JP2022545578A - 低分子ナマコ由来グリコサミノグリカン及びその応用 - Google Patents

Abstract

【課題】グルクロン酸基、Ｎ－アセチルエステルアミノガラクトース基、フコース基およびその硫酸エステル基又はアセチルエステル基を構成単位とする低分子ナマコ由来グリコサミノグリカンを提供する。【解決手段】グルクロン酸とＮ－アセチルエステルアミノガラクトース基は、β（１－３）及びβ（１－４）グルコシド結合によって交互に連結して二糖繰り返し構造単位の主鎖を形成し、フコース基は、側鎖として主鎖に連結する。モル比で、グルクロン酸基：Ｎ－アセチルエステルアミノガラクトース基：フコース基＝１：（０．８～１．２）：（０．６～１．２）となる。低分子ナマコ由来グリコサミノグリカンの構造のうち、グルクロン酸基の２－位の１０％～３０％が硫酸エステル基修飾で、残りが水酸基であり、フコース基の２－位の１０％～３０％の割合はアセチルエステル基修飾で、残りは水酸基又は硫酸エステル基である。本発明の低分子グリコサミノグリカンは、抗炎症、抗血管病変、抗腫瘍又は抗腫瘍転移および学習記憶能力を改善する作用があり、関連する薬物又は健康食品の調製に使用することができる。【選択図】図５

Description

本発明は、バイオ医薬および健康食品の技術分野に関し、特に、低分子ナマコ由来グリコサミノグリカン及びその医薬組成物又は健康食品組成物の調製への応用に関する。

軟体動物ナマコから抽出したナマコ由来グリコサミノグリカン（Holothurian Glycosaminoglycan、以下、HGと称す）は、フコース分岐鎖を有する特殊な硫酸グリコサミンポリ糖であり、アミノガラクトース（ＧａｌＮ、Ａ）、グルコンアルデヒド酸（ＧｌｃＡ、Ｕ）、フコース（Ｆｕｃ、Ｆ）及びこれらの硫酸エステル（－ＯＳＯ_３ ^－、Ｓ）が含まれる(樊絵曾氏ら、薬学学報、1983、18(3):203。Ken-ichiro Y et al.、Tetrahedron Letters、1992、33(34):4959-4962）。

従来技術の研究により、天然由来のＨＧ構造は共通性を有し、その基本構成単位は、ＧｌｃＡとＧａｌＮ（主にＮ－アセチルエステル－アミノガラクトース、ＧａｌＮＡｃ）とをβ（１－３）およびβ（１－４）グリコシド結合を介して交互に連結し、哺乳動物におけるコンドロイチン硫酸Ｅと同様の［－ＧｌｃＡβ（１－３）－ＧａｌＮＡｃβ（１－４）－］二糖繰り返し構造主鎖を形成するが、Ｆｕｃおよびその硫酸エステルは、側鎖として主鎖に結合している。(Vieira RP et al.、J. Biol.Chem.、1991、266:13530-13536)。

異なるナマコ源から得られる天然由来ＨＧは、単糖組成の割合と構造に差がある。組成の糖単位の割合の違いに加えて、主鎖におけるＨＧの違いは、主にＧａｌＮＡｃの４－位と６－位の硫酸エステル化の程度の違いに反映されている。マナマコＳ．Ｊａｐｏｎｉｃｕｓ由来のＨＧは、主鎖中のＧａｌＮＡｃの４－位と６－位にいずれも硫酸エステル化が存在する(Ken-ichiro Y et al.、Tetrahedron Letters、1992、33(34)4959-4962)。タマゴナマコＨ．ｌｅｕｃｏｓｐｉｌｏｔａ由来のＨＧ主鎖ＧａｌＮＡｃは、４－位硫酸エステル化（ＧａｌＮＡｃ４Ｓ）のみ存在し、６－位硫酸エステル化（ＧａｌＮＡｃ６Ｓ）は存在しない（樊絵曽氏ら、薬学学報、１９８０、１８（３）２０３）。一方、ブラジルナマコＬ．ｇｒｉｓｅａ由来のＨＧ主鎖のうち、約５３％のＧａｌＮＡｃは６－硫酸エステル（ＧａｌＮＡｃ６Ｓ）存在し、残りは少量の４、６－ジ硫酸エステル（ＧａｌＮＡｃ４Ｓ６Ｓ）が約１２％、４－硫酸エステル（ＧａｌＮＡｃ４Ｓ）が約４％、そして硫酸でエステル化されていない約３１％のＧａｌＮＡｃが存在する(luborborsigetal.j.biol.chem.2007、282:14984)。他方、側鎖ＦｕｃでのＨＧの違いは、主に硫酸エステル化修飾サイトと組成比率の違いに体現される。例えば、マナマコＳ．Ｊａｐｏｎｉｃｕｓ及びブラジルナマコＬ．ｇｒｉｓｅａ由来のＨＧには、いずれも、２、４－ビス硫酸エステル（Ｆｕｃ２Ｓ４Ｓ）、３、４－ビス硫酸エステル（Ｆｕｃ３Ｓ４Ｓ）及び４－硫酸エステル（Ｆｕｃ４Ｓ）の３種類の側鎖Ｆｕｃが存在する（Ｋｅｎ－ｉｃｈｉｒｏ Ｙ ｅｔ ａｌ．、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ、１９９２、３３（３４）４９５９－４９６２。Ｐａｕｌｏ ＡＳ． ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９９６、２７１：２３９７３）が、この二つの由来のＨＧ中の側鎖Ｆｕｃの組成比率に差がある。

文献に報告された天然由来ＨＧ分子構造は、まとめて以下の構造式で表すことができる。

従来の文献によると、ＨＧは多くの生物学的活性と機能を持っている。天然由来ＨＧは高度に硫酸化されたグリコサミノグリカンとして、顕著な抗凝固抗栓活性を有し（樊絵曽ら、薬学学報、１９８０、１８（３）２０３など）、その抗凝固作用は、ヘパリンと異なり、抗トロンビンII型Ｉ（ＡｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎII型Ｉ、ＡＴ－II型Ｉ）に依存せず、複数の凝血因子標的（Ｐａｕｌｏ ＡＳ．ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９９６、２７１：２３９７３）に使用できる。また、ＨＧは、抗炎症性抗腫瘍（ｌｕｂｏｒｂｏｒｓｉｇｅｔａｌ．ｊ．ｂｉｏｌ．ｃｈｅｍ．２００７、２８２：１４９８４）及び脂質調節（Ｔｏｖａｒ ｅｔ ａｌ．、Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ、１９９６、１２６：１８５－１９５）の機能も有している。

ＨＧは、多くの生物学的活性を持っているが、今まで臨床に応用することは困難である一面がある。その原因は、主にＨＧは強い抗凝固活性を持っているほか、ヘパリンによる血小板凝集を誘導するような活性を持っている特性にある。研究データによると、薬効用量のマナマコＨＧは、生体動物の血管内に投与すると血小板数が減少し(Li JZ et al.、Thromb. Haemostas.、1998、59(3):435)、この血小板減少は、ヘパリンによる免疫性血小板減少症(Heparin Induced Thrombocytopenia、HIT)を引き起こす傾向があり、出血傾向を引き起こすこともあるし、重症ないし致命的なびまん型血管内凝固を引き起こす可能性もある。一方、文献によると、ＨＧの分子量を下げることで、血小板凝集活性を誘導する作用を効果的に減少または回避し、応用安全性を高めることができる。

上記ＨＧとその誘導体技術の応用上の困難を解決するため、本発明者は、２０１５年０７月２３日に「解重合ナマコ由来グリコサミノグリカン組成物とその調製方法と応用」という中国特許出願（ＣＮ２０１５１０４３８１３９．９）を提出し、低分子量の解重合ナマコ由来グリコサミノグリカン(Depolymerized Holothurian Glycosaminoglycan、dHG)を開示した。しかし、このｄＨＧは、薬理活性が十分ではないという課題があり、その応用が制限されている現状がある。

上記課題を解決するために、より薬理活性に優れ、より臨床応用に適するＨＧ誘導体を提供することを目的として、本発明は、抽出された天然由来ＨＧから低分子量のＨＧ誘導体である低分子ナマコ由来グリコサミノグリカン(low Molecular Weight Holothurian Glycosaminoglycan、LHG)組成物を提供する。このＬＨＧは、主鎖のＧｌｃＡの２－位が１０％～３０％の割合で硫酸エステルで修飾されている（ＧｌｃＡ２Ｓ）構造と、分岐鎖のＦｕｃの２－位が１０％～３０％の割合でアセチルエステルで修飾されている（Ｆｕｃ２Ａｃ）構造と、二つの独特な分子構造特徴を有しており、これらの分子構造特徴を有するＨＧ又はＨＧ誘導体は、いずれも、これまでに報告されていない。また、本発明のＬＨＧは、生物活性の面で、抗凝血活性が低く、血小板凝集を誘導する活性が弱いが、抗炎症、抗血管病変、抗腫瘍又は抗腫瘍転移および記憶力の改善などの作用があり、潜在的に関連疾患の予防治療や健康食品への応用が可能である。

具体的には、本発明は、下記式に示すような構造を有することを特徴とする低分子ナマコ由来グリコサミノグリカンを提供する：

低分子ナマコ由来グリコサミノグリカンの構成単位は、グルクロン酸基、Ｎ－アセチルエステルアミノガラクトース基、フコース基及びそれらの硫酸エステルナトリウム又はアセチルエステル又はナトリウムであり、前記グルクロン酸及び前記Ｎ－アセチルエステルアミノガラクトース基は、β（１－３）及びβ（１－４）グルコシド結合によって交互に連結して二糖繰り返し構造単位の主鎖を形成し、前記フコース基は、側鎖として前記主鎖に連結し、モル比で、グルクロン酸基：Ｎ－アセチルエステルアミノガラクトース基：フコース基＝１：（０．８～１．２）：（０．６～１．２）であり、上記構造式では、ｎ＝１～３２であり、－Ｒ１、－Ｒ２、－Ｒ４、－Ｒ６は、いずれも水酸基（－ＯＨ）又は硫酸エステルナトリウムであり、－Ｒ３のうち、１０％～３０％は硫酸エステルナトリウムであり、残りは水酸基であり、－Ｒ５のうち、１０％～３０％はアセチルエステルであり、残りは水酸基又は硫酸エステルナトリウムである。

上記の低分子ナマコ由来グリコサミノグリカンは、ナトリウム塩の形をしており、ナトリウムはカルボキシル基又は硫酸エステル基にイオン結合で結合する。

また、低分子ナマコ由来グリコサミノグリカンは、カリウム塩、カルシウム塩、リチウム塩、亜鉛塩などの他の金属塩の形であってもよいが、これらに限定されるものではない。金属塩の形の転換は、カチオン性樹脂を用いてナトリウムイオンを吸着除去し、特定の金属塩を添加することで低分子ナマコ由来グリコサミノグリカンの他の塩誘導体を調製し、最終的にアルコール沈殿などの方法で精製するなど、当分野でよく見られる操作方法を用いて行うことができる。これらの低分子ナマコ由来グリコサミノグリカンの金属塩形式は、特定の応用環境の異なるイオン形式に対する需要を満たすことができる。

また、本発明は、炎症、血管病変関連疾患、腫瘍関連疾患、アルツハイマー病などの関連疾患の予防又は治療に使用される薬物又は健康食品の調製に、上記の低分子ナマコ由来グリコサミノグリカンを使用する応用を提供する。

本発明により提供されるＬＨＧは、血小板活性、抗炎症、抗血管病変、抗腫瘍又は抗腫瘍転移を調節し、学習記憶能力を改善する作用を有するため、ＬＨＧを活性物質として薬学的又は健康食品業界で許容される担体を用いて、炎症、血管病変、腫瘍、アルツハイマー病などの関連疾患の予防と治療に用いられる薬物又は健康食品組成物を調製することができる。

図１は、本発明の実施例３に係る主鎖二糖単位構造の特徴解析のＨＰＬＣ結果図であり、図１（Ａ）は二糖標準品の結果であり、図１（Ｂ）は、Ｓａｍｐｌｅ１－Ｍ、Ｓａｍｐｌｅ２－Ｍ、Ｓａｍｐｌｅ３－Ｍ、Ｓａｍｐｌｅ４－Ｍ、Ｓａｍｐｌｅ５－Ｍ及びＳａｍｐｌｅ６－Ｍの結果図である。 図１は、本発明の実施例３における各サンプルに含む二糖のピーク面積及びピーク面積の割合を示すヒストグラムであり、図２（Ａ）は分解された二糖成分のピーク面積を示すヒストグラムであり、図２（Ｂ）はサンプル中の各二糖成分の百分率ヒストグラムである。 図３は、本発明の実施例４のＬＨＧの^１Ｈ－ＮＭＲスペクトルである。 図４は、本発明の実施例５のＬＨＧサンプルのヘテロＣＯＳＹおよびＴＣＯＳＹ重畳マップである。 図５は、本発明の実施例５に係るＬＨＧ試料のＨＳＱＣ－ＣＯＳＹおよびＨＳＱＣ－ＴＯＣＳＹ重畳マップである。 図６は、本発明の実施例５に係るＬＨＧサンプルの糖環残基領域のＨＳＱＣマップ図である。 図７は、本発明の実施例６における異なるＬＨＧ試料の^１Ｈ－ＮＭＲスペクトル比較模式図である。 図８は、本発明の実施例７のＬＨＧ試料中の異なる分子量成分の^１Ｈ－ＮＭＲスペクトル比較模式図である。 図９は、本発明の実施例１１のＬＨＧによるマウス生体内ＳＵＩＴ２－ＬＵＣ（ヒト膵臓癌細胞）の肺転移抑制実験結果であり、図９（Ａ）は体重変化折れ線図、図９（Ｂ）は腫瘍体積変化折れ線図、図９（Ｃ）は終点における腫瘍重棒グラフ、図９（Ｄ）は蛍光信号強度のヒストグラム、図９（Ｅ）は各群のマウスのＩＶＩＳ画像、図９（Ｆ）は各群のマウスの肺および腫瘍のＩＶＩＳ画像である。

以下、本発明の具体的な実施例について図面及び実施例を併せて説明する。なお、以下の実施例は、本発明の技術スキームを説明するためにのみ使用されるが、本発明の保護範囲を限定するものではない。

実施例１：低分子ナマコ由来グリコサミノグリカン（ＬＨＧ）の調製

本実施例は、本発明のＬＨＧの調製であり、その調製工程は、以下の工程を含む。

１、ナマコ由来グリコサミノグリカン（ＨＧ）の抽出と精製
市販の干しナマコ１０Ｋｇを取り、水２０Ｌに一晩浸し、破砕する。ナマコ由来スラリを１００Ｌの反応釜に移し、水５０μＬ、炭酸ナトリウム０．８Ｋｇ、塩化ナトリウム１．６Ｋｇを追加し、５０℃まで加熱して保温する。０．２Ｋｇのアルカリプロテアーゼ２７０９を加え、酵素分解を６時間行った。酵素分解が終わった後、ガーゼで砂利をろ過除去し、そのろ液を５Ｋｇの湿重量を有する「朗盛」社制「Ｓ５４２８樹脂釜」に移し、３時間攪拌吸着を続けた。その後、樹脂を濾取し、水で樹脂を３回洗い流し、１５Ｌの４％塩化ナトリウム溶液で樹脂をすすぎ、リンス液を捨て、またすすぎを２回繰り返す。樹脂に対して、さらに１５％塩化ナトリウム溶液で溶出し、それぞれ１５Ｌで３回溶出し、室温で１５－３０分間に一回撹拌し、溶出液を併用する。撹拌して、４５Ｌの９５％エタノールを加えて沈殿させ、遠心分離でＨＧを集めた。得られたＨＧを２Ｌの３％塩化ナトリウム溶液で溶解した後、３Ｌの９５％エタノールを加えて沈殿させ、９５％エタノールを脱水し、乾燥させ、最終的にＨＧを合計１２５．２ｇを得た。

２、分解して低分子ナマコ由来グリコサミノグリカン（ＬＨＧ）を調製する
上記１の純品ＨＧを１００ｇ量り、水を０．９Ｌ加え、全溶するまで攪拌する。氷酢酸を１０ｍＬと３０％の過酸化水素を１００ｍＬ加え、反応液を加熱して５０℃程度に保つ。反応中にサンプリングしてＨＰＬＣで目的物の分子量分布を検出し、２４時間程度で、サンプリングして測定した目的物の分子量は７４００Ｄａで、反応を中止する。反応液にＮａＯＨ溶液をｐＨ中性まで補充し、塩化ナトリウム１００ｇを加え、全溶まで攪拌する。さらに２Ｌの９５％エタノールを加えて沈殿させ、遠心分離で目的のＬＨＧ粗品を得る。沈殿は、１Ｌの３％塩化ナトリウム溶液で再溶解し、さらに１．５Ｌの９５％エタノールで沈殿する。再溶解と沈殿を１回繰り返し、最終沈殿を９５％エタノールで脱水し、真空乾燥して、合計で７３．５ｇのＬＨＧを調製し、そのバッチ番号をＬＨＧ－Ｌ１８０５０１とする。

３．その他のバッチの低分子ナマコ由来グリコサミノグリカン（ＬＨＧ）の調製
本実施例では、他のルートで入手したナマコで行う複数バッチのＬＨＧの調製も挙げられる。
具体的には、上記の１と２の２つのステップを用いて、ＨＰＬＣ分子量検出に基づいてプロセス対照を行い、得られたＬＨＧの分子量がすべて１００００Ｄａ以下になるように、原材料の量（又は濃度）と温度、時間、ｐＨなどの一般的な操作パラメータ、および塩水でアルコールを溶解させる沈殿などの一般的な精製工程の使用の有無、及び回数の差についてのみ、ナマコを用いてＬＨＧの調製を行った。いくつかの典型的なバッチのバッチ番号、投入量と生産率は、以下の表１に示す通りである。

＊表１中の各バッチのＬＨＧは、マクロビオトープＨＧ段階での残留サンプルなどを含まない。

実施例２：ＬＨＧの理化学的性質と生物学的特性の分析
本実施例は実施例１で調製した各バッチのＬＨＧの理化学的性質と生物学的特性の分析実験である。

１．実験材料：
被験化合物：上記実施例１の各バッチのＬＨＧ

２．実験方法：
（１）重量平均分子量検査：ＧＰＣ－ＨＰＬＣ法を採用する。具体的な実験条件は、カラムは１本のＴＳＫｇｅｌＧ２０００ＳＷ（７．８ｍｍ×３０ｃｍ、５ｍ）と１本のＴＳＫｇｅｌＧ３０００ＳＷ（７．８ｍｍ×３０ｃｍ、５ｍ）を直列に接続し、検出器は示差屈折検出器（ＲＩＤ）を使用し、重量平均分子量計算標準品はＵＳＰ商用低分子ヘパリンの重量平均分子量校正品ＲＳを使用し、分析用ソフトとしてはＨＰＬＣワークステーション及びＡｇｉｌｅｎｔ社のＧＰＣソフトを使用する。ＳＥＣ－ＨＰＬＣ分析で検出し、ＧＰＣソフトと組み合わせて計算する。
（２）抗－Ｘａ因子活性検査：ＵＳＰ４０のヘパリンナトリウム因子力価測定方法を参照。
（３）抗凝血活性検査：ＵＳＰ３２ヘパリンナトリウムによる力価検査法（ヒツジ血漿法）を参照。
（４）ナトリウム含有量の測定：中国薬局方０４０６原子吸光光度法を参照。
（５）ＧｌｃＡ：ＧａｌＮＡｃ：Ｆｕｃのモル比分析：カルバゾール法によるグルクロン酸ＧｌｃＡ含有量の検出、Ｅｌｓｏｎ－Ｍｏｒｇｏｎ法によるアセチルエステルアミノガラクトースＧａｌＮＡｃ含有量の検出、及び^１Ｈ ＮＭＲメチル基積分面積に基づくＧａｌＮＡｃ／Ｆｕｃモル比の算出。
（６）硫酸根／カルボン酸根の割合分析：電導滴定法により測定する。
（７）比旋光度測定：中国薬局方（２０１０版）二部付録ＶＩＥ方法に基づいて測定する。
（８）絶対重量平均分子量検査：ＳＥＣ－ＭＡＬＬＳ法により検査する。

３．結果と結論
以下の表２は、本実施例のＬＨＧの各サンプルの理化学的性質と生物学的活性検査結果である。

表２から分かるように：
１）重量平均分子量：各ＬＨＧサンプルの重量平均分子量は、いずれも１００００Ｄａ以下であるに対して、天然由来ＨＧの分子量は通常６００００－８００００Ｄａ以上であるため、ＬＨＧが解重合した低分子製品であることを示している。
また、ＳＥＣ－ＭＡＬＬＳ法で測定した絶対重量平均分子量から、ＬＨＧの最大分子成分は２８０００Ｄａ－３００００Ｄａの間にあることであるため、繰り返し構成糖単位（ＧｌｃＡ（Ｆｕｃ）－ＧａｌＮＡｃ）とそれに対応する硫酸度（４．０、スルホン酸根／カルボン酸根比率の結果）の修飾から推定すると、本発明における前記ＬＨＧの一般式構造中のｎは、最大３２であることが証明される。
２）抗凝固活性：各ＬＨＧサンプルに抗－Ｘａ因子活性がほとんど見られていないため、その抗凝固作用は抗－Ｘａ因子に依存せず、別の方式で発揮される。また、ヒツジ血漿法で測定した全抗凝固活性も１０Ｕ／ｍｇ以下であるため、ＬＨＧの抗凝固活性が低いことが示唆された。
３）ナトリウム含有量：上記結果から分かるように、各ＬＨＧサンプルのナトリウム含有率は１１．２％～１２．１％の間に集中され、これは分子構造単位のカルボキシル基及び後述の硫酸根の数と一致しており、ナトリウムはこれらの基にイオン結合で結合している。
４）ＧｌｃＡ：ＧａｌＮＡｃ：Ｆｕｃのモル比：結果より、各ＬＨＧサンプルの単糖組成モルは、比較的に近似され、いずれも１：０．８－１．２：０．６－１．２の間にあることがわかった。
５）スルホン酸根／カルボン酸根比率：結果から、各ＬＨＧサンプルのスルホン酸根／カルボン酸根比率は３．９－４．１と非常に近似され、ＬＨＧの一つの構成単位（ＧｌｃＡ（Ｆｕｃ）－ＧａｌＮＡｃ）に、約４．０個の硫酸根修飾が存在し、硫酸根含有量が高いことが示唆された。
６）比旋光度：結果により、各ＬＨＧサンプルは－４７°～－５５°で異なる。

実施例３：ＬＨＧ主鎖二糖単位の構造特徴の分析
本実施例は、実施例１で調製されるＬＨＧの主鎖二糖単位構造の特徴解析実験である。
従来の文献によると、天然由来ＨＧはグルクロン酸（ＧｌｃＡ）とＮ－アセチルエステルアミノガラクトース（ＧａｌＮＡｃ）が二糖の繰り返し単位のコンドロイチン硫酸（ＣＳ）主鎖と、硫酸化Ｆｕｃを分岐鎖とするグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）である。ＬＨＧは天然由来であるため、基本的な特徴は類似しているが、主鎖の二糖繰り返し単位（ｄｐ２）では、硫酸基やアセチルエステル置換の程度や部位の違いなどの原因により、様々な形を呈する。フコース基の分枝の存在のため、コンドロイチン硫酸酵素はＬＨＧのコンドロイチン硫酸主鎖を分解することができず、主鎖の二糖分析を完了することができない。本実施例では、まず弱酸加水分解によってフコース基の分岐鎖を段階的に除去した後、コンドロイチン硫酸分解酵素ＡＢＣを用いて残りの主鎖を完全に酵素分解し、二糖単位を放出した後、二糖分析を展開した。

１．実験材料：
試験化合物：ＬＨＧサンプル（バッチ番号：ＬＨＧ－Ｌ１８０５０１）実施例１由来。
試薬：８個のＣＳ二糖（ｄｐ２）標準品（貨物番号：Ｃ３２０２）は、北京エドハウック科学技術有限公司に購入された。コンドロイチン硫酸分解酵素ＡＢＣ（バッチ番号：１２０Ｍ４０９５Ｖ）は、Ｓｉｇｍａに購入された。その他の試薬はすべて分析純である。

２． 実験方法：
２．１ サンプル処理：
２．１．１ フコース基の分枝を酸で異なる程度で取り除く：
サンプル１９２．０ｍｇを正確に量り取り、１０００μＬのピペットガンで４．８ｍＬの０．１ＭのＨ_２ＳＯ_４を加え、４０ｍｇ／ｍＬのサンプル溶液に配置する。十分に溶解した後、サンプルを均等に６組に分け、それぞれをＳａｍｐｌｅ１、Ｓａｍｐｌｅ２、Ｓａｍｐｌｅ３、Ｓａｍｐｌｅ４、Ｓａｍｐｌｅ５、Ｓａｍｐｌｅ６と表記し、６組のサンプルを同時に１００℃のオイルバスに入れて分解する。Ｓａｍｐｌｅ１－６のオイルバスからの取り出し時間は、それぞれ０ｍｉｎ、３０ｍｉｎ、６０ｍｉｎ、９０ｍｉｎ、１２０ｍｉｎ、２４０ｍｉｎとする。各サンプルを取り出す後、室温まで放置した後、飽和Ｂａ（ＯＨ）_２溶液でｐＨ７．０に調整する。上記中性に調整したサンプルを遠心分離して沈殿を除去する。１／３の上澄み液を採取し、５００Ｄａの透過性バッグに移し、２４時間透析する。透析後、サンプルはそれぞれ重量を測った遠心チューブに移し、凍結乾燥し、保存する。
２．１．２ 酵素分解で得られた主鎖二糖：
上記凍結乾燥後の６組の酸分解後のサンプルを取り、５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ＝８．０）緩衝溶液を用いて、いずれも２０ｍｇ／ｍＬのサンプル溶液に配置する。溶解が完了する後、５０μＬずつ上記サンプル溶液を取り出してそれぞれ１ｍＬの遠心チューブに入れ、それぞれ０．２ＩＵ（０．１ＩＵ／１０μＬ）のコンドロイチン硫酸分解酵素ＡＢＣを加える。混ぜて密封し、３７℃の恒温水槽に入れて３６時間酵素分解する。Ａｇｉｌｅｎｔ １２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ液体クロマトグラフ試料分析を行った。酵素分解後のサンプルを、それぞれＳａｍｐｌｅ１－Ｍ、Ｓａｍｐｌｅ２－Ｍ、Ｓａｍｐｌｅ３－Ｍ、Ｓａｍｐｌｅ４－Ｍ、Ｓａｍｐｌｅ５－Ｍ、Ｓａｍｐｌｅ６－Ｍと記す。
２．２ ＳＡＸ－ＵＶ分析：
機械：Ａｇｉｌｅｎｔ １２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ液体クロマトグラフ。
カラム：Ｗｅｌｃｈ Ｕｌｔｉｍａｔｅ ＸＢ－ＳＡＸ（４．６×２５０ｍｍ、３．０μｍ）。
移動相Ａ：２．３３ｍＭのリン酸二水素ナトリウム二水和物、ｐＨ３．０（０．３６４ｇのリン酸二水素ナトリウム二水和物を精製水９５０ｍＬに定容し、溶液をリン酸でｐＨ３．０に調整した後、０．２２ μｍフィルターを通し、脱気して保存する）。
移動相Ｂ：１．１４３Ｍの過塩素酸ナトリウム一水和物、ｐＨ３．０（１６０．６０４４ｇの過塩素酸ナトリウム一水和物を９５０ｍＬの移動相Ａに溶解し、完全に溶解した後、移動相Ａで１Ｌまで定容し、溶液をリン酸でｐＨ３．０に調整した後、０．２２μｍフィルターを通過した後、脱気して保存する）。
流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ。
カラム温度：４５℃。
サンプル量：５μＬ。
検出波長：２３２ｎｍ。
溶出勾配：下記の表３に示す。

３．結果：
図１は、本発明の実施例３に係る主鎖二糖単位構造の特徴解析のＨＰＬＣ結果図であり、図１（Ａ）は二糖標準品の結果であり、図１（Ｂ）は、Ｓａｍｐｌｅ１－Ｍ、Ｓａｍｐｌｅ２－Ｍ、Ｓａｍｐｌｅ３－Ｍ、Ｓａｍｐｌｅ４－Ｍ、Ｓａｍｐｌｅ５－Ｍ及びＳａｍｐｌｅ６－Ｍの結果図である。
酵素分解後の二糖単位の４、５位に不飽和二重結合があり、２３２ｎｍ波長に特徴的な吸収があるため、検出には、強陰イオン交換クロマトグラフィーを用いて紫外検出器を直列に接続する方法（ＳＡＸ－ＵＶ、上記２．２の方法）を採用する。
まず、本実施例２．２に記載のＳＡＸ－ＵＶ法を用いて８つのＣＳ二糖標準品を分離し、この方法の実行可能性を確保した結果、図１（Ａ）に示すように、８つの標準品を効果的に分離することができ、ＰｅａｋＡ－Ｈは、それぞれΔＵＡ→ＧａｌＮＡｃ；ΔＵＡ→ＧａｌＮＡｃ、６Ｓ；ΔＵＡ→ＧａｌＮＡｃ、４Ｓ；ΔＵＡ、２Ｓ→ＧａｌＮＡｃ；ΔＵＡ、２Ｓ→ＧａｌＮＡｃ、６Ｓ；ΔＵＡ→ＧａｌＮＡｃ、４Ｓ、６Ｓ；ΔＵＡ、２Ｓ→ＧａｌＮＡｃ、４Ｓ；及びΔＵＡ、２Ｓ→ＧａｌＮＡｃ、４Ｓ、６Ｓ二糖と、の順に表す。

上記の酸分解の程度が異なる各サンプルは、同じ酵素分解の条件下で３６時間酵素分解した。酵素分解後のサンプルはＳＡＸ－ＵＶ検査で分析した。その結果、図１（Ｂ）に示すように、酸分解処理を行わなかったフコース基糖化コンドロイチン硫酸の酵素分解効果が低く、二糖（Ｓａｍｐｌｅ１－Ｍ）が検出されなかった。これはＦｕｃ分岐を含むＬＨＧを酵素が分解できないことを示している。酸分解時間が３０ｍｉｎ（Ｓａｍｐｌｅ２－Ｍ）の場合、酵素分解可能部分はＦｕｃ分岐のＬＨＧを除去して８種類のＣＳ二糖を産生するが、その含有量が相対的に少なく、酵素分解効率が悪いことを示している。酸分解時間が６０ｍｉｎの場合、酵素はＬＨＧ主鎖をよく分解して８種類のＣＳ二糖を産生し、各二糖の含有量は増加した（Ｓａｍｐｌｅ３－Ｍ）。酸分解時間が９０ｍｉｎ（Ｓａｍｐｌｅ４－Ｍ）の場合、全体の分解効率は６つのサンプルの中で最も高くなった。酸分解時間が１２０ｍｉｎ（Ｓａｍｐｌｅ５－Ｍ）と２４０ｍｉｎ（Ｓａｍｐｌｅ６－Ｍ）の場合、全体の分解効果が徐々に低下し始める。

また、各サンプルの前段階の操作と配合条件は完全に一致しているため、同じ測定条件を前提として、各ピーク面積の変化を分解効果の判断に用いることができる。

図２は、本発明の実施例３における各サンプルに含む二糖のピーク面積とピーク面積％のヒストグラムであり、図２（Ａ）は分解する二糖成分のピーク面積のヒストグラム、図２（Ｂ）はサンプル中の各二糖成分の含有率のヒストグラムである。図２（Ａ）及び図２（Ｂ）に示すように、各サンプルの棒グラフには８本の柱状が含まれており、この８本の柱状は左から順に、ΔＵＡ→ＧａｌＮＡｃ；ΔＵＡ→ＧａｌＮＡｃ、６Ｓ；ΔＵＡ→ＧａｌＮＡｃ、４Ｓ；ΔＵＡ、２Ｓ→ＧａｌＮＡｃ；ΔＵＡ、２Ｓ→ＧａｌＮＡｃ、６Ｓ；ΔＵＡ→ＧａｌＮＡｃ、４Ｓ、６Ｓ；ΔＵＡ、２Ｓ→ＧａｌＮＡｃ、４Ｓ；及びΔＵＡ、２Ｓ→ＧａｌＮＡｃ、４Ｓ、６Ｓを表している。

図２（Ａ）に示すように、分解された二糖成分の総量のみを評価すると、酸分解時間９０ｍｉｎが最適な分解点であると考えられる。

図２（Ｂ）に示すように、サンプル中の各二糖成分の含有率を分析した結果、サンプル中の各二糖成分の割合は徐々に変化しており、各二糖成分の変化傾向は全く同じではないことが分かった。非硫酸化二糖ΔＵＡ→ＧａｌＮＡｃと６－硫酸化二糖ΔＵＡ→ＧａｌＮＡｃ、６Ｓの含有量％が次第に多くなっている。４－硫酸化二糖ΔＵＡ→ＧａｌＮＡｃ、４Ｓの含有量％が高くなると低下し、酸分解時間９０ｍｉｎで最高になった。２－硫酸化二糖ΔＵＡ、２Ｓ→ＧａｌＮＡｃの含有量％は次第に低下し、酸分解時間１２０ｍｉｎの時点では、すでに検出できなくなった。二硫酸化二糖成分ΔＵＡ、２Ｓ→ＧａｌＮＡｃ、６Ｓ；ΔＵＡ→ＧａｌＮＡｃ、４Ｓ、６Ｓ；ΔＵＡ、２Ｓ→ＧａｌＮＡｃ、４Ｓ、及び三硫酸化二糖ΔＵＡ、２Ｓ→ＧａｌＮＡｃ、４Ｓ、６Ｓの含有量％は徐々に低下する。この結果によると、適切な酸分解は、フコース基の分岐鎖を脱落させ、主鎖二糖単位の酵素作用部位を露出させ、酵素の作用及び主鎖の分析に有利であり、酵素分解後のサンプル成分の含有量を増加させることができる。しかし、酵素分解成分中の低硫酸化二糖類の含有量が増加することから、酸分解時間が長すぎて分岐鎖が脱落するとともに、露出主鎖も酸分解されて硫酸根が脱落し、酸分解時間が長すぎると、ΔＵＡ、２Ｓ→ＧａｌＮＡｃ；ΔＵＡ、２Ｓ→ＧａｌＮＡｃ、６Ｓ；ΔＵＡ，２Ｓ→ＧａｌＮＡｃ，４Ｓ；及びΔＵＡ、２Ｓ→ＧａｌＮＡｃ、４Ｓ、６Ｓまで検出できず、二糖結果の測定と分析に影響を及ぼす。

４．結論と結論：
研究の結果、実施例１のＬＨＧサンプル（ＬＨＧ－Ｌ１８０５０１）では、主鎖二糖単位のタイプには、ΔＵＡ→ＧａｌＮＡｃ；ΔＵＡ→ＧａｌＮＡｃ、６Ｓ；ΔＵＡ→ＧａｌＮＡｃ、４Ｓ；ΔＵＡ、２Ｓ→ＧａｌＮＡｃ；ΔＵＡ、２Ｓ→ＧａｌＮＡｃ、６Ｓ；ΔＵＡ→ＧａｌＮＡｃ、４Ｓ、６Ｓ；ΔＵＡ、２Ｓ→ＧａｌＮＡｃ、４Ｓ；及びΔＵＡ、２Ｓ→ＧａｌＮＡｃ、４Ｓ、６Ｓと、つまり、８種類の一般的な二糖タイプが含まれている。二糖単位の組成比率は、ΔＵＡ→ＧａｌＮＡｃ；ΔＵＡ→ＧａｌＮＡｃ、６Ｓ；ΔＵＡ→ＧａｌＮＡｃ、４Ｓ；及びΔＵＡ→ＧａｌＮＡｃ、４Ｓ、６Ｓを主とし、いずれもコンドロイチン硫酸Ｅと類似する配置を呈する。

その中で、ＬＨＧ主鎖が持つΔＵＡ、２Ｓ（すなわち母鎖中のＧｌｃＡ２Ｓ）は、従来技術では報告されていない。異なる程度の酸分解－酵素分解分析によると、本バッチのＬＨＧサンプル中のＧｌｃＡ２Ｓの総ＧｌｃＡ中のパーセンテージは１０％－２５％の間にある。本実施例では、異なる酸分解の程度のサンプルを分析するところ、温和な酸分解はＬＨＧのフコース基分岐を除去し、酵素分解効率を高めることができるが、異なる硫酸化の程度のＦｕｃ－ＧａｌＮＡｃ；ＧｌｃＡ－ＧａｌＮＡｃ；ＧｌｃＡ－ＧａｌＮＡｃ－Ｆｕｃなどの断片の発生は、酸分解によってもＬＨＧ曝露の主鎖が分解され、この分解の程度は酸分解の時間が長くなるにつれて増加することを示している。

同様に、本発明者は、実施例１で得る他の数バッチのＬＨＧサンプル（ＬＨＧ－Ｌ１８０５０１、ＬＨＧ－１８１１０１、ＬＨＧ－１８１１０３、ＬＨＧ－１９０３０１及びＬＨＧ－１９０５０１を含む）について、同様の方法で酸分解、酵素分解及びＳＡＸ－ＵＶ分析を行い、実験を行った結果、各ＬＨＧサンプルの主鎖二糖は、バッチＬＨＧ－Ｌ１８０５０１に近く、いずれも、類似するΔＵＡ、２Ｓ（すなわちＧｌｃＡ２Ｓ）成分を含み、その含有量は１０％－３０％にあることが分かった。これらの構造の特徴は、ＬＨＧがコンドロイチン硫酸Ｅ類似物だけでなく、それに含まれるＧｌｃＡ２Ｓがコンドロイチン硫酸Ｄと類似する物配置特徴として現れることを示しており、この特徴はこれまで文献に報告されていない。

実施例４： ＬＨＧの核磁気共鳴水素スペクトル（^１Ｈ－ＮＭＲ）の分析
本実施例は、実施例１で調製するＬＨＧサンプルの^１Ｈ－ＮＭＲの分析実験であり、その構造的特徴を確認するために用いる。

被験化合物：ＬＨＧサンプル（バッチ番号：ＬＨＧ－Ｌ１８０５０１）、実施例１由来。
サンプルの調製：サンプルを３５ｍｇを取り、重水素水０．６ｍＬに溶解（内標準校正ゼロ点としてＴＳＰを０．００２％添加）し、溶液を５ｍｍの核磁気チューブに移し、超音波処理を２分間行う。
機械：ＮＭＲ Ｂｒｕｋｅｒ ＡＣ５００ＨＤ。
ソフトウェア：Ｂｒｕｋｅｒ Ｔｏｐ Ｓｐｉｎ３．２（Ｂｒｕｋｅｒ ＢＩＯｓｐｉｎ ＧｍｂＨ）。

結果：
図３は、本発明の実施例４にかかるＬＨＧの^１Ｈ－ＮＭＲスペクトル図であり、図３（Ａ）は全スペクトル図、図３（Ｂ）はＦｕｃの硫酸化修飾部分の拡大図である。

図３（Ａ）及び図３（Ｂ）に示すように、ＬＨＧサンプルは、１．４０ｐｐｍ、２．０８ｐｐｍ、３．６０ｐｐｍ及び５．３０－５．７０ｐｐｍに、フコース基残基Ｆｕｃの－ＣＨ３水素ピーク（メチルハイドロ）、Ｎ－アセチルエステルアミノガラクトース残基ＧａｌＮＡｃのアセチルエステル基にメチル基がある水素ピーク、グルクロン酸残基ＧｌｃＡのＨ２水素ピーク、およびフコース基残基Ｆｕｃの各硫酸化修飾成分のＨ１水素ピークがそれぞれ存在する。

以上のように、本発明で得られたＬＨＧサンプルの^１Ｈ－ＮＭＲスペクトルは、文献に報告されているフコース基グリコサミノグリカンと類似しており、コンドロイチン硫酸様主鎖のグルクロン酸－Ｎ－アセチルエステルアミノガラクトース（ＧｌｃＡ－ＧａｌＮＡｃ）にフコース基残基Ｆｕｃ修飾(Paulo AS.et al.,J.Biol.Chem.,1996,271:23973)が存在することが特徴である。

実施例５：ＮＭＲによるＬＨＧの構造特徴の分析
現代の核磁気共鳴技術、特に２次元核磁気共鳴（ＨＱＣ－ＮＭＲ）は、多糖類成分の構造情報を解析するために広く用いられてきた。ヘテロヘッドピークのシグナルだけでなく、糖鎖の環構造のシグナルも解析できます。本実施形態により提供されるのは、実施形態１で調製したＬＨＧの糖鎖の構造特性である。

試験化合物：実施例１で調製したＬＨＧ（バッチ番号はＬＨＧ－Ｌ１９０３０１）。
サンプルの調製：５ｍｇのＬＨＧを０．６ｍＬのＤ２Ｏに十分に溶解し（０．００２％ＴＳＰをＤ２Ｏに添加し、内部較正ゼロとして）、ＬＨＧのＤ２Ｏ溶液を得た。ＬＨＧのＤ２Ｏ溶液を５ｍｍＮＭＲチューブに移し、次いで超音波処理を２分間行った。別のサンプルも同様の方法で作製し、ＬＨＧの重量のみが１００ｍｇであった。
機械：ＮＭＲ Ｂｒｕｋｅｒ ＡＣ５００ＨＤ。
ソフトウェア：Ｂｒｕｋｅｒ Ｔｏｐ Ｓｐｉｎ３．２（Ｂｒｕｋｅｒ ＢＩＯｓｐｉｎ ＧｍｂＨ）。

結果：
図４は、本発明の実施例５に係るＬＨＧサンプルの頭出しＣＯＳＹとＴＣＯＳＹの重畳画像であり、図５は、本発明の実施例５に係るＬＨＧサンプルのＨＳＱＣ－ＣＯＳＹとＨＳＱＣ－ＴＯＣＳＹの重畳画像である。

図４～図５に示すように、ＬＨＧには、硫酸化修飾方式の異なる５種類のＦｕｃ残基があり、通常の２、４－ビス硫酸エステル（Ｆｕｃ２／４Ｓ）、２種類の３、４－ビス硫酸エステル（Ｆｕｃ３／４ＳとＦＵＣ’３／４ｓ）及び４－硫酸エステル（Ｆｕｃ４Ｓ）のほか、５．２８／１００．５ｐｐｍにもう一つの硫酸化修飾されたヘテロポリシグナルがある。この硫酸化修飾されたヘテロポリシグナルが４．２６／５２．３ｐｐｍに対応するＨ２／Ｃ２を有し（即ち、アセチルエステル化修飾と一致する）、この修飾グループはＦｕｃ２Ａｃ４Ｓに分けられる。また、ＧｌｃＡ残基の２－Ｏ位にも硫酸化修飾（ＧｌａＡ２Ｓ）が存在し、４．８５／１０４．３ｐｐｍの単体シグナルと４．４／８０．１ｐｐｍのＨ２／Ｃ２との相関性が証明できる。

以上の結果から、Ｆｕｃ残基の２－Ｏ位にアセチルエステル化修飾（Ｆｕｃ２Ａｃ）が存在し、同時にＧｌｃＡ残基の２－Ｏ位に硫酸化修飾（ＧｌｃＡ２Ｓ）が存在することが明らかになった。

図６は、本発明の実施例５にかかるＬＨＧサンプルの糖環残基区のＨＳＱＣマップの模式図である。

図６に示すように、ＬＨＧの他の特徴は、ＧａｌＮＡｃ残基の６－Ｏ位が部分硫酸化であることも含まれている（図６中の７０．３ｐｐｍのＣ６Ｓ（ＧａｌＮＡｃ６Ｓ）と６４．３ｐｐｍのＣ６ＯＨ（ＧａｌＮＡｃ）参照）。

また、ＨＳＱＣと１３Ｃ画像の積分を利用して、単糖組成におけるＬＨＧサンプルの割合を計算することができ、ＧｌｃＡ：ＧａｌＮＡｃ：Ｆｕｃは、モル比で、両スペクトルの計算結果は一致し、いずれも１：１：０．９の結果が出た。

各信号の帰属は図６、表４及び表５を参照する。

^１Ｈのシグナル積分によると、このＬＨＧサンプルのＧｌｃＡ２Ｓ修飾は全体のＧｌｃＡ残基の２０％を占め、これは前述の実施例３の酸分解酵素分解分析結果が１０％～３０％であることと一致する。Ｆｕｃ残基の修飾には様々な方式が存在し、その中でＦｕｃ２Ａｃ４Ｓはこのサンプルの２７％を占めている。

このように、本発明で得られたＬＨＧにはＧｌｃＡ２ＳとＦｕｃ２Ａｃの特徴が含まれており、これら２つの構造特徴はＨＧ又はＨＧ誘導体ではこれまで文献的に報告されていない。

実施例６：ＮＭＲ法による異なるバッチのＬＨＧの特徴と差異の分析

ＨＧ又はＨＧ誘導体のような、フコース化させたコンドロイチン硫酸類似物は、炎症、血栓形成、腫瘍転移などに重要な生物学的活性を有することが知られており、ＨＧは抽出又は部分化学処理によって得られるため、ＨＧの由来やバッチによって構造に差がある可能性がある。通常、分子構造上の修飾特徴はその生物学的機能と相関があるが、この関連性研究は非常に困難である。本実施例では、異なる由来又はバッチのＬＨＧの特徴と差異をＮＭＲ法で比較した結果を以下に示す。
被験化合物：
１）バッチ番号：ＬＨＧ－Ｌ１８０５０１、実施例１由来。
２）バッチ番号：ＬＨＧ－１８１１０１、実施例１由来。
３）バッチ番号：ＬＨＧ－１８１１０２、実施例１由来。
４）バッチ番号：ＬＨＧ－１８１１０３、実施例１由来。
後の３バッチは、4６００Ｋｇ連続投入バッチの試作品である。
機械：ＮＭＲ Ｂｒｕｋｅｒ ＡＣ５００ＨＤ（実施例５と同じ）。
ソフトウェア：Ｂｒｕｋｅｒ Ｔｏｐ Ｓｐｉｎ３．２（Ｂｒｕｋｅｒ ＢＩＯｓｐｉｎ ＧｍｂＨ）（実施例５と同じ）。
結果：
図７はこれらのバッチのＬＨＧサンプルの^１Ｈ－ＮＭＲ画像の比較イメージである。
図７に示すように、これらのバッチのＬＨＧサンプルの^１Ｈ－ＮＭＲスペクトルはほぼ完全に一致した（１．２ｐｐｍと３．６ｐｐｍは残留溶媒エタノール信号である）。図７では、Ｆｕｃ２、４Ｓ；Ｆｕｃ３、４Ｓ；Ｆｕｃ４Ｓ；Ｆｕｃ’３、４Ｓ；及びＦｕｃ２Ａｃ、４Ｓの５種類の主要なｆｕｃ残基の修飾タイプが識別できる。実施例４の表３に示す^１Ｈの化学シフトから、各Ｆｕｃ残基修飾成分の含有率を積分的に算出することができる。また、ＨＳＱＣ－ＮＭＲシグナル積分により、ＧｌｃＡ、特に２－Ｏ位硫酸化修飾したＧｌｃＡ２Ｓのパーセンテージが得られた。結果を表６に示す。

上記のバッチのＬＨＧサンプルにはいずれもＧｌｃＡ２Ｓ（割合は２０％から２５％である）とＦｕｃ２ＡＣ（Ｆｕｃ２ＡＣ、４Ｓ、割合は１３％～１９％である）が存在し、このような特徴を含むＨＧ又はＨＧ誘導体は、これまで文献に報告されていない。

実施例７：ＮＭＲ法によるＬＨＧサンプル中の異なる分子量成分の異同の分析
本実施例では、本発明者は、まずゲルパーミエーションクロマトグラフィーでＬＨＧサンプルを分離し、分子量の大小の異なる成分を収集して分離し、ＮＭＲ法で各成分の異同を調べた結果を以下に示す。
被験化合物：
１）バッチ番号：ＬＨＧ－１９０３０１、分子量９２００Ｄａ、分析番号はＧ１３６９２。
２）成分１、重量平均分子量２１４００Ｄａ、分析番号Ｇ１３６９２＿Ｆ１。
３）成分２、重量平均分子量６６００Ｄａ、分析番号Ｇ１３６９２＿Ｆ３。
４）成分３、重量平均分子量４３００Ｄａ、分析番号Ｇ１３６９２＿Ｆ５。
機械：ＮＭＲ Ｂｒｕｋｅｒ ＡＣ５００ＨＤ、実施例５と同じ。
ソフトウェア：Ｂｒｕｋｅｒ Ｔｏｐ Ｓｐｉｎ３．２（Ｂｒｕｋｅｒ ＢＩＯｓｐｉｎ ＧｍｂＨ）（同実施例５）。
結果：
図８は、このＬＨＧサンプルとその異なる分子量成分の^１Ｈ－ＮＭＲ画像の比較イメージである。その結果、分離された異なる分子量成分は、分離後の重量平均分子量の差は大きいが、その^１Ｈ－ＮＭＲスペクトルはほぼ完全に一致していることが分かった。もちろん、Ｆ３とＦ５成分はより良い分解能を示しているが、Ｆ１と出発材料の分解能がやや悪いのは、分子量の大きさと成分の分散度の違いが関係しているからである。同様に、申請者はこれらの成分のＨＳＱＣ－ＮＭＲ画像を同様に考察し、結果も一致した。
図８では、Ｆｕｃ２、４Ｓ；Ｆｕｃ３、４Ｓ；Ｆｕｃ４Ｓ；Ｆｕｃ’３、４Ｓ；及びＦｕｃ２Ａｃ、４Ｓの５種類の主要なＦｕｃ残基の修飾タイプが識別できる。実施例５中の表４に示す^１Ｈの化学シフトから、各Ｆｕｃ残基修飾成分の含有率を積分的に算出することができる。また、ＨＳＱＣ－ＮＭＲシグナル積分により、ＧｌｃＡ、特に２－Ｏ位硫酸化修飾したＧｌｃＡ２Ｓのパーセンテージが得られた。結果を表７に示す。

上記のＬＨＧサンプル中の異なる分子量成分は、Ｆｕｃ２Ａｃ修飾（Ｆｕｃ２Ａｃ、４Ｓ、比率１９％～２７％異なる）、及びＧｌｃＡ２Ｓ（比率１８％～２３％異なる）の含有量が一致しているが、このような構造が存在することは、前述のように、これまで文献では報告されていない。

実施例８：ＬＨＧの誘導血小板凝集活性分析

本実施例は本発明のＬＨＧの誘導血小板凝集活性の分析実験である。

ご存知のように、血小板機能亢進は心血管疾患、血栓疾患と腫瘍疾患などと密接に関連しており、これらの疾患の研究分野では血小板の作用がますます重視されており、臨床では多くの抗心血管疾患薬、抗血栓疾患薬、抗腫瘍疾患薬が使用されており、体外実験では血小板機能の凝集などの抑制作用が見られる。本実施例では、アラキドン酸（ＡＡ）によって誘導されるウサギ血小板凝集に対するＬＨＧの影響を考察した。

１．実験材料：
被験化合物：ＬＨＧ（ＬＨＧ－ｌ１８０５０１）上記実施例１。ＨＧ（純品ＨＧ、バッチ番号：ＨＧ－Ｌ１８０５０１、実施例１におけるＬＨＧ－Ｌ１８０５０１の調製過程で工程１で得るＨＧの残留サンプル）。
２．実験方法：
ウサギを頸動脈を通して放血し、珪酸化遠沈管で血液を採取した。３．８％クエン酸ナトリウムを抗凝固のために血液中に添加し、体積比は９：１である。次いで、混合物を室温で１０分間遠心分離し（８００ｒ／ｍｉｎ）、得られた上部流体は血小板リッチ血漿（ＰＲＰ）であった。残りの血液を室温（３０００ ｒ／ｍｉｎ）で１０分間遠心分離し、血小板不良血漿（ＰＰＰ）を基準として得るか、ＰＲＰの血小板数を調節した。実験では、ＰＲＰにおける血小板数は５０万～７０万であった。
ＬＨＧとＨＧの最終濃度はそれぞれ２．４μｇ／ｍＬ、１２μｇ／ｍＬ、６０μｇ／ｍＬ、３００μｇ／ｍＬであり、ＡＡ（最終濃度は６０μｍｏｌ／Ｌ）を誘導剤として血小板凝集実験を５回ずつ繰り返す。
血小板凝集の程度は比濁法で測定し、３回の測定の平均値をとる。
３．結果：
表８は本発明の実施例６のＬＨＧがＡＡ誘導ウサギ血小板凝集に及ぼす影響の結果である。
表８に示すように、対照群と比較して、ＬＨＧサンプル群は、３００μｇ／ｍＬ群で顕著にＡＡ誘導を促進するウサギ血小板凝集作用がある以外は、他の濃度群では顕著ではなかった。一方、未解重合のＨＧサンプル群では、濃度が最も低い２．４μｇ／ｍＬ群にはＡＡ誘導を促進するウサギ血小板凝集作用がないことを除いて、他の濃度にはいずれも顕著な作用があり、濃度が大きいほど凝集が強くなる。

備考：０μｇ／ｍＬと比較して、＊はＰ＜０．０５。＊はＰ＜０．０１を示します。

４．議論：
現在の文献によると、天然の大分子ＨＧは抗凝固作用を持っているが、この抗凝固機能は血小板の凝集を抑制するのではなく、逆に血小板の凝集を誘導し、凝集時に血小板は活性化と代謝を起こさず、ただ凝集状態にある血小板は本来の生理活性と機能を発揮できない。本実施例の研究結果（表８参照）によると、大分子のＨＧは血小板凝集を誘導する活性が強く、１２μｇ／ｍＬ以上の濃度では対照０μｇ／ｍＬと有意差があるのに対し、小分子のＬＨＧは対照０μｇ／ｍＬと統計学的に有意な差がないため、ＬＨＧを使用することでＨＩＴと類似した潜在的な病態の発生を大幅に解消でき、安全性がより高まる。

また、ＬＨＧは抗凝固作用が低く、このような弱い誘導血小板凝集活性を持っていても、凝集した血小板を活性化したり変形させたりすることはなく、一般的な血小板機能活性阻害剤とは異なる。そのため、ＬＨＧという血小板に対する活性調節作用は、心血管疾患、さらには抗腫瘍疾患の予防と治療に応用できる。

実施例９：マウスの耳介腫脹に対するＬＨＧの影響（抗炎症効果）の分析

本実施例ではキシレンによるマウスの耳介腫脹炎症実験モデルを用いてＬＨＧの抗炎症効果を考察した。

炎症とは、血管系を持つ生体組織がさまざまな炎症を引き起こす因子に対する防御反応であり、異質な成分に対する生体の免疫応答である。炎症の基本的な病理変化は変質、滲出と増殖を含み、臨床症状は局所的な赤、腫、熱、痛みと機能障害であり、発熱、白血球増加、単核マクロファージ系増殖などの全身反応がある。過度の炎症反応は生体を逆にむしばみ、二次病理損傷を引き起こす。また、炎症は関節リウマチ、喘息、神経炎など、多くの疾患の発生・発展に関与しており、近年ではII型糖尿病、神経退行性疾患、癌などと密接に関連していることも発見されている。よく知られているように、粘多糖類は一定の抗炎症作用を有することが多く、例えばヘパリンはセレクチンを抑制するなどの多くの方法で体内外で急性慢性炎症に作用することができ、ポリ硫酸ペントースナトリウムは現在臨床間質性膀胱炎の唯一の承認薬である。

１．実験材料：
試験化合物：ＬＨＧ（バッチ番号：ＬＨＧ－Ｌ１８０５０１）上記実施例１由来。
動物：マウス、１８－２３ｇ、雌雄各半。
２．実験方法：
薬物調製：ＬＨＧを脱イオン水で１００ｍｇ／ｍＬに調製する。陽性対照：デキサメタゾン、脱イオン水を５０ｍｇ／ｍＬに調製する。ブランク・対照：水。
投与方式：皮下注射。
実験過程：健康マウス１８匹を採取し、ランダムに３グループに分けて各６匹の雌雄は半分ずつで、それぞれＬＨＧ薬物グループ、陽性対照グループと空白対照グループとした。上記で調製した薬物溶液を、マウス体重０．０１ ｍＬ／１ｇの量で注射投与し、５日間連続投与した。最終投与後３０ ｍｉｎ後、キシレン３０Ｌを取ってマウスの右耳の両面に均一に塗布して炎症を起こし、左耳を対照とし、炎症を起こした後１時間で頸椎を外してマウスを処分し、パンチャーで左右耳の同じ部位の耳片を外し、天秤重量を分析し、耳介腫脹率及び耳介腫脹抑制率を算出した。

３．実験結果：
表９は、本発明の実施例９のＬＨＧによるキシレンによるマウスの耳介腫脹の抑制の結果である。

備考：空白対照群と比較して、＊はＰ＜０．０５を示す。
表９に示すように、キシレンによるマウスの耳介腫脹１時間後、ＬＨＧ薬物群のマウスの耳介腫脹度は低下し、陽性対照群（デキサメタゾン）と類似し、いずれも空白対照群との差異が顕著である（Ｐ＜０．０５）ことから、ＬＨＧはキシレンによるマウスの耳介腫脹炎症反応を効果的に抑制できることが示唆された。潜在的に、ＬＨＧは炎症関連疾患の治療に応用できる。

実施例１０：ストレプトゾトシンによるマウス糖尿病モデルの血管病変に対するＬＨＧの改善作用

本実施例は主に糖尿病モデルマウスの血管病変に対するＬＨＧの改善作用を考察する。
血管病変系疾患、特に糖尿病患者の血管病変は発病率が高く、患者の健康と生活の質に深刻な危害を及ぼすことが糖尿病患者の障害と死亡の第一の原因である。粘多糖類は、血管病変の予防と治療に一定の作用があることが知られている。

１．実験材料：
被験化合物：ＬＨＧ（ＬＨＧ－ｌ１８０５０１）上記実施例１と同様。
比較化合物：ｄＨＧ１００９２、解重合ナマコ由来グリコサミノグリカン、本出願人の発明特許ＣＮ２０１５１０４３８１３９．９に係る実施例２に記載されているもの。
被験動物：ＳＤマウス、２５０ｇ±５０ｇ、オス。
２．実験方法：
薬物の調製：ＬＨＧ又はｄＨＧ１００９２を脱イオン水で１００ｍｇ／ｍＬの溶液を調製し、固形分として３０ｍｇ／Ｋｇで投与する。
投与方式：灌胃法。
飼料成分：（１）普通飼料：脂肪５％、炭水化物５５％、タンパク質２３％、セルロース及び灰分を含むその他の成分は１７％。（２）高脂肪飼料成分：脂肪５０％、炭水化物１７％、タンパク質２５％、セルロースおよび灰分を含むその他の成分は８％を占めている。
モデリングとグループ分け：６匹の空白対照グループのマウスに普通飼料を与え、残りの２４匹のマウスに高脂肪飼料を与え、４週間後にストレプトゾトシン(Streptozotocin、STZ 35mg/Kg)を一度に注射し、１週間後に１２時間断食したマウスの尾静脈血を採取し、血糖値を血糖計で測定し、空腹時血糖≧１６．７ｍｍｏｌ／Ｌを糖尿病グループのマウスのモデリング成功の指標とする。モデリングに成功したマウスをランダムにモデル対照群、ＬＨＧ薬物群及びｄＨＧ１００９２薬物群に分け、各群ごとに６匹とし、その後、ＬＨＧ薬物群及びｄＨＧ１００９２薬物群は毎日胃内投与を行い、１２週間連続で投与した。
サンプル調製及び採取：ＬＨＧ及びｄＨＧ１００９２薬物干渉１２週間後、マウス麻酔固定、採血、遠心分離で上清を取り、血管細胞間接着分子－１（ＶＣＡＭ－１）、細胞間接着分子－１（ＩＣＡＭ－１）、一酸化窒素（ＮＯ）の検出に用いる。また、大動脈壁を取り、冷凍保存する。
マウス大動脈終末糖化産物（ＡＧＥｓ）、終末糖化産物受容体（ＲＡＧＥ）の含有量の測定：約５０ｍｇを取り一定の重量までに乾燥させた大動脈組織と呼び、ＥＬＩＳＡ法によりＡＧＥｓとＲＡＧＥの含有量を測定する。

３．実験結果：
糖尿病およびモデルでは、ＡＧＥｓの生成は、蛋白質が架橋高分子を形成し、血管内皮細胞を損傷し、内皮細胞のアポトーシスを引き起こし、大動脈コンプライアンスが低下する。ＡＧＥｓは受容体と結合し、ＩＣＡＭ－１、ＶＣＡＭ－１などの発現を増加させ、多種のサイトカインを活性化し、血管病変の発生に関与する。血液中のＮＯ含有量の増加は血管の透過性増大と密接な関繋があり、ＮＯ含有量を下げることは、血管内皮細胞を効果的に保護し、血管の病変を減少させることができる。
糖尿病モデルマウスの血管病変に対するＬＨＧの改善作用、各終末指標の測定結果を表１０に示す。

備考：モデル対照群と比較して、＊はＰ＜０．０５を表し、＊＊はＰ＜０．０１を表す。

表１０から明らかなように、正常空白対照群に対して、モデル対照群のマウスはモデリング後、一つは腹部大動脈ＡＧＥｓとＲＡＧＥの含有量が上昇し、かつ有意差がある（Ｐ＜０．０１）ことは、モデルマウスの腹部大動脈ＡＧＥｓ－ＲＡＧＥ系統が顕著に活性化されていることを示す。２つ目は血清中のＩＣＡＭ－１とＶＣＡＭ－１の含有量が上昇し、同様に顕著な差異があることであり、モデルマウスＩＣＡＭ－１とＶＣＡＭ－１システムが顕著に活性化され、発現していることを示している。３つ目は血清中のＮＯ含有量が上昇し、かつ顕著な差異がある（Ｐ＜０．０１）。

一方、ＬＨＧ薬物グループはモデル対照グループと比べて、経口投与による介入後、一つは大動脈ＡＧＥｓとＲＡＧＥの含有量が明らかに低下したことであり、（Ｐ＜０．０１）は、ＬＨＧがモデルマウス腹部大動脈ＡＧＥｓ－ＲＡＧＥ系の活性化を効果的に抑制できることを示している。２つ目は血清中のＩＣＡＭ－１とＶＣＡＭ－１の含有量が同様に明らかに低下していることであり、ＬＨＧはモデルマウスＩＣＡＭ－１とＶＣＡＭ－１系統の活性化と発現を効果的に抑制できることを示している。３つ目は血清中のＮＯ含有量が明らかに低下していることであり、ＬＨＧはモデルマウスの血清ＮＯ含有量を効果的に低減できることを示している。また、ｄＨＧ１００９２薬物群とＬＨＧ薬物群を比較すると、ＬＨＧ薬物群はｄＨＧ１００９２薬物群より血管病変を改善する作用が強いことがわかった。

また、各グループのマウス大動脈血管に対して染色と病理学的検査を行った結果、モデルグループの大動脈血管壁は明らかに厚くなり、内膜は不完全で、内皮細胞は脱落状況があり、血管平滑筋細胞は肥大、ねじれ、配列乱れ、階数増加、細胞核の大きさが異なる、細胞膜と核膜が不明瞭で、細胞漿の染色が不均一で、大量の泡細胞とマクロファージが見られる。一方、ＬＨＧ薬物グループのマウス大動脈病変の状況はモデルグループより明らかに軽減され、平滑筋細胞の配列と細胞核の性状は明らかに好転し、内皮下に少量の泡沫細胞が見られ、内皮細胞は軽微に腫れ、内膜平滑筋細胞の増殖は明らかではなかった。

要するに、ＬＨＧはモデルマウス腹部大動脈ＡＧＥｓ－ＲＡＧＥ系の活性化を抑制し、モデルマウス血清ＶＣＡＭ－１、ＩＣＡＭ－１含有量、ＮＯ含有量を低減し、マウス大動脈病変を軽減し、作用効果はｄＨＧ１００９２より強い。潜在的に、ＬＨＧは血管病変関連疾患の予防と治療に応用でき、その薬効はｄＨＧ１００９２より強い。

実施例１１：ＬＨＧによるマウス体内のＳＵＩＴ２－ＬＵＣ（ヒト膵臓癌細胞）肺転移抑制実験

天然由来ＨＧや低分子ヘパリンなどの硫酸化多糖類は腫瘍の生産と転移を抑制し、多種の腫瘍の発生を抑制することが知られている。本実施例では、マウスの膵臓癌肺転移モデルを用いて、ＬＨＧを考察し、本出願人の発明特許第ＣＮ２０１５１０４３８１３９．９号に記載されているｄＨＧと低分子ヘパリン製品の抗腫瘍又は腫瘍転移抑制への作用を比較した。

１．実験材料
試験化合物：実施例１に記載の方法で調製するＬＨＧ（サンプルバッチ番号：ＬＨＧ－Ｌ１８０５０１、分子量７２００Ｄａ）。
比較化合物１：ｄＨＧ１００９２、解重合ナマコ由来グリコサミノグリカン、本出願人の発明特許第ＣＮ２０１５１０４３８１３９．９号に実施例２記載。
比較化合物２：ヘパリンナトリウム、市販の低分子ヘパリン製剤で、中国での商品名は「法安明」である。
細胞：蛍光標識したＳＵＩＴ２細胞（ＳＵＩＴ２－ＬＵＣ）ヒト膵臓癌細胞）。
動物：Ａｔｈｙｍｉｃ無毛マウス、メス。
機械：小動物生体画像形成システム(IVIS imaging system，Caliper Life Sciences,Hopkinton,MA,USA)。
２．実験方法
２．１グループと投与量：ＬＨＧ投与グループ（ＬＨＧ－ｌ１８０５０１、３０ｍｇ／ｋｇ）。対照ｄＨＧグループ（ＤＨＧ１００９２、３０ｍｇ／ｋｇ）。ヘパリンナトリウム組（市販の注射剤、１０ｍｇ／Ｋｇ）。陰性対照：ＰＢＳ緩衝液。
２．２投与方式：皮下注射、単回投与。
２．３細胞注射と動物管理：投与と同時に、ＳＵＩＴ２－ＬＵＣヒト膵臓癌細胞１００μＬ、１×１０^６細胞）を注射し、マウスに２週間給餌する。
２．４ＩＶＩＳ画像：細胞注射後と２週間給餌後に別々に画像を撮影して観察する。
２．５試験の終点で組織病理学検査を行う。

３．結果：
図９は本発明の実施例１１のＬＨＧ対マウス体内ＳＵＩＴ２－ＬＵＣ（ヒト膵臓癌細胞）肺転移抑制実験結果であり、図９（Ａ）は体重変化折れ線グラフであり、図９（Ｂ）は腫瘍の体積変化折れ線グラフであり、図９（Ｃ）は腫瘍の重ヒストグラムであり、図９（Ｄ）は蛍光信号強度のヒストグラムであり、図９（Ｅ）は各グループのマウスと腫瘍のＩＶＩＳ画像であり、図９（Ｆ）は各グループの肺と腫瘍のＩＶＩＳ画像である。また、図９において、各実験群は、対照＝ＰＢＳ緩衝液、ｄＨＧ１００９２＝対照ｄＨＧ群３０ｍｇ／Ｋｇ、ＬＨＧ－Ｌ１８０５０１＝ＬＨＧ投与群３０ｍｇ／Ｋｇ、ヘパリンナトリウム＝対照ヘパリンナトリウム群１０ｍｇ／Ｋｇである。

図９に示すように、対照群のマウスは、腫瘍細胞の転移と拡大のため、体重（Ａ）はあまり変化しないが、腫瘍体積（Ｂ）の増加は非常に顕著である。一方、ＬＨＧ投与群（ＬＨＧ－Ｌ１８０５０１）、対照ＤＨＧ群（ＤＨＧ１００９２）と対照ヘパリンナトリウム群では、マウスの体重（Ａ）はやや増加し、造型後の肺部腫瘍の体積（Ｂ）、終点時の腫瘍の重さ（Ｃ）及び蛍光シグナル強度（Ｄ）は、いずれも顕著な低下を示し、すべての投与群は対照群に対して統計学的P値が０．００１未満であった。また、生体マウス、肺、腫瘍のＩＶＩＳ画像は図９にＥとＦで示すように、対照群の腫瘍細胞の蛍光シグナルより強く、各投与群の蛍光シグナルはいずれも顕著に低下しており、腫瘍細胞がよく抑制又は死滅したことを示している。以上の結果から、ＬＨＧ（ＬＨＧ－Ｌ１８０５０１）およびＤＨＧ（ＤＨＧ１００９２）とヘパリンナトリウムの３種類の硫酸化多糖は、いずれもマウス体内の膵臓癌細胞の肺転移を顕著に抑制し、抗腫瘍又は抗腫瘍転移作用を有することが示唆された。

また、ＬＨＧ投与群（ＬＨＧ－Ｌ１８０５０１）は、ＤＨＧ対照群とヘパリンナトリウム対照群に比べて、肺部腫瘍体積（Ｂ）、終点時の腫瘍重さ（Ｃ）と蛍光シグナル強度（Ｄ）で有意な低下を示し、Ｐ＜０．００１又はＰ＜０．０５。同様に、図９（Ｅ）～（Ｆ）に示した生体マウス、肺と腫瘍のＩＶＩＳ画像によると、ＬＨＧ投与群（ＬＨＧ－Ｌ１８０５０１）の蛍光腫瘍シグナルはほぼ完全に消失し、対照ｄＨＧ群（ｄＨＧ１００９２）と対照ｄＨＧヘパリンナトリウム群より顕著に優れている。この結果、ＬＨＧはマウス体内の膵臓癌細胞の肺転移を抑制する作用がｄＨＧやヘパリンナトリウムより強く、潜在的に腫瘍や腫瘍転移に関連する疾患の予防と治療に応用できることがわかった。

実施例１２：スコポラミン・モデル・マウスの学習記憶に対するＬＨＧの影響

本実施例は主にＬＨＧスコポラミン型マウスの学習記憶能力の改善作用について考察する。
スコポラミンは中枢神経系阻害剤であり、スコポラミンを注射したマウスの学習・記憶能力が低下し、空間認知能力が低下するが、興奮性は異常に増強され、行為は老年性痴呆患者の早期臨床症状に符合するため、老年性痴呆の動物モデルとしてよく研究されている。

１．実験材料：
試験化合物：ＬＨＧ（バッチ番号：ＬＨＧ－Ｌ１８０５０１）上記実施例１由来。
被験動物：ＳＤマウス、２５０ｇ±５０ｇ、オス。
２．実験方法：
グループ化と投与量：正常対照グループ。スコポラミン・モデル群（ＳＣＯＰモデル群。陽性対照群（ドネペジル、１ｍｇ／Ｋｇ）。ＬＨＧ薬物グループ（３０ｍｇ／Ｋｇ）。
投与方式：灌胃法。
実験前に２週間連続投与し、正常対照群とモデル群にそれぞれ同等体積の蒸留水を投与し、９日目にＭｏｒｒｉｓ訓練を行い、２回／日とした。１４日目にＭｏｒｒｉｓ水迷路とジャンプ台のテストを行った。
モデリング方法と学習記憶テスト：実験当日、マウスに胃内投与３０ｍｉｎ後、臭化水素酸スコポラミンを腹腔内投与（２ｍｇ／Ｋｇ連続２日後、３日目に２ｍｇ／Ｋｇに変更）２０ ｍｉｎ後にＭｏｒｒｉｓ水迷路テストを行い、正常対照グループは同量の生理食塩水を腹腔内投与した。カメラでマウスの遊泳成績を追跡し、コンピュータは自動的にマウスの９０ｓ以内の行程、時間と運動速度を記録し、プラットフォームに辿り着くまでの遊泳時間と遊泳距離を算出した。
ジャンプ台試験：１日目に訓練を学び、２日目にテストを繰り返し、テスト前の２０ｍｉｎマウスに臭化水素酸スコポラミン（５ｍｇ／Ｋｇ）を一度に腹腔内投与し、マウスが初めてプラットフォームから飛び降りた遊泳時間（ＳＤＬ）、電撃から逃れる遊泳時間（ＥＬ）を記録する。

３．実験結果：
（１）スコポラミンによる記憶障害モデルマウスＭｏｒｒｉｓ水迷路実験へのＬＨＧの影響
表１１はスコポラミンによる記憶障害モデルマウスＭｏｒｒｉｓの水迷路実験に対するＬＨＧの影響結果である。

備考：ＳＣＯＰモデル群と比較して、＊はＰ＜０．０５を表し、＊＊はＰ＜０．０１を表す。

表１１に示すように、Ｍｏｒｒｉｓ水迷路実験では、ＬＨＧ薬物群はスコポラミンによる記憶障害モデルマウスに対して明らかに改善され、遊泳時間と遊泳距離のいずれからも明らかに短縮され、ＳＣＯＰモデル群に比べてｐ値＜０．０５であり、しかもＬＨＧ薬物群の改善状況は陽性薬物（ドネペジル）群と同等であった。

（２）スコポラミンによる記憶障害モデルマウスのジャンプ実験に対するＬＨＧの影響
表１２はスコポラミンによる記憶障害モデルマウスのジャンプ実験に対するＬＨＧの影響結果である。

備考：ＳＣＯＰモデル群と比較して、＊はＰ＜０．０５を表す。

表１２に示すように、マウスジャンプ試験において、ＬＨＧ薬物群はスコポラミンによる記憶障害モデルマウスに対して明らかに改善され、マウスの平均１回目のプラットフォームジャンプの潜伏期は明らかに延長されたが、電撃から逃れる潜伏期は明らかに短縮され、ＳＣＯＰモデル群と比較して、ｐ値＜０．０１であり、ＬＨＧ薬物群の改善状況は陽性薬物（ドネペジル）群よりかなり或いは優れている。

以上の結果から、ＬＨＧはスコポラミン型マウスの学習記憶能力に改善作用があり、潜在的に臨床アルツハイマー病関連疾患の治療に使用できることが示された。

実施例の作用と効果

実施例２から実施例７の結果から、本発明のＬＨＧは分子構造において、ＨＧ誘導体の主鎖、分岐鎖、糖単位構造の特徴を残すほか、二つの独特な特徴が存在する。一つは主鎖のＧｌｃＡの２－位に硫酸エステル修飾（ＧｌｃＡ２Ｓ、割合１０％～３０％）が存在すること、もう一つは、分岐鎖のＦｕｃの２－位にアセチルエステル修飾（Ｆｕｃ２Ａｃ、割合１０％～３０％）が存在することであり、この二つの構造的特徴は、これまで報告されていない。

実施例２と実施例８の結果から、ＬＨＧは抗凝固活性が低く、抗凝固因子Ｘａの活性を持たず、血小板凝集を誘導する活性が弱いため、応用安全性が高いことが分かる。この結果は、本発明のＬＨＧが心血管疾患、さらには抗腫瘍疾患の予防と治療に応用できる可能性があることを示している。

実施例９の結果から明らかなように、本発明のＬＨＧはキシレンで耳介が腫れたマウスに作用した場合、耳介の腫れ度を著しく低下させることができ、抗炎症効果がデキサメタゾンよりも高く、炎症の予防又は治療に使用できる可能性があることが示唆された。

実施例１０の結果から、本発明のＬＨＧはストレプトゾトシンによる糖尿病モデルマウスの血管病変に作用した場合、ＡＧＥｓ－ＲＡＧＥ系の活性化を抑制し、血清中のＶＣＡＭ－１、ＩＣＡＭ－１とＮＯ含有量を低減し、大動脈病変を軽減し、かつ血管病変の改善作用がｄＨＧより明らかに優れていることがわかり、本発明のＬＨＧは血管病変関連疾患の予防と治療に応用できる可能性があることが示唆された。

実施例１１の結果から、本発明のＬＨＧは膵臓癌肺転移モデルマウスに作用した場合、転移後の癌細胞を顕著に抑制又は死滅させることができ、抗腫瘍又は抗腫瘍転移作用はｄＨＧやヘパリンナトリウムより優れており、本発明のＬＨＧは腫瘍又は腫瘍転移に関連する疾患の予防と治療に応用できる可能性があることが示唆された。

実施例１２の結果から明らかなように、本発明のＬＨＧはスコポラミン型マウスに作用した場合、マウスの学習記憶能力を著しく改善することができ、ドネペジルと同等又はそれ以上の効果があり、本発明のＬＨＧはアルツハイマー病関連疾患の予防又は治療に使用される潜在力があることが示唆された。

また、実施例１から明らかなように、本発明のＬＨＧの調製方法では、まずプロテアーゼ酵素でナマコを分解して均一にスラリーから放出されたＨＧをアニオン性樹脂で直接吸着・交換溶出するが、これは対象物のＨＧが高度に硫酸化修飾されて持っている強い負電荷の特徴に基づいており、通常のマイナス電荷の少ないタンパク質、脂肪、核酸などの不純物と分離でき、かつ溶出塩の濃度を変えることで精製の目的を達成することができる。このようなイオン交換樹脂を用いた一段階抽出技術は極めて簡便かつ効率的であり、現在は報告されていない。次に、その後、ＬＨＧを調製する解重合段階で、本発明は酢酸／過酸化水素水系で触媒分解を行い、ＨＰＬＣで分子量を対照して反応過程を監視することで、分子量が１００００Ｄａ以下の低分子ＬＨＧを正確に調製することができ、さらに任意の分子量の大きさのＬＨＧをカスタマイズすることもでき、方法は科学的に信頼できる。また、複数バッチの大量のＬＨＧの調製は収率に大きな差はなく、いずれも０．６％～０．８％である。本発明の原料はナマコ以外の低食用価値ナマコを選択することができ、安価で生産量が多く、購入が容易である。ＬＨＧを抽出して調製するほか、ナマコ蛋白、ナマコ多ペプチドとナマコサポニンなどの高価な副産物の共同生産に併用することもでき、経済的価値が大きい。

要するに、本発明のＬＨＧは血小板活性、抗炎症、抗血管病変、抗腫瘍又は抗腫瘍転移を調節し、学習記憶能力を改善する作用があるので、ＬＨＧを活性物質として薬学的又は健康食品業界で受け入れられる担体を用いて、炎症、血管病変、腫瘍、老年痴呆などの関連疾患の予防と治療に用いられる薬物又は健康食品組成物を調製することができる。

なお、以上の説明は、本発明の好ましい実施例に過ぎず、本発明の範囲は、上記実施例の説明範囲に限定されるものではなく、本発明の原理を逸脱することなく、当業者にとっていくつかの改良およびレタッチが可能であり、これらの改良およびレタッチも本発明の範囲とみなすべきである。

Claims (6)

1. 以下のような構造式を有し、
   
   

   

   構成単位は、グルクロン酸基、Ｎ－アセチルエステルアミノガラクトース基、フコース基及びそれらの硫酸エステルナトリウム又はアセチルエステル又はナトリウムであり、
   前記グルクロン酸及び前記Ｎ－アセチルエステルアミノガラクトース基は、β（１－３）及びβ（１－４）グルコシド結合によって交互に連結して二糖繰り返し構造単位の主鎖を形成し、
   前記フコース基は、側鎖として前記主鎖に連結し、
   モル比で、グルクロン酸基：Ｎ－アセチルエステルアミノガラクトース基：フコース基＝１：（０．８～１．２）：（０．６～１．２）であり、
   前記構造式では、
   ｎ＝１～３２であり、
   －Ｒ１、－Ｒ２、－Ｒ４、－Ｒ６は、いずれも水酸基又は硫酸エステルナトリウムであり、
   －Ｒ３のうち、１０％～３０％は、硫酸エステルナトリウムであり、残りは水酸基であり、
   －Ｒ５のうち、１０％～３０％は、アセチルエステルであり、残りは水酸基又は硫酸エステルナトリウムであることを特徴とする低分子ナマコ由来グリコサミノグリカン。
2. 請求項１に記載の構造をし、ナトリウムが、対応するカリウム、又はカルシウム、又はリチウム、又は亜鉛に置き換えることを特徴とする低分子ナマコ由来グリコサミノグリカンのカリウム塩、又はカルシウム塩、又はリチウム塩、又は亜鉛塩の形式。
3. 請求項１又は２に記載の低分子ナマコ由来グリコサミノグリカンを用いて炎症を予防又は治療するための薬物又は健康食品を調製することを特徴とする応用。
4. 請求項１又は２に記載の低分子ナマコ由来グリコサミノグリカンを用いて血管病変に関連する疾患を予防又は治療するための薬物又は健康食品を調製することを特徴とする応用。
5. 請求項１又は２に記載の低分子ナマコ由来グリコサミノグリカンを用いて腫瘍関連疾患を予防又は治療するための薬物又は健康食品を調製することを特徴とする応用。
6. 請求項１又は２に記載の低分子ナマコ由来グリコサミノグリカンを用いてアルツハイマー病を予防又は治療するための薬物又は健康食品を調製することを特徴とする応用。

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