JP2023105215A - 末端近傍ヒドロキシラーゼ活性を有するシトクロムｐ４５０酵素を使用したガンマラクトンおよびデルタラクトンの生合成生産 - Google Patents

Abstract

【課題】植物抽出および化学合成によってもたらされる制限なしに、経済的かつ確実にガンマラクトンおよびデルタラクトンを生成するための新規な方法を提供する。【解決手段】ガンマラクトンおよびデルタラクトンの生産のコストを削減し、これらのラクトン化合物を抽出できる天然資源の大規模な培養および処理の環境への影響を軽減するための新しい生産方法が本明細書で提供される。より具体的には、本開示は、異種シトクロムＰ４５０（ＣＹＰ４５０）タンパク質を発現する細胞系を含む微生物発酵によってラクトンを生成するための方法および組成物を包含する。【選択図】図１

Description

関連出願への相互参照
本出願は、その開示の全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１９年３月２１日に出願された米国仮出願第６２／８２１８９４号に基づく優先権を主張している。

発明の分野
本発明の分野は、改変された微生物培養物を介してガンマラクトンおよびデルタラクトンを生成するための方法およびプロセスに関する。より具体的には、本開示は、酵素的変換を介した対応する脂肪酸基質からの５～８個の炭素原子を有するガンマラクトンおよびデルタラクトンの生産に関する。

発明の背景
心地よい味および匂いを有する食品、フレグランスおよび化粧品に対する普遍的な欲求が存在する。多くの場合、これらの心地よい匂いおよび味の特性は、望ましい芳香および香味の特徴を有するさまざまなガンマラクトンおよびデルタラクトンを含むさまざまなラクトン化合物を通して提供される。ラクトン化合物の現在の需要は、主に化学合成または植物からの抽出プロセスのいずれかによって対処されている。植物抽出ベースの生産には、目的の化合物の強度および存在量に対する天候の影響、植物病害および／または不作のリスク、化合物の安定性、生産増加の環境への影響、ならびに貿易制限などの重大な欠点がある。工業生産は環境に損害を与えるおそれがあり、危険な前駆体を使用する可能性があり、重要な基質のコストのためにそれ自体がコストの増加にさらされる可能性がある。

したがって、当技術分野では、植物抽出および化学合成によってもたらされる制限なしに、経済的かつ確実にガンマラクトンおよびデルタラクトンを生成するための新規な方法が必要とされている。

発明の要旨
本発明によると、ラクトンは、細菌および／または酵母などの微生物を使用する遺伝子改変および発酵技術によって、高収率で確実に生産され得る。これらの微生物は、新規に、または脂肪酸の生体内変換によってラクトンを合成して、商業的に有意な収量を提供することができる。したがって、ガンマラクトンおよびデルタラクトンの生産のコストを削減し、これらのラクトン化合物を抽出できる天然資源の大規模な培養および処理の環境への影響を軽減するための新しい生産方法が本明細書で提供される。

より具体的には、本開示は、異種シトクロムＰ４５０（ＣＹＰ４５０）タンパク質を発現する細胞系を含む微生物発酵によってラクトンを生成するための方法および組成物を包含する。

本開示は、一部は、一定のＣＹＰ４５０タンパク質およびその機能的変異体が特定の末端近傍（ｓｕｂｔｅｒｍｉｎａｌ）の炭素原子位置でヒドロキシラーゼ活性を有するという知見に基づく。特に、一定のＣＹＰ４５０タンパク質は、末端（ω）炭素原子に隣接する第１（ω－１）、第２（ω－２）および／または第３（ω－３）の炭素原子で直鎖脂肪酸のヒドロキシル化を引き起こすことが特定されている。改変された微生物系においてこれらのＣＹＰ４５０タンパク質を過剰発現させ、基質としての直鎖脂肪酸を前記改変された微生物系に供給することによって、ω－１、ω－２およびω－３ヒドロキシ脂肪酸が生産され、次いで、これらが高力価でさまざまなガンマラクトンおよびデルタラクトンに効率的に変換され得る。したがって、本開示は、上記の化学合成または植物抽出に関連する欠点なしに、直鎖脂肪酸からガンマラクトンおよびデルタラクトンを生成するための経済的で確実な方法を提供する。

したがって、本開示の一態様は、ラクトンを生成する方法であって、（ａ）末端近傍ヒドロキシ脂肪酸を生成するために、異種ＣＹＰ４５０タンパク質を発現する細胞系を直鎖脂肪酸を含む培地と共にインキュベートすることと、１または複数のガンマラクトンおよびデルタラクトンを生成するために、得られた末端近傍ヒドロキシ脂肪酸を細胞培養物と共にインキュベートすることと、引き続いて酸処理することとを含む方法を提供する。

いくつかの実施形態では、ＣＹＰ４５０タンパク質が、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅ由来のＣＹＰ４５０のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％）同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＹＰ４５０タンパク質が、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅ由来のＣＹＰ４５０のアミノ酸配列と少なくとも９５％（例えば、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％）同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅ由来のＣＹＰ４５０タンパク質が、配列番号３のアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、ＣＹＰ４５０タンパク質が、Ｕｍｂｅｌｏｐｓｉｓ ｉｓａｂｅｌｌｉｎａ由来のＣＹＰ４５０のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％）同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＹＰ４５０タンパク質が、Ｕｍｂｅｌｏｐｓｉｓ ｉｓａｂｅｌｌｉｎａ由来のＣＹＰ４５０のアミノ酸配列と少なくとも９５％（例えば、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％）同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｕｍｂｅｌｏｐｓｉｓ ｉｓａｂｅｌｌｉｎａ由来のＣＹＰ４５０タンパク質が、配列番号６のアミノ酸配列を含む。

本明細書に記載される任意の方法は、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（Ｉｃｄ）タンパク質（例えば、異種Ｉｃｄ）を細胞系で発現させることをさらに含み得る。いくつかの実施形態では、Ｉｃｄタンパク質が、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＩｃｄのアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％）同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｉｃｄタンパク質が、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＩｃｄのアミノ酸配列と少なくとも９５％（例えば、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％）同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＩｃｄタンパク質が、配列番号４のアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、直鎖脂肪酸が、５個の炭素原子～４０個の炭素原子を含む。好ましい実施形態では、直鎖脂肪酸が、７個の炭素原子～２０個の炭素原子を含む。いくつかの実施形態では、脂肪酸が、ラウリン酸、トリデシル酸、またはこれらの組み合わせから選択される。いくつかの実施形態では、末端近傍ヒドロキシ脂肪酸が、ヒドロキシル化ラウリン酸、ヒドロキシル化トリデシル酸、またはこれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、末端近傍ヒドロキシ脂肪酸が、ω－１、ω－２およびω－３からなる群から選択される位置にヒドロキシル基を含む。

いくつかの実施形態では、細胞系が、増殖細胞を含むことができる。いくつかの実施形態では、細胞系が、凍結乾燥細胞を含むことができる。いくつかの実施形態では、細胞系が、細菌細胞、酵母細胞、目的のラクトンを自然に産生しない植物細胞、藻類細胞、真菌細胞、またはこれらの組み合わせを含むことができ、これらのうちの１または複数は、本明細書に記載されるタンパク質を過剰発現するように形質転換されている。いくつかの実施形態では、細胞系が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ；Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ；Ｂａｃｉｌｌｕｓ；Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ；Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ；Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ；Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ；Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ；Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ；Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ；Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ；Ｃａｎｄｉｄａ；Ｈａｎｓｅｎｕｌａ；Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ；Ｍｕｃｏｒ；Ｐｉｃｈｉａ；Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ；Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ；Ａｒｔｈｒｏｂｏｔｌｙｓ；Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉａ；Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ；Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ；Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ；Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ；Ｍｕｃｏｒ；Ｐａｎｔｏｅａ；Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ；およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍからなる群から選択される細菌および／または酵母細胞を含むことができる。

いくつかの実施形態では、ラクトンが、５個の炭素～８個の炭素を含むことができる。いくつかの実施形態では、ラクトンが、複数のδ－ヘキサラクトン、γ－ヘキサラクトンおよびδ－オクタラクトンのうちの１つまたは複数を含む。いくつかの実施形態では、ラクトンが、γ－バレロラクトン、δ－ヘプタラクトンおよびγ－ヘプタラクトンのうちの１つまたは複数を含む。

いくつかの実施形態では、直鎖脂肪酸がラウリン酸であり、末端近傍ヒドロキシ脂肪酸がヒドロキシラウリン酸であり、ラクトンが、δ－ヘキサラクトン、γ－ヘキサラクトンおよびδ－オクタラクトンのうちの１つまたは複数を含む。いくつかの実施形態では、直鎖脂肪酸がトリデシル酸であり、末端近傍ヒドロキシ脂肪酸がヒドロキシトリデシル酸であり、ラクトンがγ－バレロラクトン、δ－ヘプタラクトンおよびγ－ヘプタラクトンのうちの１または複数を含む。いくつかの実施形態では、細胞培養物で処理する前に、末端近傍ヒドロキシ脂肪酸を細胞系から単離する。

本明細書に記載される任意の方法は、微生物細胞培養物または酸性環境からラクトンを単離して粗生成物を提供することをさらに含み得る。いくつかの実施形態では、このような単離ステップから得られる粗生成物が、少なくとも７０％純粋であるラクトン内容物を含むことができる。いくつかの実施形態では、本方法が、ｉ）ラクトンを含む粗生成物を精製することと；ｉｉ）真空下で溶媒を除去して濃縮生成物を提供することとをさらに含む。いくつかの実施形態では、前記粗生成物がカラムクロマトグラフィーによって精製される。いくつかの実施形態では、前記粗生成物が酸塩基抽出によって精製される。いくつかの実施形態では、前記粗生成物が真空蒸留によって精製される。いくつかの実施形態では、本方法が、セミ分取ＨＰＬＣを使用して前記ラクトンを精製することをさらに含む。

本開示はさらに、５～８個の炭素原子を有する１または複数のガンマラクトンおよび／またはデルタラクトンを含むラクトンの混合物を含む発酵生成物組成物を提供する。発酵生成物組成物中のラクトン含有量は、粗混合物の少なくとも７０％（例えば、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％）であり、次いで、微生物細胞培養物からさらに精製することができる。

当業者であれば、本明細書に記載される方法によって生産されるラクトン組成物をさらに精製し、他のラクトン、香味、または香気と混合して、さまざまな消費者製品または食品で使用するための所望の組成物を得ることができることを認識するだろう。例えば、本明細書に記載されるラクトン組成物は、食品（飲料、清涼飲料、アイスクリーム、乳製品、菓子類、シリアル、チューインガム、焼き菓子等など）、栄養補助食品、医学的栄養、ならびに所望の香味または芳香特性を与える医薬品に含まれ得る。いくつかの実施形態では、本開示は、特定の香味条件、配合またはレシピで使用するための、上記の方法のいずれか１つによって生産される、または本明細書の他の場所に記載される香味量または香気量のラクトンを含む消耗品を提供する。いくつかの実施形態では、消耗品が食品、飲料、香水または化粧品であり得る。いくつかの実施形態では、組成物が飲料、菓子類、ベーカリー製品、クッキー、およびチューインガムから選択され得る。特定の実施形態では、組成物が、モモ、アンズ、ナシ、カエデ、ココナツ、熱帯植物（tropical）、バタースコッチ、グレナディンおよび／またはナツメヤシのような味または匂いに設計された香味（favor）または芳香プロファイルを有する食品、飲料、香水または化粧品であり得る。

本開示は、さまざまな修正および代替形態の影響を受けやすいが、その特定の実施形態を、例として図面に示し、本明細書で詳細に説明する。しかしながら、本明細書に提示される図面および詳細な説明は、本開示を開示される特定の実施形態に限定することを意図するものではなく、逆に、添付の特許請求の範囲によって定義される本開示の精神および範囲に入る全ての修正、同等物および代替物を網羅することを意図していることを理解すべきである。

本発明の他の特徴および利点は、添付の図面を参照して、本発明の好ましい実施形態の以下の詳細な説明で明らかになる。
特定の実施形態では、例えば、以下が提供される：
（項目１）
ラクトンを生成する方法であって、
（ａ）末端近傍ヒドロキシ脂肪酸を生成するために、異種シトクロムＰ４５０（ＣＹＰ４５０）タンパク質を発現する細胞系を、直鎖脂肪酸を含む培地と共にインキュベートすることであって、前記直鎖脂肪酸および前記末端近傍ヒドロキシ脂肪酸は５～４０個の炭素原子を有することと、
（ｂ１）ラクトンを生成するために、前記末端近傍ヒドロキシ脂肪酸を酵母細胞培養物と共にインキュベートすることであって、前記ラクトンは少なくとも１つのガンマラクトン、少なくとも１つのデルタラクトン、またはこれらの組み合わせを含むこと、または
（ｂ２）ラクトンを生成するために、末端近傍ヒドロキシ脂肪酸を生成し前記末端近傍ヒドロキシ脂肪酸を酸性環境中でインキュベートすることであって、前記ラクトンは少なくとも１つのガンマラクトン、少なくとも１つのデルタラクトン、またはこれらの組み合わせを含むこと
のいずれかとを含む方法。
（項目２）
前記シトクロムＰ４５０タンパク質が、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅ由来のシトクロムＰ４５０タンパク質のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記シトクロムＰ４５０タンパク質が配列番号３のアミノ酸配列を含む、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記シトクロムＰ４５０タンパク質が、Ｕｍｂｅｌｏｐｓｉｓ ｉｓａｂｅｌｌｉｎａ由来のシトクロムＰ４５０タンパク質のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記細胞シトクロムＰ４５０タンパク質が配列番号６のアミノ酸配列を含む、項目１に記載の方法。
（項目６）
前記細胞系が、異種シトクロム４５０タンパク質を発現することに加えて、外因性イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（Ｉｃｄ）タンパク質を発現する、項目１から５のいずれか一項に記載の方法。
（項目７）
前記Ｉｃｄタンパク質が、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＩｃｄタンパク質のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、項目６に記載の方法。
（項目８）
前記Ｉｃｄタンパク質が配列番号４のアミノ酸配列を含む、項目６に記載の方法。
（項目９）
前記直鎖脂肪酸および前記末端近傍ヒドロキシ脂肪酸が７個の炭素～２０個の炭素を有する、項目１から８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０）
前記直鎖脂肪酸がラウリン酸またはトリデシル酸である、項目１から９のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１）
前記末端近傍ヒドロキシ脂肪酸がヒドロキシル化ラウリン酸またはヒドロキシル化トリデシル酸である、項目１から１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２）
前記末端近傍ヒドロキシ脂肪酸が、ω－１、ω－２およびω－３からなる群から選択される炭素位置にヒドロキシル基を含む、項目１から１１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３）
前記細胞系が細菌細胞、酵母細胞またはこれらの組み合わせを含む、項目１から１２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４）
前記細胞系が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ；Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ；Ｂａｃｉｌｌｕｓ；Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ；Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ；Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ；Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ；Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ；Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ；Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ；Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ；Ｃａｎｄｉｄａ；Ｈａｎｓｅｎｕｌａ；Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ；Ｍｕｃｏｒ；Ｐｉｃｈｉａ；Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ；Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ；Ａｒｔｈｒｏｂｏｔｌｙｓ；Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉａ；Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ；Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ；Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ；Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ；Ｐａｎｔｏｅａ；およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍからなる群から選択される細菌細胞または酵母細胞を含む、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
前記細菌細胞がＥ．ｃｏｌｉ細胞である、項目１から１２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１６）
前記酵母細胞培養物がＣａｎｄｉｄａ ｂｏｉｄｉｎｉｉ細胞を含む、項目１から１２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１７）
前記ラクトンが５個の炭素～８個の炭素を含む、項目１から１６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１８）
前記ラクトンが、δ－ヘキサラクトン、γ－ヘキサラクトンおよびδ－オクタラクトンのうちの１つまたは複数を含む、項目１から１７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９）
前記ラクトンが、γ－バレロラクトン、δ－ヘプタラクトンおよびγ－ヘプタラクトンのうちの１つまたは複数を含む、項目１から１７のいずれか一項に記載の方法。
（項目２０）
前記直鎖脂肪酸がラウリン酸であり、前記末端近傍ヒドロキシル脂肪酸が、ω－１ヒドロキシラウリン酸、ω－２ヒドロキシラウリン酸およびω－３ヒドロキシラウリン酸のうちの１つまたは複数を含み、前記ラクトンが、δ－ヘキサラクトン、γ－ヘキサラクトンおよびδ－オクタラクトンのうちの１つまたは複数を含む、項目１から８のいずれか一項に記載の方法。
（項目２１）
前記直鎖脂肪酸がトリデシル酸であり、前記末端近傍ヒドロキシ脂肪酸がω－１ヒドロキシトリデシル酸、ω－２ヒドロキシトリデシル酸およびω－３ヒドロキシトリデシル酸のうちの１または複数を含み、前記ラクトンがγ－バレロラクトン、δ－ヘプタラクトンおよびγ－ヘプタラクトンのうちの１または複数を含む、項目１から８のいずれか一項に記載の方法。
（項目２２）
前記末端近傍ヒドロキシ脂肪酸が、ステップ（ｂ１）または（ｂ２）の前に前記細胞系から単離される、項目１から２１のいずれか一項に記載の方法。
（項目２３）
前記酵母細胞培養物から前記ラクトンを単離することをさらに含む、項目１から２１のいずれか一項に記載の方法。
（項目２４）
ラクトンを生成する方法であって、
（ａ）末端近傍ヒドロキシ脂肪酸を生成するために、異種シトクロムＰ４５０タンパク質を発現する細胞系を、直鎖脂肪酸を含む培地と共にインキュベートすることであって、前記直鎖脂肪酸および前記末端近傍ヒドロキシ脂肪酸は５～４０個の炭素原子を有することと、
（ｂ）前記ステップ（ａ）の前記末端近傍ヒドロキシ脂肪酸よりも短い長さを有する末端近傍ヒドロキシ脂肪酸を生成するために、前記ステップ（ａ）の前記末端近傍ヒドロキシ脂肪酸を細胞培養物と共にインキュベートすることと、
（ｃ）ラクトンを生成するために、ステップ（ｂ）の最後で得られた前記末端近傍ヒドロキシ脂肪酸を酸性環境中でインキュベートすることであって、前記ラクトンは少なくとも１つのガンマラクトン、少なくとも１つのデルタラクトン、またはこれらの組み合わせを含むことと
を含む方法。
（項目２５）
前記シトクロムＰ４５０タンパク質が、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅ由来のシトクロムＰ４５０タンパク質のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
前記シトクロムＰ４５０タンパク質が、Ｕｍｂｅｌｏｐｓｉｓ ｉｓａｂｅｌｌｉｎａ由来のシトクロムＰ４５０タンパク質のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、項目２４に記載の方法。
（項目２７）
前記細胞系が、異種シトクロム４５０タンパク質を発現することに加えて、外因性イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（Ｉｃｄ）タンパク質を発現する、項目２４から２６のいずれか一項に記載の方法。
（項目２８）
前記Ｉｃｄタンパク質が、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＩｃｄタンパク質のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、項目２７に記載の方法。

以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本開示の特定の態様をさらに実証するために含まれ、本明細書に提示される特定の実施形態の詳細な説明と組み合わせてこれらの図面の１またはそれを超えるものを参照することによってよりよく理解することができる。

図１は、Ｃ１８脂肪酸（ステアリン酸）が中間体としての末端近傍ヒドロキシ脂肪酸（１７－ヒドロキシステアリン酸）を伴う２段階プロセスを介してデルタヘキサラクトンに生物変換される、本開示によるガンマラクトンおよびデルタラクトンを生成するための生合成経路の一実施形態を示す概略図を示している。

図２Ａは、Ｍ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅ ＣＹＰ５０５Ａ３０およびＥ．ｃｏｌｉ ｉｃｄが過剰発現された細胞系における、対応する直鎖脂肪酸Ｃ１２：０からの末端近傍ヒドロキシ脂肪酸ＨＯ－Ｃ１２：０の生産を確認するＧＣ／ＭＳスペクトルを示している。生物変換の４時間後に試料を採取した。

図２Ｂは、Ｍ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅ ＣＹＰ５０５Ａ３０およびＥ．ｃｏｌｉ ｉｃｄが過剰発現された細胞系における、対応する直鎖脂肪酸Ｃ１３：０からの末端近傍ヒドロキシ脂肪酸ＨＯ－Ｃ１３：０の生産を確認するＧＣ／ＭＳスペクトルをしている。生物変換の４時間後に試料を採取した。

図３は、ラウリン酸（Ｃ１２：０）からのδ－ヘキサラクトン（ＤＣ６）、γ－ヘキサラクトン（ＧＣ６）およびδ－オクタラクトン（ＤＣ８）の生産を示している。

図４Ａ、４Ｂ、４Ｃ、４Ｄおよび４Ｅは、末端近傍ヒドロキシ脂肪酸ＨＯ－１２：０からのガンマラクトンおよびデルタラクトンの生産を確認するＧＣ／ＭＳスペクトルを示している。図４Ａは上部である。図４Ｂは上から２番目である。図４Ｃは中央である。図４Ｄは上から４番目であり、図４Ｅは下部である。ピークは、Ｓｉｇｍａの標準と比較したピークの保持時間および質量スペクトルに基づいて特定される。図４Ｂおよびピーク１：γ－ヘキサラクトン（ＧＣ６）；図４Ｃおよびピーク２：δ－ヘキサラクトン（ＤＣ６）；図４Ｄおよびピーク３：フェネチルアルコール；ならびに図４Ｅおよびピーク４：δ－オクタラクトン（ＤＣ８）。 図４Ａ、４Ｂ、４Ｃ、４Ｄおよび４Ｅは、末端近傍ヒドロキシ脂肪酸ＨＯ－１２：０からのガンマラクトンおよびデルタラクトンの生産を確認するＧＣ／ＭＳスペクトルを示している。図４Ａは上部である。図４Ｂは上から２番目である。図４Ｃは中央である。図４Ｄは上から４番目であり、図４Ｅは下部である。ピークは、Ｓｉｇｍａの標準と比較したピークの保持時間および質量スペクトルに基づいて特定される。図４Ｂおよびピーク１：γ－ヘキサラクトン（ＧＣ６）；図４Ｃおよびピーク２：δ－ヘキサラクトン（ＤＣ６）；図４Ｄおよびピーク３：フェネチルアルコール；ならびに図４Ｅおよびピーク４：δ－オクタラクトン（ＤＣ８）。 図４Ａ、４Ｂ、４Ｃ、４Ｄおよび４Ｅは、末端近傍ヒドロキシ脂肪酸ＨＯ－１２：０からのガンマラクトンおよびデルタラクトンの生産を確認するＧＣ／ＭＳスペクトルを示している。図４Ａは上部である。図４Ｂは上から２番目である。図４Ｃは中央である。図４Ｄは上から４番目であり、図４Ｅは下部である。ピークは、Ｓｉｇｍａの標準と比較したピークの保持時間および質量スペクトルに基づいて特定される。図４Ｂおよびピーク１：γ－ヘキサラクトン（ＧＣ６）；図４Ｃおよびピーク２：δ－ヘキサラクトン（ＤＣ６）；図４Ｄおよびピーク３：フェネチルアルコール；ならびに図４Ｅおよびピーク４：δ－オクタラクトン（ＤＣ８）。

図５は、トリデカン酸（Ｃ１３：０）からのγ－バレロラクトン（ＧＣ５）、δ－ヘプタラクトン（ＤＣ７）およびγ－ヘプタラクトン（ＧＣ７）の生産を示している。

６Ａ、６Ｂ、６Ｃおよび６Ｄは、末端近傍ヒドロキシ脂肪酸ＨＯ－１３：０からのガンマラクトンおよびデルタラクトンの生産を確認するＧＣ／ＭＳスペクトルを示している。ピークは、Ｓｉｇｍａの標準と比較したピークの保持時間および質量スペクトルに基づいて特定される。図６Ａは上部である。図６Ｂは上から２番目である。図６Ｃは上から３番目であり、図６Ｄは下部である。図６Ｂおよびピーク１：フェネチルアルコール；図６Ｃおよびピーク２：γ－ヘプタラクトン（ＧＣ７）；図６Ｄおよびピーク３：δ－ヘプタラクトン（ＤＣ７）。 ６Ａ、６Ｂ、６Ｃおよび６Ｄは、末端近傍ヒドロキシ脂肪酸ＨＯ－１３：０からのガンマラクトンおよびデルタラクトンの生産を確認するＧＣ／ＭＳスペクトルを示している。ピークは、Ｓｉｇｍａの標準と比較したピークの保持時間および質量スペクトルに基づいて特定される。図６Ａは上部である。図６Ｂは上から２番目である。図６Ｃは上から３番目であり、図６Ｄは下部である。図６Ｂおよびピーク１：フェネチルアルコール；図６Ｃおよびピーク２：γ－ヘプタラクトン（ＧＣ７）；図６Ｄおよびピーク３：δ－ヘプタラクトン（ＤＣ７）。

図７Ａおよび７Ｂは、遺伝子ＭＩ２が過剰発現された細胞系における、それぞれＣ１２：０およびＣ１３：０からの末端近傍ヒドロキシ脂肪酸ＨＯ－Ｃ１２：０（図７Ａのピーク１）およびＨＯ－Ｃ１３：０（図７Ｂのピーク１）の生産を確認するＧＣ／ＭＳスペクトルを示している。生物変換の９時間後に試料を採取し、Ｎ－トリエチルシリル－Ｎ－メチルトリフルオロアセトアミドでシリル化した。

図８Ａおよび８Ｂは、さまざまなヒドロキシ脂肪酸からのラクトン生産を確認するＧＣ／ＭＳスペクトルを示している。図８Ａ：ＭＩ２－Ｃ１２－ＣＳＬ培地で増殖させたＣａｎｄｉｄａ ｂｏｉｄｉｎｉｉ培養物。図８Ｂ：ＭＩ２－Ｃ１３－ＣＳＬ培地で増殖させたＣａｎｄｉｄａ ｂｏｉｄｉｎｉｉ培養物。図８Ａ～８Ｂの略語は以下の意味を有する：ＧＣ６：γ－ヘキサラクトン；ＤＣ７：δ－ヘプタラクトン（ＤＣ７）；Ｃ１２：ラウリン酸；Ｃ１３：トリデカン酸。接種の２日後に試料を採取した。

好ましい実施形態の説明
ラクトンは、食品、果実および飲料に広く見られる工業的に重要な香味化合物であり、多くのフルーティーな芳香の食品および化粧品で使用されている（例えば、Ｒｏｍｅｒｏ－Ｇｕｉｄｏら、２０１１．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｌａｃｔｏｎｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ ｙｅａｓｔ ａｎｄ ｆｕｎｇｉ ａｎｄ ｉｔｓ ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｆｌａｖｏｒ ａｎｄ ｆｒａｇｒａｎｃｅ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８９：５３５－５４７参照）。本開示は、いくつかの実施形態で、脂肪酸からラクトンを生成する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本方法が、異種シトクロムＰ４５０（ＣＹＰ４５０）タンパク質を発現する細胞系が脂肪酸をヒドロキシ脂肪酸に変換する第１のステップを含む。いくつかの実施形態では、本方法が、微生物細胞培養物、例えば酵母細胞培養物が、β酸化と呼ばれる生化学的プロセスを通して末端近傍ヒドロキシ脂肪酸の長さを適切な長さに短縮し、環化すると適切なラクトンが得られる第２のステップを含む。したがって、本発明によるプロセスの第２のステップの最後での末端近傍ヒドロキシ酸の長さは、本発明によるプロセスの第１のステップの最後で得られる末端近傍ヒドロキシ脂肪酸の長さよりも短い。いくつかの実施形態では、第２のステップが、短縮された末端近傍ヒドロキシ脂肪酸の適切なラクトンへの環化を誘導する酸性化ステップをさらに含む。本明細書で提供される方法は、細胞培養物または酸性環境からラクトンを単離することをさらに含む。

ラクトンを生成する方法
本明細書に記載される方法は、いくつかの実施形態で、脂肪酸からのラクトンの生産を提供する。いくつかの実施形態では、ラクトンを生成する方法が、（ａ）末端近傍ヒドロキシ脂肪酸を生成するために、異種シトクロムＰ４５０（ＣＹＰ４５０）タンパク質を発現する細胞系を、直鎖脂肪酸を含む培地と共にインキュベートするステップと、（ｂ）末端近傍ヒドロキシ酸の長さを適切な長さに短縮するために、ステップ（ａ）の末端近傍ヒドロキシル脂肪酸を微生物細胞培養物と共にインキュベートするステップと、（ｃ）適切なラクトンを得るために、ステップ（ｂ）の短縮された末端近傍ヒドロキシ酸を酸性環境で環化に供するステップとを含む。

いくつかの実施形態では、ラクトンを生成する方法が、異種ＣＹＰ４５０タンパク質を発現する細胞系から収穫された細胞ペレットを、脂肪酸を含む培地と共にインキュベートすることを含む。いくつかの実施形態では、ラクトンを生成する方法が、細胞系から収穫された再懸濁された細胞ペレットを、脂肪酸を含む培地と共にインキュベートすることを含む。

本明細書に記載されるラクトンを生成する方法は、異種ＣＹＰ４５０タンパク質を発現する細胞系を、任意の比率で脂肪酸を含む培地と共にインキュベートすることを含む。いくつかの実施形態では、ラクトンを生成する方法が、１リットル当たり１グラムの細胞～１リットル当たり２００グラムの細胞（１ｇ／Ｌ～２００ｇ／Ｌ）を含む細胞系と１リットル当たり１グラムの脂肪酸～１リットル当たり２０グラムの脂肪酸（１ｇ／Ｌ～２０ｇ／Ｌ）を含む培地をインキュベートすることを含む。いくつかの実施形態では、ラクトンを生成する方法が、１リットル当たり１００グラムの細胞（１００ｇ／Ｌ）を含む細胞系と１リットル当たり３グラムの脂肪酸（３ｇ／Ｌ）を含む培地をインキュベートすることを含む。

いくつかの実施形態では、ラクトンを生成する方法が、ヒドロキシ脂肪酸の形成に十分な適切な期間、細胞系を、脂肪酸を含む培地と共にインキュベートすることを含む。いくつかの実施形態では、ラクトンを生成する方法が、微生物細胞培養物中のラクトンの形成に十分な適切な期間、ヒドロキシ脂肪酸を細胞培養物と接触させることを含む。いくつかの実施形態では、ラクトンを生成する方法が、微生物細胞培養物との接触前に、細胞系からヒドロキシ脂肪酸を単離することを含む。いくつかの実施形態では、ラクトンを生成する方法が、微生物細胞培養物を含む培地中でヒドロキシ脂肪酸をインキュベートすることを含む。

本明細書に記載されるラクトンを生成する方法は、特定の期間にわたって異種ＣＹＰ４５０タンパク質を発現する細胞系を、脂肪酸を含む培地と共にインキュベートすることを包含する。いくつかの実施形態では、ラクトンを生成する方法が、０．５時間～９６時間の期間、異種ＣＹＰ４５０タンパク質を発現する細胞系を、脂肪酸を含む培地と共にインキュベートすることを含む。

本明細書に記載されるラクトンを生成する方法は、特定の温度で、異種ＣＹＰ４５０タンパク質を発現する細胞系を、脂肪酸を含む培地と共にインキュベートすることを包含する。いくつかの実施形態では、ラクトンを生成する方法が、１６℃～４０℃の温度で、異種ＣＹＰ４５０タンパク質を発現する細胞系を、脂肪酸を含む培地と共にインキュベートすることを含む。

シトクロムＰ４５０
シトクロムＰ４５０（ＣＹＰ４５０）タンパク質は、一般に、基質の酸化を触媒する酵素である。ＣＹＰ４５０タンパク質は、ヘムタンパク質スーパーファミリーのメンバーであり、補因子としてヘムを含む。ＣＹＰ４５０酵素は、それだけに限らないが、動物、植物、真菌、細菌、古細菌およびウイルスを含む多くの生物で同定されている。脂肪酸の末端近傍ヒドロキシル化を触媒する任意のＣＹＰ４５０タンパク質、またはその任意の機能的変異体もしくは断片が、本明細書に記載される方法で使用され得る。末端近傍ヒドロキシラーゼ活性を有することが報告されているＣＹＰ４５０タンパク質の例としては、それだけに限らないが、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ由来のＣＹＰ１０２Ａ１（またはＰ４５０_ＢＭ３）、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅ由来のＣＹＰ４５０タンパク質（Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｇ２ＱＤＺ３）、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ由来のＣＹＰ４５０、Ｕｍｂｅｌｏｐｓｉｓ ｉｓａｂｅｌｌｉｎａ由来のＣＹＰ４５０タンパク質、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍａｒｉｎｕｍ由来のＣＹＰ１４７Ｇ１、Ｓｏｒａｎｇｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌｏｓｕｍ由来のＣＹＰ１０９Ｄ１、Ｔｒｉｔｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ由来のＣＹＰ７０９Ｃ１、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のＣＹＰ１０９Ｂ１、Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ由来のＣＹＰ５０５Ｄ６、またはその任意の機能的変異体もしくは断片が挙げられる。いくつかの実施形態では、１つを超えるＣＹＰ４５０タンパク質が本明細書に記載される方法で使用される。いくつかの実施形態では、２、３、４または５つの異なるＣＹＰ４５０タンパク質が本明細書に記載される方法で使用される。

いくつかの実施形態では、ＣＹＰ４５０タンパク質が、配列番号１の核酸配列によってコードされるＭｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅ由来のＣＹＰ４５０のアミノ酸配列と少なくとも７５％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＹＰ４５０タンパク質が、配列番号１の核酸配列によってコードされるＭｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅ由来のＣＹＰ４５０タンパク質のアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＹＰ４５０タンパク質が、配列番号１の核酸によってコードされるアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、ＣＹＰ４５０タンパク質が、配列番号３で提供されるＭｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅ由来のＣＹＰ４５０のアミノ酸配列と少なくとも７５％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＹＰ４５０タンパク質が、配列番号３で提供されるＭｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅ由来のＣＹＰ４５０タンパク質のアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＹＰ４５０タンパク質が、配列番号３のアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、ＣＹＰ４５０タンパク質が、配列番号５の核酸配列によってコードされるＵｍｂｅｌｏｐｓｉｓ ｉｓａｂｅｌｌｉｎａ由来のＣＹＰ４５０のアミノ酸配列と少なくとも７５％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＹＰ４５０タンパク質が、配列番号５の核酸配列によってコードされるＵｍｂｅｌｏｐｓｉｓ ｉｓａｂｅｌｌｉｎａ由来のＣＹＰ４５０タンパク質のアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＹＰ４５０タンパク質が、配列番号５の核酸によってコードされるアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、ＣＹＰ４５０タンパク質が、配列番号６で提供されるＵｍｂｅｌｏｐｓｉｓ ｉｓａｂｅｌｌｉｎａ由来のＣＹＰ４５０のアミノ酸配列と少なくとも７５％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＹＰ４５０タンパク質が、配列番号６で提供されるＵｍｂｅｌｏｐｓｉｓ ｉｓａｂｅｌｌｉｎａ由来のＣＹＰ４５０タンパク質のアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＹＰ４５０タンパク質が、配列番号６のアミノ酸配列を含む。

ＣＹＰ４５０タンパク質が、いくつかの実施形態では、脂肪酸のヒドロキシ脂肪酸への変換を触媒する。いくつかの実施形態では、ＣＹＰ４５０タンパク質が、ω－１～ω－３ヒドロキシ脂肪酸の形成を触媒する。いくつかの実施形態では、ＣＹＰ４５０タンパク質が、ω－１ヒドロキシ脂肪酸の形成を触媒する。いくつかの実施形態では、ＣＹＰ４５０タンパク質が、ω－２ヒドロキシ脂肪酸の形成を触媒する。いくつかの実施形態では、ＣＹＰ４５０タンパク質が、ω－３ヒドロキシ脂肪酸の形成を触媒する。

イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（Ｉｃｄ）
イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（Ｉｃｄ）タンパク質は、一般に、イソクエン酸の酸化的脱炭酸を触媒する酵素である。Ｉｃｄタンパク質は、それだけに限らないが、動物、植物、真菌、細菌、古細菌およびウイルスを含む多くの生物で同定されている。Ｉｃｄタンパク質が、いくつかの実施形態では、ＮＡＤ^＋をＮＡＤＨに、またはＮＡＤＰ^＋をＮＡＤＰＨに変換する。いくつかの実施形態では、Ｉｃｄタンパク質によって生成されたＮＡＤＨおよび／またはＮＡＤＰＨが、別の酵素（例えば、ＣＹＰ４５０）によって利用され、よって他の酵素の活性を促進し得る。ＮＡＤ^＋のＮＡＤＨへの変換もしくはＮＡＤＰ^＋のＮＡＤＰＨへの変換を触媒する任意のＩｃｄタンパク質、またはその任意の機能的変異体もしくは断片が、本明細書に記載される方法で使用され得る。Ｉｃｄタンパク質の例としては、それだけに限らないが、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＩｃｄタンパク質（Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｐ０８２００）が挙げられる。いくつかの実施形態では、１つを超えるＩｃｄタンパク質が本明細書に記載される方法で使用される。いくつかの実施形態では、２、３、４または５つの異なるＩｃｄタンパク質が本明細書に記載される方法で使用される。

いくつかの実施形態では、Ｉｃｄタンパク質が、配列番号２の核酸配列によってコードされるＥ．ｃｏｌｉ由来のＩｃｄのアミノ酸配列と少なくとも７５％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｉｃｄタンパク質が、配列番号２の核酸配列によってコードされるＥ．ｃｏｌｉ由来のＩｃｄタンパク質のアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｉｃｄタンパク質が、配列番号２の核酸によってコードされるアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、Ｉｃｄタンパク質が、配列番号４で提供されるＥ．ｃｏｌｉ由来のＩｃｄのアミノ酸配列と少なくとも７５％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｉｃｄタンパク質が、配列番号４で提供されるＥ．ｃｏｌｉ由来のＩｃｄタンパク質のアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｉｃｄタンパク質が、配列番号４のアミノ酸配列を含む。

ラクトン
本明細書に記載される方法によると、ヒドロキシ脂肪酸がラクトンに変換され得る。本開示によると、本明細書で提供される方法は、末端近傍ヒドロキシ脂肪酸をγ－ラクトン、δ－ラクトン、およびこれらの組み合わせに変換する。ラクトンの例としては、それだけに限らないが、δ－ヘキサラクトン、γ－ヘキサラクトン、δ－オクタラクトン、γ－バレロラクトン、δ－ヘプタラクトンおよびγ－ヘプタラクトンが挙げられる。

いくつかの実施形態では、末端近傍ヒドロキシラウリン酸がδ－ヘキサラクトン、γ－ヘキサラクトンおよび／またはδ－オクタラクトンに変換される。いくつかの実施形態では、ヒドロキシトリデカン酸がγ－バレロラクトン、δ－ヘプタラクトンおよび／またはγ－ヘプタラクトンに変換される。

本明細書に記載されるラクトンが、いくつかの実施形態では、５個の炭素～８個の炭素を含む。いくつかの実施形態では、ラクトンが５個の炭素を含む。いくつかの実施形態では、ラクトンが６個の炭素を含む。いくつかの実施形態では、ラクトンが７個の炭素を含む。いくつかの実施形態では、ラクトンが８個の炭素を含む。

本明細書に記載される方法に従って生産された任意のラクトンは、当技術分野で知られている任意の方法を使用して、細胞培養物から単離または精製され得る。いくつかの実施形態では、ラクトンが、クロマトグラフィーを用いて細胞培養物から単離または精製される。いくつかの実施形態では、ラクトンが、有機溶媒を用いて細胞培養物から単離または精製される。いくつかの実施形態では、単離または精製されたラクトンを、製品、例えば、食品、飲料、香水または化粧品に組み込むことができる。

脂肪酸
本明細書に記載される方法によると、脂肪酸がヒドロキシ脂肪酸に変換され得る。任意の脂肪酸が、本明細書中に開示される方法に従ってそのヒドロキシル化形態に変換され得る。脂肪酸の例としては、ペンタン酸、ヘキサン酸、ヘプタン酸、オクタン酸、ノナン酸、デカン酸、ウンデカン酸、ドデカン酸、トリデカン酸、テトラデカン酸、ペンタデカン酸、ヘキサデカン酸、ヘプタデカン酸、オクタデカン酸、ノナデカン酸、エイコサン酸、ヘンエイコサン酸、ドコサン酸、トリコサン酸、テトラコサン酸、ペンタコサン酸、ヘキサコサン酸、ヘプタコサン酸、オクタコサン酸、ノナコサン酸、トリアコンタン酸、ヘントリアコンタン酸（ｈｅｎａｔｒｉａｃｏｎｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、ドトリアコンタン酸、トリトリアコンタン酸、テトラトリアコンタン酸、ペンタトリアコンタン酸、ヘキサトリアコンタン酸、ヘプタトリアコンタン酸、オクタトリアコンタン酸、ノナトリアコンタン酸、およびテトラコンタン酸が挙げられるがこれらに限定されない。表１は、例示的な脂肪酸の一般名、構造式および脂質数を提供する。

本明細書に記載される脂肪酸が、いくつかの実施形態では、５個の炭素～４０個の炭素を含む。いくつかの実施形態では、脂肪酸が、５個の炭素、６個の炭素、７個の炭素、８個の炭素、９個の炭素、１０個の炭素、１１個の炭素、１２個の炭素、１３個の炭素、１４個の炭素、１５個の炭素、１６個の炭素、１７個の炭素、１８個の炭素、１９個の炭素、２０個の炭素、２１個の炭素、２２個の炭素、２３個の炭素、２４個の炭素、２５個の炭素、２６個の炭素、２７個の炭素、２８個の炭素、２９個の炭素、３０個の炭素、３１個の炭素、３２個の炭素、３３個の炭素、３４個の炭素、３５個の炭素、３６個の炭素、３７個の炭素、３８個の炭素、３９個の炭素、４０個の炭素、またはそれを超える炭素を含む。

本明細書に記載される脂肪酸が、いくつかの実施形態では、培地中に提供される。いくつかの実施態様では、脂肪酸を含む培地が細胞培養培地を含む。いくつかの実施形態では、脂肪酸を含む培地が塩を含む。塩は、アニオンとカチオンとの組み合わせである。カチオンの非限定的な例としては、リチウム、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムおよびアンモニウムが挙げられる。アニオンの非限定的な例としては、アセテート、塩化物、サルフェートおよびホスフェートが挙げられる。いくつかの実施形態では、脂肪酸を含む培地がイソクエン酸三ナトリウム塩を含む。

いくつかの実施形態では、脂肪酸を含む培地が緩衝液を含む。緩衝液の例としては、限定されないが、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、リンゴ酸緩衝液、ＭＥＳ緩衝液、ヒスチジン緩衝液、ＰＩＰＥＳ緩衝液、ビストリス緩衝液、およびエタノールアミン緩衝液が挙げられる。

いくつかの実施形態では、脂肪酸を含む培地が界面活性剤を含む。界面活性剤の非限定的な例としては、ポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート（ＴＷＥＥＮ（登録商標）４０）、４－（１，１，３，３－テトラメチルブチル）フェニル－ポリエチレングリコール（ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ－１００）、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、エチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＥＴＭＡＢ）、ラウリルトリメチルアンモニウムブロミド（ＬＴＡＢ）、およびラウリルトリメチルアンモニウムクロリド（ＬＴＡＣ）が挙げられる。

脂肪酸を含む培地は、任意の濃度の脂肪酸を含み得る。いくつかの実施形態では、脂肪酸を含む培地が、０．５ｇ／Ｌ～１００ｇ／Ｌの脂肪酸、例えば１ｇ／Ｌ～１０ｇ／Ｌの脂肪酸を含む。いくつかの実施形態では、脂肪酸を含む培地が、０．５ｇ／Ｌ、１ｇ／Ｌ、２ｇ／Ｌ、３ｇ／Ｌ、４ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌ、６ｇ／Ｌ、７ｇ／Ｌ、８ｇ／Ｌ、９ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌ、３０ｇ／Ｌ、４０ｇ／Ｌ、５０ｇ／Ｌ、６０ｇ／Ｌ、７０ｇ／Ｌ、８０ｇ／Ｌ、９０ｇ／Ｌまたは１００ｇ／Ｌの脂肪酸を含む。

本明細書に記載される任意の脂肪酸は、本明細書に記載される方法に従ってヒドロキシル化され得る。いくつかの実施形態では、ペンタン酸がヒドロキシル化ペンタン酸に変換され、ヘキサン酸がヒドロキシル化ヘキサン酸に変換され、ヘプタン酸がヒドロキシル化ヘプタン酸に変換され、オクタン酸がヒドロキシル化オクタン酸に変換され、ノナン酸がヒドロキシル化ノナン酸に変換され、デカン酸がヒドロキシル化デカン酸に変換され、ウンデカン酸がヒドロキシル化ウンデカン酸に変換され、ドデカン酸がヒドロキシル化ドデカン酸に変換され、トリデカン酸がヒドロキシル化トリデカン酸に変換され、テトラデカン酸がヒドロキシル化テトラデカン酸に変換され、ペンタデカン酸がヒドロキシル化ペンタデカン酸に変換され、ヘキサデカン酸がヒドロキシル化ヘキサデカン酸に変換され、ヘプタデカン酸がヒドロキシル化ヘプタデカン酸に変換され、オクタデカン酸がヒドロキシル化オクタデカン酸に変換され、ノナデカン酸がヒドロキシル化ノナデカン酸に変換され、エイコサン酸がヒドロキシル化エイコサン酸に変換され、ヘンエイコサン酸．がヒドロキシル化ヘンエイコサン酸に変換され、ドコサン酸がヒドロキシル化ドコサン酸に変換され、トリコサン酸がヒドロキシル化トリコサン酸に変換され、テトラコサン酸がヒドロキシル化テトラコサン酸に変換され、ペンタコサン酸がヒドロキシル化ペンタコサン酸に変換され、ヘキサコサン酸がヒドロキシル化ヘキサコサンに変換され、ヘプタコサン酸がヒドロキシル化ヘプタコサン酸に変換され、オクタコサン酸がヒドロキシル化オクタコサン酸に変換され、ノナコサン酸がヒドロキシル化ノナコサン酸に変換され、トリアコンタン酸がヒドロキシル化トリアコンタン酸に変換され、ヘントリアコンタン酸（ｈｅｎａｔｒｉａｃｏｎｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）がヒドロキシル化ヘントリアコンタン酸（ｈｅｎａｔｒｉａｃｏｎｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）に変換され、ドトリアコンタン酸がヒドロキシル化ドトリアコンタン酸に変換され、トリトリアコンタン酸がヒドロキシル化トリトリアコンタン酸に変換され、テトラトリアコンタン酸がヒドロキシル化テトラトリアコンタン酸に変換され、ペンタトリアコンタン酸がヒドロキシル化ペンタトリアコンタン酸に変換され、ヘキサトリアコンタン酸がヒドロキシル化ヘキサトリアコンタン酸に変換され、ヘプタトリアコンタン酸がヒドロキシル化ヘプタトリアコンタン酸に変換され、オクタトリアコンタン酸がヒドロキシル化オクタトリアコンタン酸に変換され、ノナトリアコンタン酸がヒドロキシル化ノナトリアコンタン酸に変換され、テトラコンタン酸がヒドロキシル化テトラコンタン酸に変換される。

ヒドロキシ脂肪酸が、いくつかの実施形態では、ω－１、ω－２、ω－３位またはこれらの組み合わせにヒドロキシル基を含む。いくつかの実施形態では、ヒドロキシル脂肪酸が、ω－１、ω－２およびω－３位にヒドロキシル基を含む。いくつかの実施形態では、ヒドロキシル脂肪酸が、ω－１位にヒドロキシル基を含む。いくつかの実施形態では、ヒドロキシル脂肪酸が、ω－２位にヒドロキシル基を含む。いくつかの実施形態では、ヒドロキシル脂肪酸が、ω－３位にヒドロキシル基を含む。

いくつかの実施形態では、ヒドロキシ脂肪酸を細胞培養物と接触させる。いくつかの実施形態では、ヒドロキシ脂肪酸を細胞培養物と接触させることが、もしあれば、細胞培養物中のラクトンの形成に十分な適切な期間、ヒドロキシ脂肪酸を細胞培養物に曝露することを含む。いくつかの実施形態では、ヒドロキシ脂肪酸を、細胞培養物との接触前に単離する。いくつかの実施形態では、培地中のヒドロキシ脂肪酸を細胞培養物と接触させる。

細胞系
細胞系は、異所性タンパク質または異種タンパク質（例えば、ＣＹＰ４５０）の発現を提供する任意の１つまたは複数の細胞を指す。細胞系には、それだけに限らないが、細菌細胞、酵母細胞、植物細胞および動物細胞が含まれる。いくつかの実施形態では、細胞系が細菌細胞、酵母細胞またはこれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、細胞系が原核細胞、真核細胞およびこれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、細胞系がリボソームなどの細胞成分に基づくタンパク質のインビトロ発現を含む。

本開示の細菌細胞には、限定されないが、以下が含まれる：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｓｐｐ．、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ．、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐｐ．、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐｐ．、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐｐ．、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｐ．、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ．、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｓｐｐ．、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ．、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ．、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．、Ｃｏｍａｍｏｎａｓ ｓｐｐ．、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｐ．、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｐｐ．、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．、Ｍｉｃｒｏｌｕｎａｔｕｓ ｓｐｐ．、Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｐ．、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｓｐｐ．、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｓｐｐ．、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｐｐ．、Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ．、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｐ．、Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐｐ．、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｓｐｐ．、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｐ．、Ｐａｎｔｏｅａ ｓｐｐ．およびＶｉｂｒｉｏ ｎａｔｒｉｅｇｅｎｓ。

本開示の酵母細胞には、限定されないが、操作されたＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｙａｒｒｏｗｉａ、Ｃａｎｄｉｄａ ｂｏｉｄｉｎｉｉおよびＰｉｃｈｉａが含まれる。本開示によると、本明細書で請求される酵母は、菌界のメンバーとして分類される真核生物の単細胞微生物である。酵母は、多細胞の祖先から進化した単細胞生物であるが、本開示に有用ないくつかの種は、仮性菌糸または偽菌糸として知られる接続された出芽細胞のストリングを形成することによって多細胞特性を発達させる能力を有するものである。

いくつかの実施形態では、細胞ペレットが、ＣＹＰ４５０を発現する細胞系から収穫される。いくつかの実施形態では、細胞ペレットが、さまざまな濃度で再懸濁され得る。いくつかの実施形態では、細胞ペレットが、１ｇ／Ｌ～２５０ｇ／Ｌの濃度で再懸濁される。いくつかの実施形態では、細胞系から収穫された細胞ペレットが、１ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ、２５ｇ／Ｌ、５０ｇ／Ｌ、７５ｇ／Ｌ、１００ｇ／Ｌ、１２５ｇ／Ｌ、１５０ｇ／Ｌ、１７５ｇ／Ｌ、２００ｇ／Ｌ、２２５ｇ／Ｌまたは２５０ｇ／Ｌの濃度で再懸濁される。

細胞培養物
細胞培養物は、培養物中の任意の細胞を指す。培養は、細胞を制御された条件下で、典型的にはその天然環境の外で増殖させるプロセスである。例えば、酵母細胞などの細胞は、液体栄養ブロス中の細胞懸濁液として増殖させられ得る。細胞培養物には、それだけに限らないが、細菌細胞培養物、酵母細胞培養物、植物細胞培養物および動物細胞培養物が含まれる。いくつかの実施形態では、細胞培養物が細菌細胞、酵母細胞またはこれらの組み合わせを含む。

本開示の細菌細胞培養物は、それだけに限らないが、以下を含む細菌細胞を含む：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｓｐｐ．、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ．、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐｐ．、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐｐ．、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐｐ．、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｐ．、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ．、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｓｐｐ．、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ．、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ．、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．、Ｃｏｍａｍｏｎａｓ ｓｐｐ．、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｐ．、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｐｐ．、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．、Ｍｉｃｒｏｌｕｎａｔｕｓ ｓｐｐ．、Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｐ．、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｓｐｐ．、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｓｐｐ．、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｐｐ．、Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ．、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｐ．、Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐｐ．、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｓｐｐ．、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｐ．、Ｐａｎｔｏｅａ ｓｐｐおよびＶｉｂｒｉｏ ｎａｔｒｉｅｇｅｎｓ。

本開示の酵母細胞培養物は、それだけに限らないが、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｙａｒｒｏｗｉａ、Ｃａｎｄｉｄａ ｂｏｉｄｉｎｉｉおよびＰｉｃｈｉａを含む酵母細胞を含む。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される細胞培養物を、本明細書に記載されるヒドロキシ脂肪酸と接触させる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される細胞培養物を、本明細書に記載されるヒドロキシ脂肪酸およびコーンスティープリカーと、例えば１：１のヒドロキシ脂肪酸対コーンスティープリカーの比率で接触させる。

いくつかの実施形態では、細胞が１６℃～４０℃の温度で培養される。例えば、細胞は、１６℃、１７℃、１８℃、１９℃、２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃または４０℃の温度で培養され得る。

いくつかの実施形態では、細胞が、０．５時間～９６時間、またはそれを超えた期間培養される。例えば、細胞は、１２、１８、２４、３０、３６、４２、４８、５４、６０、６６または７２時間の期間培養され得る。典型的には、細菌細胞などの細胞が１２～２４時間の期間培養される。いくつかの実施形態では、細胞が３７℃の温度で１２～２４時間培養される。いくつかの実施形態では、細胞が１６℃の温度で１２～２４時間培養される。

いくつかの実施形態では、細胞が、１×１０^８（ＯＤ_６００＜１）～２×１０^１１（ＯＤ約２００）の生細胞／ｍｌ細胞培養培地の密度まで培養される。いくつかの実施形態では、細胞が、１×１０^８、２×１０^８、３×１０^８、４×１０^８、５×１０^８、６×１０^８、７×１０^８、８×１０^８、９×１０^８、１×１０^９、２×１０^９、３×１０^９、４×１０^９、５×１０^９、６×１０^９、７×１０^９、８×１０^９、９×１０^９、１×１０^１０、２×１０^１０、３×１０^１０、４×１０^１０、５×１０^１０、６×１０^１０、７×１０^１０、８×１０^１０、９×１０^１０、１×１０^１１または２×１０^１１生細胞／ｍｌの密度まで培養される。（換算係数：ＯＤ １＝８×１０^８細胞／ｍｌ）。

ラクトン
ラクトンは、分子内エステル化から形成される１－オキサシクロアルカン－２－オン構造（－（Ｃ＝Ｏ）－Ｏ－）を含む環状カルボン酸エステルまたは類似体である。本発明は、ヒドロキシル基が酸基と反応して環状カルボン酸エステルを形成した、直鎖ヒドロキシカルボン酸から形成されたラクトン（例えば、γ－ラクトンおよびδ－ラクトン）に関する。

ラクトンの国際純正応用化学連合（ＩＵＰＡＣ）の名称は、親酸の名称の最後に「ラクトン」という用語を付加することによって得られる。ＩＵＰＡＣ名よりも頻繁に使用されるラクトンの一般名は、ヒドロキシ酸によって終わる－酸（－ｉｃ ａｃｉｄ）を－ラクトン（－ｏｌａｃｔｏｎｅ）に変えることによって形成される。ギリシャ文字は、親ヒドロキシルカルボン酸の環を閉じるためのヒドロキシ基を有する炭素原子を示す。換言すれば、ギリシャ文字の接頭辞は、複素環中の炭素原子の数、すなわち親ヒドロキシルカルボン酸の前記骨格に沿った関連する－ＯＨ基と－ＣＯＯＨ基との間の距離を指定する。親化合物上の－ＣＯＯＨ基中の炭素の後の第１の炭素原子はαと標識され、第２の炭素原子はβと標識され、以下同様である。したがって、ギリシャ文字の接頭辞はラクトン環のサイズも示す：α－ラクトン＝３員環、β－ラクトン＝４員環、γ－ラクトン＝５員環；およびδ－ラクトン＝６員環。

例示すると、γ－ヒドロキシ酪酸（γ－ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｒｙｉｃ ａｃｉｄ）の環化から誘導されるラクトンは、４－ヒドロキシブタン酸ラクトンまたはγ－ブチロラクトン（γ－ｂｕｔｒｙｏｌａｃｔｏｎｅ）として知られている。同様に、５－ヒドロキシペンタン酸はδ－ヒドロキシペンタン酸と呼ばれ、対応するラクトンは５－ヒドロキシペンタン酸ラクトンまたはδ－バレロラクトンとして知られている。

ヒドロキシ直鎖脂肪酸および末端近傍ヒドロキシ基
直鎖脂肪酸は、末端にカルボキシル基（－ＣＯＯＨ）を含む直鎖炭化水素鎖からなる。この化学的実体を酸にするのは、このカルボン酸基の存在である。直鎖脂肪酸は、必要に応じて炭素原子間に不飽和結合を有していてもよい。分岐鎖脂肪酸は、通常、炭素鎖上で置換された１または複数のアルキル分岐を有する飽和脂肪酸である。

直鎖脂肪酸の炭化水素骨格に結合した１または複数の水素原子は、ヒドロキシル（－ＯＨ）基によって置き換えられていてもよい。１または複数のヒドロキシル基を有する直鎖カルボン酸は、ヒドロキシカルボン酸と呼ばれる。リシノール酸は、天然に存在するヒドロキシカルボン酸である。

本発明は、ヒドロキシラーゼ酵素活性を有する組換えタンパク質を発現する組換え微生物を使用した、飽和直鎖脂肪酸中の水素原子のヒドロキシル基による置き換えまたは置換に関する。好ましい実施形態では、ヒドロキシル基の置換が、直鎖脂肪酸の末端メチル末端基に最も近い－ＣＨ_２－基の１つで起こる。一般的な用語では、ｎまたはωは直鎖脂肪酸のメチル末端基を指し、数ω－ｘのｎ－ｘは背骨上の炭素原子の位置を指し、ｘはメチル末端基から離れた炭素の数を示す。例示すると、ステアリン酸（またはオクタデカン酸）、式ＣＨ_３（ＣＨ_２）_１６ＣＯＯＨを有するＣ１８：０直鎖脂肪酸の例では、ω－３が、メチル末端基から除去された３個の炭素である背骨の１５番目の炭素を意味する。同様に、同じ例では、ω－１が、メチル末端基から除去された１個の炭素である背骨の１７番目の炭素を意味する。

本発明で使用される場合、本発明の組換えＤＮＡ技術を使用して、ヒドロキシル基をω－１、ω－２およびω－３位で特異的に直鎖脂肪酸に導入する場合、得られるヒドロキシル化直鎖脂肪酸分子は末端近傍ヒドロキシ脂肪酸と呼ばれ、このような脂肪酸分子のω－１、ω－２およびω－３位のヒドロキシル基は末端近傍ヒドロキシル基と呼ばれる。

Ｌｌ
微生物培養培地

野生型および組換え細菌、酵母および真菌株を含む本発明で有用な微生物は、特定の培養培地中で増殖される。微生物培養培地は、最小増殖培地またはリッチ増殖培地であり得る。最小増殖培地は、無機化合物と、１または複数の有機栄養素、例えばグルコース、スクロースまたはグリセロールの強化混合物を含む。リッチ増殖培地は、酵母抽出物、ペプトンおよび有機栄養素、例えばデキストロース、スクロースまたはグリセロールを含む。好ましい実施形態では、リッチ増殖培地にコーンスティープリカーを補充して、微生物の増殖を促進する。

合成生物学
ここで使用される標準的な組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は当技術分野で周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８９（以下「Ｍａｎｉａｔｉｓ」）；およびＳｉｌｈａｖｙ，Ｔ．Ｊ．、Ｂｅｎｎａｎ，Ｍ．Ｌ．およびＥｎｑｕｉｓｔ，Ｌ．Ｗ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎｓ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８４；およびＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら、Ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅによって出版、１９８７（各々の全体がこれにより参照により本明細書に組み込まれる）によって記載されている。

細菌生産系
原核生物におけるタンパク質の発現は、ほとんどの場合、融合タンパク質または非融合タンパク質のいずれかの発現を指示する構成的または誘導性プロモーターを含むベクターを用いて細菌宿主細胞で行われる。融合ベクターは、そこにコードされるタンパク質、通常は組換えタンパク質のアミノ末端にいくつかのアミノ酸を付加する。このような融合ベクターは、典型的には、以下の３つの目的にかなう：１）組換えタンパク質の発現を増加させる；２）組換えタンパク質の溶解度を増加させる；および３）アフィニティー精製においてリガンドとして作用することによって、組換えタンパク質の精製を助ける。通常、タンパク質分解切断部位を融合部分と組換えタンパク質の接合部で導入して、融合タンパク質の精製に続いて融合部分から組換えタンパク質を分離できるようにする。このようなベクターは、本開示の範囲内にある。

ある実施形態では、発現ベクターが、細菌細胞における組換えポリペプチドの発現のためにそれらの遺伝子要素を含む。細菌細胞における転写および翻訳のための要素は、プロモーター、タンパク質複合体のコード領域および転写ターミネーターを含むことができる。

当業者は、発現ベクターの調製に利用可能な分子生物学技術を知っているだろう。上記に記載される、本技術の発現ベクターへの組み込みに使用されるポリヌクレオチドは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの日常的な技術によって調製することができる。

相補的付着末端を介してＤＮＡをベクターに作動可能に連結するために、いくつかの分子生物学技術が開発されてきた。一実施形態では、相補的ホモポリマー区域を、ベクターＤＮＡに挿入される核酸分子に付加することができる。次いで、ベクターと核酸分子を、相補的ホモポリマーテール間の水素結合によって結合して、組換えＤＮＡ分子を形成する。

代替実施形態では、１つまたは複数の制限部位を含む合成リンカーを使用して、本技術のポリヌクレオチドを発現ベクターに作動可能に連結する。ある実施形態では、ポリヌクレオチドを、制限エンドヌクレアーゼ消化によって生成する。ある実施形態では、核酸分子を、３’－５’－エキソヌクレアーゼ活性を有する突出３’一本鎖末端を除去し、重合活性を有する陥凹３’末端を埋めて、それによって平滑末端ＤＮＡセグメントを生成する酵素であるバクテリオファージＴ４ ＤＮＡポリメラーゼまたは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩで処理する。次いで、平滑末端セグメントを、バクテリオファージＴ４ ＤＮＡリガーゼなどの平滑末端ＤＮＡ分子のライゲーションを触媒することができる酵素の存在下で、大モル過剰のリンカー分子と共にインキュベートする。したがって、反応の生成物は、その末端にポリマーリンカー配列を有するポリヌクレオチドである。次いで、これらのポリヌクレオチドを、適切な制限酵素で切断し、ポリヌクレオチドの末端と適合性の末端を生成する酵素で切断された発現ベクターに連結する。

あるいは、ライゲーション非依存クローニング（ＬＩＣ）部位を有するベクターを使用することができる。その場合、必要なＰＣＲ増幅ポリヌクレオチドを制限消化もライゲーションもなしでＬＩＣベクターにクローニングすることができる（本明細書と矛盾のない程度に参照により本明細書に組み込まれる、Ａｓｌａｎｉｄｉｓおよびｄｅ Ｊｏｎｇ、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１８ ６０６９－７４、（１９９０）、Ｈａｕｎら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １３、５１５－１８（１９９２））。

ある実施形態では、選択されたプラスミドへの挿入のために目的のポリヌクレオチドを単離および／または改変するために、ＰＣＲを使用することが適切である。配列のＰＣＲ調製に使用するための適切なプライマーは、核酸分子の必要なコード領域を単離し、制限エンドヌクレアーゼまたはＬＩＣ部位を付加し、コード領域を所望のリーディングフレームに配置するように設計することができる。

ある実施形態では、本技術の発現ベクターに組み込むためのポリヌクレオチドを、適切なオリゴヌクレオチドプライマーを使用するＰＣＲを使用することによって調製する。コード領域が増幅され、プライマー自体は増幅された配列産物に組み込まれる。ある実施形態では、増幅プライマーが、制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含み、これにより、増幅された配列産物を適切なベクターにクローニングすることが可能になる。

発現ベクターは、従来の形質転換またはトランスフェクション技術によって植物または微生物宿主細胞に導入することができる。本技術の発現ベクターによる適切な細胞の形質転換は、当技術分野で知られている方法によって達成され、典型的には、ベクターと細胞の両方のタイプに依存する。適切な技術には、リン酸カルシウムもしくは塩化カルシウム共沈、ＤＥＡＥ－デキストランを介したトランスフェクション、リポフェクション、ケモポレーション（ｃｈｅｍｏｐｏｒａｔｉｏｎ）またはエレクトロポレーションが含まれる。

首尾よく形質転換された細胞、すなわち、発現ベクターを含む細胞は、当技術分野で周知の技術によって同定することができる。例えば、本技術の発現ベクターでトランスフェクトされた細胞を培養して、本明細書に記載されるポリペプチドを生産することができる。当技術分野で周知の技術によって、発現ベクターＤＮＡの存在について細胞を調べることができる。

宿主細胞は、前記の発現ベクターの単一コピー、あるいは、発現ベクターの複数のコピーを含むことができる。

いくつかの実施形態では、形質転換細胞は、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、藻類細胞、真菌細胞または酵母細胞であり得る。いくつかの実施形態では、細胞が、カノーラ植物細胞、菜種植物細胞、ヤシ植物細胞、ヒマワリ植物細胞、ワタ植物細胞、トウモロコシ植物細胞、落花生植物細胞、亜麻植物細胞、ゴマ植物細胞、大豆植物細胞、およびペチュニア植物細胞からなる群から選択される植物細胞である。

外来タンパク質の高レベルの発現を指示する調節配列を含む微生物宿主細胞発現系および発現ベクターは、当業者に周知である。これらのいずれかを使用して、微生物宿主細胞における本技術の組換えポリペプチドの発現のためのベクターを構築することができる。次いで、これらのベクターを、形質転換を介して適切な微生物に導入して、本技術の組換えポリペプチドの高レベルの発現を可能にすることができる。

適切な微生物宿主細胞の形質転換に有用なベクターまたはカセットは、当技術分野で周知である。典型的には、ベクターまたはカセットは、関連するポリヌクレオチドの転写および翻訳を指示する配列、選択マーカー、ならびに自律複製または染色体組込みを可能にする配列を含む。適切なベクターは、転写開始制御を有するポリヌクレオチドの領域５’および転写終結を制御するＤＮＡフラグメントの領域３’を含む。両制御領域が、形質転換宿主細胞に相同な遺伝子に由来することが好ましいが、このような制御領域が、宿主として選択された特定の種に固有の遺伝子に由来する必要はないことが理解されるべきである。

所望の微生物宿主細胞における組換えポリペプチドの発現を駆動するのに有用な開始制御領域またはプロモーターは多数あり、当業者によく知られている。それだけに限らないが、ＣＹＣＩ、ＨＩＳ３、ＧＡＬＩ、ＧＡＬＩＯ、ＡＤＨＩ、ＰＧＫ、ＰＨ０５、ＧＡＰＤＨ、ＡＤＣＩ、ＴＲＰＩ、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＥＮＯ、ＴＰＩ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓでの発現に有用）；ＡＯＸＩ（Ｐｉｃｈｉａでの発現に有用）；ならびにｌａｃ、ｔｒｐ、ＪＰＬ、ＩＰＲ、Ｔ７、ｔａｃおよびｔｒｃ（大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）での発現に有用）を含む、これらの遺伝子を駆動することができる事実上いずれのプロモーターも本技術に適している。

終結制御領域はまた、微生物宿主に固有のさまざまな遺伝子に由来し得る。終結部位を必要に応じて本明細書に記載される微生物宿主のために含めることができる。

植物細胞では、本技術の発現ベクターが、発達の所望の段階で、所望の組織で、本技術の組換えポリペプチドの発現を指示することができるプロモーターに作動可能に連結されたコード領域を含むことができる。便宜上、発現されるポリヌクレオチドは、同じポリヌクレオチドに由来するプロモーター配列および翻訳リーダー配列を含み得る。転写終結シグナルをコードする３’非コード配列も存在すべきである。発現ベクターはまた、ポリヌクレオチド発現を促進するために、１またはそれを超えるイントロンを含み得る。

植物宿主細胞の場合、コード領域の発現を誘導することができる任意のプロモーターと任意のターミネーターの任意の組み合わせを、本技術のベクター配列で使用することができる。プロモーターおよびターミネーターのいくつかの適切な例としては、ノパリンシンターゼ（ｎｏｓ）、オクトピンシンターゼ（ｏｃｓ）およびカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）遺伝子からのものが挙げられる。使用され得る効率的な植物プロモーターの１つのタイプは、高レベル植物プロモーターである。このようなプロモーターは、本技術の発現ベクターと作動可能に連結して、ベクターの発現を促進することができるはずである。本技術で使用され得る高レベル植物プロモーターには、例えば大豆由来のリブロース－１，５－二リン酸カルボキシラーゼの小サブユニットのプロモーター（本明細書と矛盾のない程度に全体がこれにより本明細書に組み込まれる、Ｂｅｒｒｙ－Ｌｏｗｅら、Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ａｐｐ．Ｇｅｎ．、１：４８３－９８（１９８２）、およびクロロフィル結合タンパク質のプロモーターが含まれる。これらの２つのプロモーターは、植物細胞で光誘導されることが知られている（例えば、本明細書と矛盾のない程度に各々がこれにより参照により本明細書に組み込まれる、Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ｐｌａｎｔｓ，ａｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ、Ａ．Ｃａｓｈｍｏｒｅ、Ｐｌｅｎｕｍ、Ｎ．Ｙ．（１９８３）、２９～３８頁；Ｃｏｒｕｚｚｉ，Ｇ．ら、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２５８：１３９９（１９８３）およびＤｕｎｓｍｕｉｒ，Ｐ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２：２８５（１９８３）参照）。

同一性スコアリングを使用した配列類似性の分析
本明細書で使用される場合、「配列同一性」は、２つの最適に整列されたポリヌクレオチドまたはペプチド配列が、成分、例えば、ヌクレオチドまたはアミノ酸のアラインメントのウィンドウ全体にわたって不変である程度を指す。試験配列と参照配列の整列されたセグメントの「同一性の割合（ｉｄｅｎｔｉｔｙ ｆｒａｃｔｉｏｎ）」は、２つの整列された配列によって共有される同一の成分の数を、参照配列セグメント内の成分の総数、すなわち、参照配列全体または参照配列のより小さな規定の部分で割ったものである。

本明細書で使用される場合、「パーセント配列同一性（ｐｅｒｃｅｎｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」または「パーセント同一性（ｐｅｒｃｅｎｔ ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」という用語は、（比較窓全体で参照配列の合計２０パーセント未満の適切なヌクレオチドの挿入、欠失またはギャップにより）２つの配列を最適に整列させた場合の、試験（「本」）ポリヌクレオチド分子（またはその相補鎖）と比較した参照（「クエリ」）ポリヌクレオチド分子（またはその相補鎖）の線形ポリヌクレオチド配列中の同一ヌクレオチドのパーセンテージを指す。比較窓を整列させるための配列の最適なアラインメントは、当業者に周知であり、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎの局地的相同性アルゴリズム、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈの相同性アラインメントアルゴリズム、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎの類似性の検索方法などのツールによって、好ましくはＧＣＧ（登録商標）Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ（登録商標）（Ａｃｃｅｌｒｙｓ Ｉｎｃ．、マサチューセッツ州バーリントン）の一部として利用可能なＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡなどのこれらのアルゴリズムのコンピューター化された実装によって行われ得る。試験配列と参照配列の整列されたセグメントの「同一性の割合（ｉｄｅｎｔｉｔｙ ｆｒａｃｔｉｏｎ）」は、２つの整列された配列によって共有される同一の成分の数を、参照配列セグメント内の成分の総数、すなわち、参照配列全体または参照配列のより小さな規定の部分で割ったものである。パーセント配列同一性は、同一性の割合に１００を掛けたものとして表される。１またはそれを超えるポリヌクレオチド配列の比較は、完全長ポリヌクレオチド配列もしくはその一部、またはより長いポリヌクレオチド配列に対するものであり得る。本開示の目的のために、「パーセント同一性（ｐｅｒｃｅｎｔ ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」はまた、翻訳されたヌクレオチド配列についてはＢＬＡＳＴＸバージョン２．０、ポリヌクレオチド配列についてはＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を使用して決定され得る。

配列同一性のパーセントは、好ましくは、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ（商標）（バージョン１０；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．、ウィスコンシン州マディソン）の「Ｂｅｓｔ Ｆｉｔ」または「Ｇａｐ」プログラムを使用して決定される。「Ｇａｐ」は、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈのアルゴリズム（ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ４８：４４３－５３、１９７０）を利用して、一致数を最大化し、ギャップ数を最小化する２つの配列のアラインメントを見出す。「ＢｅｓｔＦｉｔ」は、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎの局地的相同性アルゴリズムを使用して、２つの配列間の類似性の最良のセグメントの最適なアラインメントを実施し、ギャップを挿入して一致数を最大化する（ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ、２：４８２－４８９、１９８１、Ｓｍｉｔｈら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １１：２２０５－２２２０、１９８３）。パーセント同一性は、最も好ましくは「Ｂｅｓｔ Ｆｉｔ」プログラムを使用して決定される。

配列同一性を決定するための有用な方法は、２０８９４メリーランド州ベセスダにある国立衛生研究所の国立医学図書館のアメリカ国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）から公的に入手可能なＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）プログラム；ＢＬＡＳＴ Ｍａｎｕａｌ、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、ＮＣＢＩ、ＮＬＭ、ＮＩＨ；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－１０（１９９０）参照にも開示されており；ＢＬＡＳＴプログラムのバージョン２．０またはそれを超えるバージョンは、ギャップ（欠失および挿入）のアラインメントへの導入を可能にし；ペプチド配列については、ＢＬＡＳＴＸを使用して配列同一性を決定することができ；ポリヌクレオチド配列については、ＢＬＡＳＴＮを使用して配列同一性を決定することができる。

本明細書で使用される場合、「実質的なパーセント配列同一性（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌ ｐｅｒｃｅｎｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」という用語は、少なくとも約７０％の配列同一性、少なくとも約８０％の配列同一性、少なくとも約８５％の同一性、少なくとも約９０％の配列同一性、またはさらに大きな配列同一性、例えば約９８％または約９９％の配列同一性のパーセント配列同一性を指す。したがって、本開示の一実施形態は、本明細書に記載されるポリヌクレオチド配列と少なくとも約７０％の配列同一性、少なくとも約８０％の配列同一性、少なくとも約８５％の同一性、少なくとも約９０％の配列同一性、またはさらに大きな配列同一性、例えば約９８％または約９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチド分子である。本開示のシトクロムＰ４５０遺伝子の活性を有するポリヌクレオチド分子は、さまざまなγ－およびデルタ－ラクトンの生産を指示することができる。このようなポリヌクレオチド分子は、本明細書で提供されるポリヌクレオチド配列と実質的なパーセント配列同一性を有することができ、本開示の範囲内に包含される。

同一性および類似性
同一性は、配列のアラインメント後の配列のペア間で同じであるアミノ酸の割合であり（これは、配列情報または構造情報またはいくらかの他の情報のみを使用して行うことができるが、通常は配列情報のみに基づく）、類似性は、ある類似性マトリックスを使用したアラインメントに基づいて割り当てられたスコアである。類似性指数は、以下のＢＬＯＳＵＭ６２、ＰＡＭ２５０もしくはＧＯＮＮＥＴのいずれか１つ、またはタンパク質の配列アラインメントのために当業者によって使用される任意のマトリックスであり得る。

同一性は、２つの部分配列間の対応の程度である（配列間にギャップはない）。２５％またはそれを超える同一性は機能の類似性を意味し、１８～２５％は構造または機能の類似性を意味する。２つの完全に無関係またはランダムな配列（１００残基を超える）が、２０％を超える同一性を有する可能性があることに留意されたい。類似性は、２つの配列を比較した場合の類似度である。これはその同一性に依存する。

本明細書で使用される用語の説明：
「コード配列（ｃｏｄｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」は、当業者にその通常の慣用的な意味を与えられるべきであり、限定されないが、特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を指すために使用される。

「タンパク質発現」．タンパク質生産は、遺伝子発現後に起こり得る。これは、ＤＮＡがメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に転写された後の段階からなる。次いで、ｍＲＮＡがポリペプチド鎖に翻訳され、最終的にタンパク質に折り畳まれる。ＤＮＡは、トランスフェクション（核酸を細胞に意図的に導入するプロセス）を通して細胞内に存在する。この用語は、通常、真核細胞における非ウイルス法に使用される。これはまた、他の方法および細胞型を指し得るが、他の用語が好ましい：「形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）」は、細菌、植物細胞を含む非動物真核細胞における非ウイルスＤＮＡ導入を説明するためにより頻繁に使用される。動物細胞では、形質転換がこれらの細胞における癌状態への進行（発癌）を指すためにも使用されるので、トランスフェクションが好ましい用語である。形質導入は、通常、ウイルス媒介ＤＮＡ導入を説明するために使用される。形質転換、形質導入およびウイルス感染は、本出願のトランスフェクションの定義に含まれる。

本明細書で使用される場合、単数形「ａ、ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明確に別段の指示をしない限り、複数の言及を含む。

「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「有する（ｈａｖｅ）」などの用語が明細書または特許請求の範囲で使用される限り、このような用語は、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」が請求項の移行語として使用される場合に解釈されるように、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語と同様の方法で包括的であることを意図している。

「例示的（ｅｘｅｍｐｌａｒｙ）」という単語は、本明細書では、「例、実例または例示として役立つ」ことを意味するために使用される。本明細書で「例示的（ｅｘｅｍｐｌａｒｙ）」として記載される任意の実施形態は、必ずしも他の実施形態よりも好ましいまたは有利であると解釈されるべきではない。

「相補的（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）」という用語は、当業者にその通常の慣用的な意味を与えられるべきであり、限定されないが、互いにハイブリダイズすることができるヌクレオチド塩基間の関係を説明するために使用される。例えば、ＤＮＡに関して、アデノシンはチミンに相補的であり、シトシンはグアニンに相補的である。したがって、本技術には、添付の配列表に報告されている完全な配列に相補的な単離された核酸フラグメント、ならびに実質的に類似の核酸配列も含まれる。

「核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）」および「ヌクレオチド（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」という用語は、当業者にそれぞれの通常の慣用的な意味を与えられるべきであり、限定されないが、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよびそれらの一本鎖もしくは二本鎖形態のポリマーを指すために使用される。特に限定されない限り、この用語は、参照核酸と同様の結合特性を有し、天然に存在するヌクレオチドと同様の方法で代謝される天然ヌクレオチドの既知の類似体を含む核酸を包含する。別段の指示がない限り、特定の核酸配列はまた、その保存的改変または縮重変異体（例えば、縮重コドン置換）および相補的配列、ならびに明示的に示された配列も暗黙的に包含する。

「単離された（ｉｓｏｌａｔｅｄ）」という用語は、当業者にその通常の慣用的な意味を与えられるべきであり、単離された核酸または単離されたポリペプチドの文脈で使用される場合、限定されないが、人の手によって、その天然の環境から離れて存在し、したがって天然の産物ではない核酸またはポリペプチドを指すために使用される。単離された核酸またはポリペプチドは、精製形態で存在することができる、または、例えば、トランスジェニック宿主細胞などの非天然環境に存在することができる。

「縮重変異体（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ ｖａｒｉａｎｔ）」という用語は、１またはそれを超える縮重コドン置換によって参照核酸配列とは異なる残基配列を有する核酸配列を指す。縮重コドン置換は、１またはそれを超える選択された（または全ての）コドンの３番目の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換されている配列を生成することによって達成することができる。核酸配列とその縮重変異体の全ては、同じアミノ酸またはポリペプチドを発現する。

「ポリペプチド（ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」、「タンパク質（ｐｒｏｔｅｉｎ）」、および「ペプチド（ｐｅｐｔｉｄｅ）」という用語は、当業者にそれぞれの通常の慣用的な意味を与えられるべきであり、３つの用語は時々互換的に使用され、限定されないが、そのサイズまたは機能に関係なく、アミノ酸またはアミノ酸類似体のポリマーを指すために使用される。「タンパク質（ｐｒｏｔｅｉｎ）」は通常、比較的大きなポリペプチドに関して使用され、「ペプチド（ｐｅｐｔｉｄｅ）」は通常、小さなポリペプチドに関して使用されるが、当技術分野におけるこれらの用語の使用は重複し、変化する。本明細書で使用される「ポリペプチド（ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」という用語は、特に注記しない限り、ペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質を指す。「タンパク質（ｐｒｏｔｅｉｎ）」、「ポリペプチド（ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」、および「ペプチド（ｐｅｐｔｉｄｅ）」という用語は、ポリヌクレオチド産物を指す場合、本明細書では互換的に使用される。したがって、例示的なポリペプチドには、ポリヌクレオチド産物、天然に存在するタンパク質、ホモログ、オルソログ、パラログ、フラグメントおよび他の同等物、変異体、ならびに前記の類似体が含まれる。

参照ポリペプチドに関して使用される場合、「ポリペプチドフラグメント（ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ）」および「フラグメント（ｆｒａｇｍｅｎｔ）」という用語は、当業者にそれらの通常の慣用的な意味を与えられるべきであり、限定されないが、アミノ酸残基が参照ポリペプチド自体と比較して欠失しているが、残りのアミノ酸配列が参照ポリペプチド中の対応する位置と通常同一であるポリペプチドを指すために使用される。このような欠失は、参照ポリペプチドのアミノ末端もしくはカルボキシ末端、またはその両方で起こり得る。

ポリペプチドまたはタンパク質の「機能的フラグメント（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｆｒａｇｍｅｎｔ）」という用語は、完全長ポリペプチドまたはタンパク質の一部であり、実質的に同じ生物学的活性を有する、または完全長ポリペプチドもしくはタンパク質と実質的に同じ機能を実行する（例えば、同じ酵素反応を実行する）ペプチドフラグメントを指す。

互換的に使用される「変異体ポリペプチド（ｖａｒｉａｎｔ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」、「改変アミノ酸配列（ｍｏｄｉｆｉｅｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」または「改変ポリペプチド（ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」という用語は、１またはそれを超えるアミノ酸、例えば１またはそれを超えるアミノ酸置換、欠失および／または付加によって参照ポリペプチドとは異なるアミノ酸配列を指す。ある態様では、変異体が、参照ポリペプチドの能力の一部または全てを保持する「機能的変異体（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｖａｒｉａｎｔ）」である。

「機能的変異体（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｖａｒｉａｎｔ）」という用語は、保守的に置換された変異体をさらに含む。「保存的に置換された変異体（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅｌｙ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ ｖａｒｉａｎｔ）」という用語は、１またはそれを超える保存的アミノ酸置換によって参照ペプチドとは異なり、参照ペプチドの活性の一部または全てを維持するアミノ酸配列を有するペプチドを指す。「保存的アミノ酸置換（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）」は、アミノ酸残基の機能的に類似した残基による置換である。保存的置換の例としては、イソロイシン、バリン、ロイシンもしくはメチオニンなどのある非極性（疎水性）残基の別の残基への置換；アルギニンとリジンの間、グルタミンとアスパラギンの間、スレオニンとセリンの間など、ある荷電もしくは極性（親水性）残基の別の残基への置換；リジンもしくはアルギニンなどのある塩基性残基の別の残基への置換；またはアスパラギン酸もしくはグルタミン酸などのある酸性残基の別の残基への置換；またはフェニルアラニン、チロシンもしくはトリプトファンなどのある芳香族残基の別の残基への置換が挙げられる。このような置換は、タンパク質またはポリペプチドの見かけの分子量にも等電点にもほとんどまたは全く影響を及ぼさないと予想される。「保存的に置換された変異体（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅｌｙ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ ｖａｒｉａｎｔ）」という句はまた、得られるペプチドが本明細書に記載される参照ペプチドの活性の一部または全てを維持する限り、残基が化学的に誘導体化された残基で置き換えられているペプチドを含む。

本技術のポリペプチドに関連する「変異体（ｖａｒｉａｎｔ）」という用語は、参照ポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、さらには１００％同一であるアミノ酸配列を有する機能的に活性なポリペプチドをさらに含む。

全ての文法形態および綴りのバリエーションにおける「相同（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）」という用語は、スーパーファミリーからのポリヌクレオチドまたはポリペプチドと異なる種からの相同ポリヌクレオチドまたはタンパク質を含む、「共通の進化的起源（ｃｏｍｍｏｎ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｏｒｉｇｉｎ）」を有するポリヌクレオチドまたはポリペプチド間の関係を指す（Ｒｅｅｃｋら、Ｃｅｌｌ ５０：６６７、１９８７）。このようなポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、パーセント同一性または保存された位置での特定のアミノ酸もしくはモチーフの存在に関して、それらの配列類似性によって反映される配列相同性を有する。例えば、２つの相同ポリペプチドは、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９００、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、さらには１００％同一であるアミノ酸配列を有することができる。

「適切な調節配列（ｓｕｉｔａｂｌｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）」は、当業者にその通常の慣用的な意味を与えられるべきであり、限定されないが、コード配列の上流（５’非コード配列）、内部または下流（３’非コード配列）に位置し、関連するコード配列の転写、ＲＮＡプロセシングまたは安定性、または翻訳に影響を及ぼすヌクレオチド配列を指すために使用される。調節配列には、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、およびポリアデニル化認識配列が含まれ得る。

「プロモーター（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）」は、当業者にその通常の慣用的な意味を与えられるべきであり、限定されないが、コード配列または機能的ＲＮＡの発現を制御することができるＤＮＡ配列を指すために使用される。一般に、コード配列はプロモーター配列の３’に位置している。プロモーターは、その全体が天然遺伝子に由来してもよく、または天然に見られる異なるプロモーターに由来する異なる要素で構成されていてもよく、またはさらには合成ＤＮＡセグメントを含んでもよい。異なるプロモーターが、異なる組織もしくは細胞型において、または異なる発達段階において、または異なる環境条件に応答して、遺伝子の発現を指示し得ることが当業者によって理解される。ほとんどの場合、ほとんどの細胞型で遺伝子を発現させるプロモーターは、一般に「構成的プロモーター（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）」と呼ばれる。ほとんどの場合、調節配列の正確な境界が完全に定義されていないため、異なる長さのＤＮＡフラグメントが同一のプロモーター活性を有する可能性があることがさらに認識されている。

「作動可能に連結された（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」という用語は、一方の機能が他方によって影響を受けるような、単一核酸フラグメント上の核酸配列の会合を指す。例えば、プロモーターは、そのコード配列の発現に影響を及ぼすことができる場合（すなわち、コード配列がプロモーターの転写制御下にある場合）、コード配列と作動可能に連結している。コード配列を、センスまたはアンチセンス方向で調節配列に作動可能に連結することができる。

本明細書で使用される「発現（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）」という用語は、当業者にその通常の慣用的な意味を与えられるべきであり、限定されないが、本技術の核酸フラグメントに由来するセンス（ｍＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡの転写および安定な蓄積を指すために使用される。「過剰発現（ｏｖｅｒ－ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）」は、正常な生物または非形質転換生物における産生のレベルを超える、トランスジェニックまたは組換え生物における遺伝子産物の産生を指す。

「形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）」は、当業者にその通常の慣用的な意味を与えられるべきであり、限定されないが、その細胞によるさらなる発現のための標的細胞へのポリヌクレオチドの導入を指すために使用される。導入されたポリヌクレオチドは、標的細胞のゲノムまたは染色体ＤＮＡに組み込まれ、遺伝的に安定な遺伝をもたらす、または宿主染色体とは無関係に複製することができる。形質転換核酸フラグメントを含む宿主生物は、「トランスジェニック（ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ）」または「組換え（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ）」または「形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ）」生物と呼ばれる。

「形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ）」、「トランスジェニック（ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ）」、および「組換え（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ）」という用語は、本明細書で宿主細胞に関連して使用される場合、当業者にそれぞれの通常の慣用的な意味を与えられるべきであり、限定されないが、異種核酸分子が導入された、植物または微生物細胞などの宿主生物の細胞を指すために使用される。核酸分子は宿主細胞のゲノムに安定的に組み込まれ得る、または核酸分子は染色体外分子として存在し得る。このような染色体外分子は自己複製することができる。形質転換細胞、組織、または対象は、形質転換プロセスの最終産物だけでなく、そのトランスジェニック子孫も包含すると理解される。

本明細書でポリヌクレオチドに関連して使用される場合、「組換え（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ）」、「異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）」および「外因性（ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ）」という用語は、当業者にその通常の慣用的な意味を与えられるべきであり、限定されないが、特定の宿主細胞に対して外来の供給源に由来する、または同じ供給源に由来する場合、元の形態から改変されているポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ配列または遺伝子）を指すために使用される。したがって、宿主細胞における異種遺伝子は、特定の宿主細胞に対して内因性であるが、例えば、部位特異的突然変異誘発または他の組換え技術の使用によって改変された遺伝子を含む。この用語はまた、天然に存在するＤＮＡ配列の天然に存在しない複数のコピーも含む。したがって、これらの用語は、細胞に対して外来もしくは異種である、または細胞に対して相同であるが、要素が通常は見られない宿主細胞内の位置もしくは形態にあるＤＮＡセグメントを指す。

同様に、「組換え（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ）」、「異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）」、および「外因性（ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ）」という用語は、本明細書でポリペプチドまたはアミノ酸配列に関連して使用される場合、特定の宿主細胞に対して外来の供給源に由来する、または同じ供給源に由来する場合、元の形態から改変されているポリペプチドまたはアミノ酸配列を意味する。したがって、組換えＤＮＡセグメントを宿主細胞で発現させて、組換えポリペプチドを生産することができる。

「プラスミド（ｐｌａｓｍｉｄ）」、「ベクター（ｖｅｃｔｏｒ）」、および「カセット（ｃａｓｓｅｔｔｅ）」という用語は、当業者にそれぞれの通常の慣用的な意味を与えられるべきであり、限定されないが、細胞の中央代謝の一部ではないが、通常は環状二本鎖ＤＮＡ分子の形態である遺伝子を通常有する染色体外要素を指すために使用される。このような要素は、いくつかのヌクレオチド配列が、選択された遺伝子産物のためのプロモーターフラグメントおよびＤＮＡ配列を適切な３’非翻訳配列と共に細胞に導入することができる独自の構築物に結合されたまたは組み換えられた、任意の供給源に由来する一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡの線形または環状の自律複製配列、ゲノム組込み配列、ファージまたはヌクレオチド配列であり得る。「形質転換カセット（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｃａｓｓｅｔｔｅ）」は、外来遺伝子を含み、外来遺伝子に加えて、特定の宿主細胞の形質転換を促進する要素を有する特定のベクターを指す。「発現カセット（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃａｓｓｅｔｔｅ）」は、外来遺伝子を含み、外来遺伝子に加えて、外来宿主におけるその遺伝子の発現の増強を可能にする要素を有する特定のベクターを指す。

本明細書で使用される「細胞系（ｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｙｓｔｅｍ）」という用語は、異所性タンパク質の発現を提供する任意の細胞を指す。いくつかの実施形態では、細胞系が、細菌細胞、酵母細胞、植物細胞および動物細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞系が、原核細胞および／または真核細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞系がリボソームなどの細胞成分に基づくタンパク質のインビトロ発現を含む。

本明細書で使用される「細胞培養物（ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ）」という用語は、細胞を含む組成物を指す。いくつかの実施態様では、細胞培養物が液体（例えば、ブロス培養物）である。いくつかの実施態様では、細胞培養物が固体（例えば、スタブ培養物）である。いくつかの実施態様では、細胞培養物が、細菌細胞、酵母細胞、植物細胞および動物細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞培養物が、原核細胞および／または真核細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞培養物が、リボソームなどの細胞成分に基づくタンパク質のインビトロ発現を含む。

本明細書で使用される「インキュベートする（ｉｎｃｕｂａｔｉｎｇ）」および「インキュベーション（ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）」という用語は、２つまたは複数の化学的または生物学的実体（化学化合物および酵素など）を混合し、本明細書に記載されるヒドロキシ脂肪酸（例えば、末端近傍ヒドロキシ脂肪酸）または本明細書に記載されるラクトン（例えば、ガンマラクトン、デルタラクトン、またはこれらの組み合わせ）などの新たな化学的実体を生成するのに好ましい条件下でこれらを相互作用させるプロセスを指す。

本技術の変異体ポリペプチド配列に関する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性（ｐｅｒｃｅｎｔ（％）ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」は、配列を整列させ、必要に応じて、最大パーセント配列同一性を達成するためにギャップを導入した後の、参照ポリペプチドのアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージを指し、いかなる保存的置換も配列同一性の一部として考慮しない。

パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的でのアラインメントは、当業者の技能の範囲内のさまざまな方法で、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ－２またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して達成することができる。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。例えば、％アミノ酸配列同一性は、配列比較プログラムＮＣＢＩ－ＢＬＡＳＴ２を使用して決定され得る。ＮＣＢＩ－ＢＬＡＳＴ２配列比較プログラムは、ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖからダウンロードされ得る。ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ２は、いくつかの検索パラメータを使用し、これらの検索パラメータの全てが、例えば、アンマスク（ｕｎｍａｓｋ）はい（ｙｅｓ）、鎖＝全て、予想される発生１０、最小低複雑性長＝１５／５、マルチパスｅ値＝０．０１、マルチパスの定数＝２５、最終ギャップアラインメントのドロップオフ＝２５およびスコアリングマトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２を含むデフォルト値に設定される。ＮＣＢＩ－ＢＬＡＳＴ２がアミノ酸配列の比較に使用される状況では、所与のアミノ酸配列Ａの所与のアミノ酸配列Ｂへの、これとの、またはこれに対する％アミノ酸配列同一性（あるいは、所与のアミノ酸配列Ｂへ、これと、またはこれに対して所定の％アミノ酸配列同一性を有するまたは含む所与のアミノ酸配列Ａと表現することができる）が、以下の通り計算される：分数Ｘ／Ｙの１００倍（式中、Ｘは、配列アラインメントプログラムＮＣＢＩ－ＢＬＡＳＴ２によって、ＡとＢのそのプログラムのアラインメントにおいて同一マッチとしてスコアリングされたアミノ酸残基の数であり、ＹはＢのアミノ酸残基の総数である）。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合、ＡのＢへの％アミノ酸配列同一性が、ＢのＡへの％アミノ酸配列同一性と等しくないことが理解されるだろう。

この意味で、アミノ酸配列の「類似性（ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）」を決定するための技術は当技術分野で周知である。一般に、「類似性（ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）」は、アミノ酸が同一である、あるいは電荷または疎水性などの類似の化学的および／または物理的特性を有する適切な場所での２またはそれを超えるポリペプチドの正確なアミノ酸対アミノ酸の比較を指す。そのため、いわゆる「パーセント類似性（ｐｅｒｃｅｎｔ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）」を、比較されるポリペプチド配列間で決定することができる。核酸およびアミノ酸配列の同一性を決定するための技術も当技術分野で周知であり、これらはその遺伝子のｍＲＮＡのヌクレオチド配列を決定し（通常はｃＤＮＡ中間体を介して）、そこにコードされるアミノ酸配列を決定し、これを第２のアミノ酸配列と比較することを含む。一般に、「同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」は、それぞれ２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の正確なヌクレオチド対ヌクレオチドまたはアミノ酸対アミノ酸の対応を指す。２またはそれを超えるアミノ酸配列がそうであるように、２またはそれを超えるポリヌクレオチド配列を、それらの「パーセント同一性（ｐｅｒｃｅｎｔ ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」を決定することによって比較することができる。Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ、バージョン８（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、ウィスコンシン州マディソンから入手可能）で利用可能なプログラム、例えばＧＡＰプログラムは、それぞれ、２つのポリヌクレオチド間の同一性と、２つのポリペプチド配列間の同一性および類似性の両方を計算することができる。配列間の同一性または類似性を計算するための他のプログラムは当業者に知られている。

参照位置に「対応する（ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ｔｏ）」アミノ酸位置は、アミノ酸配列を整列させることによって特定される、参照配列と整列する位置を指す。このようなアラインメントは、手動で、またはＣｌｕｓｔａｌＷ２、Ｂｌａｓｔ ２等などの周知の配列アラインメントプログラムを使用して行うことができる。

特に明記しない限り、２つのポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列のパーセント同一性は、２つの配列のうち短い方の全長にわたる同一のアミノ酸残基またはヌクレオチドのパーセンテージを指す。

「形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）」は、当業者によって理解されるその通常の慣用的な意味に従って使用され、限定されないが、標的細胞へのポリヌクレオチドの導入を指すために使用される。導入されたポリヌクレオチドは、標的細胞のゲノムまたは染色体ＤＮＡに組み込まれ、遺伝的に安定な遺伝をもたらす、または宿主染色体とは無関係に複製することができる。形質転換核酸フラグメントを含む宿主生物は、「トランスジェニック（ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ）」または「組換え（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ）」または「形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ）」生物と呼ばれる。

本明細書でポリヌクレオチドに関連して使用される場合、「組換え（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ）」、「異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）」および「外因性（ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ）」という用語は、当業者によって理解されるその通常の慣用的な意味に従って使用され、限定されないが、特定の宿主細胞に対して外来の供給源に由来する、または同じ供給源に由来する場合、元の形態から改変されているポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ配列または遺伝子）を指すために使用される。したがって、宿主細胞における異種遺伝子は、特定の宿主細胞に対して内因性であるが、例えば、部位特異的突然変異誘発または他の組換え技術の使用によって改変された遺伝子を含む。この用語はまた、天然に存在するＤＮＡ配列の天然に存在しない複数のコピーも含む。したがって、これらの用語は、細胞に対して外来もしくは異種である、または細胞に対して相同であるが、要素が通常は見られない宿主細胞内の位置もしくは形態にあるＤＮＡセグメントを指す。

同様に、「組換え（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ）」、「異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）」、および「外因性（ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ）」という用語は、本明細書でポリペプチドまたはアミノ酸配列に関連して使用される場合、特定の宿主細胞に対して外来の供給源に由来する、または同じ供給源に由来する場合、元の形態から改変されているポリペプチドまたはアミノ酸配列を意味する。したがって、組換えＤＮＡセグメントを宿主細胞で発現させて、組換えポリペプチドを生産することができる。

別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本開示が属する分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似または同等の任意の方法および材料を本開示の実施または試験に使用することができるが、好ましい材料および方法を以下に説明する。

以下の非限定的な実施例を検討すると、本開示はより完全に理解されるだろう。これらの実施例は、本技術の好ましい実施形態を示しているが、単なる例示として与えられていることを理解すべきである。上記の議論およびこれらの実施例から、当業者であれば、本技術の本質的な特徴を確認することができ、その精神および範囲から逸脱することなく、本技術をさまざまな用途および条件に適合させるためにさまざまな変更および修正を行うことができる。

本明細書に開示される全ての特徴は、任意の組み合わせで組み合わせることができる。本明細書に開示される各特徴は、同じ、等価の、または類似の目的を果たす代替的な特徴によって置き換えられてもよい。したがって、特に明記しない限り、開示される各特徴は、一般的な一連の等価または類似の特徴の例にすぎない。上記の説明から、当業者であれば、本開示の本質的な特徴を容易に確認することができ、その精神および範囲から逸脱することなく、本開示をさまざまな用途および条件に適合させるためにさまざまな変更および修正を行うことができる。したがって、他の実施形態も特許請求の範囲内である。

等価物および範囲
当業者は、本明細書に記載される具体的な実施形態との多くの等価物を認識する、または日常的な実験のみを使用して確認することができる。本明細書に記載される本実施形態の範囲は、上記の説明に限定されることを意図しておらず、添付の特許請求の範囲に示される通りである。当業者であれば、以下の特許請求の範囲に定義される本開示の精神または範囲から逸脱することなく、この説明に対するさまざまな変更および修正を行うことができることを理解するだろう。

明細書および特許請求の範囲において、本明細書で使用される不定冠詞「ａ」および「ａｎ」は、明確に指示しない限り、「少なくとも１つの」を意味すると理解されるべきである。

明細書および特許請求の範囲において、本明細書で使用される「および／または」という句は、そのように結合された要素の「いずれかまたは両方」、すなわち、ある場合には結合的に存在し、他の場合には分離的に存在する要素を意味すると理解されるべきである。「および／または」で列挙される複数の要素は、同様に、すなわち、そのように結合された要素の「１または複数」と解釈されるべきである。具体的に特定される要素に関連するかどうかにかかわらず、「および／または」節によって具体的に特定される要素以外の他の要素が、必要に応じて存在してもよい。したがって、非限定的な例として、「Ａおよび／またはＢ」への言及は、「含む」などのオープンエンド言語と組み合わせて使用される場合、一実施形態では、Ａのみ（必要に応じてＢ以外の要素を含む）；別の実施形態では、Ｂのみ（必要に応じてＡ以外の要素を含む）；さらに別の実施形態では、ＡとＢの両方（必要に応じて他の要素を含む）；等々を指すことができる。

明細書および特許請求の範囲において本明細書で使用される場合、「または」は、上に定義される「および／または」と同じ意味を有すると理解されるべきである。例えば、リスト内の項目を区切る場合、「または」または「および／または」は包括的である、すなわち、ある数またはリストの要素のうちの少なくとも１つを含むが、２つ以上も含み、必要に応じて、追加の列挙されていない項目も含む。「ただ１つの」または「正確に１つの」、または特許請求の範囲で使用される場合、「からなる」などの明確に反対に指示される用語のみが、ある数またはリストの要素うちの正確に１つの要素を含むことを指す。一般に、本明細書で使用される「または」という用語は、「いずれか」、「の一方」、「の一方のみ」または「の正確に一方」などの排他性の用語が先行する場合にのみ、排他的代替（すなわち、「一方または他方であるが両方ではない」）を示すと解釈されるものとする。「本質的にからなる」は、特許請求の範囲で使用される場合、特許法の分野で使用される通常の意味を有するものとする。

明細書および特許請求の範囲において使用される場合、１または複数の要素のリストに関連する「少なくとも１つの」という句は、その要素のリスト中のいずれかの１または複数の要素から選択される少なくとも１つの要素を意味するが、その要素のリスト内に具体的に列挙される各々のおよび全ての要素の少なくとも１つを必ずしも含むものではなく、その要素のリスト中の要素の任意の組み合わせを除外するものでもない。この定義はまた、具体的に特定される要素に関連するかどうかにかかわらず、「少なくとも１つの」という句が言及する要素のリスト内で具体的に特定される要素以外の要素が必要に応じて存在し得ることを可能にする。したがって、非限定的な例として、「ＡおよびＢの少なくとも１つ」（または、同等に、「ＡまたはＢの少なくとも１つ」、または同等に「Ａおよび／またはＢの少なくとも１つ」）は、一実施形態では、必要に応じて２つ以上のＡを含み、Ｂが存在しない（および必要に応じてＢ以外の要素を含む）少なくとも１つ；別の実施形態では、必要に応じて１つを超えるＢを含み、Ａが存在しない（および必要に応じてＡ以外の要素を含む）少なくとも１つ；さらに別の実施形態では、必要に応じて１つを超えるＡを含む少なくとも１つ、および必要に応じて１つを超えるＢを含む（および必要に応じて他の要素を含む）少なくとも１つ；等々を指すことができる。

また、明確に指示しない限り、１つを超えるステップまたは行為を含む本明細書で特許請求される任意の方法において、方法のステップまたは行為の順序は、方法のステップまたは行為が列挙される順序に必ずしも限定されないことも理解すべきである。

特許請求の範囲および上記明細書において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「保有する」、「有する」、「含有する」、「伴う」、「保持する」、「から構成される」などの全ての移行句は、オープンエンドである、すなわち、含むがこれに限定されないことを意味すると理解される。米国特許庁の特許審査手続マニュアルの第２１１１．０３節に示されるように、「からなる」および「から本質的になる」という移行句のみが、それぞれクローズまたはセミクローズ移行句であるものとする。オープンエンド移行句（例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」）を使用して本文書に記載される実施形態は、代替実施形態で、オープンエンド移行句によって記載される特徴「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」および「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」としても企図されることを理解すべきである。例えば、本開示が「ＡおよびＢを含む組成物（ａ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ Ａ ａｎｄ Ｂ）」を記載する場合、本開示はまた、代替実施形態「ＡおよびＢからなる組成物（ａ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ Ａ ａｎｄ Ｂ）」および「ＡおよびＢから本質的になる組成物（ａ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ Ａ ａｎｄ Ｂ）」を企図する。

さらに、本開示は、列挙される請求項のうちの１または複数からの１または複数の限定、要素、条項および記述用語が別の請求項に導入される全ての変形、組み合わせおよび順列を包含する。例えば、別の請求項に従属する任意の請求項は、同じ基本請求項に従属する任意の他の請求項に見られる１または複数の制限を含むように修正することができる。要素が、例えばマーカッシュ群形式でリストとして提示される場合、要素の各サブグループも開示され、任意の要素を群から除外することができる。一般に、本開示または本開示の態様が特定の要素および／または特徴を含むと言及される場合、本開示または本開示の態様の一定の実施形態は、このような要素および／または特徴からなるか、またはから本質的になることを理解すべきである。簡単にするために、これらの実施形態は、本明細書ではこれらの言葉で具体的に示されていない。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」および「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」という用語は、オープンであることを意図しており、追加の要素またはステップの包含を可能にすることにも留意されたい。範囲が与えられる場合、端点が含まれる。さらに、別段の指示がない限り、または文脈および当業者の理解から明らかでない限り、範囲として表される値は、文脈が明らかにそうでないことを指示しない限り、本開示の異なる実施形態に記載される範囲内の任意の特定の値または部分範囲を、範囲の下限の単位の１０分の１まで想定することができる。

本出願は、さまざまな雑誌論文および他の刊行物を参照し、それらの全てが参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に開示される全ての参考文献、特許および特許出願は、それぞれが引用されている主題に関して参照により組み込まれ、場合によっては文書全体を包含し得る。組み込まれた参考文献のいずれかと本明細書との間に矛盾がある場合、本明細書が優先するものとする。さらに、先行技術に入る本開示の任意の特定の実施形態は、請求項のうちのいずれか１または複数から明示的に除外することができる。このような実施形態は当業者に知られていると考えられるので、除外が本明細書に明示的に示されていなくても、除外され得る。本開示の任意の特定の実施形態は、先行技術の存在に関連するか否かにかかわらず、任意の理由で任意の請求項から除外することができる。

実施例１
Ｍ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅ ＣＹＰ５０５Ａ３０およびＥ．ｃｏｌｉ Ｉｃｄのクローニング
Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅのＢＭ３ホモログ（ＣＹＰ５０５Ａ３０）のアミノ酸配列をＵｎｉＰｒｏｔ（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｇ２ＱＤＺ３．ｆａｓｔａ）から入手し、対応する遺伝子をＥ．ｃｏｌｉでの発現のためにコドン最適化し、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）によって合成した。Ｅ．ｃｏｌｉ発現のためのコドン最適化を含むＭ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅ由来のＣＹＰ５０５Ａ３０のヌクレオチド配列は配列番号１として提供される。ＣＹＰ５０５Ａ３０のアミノ酸配列は配列番号３として提供される。

得られた遺伝子産物を、ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩ部位を通してｐＥＴＤｕｅｔ－１ベクター（ＡＭＰ^＋、Ｎｏｖａｇｅｎ）にクローニングした。構築物を、発現のためにＢＬ２１（ＤＥ３）細胞に形質転換した。Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＣＹＰ５０５Ａ３０活性を増強するために、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（Ｉｃｄ）媒介ＮＡＤＰＨ再生系をＣＹＰ５０５Ａ３０と組み合わせた。プライマーＩＣＤ－Ｆ、５’－ｇｇａａｔｔｃＣＡＴａｔｇＧＡＡＡＧＴＡＡＡＧＴＡＧＴＴＧＴ（配列番号７）およびＩＣＤ－Ｒ、５’－ｃｃｇＣＴＣＧＡＧｔｔａＣＡＴＧＴＴＴＴＣＧＡＴＧＡＴＣＧＣＧＴ（配列番号８）を使用して、Ｅ．ｃｏｌｉＫ－１２亜株ＭＧ１６５５のゲノムからＰＣＲによってｉｃｄ遺伝子を増幅した。Ｅ．ｃｏｌｉＫ－１２亜株ＭＧ１６５５由来のｉｃｄのヌクレオチド配列は配列番号２として提供される。対応するアミノ酸配列は配列番号４として提供される。

得られたＰＣＲ産物を、ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩ部位を通してｐＣＤＦＤｕｅｔ－１ベクター（Ｓｐｅｃｔ^＋、Ｎｏｖａｇｅｎ）にサブクローニングした。構築物を使用して、ＣＹＰ５０５Ａ３０を過剰発現するＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を形質転換し、形質転換体をＬＢ（ＡＭＰ^＋Ｓｐｅｃｔ^＋）プレート上で選択した。

得られたベクターを使用して、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞においてＭ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅ ＣＹＰ５０５Ａ３０およびＥ．ｃｏｌｉ Ｉｃｄを過剰発現させる。

実施例２
Ｍ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅ ＣＹＰ５０５Ａ３０およびＥ．ｃｏｌｉ Ｉｃｄを過剰発現するＥ．ｃｏｌｉ細胞を使用したガンマラクトンおよびデルタラクトンの生成
この実施例は、末端近傍ヒドロキシ脂肪酸中間体を介した短鎖脂肪酸のガンマラクトンおよびデルタラクトンへの生物変換における、Ｍ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅ ＣＹＰ５０５Ａ３０およびＥ．ｃｏｌｉ Ｉｃｄを過剰発現するＥ．ｃｏｌｉ細胞の使用を実証する。

対応する短鎖脂肪酸から末端近傍（すなわち、オメガ－１（ω－１）、オメガ－２（ω－２）、オメガ－３（ω－３））ヒドロキシ脂肪酸を生成するために、ＣＹＰ５０５Ａ３０およびＩｃｄを過剰発現するＥ．ｃｏｌｉ細胞を、短鎖脂肪酸を基質として含む培地と共にインキュベートした。

典型的な実験では、一晩培養物を使用して、１００ｍｇ／Ｌのカルベニシリンおよび１００ｍｇ／Ｌのスペクチノマイシンを含有する液体ＬＢ培地（２％）に接種した。培養物を最初に３７℃でＯＤ_６００が０．６になるまで増殖させ、１６℃に冷却した。次いで、１ｍＭのＩＰＴＧを添加して、タンパク質発現を誘導した。１６℃で１６時間インキュベートした後、細胞を遠心分離によって収穫した。

収穫した細胞ペレットを、０．１％ Ｔｗｅｅｎ（登録商標）４０を含有する１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に１００ｇ／Ｌ新鮮重量の濃度で再懸濁した。次いで、３ｇ／Ｌのラウリン酸（Ｃ１２：０）または３ｇ／Ｌのトリデカン酸（Ｃ１３：０）を１０ｇ／Ｌのイソクエン酸三ナトリウム塩と一緒に、振盪機内３０℃で生体内変換のために添加した。試料を異なる反応時間で採取し、ＧＣ／ＦＩＤによって分析した。

ＧＣ／ＦＩＤ分析はＳｈｉｍａｄｚｕ ＧＣ－２０１４システムで行った。分析カラムはＲｅｓｔｅｋ ＲＸｉ－５ｍｓ（厚さ０．２５μｍ；長さ３０ｍ；直径０．２５ｍｍ）とし、注入温度は分割モードで２４０℃とする。温度勾配は０～３分、１００℃；３～９分１００℃～２８０℃、３０の勾配；９～１２分、２８０℃である。

図２Ａおよび図２Ｂに示されるように、ＨＯ－Ｃ１２：０およびＨＯ－Ｃ１３：０は、実施例１に記載される手順に従って改変されたＥ．ｃｏｌｉ細胞によって、対応するカルボン酸Ｃ１２：０（ラウリン酸としても知られるドデカン酸）およびＣ１３：０（トリデシル酸としても知られるトリデカン酸）から効率的に生産された。Ｂａｋｅｒら（２０１７）によると、ＣＹＰ５０５Ａ３０は、ω－１～ω－３位での直鎖脂肪酸のヒドロキシル化を触媒した。しかしながら、ＧＣ／ＦＩＤは誘導体化の非存在下でω－１～ω－３ヒドロキシ脂肪酸を分離することができないので、図２Ａ～２Ｂは単一ピークを示す。結果として、ピークはω－１～ω－３ヒドロキシ脂肪酸の混合物を表す。

これらの結果は、Ｍ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅ ＣＹＰ５０５Ａ３０およびＥ．ｃｏｌｉ Ｉｃｄを過剰発現する再懸濁Ｅ．ｃｏｌｉ細胞による、対応する脂肪酸からのω－１～ω－３ヒドロキシ脂肪酸の生産を証明している。

末端近傍ヒドロキシ脂肪酸からガンマラクトン（５員環）およびデルタラクトン（６員環）を生成するために、前のステップからのω－１～ω－３ヒドロキシ脂肪酸の混合物を最初に再懸濁Ｅ．ｃｏｌｉ細胞から単離し、次いで、Ｃａｎｄｉｄａ ｂｏｉｄｉｎｉｉ培養物を接種した。

ヒドロキシ脂肪酸からラクトンを生成する例として、ＨＯ－Ｃ１２：０の混合物およびＨＯ－Ｃ１３：０の混合物をそれぞれ６０ｇ／Ｌのコーンスティープリカー（ＣＳＬ）と１：１の比率で混合し、得られた培地を１２１℃で２０分間オートクレーブ処理した。培地を、それぞれＣ１２：０およびＣ１３：０生物変換についてＣＹＰ５０５Ａ３０Ｃ１２またはＣＹＰ５０５Ａ３０Ｃ１３と命名した。次いで、培地に一晩酵母培養物（例えば、Ｃａｎｄｉｄａ ｂｏｉｄｉｎｉｉ）を接種し、酵母培養物を３０℃振盪機内で増殖させた。試料を接種後毎日採取し、本明細書に記載されるように分析した。

γ－ラクトン生産を分析するために、０．５ｍｌのＥ．ｃｏｌｉ培養物を採取し、１０μｌの２Ｎ ＨＣｌを添加した。酸性化した培養物を、室温で６０分間振盪しながら０．５ｍｌの酢酸エチルで抽出した。１４，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した後、酢酸エチル相をＧＣ／ＭＳまたはＧＣ／ＦＩＤ分析に使用した。

ＧＣ／ＭＳ分析は、ＧＣＭＳ－ＱＰ２０１０Ｓ検出器と連結したＳｈｉｍａｄｚｕ ＧＣ－２０１０システムで行った。分析カラムはＳＨＲＸＩ－５ＭＳ（厚さ０．２５μｍ；長さ３０ｍ；直径０．２５ｍｍ）とし、注入温度は分割モード下で２６５℃とする。温度勾配は０～３分８０℃；３～８．７分１２０℃～２６３℃、２５の勾配；８．７～１０．７分、２６３℃である。

図３に示されるように、最初の出発脂肪酸がＣ１２：０（ラウリン酸としても知られるドデカン酸）などの偶数の炭素を有する場合、酵母におけるβ酸化後、予想される生成物は、ω－１ヒドロキシ脂肪酸中間体からのδ－ヘキサラクトン（ＤＣ６）、ω－２ヒドロキシ脂肪酸中間体からのγ－ヘキサラクトン（ＧＣ６）、およびω－３ヒドロキシ脂肪酸中間体からのδ－オクタラクトン（ＤＣ８）となる。これは、β酸化の各ラウンドにおいて、２個の炭素原子がヒドロキシ脂肪酸中間体から除去されるためである。ヒドロキシ脂肪酸中のＯＨ基の位置に応じて、ヒドロキシ脂肪酸中のヒドロキシル化炭素原子とカルボキシル化炭素原子との間に９、８または７個の介在炭素原子が存在し得る。２個または３個の介在炭素原子が残るようにβ酸化が十分な対の炭素原子を除去すると、好ましい速度論がラクトン生成物（２個の介在炭素原子が残っている場合はγ－ラクトン、３個の介在炭素原子が残っている場合はδ－ラクトン）への環化をもたらす。

図４は、Ｃａｎｄｉｄａ ｂｏｉｄｉｎｉｉとのインキュベーション後のＣＹＰ５０５Ａ３０Ｃ１２（ω－１～ω－３ヒドロキシラウリン酸を含有）を用いて得られたＧＣ／ＭＳ分析からのスペクトルを示す。図４Ａを参照して、ピーク１、２、３および４を分析した。保持時間を既知の標準と比較した後、ピーク１をγ－ヘキサラクトンＧＣ６と特定し、ピーク２をδ－ヘキサラクトンＤＣ６と特定し、ピーク４をδ－オクタラクトンＤＣ８と特定した。ピーク３を、酵母代謝の代謝産物であるフェネチルアルコールと特定した。

図５に示されるように、最初の出発脂肪酸がＣ１３：０（トリデシル酸としても知られるトリデカン酸）などの奇数の炭素を有する場合、酵母におけるβ酸化後、予想される生成物は、ω－１ヒドロキシ脂肪酸中間体からのγ－バレロラクトン（ＧＣ５）、ω－２ヒドロキシ脂肪酸中間体からのδ－ヘプタラクトン（ＤＣ７）、およびω－３ヒドロキシ脂肪酸中間体からのγ－ヘプタラクトン（ＧＣ７）となる。これは、β酸化の各ラウンドにおいて、２個の炭素原子がヒドロキシ脂肪酸中間体から除去されるためである。ヒドロキシ脂肪酸中のＯＨ基の位置に応じて、ヒドロキシ脂肪酸中のヒドロキシル化炭素原子とカルボキシル化炭素原子との間に１０、９または８個の介在炭素原子が存在し得る。２個または３個の介在炭素原子が残るようにβ酸化が十分な対の炭素原子を除去すると、好ましい速度論がラクトン生成物（２個の介在炭素原子が残っている場合はγ－ラクトン、３個の介在炭素原子が残っている場合はδ－ラクトン）への環化をもたらす。

図６は、Ｃａｎｄｉｄａ ｂｏｉｄｉｎｉｉとのインキュベーション後のＣＹＰ５０５Ａ３０Ｃ１３（ω－１～ω－３ヒドロキシトリデカン酸を含有）を用いて得られたＧＣ／ＭＳ分析からのスペクトルを示す。図６Ａを参照して、ピーク１、２、３および４を分析した。保持時間を既知の標準と比較した後、ピーク２をγ－ヘプタンラクトンＧＣ７と特定し、ピーク３をδ－ヘプタラクトンＤＣ７と特定した。ピーク１を、酵母代謝の代謝産物であるフェネチルアルコールと特定した。バレロラクトン（ＧＣ５）は、おそらくその低い濃度または揮発性のためにＧＣ／ＭＳによって検出されなかった。

これらの結果は、酵母細胞培養物の接種によるヒドロキシ脂肪酸からのラクトンの生産を実証している。

実施例３
Ｕ．ｉｓａｂｅｌｌｉｎａシトクロムＰ４５０タンパク質を過剰発現するＥ．ｃｏｌｉ細胞を使用したラクトンの生産
シトクロムＰ４５０タンパク質であるＵｍｂｅｌｏｐｓｉｓ ｉｓａｂｅｌｌｉｎｅ由来のＢＭ３ホモログのアミノ酸配列をＪＧＩ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｏｒｔａｌ（ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｊｇｉ．ｄｏｅ．ｇｏｖ／ｃｇｉ－ｂｉｎ／ｄｉｓｐＧｅｎｅＭｏｄｅｌ？ｄｂ＝Ｕｍｂｉｓａ１＆ｉｄ＝５２３６９５）から入手し、対応する遺伝子をＥ．ｃｏｌｉでの発現のためにコドン最適化し、Ｇｅｎｅ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｉｎｃ．（Ｎｅｗａｒｋ、ＤＥ）によって合成した。Ｅ．ｃｏｌｉ発現のためのコドン最適化を含む、Ｕｍｂｅｌｏｐｓｉｓ ｉｓａｂｅｌｌｉｎａのＢＭ３ホモログ、ＭＩ２のヌクレオチド配列は配列番号５として以下に提供される。ＭＩ２のアミノ酸配列は配列番号６として以下に提供される。

得られた遺伝子産物を、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｈｏＩ部位を通してｐＥＴ－３２ａ－（＋）ベクター（ＡＭＰ^＋、Ｎｏｖａｇｅｎ）にクローニングした。構築物を発現のためにＢＬ２１（ＤＥ３）細胞に形質転換し、一晩培養物を使用して、１００ｍｇ／Ｌのカルベニシリンを含有する液体ＬＢ培地（２％）に接種した。１６℃で１６時間インキュベートした後、細胞を遠心分離によって収穫した。

収穫した細胞ペレットを、０．１％ Ｔｗｅｅｎ（登録商標）４０を含有する１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に１００ｇ／Ｌ新鮮重量の濃度で再懸濁した。次いで、１ｇ／Ｌのラウリン酸（Ｃ１２：０）または１ｇ／Ｌのトリデカン酸（Ｃ１３：０）を振盪機内３０℃で生体内変換のために添加した。試料を異なる反応時間で採取し、ＭＳＴＦＡ（Ｎ－メチル－Ｎ－トリメチルシリル－トリフルオロアセトアミド）でシリル化した後、ＧＣ／ＭＳによってヒドロキシ脂肪酸の生産を決定した。

図７Ａおよび図７Ｂは、Ｕｍｂｅｌｏｐｓｉｓ ｉｓａｂｅｌｌｉｎａのＢＭ３ホモログ、ＭＩ２を過剰発現するＥ．ｃｏｌｉ細胞による、対応するカルボン酸からのＨＯ－Ｃ１２：０およびＨＯ－Ｃ１３：０の生産を実証する。マススペクトルライブラリー検索では、試料中のピーク１について正確な一致は見られなかったが、検索により、ピークがヒドロキシ脂肪酸であることが示された。

ヒドロキシ脂肪酸ＨＯ－Ｃ１２：０およびＨＯ－Ｃ１３：０からラクトンを生成するために、生体内変換混合物を６０ｇ／Ｌのコーンスティープリカー（ＣＳＬ）と１：１の比率で混合し、得られた培地を１２１℃で２０分間オートクレーブ処理した。培地を、それぞれＣ１２：０およびＣ１３：０生物変換についてＭＩ２－Ｃ１２－ＣＳＬまたはＭＩ２－Ｃ１３－ＣＳＬと標識した。次いで、培地に一晩酵母培養物、例えば、Ｃａｎｄｉｄａ ｂｏｉｄｉｎｉｉを接種し、酵母培養物を３０℃振盪機内で増殖させた。接種後、試料を毎日採取した。

酵母培養物中のラクトン生産を分析するために、０．５ｍｌのＣａｎｄｉｄａ ｂｏｉｄｉｎｉｉ培養物を採取し、１０μｌの２Ｎ ＨＣｌを添加した。酸性化した培養物を、室温で６０分間振盪しながら０．５ｍｌの酢酸エチルで抽出した。１４，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した後、酢酸エチル相をＧＣ／ＭＳまたはＧＣ／ＦＩＤ分析に使用した。

図８Ａおよび図８Ｂは、ＧＣ６が（中間体としてのＨＯ－Ｃ１２：０を介して）Ｃ１２：０から誘導される主要なラクトンであり、ＤＣ７が（中間体としてのＨＯ－Ｃ１３：０を介して）Ｃ１３：０から誘導される主要なラクトンであることをそれぞれ実証している。これは、ω－２ヒドロキシラウリン酸およびω－２ヒドロキシトリデカン酸が、それぞれ図７Ａおよび図７Ｂのピーク１に対応している可能性が高いことを示唆しており、これらはそれぞれＣ１２およびＣ１３から誘導された。

まとめると、これらの結果は、Ｕｍｂｅｌｏｐｓｉｓ ｉｓａｂｅｌｌｉｎａシトクロムＰ４５０ ＭＩ２がω－２脂肪酸ヒドロキシラーゼであり、γ－ヘキサラクトンまたはδ－ヘプタラクトンの生産に使用できることを実証している。
重要な配列
Ｍ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅ ＣＹＰ５０５Ａ３０ヌクレオチド配列（配列番号１）
ATGGCGGATAAGACCACCGAAACCGTGCCGATTCCGGGTCCGCCGGGCCTGCCGCTGGTTGGTAATGCGCTGGCGTTTGATAGCGAACTGCCGCTGCGTACCTTCCAGGAATTTGCGGAGGAATACGGCGAGATCTATCGTCTGACCCTGCCGACCGGTACCACCCTGGTGGTTAGCAGCCAAGCGCTGGTTCACGAACTGTGCGACGATAAGCGTTTCAAGAAGCCGGTTGCTGCGGCGCTGGCGGAAGTGCGTAACGGCGTTAACGACGGTCTGTTTACCGCGCGTGAAGAGGAGCCGAACTGGGGCATCGCGCACCGTATTCTGATGCCGGCGTTTGGTCCGGCGAGCATTCAGGGCATGTTTACCGAAATGCACGAGATCGCGAGCCAACTGGCGCTGAAATGGGCGCGTCACGGTCCGGACACCCCGATTTTCGTTACCGACGATTTTACCCGTCTGACCCTGGATACCCTGGCGCTGTGCACCATGAACTTCCGTTTTAACAGCTACTATCACGACGAACTGCACCCGTTCATCAACGCGATGGGCAACTTTCTGACCGAGAGCGGTGCGCGTGCGATGCGTCCGGCGATCACCAGCATTTTCCACCAGGCGGCGAACCGTAAGTACTGGGAAGATATTGAGGTTCTGCGTAAAACCGCGCAAGGTGTGCTGGACACCCGTCGTAAGCACCCGACCAACCGTAAAGATCTGCTGAGCGCGATGCTGGACGGCGTGGATGCGAAAACCGGTCAGAAACTGAGCGACAGCAGCATCATTGATAACCTGATCACCTTTCTGATTGCGGGCCACGAAACCACCAGCGGTCTGCTGAGCTTCGCGTTTTACCTGCTGATTAAGCACCAGGACGCGTATCGTAAAGCGCAAGAAGAGGTGGATCGTGTTATCGGCAAGGGCCCGATTAAAGTTGAACACATCAAGAAACTGCCGTACATCGCGGCGGTGCTGCGTGAAACCCTGCGTCTGTGCCCGACCATTCCGATCATTAACCGTGCGGCGAAGCAGGACGAAGTTATCGGTGGCAAGTACGCGGTGGCGAAAGATCAGCGTCTGGCGCTGCTGCTGGCGCAAAGCCACCTGGACCCGGCGGTTTATGGCGAAACCGCGAAGCAATTCATTCCGGAGCGTATGCTGGACGAAAACTTTGAGCGTCTGAACCGTGAGTATCCGGATTGCTGGAAACCGTTCGGTACCGGCATGCGTGCGTGCATCGGTCGTCCGTTTGCGTGGCAGGAAGCGGTGCTGGTTATGGCGATGCTGCTGCAAAACTTCGACTTTGTTCTGCACGATCCGTACTATGAGCTGCACTACAAGCAGACCCTGACCACCAAGCCGAAAGACTTCTATATGCGTGCGATCCTGCGTGATGGCCTGACCGCGACCGAACTGGAGCACCGTCTGGCGGGTAACGCGGCGAGCGTGGCGCGTAGCGGTGGCGGTGGCGGTGGCCCGAGCAAACCGACCGCGCAGAAAACCAGCCCGGCGGAAGCGAAACCGATGAGCATCTTCTACGGCAGCAACACCGGTACCTGCGAGAGCCTGGCGCAACGTCTGGCGACCGATGCGGCGAGCCACGGTTATGCTGCGGCGGCGGTGGAACCGCTGGACACCGCGACCGAGAAGCTGCCGACCGATCGTCCGGTGGTTATCATTACCGCGAGCTTCGAGGGTCAGCCGCCGGACAACGCGGCGAAGTTTTGCGGCTGGCTGAAAAACCTGGAAGGTGATGAGCTGAAAAACGTGAGCTACGCGGTTTTCGGTTGCGGCCACCACGACTGGAGCCAGACCTTTCACCGTATTCCGAAGCTGGTTCACCAAACCATGAAAGCGCACGGTGCGAGCCCGATCTGCGACGAAGGCCTGACCGATGTGGCGGAGGGTAACATGTTCACCGATTTTGAACAATGGGAGGACGATGTGTTCTGGCCGGCGGTTCGTGCGCGTTATGGCGCGGCGGGTGCGGTTGCGGAAACCGAGGACGCGCCGGGTAGCGATGGTCTGAACATCCACTTTAGCAGCCCGCGTAGCAGCACCCTGCGTCAGGACGTGCGTGAAGCGACCGTGGTTGGTGAAGCGCTGCTGACCGCGCCGGATGCGCCGCCGAAGAAACACATTGAAGTTCAACTGCCGGACGGCGCGACCTACAAAGTGGGTGATTATCTGGCGGTGCTGCCGGTTAACAGCAAGGAGAGCATTGGTCGTGTTATGCGTAAATTCCAGCTGAGCTGGGACAGCCACGTGACCATCGCGAGCGATCGTTGGACCGCGCTGCCGACCGGTACCCCGGTGCCGGCGTACGACGTTCTGGGTAGCTATGTGGAGCTGAGCCAACCGGCGACCAAACGTGGTATCCTGCGTCTGGCGGATGCGGCGGAAGATGAGGCGACCAAGGCGGAACTGCAAAAACTGGCGGGTGATCTGTACACCAGCGAGATTAGCCTGAAACGTGCGAGCGTTCTGGACCTGCTGGATCGTTTCCCGAGCATCAGCCTGCCGTTCGGTACCTTTCTGAGCCTGCTGCCGCCGATTCGTCCGCGTCAATACAGCATCAGCAGCAGCCCGCTGAACGACCCGAGCCGTGCGACCCTGACCTATAGCCTGCTGGATAGCCCGAGCCTGGCGAACCCGAGCCGTCGTTTCGTGGGCGTTGCGACCAGCTACCTGAGCAGCCTGGTTCGTGGTGACAAGCTGCTGGTGAGCGTTCGTCCGACCCACACCGCGTTTCGTCTGCCGGACGAAGATAAAATGGGTGAAACCGCGATCATTTGCGTGGGTGCGGGTAGCGGTCTGGCGCCGTTCCGTGGTTTTATCCAGGAACGTGCGGCGCTGCTGGCGAAAGGTACCCAACTGGCGGCGGCGCTGCTGTTCTACGGTTGCCGTAGCCCGGAGAAGGACGATCTGTATCGTGACGAATTCGATAAATGGCAAGAGAGCGGTGCGGTGGATGTTCGTCGTGCGTTTAGCCGTGTTGATAGCGACGATACCGAGGCGCGTGGTTGCCGTCACGTTCAGGACCGTCTGTGGCACGATCGTGAAGAGGTGAAGGCGCTGTGGGACCGTGGCGCGCGTGTGTACGTTTGCGGTAGCCGTCAAGTGGGCGAAGGTGTTAAAACCGCGATGGGCCGTATCGTGCTGGGTGAAGAGGACGCGGAGGATGCGATCAGCAAGTGGTATGAAACCGTGCGTAATGACCGTTATGCGACCGATGTGTTCGACTAA

Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ－１２亜株ＭＧ１６５５由来のｉｃｄ遺伝子（配列番号２）
GAAAGTAAAGTAGTTGTTCCGGCACAAGGCAAGAAGATCACCCTGCAAAACGGCAAACTCAACGTTCCTGAAAATCCGATTATCCCTTACATTGAAGGTGATGGAATCGGTGTAGATGTAACCCCAGCCATGCTGAAAGTGGTCGACGCTGCAGTCGAGAAAGCCTATAAAGGCGAGCGTAAAATCTCCTGGATGGAAATTTACACCGGTGAAAAATCCACACAGGTTTATGGTCAGGACGTCTGGCTGCCTGCTGAAACTCTTGATCTGATTCGTGAATATCGCGTTGCCATTAAAGGTCCGCTGACCACTCCGGTTGGTGGCGGTATTCGCTCTCTGAACGTTGCCCTGCGCCAGGAACTGGATCTCTACATCTGCCTGCGTCCGGTACGTTACTATCAGGGCACTCCAAGCCCGGTTAAACACCCTGAACTGACCGATATGGTTATCTTCCGTGAAAACTCGGAAGACATTTATGCGGGTATCGAATGGAAAGCAGACTCTGCCGACGCCGAGAAAGTGATTAAATTCCTGCGTGAAGAGATGGGGGTGAAGAAAATTCGCTTCCCGGAACATTGTGGTATCGGTATTAAGCCGTGTTCGGAAGAAGGCACCAAACGTCTGGTTCGTGCAGCGATCGAATACGCAATTGCTAACGATCGTGACTCTGTGACTCTGGTGCACAAAGGCAACATCATGAAGTTCACCGAAGGAGCGTTTAAAGACTGGGGCTACCAGCTGGCGCGTGAAGAGTTTGGCGGTGAACTGATCGACGGTGGCCCGTGGCTGAAAGTTAAAAACCCGAACACTGGCAAAGAGATCGTCATTAAAGACGTGATTGCTGATGCATTCCTGCAACAGATCCTGCTGCGTCCGGCTGAATATGATGTTATCGCCTGTATGAACCTGAACGGTGACTACATTTCTGACGCCCTGGCAGCGCAGGTTGGCGGTATCGGTATCGCCCCTGGTGCAAACATCGGTGACGAATGCGCCCTGTTTGAAGCCACCCACGGTACTGCGCCGAAATATGCCGGTCAGGACAAAGTAAATCCTGGCTCTATTATTCTCTCCGCTGAGATGATGCTGCGCCACATGGGTTGGACCGAAGCGGCTGACTTAATTGTTAAAGGTATGGAAGGCGCAATCAACGCGAAAACCGTAACCTATGACTTCGAGCGTCTGATGGATGGCGCTAAACTGCTGAAATGTTCAGAGTTTGGTGACGCGATCATCGAAAACATGTAA

Ｍ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅ ＣＹＰ５０５Ａ３０アミノ酸配列（配列番号３）
MADKTTETVPIPGPPGLPLVGNALAFDSELPLRTFQEFAEEYGEIYRLTLPTGTTLVVSSQALVHELCDDKRFKKPVAAALAEVRNGVNDGLFTAREEEPNWGIAHRILMPAFGPASIQGMFTEMHEIASQLALKWARHGPDTPIFVTDDFTRLTLDTLALCTMNFRFNSYYHDELHPFINAMGNFLTESGARAMRPAITSIFHQAANRKYWEDIEVLRKTAQGVLDTRRKHPTNRKDLLSAMLDGVDAKTGQKLSDSSIIDNLITFLIAGHETTSGLLSFAFYLLIKHQDAYRKAQEEVDRVIGKGPIKVEHIKKLPYIAAVLRETLRLCPTIPIINRAAKQDEVIGGKYAVAKDQRLALLLAQSHLDPAVYGETAKQFIPERMLDENFERLNREYPDCWKPFGTGMRACIGRPFAWQEAVLVMAMLLQNFDFVLHDPYYELHYKQTLTTKPKDFYMRAILRDGLTATELEHRLAGNAASVARSGGGGGGPSKPTAQKTSPAEAKPMSIFYGSNTGTCESLAQRLATDAASHGYAAAAVEPLDTATEKLPTDRPVVIITASFEGQPPDNAAKFCGWLKNLEGDELKNVSYAVFGCGHHDWSQTFHRIPKLVHQTMKAHGASPICDEGLTDVAEGNMFTDFEQWEDDVFWPAVRARYGAAGAVAETEDAPGSDGLNIHFSSPRSSTLRQDVREATVVGEALLTAPDAPPKKHIEVQLPDGATYKVGDYLAVLPVNSKESIGRVMRKFQLSWDSHVTIASDRWTALPTGTPVPAYDVLGSYVELSQPATKRGILRLADAAEDEATKAELQKLAGDLYTSEISLKRASVLDLLDRFPSISLPFGTFLSLLPPIRPRQYSISSSPLNDPSRATLTYSLLDSPSLANPSRRFVGVATSYLSSLVRGDKLLVSVRPTHTAFRLPDEDKMGETAIICVGAGSGLAPFRGFIQERAALLAKGTQLAAALLFYGCRSPEKDDLYRDEFDKWQESGAVDVRRAFSRVDSDDTEARGCRHVQDRLWHDREEVKALWDRGARVYVCGSRQVGEGVKTAMGRIVLGEEDAEDAISKWYETVRNDRYATDVFD

Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ－１２亜株ＭＧ１６５５由来のｉｃｄタンパク質（配列番号４）
MESKVVVPAQGKKITLQNGKLNVPENPIIPYIEGDGIGVDVTPAMLKVVDAAVEKAYKGERKISWMEIYTGEKSTQVYGQDVWLPAETLDLIREYRVAIKGPLTTPVGGGIRSLNVALRQELDLYICLRPVRYYQGTPSPVKHPELTDMVIFRENSEDIYAGIEWKADSADAEKVIKFLREEMGVKKIRFPEHCGIGIKPCSEEGTKRLVRAAIEYAIANDRDSVTLVHKGNIMKFTEGAFKDWGYQLAREEFGGELIDGGPWLKVKNPNTGKEIVIKDVIADAFLQQILLRPAEYDVIACMNLNGDYISDALAAQVGGIGIAPGANIGDECALFEATHGTAPKYAGQDKVNPGSIILSAEMMLRHMGWTEAADLIVKGMEGAINAKTVTYDFERLMDGAKLLKCSEFGDAIIENM

Ｕｍｂｅｌｏｐｓｉｓ ｉｓａｂｅｌｌｉｎａ ＭＩ２ヌクレオチド配列（配列番号５）
ATGAGCACCACCACCCTGATTGTGGCCATTAAGGGTACCGATAATGTTGAACGTGATGGCGCAATTGTTCGTCTGGATGCCGGCGCCAGTATGGAAACCCTGCGTCCGCGCATTGCAGAAAAACTGGCCATTAGCAGTGGCATTGAAGATCTGATTCTGGAAGATGCAAATGGTGACAATCTGACCACCATTGATCAGGTTCGTAAACAGCAGACCGTTTTTGTTAATCTGGAAGATCAGATTAAGCTGCCGGCAGTTCCGGCCCATACCCTGCCGTATTTTGGTAATCTGTATCAGCTGCTGCCGGATATGCTGGCCGGTTGGCGCAAACTGTTTGATGAATATGGTCCGGTTGTTAAAGTGAATCTGCTGGGCAATGAAATTATTGGTACCAATGATCCGGCCGTGGCCGAACTGTGGGTTAAAGAAAGCGAATATTTTACCAAAAAGATCTACGGTGGCCTGCAGGAAGTTAAAAGTTTTGGCGGCCAGGGTCTGTTTACCACCGATAGCGATGATATGGATTGGAAACTGGCACATAAACTGCTGATGCCGGCATTTTCACCGCGCGCCATTAAGGTTTATCAGCATGAAATGAGCGTGATTGGTCTGCAGACCATTAAGGTTTTTGAACAGTATAGCCCGGATGAAGAAGTGGAAATTCTGCATTGGACCACCAATCTGACCTTTGAAACCATTGGCAAAGTTGGTTTTGGCTATGATTTTCATCTGCTGGATGATCGTTATGGCGAAAATCATCCGTTTATTGAAGCAATGGGTTATTGCATGAAACAGAGCTTTGCCCGTGGCACCCAGAGCAAACTGATTAAGTATCTGCCGATTGAAGCCAATCGTCGCTATGATCGCAGTCTGAATCTGATGCATAGCATTGTTGATGAAGTTATTACCCAGCGTAAAAGCCATCCGCATGCAAGCGAAGATAATAAGGATCTGCTGGATTTTATGCTGACCGCACGTGATGAAAATAATCTGGGCCTGAGCGATGAAAATATTCGCGATCAGGTTATTACCTTTCTGATTGCCGGCCATGAAACCACCAGCAATACCCTGGCATGGACCCTGTATGAACTGAGTCGCCATCCGGAAATTGAACAGAAAATTCTGCAGGAAGTGGTGAATCTGGGCATTACCACCGATTCACTGCCGACCAGCGAACAGAGCAGTAGCATGAAATATACCTATCAGGTGCTGAAAGAAACCCTGCGCATGTATAGTCCGCTGCGTGCACTGGCAAAATATTGCAAAAAAGATATTGTGGTGCCGGGCGGCTATCAGATTAAGGCAGGCGATCGTGTGGCCGTTCAGCTGAATAGCCTGCATTATAATGAAAAAGTTTACCCGAATCCGACCCAGTATGATCCGAGTCGCTGGACCCCGGAAGAAGAACAGAAACGCAGTCGCTTTGCCTGGCTGCCGTTTAGCACCGGCCCGCGTAGCTGCATTGGTATGGCACTGGCCCTGCAGGAAGCAAAAACCATTCTGGCAATGATTCTGCTGAAATTTCGCTTTGTTTATGATGGTCCGCCGATTGGTTATGATCCGAAAAGCCCGACCATTCGTCCGCTGAATCTGATGATGAAAATTCTGCCGCGTGATAAACTGCCGAGCCCGACCGCCGATAATAAGCTGACCCCGGTTGGCAGTCCGAATATTGGTAAAGCCCAGATGGCAATGCCGACCGCAGCCACCAATGTTGGTACCGCCGAACTGCCGCCGGTTTTCTTTCTGTATGGTACCCAGACCGGTACCGCCCAGGATTATGCAAGTCAGCTGGCAAGCCAGGCCAAAAGTTTTGGTTTTAAAGATATTACCCTGTGTGAAATGGATAAATGGGAAGTGCTGCAGAGCGGCAAATATACCGGTGCCAAAGAAGAAAAAGATACCCGTGCCCTGGTTGTTATTTGTACCGCAACCTATAATGGCAGCCCGCCGGATAGTGCAGAAAATTTTGATAAATTCATTACCGACACCAGCAAAGATAATGATCTGCCGCTGAAAGGCCTGCTGTATACCGTGTTTGGCCTGGGCAATCGTAATTGGCGCACCTATCAGCAGTTTCCGATTAAGTGCGATGCCCGTCTGGATGAACTGGGTGGTGAACGCTTTTATGATCTGGGCAGCGGCAATGCCGATAAAGATATGGATGGTGAATTTCATGATTGGTGCGCCCATTTTTGGACCCATACCCTGACCTATTATGGCATTGCAACCCATGAAGGTAGTGCAAGTCTGGTGCCGGGCCAGAAAACCACCGAAGATCCGACCAGCGGTCTGGAAATTCGTTTTATTCCGCCGAGCGAAAGCGAAGCCTGGGATAAAGCCGATAAAAATGTTAATGGTGACTATAATGCGGAAATTCAGGTGAATCGCGAACTGCAGAATATTGAACGTAGTAAACGTAGCACCCGCCATATTGAAATTGATATTAGTAAACTGCAGAGCCCGGATACCGATAAACATCGTTATCTGACCGGTGACCATCTGGAAGTGTATCCGGAAAATGCCGATAATGTGGTGGAAAGCATTGCCCTGGGCTTTGGTCTGATTCTGGATAGTGTGTTTGAAATTACCAGCGTGGATAAAAGTACCGTGAGTAGTCGTAGCCTGGCAGCCAGTATTACCGGCCCGTGTACCGTTCGTAATGCCCTGAAATATTATGCCGATATATATAGTGCCCCGAGCCGTTATCTGCTGGCCTTTTTCGCAGCACGCCTGCAGGATACCCATCCGGATGTTGCCGCAAGTTTTAGCGATGTGATTATTCCGGGTGAAAATGGCCAGAAAGCCTATAATGAATTCATTCAGAAATACCGTAACCTGCTGGATCTGCAGCGCGGCTTTCCGCTGAAAGAACTGGATCTGAAAGAATTTCTGTGCGCAGTTAGCGTTATGCAGCCGCGCCGTTATAGCATTGCCAGCAGCCCGCTGAAAGCAGAAGATACCGCATATCTGGCAGTTGGTGTGGTGGATGATGTGTTTGCAAATCGTCATTATTATGGCCTGGCCAGTGGCTATCTGGCCCGCAGCCAGCCGCCGACACCGATTCGTGCACGTATTAAGAGTAGCAAAAGTACCTTTGGCCTGCCGGAAAATCCGGAAACCCCGATTATTATGATTGGTGCCGGTACCGGTATTAGTCCGTTTATGGGCTTTATGCAGGAACGCGAAATGCTGAAAAGCAAAGCAGAAGCCCATCTGTTTTTCGGCTGCCGCCATCCGGATGAAGATTTTATCTATCGTAGCGTTTTTGAAGGCTATGAAAAAAGCGGCGTTATTACCAAACTGTATCCGGCCTTTAGCCGTCTGGGTGAAGATAATCCGCGCAAATATGTTCAGCATCAGCTGATGGCAAATGCCGGCAAAATTTGGACCCTGCTGACCAATGGCGCAAATGTGTATGTTTGCGGCAGTGGCCCGATGAGCCGCGATGTGCGTCGTAGCTTTGAACTGATGGCAAAAAGTTTTGGAGGCGCCAAAACCGATGATGAAGCATGCGAAAAACTGCTGGAATTCATGAGCGCAGGTCGTTATAATGAAGATGTGTGGGGTTAA

Ｕｍｂｅｌｏｐｓｉｓ ｉｓａｂｅｌｌｉｎａ ＭＩ２アミノ酸配列（配列番号６）
MSTTTLIVAIKGTDNVERDGAIVRLDAGASMETLRPRIAEKLAISSGIEDLILEDANGDNLTTIDQVRKQQTVFVNLEDQIKLPAVPAHTLPYFGNLYQLLPDMLAGWRKLFDEYGPVVKVNLLGNEIIGTNDPAVAELWVKESEYFTKKIYGGLQEVKSFGGQGLFTTDSDDMDWKLAHKLLMPAFSPRAIKVYQHEMSVIGLQTIKVFEQYSPDEEVEILHWTTNLTFETIGKVGFGYDFHLLDDRYGENHPFIEAMGYCMKQSFARGTQSKLIKYLPIEANRRYDRSLNLMHSIVDEVITQRKSHPHASEDNKDLLDFMLTARDENNLGLSDENIRDQVITFLIAGHETTSNTLAWTLYELSRHPEIEQKILQEVVNLGITTDSLPTSEQSSSMKYTYQVLKETLRMYSPLRALAKYCKKDIVVPGGYQIKAGDRVAVQLNSLHYNEKVYPNPTQYDPSRWTPEEEQKRSRFAWLPFSTGPRSCIGMALALQEAKTILAMILLKFRFVYDGPPIGYDPKSPTIRPLNLMMKILPRDKLPSPTADNKLTPVGSPNIGKAQMAMPTAATNVGTAELPPVFFLYGTQTGTAQDYASQLASQAKSFGFKDITLCEMDKWEVLQSGKYTGAKEEKDTRALVVICTATYNGSPPDSAENFDKFITDTSKDNDLPLKGLLYTVFGLGNRNWRTYQQFPIKCDARLDELGGERFYDLGSGNADKDMDGEFHDWCAHFWTHTLTYYGIATHEGSASLVPGQKTTEDPTSGLEIRFIPPSESEAWDKADKNVNGDYNAEIQVNRELQNIERSKRSTRHIEIDISKLQSPDTDKHRYLTGDHLEVYPENADNVVESIALGFGLILDSVFEITSVDKSTVSSRSLAASITGPCTVRNALKYYADIYSAPSRYLLAFFAARLQDTHPDVAASFSDVIIPGENGQKAYNEFIQKYRNLLDLQRGFPLKELDLKEFLCAVSVMQPRRYSIASSPLKAEDTAYLAVGVVDDVFANRHYYGLASGYLARSQPPTPIRARIKSSKSTFGLPENPETPIIMIGAGTGISPFMGFMQEREMLKSKAEAHLFFGCRHPDEDFIYRSVFEGYEKSGVITKLYPAFSRLGEDNPRKYVQHQLMANAGKIWTLLTNGANVYVCGSGPMSRDVRRSFELMAKSFGGAKTDDEACEKLLEFMSAGRYNEDVWG

ＩＣＤ－Ｆプライマー（配列番号７）
GGAATTCCATATGGAAAGTAAAGTAGTTGT

ＩＣＤ－Ｒプライマー（配列番号８）
CCGCTCGAGTTACATGTTTTCGATGATCGCGT

Claims (1)

1. 明細書に記載の発明。

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