０倍である。別の実施形態において、本開示のＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントを発現する細胞によって産生されるω−ＯＨ脂肪酸またはその誘導体の力価及び／または収率は、ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチド鋳型バリアント、特に配列番号６または配列番号３８のＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドを発現する対応する細胞のものの、少なくとも約１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、または少なくとも約１０倍である。別の実施形態において、本開示のＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントを発現する細胞により産生されるω−ＯＨ脂肪酸の力価及び／または収率は、例えば配列番号４２または配列番号４６のＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドを発現する対応する細胞のものの少なくとも２倍である。別の実施形態において、本開示のＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントを発現する細胞により産生されるω−ＯＨ脂肪酸の力価及び／または収率は、例えば配列番号９８のＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドを発現する対応する細胞のものの少なくとも２倍である。１つの実施形態において、本開示のＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントを発現する細胞によって産生されるω−ＯＨ脂肪酸またはその誘導体の力価及び／または収率は、鋳型または参照ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチド、例えば、配列番号６または配列番号３８のＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドを発現する対応する細胞のものより、少なくとも約１パーセント、少なくとも約２パーセント、少なくとも約３パーセント、少なくとも約４パーセント、少なくとも約５パーセント、少なくとも約６パーセント、少なくとも約７パーセント、少なくとも約８パーセント、少なくとも約９パーセント、または少なくとも約１０パーセント高い。別の実施形態において、本開示のＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントを発現する細胞によって産生されるω−ＯＨ脂肪酸またはその誘導体の力価及び／または収率は、例えば配列番号４２または配列番号４６のＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチド鋳型バリアントを発現する対応する細胞のものより、少なくとも約１パーセント、少なくとも約２パーセント、少なくとも約３パーセント、少なくとも約４パーセント、少なくとも約５パーセント、少なくとも約６パーセント、少なくとも約７パーセント、少なくとも約８パーセント、少なくとも約９パーセント、または少なくとも約１０パーセント高い。別の実施形態において、本開示のＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントを発現する細胞によって産生されるω−ＯＨ脂肪酸またはその誘導体の力価及び／または収率は、例えば配列番号９８のＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチド鋳型バリアントを発現する対応する細胞のものより、少なくとも約１パーセント、少なくとも約２パーセント、少なくとも約３パーセント、少なくとも約４パーセント、少なくとも約５パーセント、少なくとも約６パーセント、少なくとも約７パーセント、少なくとも約８パーセント、少なくとも約９パーセント、または少なくとも約１０パーセント高い。
別の実施形態において、ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントの発現により組換え細胞で産生されるω−ＯＨ脂肪酸またはその誘導体の力価及び／または収率は、例えば配列番号６または配列番号３８のＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドを発現する対応する細胞のものより、少なくとも約２０パーセント〜少なくとも約８０パーセント高い。別の実施形態において、ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントの発現により組換え細胞で産生されるω−ＯＨ脂肪酸またはその誘導体の力価及び／または収率は、例えば配列番号４２または配列番号４６のＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドを発現する対応する細胞のものより、少なくとも約２０パーセント〜少なくとも約８０パーセント高い。別の実施形態において、ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントの発現により組換え細胞で産生されるω−ＯＨ脂肪酸またはその誘導体の力価及び／または収率は、例えば配列番号９８のＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドを発現する対応する細胞のものより、少なくとも約２０パーセント〜少なくとも約８０パーセント高い。
いくつかの実施形態において、細胞により産出されるω−ＯＨ脂肪酸の力価及び／または収率は、ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドを発現する対応する細胞のものより、少なくとも約２０パーセント、少なくとも約２５パーセント、少なくとも約３０パーセント、少なくとも約３５パーセント、少なくとも約４０パーセント、少なくとも約４５パーセント、少なくとも約５０パーセント、少なくとも約５５パーセント、少なくとも約６０パーセント、少なくとも約６５パーセント、少なくとも約７０パーセント、少なくとも約７５パーセント、少なくとも約８０パーセント、少なくとも約８５パーセント、少なくとも約９０パーセント、少なくとも約９５パーセント、少なくとも約９７パーセント、少なくとも約９８パーセント、または少なくとも約１００パーセント高い。他の実施形態において、本開示の細胞または組換え微生物により産出されるω−ＯＨ脂肪酸の力価及び／または収率は、ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチド鋳型バリアント、特に、例えば配列番号６または配列番号３８のＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドを発現する対応する細胞のものより、少なくとも約２０パーセント、少なくとも約２５パーセント、少なくとも約３０パーセント、少なくとも約３５パーセント、少なくとも約４０パーセント、少なくとも約４５パーセント、少なくとも約５０パーセント、少なくとも約５５パーセント、少なくとも約６０パーセント、少なくとも約６５パーセント、少なくとも約７０パーセント、少なくとも約７５パーセント、少なくとも約８０パーセント、少なくとも約８５パーセント、少なくとも約９０パーセント、少なくとも約９５パーセント、少なくとも約９７パーセント、少なくとも約９８パーセント、または少なくとも約１００パーセント高い。他の実施形態において、本開示の細胞または組換え微生物により産出されるω−ＯＨ脂肪酸の力価及び／または収率は、例えば配列番号４２または配列番号４６のＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドを発現する対応する細胞のものより、少なくとも約２０パーセント、少なくとも約２５パーセント、少なくとも約３０パーセント、少なくとも約３５パーセント、少なくとも約４０パーセント、少なくとも約４５パーセント、少なくとも約５０パーセント、少なくとも約５５パーセント、少なくとも約６０パーセント、少なくとも約６５パーセント、少なくとも約７０パーセント、少なくとも約７５パーセント、少なくとも約８０パーセント、少なくとも約８５パーセント、少なくとも約９０パーセント、少なくとも約９５パーセント、少なくとも約９７パーセント、少なくとも約９８パーセント、または少なくとも約１００パーセント高い。他の実施形態において、本開示の細胞または組換え微生物により産出されるω−ＯＨ脂肪酸の力価及び／または収率は、例えば配列番号９８のＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドを発現する対応する細胞のものより、少なくとも約２０パーセント、少なくとも約２５パーセント、少なくとも約３０パーセント、少なくとも約３５パーセント、少なくとも約４０パーセント、少なくとも約４５パーセント、少なくとも約５０パーセント、少なくとも約５５パーセント、少なくとも約６０パーセント、少なくとも約６５パーセント、少なくとも約７０パーセント、少なくとも約７５パーセント、少なくとも約８０パーセント、少なくとも約８５パーセント、少なくとも約９０パーセント、少なくとも約９５パーセント、少なくとも約９７パーセント、少なくとも約９８パーセント、または少なくとも約１００パーセント高い。
したがって、本開示は、ω−ＯＨ脂肪酸またはその誘導体を産生する本開示のＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントを発現するように操作された組換え宿主細胞を提供する。このようなバリアントの例を、配列の表Ａ、Ｂ及びＣ（下記）に示す。１つの実施形態において、ω−ＯＨ脂肪酸の生合成は、ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチド発現宿主細胞、即ち、例えば配列番号６、配列番号３８、配列番号４２、及び配列番号４６に基づくＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドまたは同じ酵素機能を有する他のポリペプチドを発現する宿主細胞と比較して向上している。１つの実施形態において、ω−ＯＨ脂肪酸の生合成は、ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチド発現宿主細胞、即ち、例えば、配列番号９８に基づくＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドを発現する宿主細胞と比較して向上している。別の実施形態において、ω−ＯＨ脂肪酸の生合成は、ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチド鋳型バリアント発現宿主細胞、即ち、配列番号３８に基づくＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドまたは同じ酵素機能を有する他のポリペプチドを発現する宿主細胞と比較して向上している。別の実施形態において、ω−ＯＨ脂肪酸の生合成は、ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチド鋳型バリアント発現宿主細胞、即ち、配列番号６に基づくＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドまたは同じ酵素機能を有する他のポリペプチドを発現する宿主細胞と比較して向上している。別の実施形態において、ω−ＯＨ脂肪酸の生合成は、ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチド鋳型バリアント発現宿主細胞、即ち、例えば配列番号４２に基づくＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドまたは同じ酵素機能を有する他のポリペプチドを発現する宿主細胞と比較して向上している。別の実施形態において、ω−ＯＨ脂肪酸の生合成は、ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチド鋳型バリアント発現宿主細胞、即ち、例えば配列番号４６に基づくＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドまたは同じ酵素機能を有する他のポリペプチドを発現する宿主細胞と比較して向上している。別の実施形態において、ω−ＯＨ脂肪酸の生合成は、ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチド鋳型バリアント発現宿主細胞、即ち、例えば配列番号９８に基づくＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドまたは同じ酵素機能を有する他のポリペプチドを発現する宿主細胞と比較して向上している。様々な異なる宿主細胞は、ω−ＯＨ脂肪酸及びω−ＯＨ脂肪酸誘導体またはその組成物の向上した産生に好適な組換え宿主細胞をもたらす、本明細書に記載されたもののようなＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントを発現するように改変することができる。産生されるω−ＯＨ脂肪酸の例は、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、Ｃ１５、Ｃ１６、Ｃ１７、Ｃ１８、Ｃ１９、Ｃ２０、Ｃ８：１、Ｃ９：１、Ｃ１０：１、Ｃ１１：１、Ｃ１２：１、Ｃ１３：１、Ｃ１４：１、Ｃ１５：１、Ｃ１６：１、Ｃ１７：１、Ｃ１８：１、Ｃ１９：１及び／またはＣ２０：１脂肪酸である。１つの実施形態において、このようなω−ＯＨ脂肪酸は、ω−ＯＨ Ｃ８：０脂肪酸、ω−ＯＨ Ｃ１０：０脂肪酸、ω−ＯＨ Ｃ１２：０脂肪酸、ω−ＯＨ Ｃ１４：０脂肪酸、ω−ＯＨ Ｃ１６：０脂肪酸、ω−ＯＨ Ｃ１８：０脂肪酸、ω−ＯＨ Ｃ２０：０脂肪酸、ω−ＯＨ Ｃ８：１脂肪酸、ω−ＯＨ Ｃ１０：１脂肪酸、ω−ＯＨ Ｃ１２：１脂肪酸、ω−ＯＨ Ｃ１４：１脂肪酸、ω−ＯＨ Ｃ１６：１脂肪酸、ω−ＯＨ Ｃ１８：１脂肪酸、ω−ＯＨ Ｃ２０：１脂肪酸等である。様々な細胞は、本明細書に記載された組換え宿主細胞における使用に好適なポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む遺伝物質源を提供することができることが理解される。
経路操作及び酵素活性
脂肪酸の合成は細菌生合成機構のうち最も保存されたシステムの１つである。脂肪酸シンターゼ（ＦＡＳ）多酵素複合体は、全ての細菌及び真核生物において存在する。ＦＡＳ関連遺伝子のほとんどは、細胞の増殖及び生存に欠かせないものである。真核生物及び細菌ＦＡＳは、実質的に同じ生化学形質転換を推進する。真核生物において、ＦＡＳはＦＡＳ Iと称され、その触媒ドメインのほとんどは１つのポリペプチド鎖（非解離性）によりコードされる。細菌等の真核生物においては、ＦＡＳはＦＡＳIIと称され、その個々の酵素及びキャリアータンパク質は、別々の（解離性の）タンパク質をコードする別々の遺伝子によりコードされる。このため、ＦＡＳIIは重大な多様性及び明確な特性を有する複合系である。
ＦＡＳ経路において酵素と共にアシルキャリアータンパク質（ＡＣＰ）が、天然の生物で産生される脂肪酸の長さ、飽和の程度及び分岐を制御する。この経路におけるステップは、脂肪酸生合成（ＦＡＢ）及びアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣ）遺伝子ファミリーの酵素により触媒される。例えば、ＦＡＳ経路に含まれ得る酵素には、ＡｃｃＡＢＣＤ、ＦａｂＤ、ＦａｂＨ、ＦａｂＧ、ＦａｂＡ、ＦａｂＺ、ＦａｂＩ、ＦａｂＫ、ＦａｂＬ、ＦａｂＭ、ＦａｂＢ、及びＦａｂＦが含まれる。所望の産物に応じて、これらの遺伝子の１つ以上が低減され、または過剰発現され得る。このため、原核生物は、グルコースまたは他の炭素源等の再生可能な原料からの脂肪酸誘導体の産生を増大させるように操作されている。本明細書において、主要な目標は、細菌株を、脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）、脂肪酸エチルエステル（ＦＡＥＥ）及び脂肪アルコール（ＦＡＬＣ）を含む脂肪酸誘導体の産生のための微生物工場に変換するために、脂肪酸誘導体の産生を調節する重要な制御酵素の活性を高めることである（例えば、米国特許第８，２８３，１４３号を参照。これは本明細書に参照により組み入れられる）。
本開示は、ω−ＯＨ脂肪酸またはω−ＯＨ脂肪酸誘導体等の所望の化合物を産生するための酵素経路を改変するために、酵素機能のポリペプチドをコードするＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリヌクレオチドを特定する。本明細書において酵素アクセッション番号（ＥＣ番号）によって特定されるこれらのポリペプチドは、ω−ＯＨ脂肪酸及びω−ＯＨ脂肪酸誘導体（例、α，ω―二酸）等の他の二官能性分子の産生を導く脂肪酸経路を操作するために有用である（図１参照）。
１つの実施形態において、グルコース等の再生可能な原料から誘導される炭素源を用いてω−ＯＨ脂肪酸誘導体を生成する経路は、図１に描かれている。炭水化物（例、グルコース）は天然の生物によりアシル−ＡＣＰ等のアシル−チオエステルに変換される（図１のステップ１参照）。脂肪酸分解酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、任意で、所望の産物に応じて低減させることができる（下記の実施例を参照）。そのようなポリペプチドの非限定的な例としては、アシル−ＣｏＡシンテターゼ（ＦａｄＤ）及びアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＦａｄＥ）が挙げられる。表１は、当技術分野において公知の方法に従って任意で低減させることができる、様々な脂肪酸分解酵素を含む代謝経路内にある酵素活性の包括的リスト（下記）を提示する（例えば、上記の米国特許第８，２８３，１４３号を参照）。
例えば、ＦａｄＲ（下記の表１を参照）は、脂肪酸分解経路及び脂肪酸生合成経路に関与する重要な調節因子である（Ｃｒｏｎａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２９（４）：９３７−９４３（１９９８））。大腸菌の酵素ＦａｄＤ（下記の表１参照）及び脂肪酸輸送タンパク質ＦａｄＬは、脂肪酸取り込み系の構成成分である。ＦａｄＬは細菌細胞内への脂肪酸の輸送を媒介し、ＦａｄＤはアシル−ＣｏＡエステルの形成を媒介する。他の炭素源が利用できない場合には、外因性脂肪酸は細菌により取り込まれてアシル−ＣｏＡエステルに変換され、これが転写因子ＦａｄＲと結合し、脂肪酸の輸送（ＦａｄＬ）、活性化（ＦａｄＤ）、及びβ−酸化（ＦａｄＡ、ＦａｄＢ及びＦａｄＥ）を担うタンパク質をコードするｆａｄ遺伝子の発現を抑制することができる。代替の炭素源が利用できる場合には、細菌は脂肪酸をアシル−ＡＣＰとして合成し、それらはリン脂質合成には用いられるが、β-酸化の基質ではない。したがって、アシル−ＣｏＡ及びアシル−ＡＣＰはいずれも、異なる最終産物をもたらし得る、脂肪酸の独立した供給源である（Ｃａｖｉｇｌｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７９（１２）：１１６３−１１６９（２００４））。
（表１）酵素活性
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図１は、アシル−ＡＣＰ等のアシルチオエステルを、前駆中間体としてのＣ１２またはＣ１６：１脂肪酸（ＦＦＡ）に変換することができる例示的な経路を示す。図１のステップ１では、チオエステラーゼを用いてアシル−ＡＣＰがＦＦＡに変換される。ある特定の実施形態において、チオエステラーゼをコードする遺伝子は、ｔｅｓＡ、‘ｔｅｓＡ、ｔｅｓＢ、ｆａｔＢ１、ｆａｔＢ２、ｆａｔＢ３、ｆａｔＡ１、またはｆａｔＡである（このステップを触媒するのに使用され得るチオエステラーゼの酵素活性を有するポリペプチドを示す上記表１も参照）。ステップ２では、ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドまたはそのバリアントが、脂肪酸からω−ＯＨ脂肪酸（ω−ＯＨ ＦＦＡ）を形成するために使用される。他の二官能性分子は、例えば、α，ω−二酸または他のω−ＯＨ脂肪酸誘導体が、経路内の下流で産生され得るが、それは経路に存在する酵素機能性に依存する。
ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチド
ω−ヒドロキシラーゼ（またはω−オキシゲナーゼ）は、ある種の非ヘム二鉄オキシゲナーゼ（例えば、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）ＧＰｏ１由来のａｌｋＢ）及びある種のヘム型Ｐ４５０オキシゲナーゼ（例えば、マリノバクター・アクアエオレイ（Ｍａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒ ａｑｕａｅｏｌｅｉ）由来のｃｙｐ１５３Ａ等のω−ヒドロキシラーゼ）を含む。Ｐ４５０は、偏在性分布している酵素であり、高度の複雑性を有し、幅広い領域にわたって活性を示す。それらは、広範囲の様々の基質を変換し、様々の化学的反応を触媒する、遺伝子のスーパーファミリーによってコードされるタンパク質である。Ｃｙｐ１５３Ａは、ω位に高い選択性を持って炭化水素鎖をヒドロキシル化する可溶性細菌チトクロームＰ４５０のサブファミリーである（ｖａｎ Ｂｅｉｌｅｎ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７２：５９−６５）。ｃｙｐ１５３Ａファミリーのメンバーは、インビトロでアルカン、脂肪酸または脂肪アルコールのω位を選択的にヒドロキシル化することが示されており、例えば、マイコバクテリウム属の種ＨＸＮ−１５００由来のｃｙｐ１５３Ａ６（Ｆｕｎｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８８：５２２０−５２２７）、マイコバクテリウム・マリヌム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍａｒｉｎｕｍ）由来のｃｙｐ１５３Ａ１６、及びポラロモナス属の種（Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＪＳ６６６由来のｃｙｐ１５３Ａ（Ｓｃｈｅｐｓ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．９：６７２７−６７３３）ならびにマリノバクター・アクアエオレイ由来のｃｙｐ１５３Ａ（Ｈｏｎｄａ−Ｍａｌｃａ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．４８：５１１５−５１１７）が挙げられる。下記の表２Ａ及び２Ｂは、ω−ＯＨ脂肪酸及びω−ＯＨ脂肪酸誘導体の産生に使用され得るω−ヒドロキシラーゼ酵素活性を有する酵素及びレドックスパートナーの例を示す。
（表２Ａ）ω−ヒドロキシラーゼ酵素活性（Ｐ４５０）（ＥＣ １．１４．１５．３）の例
Figure 2018537111
（表２Ｂ）ω−ヒドロキシラーゼ酵素活性（Ｐ４５０）（ＥＣ １．１４．１５．３）のレドックスパートナーの例
Figure 2018537111
全てのチトクロームＰ４５０がそうであるように、Ｃｙｐ１５３Ａ ω−ヒドロキシラーゼはその触媒活性のために電子を必要とするが、これらはフェレドキシン及びフェレドキシンレダクターゼ等の特定の酸化還元タンパク質を介して与えられる。これらはｃｙｐ１５３Ａと相互作用する別々のタンパク質である。自給型ハイブリッド（キメラ）ｃｙｐ１５３Ａオキシゲナーゼ（即ち、活性のために別々のフェレドキシン及びフェレドキシンレダクターゼタンパク質を必要としないオキシゲナーゼ）は、以前に、アルカニボラクス・ボルクメンシスＳＫ２由来のｃｙｐ１５３Ａ（Ｋｕｂｏｔａ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６９：２４２１−２４３０；Ｆｕｊｉｔａ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７３：１８２５−１８３０）を、フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）結合部位及びＮＡＤＰＨ結合部位ならびに［２ＦｅＳ］フェレドキシン中心を含むＰ４５０ＲｈＦ由来のレダクターゼドメイン（Ｈｕｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００５）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．５７９：２２１５−２２２０）と融合させることによって作り出されている。Ｐ４５０ＲｈＦはクラス−Ｉ Ｐ４５０融合ＰＦＯＲに属する（ＤｅＭｏｔ ａｎｄ Ｐａｒｒｅｔ（２００３）Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１０：５０２）。このハイブリッドｃｙｐ１５３Ａ−ＲｅｄＲｈＦ融合タンパク質は、インビトロ生体内変換において、ω位にあるオクタンをヒドロキシル化すること、及びシクロヘキサンまたはブチルベンゼン等の他の化合物もヒドロキシル化することが示されている。他の自給型ハイブリッド（キメラ）ｃｙｐ１５３Ａオキシゲナーゼは、マリノバクター・アクアエオレイからのｃｙｐ１５３Ａを、Ｐ４５０ＲｈＦ及びＰ４５０−ＢＭ３（Ｓｃｈｅｐｓ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｍｉｃｒｏｂ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６：６９４−７０７）からのレダクターゼドメインと融合することにより作り出されている。天然Ｐ４５０−レダクターゼ融合タンパク質の例を、下記の表２Ｃ及び表２Ｄに示す。
（表２Ｃ）自給型ω−１、ω−２、ω−３−ヒドロキシラーゼ（ＥＣ １．１４．１４．１）融合タンパク質の例
Figure 2018537111
（表２Ｄ）自給型クラス−Ｉ Ｐ４５０融合ＰＦＯＲ融合タンパク質の例
Figure 2018537111
炭化水素のω−位置に対してそれらの選択性を考慮すると、ｃｙｐ１５３Ａファミリーのオキシゲナーゼは、再生可能な炭素源からα，ω−二官能性脂肪酸誘導体を産生するのに適した候補の中の優れた例であるように思われる。これにより、これらの有益な化合物を産生する商業的に実現可能な工程が可能になると考えられる。しかしながら、他のチトクロームＰ４５０と同様に、ｃｙｐ１５３Ａファミリータンパク質はこれまでのところ、ほとんどは、脂肪酸誘導体または炭化水素を細胞外に添加する、精製された酵素または粗製細胞溶解物を用いるインビトロ実験、或いは休止細胞での生体内変換に、適用されている（Ｋｕｂｏｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｆｕｊｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｈｏｎｄａ−Ｍａｌｃａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｈｅｐｓ ｅｔ ａｌ．，上記）。しかしながら、ハイブリッド融合体を使用するインビトロ手順または休止細胞での生体内変換は、ω−ヒドロキシ脂肪酸誘導体の大規模で且つ費用効率の高い産生にはつながらない。当技術分野において広く受け入れられている知見は、多くのチトクロームＰ４５０及びａｌｋＢ型ω−ヒドロキシラーゼを組換え微生物において機能的に発現させることは容易でないということである。なぜなら、酵素はしばしば不活性であり、それらの化学的現象を解明することが困難であったためである。実際、これまでに試みられた脂肪酸誘導体以外の再生可能な炭素源を用いる唯一のインビボ研究では、ａｌｋＢ ω−ヒドロキシラーゼが使用されているが、高密度細胞発酵においてω−ヒドロキシ脂肪酸誘導体は低い力価でしか得られていない（ＷＯ２０１３／０２４１１４Ａ２）。
本開示は、再生可能な炭素源からω−ヒドロキシ脂肪酸誘導体をインビボで効率的に産生することができるＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合タンパク質バリアントを提供する。より具体的には、位置３０７でアラニン（Ａ）がグリシン（Ｇ）に取って代わっているＣＹＰ１５３Ａ（Ｇ３０７Ａ）Ｐ４５０触媒ドメインのハイブリッド融合タンパク質をコードする、マリノバクター・アクアエオレイ由来の遺伝子を、ロドコッカス属の種ＮＣＩＭＢ９７８４由来のＰ４５０ＲｈＦのｃ末端ＦＭＮ及びＦｅ／Ｓを含有するレダクターゼドメインをコードする遺伝子と、リンカーポリペプチドを介して融合させた。得られるポリペプチドは、対応する核酸配列（配列番号５）を有するＣＹＰ１５３Ａ−ＲｅｄＲｈＦハイブリッド融合ポリペプチド（配列番号６、図３参照）である。このＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合タンパク質を、グルコース等の単純な炭素源で大腸菌細胞において発現させたところ、脂肪酸誘導体がω−ヒドロキシ脂肪酸誘導体に効率的に変換された（実施例１参照）。同様のＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドを形成するために用い得る、適したω−ヒドロキシラーゼ（ＥＣ １．１４．１５．３）及びそれらのレドックスパートナーの他の例は、表２Ａ及び２Ｂ（上記）に列記されている。
ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアント
本開示は、宿主細胞で発現された場合のＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドと比較して、特に、宿主細胞で発現された、例えば配列番号６、配列番号３８、配列番号４２、配列番号４６、及び配列番号９８のいずれかのＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドと比較して、より具体的には、宿主細胞で発現された配列番号３８のＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドと比較して、ω−ヒドロキシル化脂肪酸誘導体組成物のより高い力価、収率及び／または生産性をもたらすＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントを特定する。様々な実施形態において、本開示は、宿主細胞で発現された、例えば配列番号４２、配列番号４６または配列番号９８のＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドと比較して、ω−ヒドロキシル化脂肪酸誘導体組成物のより高い力価、収率及び／または生産性をもたらすＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントを提供する。本開示の非限定的な例（下記の実施例１〜７参照）においては、ＣＹＰ１５３Ａ（Ｇ３０７Ａ）−ＲｅｄＲｈＦハイブリッド融合ポリペプチド（上記）を鋳型として用い、ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントを効率的に操作して、より多くの量のω−ＯＨ脂肪酸及びω−ＯＨ脂肪酸誘導体を産生した。例えば、ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは、インビボで、グルコース等の単純な炭素源から、ドデカン酸等の化合物を１２−ヒドロキシドデカン酸に効率的に変換することができる。例えば、再生可能な原料に由来するような任意の単純な炭素源が適している。操作されたＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアント（即ち、操作されたＣＹＰ１５３Ａ−ＲｅｄＲｈＦハイブリッド融合ポリペプチドバリアントによって例示されている）は、再生可能な原料由来のグルコース等の炭素源を用いて宿主細胞（例、大腸菌）においてチオエステラーゼと共発現させた場合に、インビボで脂肪酸を特定の望ましい化合物（ω−ＯＨ脂肪酸を含む）に変換させ得ることが示された（下記の実施例参照）。本開示に従って、突然変異させた遺伝子、例えばＣＹＰ１５３Ａ触媒ドメインをコードする遺伝子を、ｃ末端レダクターゼドメインをコードする突然変異遺伝子と連結させることによって、他のハイブリッド融合ポリペプチドバリアントを操作することができる（上記表２Ａ〜２Ｄ及び図５を参照）。例えば、両方の遺伝子（Ｐ５４５０触媒ドメイン及びレダクターゼドメイン）を突然変異させる、または一方の遺伝子（Ｐ４５０触媒ドメインまたはレダクターゼドメイン）を突然変異させる変形も、本明細書に包含される。これらの指示に従い、類似の融合タンパク質バリアントをω−ヒドロキシラーゼの他のタイプから作り出すことができる。
したがって、本開示は、宿主細胞で発現された場合のＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドと比較して、特に、宿主細胞で発現された、例えば配列番号６、配列番号３８、配列番号４２、配列番号４６、及び配列番号９８のいずれかのＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドと比較して、より具体的には、宿主細胞で発現された配列番号３８のＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドと比較して、ω−ヒドロキシル化脂肪酸誘導体組成物の高い力価、収率及び／または生産性をもたらすＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントに関する。様々な実施形態において、本開示は、宿主細胞で発現された、例えば配列番号４２、配列番号４６または配列番号９８のＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドと比較して、ω−ヒドロキシル化脂肪酸誘導体組成物の高い力価、収率及び／または生産性をもたらすＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントに関する。ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは、ＣＹＰ１５３Ａドメインまたはレダクターゼドメインまたはその両方に、１つ以上の突然変異を有する。１つの実施形態において、本開示は、配列番号６（図３参照）に対して少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有し、且つ位置２７、８２、１４１、１７８、２３１、３０９、４０７、４１５、５１６、６６６、及び／または７９６を含むアミノ酸位置に１つ以上の突然変異を有する、ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントであって、脂肪酸からω−ＯＨ脂肪酸への変換を触媒する、ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントを提供する。より具体的には、ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは、以下を含む突然変異を１つ以上有する：例えば、アルギニン（Ｒ）がリジン（Ｌ）で置換されているＲ２７Ｌ；アルギニン（Ｒ）がアスパラギン酸（Ｄ）で置換されている位置Ｒ８２Ｄ；バリンがイソロイシン（Ｉ）で置換されている位置Ｖ１４１Ｉ；バリン（Ｖ）がグルタミン（Ｑ）で置換されている位置Ｖ１４１Ｑ；バリン（Ｖ）がグリシン（Ｇ）で置換されている位置Ｖ１４１Ｇ；バリン（Ｖ）がメチオニン（Ｍ）で置換されている位置Ｖ１４１Ｍ；バリン（Ｖ）がロイシン（Ｌ）で置換されている位置Ｖ１４１Ｌ；バリン（Ｖ）がスレオニン（Ｔ）で置換されている位置Ｖ１４１Ｔ；アルギニン（Ｒ）がアスパラギン（Ｎ）で置換されている位置Ｒ１７８Ｎ；アラニン（Ａ）がスレオニン（Ｔ）で置換されている位置Ａ２３１Ｔ；アスパラギン（Ｎ）がアルギニン（Ｒ）で置換されている位置Ｎ３０９Ｒ；アスパラギン（Ｎ）がアラニン（Ａ）で置換されている位置Ｎ４０７Ａ；バリン（Ｖ）がアルギニン（Ｒ）で置換されている位置Ｖ４１５Ｒ；スレオニン（Ｔ）がバリン（Ｖ）で置換されている位置Ｔ５１６Ｖ；プロリン（Ｐ）がアラニン（Ａ）で置換されている位置Ｐ６６６Ａ；プロリン（Ｐ）がアスパラギン酸（Ｄ）で置換されている位置Ｐ６６６Ｄ；及び、アラニン（Ａ）がバリン（Ｖ）で置換されている位置Ａ７９６Ｖ。ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントの例としては、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８もしくは配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、及び配列番号４６が挙げられる。１つの実施形態において、ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは、ハイブリッドｃｙｐ１５３Ａ−ＲｅｄＲｈＦ型の融合タンパク質バリアントである。別の実施形態において、組換え宿主細胞内のＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは、対応する宿主細胞内のＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドの発現により産生されるω−ＯＨ脂肪酸またはその組成物の力価よりも高い力価を有するω−ＯＨ脂肪酸またはその組成物をもたらす。別の実施形態において、ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは、Ｖ１４１Ｉ及び／またはＶ１４１Ｔを含むアミノ酸位置１４１における突然変異を有する。本明細書では、組換え宿主細胞における突然変異Ｖ１４１Ｉ及び／またはＶ１４１Ｔを有するＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントの発現は、ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドの発現により産生されるω−ＯＨ Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、Ｃ１５、Ｃ１６、Ｃ１７、Ｃ１８、Ｃ１９、Ｃ２０、Ｃ８：１、Ｃ９：１、Ｃ１０：１、Ｃ１１：１、Ｃ１２：１、Ｃ１３：１、Ｃ１４：１、Ｃ１５：１、Ｃ１６：１、Ｃ１７：１、Ｃ１８：１、Ｃ１９：１及び／またはＣ２０：１脂肪酸の力価と比較して、それぞれ、より高い力価のω−ＯＨ Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、Ｃ１５、Ｃ１６、Ｃ１７、Ｃ１８、Ｃ１９、Ｃ２０、Ｃ８：１、Ｃ９：１、Ｃ１０：１、Ｃ１１：１、Ｃ１２：１、Ｃ１３：１、Ｃ１４：１、Ｃ１５：１、Ｃ１６：１、Ｃ１７：１、Ｃ１８：１、Ｃ１９：１及び／またはＣ２０：１脂肪酸をもたらす。１つの実施形態において、ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは、突然変異Ｖ１４１Ｉ及びＡ２３１Ｔ（配列番号３２）を有し、且つチオエステラーゼの酵素機能を有する宿主細胞で発現された場合に、増大した量のω−ＯＨ Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、Ｃ１５、Ｃ１６、Ｃ１７、Ｃ１８、Ｃ１９、Ｃ２０、Ｃ８：１、Ｃ９：１、Ｃ１０：１、Ｃ１１：１、Ｃ１２：１、Ｃ１３：１、Ｃ１４：１、Ｃ１５：１、Ｃ１６：１、Ｃ１７：１、Ｃ１８：１、Ｃ１９：１及び／またはＣ２０：１脂肪酸を産生する。別の実施形態において、ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは、突然変異Ｒ２７Ｌ、Ｒ８２Ｄ、Ｖ１４１Ｍ、Ｒ１７８Ｎ及びＮ４０７Ａ（配列番号３４）を有し、且つチオエステラーゼの酵素機能を有する宿主細胞で発現された場合に、増大した量のω−ＯＨ Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、Ｃ１５、Ｃ１６、Ｃ１７、Ｃ１８、Ｃ１９、Ｃ２０、Ｃ８：１、Ｃ９：１、Ｃ１０：１、Ｃ１１：１、Ｃ１２：１、Ｃ１３：１、Ｃ１４：１、Ｃ１５：１、Ｃ１６：１、Ｃ１７：１、Ｃ１８：１、Ｃ１９：１及び／またはＣ２０：１脂肪酸を産生する。別の実施形態において、ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは、突然変異Ｐ６６６Ａ（配列番号３６）を有し、且つチオエステラーゼの酵素機能を有する宿主細胞で発現された場合に、増大した量のω−ＯＨ Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、Ｃ１５、Ｃ１６、Ｃ１７、Ｃ１８、Ｃ１９、Ｃ２０、Ｃ８：１、Ｃ９：１、Ｃ１０：１、Ｃ１１：１、Ｃ１２：１、Ｃ１３：１、Ｃ１４：１、Ｃ１５：１、Ｃ１６：１、Ｃ１７：１、Ｃ１８：１、Ｃ１９：１及び／またはＣ２０：１脂肪酸を産生する。別の実施形態において、ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは、そのレダクターゼドメインに突然変異Ａ７９６Ｖ（配列番号３８）を有し（図５参照）、且つチオエステラーゼの酵素機能を有する宿主細胞で発現された場合に、増大した量のω−ＯＨ Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、Ｃ１５、Ｃ１６、Ｃ１７、Ｃ１８、Ｃ１９、Ｃ２０、Ｃ８：１、Ｃ９：１、Ｃ１０：１、Ｃ１１：１、Ｃ１２：１、Ｃ１３：１、Ｃ１４：１、Ｃ１５：１、Ｃ１６：１、Ｃ１７：１、Ｃ１８：１、Ｃ１９：１及び／またはＣ２０：１脂肪酸を産生する。別の実施形態において、ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは、そのレダクターゼドメインに突然変異Ａ７９６Ｖ、Ｐ６６６Ｄ及びＴ５１６Ｖ（配列番号４０）を有し、且つチオエステラーゼの酵素機能を有する宿主細胞で発現された場合に、増大した量のω−ＯＨ Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、Ｃ１５、Ｃ１６、Ｃ１７、Ｃ１８、Ｃ１９、Ｃ２０、Ｃ８：１、Ｃ９：１、Ｃ１０：１、Ｃ１１：１、Ｃ１２：１、Ｃ１３：１、Ｃ１４：１、Ｃ１５：１、Ｃ１６：１、Ｃ１７：１、Ｃ１８：１、Ｃ１９：１及び／またはＣ２０：１脂肪酸を産生する。別の実施形態において、ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは、触媒ドメインに突然変異Ｖ１４１Ｉ及びＡ２３１Ｔ、レダクターゼドメインに突然変異Ａ７９６Ｖを有し（配列番号４２）、且つチオエステラーゼの酵素機能を有する宿主細胞で発現された場合にω−ＯＨ Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、Ｃ１５、Ｃ１６、Ｃ１７、Ｃ１８、Ｃ１９、Ｃ２０、Ｃ８：１、Ｃ９：１、Ｃ１０：１、Ｃ１１：１、Ｃ１２：１、Ｃ
１３：１、Ｃ１４：１、Ｃ１５：１、Ｃ１６：１、Ｃ１７：１、Ｃ１８：１、Ｃ１９：１及び／またはＣ２０：１脂肪酸を増加した量で産生する。別の実施形態において、ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは、触媒ドメインに突然変異Ｒ２７Ｌ、Ｒ８２Ｄ、Ｖ１４１Ｍ、Ｒ１７８Ｎ及びＮ４０７Ａ、レダクターゼドメインに突然変異Ａ７９６Ｖを有し（配列番号４４）、且つチオエステラーゼの酵素機能を有する宿主細胞で発現された場合にω−ＯＨ Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、Ｃ１５、Ｃ１６、Ｃ１７、Ｃ１８、Ｃ１９、Ｃ２０、Ｃ８：１、Ｃ９：１、Ｃ１０：１、Ｃ１１：１、Ｃ１２：１、Ｃ１３：１、Ｃ１４：１、Ｃ１５：１、Ｃ１６：１、Ｃ１７：１、Ｃ１８：１、Ｃ１９：１及び／またはＣ２０：１脂肪酸を増加した量で産生する。別の実施形態において、ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは、触媒ドメインに突然変異Ｖ１４１Ｔ及びＡ２３１Ｔ、レダクターゼドメインに突然変異Ａ７９６Ｖを有し（配列番号４６）、且つチオエステラーゼの酵素機能を有する宿主細胞で発現された場合にω−ＯＨ Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、Ｃ１５、Ｃ１６、Ｃ１７、Ｃ１８、Ｃ１９、Ｃ２０、Ｃ８：１、Ｃ９：１、Ｃ１０：１、Ｃ１１：１、Ｃ１２：１、Ｃ１３：１、Ｃ１４：１、Ｃ１５：１、Ｃ１６：１、Ｃ１７：１、Ｃ１８：１、Ｃ１９：１及び／またはＣ２０：１脂肪酸を増加した量で産生する。１つの実施形態において、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４及び配列番号４６のバリアントは、配列番号６と比較して、増大した量のω−ＯＨ脂肪酸または脂肪酸誘導体を産生した。１つの実施形態において、これらのω−ＯＨ脂肪酸は、ω−ＯＨ Ｃ８：０脂肪酸、ω−ＯＨ Ｃ１０：０脂肪酸、ω−ＯＨ Ｃ１２：０脂肪酸、ω−ＯＨ Ｃ１４：０脂肪酸、ω−ＯＨ Ｃ１６：０脂肪酸、ω−ＯＨ Ｃ１８：０脂肪酸、ω−ＯＨ Ｃ２０：０脂肪酸、ω−ＯＨ Ｃ８：１脂肪酸、ω−ＯＨ Ｃ１０：１脂肪酸、ω−ＯＨ Ｃ１２：１脂肪酸、ω−ＯＨ Ｃ１４：１脂肪酸、ω−ＯＨ Ｃ１６：１脂肪酸、ω−ＯＨ Ｃ１８：１脂肪酸、ω−ＯＨ Ｃ２０：１脂肪酸等である。
本開示は、ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリヌクレオチド及びポリペプチドバリアントを特定する。ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントとしては、配列番号８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４及び４６が挙げられる。ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合核酸バリアント（ＤＮＡ配列）としては、配列番号７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５及び４７が挙げられる。しかしながら、ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリヌクレオチドバリアントに対して絶対配列同一性は必要としないことが認識されるであろう。例えば、特定のポリヌクレオチド配列を変化させて、コードされたポリペプチドを活性化についてスクリーニングすることができる。このような変化には、典型的には、例えばコドン最適化等による保存的突然変異及びサイレント突然変異が含まれる。改変されたまたは突然変異を受けた（即ち、突然変異）ポリヌクレオチド及びコードされるバリアントポリペプチドは、当技術分野において公知の方法を用いて、触媒活性の増大、安定性の増大、または阻害の低下（例、フィードバック阻害の低下）を含むがこれらに限定されない、野生型または鋳型ポリペプチドと比較して改良された機能等の所望の機能を得るためにスクリーニングすることができる。本開示では、本明細書に記載の脂肪酸生合成経路の様々なステップ（即ち反応）に関与する酵素活性を酵素分類（ＥＣ）番号に従って特定し、そのようなＥＣ番号によって分類される例示的な（例えば、特定の酵素として機能し且つ特定の酵素活性を示す）ポリペプチド、及びこのようなポリペプチドをコードする例示的なポリヌクレオチドを提供している。本明細書において配列識別子番号（配列番号；上記）により特定されるこのような例示的なポリペプチド及びポリヌクレオチドは、図１に示されたもののような宿主細胞における脂肪酸経路を操作するために有用である。しかしながら、本明細書に記載のポリペプチド及びポリヌクレオチドは例示的なものであるため、限定的ではないことが理解される必要がある。本明細書に記載の例示的なポリペプチドの相同体の配列は、データベース、例えば、いずれもワールド・ワイド・ウェブ上で利用可能である、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）によって提供されているＥｎｔｒｅｚデータベース、Ｓｗｉｓｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓによって提供されているＥｘＰａｓｙデータベース、Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇによって提供されているＢＲＥＮＤＡデータベース、ならびにＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｋｙｏｔｏ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ及びＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｏｋｙｏによって提供されているＫＥＧＧデータベースを用いて、当業者には入手可能である。
１つの実施形態において、本開示を実施するために使用されるＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８または配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、及び配列番号４６に対して少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態において、ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは、触媒ドメインにおいてアラニン（Ａ）がグリシン（Ｇ）に取って代わっている、マリノバクター・アクアエオレイ由来のＣＹＰ１５３Ａ（Ｇ３０７Ａ）ポリペプチドに由来し、ロドコッカス属の種ＮＣＩＭＢ９７８４由来のＰ４５０ＲｈＦのレダクターゼドメインとリンカーポリペプチドを介して融合している。チトクロームＰ４５０ＲｈＦは自給型であり、高度な基質多様性（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｐｒｏｍｉｓｃｕｉｔｙ）を示し、広範な官能基を触媒する。他の実施形態において、本開示の実施に用いるためのＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８または配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４または配列番号４６に対して、少なくとも約７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有し、さらに本明細書に記載されているような有用な特徴及び／または特性をもたらす１つ以上の置換を含んでいてもよい。他の実施形態において、本開示の実施に用いられるＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８または配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、または配列番号４６に対して、約１００％、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、または９０％の配列同一性を有する。さらに他の実施形態において、ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントのＰ４５０触媒ドメインは、マリノバクター・アクアエオレイ以外の生物に由来する。このような他の種としては、以下を非限定的に含む：アシネトバクター属の種、マイコバクテリウム・マリヌム、ポラロモナス属の種、アルカニボラクス・ボルクメンシス、バークホルデリア・フンゴルム（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｆｕｎｇｏｒｕｍ）、カウロバクター・クレセンタス（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ）、ヒポモナス・ネプツニウム（Ｈｙｐｈｏｍｏｎａｓ ｎｅｐｔｕｎｉｕｍ）、ロドシュードモナス・パルストリス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐａｌｕｓｔｒｉｓ）、スフィンゴモナス属の種、マイコバクテリウム属の種。さらに他の実施形態において、ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントのレダクターゼドメインは、ロドコッカス属の種以外の生物に由来する。そのような他の生物は、以下を非限定的に含む：ロドコッカス・エクイ、アシネトバクター・ラジオレシステンス、バークホルデリア・マレイ、バークホルデリア・マレイ、ラルストニア・ユートロファ、カプリアビダス・メタリデュランス。
関連する実施形態において、本開示は、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、または配列番号４７に対して、少なくとも約７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリヌクレオチドバリアントを包含する。いくつかの実施形態において、核酸配列は、本明細書に記載の改良された特徴及び／または特性をもたらす１つ以上の置換を有するＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントをコードする。さらに別の関連した実施形態において、本開示の実施に用いるためのＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５または配列番号４７に対して少なくとも約１００％、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％または９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる。別の態様において、本開示は、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、または配列番号４７に対応する核酸配列の実質的に全長に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を包含するＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントに関する。いくつかの実施形態において、ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは、マリノバクター・アクアエオレイに由来する。他の実施形態において、Ｐ４５０ハイブリッド融合ポリペプチドは、アシネトバクター属の種、マイコバクテリウム・マリヌム、ポラロモナス属の種、アルカニボラクス・ボルクメンシス、バークホルデリア・フンゴルム、カウロバクター・クレセンタス、ヒポモナス・ネプツニウム、ロドシュードモナス・パルストリス、スフィンゴモナス属の種、及びマイコバクテリウム属の種に由来する。
追加のＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアント
本開示は、バリアントが鋳型として使用された追加のＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合関連ポリヌクレオチド及びポリペプチドバリアント（鋳型バリアント）を特定する。ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアント（配列番号３８）は、Ｐ５４０ ＣＹＰ１５３Ａ（Ｇ３０７Ａ）−Ｒｅｄ４５０ＲｈＦ（Ａ７９６Ｖ）融合ポリペプチドに基づいており、触媒ドメインにおいてグリシン（Ｇ）がアラニン（Ａ）で置き換えられている突然変異Ｇ３０７Ａ、レダクターゼドメインにおいてアラニン（Ａ）がバリン（Ｖ）で置き換えられている突然変異Ａ７９６Ｖを含み、リンカーポリペプチドは触媒ドメインをレダクターゼドメインに接続させている（図４及び５を参照）。いくつかの実施形態において、マリノバクター・アクアエオレイ由来のＣＹＰ１５３Ａポリペプチドは、リンカーを介して、ロドコッカス属の種ＮＣＩＭＢ９７８４由来のＰ４５０ＲｈＦのレダクターゼドメインと融合する。上述のように、チトクロームＰ４５０ＲｈＦは自給型であり、高度な基質多様性（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｐｒｏｍｉｓｃｕｉｔｙ）を示し、広範な官能基を触媒する。触媒ドメインにおける突然変異Ｇ３０７Ａ及びレダクターゼドメインにおける突然変異Ａ７９６Ｖは、ｃｙｐ１５３Ａのω−ヒドロキシラーゼ活性を改良する有益な突然変異である（配列番号３８参照）。ｃｙｐ１５３Ａ−Ｒｅｄ４５０ＲｈＦ融合タンパク質の完全飽和ライブラリーが構築され、Ｐ４５０ ｃｙｐ１５３Ａ（Ｇ３０７Ａ）−Ｒｅｄ４５０ＲｈＦ（Ａ７９６Ｖ）（配列番号３８）に対する改良を示すバリアントについてスクリーニングされた（実施例７参照）。得られたＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントを、実施例（下記）及び配列の表Ｂ及びＣに示す。これらＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは、配列番号３８と比較して増大した量のω−ヒドロキシ脂肪酸（ω−ＯＨ ＦＦＡ力価）を産生し、配列番号４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２及び１４４を含む。同様に、これらＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは、配列番号６と比較して増大した量のω−ヒドロキシ脂肪酸（ω−ＯＨ ＦＦＡ力価）を産生し、配列番号４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、及び１６４を含む。これらＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは、増大した量のω−ＯＨ脂肪酸を産生することができ、この脂肪酸にはＣ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、Ｃ１５、Ｃ１６、Ｃ１７、Ｃ１８、Ｃ１９、Ｃ２０、Ｃ８：１、Ｃ９：１、Ｃ１０：１、Ｃ１１：１、Ｃ１２：１、Ｃ１３：１、Ｃ１４：１、Ｃ１５：１、Ｃ１６：１、Ｃ１７：１、Ｃ１８：１、Ｃ１９：１及び／またはＣ２０：１脂肪酸が含まれる。
触媒ドメインにおける突然変異Ｑ１２Ｗ、Ｒ２７Ｌ、Ｋ１１９Ｒ、Ｓ１４０Ｎ、Ｓ１５７Ｒ、Ｖ１５９Ｍ、Ｓ２３３Ｌ及びＡ２４４Ｒ（さらに突然変異Ｇ３０７Ａ）ならびにレダクターゼドメインにおける突然変異Ａ７９６Ｖは、ｃｙｐ１５３Ａのω−ヒドロキシラーゼ活性をさらに改良した有益な突然変異である（配列番号９８及び実施例８を参照）。ｃｙｐ１５３Ａ−Ｒｅｄ４５０ＲｈＦ融合タンパク質の完全飽和ライブラリーが構築され、配列番号９８に対する改良を示すバリアントについてスクリーニングされた（実施例１１参照）。得られたＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントを、実施例（下記）及び配列の表Ｃ（下記）に示す。これらのＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは、配列番号９８の場合よりも増大した量のω−ヒドロキシ脂肪酸（ω−ＯＨ ＦＦＡ力価）を産生し、そして配列番号１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、及び１６４を包含している。同様に、これらのＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは、配列番号６及び配列番号３８の場合よりも増大した量のω−ヒドロキシ脂肪酸（ω−ＯＨ ＦＦＡ力価）を産生し、そして配列番号１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、及び１６４を包含している。これらのＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは、増大した量のＣ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、Ｃ１５、Ｃ１６、Ｃ１７、Ｃ１８、Ｃ１９、Ｃ２０、Ｃ８：１、Ｃ９：１、Ｃ１０：１、Ｃ１１：１、Ｃ１２：１、Ｃ１３：１、Ｃ１４：１、Ｃ１５：１、Ｃ１６：１、Ｃ１７：１、Ｃ１８：１、Ｃ１９：１及び／またはＣ２０：１脂肪酸及び／または脂肪酸誘導体を含むω−ＯＨ脂肪酸を産生することができる。
ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合核酸バリアント（ＤＮＡ配列）としては、配列番号４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１及び１６３が挙げられる。しかしながら、ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリヌクレオチドバリアントに対して絶対配列同一性は必要としないことが認識されるであろう。例えば、特定のポリヌクレオチド配列を変化させて、コードされたポリペプチドを活性化についてスクリーニングすることができる。このような変化には、典型的には、例えばコドン最適化等による保存的突然変異及びサイレント突然変異が含まれる。改変されたまたは突然変異を受けた（即ち、突然変異）ポリヌクレオチド及びコードされるバリアントポリペプチドは、当技術分野において公知の方法を用いて、触媒活性の増大、安定性の増大、または阻害の低下（例、フィードバック阻害の低下）を含むがこれらに限定されない、野生型または鋳型ポリペプチドと比較して改良された機能等の所望の機能を得るためにスクリーニングすることができる。本開示では、本明細書に記載の脂肪酸生合成経路の様々なステップ（即ち反応）に関与する酵素活性を酵素分類（ＥＣ）番号に従って特定し、そのようなＥＣ番号によって分類される例示的な（例えば、特定の酵素として機能し且つ特定の酵素活性を示す）ポリペプチド、及びこのようなポリペプチドをコードする例示的なポリヌクレオチドを提供している。本明細書において配列識別子番号（配列番号；上記）により特定されるこのような例示的なポリペプチド及びポリヌクレオチドは、図１に示されたもののような宿主細胞における脂肪酸経路を操作するために有用である。しかしながら、本明細書に記載のポリペプチド及びポリヌクレオチドは例示的なものであるため、限定的ではないことが理解される必要がある。本明細書に記載の例示的なポリペプチドの相同体の配列は、データベース、例えば、いずれもワールド・ワイド・ウェブ上で利用可能である、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）によって提供されているＥｎｔｒｅｚデータベース、Ｓｗｉｓｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓによって提供されているＥｘＰａｓｙデータベース、Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇによって提供されているＢＲＥＮＤＡデータベース、ならびにＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｋｙｏｔｏ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ及びＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｏｋｙｏによって提供されているＫＥＧＧデータベースを用いて、当業者には入手可能である。
様々な実施形態において、本開示のＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、配列番号１２２、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４、配列番号１３６、配列番号１３８、配列番号１４０、配列番号１４２、配列番号１４４、配列番号１４６、配列番号１４８、配列番号１５０、配列番号１５２、配列番号１５４、配列番号１５６、配列番号１５８、配列番号１６０、配列番号１６２及び配列番号１６４のいずれかのアミノ酸配列に対して、少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、または８９％の配列同一性を有し、前記ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは、脂肪酸からω−ヒドロキシル化脂肪酸への変換を触媒する。好ましくは、前記ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは、組換え宿主細胞における発現の際に、対応する宿主細胞における配列番号６または配列番号３８のＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドの発現により産生されるω−ヒドロキシル化脂肪酸の力価と比較して、より高い力価のω−ヒドロキシル化脂肪酸をもたらす。様々な実施形態において、本開示のＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、配列番号１２２、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４、配列番号１３６、配列番号１３８、配列番号１４０、配列番号１４２、配列番号１４４、配列番号１４６、配列番号１４８、配列番号１５０、配列番号１５２、配列番号１５４、配列番号１５６、配列番号１５８、配列番号１６０、配列番号１６２及び配列番号１６４のいずれかのアミノ酸配列に対して、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有し、前記ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは、脂肪酸からω−ヒドロキシル化脂肪酸への変換を触媒する。好ましくは、前記ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは、組換え宿主細胞における発現の際に、対応する宿主細胞における配列番号６または配列番号３８のＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドの発現により産生されるω−ヒドロキシル化脂肪酸の力価と比較して、より高い力価のω−ヒドロキシル化脂肪酸をもたらす。いくつかの実施形態において、ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは、グリシン（Ｇ）がアラニン（Ａ）で置き換えられているマリノバクター・アクアエオレイ由来のＣＹＰ１５３Ａ（Ｇ３０７Ａ）ポリペプチドに由来し、ロドコッカス属の種ＮＣＩＭＢ９７８４由来のＰ４５０ＲｈＦのレダクターゼドメインと融合し、アラニン（Ａ）がバリン（Ｖ）で置き換えられている追加の突然変異Ａ７９６Ｖを含む。他の実施形態において、本開示の実施に用いるためのＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは、配列番号３８、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８もしくは配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、配列番号１２２、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４、配列番号１３６、配列番号１３８、配列番号１４０、配列番号１４２、配列番号１４４、配列番号１４６、配列番号１４８、配列番号１５０、配列番号１５２、配列番号１５４、配列番号１５６、配列番号１５８、配列番号１６０、配列番号１６２及び配列番号１６４に対して、少なくとも約７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有し、さらに本明細書に記載されているような有用な特徴及び／または特性をもたらす１つ以上の置換を含んでいてもよい。他の実施形態において、本開示の実施に用いられるＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは、配列番号３８、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８もしくは配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、または配列番号９６に対して、少なくとも約１００％、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％または９０％の配列同一性を有する。なお他の実施形態において、ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントのＰ４５０触媒ドメインは、マリノバクター・アクアエオレイ以外の生物に由来する。このような他の種としては、以下を非限定的に含む：アシネトバクター属の種、マイコバクテリウム・マリヌム、ポラロモナス属の種、アルカニボラクス・ボルクメンシス、バークホルデリア・フンゴルム、カウロバクター・クレセンタス、ヒポモナス・ネプツニウム、ロドシュードモナス・パルストリス、スフィンゴモナス属の種、マイコバクテリウム属の種。なお他の実施形態において、ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントのレダクターゼドメインは、ロドコッカス属の種以外の生物に由来する。そのような他の生物は、以下を非限定的に含む：ロドコッカス・エクイ、アシネトバクター・ラジオレシステンス、バークホルデリア・マレイ、バークホルデリア・マレイ、ラルストニア・ユートロファ、カプリアビダス・メタリデュランス。
関連する実施形態において、本開示は、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１９、配列番号１２１、配列番号１２３、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３７、配列番号１３９、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４５、配列番号１４７、配列番号１４９、配列番号１５１、配列番号１５３、配列番号１５５、配列番号１５７、配列番号１５９、配列番号１６１及び配列番号１６３のいずれかの核酸配列に対して、少なくとも約７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリヌクレオチドバリアントを包含し、前記ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリヌクレオチドバリアントによりコードされるＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは、脂肪酸からω−ヒドロキシル化脂肪酸への変換を触媒する。好ましくは、前記ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリヌクレオチドバリアントによりコードされる前記ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは、組換え宿主細胞における発現の際に、対応する宿主細胞における配列番号６または配列番号３８のＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドの発現により産生されるω−ヒドロキシル化脂肪酸の力価と比較して、より高い力価のω−ヒドロキシル化脂肪酸をもたらす。一部の実施形態において、当該核酸配列は、本明細書に記載される改良された特徴及び／または特性をもたらす１つ以上の置換を有するＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントをコードする。また別の関連する実施形態において、本開示のＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１９、配列番号１２１、配列番号１２３、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３７、配列番号１３９、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４５、配列番号１４７、配列番号１４９、配列番号１５１、配列番号１５３、配列番号１５５、配列番号１５７、配列番号１５９、配列番号１６１及び配列番号１６３のいずれかのヌクレオチド配列に対して、少なくとも約１００％、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％または９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされる。別の態様において、本開示は、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１９、配列番号１２１、配列番号１２３、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３７、配列番号１３９、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４５、配列番号１４７、配列番号１４９、配列番号１５１、配列番号１５３、配列番号１５５、配列番号１５７、配列番号１５９、配列番号１６１、及び配列番号１６３のいずれかに対応する核酸配列の実質的な全長にわたってストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を包含する、ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントに関する。いくつかの実施形態において、ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは、マリノバクター・アクアエオレイ種に由来する。他の実施形態において、Ｐ４５０ハイブリッド融合ポリペプチドは、アシネトバクター属の種、マイコバクテリウム・マリヌム、ポラロモナス属の種、アルカニボラクス・ボルクメンシス、バークホルデリア・フンゴルム、カウロバクター・クレセンタス、ヒポモナス・ネプツニウム、ロドシュードモナス・パルストリス、スフィンゴモナス属の種、及びマイコバクテリウム属の種に由来する。
配列
以下の配列の表Ａに示すバリアントは、ハイブリッドチトクロームＰ４５０ ｃｙｐ１５３Ａ１６（Ｇ３０７Ａ）−ＲｅｄＲｈＦ融合タンパク質に基づいている。
（配列の表Ａ）配列番号６に示されるハイブリッドチトクロームＰ４５０ Ｃｙｐ１５３Ａ１６（Ｇ３０７Ａ）−ＲｅｄＲｈＦ融合タンパク質に基づくバリアント
Figure 2018537111
Figure 2018537111
Figure 2018537111
Figure 2018537111
以下の配列の表Ｂに示すバリアントは、ハイブリッドチトクロームＰ４５０ ｃｙｐ１５３Ａ（Ｇ３０７Ａ）−Ｒｅｄ４５０ＲｈＦ（Ａ７９６Ｖ）融合タンパク質に基づいている。
（配列の表Ｂ）配列番号３８に示されるハイブリッドチトクロームＰ４５０ ｃｙｐ１５３Ａ（Ｇ３０７Ａ）−Ｒｅｄ４５０ＲｈＦ（Ａ７９６Ｖ）融合タンパク質に基づくバリアント
Figure 2018537111
Figure 2018537111
Figure 2018537111
Figure 2018537111
Figure 2018537111
Figure 2018537111
以下の配列の表Ｃに示すバリアントは、ハイブリッドチトクロームＰ４５０ ｃｙｐ１５３Ａ（Ｑ１２Ｗ、Ｒ２７Ｌ、Ｋ１１９Ｒ、Ｓ１４０Ｎ、Ｓ１５７Ｒ、Ｖ１５９Ｍ、Ｓ２３３Ｌ、Ａ２４４Ｒ、Ｇ３０７Ａ）−Ｒｅｄ４５０ＲｈＦ（Ａ７９６Ｖ）融合タンパク質（配列番号９８）に基づいている。
（配列の表Ｃ）配列番号９８＊に示されるハイブリッドチトクロームＰ４５０ ｃｙｐ１５３Ａ（Ｑ１２Ｗ、Ｒ２７Ｌ、Ｋ１１９Ｒ、Ｓ１４０Ｎ、Ｓ１５７Ｒ、Ｖ１５９Ｍ、Ｓ２３３Ｌ、Ａ２４４Ｒ、Ｇ３０７Ａ）−Ｒｅｄ４５０ＲｈＦ（Ａ７９６Ｖ）融合タンパク質に基づくバリアント
Figure 2018537111
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＊鋳型配列番号９８におけるいくつかの突然変異は野生型に復帰する。全てのバリアントは、Ｇ３０７Ａ及びＡ７９６Ｖ突然変異（配列番号３８）ならびに追加の突然変異を含有する。
以下の配列の表Ｄに示すバリアントは、ハイブリッドチトクロームＰ４５０ ｃｙｐ１５３Ａ（Ｑ１２Ｗ、Ｒ２７Ｌ、Ｋ１１９Ｒ、Ｓ１４０Ｎ、Ｓ１５７Ｒ、Ｖ１５９Ｍ、Ｓ２３３Ｌ、Ａ２４４Ｒ、Ｇ３０７Ａ）−Ｒｅｄ４５０ＲｈＦ（Ａ７９６Ｖ）融合タンパク質（配列番号９８）に基づいている。この表では、全てのバリアントを（鋳型突然変異を含む）突然変異の完全なリストで示している。
（配列の表Ｄ）配列番号９８＊に示されるハイブリッドチトクロームＰ４５０ ｃｙｐ１５３Ａ（Ｑ１２Ｗ、Ｒ２７Ｌ、Ｋ１１９Ｒ、Ｓ１４０Ｎ、Ｓ１５７Ｒ、Ｖ１５９Ｍ、Ｓ２３３Ｌ、Ａ２４４Ｒ、Ｇ３０７Ａ）−Ｒｅｄ４５０ＲｈＦ（Ａ７９６Ｖ）融合タンパク質に基づくバリアント
Figure 2018537111
Figure 2018537111
＊鋳型配列番号９８におけるいくつかの突然変異は野生型に復帰した。全てのバリアントは、Ｇ３０７Ａ及びＡ７９６Ｖ突然変異（配列番号３８）ならびに追加の突然変異を含有する。
変異及び突然変異
本明細書で使用されるバリアントポリペプチドは、野生型ＣＹＰ１５３Ａまたは鋳型ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドとは少なくとも１つのアミノ酸が異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドのことを言う。例えば、バリアント（例、突然変異体）は、以下の保存的アミノ酸置換、これらに限定されるものではないが、例えば、アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシン等の脂肪族アミノ酸の、別の脂肪族アミノ酸による置換；セリンのスレオニンによる置換；スレオニンのセリンによる置換；例えばアスパラギン酸及びグルタミン酸等の酸性残基の、別の酸性残基による置換；アスパラギン及びグルタミン等のアミド基を有する残基の別のアミド基を有する残基による置換；リジン及びアルギニン等の塩基性残基の、別の塩基性残基との交換；ならびに、フェニルアラニン及びチロシン等の芳香族残基の、別の芳香族残基による置換のうちの、１つ以上を有することができる。いくつかの実施形態において、バリアントポリペプチドは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９９、またはそれを超えるアミノ酸置換、付加、挿入または欠失を有する。本開示は、本開示のＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントの断片を包含し、このような断片は、対応する全長のＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントのように、脂肪酸からω−ヒドロキシル化脂肪酸への変換を触媒する。好ましくは、本開示のこのような断片は、組換え宿主細胞における発現の際に、対応する宿主細胞における、例えば配列番号６または配列番号３８の鋳型ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドの発現により産生されるω−ヒドロキシル化脂肪酸の力価と比較して、より高い力価のω−ヒドロキシル化脂肪酸をもたらす。したがって、本開示のＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントまたは突然変異体の断片は、対応する本開示の全長のＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントまたは突然変異体における生物学的機能（例えば酵素活性、具体的にはω−ヒドロキシラーゼ酵素活性）の一部または全てを保持している。また、本開示により提供されるＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアント断片は、対応する野生型ＣＹＰ１５３Ａポリペプチド、または対応する鋳型ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチド（例えば、配列番号６または配列番号３８のＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチド）における生物学的機能（例えば酵素活性、具体的にはω−ヒドロキシラーゼ酵素活性）の一部または全ても保持している。いくつかの実施形態において、当該断片は、対応する野生型ＣＹＰ１５３Ａポリペプチド、または対応する本開示の全長のＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアント、または対応する鋳型ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドにおける生物学的機能の少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％またはそれ以上を保持している。他の実施形態において、当該断片または突然変異体は、対応する野生型ＣＹＰ１５３Ａポリペプチド、または対応する本開示の全長のＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアント、または対応する鋳型ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドにおける生物学的機能の約１００％を保持している。他の実施形態において、いくつかの断片は、対応する野生型ＣＹＰ１５３Ａポリペプチド、または対応する鋳型ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドと比較して増大した生物学的機能を示す。生物活性に影響を与えることなく、どのアミノ酸残基を置換し、挿入し、または欠失させることができるかを判定するための手引きは、当技術分野において周知のコンピュータプログラム、例えば、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて知ることができる。いくつかの実施形態において、断片は、対応する野生型ＣＹＰ１５３Ａポリペプチド、または対応する鋳型ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドと比較して増大した生物学的機能を示す。例えば、断片は、対応する野生型ＣＹＰ１５３Ａポリペプチド、または対応する鋳型ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドと比較して、酵素活性において少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％または少なくとも９０％の改善を示し得る。他の実施形態において、断片は、対応する野生型ＣＹＰ１５３Ａポリペプチド、または対応する鋳型ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドと比較して、酵素活性の点で少なくとも１００％、少なくとも２００％、または少なくとも５００％の改良を示す。本開示が、上述のように本開示のＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントの断片を包含する事実に従えば、本開示のＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントに関して本明細書に記載される全ての構造的及び機能的な技術的特性が、本開示のＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントの断片にも当てはまることは、本明細書において、本開示のＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントの構造的及び機能的な技術的特性が記載されている各箇所でこのような断片が明示的に言及されないことがあっても、明示的に理解される必要がある。
本明細書に記載されるポリペプチドが、ポリペプチドの機能に実質的な影響を及ぼさないさらなる保存的または非必須のアミノ酸置換を有してもよいことが理解される。当技術分野において公知のように、ある特定の置換が許容される（即ち、ω−ヒドロキシラーゼ酵素活性等の所望の生物学的機能に有害な影響を及ぼさない）か否かを判定することができる（Ｂｏｗｉｅ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４７：１３０６−１３１０参照）。保存的アミノ酸置換とは、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基によって置換されたものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野において定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖（例、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分枝側鎖（例、スレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖（例、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸が含まれる。
バリアントは、天然に存在してもよく、またはインビトロで作り出してもよい。特に、このようなバリアントは、部位指定突然変異誘発、ランダム化学的突然変異誘発、エキソヌクレアーゼIII欠失手順、または標準的なクローニング手法等の遺伝子工学技術を用いて作製することができる。或いは、このようなバリアント、突然変異体、断片、類似体または誘導体を、化学合成または改変手順を用いて作製することもできる。バリアントの作製方法は当技術分野において周知である。例えば、バリアントは、ランダム突然変異誘発及び部位指定突然変異誘発を用いることによって調製することができる。ランダム突然変異誘発及び部位指定突然変異誘発は、当技術分野において広く知られている（例えば、Ａｒｎｏｌｄ（１９９３）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．４：４５０−４５５参照）。ランダム突然変異誘発は、エラープローンＰＣＲ（例えば、Ｌｅｕｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９８９），Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，１：１１−１５；及びＣａｌｄｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．（１９９２）ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌｉｃ，２：２８−３３参照）を用いて達成することができる。エラープローンＰＣＲでは、ＰＣＲ産物の全長に沿って高い点突然変異率が得られるように、ＤＮＡポリメラーゼの複製忠実度（ｃｏｐｙｉｎｇ ｆｉｄｅｌｉｔｙ）が低くなる条件下で実際のＰＣＲを行う。簡潔に述べると、このような手法では、突然変異誘発させる核酸（例えば、Ｐ４５０タンパク質またはＰ４５０ハイブリッド融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列）を、ＰＣＲ産物の全長にわたって高い点突然変異率を得るために、ＰＣＲプライマー、反応緩衝液、ＭｇＣｌ２、ＭｎＣｌ２、Ｔａｑポリメラーゼ、及び適当な濃度のｄＮＴＰと混合する。例えば、反応は、２０ｆｍｏｌの突然変異誘発させる核酸、３０ｐｍｏｌの各ＰＣＲプライマー、５０ｍＭＫＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ ８．３）、０．０１％ゼラチン、７ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．５ｍＭ ＭｎＣｌ２、５単位のＴａｑポリメラーゼ、０．２ｍＭ ｄＧＴＰ、０．２ｍＭ ｄＡＴＰ、１ｍＭ ｄＣＴＰ、及び１ｍＭ ｄＴＴＰを含む反応緩衝液を用いて行うことができる。ＰＣＲは、９４℃で１分、４５℃で１分、及び７２℃で１分を３０サイクル行うことができる。しかしながら、これらのパラメータを適宜変更し得ることは当業者に理解されるであろう。その後、突然変異誘発した核酸を適切なベクター中にクローニングし、突然変異誘発した核酸によってコードされるポリペプチドの活性を評価する。部位指定突然変異誘発は、クローニングされた対象のＤＮＡ中に部位特異的突然変異を発生させるためにオリゴヌクレオチド指定突然変異誘発を用いて達成することができる。オリゴヌクレオチド突然変異誘発は当技術分野において記載されている（例えば、Ｒｅｉｄｈａａｒ−Ｏｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４１：５３−５７参照）。簡潔に言うと、このような手順では、クローニングされたＤＮＡ中に導入しようとする１つ以上の突然変異を有する複数の二本鎖オリゴヌクレオチドを合成し、突然変異誘発させるクローニングされたＤＮＡ（例、Ｐ４５０ポリペプチドまたはＰ４５０ハイブリッド融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列）中に挿入する。突然変異誘発されたＤＮＡを含有するクローンを回収し、これらがコードするポリペプチドの活性を評価する。
バリアントを作り出す別の方法は、アセンブリＰＣＲである。アセンブリＰＣＲでは、小さなＤＮＡ断片の混合物からのＰＣＲ産物のアセンブリが行われる。同一のバイアル内で多数の異なるＰＣＲ反応が並行して起こり、ある反応の産物が別の反応の産物をプライミングする（米国特許第５，９６５，４０８号参照）。バリアントを作製するなお別の方法は、セクシャルＰＣＲ突然変異誘発である。セクシャルＰＣＲ突然変異誘発では、ＤＮＡ分子のランダム断片化の結果として、異なってはいるが類似性の高いＤＮＡ配列のＤＮＡ分子間で、配列相同性に基づき、強制的な相同組換えがインビトロで起こる。これに続いて、ＰＣＲ反応におけるプライマー伸長により組換え（ｃｒｏｓｓｏｖｅｒ）の固定が行われる。セクシャルＰＣＲ突然変異誘発は、当技術分野で公知の刊行物に記載されている（例、Ｓｔｅｍｍｅｒ，（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．，９１：１０７４７−１０７５１参照）。バリアントは、インビボ突然変異誘発によって作製することもできる。いくつかの態様においては、ＤＮＡ修復経路の１つ以上に突然変異を有する大腸菌株等の細菌株において配列を伝搬させることにより、核酸配列中にランダム突然変異を生じさせる。このようなミューテーター（ｍｕｔａｔｏｒ）菌株は、野生型菌株よりも高いランダム突然変異率を有する。これらの菌株の１つでＤＮＡ配列（例、Ｐ４５０ハイブリッド融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列）を伝搬させることにより、最終的にＤＮＡ内にランダム突然変異を生じさせる。インビボ突然変異誘発において好適に使用されるミューテーター菌株は、当技術分野の刊行物に記載されている（例えば、国際特許出願公開第ＷＯ１９９１／０１６４２７号参照）。また、バリアントはカセット突然変異誘発を用いて作製することもできる。カセット突然変異誘発では、二本鎖ＤＮＡ分子の小さな領域を、生来の配列とは異なる合成オリゴヌクレオチドカセットで置き換える。オリゴヌクレオチドは、多くの場合、完全及び／または部分的にランダム化された生来の配列を含有する。また、リカーシブ・アンサンブル（ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ ｅｎｓｅｍｂｌｅ）突然変異誘発を、バリアントの作製に用いることもできる。リカーシブ・アンサンブル突然変異誘発は、メンバーのアミノ酸配列が異なる、表現型が関連する突然変異体の多様な集団を作製するために開発されたタンパク質工学（即ち、タンパク質突然変異誘発）のアルゴリズムである。この方法では、フィードバック機構を用いて、連続的に繰り返されるコンビナトリアルカセット突然変異誘発を制御する（例えば、Ａｒｋｉｎ ｅｔ ａｌ，（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．,８９：７８１１−７８１５参照）。いくつかの実施形態においては、エクスポネンシャル・アンサンブル突然変異誘発を用いてバリアントが作製される。エクスポネンシャル・アンサンブル突然変異誘発は、特有で機能的な突然変異体を高いパーセンテージで有するコンビナトリアルライブラリーを作製するための工程であり、この工程では、少数の残基群を並行してランダム化して、変更された各位置で機能的タンパク質をもたらすアミノ酸を同定する（例えば、Ｄｅｌｅｇｒａｖｅ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｒｅｓ，１１：１５４８−１５５２参照）。いくつかの実施形態においては、シャフリング手順を用いてバリアントが作製され、この手順では、別個のポリペプチドをコードする複数の核酸の部分を相互に融合させて、キメラポリペプチドをコードするキメラ核酸配列を作り出す（例えば、米国特許第５，９６５，４０８号及び第５，９３９，２５０号に記載されている）。
モチーフ及び構造
ＣＹＰ１５３Ａ（Ｇ３０７Ａ）突然変異体の同定及びキャラクタリゼーションについてはＨｏｎｄａ Ｍａｌｃａ ｅｔ ａｌ．（上記）に記載されており、筆者らはＣＹＰ１５３Ａにおける潜在的な基質相互作用残基について研究した。Ｈｏｎｄａ Ｍａｌｃａらは、構造に基づく分析を実施し、側鎖によってヘム中心に向いているアミノ酸を含有するために活性化酸素の攻撃中に全ての基質分子と接触していると予想される構造的要素における主要な残基の同定に焦点を絞った。その目的で、位置Ｇ３０７が２つのホットスポット位置の１つとして同定された。これはタンパク質構造から同定することができ、また先述のＣＹＰ１５３Ａ６用に構築した相同性モデルの活性部位の一部でもある。一方、本開示は、生成物の出力を改良する試みの一環としてのランダム突然変異の生成に基づいている（下記の表５〜１１に示される飽和ライブラリーについての実施例を参照）。例えば、配列番号９８のバリアントは、（Ｇ３０７Ａ及びＡ７９６Ｖ突然変異を有する）配列番号３８に基づき、Ｑ１２Ｗ、Ｒ２７Ｌ、Ｋ１１９Ｒ、Ｓ１４０Ｎ、Ｓ１５７Ｒ、Ｖ１５９Ｍ、Ｓ２３３Ｌ及びＡ２４４Ｒを含む追加の突然変異を有し、これらの突然変異はいずれも、３次元モデリングに基づいたＣＹＰ１５３Ａドメインの活性部位には位置しない（図６参照）。
ＣＹＰ１５３Ａは球状タンパク質であり、その触媒活性部位は、基質ヒドロキシル化の化学作用が発生するヘム基に隣接したアミノ酸残基を含む。図５は、ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチド内のレダクターゼドメインの隣にあるＣＹＰ１５３Ａ触媒ドメインを描写している。位置Ｇ３０７は、活性部位におけるヘムに極めて近接している。しかしながら、本開示は、タンパク質の活性部位において必要ではない特定の位置、例えば、配列番号３８の位置１２、２７、２８、１１９、１４１、１５７、１５９、２３１、２３３、及び２４４；配列番号３８の位置１２、２８、１１９、１４０、１５７、１５９、２３３、２４４、２５４、及び４０７；配列番号３８の位置１２、２７、１１１、１１９、１４１、１５７、１５９、２３１、２３３、２４４、及び２５４；配列番号３８の位置１２、２８、１１９、１４０、１４９、１５７、１５９、２３１、２３３、及び４０７；配列番号３８の位置１２、２７、２８、１１９、１４０、１５７、１５９、２３３、２４４、及び４０７；配列番号３８の位置１０、１１、１２、２８、１１９、１４１、１５９、２３１、２３３、２４４、及び４０７；配列番号３８の位置１１、１２、２７、２８、１１９、１４１、１５７、１５９、１９７、２３１、２３３、２４４、４０７、及び４７７；配列番号３８の位置１１、１２、２８、１１９、１４１、１５７、１５９、１９７、２３１、２３３、２４４、及び４０７；ならびに／または配列番号３８の位置１１、１２、２７、２８、１１９、１４１、１４９、１５７、１５９、２３１、２３３、及び４０７を突然変異させると、ＣＹＰ１５３Ａの触媒特性が改良され得ることを示している。触媒特性を改良する特定のバリアントの例は、Ｑ１２Ｗ、Ｒ２７Ｌ、Ｑ２８Ｍ、Ｋ１１９Ｒ、Ｖ１４１Ｔ、Ｓ１５７Ｒ、Ｖ１５９Ｍ、Ａ２３１Ｙ、Ｓ２３３Ｌ、Ａ２４４Ｒ（配列番号１６６）；Ｑ１２Ｗ、Ｑ２８Ｍ、Ｋ１１９Ｒ、Ｓ１４０Ｎ、Ｓ１５７Ｒ、Ｖ１５９Ｍ、Ｓ２３３Ｌ、Ａ２４４Ｒ、Ｒ２５４Ｇ、Ｎ４０７Ｇ（配列番号１６８）；Ｑ１２Ｗ、Ｒ２７Ｌ、Ｆ１１１Ａ、Ｋ１１９Ｒ、Ｖ１４１Ｔ、Ｓ１５７Ｒ、Ｖ１５９Ｍ、Ａ２３１Ｙ、Ｓ２３３Ｌ、Ａ２４４Ｒ、Ｒ２５４Ｇ（配列番号１７０）；Ｑ１２Ｗ、Ｑ２８Ｍ、Ｋ１１９Ｒ、Ｓ１４０Ｎ、Ｐ１４９Ｇ、Ｓ１５７Ｒ、Ｖ１５９Ｍ、Ａ２３１Ｙ、Ｓ２３３Ｌ、Ｎ４０７Ｇ（配列番号１７２）；Ｑ１２Ｗ、Ｒ２７Ｌ、Ｑ２８Ｍ、Ｋ１１９Ｒ、Ｓ１４０Ｎ、Ｓ１５７Ｒ、Ｖ１５９Ｍ、Ｓ２３３Ｌ、Ａ２４４Ｒ、Ｎ４０７Ｇ（配列番号１７４）；Ｄ１０Ｙ、Ｉ１１Ｌ、Ｑ１２Ｗ、Ｑ２８Ｍ、Ｋ１１９Ｒ、Ｖ１４１Ｔ、Ｖ１５９Ｍ、Ａ２３１Ｙ、Ｓ２３３Ｌ、Ａ２４４Ｒ、Ｎ４０７Ｇ（配列番号１７６）；Ｉ１１Ｌ、Ｑ１２Ｗ、Ｒ２７Ｌ、Ｑ２８Ｍ、Ｋ１１９Ｒ、Ｖ１４１Ｔ、Ｓ１５７Ｒ、Ｖ１５９Ｍ、Ａ１９７Ｔ、Ａ２３１Ｙ、Ｓ２３３Ｌ、Ａ２４４Ｒ、Ｎ４０７Ｇ、Ｐ４７７Ｇ（配列番号１７８）；Ｉ１１Ｌ、Ｑ１２Ｗ、Ｑ２８Ｍ、Ｋ１１９Ｒ、Ｖ１４１Ｔ、Ｓ１５７Ｒ、Ｖ１５９Ｍ、Ａ１９７Ｔ、Ａ２３１Ｙ、Ｓ２３３Ｌ、Ａ２４４Ｒ、Ｎ４０７Ｇ（配列番号１８０）；及びＩ１１Ｌ、Ｑ１２Ｗ、Ｒ２７Ｌ、Ｑ２８Ｍ、Ｋ１１９Ｒ、Ｖ１４１Ｔ、Ｐ１４９Ｇ、Ｓ１５７Ｒ、Ｖ１５９Ｍ、Ａ２３１Ｙ、Ｓ２３３Ｌ、Ｎ４０７Ｇ（配列番号１８２）である。
宿主細胞
組換え宿主細胞によるω−ＯＨの産生を増大させる戦略には、産生宿主においてＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合遺伝子及びチオエステラーゼ遺伝子の発現による脂肪酸生合成経路の通過フラックスの増大が含まれる。本明細書で用いられるとき、組換え宿主細胞または操作された宿主細胞という用語は、例えば、新たな遺伝因子の意図的導入、及び／または宿主細胞内に天然に存在する遺伝因子の意図的改変によって、対応する野生型宿主細胞に比べて遺伝子構成が変更された宿主細胞を指す。このような組換え宿主細胞の子孫も、これらの新しい及び／または改変された遺伝因子を含有する。本明細書に記載の本開示の任意の態様において、宿主細胞は、植物細胞、昆虫細胞、真菌細胞（例、カンジダ属の種（Ｃａｎｄｉｄａ ｓｐ．）等の糸状菌、またはサッカロマイセス属の種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）等の出芽酵母）、藻類細胞及び細菌細胞より選択され得る。１つの実施形態において、組換え宿主細胞は、組換え微生物である。微生物である宿主細胞の例としては、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、フミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、リゾムコール（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ）、クリベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）、ミセリオフトラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｏｒａ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ファネロカエテ（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ）、プレロータス（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ）、トラメテス（Ｔｒａｍｅｔｅｓ）、クリソスポリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ステノトロホモナス（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈａｍｏｎａｓ）、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、またはストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に由来する細胞を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。いくつかの実施形態において、宿主細胞はグラム陽性細菌細胞である。他の実施形態において、宿主細胞はグラム陰性細菌細胞である。いくつかの実施形態において、宿主細胞は大腸菌細胞である。いくつかの実施形態において、宿主細胞は大腸菌 Ｂ細胞、大腸菌 Ｃ細胞、大腸菌 Ｋ細胞、または大腸菌 Ｗ細胞である。他の実施形態において、宿主細胞は、バチルス・レンタス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｎｔｕｓ）細胞、バチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）細胞、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）細胞、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｏｆｏｒｍｉｓ）細胞、バチルス・アルカロフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）細胞、バチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）細胞、バチルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）細胞、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｉｓ）細胞、バチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）細胞、バチルス・クラウジイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｌａｕｓｉｉ）細胞、バチルス・メガテリウム細胞、枯草菌細胞、またはバチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）細胞である。他の実施形態において、宿主細胞は、トリコデルマ・コニンギ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｋｏｎｉｎｇｉｉ）細胞、トリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅ）細胞、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）細胞、トリコデルマ・ロンギブラキアタム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）細胞、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ）細胞、アスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｅｓ）細胞、アスペルギルス・フェティデュス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｏｅｔｉｄｕｓ）細胞、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）細胞、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）細胞、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）細胞、フミコーラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ）細胞、フミコーラ・ラヌギノーサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｌａｎｕｇｉｎｏｓｅ）細胞、ロドコッカス・オパカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｏｐａｃｕｓ）細胞、リゾムコール・ミーヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）細胞、またはムコール・ミーヘイ（Ｍｕｃｏｒ ｍｉｃｈｅｉ）細胞である。さらに他の実施形態において、宿主細胞は、ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）細胞またはストレプトマイセス・ムリナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｍｕｒｉｎｕｓ）細胞である。さらに他の実施形態において、宿主細胞はアクチノマイセス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）細胞である。いくつかの実施形態において、宿主細胞はサッカロマイセス・セレビシエ細胞である。
他の実施形態において、宿主細胞は、真核植物細胞、藻類細胞、藍色細菌細胞、緑色硫黄細菌細胞、緑色非硫黄細菌細胞、紅色硫黄細菌細胞、紅色非硫黄細菌細胞、好極限性細菌細胞、酵母細胞、真菌細胞、本明細書に記載された生物のいずれかの操作された細胞または合成生物の操作細胞である。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、光依存性であるか、或いは炭素を固定する。いくつかの実施形態において、宿主細胞は独立栄養活性を有する。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、光の存在下等において光独立栄養活性を有する。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、光の非存在下において従属栄養性または混合栄養性である。ある特定の実施形態において、宿主細胞は、シロイヌナズナ、スイッチグラス（Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍ）、ジャイアントミスカンサス（Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ ｇｉｇａｎｔｅｕｓ）、トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）、ボツリオコッカス・ブラウニー（Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓｅ ｂｒａｕｎｉｉ）、コナミドリムシ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）、ドナリエラ・サリナ（Ｄｕｎａｌｉｅｌａ ｓａｌｉｎａ）、シネココッカス属の種（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）ＰＣＣ７００２、シネココッカス属の種ＰＣＣ７９４２、シネコシスティス属の種（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．）ＰＣＣ ６８０３、サーモシネココッカス・エロンガタス（Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｅｌｏｎｇａｔｅｓ）ＢＰ−１、クロロビウム・テピダム（Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ ｔｅｐｉｄｕｍ）、クロロフレクサス・オウランティアカス（Ｃｈｌｏｒｏｊｌｅｘｕｓ ａｕｒａｎｔｉｃｕｓ）、クロマチウム・ビノサム（Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍｍ ｖｉｎｏｓｕｍ）、ロドスピリラム・ラブラム（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｒｕｂｒｕｍ）、ロドバクター・カプスラータ（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ）、ロドシュードモナス・パルストリス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐａｌｕｓｒｉｓ）、クロストリジウム・リュングダリイ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ）、クロストリジウム・サーモセラム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）、ペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、サッカロマイセス・セレビシエ、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、シュードモナス・フルオレセンス、またはザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）に由来する細胞である。１つの態様において、微生物細胞は、プロクロロコッカス（Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ）、シネココッカス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）、シネコシスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）、シアノセイス（Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ）、及びノストック・パンクチフォルメ（Ｎｏｓｔｏｃ ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ）を含むがこれらに限定されないシアノバクテリアに由来する。別の実施形態において、微生物細胞は、シネココッカス・エロンガタス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｅｌｏｎｇａｔｕｓ）ＰＣＣ７９４２、シネコシスティス属の種ＰＣＣ６８０３、及びシネココッカス属の種ＰＣＣ７００１を含むがこれらに限定されない特定のシアノバクテリア種に由来する。
発現ベクター
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド（または遺伝子）配列が、ポリヌクレオチド配列と機能的に連結したプロモーターを含む組換えベクターにより、宿主細胞に与えられる。ある特定の実施形態において、プロモーターは、発生調節性の、オルガネラ特異的な、組織特異的な、誘導性の、構成的な、または細胞特異的なプロモーターである。いくつかの実施形態において、組換えベクターは、ポリヌクレオチド配列と機能的に結合した発現制御配列；ポリヌクレオチド配列と機能的に結合した選択マーカー；ポリヌクレオチド配列と機能的に結合したマーカー配列；ポリヌクレオチド配列と機能的に結合した精製部分；ポリヌクレオチド配列と機能的に結合した分泌配列；及びポリヌクレオチド配列と機能的に結合したターゲティング配列より選択される、少なくとも1つの配列を含む。本明細書に記載の発現ベクターは、ポリヌクレオチド配列を、宿主細胞においてこのポリヌクレオチド配列を発現するのに適した形態で含む。当業者には、発現ベクターの設計は、形質転換させようとする宿主細胞の選択、及び所望のポリペプチドの発現レベル等の要因に依存することが理解されるであろう。上述のポリヌクレオチド配列（上記）によってコードされる、融合ポリペプチド等のポリペプチドを産生させるために、本明細書に記載の発現ベクターは宿主細胞に導入することができる。原核生物、例えば大腸菌のポリペプチドをコードする遺伝子の発現は、融合または非融合ポリペプチドの発現を導く構成的または誘導性プロモーターを含有するベクターを用いて実施されることが最も多い。融合ベクターは、その中にコードされているポリペプチド、通常は組換えポリペプチドのアミノ末端またはカルボキシ末端に、いくつかのアミノ酸を付加する。このような融合ベクターは、一般に、組換えポリペプチドの発現の増大；組換えポリペプチドの溶解性の増大；及びアフィニティー精製においてリガンドとして作用することによる組換えポリペプチドの精製への援助、を含む３つの目的の１つ以上に役立つ。融合発現ベクターでは、しばしば、融合部分と組換えポリペプチドの接合部にタンパク質分開裂部位が導入されている。これにより、融合ポリペプチドの精製後に、融合部分からの組換えポリペプチドの分離が可能になる。このような酵素及びそれらの同族認識配列の例としては、第Ｘａ因子、トロンビン及びエンテロキナーゼが含まれる。具体的な融合発現ベクターとしては、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ；Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｇｅｎｅ ６７：３１−４０）、ｐＭＡＬベクター（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）、及びｐＲＩＴＳベクター（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）を挙げることができ、これらはそれぞれ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質またはタンパク質Ａを標的組換えポリペプチドと融合させる。
誘導性非融合大腸菌発現ベクターの例としては、ｐＴｒｃベクター（Ａｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｇｅｎｅ ６９：３０１−３１５）及びｐＥＴ １１ｄベクター（Ｓｔｕｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）６０−８９）が挙げられる。ｐＴｒｃベクターからの標的遺伝子発現は、ハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃ融合プロモーターからの宿主ＲＮＡポリメラーゼ転写に依存している。ｐＥＴ １１ｄベクターからの標的遺伝子発現は、共発現させたウイルスＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７ ｇｎ１）を介して行われるＴ７ ｇｎ１０−ｌａｃ融合プロモーターからの転写に依存している。このウイルスポリメラーゼは、ＢＬ２１（ＤＥ３）またはＨＭＳ１７４（ＤＥ３）等の宿主菌株により、ｌａｃＵＶ ５プロモーターの転写制御下にＴ７ ｇｎ１遺伝子を保有する常在性λプロファージから供給される。原核細胞及び真核細胞の両者に適した発現系は、当技術分野において周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙを参照）。誘導性の非融合大腸菌発現ベクターの例としては、ｐＴｒｃベクター（Ａｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｇｅｎｅ，６９：３０１−３１５）及びＰＥＴ １１ｄベクター（Ｓｔｕｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ｐｐ．６０−８９）が含まれる。ある特定の実施形態において、本開示のポリヌクレオチド配列は、バクテリオファージＴ５由来のプロモーターと機能的に連結されている。１つの実施形態において、宿主細胞は酵母細胞である。この実施形態において、発現ベクターは酵母発現ベクターである。ベクターは、外来性核酸（例、ＤＮＡ）を宿主細胞に導入する当該技術分野で認識された様々な手法を介して原核細胞または真核細胞に導入することができる。宿主細胞の形質転換またはトランスフェクションをするために適した方法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（上記）に見られる。細菌細胞の安定的な形質転換に関しては、（用いる発現ベクター及び形質転換手法に応じて）細胞のある特定の割合が発現ベクターを取り込んで複製することが知られている。これらの形質転換体を同定及び選択するために、選択マーカー（例、抗生物質に対する耐性）をコードする遺伝子を、対象の遺伝子と共に宿主細胞に導入することができる。選択マーカーとしては、これらには限定されないが、アンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール、またはテトラサイクリン等の、薬に対する耐性を付与するものが挙げられる。選択マーカーをコードする核酸は、本明細書に記載のポリペプチドをコードするのと同じのベクター上で宿主細胞中に導入することができ、または別個のベクター上で導入することもできる。
任意の経路操作
本開示の宿主細胞または微生物は、酵素活性に対する特定の突然変異の効率を試験するために変更を含むように遺伝子操作されたまたは改変された宿主菌株または宿主細胞（即ち、組換え細胞または微生物）を包含する。どの生来の酵素経路が元の宿主細胞に存在しているかに応じて、様々な任意選択的な遺伝的操作及び変更を、種々の宿主細胞に区別なく用いることができる。１つの実施形態において、宿主菌株は、他の生合成ポリペプチド（例、酵素）と組み合わせてＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントの発現を試験するために用いることができる。宿主菌株は、発酵の構成成分、炭素源（例、原料）、温度、圧力、低減された培養汚染条件及び酸素レベル等(これらに限定さないが)の培養条件を含む、特定の変数を試験するためのいくつかの遺伝的変異を包含し得る。
１つの実施形態において、宿主菌株は、任意でｆａｄＥ及びｆｈｕＡの欠失を含む。アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＦａｄＥ）は、脂肪酸を代謝するために重要な酵素である。これは、脂肪酸（アシル−ＣｏＡ）の長鎖を分解してアセチル−ＣｏＡ分子にする過程である、脂肪酸利用における第２のステップ（β−酸化）を触媒する。より具体的には、細菌における脂肪酸分解のβ−酸化サイクルの第２ステップは、アシル−ＣｏＡの２−エノイル−ＣｏＡへの酸化であり、これはＦａｄＥによって触媒される。大腸菌がＦａｄＥを欠損していると、脂肪酸を炭素源として増殖することができないが、酢酸塩によって増殖することはできる。どのような鎖長を有する脂肪酸も利用できないことは、ｆａｄＥ菌株の報告されている表現型、即ち、ＦａｄＥ機能が破壊されたｆａｄＥ突然変異体株とも合致している。脂肪酸誘導体経路の中間体と考えられるアシル−ＣｏＡが、全てのアシル−ＣｏＡが脂肪酸誘導体へと効率的に変換されうるように、細胞内に蓄積できることを確かめるために、ｆａｄＥ遺伝子を任意に不活性化または低減させることができる。しかしながら、糖が炭素源として用いられる場合にはｆａｄＥの低減は任意である。なぜなら、そのような条件下ではＦａｄＥの発現が抑制されがちであり、そのためＦａｄＥが少量でしか存在せず、エステルシンターゼまたはアシル−ＣｏＡ基質の他の酵素と効率的に競合し得ないと考えられるからである。ＦａｄＥは異化代謝産物抑制が原因で抑制される。大腸菌及び他の多くの微生物は脂肪酸よりも糖を消費することを好むため、両方の供給源が利用可能である場合には、ｆａｄレギュロンを抑制することにより糖が最初に消費される（Ｄ． Ｃｌａｒｋ， Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９８１）１４８（２）：５２１−６）参照）。加えて、糖の欠如及び脂肪酸の存在によってＦａｄＥ発現が誘導される。ｆａｄレギュロン（ＦａｄＥを含む）によって発現されるタンパク質がアップレギュレートされ、アシル−ＣｏＡについて効率的に競合すると考えられるので、β酸化経路に対しアシル−ＣｏＡ中間体が失われるであろう。したがって、ｆａｄＥ遺伝子を不活性化または低減させることは有益となりうる。ほとんどの炭素源は主として糖を基礎としているため、ＦａｄＥを低減させることは任意である。遺伝子ｆｈｕＡは、大腸菌の外膜にあるエネルギー共役輸送体及び受容体であるＴｏｎＡタンパク質をコードする（Ｖ． Ｂｒａｕｎ（２００９）Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９１（１１）：３４３１−３４３６）。その欠失は任意である。ｆｈｕＡ欠失により、細胞をファージ攻撃に対してより抵抗性にすることができ、これはある特定の発酵条件では有益となり得る。したがって、発酵実行中に汚染可能性のある宿主細胞では、ｆｈｕＡを欠失させることが望ましいであろう。
別の実施形態において、宿主菌株（上記）は、以下の、ｆａｄＲ、ｆａｂＡ、ｆａｂＤ、ｆａｂＧ、ｆａｂＨ、ｆａｂＶ及び／またはｆａｂＦ等の遺伝子のうち１つ以上の任意の過剰発現も含む。このような遺伝子の例としては、大腸菌由来のｆａｄＲ、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）由来のｆａｂＡ（ＮＰ＿４６００４１）、ネズミチフス菌由来のｆａｂＤ（ＮＰ＿４６０１６４）、ネズミチフス菌由来のｆａｂＧ（ＮＰ＿４６０１６５）、ネズミチフス菌由来のｆａｂＨ（ＮＰ＿４６０１６３）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａ）由来のｆａｂＶ（ＹＰ＿００１２１７２８３）、及びクロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）由来のｆａｂＦ（ＮＰ＿３５０１５６）がある。脂肪酸生合成における酵素及び調節因子をコードするこれらの遺伝子のうち１つ以上の過剰発現は、ω−ＯＨ脂肪酸及びその誘導体を含む脂肪酸誘導体化合物の力価を様々な培養条件下で増大させるために役立ち得る。
別の実施形態において、ω−ＯＨ脂肪酸及びその誘導体の産生のための宿主細胞として大腸菌株が用いられる。同様に、これらの宿主細胞も、ｆａｄＲ、ｆａｂＡ、ｆａｂＤ、ｆａｂＧ、ｆａｂＨ、ｆａｂＶ及び／またはｆａｂＦ(これらに限定されない)を含む様々な培養条件下で脂肪酸誘導体（例、ω−ＯＨ脂肪酸及びα,ω−二酸など）等の脂肪酸誘導体化合物の力価をさらに増大、即ち向上させることができる、１つ以上の生合成遺伝子（即ち、脂肪酸生合成の酵素及び調節因子をコードする遺伝子）の任意の過剰発現を提供する。遺伝的変異の例としては、大腸菌由来のｆａｄＲ、ネズミチフス菌由来のｆａｂＡ（ＮＰ＿４６００４１）、ネズミチフス菌由来のｆａｂＤ（ＮＰ＿４６０１６４）、ネズミチフス菌由来のｆａｂＧ（ＮＰ＿４６０１６５）、ネズミチフス菌由来のｆａｂＨ（ＮＰ＿４６０１６３）、コレラ菌由来のｆａｂＶ（ＹＰ＿００１２１７２８３）、及びクロストリジウム・アセトブチリカム由来のｆａｂＦ（ＮＰ＿３５０１５６）が挙げられる。いくつかの実施形態においては、様々な培養条件下でのＰ４５０発現を試験するため、及び／またはω−ＯＨ脂肪酸及びα，ω−二酸の産生をさらに強化するために、これらの生合成遺伝子を有する合成オペロンを操作して、細胞において発現させることができる。このような合成オペロンは、１つ以上の生合成遺伝子を含むことができる。操作されたオペロンは、特定の培養条件について試験するために、脂肪酸誘導体の過剰発現を促進するために用いることのできる、コレラ菌由来のｆａｂＶ、ネズミチフス菌由来のｆａｂＨ、ネズミチフス菌（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）由来のｆａｂＤ、ネズミチフス菌由来のｆａｂＧ、ネズミチフス菌由来のｆａｂＡ及び／またはクロストリジウム・アセトブチリカム由来のｆａｂＦ等の任意の脂肪酸生合成遺伝子を含むことができる。このような合成オペロンの１つの利点は、ω−ＯＨ脂肪酸誘導体産生の速度をさらに増大、即ち向上させ得ることである。
いくつかの実施形態において、ＡＣＰ及び生合成酵素（例、ω−ヒドロキシラーゼ、チオエステラーゼ、など）を発現させるために用いられる宿主細胞または微生物は、ω−ＯＨ脂肪酸、ω−ＯＨ脂肪酸誘導体、α，ω−二酸等の１つ以上の特定の脂肪酸誘導体の産生を増大させることのできるある特定の酵素活性を含む遺伝子をさらに発現する。１つの実施形態において、宿主細胞は、遺伝子を過剰発現させることによって増大させることのできる脂肪酸の産生のためのチオエステラーゼ活性（Ｅ．Ｃ．３．１．２．＊またはＥ．Ｃ．３．１．２．１４またはＥ．Ｃ．３．１．１．５）を有する。別の実施形態において、宿主細胞は、脂肪エステルの産生のためのエステルシンターゼ活性（Ｅ．Ｃ．２．３．１．７５）を有する。別の実施形態において、宿主細胞は、脂肪アルコールの産生のための、アシル−ＡＣＰレダクターゼ（ＡＡＲ）（Ｅ．Ｃ．１．２．１．８０）活性及び／またはアルコールデヒドロゲナーゼ活性（Ｅ．Ｃ．１．１．１．１．）及び／または脂肪アルコールアシル−ＣｏＡレダクターゼ（ＦＡＲ）（Ｅ．Ｃ．１．１．１．＊）活性及び／またはカルボン酸レダクターゼ（ＣＡＲ）（ＥＣ１．２．９９．６）活性を有する。別の実施形態において、宿主細胞は、脂肪アルデヒドの産生のためのアシル−ＡＣＰレダクターゼ（ＡＡＲ）（Ｅ．Ｃ．１．２．１．８０）活性を有する。別の実施形態において、宿主細胞は、アルカン及びアルケンの産生のためのアシル−ＡＣＰレダクターゼ（ＡＡＲ）（Ｅ．Ｃ．１．２．１．８０）活性及びデカルボニラーゼ（ＡＤＣ）活性を有する。別の実施形態において、宿主細胞は、脂肪アルコールの産生のための、アシル−ＣｏＡレダクターゼ（Ｅ．Ｃ．１．２．１．５０）活性、アシル−ＣｏＡシンターゼ（ＦａｄＤ）（Ｅ．Ｃ．２．３．１．８６）活性及びチオエステラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．２．＊またはＥ．Ｃ．３．１．２．１４またはＥ．Ｃ．３．１．１．５）活性を有する。別の実施形態において、宿主細胞は、脂肪エステルの産生のための、エステルシンターゼ活性（Ｅ．Ｃ．２．３．１．７５）、アシル−ＣｏＡシンターゼ（ＦａｄＤ）（Ｅ．Ｃ．２．３．１．８６）活性及びチオエステラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．２．＊またはＥ．Ｃ．３．１．２．１４またはＥ．Ｃ．３．１．１．５）活性を有する。別の実施形態において、宿主細胞はケトンの産生のためのＯｌｅＡ活性を有する。別の実施形態において、宿主細胞は、内部オレフィンの産生のためのＯｌｅＢＣＤ活性を有する。別の実施形態において、宿主細胞は、脂肪アルコールの産生のためのアシル−ＡＣＰレダクターゼ（ＡＡＲ）（Ｅ．Ｃ．１．２．１．８０）活性及びアルコールデヒドロゲナーゼ活性（Ｅ．Ｃ．１．１．１．１．）を有する。別の実施形態において、宿主細胞は、末端オレフィンの生成のためのチオエステラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．２．＊またはＥ．Ｃ．３．１．２．１４またはＥ．Ｃ．３．１．１．５）活性及びデカルボキシラーゼ活性を有する。微生物及び微生物細胞における酵素活性の発現は、米国特許第８，０９７，４３９号；第８，１１０，０９３号；第８，１１０，６７０号；第８，１８３，０２８号；第８，２６８，５９９号；第８，２８３，１４３号；第８，２３２，９２４号；第８，３７２，６１０号；及び第８，５３０，２２１号により教示されており、それらは参照により本明細書に組み入れられる。他の実施形態において、ＡＣＰ及び他の生合成酵素を発現させるために用いられる宿主細胞または微生物は、ω−ＯＨ脂肪酸、ω−ＯＨ脂肪酸誘導体、及びα，ω−二酸等の１つ以上の特定の脂肪酸誘導体を産生する目的で上方制御（アップレギュレート）または過剰発現される、ある特定の生来の酵素活性を含む。１つの実施形態において、宿主細胞は、チオエステラーゼ遺伝子を過剰発現させることによって増大させることのできる脂肪酸の産生のための生来のチオエステラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．２．＊またはＥ．Ｃ．３．１．２．１４またはＥ．Ｃ．３．１．１．５）活性を有する。
本開示は、ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアント及び他の生合成酵素（上記）をコードする遺伝子を発現する宿主菌株または微生物を包含している。組換え宿主細胞は、脂肪酸誘導体（例えば、ω−ＯＨ脂肪酸、ω−ＯＨ脂肪酸誘導体、α，ω−二酸）、ならびにその組成物及びブレンドを産生する。脂肪酸誘導体は、一般に、培養培地から回収され、及び／または宿主細胞から単離される。１つの実施形態において、脂肪酸誘導体は培養培地から回収される（細胞外）。別の実施形態において、脂肪酸誘導体は宿主細胞から単離される（細胞内）。別の実施形態において、脂肪酸誘導体は、培養培地から回収されて、宿主細胞から単離される。宿主細胞によって産生された脂肪酸誘導体または組成物は、特定の脂肪酸誘導体の分布、ならびにω−ＯＨ脂肪酸、ω−ＯＨ脂肪酸エステル、α，ω−二酸及びその他などのω−ＯＨ脂肪酸誘導体の構成成分の鎖長及び飽和度を決定するために、当技術分野において公知の方法、例えばＧＣ−ＦＩＤを用いて分析することができる。
培養及び発酵
本明細書で使用されるとき、発酵という用語は、組換え宿主細胞の培養物を、炭素源を含む培地中で繁殖させることによる、宿主細胞による有機材料から目的物質への変換、例えば、組換え宿主細胞による炭素源からω−ＯＨ脂肪酸またはその誘導体への変換を広く指す。産生を許容する条件とは、宿主細胞が所望の生成物、例えばω−ＯＨ脂肪酸を産生することを可能にする、あらゆる条件を言う。同様に、ベクターのポリヌクレオチド配列が発現される条件とは、宿主細胞がポリペプチドを合成することを可能にするあらゆる条件を意味する。適当な条件には、例えば、発酵条件が含まれる。発酵条件は、温度範囲、通気レベル、供給速度及び培地組成等、これらに限定されないが、多くのパラメータを含み得る。これらの条件のそれぞれは、個々に、または組み合わせて、宿主細胞が増殖することを可能にする。発酵は、好気性、嫌気性、またはこれらの変形（微好気性等）であり得る。培養培地の例には、ブロスまたはゲルが含まれる。一般に、培地は、宿主細胞によって直接代謝されうる炭素源を含む。加えて、炭素源の可動化（例えば、デンプンまたはセルロースの発酵性糖への解重合）及びその後の代謝を促進するために、培地中に酵素を用いることができる。
小規模産生のために、操作された宿主細胞を、例えば、約１００μＬ、２００μＬ、３００μＬ、４００μＬ、５００μＬ、１ｍＬ、５ｍＬ、１０ｍＬ、１５ｍＬ、２５ｍＬ、５０ｍＬ、７５ｍＬ、１００ｍＬ、５００ｍＬ、１Ｌ、２Ｌ、５Ｌまたは１０Ｌのバッチ中で培養し、発酵させて、所望のポリヌクレオチド配列、例えば、Ｐ４５０ハイブリッド融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を発現するように誘導することができる。大規模産生のためには、操作された宿主細胞を、約１０Ｌ、１００Ｌ、１０００Ｌ、１０，０００Ｌ、１００，０００Ｌ、及び１，０００，０００Ｌまたはそれを超えるバッチ中で培養し、発酵させて、所望のポリヌクレオチド配列を発現するように誘導することができる。或いは、大規模流加発酵を実施することもできる。本明細書に記載のω−ＯＨ脂肪酸、誘導体及びその組成物は、組換え宿主細胞培養物の細胞外環境で見られ、培養培地から容易に単離することができる。ω−ＯＨ脂肪酸またはその誘導体は組換え宿主細胞によって分泌されても、組換え宿主細胞培養物の細胞外環境に輸送されても、組換え宿主細胞培養物の細胞外環境に受動的に移行されてもよい。ω−ＯＨ脂肪酸またはその誘導体は、当技術分野において公知の常法を用いて、組換え宿主細胞培養物から単離される。
組換え宿主細胞由来の生成物
本明細書で用いられるとき、現代炭素率、即ちｆＭは、米国国立標準技術研究所（（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）（ＮＩＳＴ））の標準物質（（Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｍａｔｅｒｉａｌ）（ＳＲＭ））４９９０Ｂ及び４９９０Ｃ（それぞれシュウ酸標準品ＨＯｘＩ及びＨＯｘＩＩとして知られている）、によって定義される意味と同じ意味を有する。基本的定義はＨＯｘＩの1４Ｃ／１２Ｃ同位体比の０．９５倍と関連している（西暦１９５０年を基準）。これは、減衰補正された産業革命前の木とほぼ同一である。現在の生体生物圏（植物材料）については、ｆＭは約１．１である。バイオ生成物（例えば、本開示に従って産生されたω−ＯＨ脂肪酸及び誘導体等の脂肪酸誘導体）は、生物的に産生された有機化合物を含む。特に、本明細書における脂肪酸生合成経路を用いて産生された脂肪酸誘導体（例えば、ω−ＯＨ脂肪酸及びその誘導体）は、これまで再生資源から産生されたことはなく、それ故新規な物の組成物である。これらの新たなバイオ製品は、石油化学炭素由来の有機化合物と、デュアルカーボン同位体フィンガープリント法（ｄｕａｌ ｃａｒｂｏｎ−ｉｓｏｔｏｐｉｃ ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ）または１４Ｃ年代測定法（１４Ｃ ｄａｔｉｎｇ）に基づいて区別することができる。さらに、生物起源炭素の具体的な供給源（例えば、グルコース対グリセロール）を、デュアルカーボン同位体フィンガープリント法によって決定することもできる（例えば、米国特許第７，１６９，５８８号参照）。バイオ製品を石油系有機化合物と区別する能力は、これらの材料の商業目的の追跡に有益である。例えば、生物学に基づく炭素同位体プロファイルと石油系の炭素同位体プロファイルの両方を含む有機化合物または化学物質は、石油系の材料のみで作製された有機化合物及び化学物質と区別することができる。このため、本明細書におけるバイオ生成物は、その固有の炭素同位体プロファイルに基づいて、商業的追跡即ちトラッキングをすることができる。バイオ生成物は、各試料中の安定炭素同位体比（１３Ｃ／１２Ｃ）を比較することにより石油系の有機化合物から区別することができる。既知のバイオ生成物における１３Ｃ／１２Ｃ比は、二酸化炭素が固定されたときの大気中の二酸化炭素における１３Ｃ／１２Ｃ比により生じた結果である。それはまた、厳密な代謝経路も反映する。地域的変動も起こる。石油、Ｃ３植物（広葉植物）、Ｃ４植物（イネ科草本）、及び海洋炭酸塩は全て、１３Ｃ／１２Ｃ及び対応するδ１３Ｃ値において有意な差を示す。さらに、Ｃ３植物及びＣ４植物の脂質物質は、代謝経路の結果として、同じ植物の炭水化物成分から誘導される材料とは異なる分析結果を示す。測定精度内で、１３Ｃは同位体分別効果により大きな変動を示すが、バイオ生成物に関して最も重要なのは光合成機構である。植物における炭素同位体比の相違の主因は、植物における光合成炭素代謝の経路の違い、特に初期のカルボキシル化（即ち、大気ＣＯ２の初期固定）時に起こる反応の相違と密接に関連している。植物の二つの大きな種類は、Ｃ３（即ちカルビン・ベンソン）光合成回路が組み込まれているものと、Ｃ４（即ちハッチ・スラック）光合成回路が組み込まれているものである。Ｃ３植物では、一次ＣＯ２固定またはカルボキシル化反応にリブロース−１，５−二リン酸カルボキシラーゼ酵素が関与し、最初の安定生成物は３−炭素化合物である。広葉樹及び針葉樹等のＣ３植物は、温帯気候帯において優勢である。Ｃ４植物では、別の酵素であるホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼが関与するさらなるカルボキシル化反応が、初期のカルボキシル化反応である。最初の安定炭素化合物は４−炭素酸であり、次いで脱炭酸される。このようにして放出されたＣＯ２は、Ｃ３回路により再び固定される。Ｃ４植物の例としては、熱帯型牧草、トウモロコシ、及びサトウキビがある。Ｃ４植物及びＣ３植物は共に、１３Ｃ／１２Ｃ同位体比の範囲を示すが、一般に、Ｃ４植物については約−７〜約−１３パーミル、Ｃ３植物については約−１９〜約−２７パーミルである（例えば、Ｓｔｕｉｖｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９７７）Ｒａｄｉｏｃａｒｂｏｎ １９：３５５を参照）。石炭及び石油は一般に後者の範囲に含まれる。１３Ｃ測定尺度は、元々ピーディーベレムナイト（Ｐｅｅ Ｄｅｅ Ｂｅｌｅｍｎｉｔｅ（ＰＤＢ））石灰石によって設定されたゼロにより定義されたものであり、この値は、この材料からの千分の一偏差（ｐａｒｔｓ ｐｅｒ ｔｈｏｕｓａｎｄ ｄｅｖｉａｔｉｏｎｓ）で与えられる。δ１３Ｃ値は、千分率（パーミル）で表されて‰略記され、以下のように計算される。
δ１３Ｃ（‰）＝[(１３Ｃ/１２Ｃ)試料−（１３Ｃ／１２Ｃ）標準物質]／（１３Ｃ／１２Ｃ）標準物質×１０００
ＰＤＢ標準物質（ＲＭ）が消費されているので、ＩＡＥＡ、ＵＳＧＳ、ＮＩＳＴ、及び他の選ばれた国際的同位体研究所との協同で、一連の代替ＲＭが開発されている。ＰＤＢからのパーミル偏差の表記がδ１３Ｃである。測定は、ＣＯ２について、質量４４、４５及び４６の分子イオンに関する高精度安定同位体比質量分析（ｈｉｇｈ ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ｓｔａｂｌｅ ｒａｔｉｏ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）（ＩＲＭＳ）により行われる。本明細書に記載の組成物は、本明細書に記載の方法のいずれかにより産生されたバイオ生成物、例えば、脂肪酸誘導体生成物が含まれる。具体的には、バイオ生成物は、約−２８以上、約−２７以上、−２０以上、−１８以上、−１５以上、−１３以上、−１０以上、または−８以上のδ１３Ｃを有することができる。例えば、バイオ生成物は、約−３０〜約−１５、約−２７〜約−１９、約−２５〜約−２１、約−１５〜約−５、約−１３〜約−７、または約−１３〜約−１０のδ１３Ｃを有することができる。他の例では、バイオ生成物は、約−１０、−１１、−１２、または−１２．３のδ１３Ｃを有することができる。本明細書における本開示に従って産生されたバイオ生成物は、各化合物における１４Ｃの量を比較することによって、石油系の有機化合物と区別することもできる。１４Ｃは５７３０年という核半減期を有するので、古い炭素を含有する石油系燃料を、新しい炭素を含有するバイオ生成物と区別することができる（例えば、Ｃｕｒｒｉｅ， Ｓｏｕｒｃｅ Ａｐｐｏｒｔｉｏｎｍｅｎｔ ｏｆ Ａｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ，Ｊ． Ｂｕｆｆｌｅ ａｎｄ Ｈ． Ｐ．ｖａｎ Ｌｅｅｕｗｅｎ，Ｅｄｓ．，１ ｏｆ Ｖｏｌ．Ｉ ｏｆ ｔｈｅ ＩＵＰＡＣ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｓｅｒｉｅｓ（Ｌｅｗｉｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．）３−７４，（１９９２）を参照）。放射性炭素年代測定法における基本的仮定は、大気中の１４Ｃ濃度の不変性が生体における１４Ｃの不変性を導くというものである。しかしながら、１９５０年以降の大気圏内核実験及び１８５０年以降の化石燃料の燃焼により、１４Ｃは第２の地球化学的時間特性を獲得した。大気のＣＯ２における、それ故生体生物圏における、その濃度は、１９６０年代中頃の核実験のピーク時には約２倍になった。それ以後は、７〜１０年のおよその緩和「半減期」で、約１．２×１０−１2の定常状態宇宙線起源（大気）ベースライン同位体比（１４Ｃ／１２Ｃ）へと徐々に戻りつつある。後者の半減期は文字通りにとれない；むしろ、核時代の開始以降の大気及び生物圏１４Ｃの変動を追跡するには、詳細な大気核投入量／崩壊関数（ａｔｏｍｏｓｐｈｅｒｉｃ ｎｕｃｌｅａｒ ｉｎｐｕｔ／ｄｅｃａｙ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）を用いる必要がある。近年の生物圏炭素の年代測定（ａｎｎｕａｌ ｄａｔｉｎｇ）に裏づけを与えるのは、後者の生物圏１４Ｃ時間特性である。１４Ｃは加速器質量分析（ＡＭＳ）によって測定することができ、その結果は現代炭素率（ｆＭ）という単位で与えられる。ｆＭは、米国国立標準技術研究所（ＮＩＳＴ）の標準物質（ＳＲＭ）４９９０Ｂ及び４９９０Ｃによって定義される。本明細書で用いられるとき、現在標準炭素率、即ちｆＭは、米国国立標準技術研究所（ＮＩＳＴ）の標準物質（ＳＲＭ）４９９０Ｂ及び４９９０Ｃ、それぞれシュウ酸標準品ＨＯｘＩ及びＨＯｘＩＩとして知られるものによって定義される意味と同じ意味を有する。基本的定義はＨＯｘＩの１４Ｃ／１２Ｃ同位体比の０．９５倍に当たる（西暦１９５０年を基準とする）。これは、減衰補正された産業革命前の木にほぼ等しい。現在の生体生物圏（植物材料）については、ｆＭは約１．１である。本明細書に記載の組成物は、少なくとも約１のｆＭ １４Ｃを有し得るバイオ生成物を含む。例えば、本開示のバイオ生成物は、少なくとも約１．０１のｆＭ １４Ｃ、約１〜約１．５のｆＭ １４Ｃ、約１．０４〜約１．１８のｆＭ １４Ｃ、または約１．１１１〜約１．１２４のｆＭ １４Ｃを有することができる。
１４Ｃの別の測定値は、現代炭素パーセント（ｐｅｒｃｅｎｔ ｏｆ ｍｏｄｅｒｎ ｃａｒｂｏｎ）（ｐＭＣ）として知られている。１４Ｃ年代値を用いる考古学者または地質学者にとっては、西暦１９５０年が０歳に相当する。これはまた、１００ｐＭＣも表す。熱核兵器のピークであった１９６３年に、大気中の核爆弾放射線炭素（ｂｏｍｂ ｃａｒｂｏｎ）は正常レベルの約２倍に達した。その出現以来、大気圏内でのその分布は、西暦１９５０年以降に生きる植物及び動物については１００ｐＭＣを上まわる値を示すと概算されている。これは時間の経過と共に徐々に減少しており、現在の値は１０７．５ｐＭＣ近辺にある。これは、トウモロコシ等の新鮮なバイオマス材料が１０７．５ｐＭＣに近い１４Ｃ特性を与えるであろうことを意味する。石油系化合物のｐＭＣ値はゼロであろう。化石炭素を現代炭素と混合すると、現代ｐＭＣ含有量の希釈が起こる。１０７．５ｐＭＣが現代バイオマス材料の１４Ｃ含有量を表し、０ｐＭＣが石油系生成物の１４Ｃ含有量を表すと仮定すると、その材料の測定されるｐＭＣ値はこれらの２種類の構成成分の割合を反映する。例えば、現代の大豆に１００％由来する材料は、１０７．５ｐＭＣに近い放射性炭素特性を与えるであろう。この材料を石油系生成物で５０％希釈すると、放射性炭素特性は約５４ｐＭＣになるであろう。生物学に基づく炭素含有量は、１００％同等を１０７．５ｐＭＣに割り当て、０％同等を０ｐＭＣに割り当てることによって導かれる。例えば、９９ｐＭＣと測定される試料は、９３％の生物学に基づく換算の炭素含有量を与える。この値は、生物学に基づく炭素結果平均値と称され、分析される材料内の全ての構成成分が、現代の生物材料または石油系材料に由来すると仮定している。本明細書に述べたような１つ以上の脂肪酸誘導体を含むバイオ生成物は、少なくとも約５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、または１００のｐＭＣを有することができる。他の例では、本明細書に記載の脂肪酸誘導体は、約５０〜約１００；約６０〜約１００；約７０〜約１００；約８０〜約１００；約８５〜約１００；約８７〜約９８；または約９０〜約９５のｐＭＣを有することができる。さらに他の例では、本明細書に記載の脂肪酸誘導体は、約９０、９１、９２、９３、９４、または９４．２のｐＭＣを有することができる。
以下の特定の実施例は本開示を説明するが、特許請求の範囲を限定すると解釈されるべきではない。
プロトコル及び方法
ライブラリーのスクリーニング
本明細書に記載されたプロトコルは全て、培養物を増殖させるための９６ウェルプレート−マスターブロック（ｍａｓｔｅｒ ｂｌｏｃｋ）−２ｍＬシステム（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ−Ｏｎｅ，Ｍｏｎｒｏｅ，ＮＣまたはＣｏｒｎｉｎｇ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）、及び培養ブロスから脂肪酸種を抽出するためのプレート（Ｃｏｓｔａｒ， Ｉｎｃ．）を利用している。以下に示したプロトコルは発酵条件の例である。代替のプロトコルを用いて脂肪酸種の産生を評価することができる。
３２℃ Ｐｌｉｍ培養プロトコル
（９６ウェルプレート中で増殖させたＬＢ培養物からの）３０μＬのＬＢ培養物を用いて２９０μＬのｐｌｉｍ培地（表２）に接種し、続いてそれを３２℃で振とうしながら約１６時間培養した。一晩播種物（ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ ｓｅｅｄ）の４０μＬを用いて３６０μＬのＰｌｉｍ培地に接種した。３２℃で２時間増殖させた後に、培養物をＩＰＴＧ（最終濃度１ｍＭ）によって誘導した（表３、下記）。特記されない限り、培養物をその後３２℃で振とうしながら２０時間培養し、その後にそれらを、以下に詳述する標準抽出プロトコルに従って抽出した。
３５℃ Ｎｌｉｍ培養プロトコル
（９６ウェルプレート中で増殖させたＬＢ培養物からの）４０μＬのＬＢ培養物を用いて３６０μＬのＬＢ培地に接種し（表３、下記）、続いてそれを３２℃で振とうしながら約４時間培養した。４０μＬのＬＢ播種物（ｓｅｅｄ）を用いて、３６０μＬのＮｌｉｍ培地に接種した。３５℃で２時間３２℃で増殖させた後に、培養物をＩＰＴＧ（最終濃度１ｍＭ）によって誘導した（表３、下記）。特記されない限り、培養物を続いて３５℃で振とうしながら２０時間増殖し、その後にそれらを、以下に詳述する標準抽出プロトコルに従って抽出した。
（表３）培地名称及び配合
Figure 2018537111
脂肪酸種の標準的抽出プロトコル
抽出される各ウェルに、８０μＬの１Ｍ ＨＣｌを添加し、次いで４００μＬの酢酸ブチル（内部標準物質としての５００ｍｇ／Ｌのペンタデカノールと共に）を添加した。その後、９６ウェルプレートを、プレートシーラー（ＡＬＰＳ−３００ヒーター；Ａｂｇｅｎｅ，ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を用いて熱融着させて、ＭＩＸＭＡＴＥ混合機（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ，Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて２０００ｒｐｍで１５分間振とうさせた。振とう後、プレートを室温にて４５００ｒｐｍで１０分間遠心処理して（Ａｌｌｅｇｒａ Ｘ−１５Ｒ、ローターＳＸ４７５０Ａ、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｂｒｅａ，ＣＡ）、水層と有機層を分離した。１００μＬの有機層を９６ウェルプレートに移し（ポリプロピレン製、Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）、１００ｕＬのＢＳＴＦＡで誘導体化した。次いで、プレートを熱融着させ、ｗ―ＯＨ ＦＦＡ法を用いるＧＣ−ＦＩＤによって評価するまで−２０℃で保存した。ｗ―ＯＨ ＦＦＡ法は以下の通りに実施した：１μＬの試料を、水素炎イオン化検出器（ＦＩＤ）を備えたＡｇｉｌｅｎｔ ７８９０Ａ ＧＣ Ｕｌｔｒａデバイス（Ａｇｉｌｅｎｔ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）の中の分析用カラム（ＤＢ−１、１０ｍ×１８０μｍ×膜厚０．２μＭ、ＪＷ １２１−１０１Ａ製）に、１−２０スプリットを用いて注入した。機器はＣ１０〜Ｃ１８脂肪酸及びω−ヒドロキシル化脂肪酸を検出及び定量するように設定した。上記に詳述したプロトコルは標準的な条件を示しており、分析結果を最適化するために必要に応じて改変してもよい。
エラープローンライブラリーの構築
エラープローンライブラリーの調製には、当業者に公知の標準的手法を用いた。１つの例では、ベクター中に制限エンドヌクレアーゼを用いてベクター骨格を調製し、ＤＮＡインサートにおける多様性の創出を、ミスマッチヌクレオチドの組み入れを促進する条件下でＤＮＡ鋳型からＰＣＲ増幅することにより行った。１つのアプローチでは、ベクター骨格及び多様性を有するＤＮＡインサートのクローニングを、ＩＮＦＵＳＩＯＮ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）を用い、製造業者のプロトコルに従って行った。
飽和ライブラリーの構築
飽和ライブラリーの調製に、当業者に公知の標準的な手法を用いた。１つの例では、ベクター内に制限エンドヌクレアーゼを用いてベクター骨格を調製し、ＤＮＡインサートにおける多様性の創出を縮重したプライマーを用いて行った。１つのアプローチでは、ベクター骨格及び多様性を有するＤＮＡインサートのクローニングを、ＩＮＦＵＳＩＯＮ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）を用い、製造業者のプロトコルに従って行った。
組み合わせライブラリーの構築
有益と確認された突然変異を組み合わせて、さらに改良されたω−ＯＨ脂肪酸誘導体種の産生を伴うＣＹＰ１５３−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアント（例、ＣＹＰ１５３Ａ−ＲｅｄＲｈＦハイブリッドタンパク質バリアント）を得た。組合せライブラリーの調製には、当業者に公知の標準的手法を用いた。１つの例では、ベクター中に制限エンドヌクレアーゼを用いてベクター骨格を調製し、ＤＮＡインサートにおける多様性の創出は、所望の突然変異を導入するためのプライマーを用いて行った。上記のように、１つのアプローチでは、ベクター骨格及び多様性を有するＤＮＡインサートのクローニングを、ＩＮＦＵＳＩＯＮ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）を用い、製造業者のプロトコルに従って行った。組合せライブラリーは、トランスファーＰＣＲ（ｔＰＣＲ）プロトコル（Ｅｒｉｊｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｊ． Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏ．１７５：１７１−１７７）を用いて作製することができる。
ライブラリースクリーニング
エラープローンライブラリー、飽和ライブラリーまたは組合せライブラリーにおいてライブラリーの多様性を生じさせた時点で、それを上記の方法の１つを用いてスクリーニングした。２種類のヒットが同定された：（１）ω−ヒドロキシ脂肪酸量の増大（ω−ＯＨ ＦＦＡ力価）；及び／または（２）脂肪酸からω−ヒドロキシ脂肪酸への変換の増大。各ヒット内のハイブリッドｃｙｐ１５３Ａ−ＲｅｄＲｈＦタンパク質バリアントにおける突然変異を、当業者によって慣用されている標準的手法を用いたシークエンシングによって同定した。以下の表５、６及び７には、飽和ライブラリーにおいて有益と同定された突然変異（ヒット）が列記されている。
実施例１：ライブラリースクリーニング用菌株及びプラスミドの構築
本実施例では、飽和ライブラリーまたはコンビナトリアル突然変異誘発ライブラリーのスクリーニングのために構築した菌株及びプラスミドについて説明する。
マリノバクター・アクアエオレイ由来のＣＹＰ１５３Ａ（Ｇ３０７Ａ）Ｐ４５０触媒タンパク質、及びロドコッカス属の種ＮＣＩＭＢ９７８４由来のＰ４５０ＲｈＦのｃ末端ＦＭＮ及びＦｅ／Ｓ含有レダクターゼドメインから構成されるハイブリッド融合タンパク質をコードする遺伝子を、以下のように作製した：ｃｙｐ１６５Ａ（Ｇ３０７Ａ）＿Ｍａｑｕ遺伝子をゲノムＤＮＡから増幅し、コドンが最適化された合成Ｐ４５０ＲｈＦレダクターゼドメイン及びクロスオーバーＰＣＲと融合させた。得られた融合遺伝子（配列番号５）を、その転写がＩＰＴＧ誘導性Ｐｔｒｃプロモーターによって制御されるように、ｐＡＣＹＣ派生物（即ち、ｐ１５Ａレプリコン、カナマイシン耐性マーカー）中にクローニングした。このプラスミドをｐＥＰ１２５と名付けた（下記、表４参照）。
ｃｙｐ１５３Ａ（Ｇ３０７Ａ）−Ｒｅｄ４５０ＲｈＦハイブリッド融合タンパク質をコードする遺伝子もｐＥＰ１２５から増幅させ、そして、その転写がＩＰＴＧ誘導性Ｐｔｒｃプロモーターによって制御され、且つそれが植物性チオエステラーゼ（ｆａｔＢ１）、３-ケト−アシル−ＡＣＰシンターゼ（ｆａｂＢ）のバリアント及び転写調節因子（ｆａｄＲ）をコードする遺伝子を有するオペロンを形成するように、ｐＣＬ１９２０派生ベクター（ＳＣ１０１レプリコン、スペクチノマイシン耐性マーカー）中にクローニングした。このプラスミドをｐＬＣ８１と名付けた（下記、表４参照）。
さらなるプラスミドを、以下のように作り出した：ウンベルラリア・カリフォルニカ由来の植物性チオエステラーゼ（ｆａｔＢ１）をコードする遺伝子を、コドンが最適化されたＤＮＡとして合成し、そして、その転写がＩＰＴＧ誘導性Ｐｔｒｃプロモーターによって制御され、且つそれがアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ａｃｃＤＡＣＢ）、ビオチンリガーゼ（ｂｉｒＡ）及びアシル−キャリアータンパク質をコードする遺伝子を有するオペロンを形成するように、ｐＣＬ１９２０派生ベクター（ＳＣ１０１レプリコン、スペクチノマイシン耐性マーカー）中にクローニングした。このプラスミドをｐＮＨ３０５と命名した（下記、表４参照）。プラスミドｐＡＳ０３３は、ｐＮＨ３０５のｆａｔＢ１を、シロイヌナズナ由来のコドンが最適化された合成植物性チオエステラーゼ（ｆａｔＡ３）により置換することにより作製された（下記、表４参照）。プラスミドｐＥＰ１４６は、ｐＬＣ８１におけるｆａｔＢ１を、シロイヌナズナ由来のコドンが最適化された合成植物性チオエステラーゼ（ｆａｔＡ３）により置換することによって作製された（下記、表４参照）。ｐＥＰ１４６は、ｒｅｐＡタンパク質によってコードされる突然変異もプラスミド中に有していた。
プラスミド形質転換のために使用される基本菌株は、ＧＬＰ０７７及びＢＺ１２８である。簡潔に述べると、基本菌株ＧＬＰＨ０７７のゲノムを以下のように操作した：アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ｆａｄＥ）遺伝子を欠失させ、そして転写調節因子（ｆａｄＲ）及び合成脂肪酸生合成オペロンを過剰発現させた。簡潔に言うと、基本菌株ＢＺ１２８のゲノムを以下のように操作した：ｆａｄＥ（アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ）遺伝子を欠失させ、そして合成脂肪酸生合成オペロン、β−ヒドロキシ脂肪アシル−ＡＣＰデヒドラターゼ（ｆａｂＺ）、及びチオエステラーゼ（ｔｅｓＡ）のバリアントを過剰発現させた。加えて、この菌株は予めトランスポゾン突然変異誘発及びＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）突然変異誘発ならびにスクリーニングを受けている。
（表４）ライブラリースクリーニングに使用されたプラスミド
Figure 2018537111
ハイブリッドｃｙｐ１５３Ａ（Ｇ３０７Ａ）−Ｒｅｄ４５０ＲｈＦ融合タンパク質を、宿主細胞における発現によりω−ＯＨ脂肪酸誘導体が産生されうるか否かを調べるために試験した。配列番号５を発現する微生物は、グルコースから１ｇ／Ｌを上回るω−ＯＨ脂肪酸誘導体を産生することができた。このため、この操作された酵素はさらなる進化研究のために選択された。
実施例２：ｃｙｐ１５３Ａ（Ｇ３０７Ａ）−Ｒｅｄ４５０ＲｈＦ融合タンパク質のＰ４５０触媒ドメインの飽和ライブラリー
ｃｙｐ１５３Ａ−Ｒｅｄ４５０ＲｈＦ融合タンパク質のＰ４５０触媒ドメインの完全飽和ライブラリーを構築し、ｃｙｐ１５３Ａ（Ｇ３０７Ａ）−Ｒｅｄ４５０ＲｈＦ（即ち、鋳型ポリペプチド）を超える改良を示すバリアントを得るためにスクリーニングを行った。Ｇ３０７Ａ（即ち、位置３０７のグリシン残基をアラニン残基が置き換え）は、ｃｙｐ１５３Ａのω−ヒドロキシラーゼ活性を改良する有益な突然変異である（Ｈｏｎｄａ Ｍａｌｃａ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．４８：５１１５参照）。ヒットに関する選択基準は、（１）ω−ヒドロキシ脂肪酸の量（ωＯＨ ＦＦＡ力価）の増大；及び／または（２）脂肪酸からω−ヒドロキシ脂肪酸への変換の増大とした。
飽和ライブラリーの調製には、当業者に周知の標準的手法を用いた。プラスミドｐＥＰ１２５及びｐＬＣ８１（上記表４参照）を用いて完全飽和ライブラリーを作製した。３種の飽和ライブラリーをスクリーニングした：第１のライブラリーについて、ｐＥＰ１２５をｐＮＨ３０５と共に菌株ＧＬＰＨ０７７に形質転換し、第２のライブラリーについて、ｐＬＣ８１をＢＺ１２８に形質転換し、第３のライブラリーついて、ｐＥＰ１２５をｐＡＳ．０３３と共にＧＬＰＨ０７７菌株に形質転換した。第１及び第２のライブラリーは、特にω−ヒドロキシドデカン酸形成におけるバリアントの改良についてスクリーニングし、第３のライブラリーは、特にω−ヒドロキシヘキサデセン酸形成におけるバリアントの改良についてスクリーニングした。ライブラリーは、上記の標準的なプロトコルの１つを用いてスクリーニングした。改良されたバリアントを、以下の表５〜７（下記）に示している。特に、位置１４１でのバリアントが複数回同定され、ω−ヒドロキシドデカン酸及びω−ヒドロキシヘキサデセン酸の両方の形成を顕著に改良する酵素であることが分かった。
（表５）ｃｙｐ１５３Ａ（Ｇ３０７Ａ）−Ｒｅｄ４５０ＲｈＦの触媒ドメインの第１部位飽和ライブラリーからの改良されたバリアントの概要
Figure 2018537111
ＦＩＯＣ＝対照に対する改良倍数；対照は太字
（表６）ｃｙｐ１５３Ａ（Ｇ３０７Ａ）−Ｒｅｄ４５０ＲｈＦの触媒ドメインの第２部位飽和ライブラリーからの改良されたバリアントの概要
Figure 2018537111
ＦＩＯＣ＝対照に対する改良倍数；対照は太字
（表７）ｃｙｐ１５３Ａ（Ｇ３０７Ａ）−Ｒｅｄ４５０ＲｈＦの触媒ドメインの第３部位飽和ライブラリーからの改良されたバリアントの概要
Figure 2018537111
ＦＩＯＣ＝対照に対する改良倍数；対照は太字
実施例３：ｃｙｐ１５３Ａ（Ｇ３０７Ａ）−Ｒｅｄ４５０ＲｈＦ融合タンパク質のレダクターゼドメインの部分的部位飽和ライブラリー
ハイブリッドｃｙｐ１５３Ａ−Ｒｅｄ４５０ＲｈＦ融合タンパク質のレダクターゼドメインの部分的飽和ライブラリー（１０番目のアミノ酸毎に突然変異させた）を構築し、触媒Ｐ４５０ ｃｙｐ１５３Ａドメインの部位飽和突然変異誘発ライブラリーにおいて同定されたバリアントの1つであるｃｙｐ１５３Ａ（Ｖ１４１Ｉ，Ａ２３１Ｔ，Ｇ３０７Ａ）−Ｒｅｄ４５０ＲｈＦ（配列番号３２）を超える改良を示すバリアントを得るためにスクリーニングした。ヒットに関する選択基準は、（１）ω−ヒドロキシドデカン酸の量（ωＯＨ ＦＦＡ力価）の増大；及び／または（２）ドデカン酸からω−ヒドロキシドデカン酸への変換の増大とした。
飽和ライブラリーの調製には、当業者に公知の標準的手法を用いた。ライブラリーについて、ｃｙｐ１５３Ａ（Ｖ１４１Ｉ，Ａ２３１Ｔ，Ｇ３０７Ａ）−Ｒｅｄ４５０ＲｈＦを有するｐＬＣ８１をＢＺ１２８に形質転換した。ライブラリーを、上記の標準的プロトコルの１つを用いてスクリーニングした。改良されたバリアントを、以下の表８に示す。特に、バリアントＡ７９６Ｖ（配列番号４２）及びＰ６６６Ａは、顕著に改良された酵素であった。
（表８）ｃｙｐ１５３Ａ（Ｖ１４１Ｉ Ａ２３１Ｔ Ｇ３０７Ａ）−Ｒｅｄ４５０ＲｈＦのレダクターゼドメインの部分飽和ライブラリーからの改良されたバリアントの概要
Figure 2018537111
ＦＩＯＣ＝対照に対する改良倍数；対照は太字
実施例４：ｃｙｐ１５３Ａ（Ｇ３０７Ａ）−Ｒｅｄ４５０ＲｈＦ融合タンパク質のレダクターゼドメインのコンビナトリアルライブラリー
レダクターゼドメインの部分的飽和ライブラリーにおいて同定された有益な突然変異（実施例３）を、ｃｙｐ１５３Ａ（Ｇ３０７Ａ）−Ｒｅｄ４５０ＲｈＦ融合タンパク質をさらに改良するための組合せライブラリーの基礎とした。選択基準は、（１）ω−ヒドロキシドデカン酸（ωＯＨ ＦＦＡ力価）の量の増大；及び／または（２）ドデカン酸からω−ヒドロキシドデカン酸への変換の増大とした。
組合せライブラリーは、ｃｙｐ１５３Ａ（Ｖ１４１Ｉ，Ａ２３１Ｔ，Ｇ３０７Ａ）−Ｒｅｄ４５０ＲｈＦ（配列番号３２）を有するｐＬＣ８１中に構築し、ＢＺ１２８に形質転換した。組合せライブラリーの調製には、当業者に公知の標準的手法を用いた。このライブラリーを、上記の標準的なプロトコルの１つを用いてスクリーニングした。改良されたバリアントを、以下の表９に示す。
（表９）ｃｙｐ１５３Ａ（Ｖ１４１Ｉ，Ａ２３１Ｔ，Ｇ３０７Ａ）−Ｒｅｄ４５０ＲｈＦのレダクターゼドメインの組合せライブラリーからの改良されたバリアントの概要
Figure 2018537111
ＦＩＯＣ＝対照に対する改良倍数；対照は太字
実施例５：ｃｙｐ１５３Ａ（Ｇ３０７Ａ）−Ｒｅｄ４５０ＲｈＦ融合タンパク質の触媒及びレダクターゼドメインのコンビナトリアルライブラリー
飽和ライブラリーにおいて同定された有益な突然変異（実施例２または３）を、ｃｙｐ１５３Ａ（Ｇ３０７Ａ）−Ｒｅｄ４５０ＲｈＦ融合タンパク質をさらに改良するための組合せライブラリーの基礎とした。選択基準は、（１）ω−ヒドロキシドデカン酸の量（ωＯＨ ＦＦＡ力価）の増大；及び／または（２）ドデカン酸からω−ヒドロキシドデカン酸への変換の増大とした。組合せライブラリーをｐＬＣ８１中に構築し、ＢＺ１２８に形質転換した。組合せライブラリーの構築には、当業者に公知の標準的手法を用いた。ライブラリーを、上記の標準的なプロトコルの１つを用いてスクリーニングした。最も改良されたバリアントの上位から２つを表１０に示す。
（表１０）ｃｙｐ１５３Ａ（Ｇ３０７Ａ）−Ｒｅｄ４５０ＲｈＦのコンビナトリアルライブラリーからの最も改良されたバリアント
Figure 2018537111
＊４８時間後の力価（ｍｇ／Ｌ）
実施例６：ｃｙｐ１５３Ａ（Ｇ３０７Ａ，Ａ７９６Ｖ）−Ｒｅｄ４５０ＲｈＦの位置１４１及び３０９での部位飽和突然変異誘発
位置１４１位における変化は基質特異性に影響を及ぼすことが認められた。それ故、これらの２つの位置での部位飽和突然変異誘発を、ｃｙｐ１５３Ａ（Ｇ３０７Ａ，Ａ７９６Ｖ）−Ｒｅｄ４５０ＲｈＦにおいて行った。ヒットに関する選択基準は、（１）ω−ヒドロキシヘキサデセン酸の量の増大；及び/または（２）ヘキサデセン酸からω−ヒドロキシヘキサデセン酸への変換の増大とした。
ライブラリーについて、ｃｙｐ１５３Ａ（Ｇ３０７Ａ Ａ７９６Ｖ）−Ｒｅｄ４５０ＲｈＦ（配列番号３８）を有するｐＥＰ１４６を、ＢＺ１２８に形質転換した。部位飽和ライブラリーの調製には、当業者に公知の標準的手法を用いた。ライブラリーを、上記の標準的なプロトコルの１つを用いてスクリーニングした。改良バリアントを図２に示す。特に、Ｖ１４１Ｔを有するバリアント（配列番号４６）は、最も高いω−ヒドロキシヘキサデセン酸力価、及びヘキサデセン酸からの最高の転換を示した。
実施例７：改良されたハイブリッドｃｙｐ１５３Ａ（Ｇ３０７Ａ）−Ｒｅｄ４５０ＲｈＦ（Ａ７９６Ｖ）融合タンパク質の飽和ライブラリー
ｃｙｐ１５３Ａ−Ｒｅｄ４５０ＲｈF融合タンパク質の完全飽和ライブラリーを構築し、スクリーニングしてｃｙｐｌ５３Ａ（Ｇ３０７Ａ）−Ｒｅｄ４５０ＲｈＦ（Ａ７９６Ｖ）(即ち鋳型バリアント、配列番号３８)を超える改良を示すバリアントを得た。Ｇ３０７Ａ（即ち、位置３０７のグリシンをアラニン残基が置き換え）及びＡ７９６Ｖ（即ち、位置７９６のアラニンをバリン残基が置き換え）は、ｃｙｐ１５３Ａのω−ヒドロキシラーゼ活性を改良する有益な突然変異である（前記参照）。ヒットに関する選択基準は、（１）ω−ヒドロキシ脂肪酸の量（ω−ＯＨ ＦＦＡ力価）の増大；及び／または（２）脂肪酸からω−ヒドロキシ脂肪酸への変換の増大とした。
飽和ライブラリーの調製には、当業者に周知の標準的手法を用いた。プラスミドｐＥＰ３０２を用いて、ｐＥＰ１４６の誘導体である（前記表４参照）完全飽和ライブラリーを作製し、その際遺伝子の順序を変更し（ｆａｔＡ３−ｆａｄＢ−ｆａｄＲ−ｃｙｐ１５３Ａ（Ｇ３０７Ａ）−Ｒｅｄ４５０ＲｈＦ（Ａ７９６Ｖ）)且つ最後の遺伝子を分離プロモーターから発現した。ライブラリーを菌株ｓｔＮＨ１５２５に形質転換した。簡潔に言うと、基本菌株ｓｔＮＨ１５２５のゲノムを以下のように操作した：ｆａｄＥ（アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ）遺伝子を欠失させ、そして合成脂肪酸生合成オペロンを過剰発現させた。加えて、この菌株は予めトランスポゾン突然変異誘発及びＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）突然変異誘発ならびにスクリーニングを受けている。
ライブラリーは上記の標準プロトコルの１つを用いたスクリーニングが行われた。改良されたバリアントを、以下の表１１に示しており、特に、ω−ヒドロキシヘキサデカン酸及びω−ヒドロキシヘキサデセン酸の形成を顕著に改良するバリアントを示している。
（表１１）ｃｙｐ１５３Ａ（Ｇ３０７Ａ）−Ｒｅｄ４５０ＲｈＦ（Ａ９７６Ｖ）の部位飽和ライブラリーからの改良されたバリアントの概要
Figure 2018537111
Figure 2018537111
Figure 2018537111
実施例８：ｃｙｐ１５３Ａ（Ｇ３０７Ａ）−Ｒｅｄ４５０ＲｈＦ（Ａ７９６Ｖ）融合タンパク質の触媒ドメインのコンビナトリアルライブラリー
触媒ドメインの飽和ライブラリー（実施例７）で特定される有益な突然変異を、ｃｙｐ１５３Ａ（Ｇ３０７Ａ）−Ｒｅｄ４５０ＲｈＦ（Ａ７９６Ｖ）融合タンパク質をさらに改良するための組合せライブラリーにおける基礎とした。ヒットの選択基準は、（１）ω−ヒドロキシ脂肪酸（ω−ＯＨ ＦＦＡ力価）の量の増大；及び／または（２）脂肪酸からω−ヒドロキシ脂肪酸への変換の増大とした。
ｃｙｐ１５３Ａ（Ｇ３０７Ａ）−Ｒｅｄ４５０ＲｈＦ（Ａ７９６Ａ）（配列番号３８）を有するｐＥＰ３０２において組合せライブラリーを構築し、ｓｔＮＨ１５２５に形質転換した。組合せライブラリーの調製には、当業者に公知の標準的手法を用いた。上述の標準プロトコルの１つを用いて、ライブラリーをスクリーニングした。改良されたバリアント、特にω−ヒドロキシ脂肪酸形成を著しく改良したバリアントを以下の表１２に示す。
（表１２）ｃｙｐ１５３Ａ（Ｇ３０７Ａ）−Ｒｅｄ４５０ＲｈＦ（Ａ７９６Ｖ）（配列番号３８）の触媒ドメインにおける組合せライブラリーからの改良されたバリアントの概要
Figure 2018537111
実施例９：高い発現レベルにおけるｃｙｐ１５３Ａ（Ｇ３０７Ａ）−Ｒｅｄ４５０ＲｈＦ（Ａ７９６Ｖ）融合タンパク質の触媒ドメインのコンビナトリアルライブラリー
触媒ドメインのコンビナトリアルライブラリーで特定される有益な突然変異（上記の実施例８参照）を、ｃｙｐ１５３Ａ（Ｇ３０７Ａ）−Ｒｅｄ４５０ＲｈＦ（Ａ７９６Ｖ）融合タンパク質をさらに改良するための組合せライブラリーにおける次のラウンドの基礎とした。ヒットの選択基準は、（１）ω−ヒドロキシ脂肪酸（ω−ＯＨ ＦＦＡ力価）の量の増大；及び／または（２）脂肪酸からω−ヒドロキシ脂肪酸への変換の増大とした。
より高い発現レベルでのｃｙｐ１５３Ａ（Ｇ３０７Ａ）−Ｒｅｄ４５０ＲｈＦ（Ａ７９６Ａ）（配列番号３８）を有するｐＥＰ３０２の誘導体であるｐＡＡ．０１６プラスミドにおいて組合せライブラリーを構築し、ｓｔＮＨ１５２５に形質転換した。組合せライブラリーの調製には、当業者に公知の標準的手法を用いた。上述の標準プロトコルの１つを用いて、ライブラリーをスクリーニングした。改良されたバリアント、特にω−ヒドロキシ脂肪酸形成を著しく改良したバリアントを表１３に示す。
（表１３）ｃｙｐ１５３Ａ（Ｇ３０７Ａ）−Ｒｅｄ４５０ＲｈＦ（Ａ７９６Ｖ）の触媒ドメインにおける組合せライブラリーからの高い発現レベルでの改良されたバリアントの概要
Figure 2018537111
実施例１０：ｃｙｐ１５３Ａ（Ｇ３０７Ａ）−Ｒｅｄ４５０ＲｈＦ（Ａ７９６Ｖ）融合タンパク質のレダクターゼドメインのコンビナトリアルライブラリー
レダクターゼドメインの飽和ライブラリー（実施例７）で特定される有益な突然変異を、ｃｙｐ１５３Ａ（Ｇ３０７Ａ）−Ｒｅｄ４５０ＲｈＦ（Ａ７９６Ｖ）融合タンパク質をさらに改良するための組合せライブラリーにおける基礎とした。選択基準は、（１）ω−ヒドロキシ脂肪酸（ω−ＯＨ ＦＦＡ力価）の量の増大；及び／または（２）脂肪酸からω−ヒドロキシ脂肪酸への変換の増大とした。
ｐＥＰ３０２において組合せライブラリーを構築し、ｓｔＮＨ１５２５に形質転換した。組合せライブラリーの調製には、当業者に公知の標準的手法を用いた。上述の標準プロトコルの１つを用いて、ライブラリーをスクリーニングした。改良されたバリアントを表１４に示す。
（表１４）ｃｙｐ１５３Ａ（Ｇ３０７Ａ）−Ｒｅｄ４５０ＲｈＦ（Ａ７９６Ｖ）のレダクターゼドメインにおけるコンビナトリアルライブラリーからの改良されたバリアント
Figure 2018537111
実施例１１：ｃｙｐ１５３Ａ（Ｑ１２Ｗ、Ｒ２７Ｌ、Ｋ１１９Ｒ、Ｓ１４０Ｎ、Ｓ１５７Ｒ、Ｖ１５９Ｍ、Ｓ２３３Ｌ、Ａ２４４Ｒ、Ｇ３０７Ａ）−Ｒｅｄ４５０ＲｈＦ（Ａ７９６Ｖ）融合タンパク質（配列番号９８）の触媒ドメイン及びレダクターゼドメインのコンビナトリアルライブラリー
触媒ドメイン及びレダクターゼドメインのコンビナトリアルライブラリーで特定される有益な突然変異（上記の実施例８〜１０参照）を、ｃｙｐ１５３Ａ（Ｑ１２Ｗ、Ｒ２７Ｌ、Ｋ１１９Ｒ、Ｓ１４０Ｎ、Ｓ１５７Ｒ、Ｖ１５９Ｍ、Ｓ２３３Ｌ、Ａ２４４Ｒ、Ｇ３０７Ａ）−Ｒｅｄ４５０ＲｈＦ（Ａ７９６Ｖ）融合タンパク質（配列番号９８）をさらに改良するための組合せライブラリーにおける基礎とした。選択基準は、（１）ω−ヒドロキシ脂肪酸（ω−ＯＨ ＦＦＡ力価）の量の増大；及び／または（２）脂肪酸からω−ヒドロキシ脂肪酸への変換の増大とした。
ｃｙｐ１５３Ａ（Ｑ１２Ｗ、Ｒ２７Ｌ、Ｋ１１９Ｒ、Ｓ１４０Ｎ、Ｓ１５７Ｒ、Ｖ１５９Ｍ、Ｓ２３３Ｌ、Ａ２４４Ｒ、Ｇ３０７Ａ）−Ｒｅｄ４５０ＲｈＦ（Ａ７９６Ｖ）融合タンパク質（配列番号９８）を有するｐＥＰ３０２の誘導体であるｐＥＰ．３３３プラスミド（実施例７参照）において組合せライブラリーを構築し、ｓｔＮＨ１５２５に形質転換した。組合せライブラリーの調製には、当業者に公知の標準的手法を用いた。上述の標準プロトコルの１つを用いて、ライブラリーをスクリーニングした。
改良されたバリアントを表１５に示す。配列番号９８の鋳型におけるいくつかの突然変異は、表１５に示されるように野生型に復帰した。例えば、表１５に示す４番目の突然変異体では、配列番号１５２のバリアントにおいてＳ２３３Ｌ及びＡ２４４Ｒの突然変異が存在しない一方で、新たな突然変異Ｖ１４１Ｔ及びＡ２３１Ｙが加えられた。
（表１５）ｃｙｐ１５３Ａ（Ｑ１２Ｗ、Ｒ２７Ｌ、Ｋ１１９Ｒ、Ｓ１４０Ｎ、Ｓ１５７Ｒ、Ｖ１５９Ｍ、Ｓ２３３Ｌ、Ａ２４４Ｒ、Ｇ３０７Ａ）−Ｒｅｄ４５０ＲｈＦ（Ａ７９６Ｖ）融合タンパク質（配列番号９８）の触媒ドメイン及びレダクターゼドメインのコンビナトリアルライブラリーからの改良されたバリアント
Figure 2018537111
実施例１２：ｃｙｐ１５３Ａ（Ｑ１２Ｗ、Ｒ２７Ｌ、Ｋ１１９Ｒ、Ｓ１４０Ｎ、Ｓ１５７Ｒ、Ｖ１５９Ｍ、Ｓ２３３Ｌ、Ａ２４４Ｒ、Ｇ３０７Ａ）−Ｒｅｄ４５０ＲｈＦ（Ａ７９６Ｖ）融合タンパク質（配列番号９８）の触媒ドメインのコンビナトリアルライブラリー
触媒ドメインのコンビナトリアルライブラリーで特定される有益な突然変異（上記の実施例８参照）を、配列番号９８のｃｙｐ１５３Ａ（Ｑ１２Ｗ、Ｒ２７Ｌ、Ｋ１１９Ｒ、Ｓ１４０Ｎ、Ｓ１５７Ｒ、Ｖ１５９Ｍ、Ｓ２３３Ｌ、Ａ２４４Ｒ、Ｇ３０７Ａ）−Ｒｅｄ４５０ＲｈＦ（Ａ７９６Ｖ）融合タンパク質をさらに改良するための組合せライブラリーにおける基礎とした。選択基準は、（１）ω−ヒドロキシ脂肪酸（ω−ＯＨ ＦＦＡ力価）の量の増大；及び／または（２）脂肪酸からω−ヒドロキシ脂肪酸への変換の増大とした。
より高い発現レベルでのｃｙｐ１５３Ａ（Ｑ１２Ｗ、Ｒ２７Ｌ、Ｋ１１９Ｒ、Ｓ１４０Ｎ、Ｓ１５７Ｒ、Ｖ１５９Ｍ、Ｓ２３３Ｌ、Ａ２４４Ｒ、Ｇ３０７Ａ）−Ｒｅｄ４５０ＲｈＦ（Ａ７９６Ｖ）融合タンパク質（配列番号９８）と、チオエステラーゼｆａｔＡ３及びβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼｆａｂＢのバリアントを有する第２のオペロンとを有する、ｐＥＰ．３３３プラスミドの低コピー数誘導体であるｐＥＰ．３３４プラスミド（実施例１１を参照）において、組合せライブラリーを構築した。ｐＥＰ３４４を、構成的に発現された調節タンパク質のバリアントｆａｄＲを有するｓｔＮＨ１５２５株（実施例７参照）の誘導体であるＡＡ．２３３株に形質転換した。組合せライブラリーの調製には、当業者に公知の標準的手法を用いた。上述の標準プロトコルの１つを用いて、ライブラリーをスクリーニングした。改良されたバリアントを表１６に示す。配列番号９８の鋳型におけるいくつかの突然変異は、表１６に示されるように野生型に復帰した。例えば、表１６に示す１番目の突然変異体では、配列番号１６６のバリアントにおいてＳ１４０Ｎの突然変異が存在しない一方で、新たな突然変異Ｑ２８Ｍ、Ｖ１４１Ｔ及びＡ２３１Ｙが加えられた。
（表１６）ｃｙｐ１５３Ａ（Ｑ１２Ｗ、Ｒ２７Ｌ、Ｋ１１９Ｒ、Ｓ１４０Ｎ、Ｓ１５７Ｒ、Ｖ１５９Ｍ、Ｓ２３３Ｌ、Ａ２４４Ｒ、Ｇ３０７Ａ）−Ｒｅｄ４５０ＲｈＦ（Ａ７９６Ｖ）融合タンパク質（配列番号９８）の触媒ドメインのコンビナトリアルライブラリーからの改良されたバリアント
Figure 2018537111
当業者には明らかなように、上記態様及び実施形態の様々な改変及び変形は、本開示の趣旨及び範囲から逸脱せずに行うことができる。このような改変及び変形は本開示の範囲内である。

Claims (13)

  1. 配列番号３８のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を備えるＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントであって、アミノ酸位置１２位における突然変異と、以下のアミノ酸位置：
    （ａ）配列番号３８の１２、２７、２８、１１９、１４１、１５７、１５９、２３１、２３３、及び２４４位；
    （ｂ）配列番号３８の１２、２８、１１９、１４０、１５７、１５９、２３３、２４４、２５４、及び４０７位；
    （ｃ）配列番号３８の１２、２７、１１１、１１９、１４１、１５７、１５９、２３１、２３３、２４４、及び２５４位；
    （ｄ）配列番号３８の１２、２８、１１９、１４０、１４９、１５７、１５９、２３１、２３３、及び４０７位；
    （ｅ）配列番号３８の１２、２７、２８、１１９、１４０、１５７、１５９、２３３、２４４、及び４０７位；
    （ｆ）配列番号３８の１０、１１、１２、２８、１１９、１４１、１５９、２３１、２３３、２４４、及び４０７位；
    （ｇ）配列番号３８の１１、１２、２７、２８、１１９、１４１、１５７、１５９、１９７、２３１、２３３、２４４、４０７、及び４７７位；
    （ｈ）配列番号３８の１１、１２、２８、１１９、１４１、１５７、１５９、１９７、２３１、２３３、２４４、及び４０７位；または
    （ｉ）配列番号３８の１１、１２、２７、２８、１１９、１４１、１４９、１５７、１５９、２３１、２３３、及び４０７位
    の各々における突然変異とを含み、脂肪酸からω−ヒドロキシル化脂肪酸への変換を触媒する、前記ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアント。
  2. （ａ）配列番号３８のアミノ酸位置１２、２７、２８、１１９、１４１、１５７、１５９、２３１、２３３、及び２４４位における前記突然変異が、それぞれ、Ｑ１２Ｗ、Ｒ２７Ｌ、Ｑ２８Ｍ、Ｋ１１９Ｒ、Ｖ１４１Ｔ、Ｓ１５７Ｒ、Ｖ１５９Ｍ、Ａ２３１Ｙ、Ｓ２３３Ｌ、及びＡ２４４Ｒである；
    （ｂ）配列番号３８のアミノ酸位置１２、２８、１１９、１４０、１５７、１５９、２３３、２４４、２５４、及び４０７位における前記突然変異が、それぞれ、Ｑ１２Ｗ、Ｑ２８Ｍ、Ｋ１１９Ｒ、Ｓ１４０Ｎ、Ｓ１５７Ｒ、Ｖ１５９Ｍ、Ｓ２３３Ｌ、Ａ２４４Ｒ、Ｒ２５４Ｇ、及びＮ４０７Ｇである；
    （ｃ）配列番号３８のアミノ酸位置１２、２７、１１１、１１９、１４１、１５７、１５９、２３１、２３３、２４４、及び２５４位における前記突然変異が、それぞれ、Ｑ１２Ｗ、Ｒ２７Ｌ、Ｆ１１１Ａ、Ｋ１１９Ｒ、Ｖ１４１Ｔ、Ｓ１５７Ｒ、Ｖ１５９Ｍ、Ａ２３１Ｙ、Ｓ２３３Ｌ、Ａ２４４Ｒ、及びＲ２５４Ｇである；
    （ｄ）配列番号３８のアミノ酸位置１２、２８、１１９、１４０、１４９、１５７、１５９、２３１、２３３、及び４０７位における前記突然変異が、それぞれ、Ｑ１２Ｗ、Ｑ２８Ｍ、Ｋ１１９Ｒ、Ｓ１４０Ｎ、Ｐ１４９Ｇ、Ｓ１５７Ｒ、Ｖ１５９Ｍ、Ａ２３１Ｙ、Ｓ２３３Ｌ、及びＮ４０７Ｇである；
    （ｅ）配列番号３８のアミノ酸位置１２、２７、２８、１１９、１４０、１５７、１５９、２３３、２４４、及び４０７位における前記突然変異が、それぞれ、Ｑ１２Ｗ、Ｒ２７Ｌ、Ｑ２８Ｍ、Ｋ１１９Ｒ、Ｓ１４０Ｎ、Ｓ１５７Ｒ、Ｖ１５９Ｍ、Ｓ２３３Ｌ、Ａ２４４Ｒ、及びＮ４０７Ｇである；
    （ｆ）配列番号３８のアミノ酸位置１０、１１、１２、２８、１１９、１４１、１５９、２３１、２３３、２４４、及び４０７位における前記突然変異が、それぞれ、Ｄ１０Ｙ、Ｉ１１Ｌ、Ｑ１２Ｗ、Ｑ２８Ｍ、Ｋ１１９Ｒ、Ｖ１４１Ｔ、Ｖ１５９Ｍ、Ａ２３１Ｙ、Ｓ２３３Ｌ、Ａ２４４Ｒ、及びＮ４０７Ｇである；
    （ｇ）配列番号３８のアミノ酸位置１１、１２、２７、２８、１１９、１４１、１５７、１５９、１９７、２３１、２３３、２４４、４０７、及び４７７位における前記突然変異が、それぞれ、Ｉ１１Ｌ、Ｑ１２Ｗ、Ｒ２７Ｌ、Ｑ２８Ｍ、Ｋ１１９Ｒ、Ｖ１４１Ｔ、Ｓ１５７Ｒ、Ｖ１５９Ｍ、Ａ１９７Ｔ、Ａ２３１Ｙ、Ｓ２３３Ｌ、Ａ２４４Ｒ、Ｎ４０７Ｇ、及びＰ４７７Ｇである；
    （ｈ）配列番号３８のアミノ酸位置１１、１２、２８、１１９、１４１、１５７、１５９、１９７、２３１、２３３、２４４、及び４０７位における前記突然変異が、それぞれ、Ｉ１１Ｌ、Ｑ１２Ｗ、Ｑ２８Ｍ、Ｋ１１９Ｒ、Ｖ１４１Ｔ、Ｓ１５７Ｒ、Ｖ１５９Ｍ、Ａ１９７Ｔ、Ａ２３１Ｙ、Ｓ２３３Ｌ、Ａ２４４Ｒ、及びＮ４０７Ｇである；ならびに
    （ｉ）配列番号３８のアミノ酸位置１１、１２、２７、２８、１１９、１４１、１４９、１５７、１５９、２３１、２３３、及び４０７位における前記突然変異が、それぞれ、Ｉ１１Ｌ、Ｑ１２Ｗ、Ｒ２７Ｌ、Ｑ２８Ｍ、Ｋ１１９Ｒ、Ｖ１４１Ｔ、Ｐ１４９Ｇ、Ｓ１５７Ｒ、Ｖ１５９Ｍ、Ａ２３１Ｙ、Ｓ２３３Ｌ、及びＮ４０７Ｇである、
    請求項１に記載のＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアント。
  3. （ａ）前記（ａ）のＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントが、配列番号１６６のアミノ酸配列を含む；
    （ｂ）前記（ｂ）のＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントが、配列番号１６８のアミノ酸配列を含む；
    （ｃ）前記（ｃ）のＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントが、配列番号１７０のアミノ酸配列を含む；
    （ｄ）前記（ｄ）のＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントが、配列番号１７２のアミノ酸配列を含む；
    （ｅ）前記（ｅ）のＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントが、配列番号１７４のアミノ酸配列を含む；
    （ｆ）前記（ｆ）のＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントが、配列番号１７６のアミノ酸配列を含む；
    （ｇ）前記（ｇ）のＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントが、配列番号１７８のアミノ酸配列を含む；
    （ｈ）前記（ｈ）のＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントが、配列番号１８０のアミノ酸配列を含む；及び
    （ｉ）前記（ｉ）のＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントが、配列番号１８２のアミノ酸配列を含む、
    請求項２に記載のＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアント。
  4. 配列番号１６６、配列番号１６８、配列番号１７０、配列番号１７２、配列番号１７４、配列番号１７６、配列番号１７８、配列番号１８０、及び配列番号１８２からなる群から選択される、ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアント。
  5. 組換え宿主細胞における前記ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントの発現が、対応する宿主細胞における配列番号６または配列番号３８のＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドの発現により産生されるω−ヒドロキシル化脂肪酸の力価と比較して、より高いω−ヒドロキシル化脂肪酸の力価をもたらす、請求項１〜４のいずれか１項に記載のＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアント。
  6. ハイブリッドＣＹＰ１５３Ａ−ＲｅｄＲｈＦ融合タンパク質バリアントである、請求項１〜４のいずれか１項に記載のＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアント。
  7. 請求項１〜４のいずれか１項に記載のＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントを発現する、組換え宿主細胞。
  8. ＥＣ ３．１．２．−、ＥＣ ３．１．１．５、またはＥＣ ３．１．２．１４のチオエステラーゼポリペプチドをさらに発現する、請求項７に記載の組換え宿主細胞。
  9. 炭素源含有培地において培養された場合に、配列番号３８または配列番号６を含む対応するＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドを発現する宿主細胞により産生されるω−ヒドロキシル化脂肪酸組成物の力価よりも、少なくとも１０％高い、少なくとも１５％高い、少なくとも２０％高い、少なくとも２５％高い、または少なくとも３０％高い力価を有するω−ヒドロキシル化脂肪酸組成物を産生する、請求項８に記載の組換え宿主細胞。
  10. 請求項７〜９のいずれか１項に記載の組換え宿主細胞を含む、細胞培養物。
  11. （ｉ）請求項７〜９のいずれか１項に記載の組換え宿主細胞または請求項１０に記載の細胞培養物を炭素源の存在下で培養すること、及び
    （ｉｉ）ω−ヒドロキシル化脂肪酸を採取すること
    を含む、ω−ヒドロキシル化脂肪酸を産生する方法。
  12. （ｉ）ＥＣ ３．１．２．−、ＥＣ ３．１．１．５、またはＥＣ ３．１．２．１４のチオエステラーゼ、及び
    （ｉｉ）請求項１〜６のいずれか１項に記載のＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアント
    を含むポリペプチドをコードする少なくとも２つの核酸配列を発現するように操作された経路を含む、組換え微生物。
  13. 前記ＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントが、自給型ＣＹＰ１５３Ａ−ＲｅｄＲｈＦハイブリッド融合ポリペプチドバリアントである、請求項１〜６のいずれか１項に記載のＣＹＰ１５３Ａ−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアント、または請求項７〜９のいずれか１項に記載の組換え宿主細胞、または請求項１０に記載の細胞培養物、または請求項１１に記載の方法、または請求項１２に記載の組換え微生物。
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SUMIRE HONDA MALCA; ET AL: "BACTERIAL CYP153A MONOOXYGENASES FOR THE SYNTHESIS OF OMEGA-HYDROXYLATED FATTY ACIDS", CHEMICAL COMMUNICATIONS-CHEMCOM, vol. 48, JPN5018009048, March 2012 (2012-03-01), pages 5115 - 5117, XP002695533, ISSN: 0004421086, DOI: 10.1039/C2CC18103G *

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