JP2022512131A - 機能化酵素駆動ナノモーター - Google Patents

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オルドニェス，サミュエル サンチェス
パディアル， タニア パティーニョ
オルテラオ，アナ カンディダ ロペス
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ファンダシオ インスティトゥト デ ビオエンジニエリア デ カタルーニャ
インスティトゥーシオ カタラーナ デ レセルカ イ エストゥディス アバンサッツ
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Abstract

本発明は、表面を有する粒子と、酵素と、異種分子と、を含み、酵素および異種分子が、粒子の表面全体にかけて不連続に付着していることを特徴とする、酵素駆動ナノモーターを提供する。本発明はまた、特に、癌の治療のための、療法、診断、および予後における使用のためのナノモーターを提供する。加えて、本発明は、単離された試料中の分析物を検出するためのナノモーターの使用を提供する。【選択図】図５

Description

本出願は、２０１８年１２月５日に提出された欧州特許出願第ＥＰ１８３８２８９６号の利益を主張する。
本発明は、ナノテクノロジーの分野に属する。具体的には、本発明は、外部機能化された酵素駆動ナノモーターに関する。本発明のナノモーターは、療法およびバイオセンシングに特に有用である。
触媒マイクロスイマーは、化学的なエネルギーの、最終的には能動的運動に変換する機械的な力への変換のために、自己推進することができる人工システムである。
化学駆動マイクロおよびナノモーターは、環境修復、カーゴ輸送および送達、組織および細胞透過、ならびにインビボでの胃への能動的薬物送達などの多くの分野で有望な適用性を示しているが、生物医学におけるそれらの実装は、多くの場合、燃料の固有の毒性または生物内でのその限定された利用可能性のいずれかによって制限される。
最近、酵素触媒作用の使用は、生体適合性、汎用性、および燃料バイオアベイラビリティを含む独自の特徴を提供するため、一般的に使用される毒性燃料を置き換える魅力的な代替として浮上している。これに関して、ウレアーゼ、カタラーゼ、およびグルコースオキシダーゼの使用は、酵素基質の生理学的に適切な濃度でナノサイズの粒子の拡散を増加させることが示されている。
加えて、中空シリカヤヌス粒子、すなわち、それらの一方のみが酵素に結合する２つの半球体を有する粒子を駆動するためにウレアーゼを使用する場合、指向性推進を達成することができる。それらの運動は、酵素阻害塩の添加によってオンとオフとを切り替えることができ、軌道は、磁場の適用によってオンデマンドで変更することができ、高度の制御性を可能にする（Ｘｉｎｇ ＭＡ ｅｔ ａｌ．，“Ｍｏｔｉｏｎ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｕｒｅａ－Ｐｏｗｅｒｅｄ Ｂｉｏｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ Ｈｏｌｌｏｗ Ｍｉｃｒｏｃａｐｓｕｌｅｓ”，ＡＣＳ Ｎａｎｏ．，２０１６，ｖｏｌ．１０（３），ｐｐ．３５９７－６０５）。
インビトロでの癌細胞へのドキソルビシンの送達効率を増加させるための酵素推進ナノモーターの使用についても記載されている（Ａｎａ Ｃ．ｅｔ ａｌ．，“Ｅｎｚｙｍｅ－Ｐｏｗｅｒｅｄ Ｎａｎｏｂｏｔｓ Ｅｎｈａｎｃｅ Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ”，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，２０１７，ｖｏｌ．２８（２５））。
しかしながら、球形ヤヌス粒子の生成は、スケーラビリティおよび、したがって、それらの適用性を損ない得る、費用および時間のかかる技法を伴う。
より最近では、触媒の非対称構造および分布が、能動的運動の生成に不可欠であると伝統的に主張されてきたという事実にもかかわらず、粒子表面全体にかけて位置する酵素触媒作用によって駆動される非ヤヌス球形モーターの自己推進が示された（Ｐａｔｉｎｏ Ｔ．ｅｔ ａｌ．，“Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｅ Ｑｕａｎｔｉｔｙ ａｎｄ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｎ ｔｈｅ Ｓｅｌｆ－Ｐｒｏｐｕｌｓｉｏｎ ｏｆ Ｎｏｎ－Ｊａｎｕｓ Ｕｒｅａｓｅ－Ｐｏｗｅｒｅｄ Ｍｉｃｒｏｍｏｔｏｒｓ”，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２０１８，ｖｏｌ．１４０（２５），ｐｐ．７８９６－７９０３）。しかしながら、このタイプのナノモーターの移動は、酵素被覆率に非常に感受性であることが示された。実際、望ましい移動を達成するには、ナノモーターあたり多数の酵素分子が必要であることが見出された。これは、外部機能化に課せられる制限のために、これらのナノモーターの使用および適用性を強く妨げている。
したがって、これまでの努力にもかかわらず、高い移動能力を維持しながら、製造すること、および様々な用途に適応することが容易である酵素駆動ナノモーターが依然として必要とされている。
本発明者らは、様々な生物医学的、化学的、および環境的用途において有用である、新規の酵素推進機能化ナノモーターを開発した。
驚くべきことに、発明者らは、酵素駆動非ヤヌスナノモーターに分子を外部付着させることによって、粒子の速度および移動パターンを維持またはさらに増加させることができることを見出した（図２Ｄおよび図７Ｂを参照されたい）。
推進酵素が粒子の表面全体にかけて付着しているナノモーターは、酵素被覆率に大きく依存する移動を有することが以前に示されたので、これは非常に予想外であった。したがって、酵素の数が所定の閾値を下回る場合、粒子の移動が完全に消失したことが示された（Ｐａｔｉｎｏ Ｔ．ｅｔ ａｌ．、上記）。よって、これらの粒子の表面上で行われ、必然的に酵素付着に利用可能な表面を低減する、任意の修飾が、ナノモーター移動能力、およびしたがってその適用性を低減すると予想されることは明らかであった。
以下の実施例に示されるように、本発明者らは、抗体またはＤＮＡ構造などの異なるタイプの多量の分子の外部付着が、ナノモーターの移動に影響を与えないだけでなく、それらの細胞透過能力、安定性も増加させ、それらの凝集を回避することを見出した。図４は、あらゆる細胞透過ペプチドを欠くにもかかわらず、腫瘍細胞を透過する、抗体で機能化されたナノモーターのより高い能力を示す。
加えて、本発明者らは、驚くべきことに、本明細書で提供される機能化酵素駆動ナノモーターが、任意の細胞毒性薬で充填されない場合も、癌細胞死を増加させることができる強力な活性などを示すことを発見した（図４Ｄを参照）。これは、より高い特異的およびより低い二次的効果を有する抗癌治療の開発を可能にするため、大きな利点を構成する。
本発明のナノモーターの重要な利点は、それらの多様性であり、それらは、基質が存在する場所でのみそれらを活性化するように、異なる酵素で操作され得る。これは、高い特異的および低い二次的効果を有する治療の開発を可能にするという利点をさらに提供する。
上記を考慮して、本発明のナノモーターは、疾患治療およびバイオセンシングなどの様々な分野で有用な非常に価値のあるツールを提供する。
よって、第１の態様では、本発明は、表面を有する粒子と、酵素と、異種分子と、を含み、酵素および異種分子が、粒子の表面全体にかけて不連続に付着していることを特徴とする、酵素駆動ナノモーターを提供する。本発明はまた、表面を有する粒子と、酵素と、異種分子と、を含み、酵素および異種分子が、粒子の表面全体にかけて不連続に付着している、酵素駆動ナノモーターを提供する。
第２の態様では、本発明は、治療有効量の、第１の態様において定義されるナノモーターと、薬学的に許容される賦形剤および／または担体と、を含む、薬学的組成物を提供する。
第３の態様では、本発明は、療法、診断、または予後における使用のための、第１の態様において定義されるナノモーターまたは第２の態様において定義される薬学的組成物を提供する。
第４の態様では、本発明は、第１の態様において定義されるナノモーターまたは第２の態様において定義される薬学的組成物と、任意に、その使用のための説明書と、を含む、キットオブパーツを提供する。本発明はまた、第１の態様において定義されるナノモーターまたは第２の態様において定義される薬学的組成物と、その使用のための説明書と、を含む、キットオブパーツを提供する。本発明のキットは、本発明のナノモーターを希釈するために好適なバッファー、または本発明の乾燥または凍結乾燥されたナノモーターを再懸濁するためのバッファーをさらに含み得る。
第５の態様では、本発明は、単離された試料中の分析物を検出するインビトロ方法を提供し、これは第１の態様を定義するナノモーターを試料と接触させることを含む。
第６の態様では、本発明は、単離された試料中の分析物を検出するためのインビトロ方法における第１の態様において定義されるナノモーターの使用を提供する。
実施例１に関連し、ウレアーゼ／ＰＥＧナノモーター（ＭＳＮＰ－Ｕｒ／ＰＥＧ）および抗体修飾ウレアーゼナノモーター（ＭＳＮＰ－Ｕｒ／ＰＥＧ－Ａｂ）の製造および特徴付けを示す。Ａ）ナノモーターを得るための段階的な製造プロセスを提示するスキーム。 実施例１に関連し、ＭＳＮＰ－Ｕｒ／ＰＥＧおよびＭＳＮＰ－Ｕｒ／ＰＥＧ－Ａｂの運動分析を示す。Ａ）ＭＳＮＰ－Ｕｒ／ＰＥＧナノモーターならびにＢ）０ｍＭ、５０ｍＭ、および１００ｍＭの尿素でのＭＳＮＰ－Ｕｒ／ＰＥＧ－Ａｂナノモーターの代表的な追跡軌道ならびにＣ）０ｍＭ、５０ｍＭ、および１００ｍＭでの両方のタイプのナノモーターの代表的な平均二乗変位（ＭＳＤ）。Ｄ）異なる尿素濃度でのＭＳＤ分析によって得られる有効拡散係数（Ｎ＝２０、エラーバーはＳＥを表し、ｐ＜０．００１）。 実施例１に関連し、異なる濃度の尿素の存在下でのスフェロイドの生存率に対する抗体ありおよびなしのナノモーターの効果を示す。異なる尿素濃度（Ｎ＝３、エラーバーはＳＥを表す）でのＭＳＮＰ－Ｕｒ／ＰＥＧ（元は青）およびＭＳＮＰ－Ｕｒ／ＰＥＧ－Ａｂ（元は赤）との４時間インキュベーション後のスフェロイドの生存率の定量化。 実施例１に関連し、抗体修飾ナノモーターの膀胱癌スフェロイドへの標的化および透過能力を示す。４時間のインキュベーション後の尿素の存在下（４０ｍＭ）および不在下での膀胱癌スフェロイドへの抗体修飾ナノモーターの内在化の定量化、ならびに４８時間の休止期間後に測定された後で尿素の存在下（４０ｍＭ）および不在下、４時間のＭＳＮＰ－Ｕｒ／ＰＥＧおよびＭＳＮＰ－Ｕｒ／ＰＥＧ－Ａｂとインキュベートされたスフェロイドの増殖の定量化。 実施例２に関連し、ＤＮＡマイクロモーターの製造アプローチおよび特徴付けを示す。Ａ）ＡＰＴＥＳおよびＴＥＯＳシリカ前駆体を添加することによって二酸化ケイ素層を市販のポリスチレンテンプレート上で成長させる、マイクロモーター製造の概略図。次いで、ポリスチレンコアがＤＭＦによって除去され、マイクロカプセルがグルタルアルデヒド（ＧＡ）リンカーの使用を通してウレアーゼおよびＤＮＡ足場で機能化される。Ｂ）ｐＨ応答性ＤＮＡナノスイッチは、マイクロモーター上で共有結合する相補的ＤＮＡ足場にハイブリダイズする。自己推進は、ウレアーゼ酵素によって媒介される、尿素のアンモニアおよび二酸化炭素への変換によって達成される。Ｃ）単分子ＤＮＡナノスイッチのｐＨ依存性の三重鎖から二重鎖への遷移は、ＦＲＥＴ効率の変化をもたらす。Ｄ）ＳｉＯ２マイクロカプセルの走査電子顕微鏡写真。挿入図は、選択された領域の拡大図を示す。スケールバー＝２μｍ。Ｅ）透過電子顕微鏡法によって得られるトポグラフィー画像。キャリブレーションバーは高さμｍを示す。Ｆ）機能化プロセスに沿ったマイクロ粒子表面のＺ電位測定（ＮＨ２＝合成から生じるアミン被覆粒子、ＧＡ＝グルタルアルデヒドとのインキュベーション後のマイクロ粒子、ＵＲ＝ウレアーゼ機能化マイクロ粒子、ＵＲ＋ＤＮＡｓｓ＝ウレアーゼおよびＤＮＡ足場の両方で機能化されたマイクロ粒子、スイッチ＝ＤＮＡスイッチと３０分間ハイブリダイゼーション後の、ウレアーゼおよびＤＮＡ足場機能化マイクロ粒子。） 実施例２に関連し、三重鎖ベースのｐＨ応答性ＤＮＡナノスイッチは、溶液中のｐＨ変化を検出することができ、マイクロモーター構造にコンジュゲートされることを示す。Ａ）三重鎖ＤＮＡナノスイッチは、ｐＨ非感受性ワトソン－クリック相互作用（破線）およびｐＨ感受性フーグスティーン相互作用（点）の形成を通して分子内二重ヘアピン構造を形成する。ＣＧＣおよびＴＡＴトリプレットを含有する三重鎖ナノスイッチは、溶液のｐＨを増加させることによって二重鎖コンフォメーションにアンフォールドする。溶液中のｐＨ変化の関数としてのＤＮＡナノスイッチの三重から二重への遷移を示すレシオメトリックＦＲＥＴ発光（左）。Ｂ）キャリブレーションバーに示される、Ｃｙ３チャネル、ＦＲＥＴチャネル、およびＦＲＥＴ／Ｃｙ３比値を右から左に示す、ＤＮＡナノスイッチ機能化マイクロ粒子のＦＲＥＴ効果のＣＳＬＭ分析。スケールバー＝２μｍ。白矢印は機能化マイクロ粒子を示す（元々はＣｙ３チャネルについて赤、ＦＲＥＴチャネルについて緑、Ｃｙ３／ＦＲＥＴマージについて黄色）。平均±平均の標準誤差として示される、平均ＦＲＥＴ／Ｃｙ３発光値として示される、ｐＨ感受性（Ｃ）および非ｐＨ特異的（Ｄ）についてのＤＮＡ機能化マイクロモーターによる定量的ｐＨ測定。 実施例２に関連する。Ａ）ＤＮＡスイッチマイクロモーターのＭＳＤ。結果は平均±平均の標準誤差として示される。Ｂ）ＭＳＤから計算された速度。結果は平均±平均の標準誤差として示される。
本出願における本明細書で使用されるすべての用語は、特に明記されない限り、当該技術分野で既知のそれらの通常の意味で理解されるものとする。本出願において使用される特定の用語の他のより具体的な定義は、以下に記載される通りであり、他に明示的に定められた定義がより広い定義を提供しない限り、本明細書および特許請求の範囲全体に均一に適用されることが意図される。
本明細書で使用される場合、不定冠詞「ａ」および「ａｎ」は、「少なくとも１つ」または「１つ以上」と同義である。特に示されない限り、「ｔｈｅ」などの本明細書で使用される定冠詞には、名詞の複数形も含まれる。
「酵素推進ナノモーター」または「酵素駆動ナノモーター」という用語は、デバイスの表面上に位置する酵素の作用を通して化学エネルギーを移動に変換することができる、マイクロまたはナノスケールの、分子デバイスを指す。言い換えれば、ナノモーターは、酵素で外部機能化されたナノ粒子またはマイクロ粒子である。理論によって縛られることなく、酵素は、触媒反応に関与する生成物の非対称放出を通して移動を生み出し、浸透圧勾配、電荷、または他の特性に応じて界面力を生じる。「ナノモーター」および「マイクロモーター」という用語は、本出願で交換可能に使用される。
本明細書で使用される場合、「異種分子」は、酵素（複数可）とは異なる任意の分子を指し、当該酵素（複数可）は、ナノモーターの推進を担当し、粒子の表面全体にかけて不連続に付着する。それによって、実施形態は、基本的に、粒子に結合することができる任意のタイプの分子が、粒子へのその直接的または間接的接続を通して表面に固定化されることを可能にする。
異種分子の以下に提供されるリストは、単に本発明のナノモーターで使用され得る分子の例示的かつ非限定的なリストとして見られるべきである。しかしながら、実施形態は、それに限定されず、実施形態のナノモーターに直接的または間接的に結合することができる任意の異種分子を包含する。
目的の異種分子は、蛍光マーカー、すなわち、フルオロフォア、例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、および他のイソチオシアネート；Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）フルオレセインおよび他のスクシンイミジルエステル；フルオレセイン－５－マレイミドおよび他のマレイミド活性化フルオロフォア；シアニンフルオロフォア；フルオレセインフルオロフォア；ローダミンフルオロフォア；ＡＴＴＯ色素；ＤｙＬｉｇｈｔ Ｆｌｕｏｒ色素；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ色素；ならびにホウ素－ジピロメテン（ＢＯＤＩＰＹ）色素などのマーカーの中から選択することができる。さらなる例には、同位体ラベルまたはマーカー、化学発光マーカー、放射線不透過性マーカーなどが挙げられる。そのような場合、ナノモーターは、試験分子として使用され、表面上のナノモーターのマーカーを使用して、その検出を可能にすることができる。
異種分子のさらなる例には、免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリー、インテグリン、カドヘレイン、およびセレクチンを含む、細胞接着分子（ＣＡＭ）などの細胞接着および細胞付着分子が挙げられる。
異種分子のさらなる例は、例えば、プロテオグリカン（ＰＧ）、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）、ヘパラン硫酸（ＨＳ）、コンドロイチン硫酸、ケラチン硫酸、コラーゲン、エラスチンなどを含む細胞外マトリックス（ＥＣＭ）分子である。
目的の分子の関連タイプは、上皮細胞によって分泌されるＥＣＭの層である、基底膜の分子を含む基底膜分子である。そのような基底膜分子の非限定的な例には、ラミニン、ＩＶ型コラーゲン、エンタクチン、およびパーレカンが挙げられる。
目的の異種分子のさらに別の例は、コルチコステロイドなどの抗炎症分子、糖質コルチコイド、アセチルサリチル酸、イソブチルプロパンフェノール酸、およびナプロキセンナトリウム（ＩＮＮ）などの非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、リポキシン、インターロイキン－１受容体アンタゴニスト（ＩＬ－１ＲＡ）などである。
抗生物質は、細菌成長を阻害または細菌を殺滅するために、目的の異種分子として使用することもできる。抗生物質の非限定的な例には、ペニシリン；セファロスポリン；ポリミキシン；リファマイシン；リピアルマイシン；キノロン；スルホンアミド；マクロライド；リンコサミド；テトラサイクリン；殺菌性アミノグリコシド；ダプトマイシンなどの環状リポペプチド；チゲサイクリンなどのグリシルシリン；リネゾリドなどのオキサゾリドン；およびフィダキソマイシンなどのリピアルマイシンが挙げられる。
同様に、抗真菌分子、例えば、アンホテリシンＢ、カンジシジン、フィリピン、ハマイシン、ナタマイシン、ナイスタチン、およびリモシジンなどのポリエン抗真菌剤；イミダゾール、例えば、ビフォナゾール、ブトコナゾール、クロトリマゾール、エコナゾール、フェンチコナゾール、イソコナゾール、ミコナゾール、オモコナゾール、オキシコナゾール、セルタコナゾール、スルコナゾール、およびチオコナゾールなどのアゾール抗真菌剤；トリアゾール、例えば、アルバコナゾール、フルコナゾール、イザブコナゾール、イトラコナゾール、ポサコナゾール、ラブコナゾール、テルコナゾール、およびボリコナゾール；ならびにチアゾール、例えば、アバファンギン；アモロルフィン、ブテナフィン、ナフチフィン、およびテルビナフィンなどのアリルアミン；アニデュラファンギン、カスポファンギン、およびミカファンギンなどのエキノカンジン；安息香酸；シクロピロックスオラミン；フルシトシン；グリセオフルビン；トルナフタートおよびウンデシレン酸などの他のタイプの微生物を標的化する分子。また、抗ウイルス分子、例えば、ウイルス支援タンパク質（ＶＡＰ）抗イディオタイプ抗体；アマンタジン；リマンタジン；プレコナリル；アシクロビル；ジドブジン（ＡＺＴ）；ラミブジン；インテグラーゼ；ホミビルセン；リファンピシン；ザナミビルおよびオセルタミビル、ならびにメベンダゾールなどの抗寄生虫分子；ピランテルパモエート；チアベンダゾール；ジエチルカルバマジン；イベルメクトリン；ニクロサミド；プラジカンテル；アルベンダゾール；プラジカンテル；リファンピン；アンホテリシンＢ；メラルソプロール；エルフォルニチン；メトロニダゾール；チニダゾールおよびミルテフォシンは、目的の異種分子として使用され得る。
異種分子のさらなる例には、アデノメデュリン（ＡＭ）、アンジオポエチン（Ａｎｇ）、自己分泌運動因子、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、表皮成長因子（ＥＧＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、成長分化因子－９（ＧＤＦ９）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、肝細胞腫由来成長因子（ＨＤＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、ミスタチン（ＧＤＦ－８）、神経成長因子（ＮＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、形質転換成長因子アルファ（ＴＧＦ－α）、形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ－β）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ－α）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、胎盤成長因子（ＰＩＧＦ）などの成長因子が挙げられる。表面結合ペプチドに結合した成長因子を有するナノモーターを使用して、例えば、細胞成長、増殖、および／または細胞分化を刺激する能力を有する表面を提供することができる。
目的の異種分子のさらなる例には、細胞成長阻害剤および化学療法剤が挙げられる。そのようなタイプの異種分子は、ナノモーターに含まれる場合、局所的な細胞成長阻害効果を提供するであろう。そのような目的の異種分子の非限定的な例には、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤；ナイトロジェンマスタード、例えば、メクロレタミン、シクロホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、イホスファミド、およびブスルファンなどのアルキル化剤；ニトロソ尿素、例えば、Ｎ－ニトロソ－Ｎ－メチル尿素（ＭＮＵ）、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、セムスチン（ＭｅＣＣＮＵ）、ホテムスチンおよびストレプトゾトシン；テトラジン、例えば、ダカルバジン、ミトゾロミド、およびテモゾロミド、ならびにアジリジン、例えば、チオテパ、ミトマイシン、ジアジクオン（ＡＺＱ）；ならびにシスプラチン、例えば、シスプラチン、カルボプラチン、およびオキサプラチン；抗葉酸剤、例えば、メトトレキセートおよびペメトレキセドなどの代謝拮抗剤；フルロピリミジン、例えば、フルオロウラシルおよびカペシタビン；シタラビン、ゲムシタビン、デシタビン、ビダザ、フルダラビン、ネララビン、クラドリビン、クロファラビン、およびペントスタチンなどのデオシヌクレオシド類似体；ならびにチオプリン、例えば、チグアニンおよびメルカプトプリン；ビンカアルカロイド、例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、ビンデシン、およびビンフルニンなどの抗微小管剤；ならびにタキサン、例えば、パクリタキセルおよびドセタキセル；ならびにポドフィロトキシン；イリノテカン、トポテカン、カプトテシン、エトポシド、ドキソルビシン、ミトキサントロン、テニポシド、ノボビオシン、メルバロン、およびアクラルビシンなどのトポイソメラーゼ阻害剤；アントラサイクリン、例えば、ドキソルビシン、ダウモルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ピラルビシン、アクラルビシン、ミトキサントロン、アクチノマイシン、ブレオマイシン、プリカマイシン、およびマイトマイシンなどの細胞毒性抗生物質が挙げられる。
目的の異種分子の他の群には、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子などのポリヌクレオチドが挙げられる。異種分子はまた、ナノセンサーまたは分子ゲートであり得る。
「表面全体にかけて不連続に付着している」とは、粒子の単一の面または半球体に制限されない離散型分布を指し、すなわち、非極性分布を指す。しかしながら、分子が粒子の表面全体を均質に被覆していることを意味しない。本発明の粒子は、粒子の表面全体にかけて別個のパッチを形成する外部に付着した分子を提示し得るか、または同じであり、分子が付着していないギャップを提示する。
本明細書で使用される場合、「標的化分子」は、特定の細胞、組織、または器官についての特異性を有する分子を指す。標的化分子の好ましい例には、抗体、成長因子、および多糖類が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「ナノセンサー」は、任意のナノまたはマイクロスケールの感知デバイスを指す。本発明のナノセンサーは、それらが位置する環境における変化を検出し、それに応答することができる。特に、本発明のナノセンサーは、２つの異なる形態の間で切り替えることができるナノセンサーである、ナノスイッチであり得る。ＤＮＡナノスイッチは、環境変化、例えば、ｐＨ変化に応じて変化するコンフォメーションを有する一本鎖ＤＮＡ分子を含有する。ＤＮＡ分子は、コンフォメーション変化の検出を可能にする蛍光分子に結合され得る。
本明細書で使用される場合、「標識分子」は、ナノモーターに化学的に結合することができ、ナノモーターが検出されることを可能にする検出可能なシグナルを放出する分子を指す。標識分子の特に好ましい例には、化学発光分子、蛍光分子、および同位体が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「分子ゲート」または「ナノバルブ」は、光、温度、磁場、およびｐＨなどの選択されたトリガーに応答して、第１の閉鎖形態と第２の開放形態との間で切り替わるナノまたはマイクロスケールでの分子システムを指す。閉鎖形態は、分子ゲートが付着する粒子に含有されるカーゴの放出をブロックするように設計される。トリガーの適用時、ゲートは、カーゴの放出を可能にする開放形態に変わる。
「抗癌抗体」は、癌細胞を停止または排除する能力を有する抗体を指す。
上記のように、本発明は、第１の態様では、異種分子で外部機能化された酵素駆動ナノモーターを提供する。
第１の態様の具体的な実施形態では、任意に上または下に提供される実施形態のいずれかと組み合わせて、粒子は、ナノ粒子またはマイクロ粒子である。本明細書で使用される「ナノ粒子」という用語は、ナノスケールで少なくとも２次元、特にナノスケールで３次元すべてを有する粒子を指す。類推のために、本明細書で使用される「マイクロ粒子」という用語は、マイクロスケールで少なくとも２つの寸法、特にマイクロスケールですべての３つの寸法を有する粒子を指す。具体的な実施形態では、粒子は、１ｎｍ～１００μｍである。具体的には、３０ｎｍ～２μｍである。より具体的には、１００ｎｍ～１μｍである。さらにより具体的には、４００ｎｍ～６００ｎｍである。
本明細書に記載されるナノ粒子またはマイクロ粒子の形状に関して、球体、多面体、および棒状形状が含まれる。特に、ナノ粒子またはマイクロ粒子が、ナノワイヤまたはナノチューブ、マイクロワイヤまたはマイクロチューブなどの、実質的に円形の断面を有する実質的に棒状形状である場合、「ナノ粒子」または「マイクロ粒子」は、ナノスケールまたはマイクロスケールで少なくとも２つの寸法を有する粒子を指し、これら２つの寸法は、ナノ粒子またはマイクロ粒子の断面である。
第１の態様の具体的な実施形態では、任意に上または下に提供される実施形態のいずれかと組み合わせて、粒子は、球形である。
本明細書で使用される場合、「サイズ」という用語は、特徴的な物理的寸法を指す。例えば、実質的に球形であるナノ粒子／マイクロ粒子の場合、ナノ粒子／マイクロ粒子のサイズは、ナノ粒子／マイクロ粒子の直径に対応する。ナノ粒子／マイクロ粒子のセットを具体的なサイズのものとして言及する場合、セットは、指定されたサイズの周りのサイズの分布を有することができることが企図される。よって、本明細書で使用される場合、ナノ粒子／マイクロ粒子のセットのサイズは、サイズの分布のピークサイズなどのサイズの分布のモードを指すことができる。加えて、完全に球形でない場合、直径は、物体を含む球体の等価直径である。この直径は、一般に「流体力学的直径」と呼ばれ、その測定は、Ａｔｌａｓセル加圧システムまたはＭａｌｖｅｒｎと組み合わせたＷｙａｔｔ Ｍｏｂｉｕｓを使用して行うことができる。透過電子顕微鏡法（ＴＥＭ）または走査電子顕微鏡法（ＳＥＭ）画像も、直径に関する情報を与える。
多種多様な粒子材料が当業者に入手可能であり、当業者は、選択される材料がナノモーターの意図された用途に依存し、例えば、治療的使用のためのナノモーターは、生体適合性粒子で作製されるべきであるということを理解する。
よって、第１の態様の具体的な実施形態では、任意に上または下に提供される実施形態のいずれかと組み合わせて、粒子は、金属、金属酸化物、ポリマー、脂質、タンパク質、細胞膜、細胞体、炭素質材料、およびそれらの混合物からなる群から選択される材料で作製される。具体的な実施形態では、金属は、アルミニウム（Ａｌ）、白金（Ｐｔ）、パラジウム（Ｐｄ）、またはマグネシウム（Ｍｇ）である。具体的な実施形態では、金属酸化物は、シリカ（ＳｉＯ２）、酸化マンガン（ＭｎＯ２）、および酸化チタン（ＴｉＯ２）から選択される。具体的な実施形態では、ポリマーは、ポリスチレンまたは金属有機フレームワークである。具体的な実施形態では、炭素質材料は、炭素、グラフェン、およびフラーレンから選択される。具体的な実施形態では、粒子の材料は、ポリマーソームである。具体的な実施形態では、粒子は、タンパク質ベースの粒子（プロテインソーム）である。具体的な実施形態では、細胞体は、血小板または赤血球（ＲＢＣ）である。
「金属有機フレームワーク」または「ＭＯＦ」という用語は、有機配位子に配位された金属イオンまたはクラスターを含む化合物を指す。中心金属元素は、亜鉛（Ｚｎ）、コバルト（Ｃｏ）、カドミウム（Ｃｄ）、ニッケル（Ｎｉ）、マンガン（Ｍｎ）、クロム（Ｃｒ）、銅（Ｃｕ）、ランタン（Ｌａ）、鉄（Ｆｅ）、白金（Ｐｔ）、パラジウム（Ｐｄ）、銀（Ａｇ）、金（Ａｕ）、ロジウム（Ｒｈ）、イリジウム（Ｉｒ）、ルテニウム（Ｒｕ）、鉛（Ｐｂ）、スズ（Ｓｎ）、アルミニウム（Ａｌ）、チタン（Ｔｉ）、モリブデン（Ｍｏ）、タングステン（Ｗ）、バナジウム（Ｖ）、ニオブ（Ｎｂ）、タンタル（Ｔａ）、スカンジウム（Ｓｃ）、イットリウム（Ｙ）、ガリウム（Ｇａ）、ゲルマニウム（Ｇｅ）、インジウム（Ｉｎ）、ビスマス（Ｂｉ）、セレン（Ｓｅ）、およびアンチモン（Ｓｂ）からなる群から選択される少なくとも１つであり得る。有機配位子は、少なくとも２つの金属イオンに結合可能な官能基を含み得る。
「細胞膜」とは、細胞の周りに連続的な障壁を形成する脂質二重層を指す。本発明の粒子は、原核生物または真核生物の細胞膜で形成することができる。
本明細書で使用される場合、「細胞体」は、細胞質および原形質膜によって囲まれた遺伝物質を含有する細胞の部分を指す。
「ポリマーソーム」という用語は、両親媒性合成ブロックコポリマーで作製された人工小胞を指す。
「プロテイノソーム」という用語は、自己組織化タンパク質またはタンパク質－ポリマーコンジュゲートで構成される粒子を指す。
具体的な実施形態では、任意に上または下に提供される実施形態のいずれかと組み合わせて、粒子は、メソポーラスシリカで作製される。本明細書で使用される場合、「メソポーラスシリカ」は、規則的に配置された中型細孔を有する多孔質シリカを指し、具体的には、細孔は、２ｎｍ～５０ｎｍ、より具体的には、４ｎｍ～約４０ｎｍである。
第１の態様の具体的な実施形態では、任意に上または下に提供される実施形態のいずれかと組み合わせて、酵素は、オキシドレダクターゼ、ヒドロラーゼ、およびリアーゼからなる群から選択される。より具体的な実施形態では、酵素は、グルコースオキシダーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルタミン酸オキシダーゼ、キサンチンオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、ビリルビンオキシダーゼ、リパーゼ、プロテアーゼ、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。より具体的な実施形態では、酵素は、ウレアーゼである。ウレアーゼ（ＥＣ ３．５．１．５）という用語は、二酸化炭素およびアンモニアへの尿素の加水分解を触媒する酵素の群を指す。本発明の具体的な実施形態では、ウレアーゼは、Ｃａｎａｖａｌｉａ ｅｎｓｉｆｏｒｍｉｓ（ＣＡＳ番号９００２－１３－５）に由来する。より具体的な実施形態では、それは、Ｃａｎａｖａｌｉａ ｅｎｓｉｆｏｒｍｉｓ（ＣＡＳ番号９００２－１３－５）由来のＩＸ型ウレアーゼである。酵素の配列は、Ｕｎｉｐｒｏｔ（Ｐ０７３７４ ＵＲＥＡ＿ＣＡＮＥＮ、１９９４年２月１日更新）などの様々なデータベースで見つけることができる。
第１の態様の具体的な実施形態では、任意に上または下に提供される実施形態のいずれかと組み合わせて、異種分子は、標的化分子、標識分子、ナノセンサー、および分子ゲートからなる群から選択される。
第１の態様の具体的な実施形態では、任意に上または下に提供される実施形態のいずれかと組み合わせて、異種分子は、抗体である。より具体的な実施形態では、抗体は、抗癌抗体である。より具体的な実施形態では、抗癌抗体は、膜受容体に結合する。より具体的な実施形態では、膜受容体は、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、およびＦＧＦＲ４からなる群から選択されるＦＧＦＲ（線維芽細胞成長因子受容体）である。より具体的な実施形態では、ＦＧＦＲは、ＦＧＦＲ３である。
第１の態様の具体的な実施形態では、任意に上または下に提供される実施形態のいずれかと組み合わせて、異種分子は、ナノセンサーである。当業者に入手可能な多数のナノセンサーが存在する（Ｃａｍｐｕｚａｎｏ Ｓ．ｅｔ ａｌ．，“Ｍｏｔｉｏｎ－ｄｒｉｖｅｎ ｓｅｎｓｉｎｇ ａｎｄ ｂｉｏｓｅｎｓｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｐｒｏｐｅｌｌｅｄ ｎａｎｏｍｏｔｏｒｓ”，Ａｎａｌｙｓｔ．２０１１，ｖｏｌ．３６（２２），ｐｐ．４６２１－３０）。具体的な実施形態では、ナノセンサーは、ＤＮＡナノスイッチである。ＤＮＡナノスイッチは、フルオロフォア－クエンチャーペアに結合した一本鎖ＤＮＡ分子を含む分子複合体である。具体的な実施形態では、ＤＮＡナノスイッチのＤＮＡ分子の配列は、配列番号１との少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する。
具体的な実施形態では、ナノセンサーは、ナノ粒子である。より具体的な実施形態では、ナノセンサーは、金属ナノ粒子である。より具体的には、金属ナノ粒子は、金（Ａｕ）ナノ粒子である。当業者であれば、ナノセンサーを形成するナノ粒子が、ナノモーターを形成するナノ粒子またはマイクロ粒子よりも小さくなければならないことを理解するであろう。
本発明では、「同一性」という用語は、配列が最適に整列される場合、２つの配列において同一である残基のパーセンテージを指す。最適なアラインメントにおいて、第１の配列における位置が第２の配列における対応する位置と同じアミノ酸残基によって占められる場合、配列は、その位置に関して同一性を示す。２つの配列間の同一性のレベル（または「配列同一性パーセント」）は、配列のサイズに対する配列によって共有される同一位置の数の比として測定される（すなわち、配列同一性パーセント＝（同一位置の数／位置の総数）×１００）。
最適なアラインメントを迅速に取得し、２つ以上の配列間の同一性を計算するためのいくつかの数学的アルゴリズムが知られており、いくつかの利用可能なソフトウェアプログラムに組み込まれる。そのようなプログラムの例には、とりわけ、アミノ酸配列分析のためのＭＡＴＣＨ－ＢＯＸ、ＭＵＬＴＡＩＮ、ＧＣＧ、ＦＡＳＴＡ、およびＲＯＢＵＳＴプログラムが挙げられる。好ましいソフトウェア分析プログラムには、ＡＬＩＧＮ、ＣＬＵＳＴＡＬ Ｗ、およびＢＬＡＳＴプログラム（例えば、ＢＬＡＳＴ ２．１、ＢＬ２ＳＥＱ、およびそれらのそれ以降のバージョン）が含まれる。
アミノ酸配列分析について、ＢＬＯＳＵＭマトリックス（例えば、ＢＬＯＳＵＭ４５、ＢＬＯＳＵＭ５０、ＢＬＯＳＵＭ６２、およびＢＬＯＳＵＭ８０マトリックス）、Ｇｏｎｎｅｔマトリックス、またはＰＡＭマトリックス（例えば、ＰＡＭ３０、ＰＡＭ７０、ＰＡＭ１２０、ＰＡＭ１６０、ＰＡＭ２５０、およびＰＡＭ３５０マトリックス）などの重みマトリックスは、同一性の決定に使用される。
ＢＬＡＳＴプログラムは、選択された配列を、データベース（例えば、ＧｅｎＳｅｑ）中の複数の配列に対して整列させることによるか、または２つの選択された配列間、ＢＬ２ＳＥＱのいずれかで、少なくとも２つのアミノ酸配列の分析を提供する。ＢＬＡＳＴプログラムは、好ましくは、ＤＵＳＴまたはＳＥＧプログラムなどの複雑度の低いフィルタリングプログラムによって改変され、これらは、好ましくはＢＬＡＳＴプログラム操作に組み込まれる。ギャップ存在コスト（またはギャップスコア）が使用される場合、ギャップ存在コストは、好ましくは、約－５～－１５に設定される。同様のギャップパラメータは、必要に応じて他のプログラムで使用することができる。ＢＬＡＳＴプログラムおよびそれらの根底にある原理は、例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，“Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ”，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，ｖ．２１５，ｐａｇｅｓ ４０３－４１０にさらに記載される。
多重配列分析には、ＣＬＵＳＴＡＬ Ｗプログラムを使用することができる。ＣＬＵＳＴＡＬ Ｗプログラムは、望ましくは「動的」（「高速」に対して）設定を使用して実行される。アミノ酸配列は、配列間の同一性のレベルに応じて、ＢＬＯＳＵＭマトリックスの可変セットを使用して評価される。ＣＬＵＳＴＡＬ Ｗプログラムおよび基本的な動作原理は、例えば、Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，“ＣＬＵＳＴＡＬ Ｖ：ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｆｏｒ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ”，１９９２，ＣＡＢＩＯＳ，８（２），ｐａｇｅｓ １８９－１９１でさらに説明される。
第１の態様の具体的な実施形態では、任意に上または下に提供される実施形態のいずれかと組み合わせて、ナノモーターは、カーゴをさらに含む。具体的な実施形態では、カーゴは、薬物からなるリストから選択され、薬物は、小分子、核酸、治療用酵素、ペプチド、タンパク質、またはホルモンからなる群から選択される。「カーゴ」について、ナノモーター内で輸送された任意の分子が所望の標的で送達されることが理解される。粒子の表面材料および多孔性に応じて、カーゴは、粒子の内部にあるか、またはその表面に吸着され得る。
具体的な実施形態では、薬物は、細胞毒性薬である。より具体的には、それは、抗癌薬である。
第１の態様の具体的な実施形態では、任意に上または下に提供される実施形態のいずれかと組み合わせて、酵素および異種分子は、直接またはリンカーを通して粒子の表面に付着する。より具体的な実施形態では、リンカーは、無水物、アルコール、酸、アミン、エポキシ、イソシアネート、シラン、ハロゲン化基、および重合性基、好ましくは３－アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）からなる群から選択される。さらにより具体的な実施形態では、リンカーは、グルタルアルデヒドである。
そのような態様では、リンカーの一部分は、粒子の表面に結合し、リンカーの別の部分は、酵素または異種分子に結合し、それによって酵素または異種分子と表面との間に共有結合を形成する。リンカーと当該表面および当該酵素または異種分子との間の結合は、リンカーと酵素または異種分子との間で発生する化学反応によってもたらされ、それによって表面と当該酵素または異種分子との間の共有結合を確保する。一実施形態では、酵素および／または異種分子は、粒子の表面に、粒子の当該表面の化学的前処理の後に付着する。
上記のように、第２の態様では、本発明は、治療有効量の第１の態様のナノモーターと、薬学的に許容される賦形剤および／または担体と、を含む、薬学的組成物を提供する。
本明細書で使用される「治療有効量」という表現は、投与される場合、対処される疾患または障害の症状のうちの１つ以上の発症を予防するか、またはこれをある程度緩和するのに十分なナノモーターの量を指す。本発明に従って投与される薬剤の特定の用量は、もちろん、投与されるナノモーター、投与経路、治療されている特定の病態、および同様の考慮事項を含む、症例を取り巻く特定の状況によって決定されるであろう。
「薬学的組成物」という表現は、ヒトおよび非ヒト動物（すなわち、獣医学的組成物）用に意図された両方の組成物を包含する。
「薬学的に許容される担体または賦形剤」という表現は、薬学的に許容される材料、組成物、またはビヒクルを指す。各成分は、薬学的組成物の他の成分と適合性があるという意味で薬学的に許容可能でなければならない。それはまた、過度の毒性、炎症、アレルギー反応、免疫原性、または合理的なベネフィット／リスク比と相応する他の問題もしくは合併症なしに、ヒトおよび非ヒト動物の組織または器官と接触する使用に好適でなければならない。
好適な薬学的に許容される賦形剤の例は、溶媒、分散媒体、希釈剤、または他の液体ビヒクル、分散剤もしくは懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、増粘剤もしくは乳化剤、防腐剤、固体結合剤、潤滑剤などである。任意の従来の賦形剤媒体が、任意の望ましくない生物学的効果を生成すること、または他の方法で薬学的組成物の任意の他の成分（複数可）と有害な様式で相互作用することなどによって、物質またはその誘導体と不適合である限りを除いて、その使用は、本発明の範囲内であることが企図される。
本発明の薬学的組成物中のナノモーター、薬学的に許容される賦形剤、および／または任意の追加の成分の相対量は、治療される対象の同一性、サイズ、および／または病態に応じて、かつさらに組成物が投与される経路に応じて変化するであろう。
薬学的組成物の製造に使用される薬学的に許容される賦形剤には、不活性希釈剤、分散剤および／または造粒剤、界面活性剤および／または乳化剤、崩壊剤、結合剤、防腐剤、緩衝剤、潤滑剤、および／または油が挙げられるが、これらに限定されない。配合者の判断に従って、着色剤、コーティング剤、甘味剤、および香味剤などの賦形剤が組成物中に存在し得る。
本発明のナノモーターを含有する薬学的組成物は、任意の剤形、例えば、固体または液体で提示することができ、任意の好適な経路、例えば、経口、非経口、直腸、局所、鼻腔内、または舌下経路によって投与することができ、そのため、それらは所望の剤形の製剤、例えば、局所製剤（軟膏、クリーム、リポゲル、ヒドロゲルなど）、点眼薬、エアロゾルスプレー、注射可能な溶液、浸透圧ポンプなどに必要な薬学的に許容される賦形剤を含むであろう。
例示的な希釈剤には、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、リン酸カルシウム、リン酸二カルシウム、硫酸カルシウム、リン酸水素カルシウム、リン酸ナトリウムラクトース、スクロース、セルロース、微結晶性セルロース、カオリン、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、塩化ナトリウム、乾燥デンプン、トウモロコシデンプン、粉糖、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
例示的な造粒剤および／または分散剤には、ジャガイモデンプン、トウモロコシデンプン、タピオカデンプン、デンプングリコレール酸ナトリウム、クレー、アルギン酸、グアーガム、柑橘パルプ、寒天、ベントナイト、セルロースおよび木製品、天然スポンジ、カチオン交換樹脂、炭酸カルシウム、ケイ酸塩、炭酸ナトリウム、架橋ポリビニルピロリドン）（クロスポビドン）、カルボキシメチルデンプンナトリウム（デンプングリコール酸ナトリウム）、カルボキシメチルセルロース、架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム（クロスカルメロース）、メチルセルロース、アルファ化デンプン（デンプン１５００）、微結晶性デンプン、水不溶性デンプン、カルボキシメチルセルロースカルシウム、ケイ酸アルミニウムマグネシウム（Ｖｅｅｇｕｍ）、ラウリル硫酸ナトリウム、第四級アンモニウム化合物、ならびにそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
例示的な結合賦形剤には、デンプン（例えば、トウモロコシデンプンおよびデンプンペースト）；ゼラチン；糖（例えば、スクロース、グルコース、デキストロース、デキストリン、糖蜜、ラクトース、ラクチトール、マンニトール）；天然および合成ガム（例えば、アカシア、アルギン酸ナトリウム、アイリッシュモスの抽出物、パンワーガム、ガッティガム、イサポールハスクの粘液、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、微結晶性セルロース、酢酸セルロース、ポリビニルピロリドン）、ケイ酸アルミニウムマグネシウム（Ｖｅｅｇｕｍ）、およびカラマツアラボガラクタン）；アルギン酸塩；酸化ポリエチレン；ポリエチレングリコール；無機カルシウム塩；ケイ酸；ポリメタクリレート；ワックス；水；アルコール；ならびにそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
例示的な防腐剤には、抗酸化剤、キレート剤、抗菌性防腐剤、抗真菌性防腐剤、アルコール防腐剤、酸性防腐剤、および他の防腐剤が挙げられ得る。例示的な抗酸化剤には、アルファトコフェロール、アスコルビン酸、パルミチン酸アスコルビル、ステアリン酸アスコルビル、オレイン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、モノチオグリセロール、メタ重亜硫酸カリウム、プロピオン酸、没食子酸プロピル、アスコルビン酸ナトリウム、重亜硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、および亜硫酸ナトリウムが挙げられるが、これらに限定されない。例示的なキレート剤には、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、クエン酸一水和物、エデト酸二ナトリウム、エデト酸二カリウム、エデト酸、フマル酸、リンゴ酸、リン酸、エデト酸ナトリウム、酒石酸、およびエデト酸三ナトリウムが挙げられる。
例示的な緩衝剤には、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、塩化アンモニウム、炭酸カルシウム、塩化カルシウム、クエン酸カルシウム、グルビオン酸カルシウム、グルセプチン酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、Ｄ－グルコン酸、グリセロリン酸カルシウム、乳酸カルシウム、プロパン酸、レブリン酸カルシウム、ペンタン酸、二塩基性リン酸カルシウム、リン酸、三塩基性リン酸カルシウム、水酸化リン酸カルシウム、酢酸カリウム、塩化カリウム、グルコン酸カリウム、カリウム混合物、二塩基性リン酸カリウム、一塩基性リン酸カリウム、リン酸カリウム混合物、酢酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、二塩基性リン酸ナトリウム、一塩基性リン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム混合物、トロメタミン、水酸化マグネシウム、水酸化アルミニウム、アルギン酸、パイロジェンフリー水、等張食塩水、リンガー溶液、エチルアルコール、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
例示的な潤滑剤には、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸、シリカ、タルク、モルト、ベヘン酸グリセリル、水素化植物油、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、ロイシン、ラウリル硫酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
前述のように、本発明はまた、第３の態様では、療法、診断、または予後における使用のための本発明のナノモーターまたは薬学的組成物を提供する。
ウレアーゼ推進ナノモーターは、尿などの液体媒体だけではなく、ヒアルロン酸などの粘性媒体中でも移動することができる。さらに、それらは粘液分泌物中でも活性である。したがって、本発明のナノモーターは、眼の房水などの液体および粘性組織の両方で使用することができる。
第３の態様の特定の実施形態では、任意に上または下に提供される実施形態のいずれかと組み合わせて、第１の態様のナノモーターまたは第２の態様の薬学的組成物は、癌の治療における使用のためのものである。
この実施形態はまた、癌の治療および／または予防のための医薬品の製造のための、第１の態様のナノモーター、または第２の態様の薬学的組成物の使用として製剤化することができる。この態様はまた、癌を治療および／または予防するための方法として製剤化することができ、方法は、治療有効量の第１の態様のナノモーターまたは第２の態様の薬学的組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む。
本発明のナノモーターまたは薬学的組成物で治療することができる癌の例示的な非限定的な例には、乳頭腫、腺腫、脂肪腫、骨腫、筋腫、血管腫、母斑、成熟奇形腫、癌腫、肉腫、未熟奇形腫、黒色腫、骨髄腫、白血病、ホジキンリンパ腫、基底細胞腫、棘細胞腫、乳癌、卵巣癌、子宮癌、膀胱癌、肺癌、気管支癌、前立腺癌、結腸癌、膵臓癌、腎臓癌、食道癌、肝細胞癌、頭頸部癌などが挙げられるが、これらに限定されない。第３の態様の特定の実施形態では、癌は、膀胱癌である。
本明細書で提供されるデータから、当業者であれば、本発明のナノモーターおよび薬学的組成物が、代謝性、神経性、および炎症性疾患などの他の疾患の治療にも有用であり得ることを理解するであろう。
上記のように、第５の態様では、本発明は、単離された試料中の分析物を検出するインビトロ方法を提供し、これは第１の態様において定義されるナノモーターを試料と接触させることを含む。当業者であれば、本発明のナノモーターが、当該分析物のセンサーでのそれらの機能化を通して、異なる分析物を検出するように適合され得ることを理解するであろう。
第５の態様の具体的な実施形態では、任意に上または下に提供される実施形態のいずれかと組み合わせて、試料は、生物学的に単離された試料である。より具体的には、生物学的に単離された試料は、血液、血漿、または血清である。
上記のように、第６の態様では、本発明は、単離された試料中の分析物を検出するためのインビトロ方法における第１の態様において定義されるナノモーターの使用を提供する。
第５または第６の態様の具体的な実施形態では、任意に上または下に提供される実施形態のいずれかと組み合わせて、試料は、液体試料である。前述のように、本発明者らのナノモーターは、様々な粘度を有する液体中で移動することができる。例えば、それらは尿中を移動することができ、これは（Ｉｎｍａｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｔｈｅ ｉｍｐａｃｔ ｏｆ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ａｎｄ ｕｒｉｎａｒｙ ｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔｓ ｏｎ ｕｒｉｎｅ ｖｉｓｃｏｓｉｔｙ ａｎｄ ｉｔｓ ｒｅｌｅｖａｎｃｅ ｔｏ ｂｌａｄｄｅｒ ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｉａ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ”，Ｉｎｔ Ｊ Ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｉａ，２０１３，ｖｏｌ．２９（３），ｐｐ．２０６－１０によって測定される）２０℃で１．０７００ｃＳｔの動粘度、および滑液に見られる濃度のヒアルロン酸（１ｍｇ／ｍｌ、レオメーターで測定される、１～１０Ｈｚの範囲のせん断速度について約１０－２Ｐａ＊ｓ）を有する。
本発明のナノモーターは、汚染物質またはバイオマーカーなどの多種多様な分析物の検出に特に有用である。
本明細書および特許請求の範囲全体を通して、「含む」という単語および単語の変形は、他の技術的特徴、添加剤、成分、またはステップを除外することを意図しない。さらに、「含む」という単語は、「からなる」の場合を包含する。本発明の追加の目的、利点、および特徴は、本明細書の検討後に当業者に明らかになるか、または本発明の実施によって習得され得る。以下の実施例および図面は、例示として提供されており、本発明を限定することを意図しない。図面に関連し、特許請求の範囲の括弧内に配置される参照記号は、単に特許請求の範囲の明瞭性を増加させることを試みるためであり、特許請求の範囲の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。さらに、本発明は、本明細書に記載される具体的かつ好ましい実施形態のすべての可能な組み合わせをカバーする。
１．ウレアーゼ駆動ナノモーターでの３Ｄ膀胱癌スフェロイドの標的化
１．１．方法
材料
エタノール（ＥｔＯＨ、９９％）、メタノール（ＭｅＯＨ、９９％）、塩酸（水中３７％）、水酸化アンモニウム（水中２５％）、テトラエチルオルトシリケート（ＴＥＯＳ、９９％）、トリエタノールアミン（ＴＥＯＡ、９９％）、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ、９９％）、３－アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ、９９％）、グルタルアルデヒド（ＧＡ、水中２５％）、ウレアーゼ（Ｃａｎａｖａｌｉａ ｅｎｓｉｆｏｒｍｉｓ、タイプＩＸ、粉末、５０，０００－１００，０００ユニット／ｇ固体）、ウレアーゼ活性アッセイキット（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、尿素（９９．９％）、グリセロール（９９％）、水素化ホウ素ナトリウム粉末（ＮａＢＨ４、９８．０％）、ホルムアルデヒド溶液（水中３７％）、ウシ血清アルブミン（凍結乾燥粉末）、４－ニトロフェノール溶液（１０ｍＭ）、塩化ナトリウムｐｕｒｉｓｓ．（ＮａＣｌ）、無水塩化カリウム（ＫＣＩ）、一塩基性リン酸ナトリウム（ＮａＨ２ＰＯ４）、重炭酸ナトリウムＢｉｏＸｔｒａ（９９．５－１００．５％、ＮａＨＣＯ３）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、９９．９％）、およびＨＳ－ＰＥＧ５Ｋ－ＮＨ２（ＨＣＩ塩）は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。Ｐｉｅｒｃｅ（商標）．ＢＣＡタンパク質アッセイキット、小麦胚芽凝集素（ＷＧＡ ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（商標）６４７コンジュゲート）、ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）Ａｌｅｘａ ＦｌｕｏｒＴＭ ４８８コンジュゲート、３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－２，５－ジフェニルテトラゾリウム臭化物（ＭＴＴ）、およびリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した。Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）基底マトリックスは、Ｃｏｒｎｉｎｇから購入した。抗ＦＧＦＲ３抗体（ａｂ８９６６０）は、Ａｂｃａｍから購入した。Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２は、Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓから購入した。Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ（登録商標）７標準ＲＣ前処理済み透析チュービング（３．５ｋＤ）は、Ｓｐｅｃｔｒｕｍから購入した。Ｃｙａｎｉｎｅ３ ＮＨＳエステルは、Ｌｕｍｉｐｒｏｂｅから購入した。ＭｃＣｏｙの５Ａ（改変）培地、ペニシリンストレプトマイシン溶液、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、およびトリプシン０．５％ＥＤＴＡは、Ｇｉｂｃｏから購入した。ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）生存率／細胞毒性キットは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した。ヒト膀胱移行上皮乳頭腫ＲＴ４細胞は、ＡＴＣＣ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＡ）から入手した。
装置
透過電子顕微鏡法（ＴＥＭ）画像は、ＪＥＯＬ ＪＥＭ－２１００顕微鏡を使用して捕捉した。走査電子顕微鏡法（ＳＥＭ）画像は、１０ｋＶでＦＥＩ ＮＯＶＡ ＮａｎｏＳＥＭ ２３０を使用して捕捉した。流体力学的半径および電気泳動移動度の測定は、Ａｔｌａｓセル加圧システムと組み合わせたＷｙａｔｔ Ｍｏｂｉｕｓを使用して行った。Ｂｒｕｎａｕｅｒ－Ｅｍｍｅｔｔ－Ｔｅｌｌｅｒ（ＢＥＴ）分析は、Ｍｉｃｒｏｍｅｒｉｔｉｃｓ Ｔｒｉｓｔａｒ ＩＩ Ｐｌｕｓ自動分析装置を使用して実施した。光学ビデオおよび細胞培養イメージングは、６３倍水浸対物レンズ、ガルボステージ、ならびにＦＩＴＣ、ローダミン、ＤＡＰＩ、およびＣＹ５用のフィルターキューブを備えた倒立光学顕微鏡（Ｌｅｉｃａ ＤＭｉ８）を使用して行った。タンパク質定量化および酵素活性アッセイは、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００ ＰＲＯ Ｍｕｌｔｉｍｏｄｅ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒを使用して実施した。共焦点顕微鏡法分析は、６３倍油浸対物レンズを備えたＬＳＭ ８００－Ｚｅｉｓｓを使用して行った。
メソポーラスシリカナノ粒子（ＭＳＮＰ）の合成：ＭＳＮＰはゾルゲル法を使用して調製された。簡潔には、ＣＴＡＢ（５７０ｍｇ）、ＴＥＯＡ（３５ｇ）、および水（２０ｍＬ）を含有する溶液をシリコンオイルバスで９５℃まで加熱した。この混合物を３０分間撹拌し、その後ＴＥＯＳ（１．５ｍＬ）を滴下した。混合物をさらに９５℃で２時間撹拌した。生成された粒子を遠心分離によって収集し、エタノール（３回、１３５０ｇ、１０分）で洗浄した。次いで、粒子をＭｅＯＨ：ＨＣｌ混合物（３０ｍＬ、１０：０．６）に懸濁し、ＭＳＮＰの細孔からのＣＴＡＢの除去のために、８０℃で２４時間還流した。最後に、粒子を遠心分離によって収集し、エタノール（３回、１３５０ｇ、１０分）中で洗浄し、各遠心分離間に２０分超音波処理した。アリコート（０．５ｍＬ）を収集し、遠心分離し、風乾して、ＭＳＮＰ懸濁液の濃度を決定した。
ＭＳＮＰのアミン機能化（ＭＳＮＰ－ＮＨ２）：以前に合成されたＭＳＮＰをＥｔＯＨ（２ｍｇ／ｍＬ）に懸濁した。次いで、ＡＰＴＥＳを懸濁液（１０μＬ／ｍｇのＭＳＮＰ）に加え、エンドツーエンドのロータリーシェーカーを使用して、室温で２４時間振盪した。最後に、粒子を遠心分離によって収集し、エタノール（３回、１３５０ｇ １０分）および水（３回、１９２８ｇ １０分）中で洗浄し、各遠心分離間に２０分超音波処理した。アリコート（０．５ｍＬ）を収集し、遠心分離し、風乾して、ＭＳＮＰ懸濁液の濃度を決定した。ウレアーゼおよびヘテロ二機能性Ｈ２Ｎ－ＰＥＧ－ＳＨ（ＭＳＮＰ－ＵＲ／ＰＥＧ）でのＭＳＮＰ－ＮＨ２の機能化：ＭＳＮＰ－ＮＨ２を１３４０ｇで１０分間遠心分離し、９００μＬのＰＢＳ（２ｍｇ／ｍｌ）に懸濁し、２０分間超音波処理した。この後、１００μＬのグルタルアルデヒドを添加し、混合物を３０秒間ボルテックスして、良好な分散液を得た。混合物を、室温で、エンドツーエンドのロータリーシェーカーに２．５時間置いた。次いで、ナノ粒子を収集し、ＰＢＳで３回洗浄し（１３４０ｇ、１０分）、各洗浄間に２０分間超音波処理した。次に、ＧＡ活性化ナノ粒子を、ウレアーゼ（３ｍｇ／ｍＬ）およびＨ２Ｎ－ＰＥＧ－ＳＨ（１μｇ／ｍｇのＭＳＮＰ－ＮＨ２）を含有するＰＢＳの溶液に懸濁した。次いで、混合物を、室温で、エンドツーエンドのロータリーシェーカーに一晩置いた。得られたナノモーターを遠心分離（１３４０ｇ、１０分）によってＰＢＳで３回洗浄し、洗浄間に３分の超音波処理を入れた。
抗ＦＧＦＲ３抗体（ＭＳＮＰ－Ｕｒ／ＰＥＧ－Ａｂ）でのＰＥＧ化ウレアーゼナノモーターの機能化：ナノモーターをＰＢＳ（２ｍｇ／ｍＬ）に懸濁し、抗ＦＧＦＲ３抗体（ナノモーター１ｍｇあたり３０μｇの抗体）を添加した。次いで、混合物を、室温で、ロータリーシェーカーにおいて一晩インキュベートした。最後に、抗体修飾ナノモーターを遠心分離（１３４０ｇ、１０分）によって収集し、ＰＢＳで３回洗浄し、洗浄間に３分の超音波処理を入れた。流体力学的半径および表面電荷の分析：ＡＴＬＡＳ加圧器に連結された、Ｗｙａｔｔ Ｍｏｂｉｕｓ ＤＬＳを使用して、ＭＳＮＰ、ＭＳＮＰ－ＮＨ２、ＭＳＮＰ－Ｕｒ／ＰＥＧ、およびＭＳＮＰ－Ｕｒ／ＰＥＧ－Ａｂのサイズ分布および表面電荷を特徴付けた。装置は、５３２ｎｍの波長のレーザーおよび１６３．５°の検出器角度を使用する。分析された試料を０．３ｍｇ／ｍＬの濃度に希釈し、５秒の取得時間で、光散乱および電気泳動移動度について同時に分析し、測定ごとに３回実行した。統計関連データを得るために、合計９回の測定を行った。
ＭＳＮＰ上のウレアーゼおよび抗体の量の定量化：ＭＳＮＰ－Ｕｒ／ＰＥＧ上に存在するウレアーゼの濃度は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃからのＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔを使用して、製造業者の指示に従って測定した。このキットは、タンパク質の量をペプチド結合による銅の還元と相関する。ナノモーターに結合した抗体の量を定量化するために、ＭＳＮＰ－Ｕｒ／ＰＥＧ－Ａｂについて同じ手順を繰り返した。
ウレアーゼ活性アッセイ：ＭＳＮＰに結合している間のウレアーゼの酵素活性は、Ｂｅｒｔｈｅｌｏｔの方法によって生成されたアンモニアの濃度を決定する市販のキットを使用して評価された（Ｐａｔｔｏｎ，Ｃ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，“Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃ ａｎｄ Ｋｉｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｂｅｒｔｈｅｌｏｔ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｍｍｏｎｉａ”，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，１９７７，ｖｏｌ．４９，ｐｐ．４６４－４６９）。ナノモーターは０．５ｍｇ／ｍＬの濃度であり、実験は製造業者の指示に従って実施された。
Ｃｙ３でのウレアーゼ標識：ウレアーゼ（２２ｍｇ）を１ｍＬの重炭酸ナトリウムバッファー（１００ｍＭ）に溶解した。次に、ＤＭＳＯ（５ｍＭ）中の７μＬのＣｙ３溶液をウレアーゼ溶液に加え、混合物を室温で暗所で振盪しながら４時間インキュベートした。次いで、標識されたウレアーゼの溶液を２４時間透析して（３．５ｋＤ細孔膜）、非反応Ｃｙ３分子を排除した。
ＭＳＮＰ－Ｕｒ／ＰＥＧによるアンモニア生成の定量化：ナノモーターによって生成されたアンモニアは、滴定法を使用して定量化した。このために、ナノモーターを異なる尿素濃度（１２．５、２５、５０、１００、２００、および３００ｍＭ）でインキュベートし、試料を異なる時点で（５、１５、６０、１２０、２４０分、および２４時間で）分析した。各時点で、ナノモーターの懸濁液を遠心分離し、ｐ－ニトロフェノールを指標として使用して、上清をＨＣｌ（１０ｍＭ）で滴定した。
ナノモーターの光学ビデオ記録およびＭＳＤ分析：６３倍水浸対物レンズを備えた倒立顕微鏡を使用して、ナノモーター移動のビデオを観察および記録した。ナノモーターを含有する模擬尿の水性溶液の試料をガラススライドに入れ、様々な尿素濃度（１２．５、２５、５０、１００、２００、および３００ｍＭ）で模擬尿と十分に混合した。次いで、ドリフトによって引き起こされるアーチファクトを回避するために試料をガラススライドで覆い、３０秒のビデオを記録した。ビデオは、浜松カメラを使用して、５０ｆｐｓのフレームレートで明視野において取得した。条件あたり少なくとも２０個のナノモーターが分析される。Ｐｙｔｈｏｎベースのコードを使用してビデオを分析して、ナノモーターの軌道を取得し、以下のように平均二乗変位（ＭＳＤ）を計算した。
ＭＳＤ（Δｔ）＝＜（ｘ＿ｉ（ｔ＋Δｔ）－ｘ＿ｉ（ｔ））＾２＞、２Ｄ分析についてｉ＝２
この後、拡散係数（Ｄｅ）は、ＭＳＤデータを式２に当てはめることによって得られたが、これは低い回転拡散で、小粒子について短い時間間隔で有効である。３Ｄ細胞培養：ヒト膀胱移行上皮乳頭腫ＲＴ４細胞を、ＦＢＳ（１０％）およびペニシリン－ストレプトマイシン溶液（１％）で補足された、ＭｃＣｏｙの５Ａ（改変）培地において、３７℃および５％ＣＯ２雰囲気で培養した。細胞を４日毎に１：２比で分割した。３Ｄ ＲＴ４細胞培養物を得るために、８ウェルｉｂｉｄｉ皿に２３μＬのＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）（５ｍｇ／ｍＬ）を予めコーティングし、３７℃で３０分間インキュベートし、ゲルを形成させた。次に、５×１０６細胞／ｍＬの密度の３０μＬのＲＴ４細胞の懸濁液を各ウェルに均等に分散し、皿を３７℃で３０分間インキュベートした。最後に、１０％のＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）を含有する１５０μＬのＲＴ４ ＭｃＣｏｙの培地を添加した。培養物を実験前に７日間成長させ、２日毎に培地を交換した。
３Ｄ ＲＴ４細胞培養物におけるＦＧＦＲ３膜貫通タンパク質の免疫染色：上記の３Ｄ培養物をＰＢＳ １×で３回洗浄した。次いで、ウェルの表面をピペット先端でそっと引っ掻き、培養物をチューブにおいてＭｃＣｏｙの培地に懸濁させた。チューブを短時間回転させ、上清を除去した。次に、細胞をホルムアルデヒド（３．７％）に懸濁させ、８ウェル皿に入れ、室温で１５分間インキュベートした。続いて、培養物をＰＢＳ １×で洗浄し、ＰＢＳ－ＢＳＡの溶液（５％）を加え、皿を室温で４０分間インキュベートした。次いで、抗ＦＧＦＲ３を１：５０の割合で培養物に添加し、皿を５％ＣＯ２雰囲気中、３７℃で２４時間インキュベートした。その後、培養物をＰＢＳ １×で３回洗浄し、二次抗体（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ４８８で標識）を１：５００の割合で添加し、皿を暗所において室温で４０分間インキュベートした。最後に、培養物をＰＢＳ １×で３回洗浄し、核をＨｏｅｓｃｈｔで標識し、ＰＢＳ中のグリセロールの溶液（７０％）を加えた。共焦点顕微鏡法を使用して培養物を観察した。
細胞毒性アッセイ：ＲＴ４ ３Ｄ培養物の生存率を、Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅアッセイを使用して定量化し、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ生存率キットを製造業者の指示に従って使用して視覚化した。このために、ＲＴ４細胞を上記のように培養し、７日目に各処理でインキュベートした：アンモニア（１ｍＭ、１．５ｍＭ、３ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、および２０ｍＭ、２４時間）、尿素（２５ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭ、および５０ｍＭ、２４時間）、ＭＳＮＰ－Ｕｒ／ＰＥＧ（１２．５μｇ／ｍＬ、尿素濃度の範囲－２５ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭ、および５０ｍＭ、１、２および４時間）。その後、培養物を培地で洗浄し、２４時間静置し続け、製造業者の指示に従って生存率を調査した。
さらに、生存率はまた、４８時間の時点で評価された。
ＲＴ４ ３Ｄ培養物およびナノモーターのイメージング：７日目に、３Ｄ細胞培養物を各処理（ＭＳＮＰ－Ｕｒ／ＰＥＧまたはＭＳＮＰ－Ｕｒ／ＰＥＧ－Ａｂ、１２．５μｇ／ｍＬ）で４時間インキュベートした。各時点で、培養物を洗浄し、３７℃および５％ＣＯ２雰囲気で２４時間保持した。次いで、培養物をＷＧＡ ６４７（膜）で標識し、６３倍対物レンズおよびガルボステージ、ならびにローダミン、ＦＩＴＣ、ＤＡＰＩ、およびＣｙ５用のフィルターキューブを備えた倒立蛍光顕微鏡を使用して撮像した。
１．２．結果および考察
完全メソポーラスシリカナノ粒子（ＭＳＮＰ）は、ゾルゲル化学を使用して調製し、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）をポロゲン剤として使用し、トリエタノールアミン（ＴＥＯＡ）を塩基触媒として使用した。調製されたＭＳＮＰは、走査電子顕微鏡法（ＳＥＭ）によって特徴付けられた。ＳＥＭ分析は、試料の良好な単分散性（多分散性指数＝０．１１４）および４８１±２ｎｍの平均直径（Ｎ＝１５０、平均サイズ±平均の標準誤差（ＳＥ））を明らかにした。さらに、ＭＳＮＰの多孔質構造を透過電子顕微鏡法によって評価した。明確な放射孔性がＴＥＭによって証明された。この結晶構成は、多孔質パターンの周期性を示した、高速フーリエ変換によってさらに確認された。ナノ粒子の表面積は、Ｂｒｕｎａｕｅｒ－Ｅｍｍｅｔｔ－Ｔｅｌｌｅｒ分析（ＢＥＴ）法を使用して、窒素吸着／脱着を行うことによって研究された。ＭＳＮＰは、メソポーラスシリカ構造に典型的な、ＩＶ型等温線、および２ｎｍの平均孔径で、１１８４．８ｍ２／ｇのＢＥＴ比表面積を示した。
次いで、生成された粒子は、アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）を使用することによってアミン基で機能化された。ＭＳＮＰの表面上のアミン基は、その後グルタルアルデヒド（ＧＡ）で活性化し、それは粒子とウレアーゼおよびヘテロ二機能性ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子との間のリンカーとして作用する（図１Ａ）。ＰＥＧの末端チオール基は、標的化部分、抗線維芽細胞成長因子３（抗ＦＧＦＲ３）の組み合わせを可能する。
機能化ステップに続いて、動的光散乱（ＤＬＳ）および電気泳動移動度分析を行って、それぞれ流体力学的半径および表面電荷を得た。合成されたままのＭＳＮＰのＤＬＳ分析は、懸濁液中の凝集体の存在を示す幅広いピークを示した。ＭＳＮＰの電気泳動移動度分析は、シリカナノ粒子に典型的な、－２６．８１±０．３５ｍＶ（Ｎ＝９、平均±ＳＥ）の表面電荷を示した。アミンでの機能化の成功は、表面上の遊離アミン基の存在に特徴的な、表面電荷における強い正の値（３３．６±１．０ｍＭ、Ｎ＝９、平均±ＳＥ）への顕著な変化によって証明された。アミン機能化ＭＳＮＰ（ＭＳＮＰ－ＮＨ２）の流体力学的半径は、表面電荷および表面化学の両方による粒子の安定化に起因し得る、より鋭いピークを示した。
その後の機能化ステップは、ウレアーゼ酵素およびヘテロ二機能性ＰＥＧの両方の組み合わせに関した。典型的には、ＰＥＧは、スペーサーとして、または粒子間に立体障害を提供することによって懸濁液中での凝集を防止する手段として使用される。我々は、鋭い単一集団ピークが観察された、ＤＬＳ分析によって、ＭＳＮＰ－Ｕｒ／ＰＥＧのコロイド安定性に対するこの効果を確認した。さらに、ＰＥＧ分子は、ＰＥＧの外端における遊離チオール基を抗体のシステイン残基に結合することによって、抗体のナノ粒子へのコンジュゲーションを可能にした。このアプローチは、重鎖の定常領域上に存在するシステイン残基の高い含有量のため、ＩｇＧ抗体の結合に対してより特異性を提供する（図１Ａ）。ＭＳＮＰ－Ｕｒ／ＰＥＧの抗ＦＧＦＲ３抗体とのコンジュゲーション（ＭＳＮＰ－Ｕｒ／ＰＥＧ－Ａｂ）もＤＬＳによって分析し、観察された単一ピークは、抗体の存在が溶液中の粒子の安定性に影響を与えなかったことを示した。我々は、タンパク質のペプチド結合による銅の還元に基づいてタンパク質を定量化するキットを使用して、ＭＳＮＰの表面上のウレアーゼ、および抗体の存在を確認し、ナノモーターに結合した状態でのウレアーゼ酵素活性を評価した。
ＭＳＮＰ－Ｕｒ／ＰＥＧおよびＭＳＮＰ－Ｕｒ／ＰＥＧ－Ａｂの表面上に存在するウレアーゼは、以下の式に従って、尿素のアンモニアおよび二酸化炭素への生体触媒変換を可能にする。
（ＮＨ２）２ＣＯ＋Ｈ２Ｏ→ＣＯ２＋２ ＮＨ３
典型的には、力の非対称生成を達成するために、マイクロ／ナノ構造（例えば、ヤヌス粒子）に幾何学的非対称が誘導され、これは低レイノルズ数で運動を生成するための重要な要件である。しかしながら、最近、生体触媒変換を介して推進されるモーターについて、酵素の分子不均衡分布が、正味運動を生成するために必要な非対称性の生成には十分であることが報告されている。それでも、その以前の研究は、ミクロンサイズのモーターについて報告された。この研究で報告されるＭＳＮＰ－Ｕｒ／ＰＥＧおよびＭＳＮＰ－Ｕｒ／ＰＥＧ－Ａｂナノモーターは、ナノスケールのモーターの自己推進のためのそのような固有の非対称性に依存する。ＭＳＮＰ－Ｕｒ／ＰＥＧおよびＭＳＮＰ－Ｕｒ／ＰＥＧ－Ａｂの運動プロファイルは、模擬尿中で、様々な尿素濃度（０ｍＭ、１２．５ｍＭ、２５ｍＭ、５０ｍＭ、１００ｍＭ、２００ｍＭ、および３００ｍＭ）の存在下で評価された。光学追跡技法を使用して、ナノモーターの追跡軌道を取得し（図２ＡおよびＢ）、次いでそれを使用して平均二乗変位（ＭＳＤ）を計算した。図２Ｃは、模擬尿中のウレアーゼ／ＰＥＧナノモーターおよび抗体修飾ナノモーターの典型的なＭＳＤを示す。我々は、ＭＳＤが時間とともに線形増加することを観察し、これは拡散運動に特徴的であり、ＭＳＤを以下の式に当てはめることによって各所与の条件について有効拡散係数を求めた。
ＭＳＤ（Δｔ）＝４ ＤｅΔｔ
式中、Ｄｅは有効拡散係数を表し、Δｔは時間間隔を表す。
図２Ｄは、ＭＳＮＰ－Ｕｒ／ＰＥＧおよびＭＳＮＰ－Ｕｒ／ＰＥＧ－Ａｂの両方について計算された有効拡散係数を示し、５０ｍＭの尿素濃度で有意な拡散の増加が達成されたことを証明した（ｐ＜０．００１）。拡散係数は、模擬尿中の増加する尿素濃度でさらに増加し、プラトーに達した。増加する尿素濃度に対する拡散の増加は、以下の式に従う、ウレアーゼ酵素ミカエリス－メンテン動力学に関連し得る。
Figure 2022512131000002
 式中、Ｖ最大は最大反応速度を表し、Ｓは基質濃度を表し、Ｋｍはミカエリス－メンテン定数を表す。図２Ｄに示されるように、ＭＳＮＰ－Ｕｒ／ＰＥＧおよびＭＳＮＰ－Ｕｒ／ＰＥＧ－Ａｂの運動プロファイル間に有意差は見られず、この標的化部分の存在がナノモーターの運動能力を妨げないことを示す。
我々は、ヒト膀胱移行上皮乳頭腫ＲＴ４細胞の３Ｄ培養物（スフェロイド）を使用することによって、ナノモーターの運動に必要な基質（尿素）および生体触媒作用の副産物（アンモニア）のインビトロ生体適合性を研究した。スフェロイドは、細胞外マトリックスに似ており、細胞成長のための３Ｄ環境を提供する、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）でコーティングされた皿にＲＴ４細胞を播種することによって得た。次いで、培養物を７日間増殖させ、スフェロイド成長を毎日監視した。次いで、スフェロイドを各条件で２４時間インキュベートすることによって、様々な濃度の尿素（０ｍＭ、２５ｍＭ、５０ｍＭ、および１００ｍＭ）ならびにアンモニア（０ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭ、および５０ｍＭ）の効果を調査した。その後、培養物を培地で洗浄し、細胞生存率および増殖を、Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅアッセイを使用して評価した。このアッセイは、代謝的に活性な細胞による蛍光化合物レゾルフィンへのレサズリンの還元に基づく。
尿素は、良好な生体適合性を示し、我々が研究した最高濃度でさえもスフェロイド生存率に影響を与えなかったが、アンモニアは、増加する濃度とともに増加した細胞毒性の傾向を明らかにした。それにもかかわらず、スフェロイドは、試験されたすべてのアンモニア濃度で生存可能（＞７０％生存率）のままであった。
様々な濃度の尿素下、かつ異なるインキュベーション期間で、ナノモーター（ＭＳＮＰ－Ｕｒ／ＰＥＧ）に曝露された場合のスフェロイドの生存率をさらに調査した。スフェロイドは、１２．５μｇ／ｍＬのベアナノモーターまたは抗体修飾ナノモーターと、０ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭ、および４０ｍＭの尿素で、１、２および４時間インキュベートした。次に、培養物を培地で完全に洗浄して、ナノモーターおよび未触媒尿素を除去し、分析前に２４時間保持した。膀胱癌スフェロイドの生存率に対するナノモーターの効果は、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）生存率キットを使用して視覚化され、Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅアッセイを使用して定量化された（図３）。尿素の不在下、ナノモーターは毒性ではないことが観察され、これはナノモーターのシャーシ（メソポーラスシリカ、タイプＭＣＭ－４１）、ならびにＰＥＧおよび酵素の良好な生体適合性を示す。増加する濃度の尿素の存在下、細胞毒性効果が両方のナノモーターについて示され、抗体修飾ナノモーターでより顕著である（図３）。ベアナノモーターについて観察された毒性は、尿素の生体触媒変換に起因するアンモニアの生成によるものである。しかしながら、抗体を運ぶナノモーターについて確認されたより高い細胞毒性効果は、スフェロイドの膜上に存在する抗ＦＧＦＲ３および抗原の間の相互作用から生じ得る。これらの部分間の相互作用は、細胞成長および増殖に関与する、ＦＧＦシグナル伝達経路を遮断することが報告されている。
スフェロイドで観察される細胞毒性効果へのアンモニアの寄与をよりよく理解するために、異なる濃度の尿素で定義された期間にナノモーターによって生成されたアンモニアの有効濃度が研究された。１２．５μｇ／ｍＬのナノモーターを様々な濃度の尿素（０ｍＭ、１２．５ｍＭ、２５ｍＭ、５０ｍＭ、１００ｍＭ、２００ｍＭ、および３００ｍＭ）とインキュベートし、ｐＨの指標としてｐ－ニトロフェノールを使用した。ナノモーターによるアンモニアおよび二酸化炭素への尿素の変換は、ｐＨの急激な上昇をもたらすため、ナノモーターを含有する溶液は、ｐ－ニトロフェノールの存在によって黄色に変わり、ＨＣｌで滴定して、以下の式に従って、存在するアンモニアの量を定量化することができる。
ＮＨ３＋ＨＣＩ→ＮＨ４ＣＩ
この濃度のナノモーターでは、到達した最大アンモニア出力は、１７ｍＭであることがわかり、これは膀胱癌スフェロイドに対して生体適合性であることがわかった（２０ｍＭのアンモニアについて＞７０％生存率）。それにもかかわらず、ナノモーターおよび尿素とのインキュベーション後、観察された細胞毒性効果は、遊離アンモニアよりも強い。この結果は、スフェロイドの近くのナノモーターによる局所的に高濃度のアンモニアの生成から生じ得、よって、より高い細胞毒性につながる。
ナノモーターの強化された拡散能力および生体適合性を考慮して、膀胱癌スフェロイドを標的にし、これに浸透するそれらの潜在性がその後調査された（図４）。まず、蛍光標識抗体によって試料上の特定のタンパク質の場所を視覚的に検出するために使用される技法である免疫細胞化学によって、膀胱癌スフェロイドの表面での標的化抗原（ＦＧＦＲ３）の発現が確認された。膀胱癌スフェロイドの免疫細胞化学は、細胞膜上に緑色の蛍光を示し、膜貫通タンパク質ＦＧＦＲ３の存在を確認し、青色は、Ｈｏｅｃｈｓｔで標識された細胞核を表す。
次いで、膀胱癌スフェロイドに浸透するナノモーターの能力、および内在化効率に対する標的化部分の存在の効果が調査された。さらに、４０ｍＭの尿素の存在下で、スフェロイドをベアナノモーターまたは抗体修飾ナノモーターとインキュベートすることによって、内在化効率における能動的運動の影響が評価された。このため、ウレアーゼは、ＭＳＮＰ－ＮＨ２上へのその機能化の前に蛍光マーカーであるシアニン３（Ｃｙ３）で標識して、蛍光顕微鏡法を使用してナノモーターを正確に局限した。次いで、ナノモーターを純粋ウレアーゼおよび標識ウレアーゼ（５％）の両方で機能化し、標識酵素の存在にもかかわらず運動能力が保持されていることを確認した。次に、３Ｄ培養物を１２．５μｇ／ｍＬのＭＳＮＰ－Ｕｒ／ＰＥＧ－Ａｂ、または標的化のための陰性対照としてのＭＳＮＰ－Ｕｒ／ＰＥＧと、尿素（４０ｍＭ）の不在および存在下で、４時間インキュベートした。その後、培養物を洗浄し、細胞膜を小麦胚芽凝集素（ＷＧＡ）で標識した。スフェロイド（直径５０～１００ｐｍ）内のＣｙ３の蛍光強度の定量化は、能動的モーターが、尿素の不在下よりも３倍高い内在化効率を示すことを明らかにし、これは能動的な運動によって生成される推進力のためであり得る。さらに、尿素の存在下では、抗体修飾ナノモーターは、抗体なしのナノモーターよりも４倍高い内在化効率を示す（図４）。これは、ナノモーターが能動的に動いている場合、抗体が標的抗原と相互作用する確率が、ブラウン拡散のみが起こっている場合よりも高いためであり得る。我々の場合、４０ｍＭの尿素で推進するナノモーターは、ＭＳＤによって証明されるように、ブラウン拡散を単に経験するナノモーターよりも１秒で５３％広い面積をカバーし、これは抗体が抗原と接触し、スフェロイドに浸透する可能性を高める。
使用された抗体が抗原に結合した場合に細胞のＦＧＦシグナル伝達経路を遮断することを考慮して、細胞増殖を分析することによって、抗体修飾ナノモーターの潜在的な治療効果がさらに調査された（挿入図４）。このために、膀胱癌スフェロイドを、対照として抗体を含まないナノモーターを使用して、尿素ありおよびなしで、ＭＳＮＰ－Ｕｒ／ＰＥＧ－Ａｂと４時間インキュベートした。その後、スフェロイドを洗浄して、未触媒尿素および非内在化ナノモーターを除去し、Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅアッセイを使用して４８時間の休止期間後に増殖を測定した。ベアナノモーター（抗体なし）とインキュベートされたスフェロイドは、２４時間で観察された生存率レベルを維持したが、抗体修飾ナノモーターとインキュベートされたスフェロイドは、生存率を低下させたことが観察され、細胞増殖が停止されたことを示した。これらの結果は、標的化膀胱癌療法のためのツールとしての抗ＦＧＦＲ３抗体を運ぶナノモーターの適用可能性を示す。
１．３．結論
ＰＥＧが、凝集を防止する立体障害およびナノモーターの表面上の特定の膀胱癌抗体（抗ＦＧＦＲ３）を接続するリンカーの両方として作用する、ＰＥＧを含むウレアーゼ駆動ナノモーターが開発された。ナノモーターは、抗体ありおよびなしで、膀胱に見られる様々な濃度の尿素での模擬尿中の強化された拡散を示し、これはこの臓器における生物医学的用途でのそれらの使用を可能にすることができる。私は、従来の２Ｄ培養物と比較される場合、より良好な模倣腫瘍環境であると考えられる、ヒト膀胱癌細胞（３Ｄ培養物）に由来するスフェロイドを使用して、これらの酵素ナノモーターの基質依存性誘導毒性を実証した。内在化現象は、膀胱排尿間隔と同様の期間で監視され、能動的運動がナノモーター浸透を３倍強化することが観察された。さらに、活性抗体修飾ナノモーターは、抗体なしの活性ナノモーターよりも４倍高い内在化効率を示し、これはスフェロイドに浸透する活性粒子の能力に対する自己推進および標的化の影響を反映した。スフェロイドについての細胞増殖研究は、標的化ナノモーターがベアナノモーター（抗体なし）よりも高い生存率の損失を誘導することを示し、細胞増殖の抑制およびより高いナノモーター内在化率の両方に起因し得る抗ＦＧＦＲ３の治療効果を示した。これらの結果は、粒子の標的化能力が能動的運動で強化され、抗ＦＧＦＲ３抗体の治療効果の改善をもたらすため、標的化膀胱癌療法におけるツールとしてのそのような抗体修飾ナノモーターの可能性を示す。
２．局所ｐＨ監視のためのＤＮＡナノスイッチで修飾された酵素駆動マイクロモーター
２．１．材料および方法
化学品
未修飾およびフルオロフォアタグ付きＤＮＡオリゴヌクレオチドは、ＩＢＡ ＧｍＢＨ（Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって合成および精製され（ＨＰＬＣ精製）、さらなる精製なしに使用された。ＤＮＡ構築物の配列を以下に報告する。
ＤＮＡ配列
ｐＨ応答性ＤＮＡナノスイッチ
（配列表１）
Figure 2022512131000003
アミノ修飾ＤＮＡ足場
５’－ＧＡＣＡＧＡＣＡＧＡＣＡＧＡＣＡＡＧＧＡ－ＮＨ２－３’
対照スイッチ
（配列表２）
Figure 2022512131000004
Figure 2022512131000005
 上記のすべての配列について、太字の塩基は、二重鎖部分のループを表し、下線が引かれた塩基は、平行三重鎖領域のループを表す。ｐＨ応答性ＤＮＡナノスイッチおよび対照スイッチの両方は、アミノ修飾ＤＮＡ足場に完全に相補的な（２０塩基）部分（ここではイタリック体）を有する。
バッファー条件
すべてのＤＮＡオリゴマーは、１×ＰＢＳ中で保存した（１００μＭ）。
蛍光測定
蛍光測定は、Ｃａｒｙ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｅｒ（Ｖａｒｉａｎ）で行い、励起波長をλｅｘ＝５３０ｎｍ（ｓｌｉｔｅｘ＝５ｎｍ）および取得を５４０～７００ｎｍ（ｓｌｉｔｅｍ＝５ｎｍ）に設定し、低減した体積（１００μＬ）の石英キュベットを使用した。すべての測定は、１０ｍＭのＨＥＰＥＳにおいてＴ＝２５℃で行った。スイッチは、まず１μＭの濃度でＨＥＰＥＳ １０ｍＭに希釈した。次いで、このストック溶液を同じバッファーで２０ｎＭに希釈し、そのｐＨを所望の値（ｐＨ５．０～９．０）に調整した。
蛍光データ分析
レシオメトリックＦＲＥＴは、以下のように計算された。
Figure 2022512131000006
式中、ＦＣｙ５は、Ｃｙ５の最大蛍光発光（λｅｍ＝６７０ｎｍ）であり、ＦＣｙ３は、Ｃｙ３の最大蛍光発光（λｅｍ＝５７０ｎｍ）である。Ｒａｔ．ＦＲＥＴ対ヒドロニウムイオン濃度をプロットし、データを以下のラングミュアタイプの式で当てはめることによって、ｐＨ滴定曲線を得た。
Figure 2022512131000007
式中、Ｒａｔ．ＦＲＥＴＴＲＩＰＬＥＸおよびＲａｔ．ＦＲＥＴＤＵＰＬＥＸは、それぞれ、三重鎖状態（閉）および二重鎖状態（開）におけるスイッチのＦＲＥＴシグナルを表し、［Ｈ＋］は、水素イオンの総濃度を表し、
Figure 2022512131000008
 は、スイッチについて観察された酸定数である。
マイクロカプセル製造
ポリスチレン（ＰＳ）をベースとする市販の２μｍ粒子（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号７８４５２）を、以前に報告された共縮合法（Ｒｅｆ．Ｍａ Ｘｉｎｇ ＡＣＳ Ｎａｎｏ ２０１６）によって二酸化ケイ素シェルに使用した。簡潔には、２５０μＬのポリスチレン粒子（ストック溶液、１０％固体）を０．５ｍＬの９９％エタノール（Ｐａｎｒｅａｃ Ａｐｐｌｉｃｈｅｍカタログ番号１３１０８６－１２１４）、０．４ｍＬのＭｉｌｌｉ－Ｑ水、および２５ｕｌの水酸化アンモニウム（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号２２１２２８）と混合した。混合物を室温（ＲＴ）で５分間撹拌した。次いで、２．５μＬの３－アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）９９％（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号４４０１４０）を溶液に添加し、これを撹拌しながら室温で６時間インキュベートした。次に、７．５μｌのテトラエチルオルトシリケート（ＴＥＯＳ）≧９９％（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号８６５７８）を添加し、得られた混合物を磁気撹拌下、室温で一晩反応させた。二酸化ケイ素シェルでコーティングされたポリスチレンからなる得られたマイクロ粒子を、３５００ｒｐｍで３．５分間遠心分離することによって、エタノール中で３回洗浄した。次いで、ポリスチレンコアを、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）≧９９．８％（Ａｃｒｏｓ Ｏｒｇａｎｉｃｓカタログ番号４２３６４００１０）中で１５分間、４回の洗浄を行うことによって粒子をインキュベートすることによって除去した。得られたマイクロカプセルをエタノール中で３回洗浄し、それらの使用まで室温で保存した。マイクロカプセルのサイズおよび形態を特徴付けるために、走査電子顕微鏡法（ＳＥＭ）（ＦＥＩ ＮＯＶＡ ＮａｎｏＳＥＭ ２３０）および透過電子顕微鏡法を実施した。
ウレアーゼおよびＤＮＡナノスイッチ機能化
中空シリカマイクロカプセルは、ウレアーゼで機能化されて、自己推進を備えた。このために、ＳｉＯ２マイクロカプセルを、３５００ｒｐｍで３．５分間遠心分離することによってＭｉｌｌｉ－Ｑで３回洗浄した。その後、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ＝７．４）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログ番号７００１１－０３６）中でのさらに３回の洗浄を行った。次いで、マイクロカプセルを、ＰＢＳ中の２．５％（重量）グルタルアルデヒド溶液（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号Ｇ６２５７）に懸濁させ、エンドツーエンド混合下室温で３時間放置した。ＧＡ機能化粒子をＰＢＳ１×中で３回洗浄し、ＰＢＳ中の、２００μｇ／ｍｌのＣａｎａｖａｌｉａ ｅｎｓｉｆｏｒｍｉｓ（タチナタマメ）由来のウレアーゼ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号Ｕ４００２）、および１μＭのＤＮＡ足場を含有する溶液に懸濁させた。得られた溶液を、２時間エンドツーエンド混合下に保持した。次いで、３回の洗浄をＰＢＳ中で行い、機能化粒子をそれらの使用まで４℃で保持した。
運動分析
マイクロモーターは、６３倍水浸対物レンズおよび浜松カメラを備えた倒立光学顕微鏡（Ｌｅｉｃａ ＤＭｉ８）下で、毎秒２５フレームの割合で２０秒間記録された。各条件について、少なくとも１５個の粒子が記録された。マイクロモーター軌道は、以下の式を適用することによって、モーターのＭＳＤおよび速度を計算することを可能にしたカスタムメイドのＰｈｙｔｏｎベースのコードによって分析した。
ＭＳＤ（Δｔ）＝＜（ｘｉ（ｔ＋Δｔ）－ｘｉ（ｔ））２＞（１）
ＭＳＤを式１に当てはめることによって、速度を求めた。
ウレアーゼ活性測定
酵素活性は、ウレアーゼ活性によるアンモニア生成を測定する比色アッセイであるＢａｒｔｈｅｌｏｔ法に基づく、Ｕｒｅａｓｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｋｉｔ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して、製造業者の指示に従うことによって測定された。まず、マイクロモーターを１００ｍＭの尿素とインキュベートした。次いで、異なる時点で、製造業者の指示に従って酵素反応を停止させた。その後、測定による粒子の干渉を回避するために、試料を３５００ｒｐｍで３．５分間遠心分離した。各試料からの上清を収集し、６７０ｎｍで吸光度を測定して、ウレアーゼ活性を決定した。
２．２．結果および考察
表面上にアミン基を有する中空シリカマイクロカプセルは、図５Ａに示されるように、以前に報告された共縮合法（Ｍａ，Ｘ．ｅｔ ａｌ．，“Ｍｏｔｉｏｎ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｕｒｅａ－Ｐｏｗｅｒｅｄ Ｂｉｏｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ Ｈｏｌｌｏｗ Ｍｉｃｒｏｃａｐｓｕｌｅｓ”，ＡＣＳ Ｎａｎｏ，２０１６，ｖｏｌ．１０（３），ｐｐ．３５９７－３６０５）に従って、シリカ前駆体として３－アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）およびテトラエチルオルトシリケート（ＴＥＯＳ）を使用して２μｍの
（記号１）
Figure 2022512131000009
市販ポリスチレンマイクロ粒子上でのＳｉＯ２シェルの成長、続いてジメチルホルムアミドによるポリスチレンコアの除去に基づいて合成された。
実施例１に記載されるように、リンカーとしてグルタルアルデヒド（ＧＡ）を使用して、ウレアーゼをマイクロモーター表面に共有結合でコンジュゲートした。このステップ中、ｐＨ応答性ＤＮＡナノスイッチのアンカー部分として機能した、アミノ修飾一本鎖ＤＮＡ（ＤＮＡｓｓ、２０塩基）もコンジュゲートされた（図５Ｂ）。図５Ｃは、ＤＮＡナノスイッチの開放／閉鎖状態に基づくｐＨ検知戦略の概略図を示し、これはそれぞれ、低または高ＦＲＥＴ効率をもたらす。得られる中空マイクロカプセルは、走査および透過電子顕微鏡法（それぞれ、ＳＥＭおよびＴＥＭ）の両方によって研究された。図５Ｄは、非常に単分散のサイズ（２．０４±０．０６μｍ、平均±平均の標準誤差）および粗い表面を有するマイクロカプセルを観察することができるＳＥＭ顕微鏡写真を示す。マイクロカプセルは、おそらく以前に報告されたようなシリカシェルの成長中の粒子の近接性のために、それらの表面上に穴を示し、これは構造的非対称性を提供する。図５Ｅは、ＴＥＭによって取得されたトポグラフィー画像を示し、異なる疑似カラーは、高さをμｍで示す。
機能化プロセスは、各ステップ後にマイクロ粒子のζ電位を測定することによって特徴付けられた（図５Ｆ）。最初に、マイクロカプセルは、アミン基の存在のために正に帯電した表面を示し、これは次いでＧＡでの修飾のために負帯電にシフトされた。ウレアーゼ添加後、表面電荷は、わずかに低減した。ウレアーゼおよびＤＮＡｓｓ（ＵＲ＋ＤＮＡｓｓ）の両方での機能化も、ＧＡに関してζ電位の低下をもたらした。
最後に、マイクロ粒子をＤＮＡナノスイッチ（すなわち、１μＭ）を含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中でインキュベートした。ナノスイッチの酵素／アンカー鎖コンジュゲートモーターとの１５分のインキュベーションは、ｐＨ応答性ナノスイッチでシリカ粒子を機能化するのに十分であった。注目すべきことに、スイッチは、シリカマイクロカプセルに共有結合でコンジュゲートしたＤＮＡｓｓと相補的な配列の５’末端に２０塩基長の隣接テールを示す。コンジュゲーションの結果として、表面電荷のさらなる低下が測定されており、スイッチでのモーターの効果的な機能化を確認する。ここで採用されるｐＨ応答性ＤＮＡナノスイッチが、ワトソン－クリックおよび平行フーグスティーン相互作用の両方で安定化された分子内ＤＮＡヘアピンを含有する三重鎖形成一本鎖ＤＮＡであることも注目に値する。ワトソン－クリック（Ｗ－Ｃ）相互作用はｐＨに対して効果的に非感受性であるが、フーグスティーン相互作用は強力でプログラム可能なｐＨ依存性を示す（図６Ａ）。ナノスイッチをＦＲＥＴペアで標識することによって、我々は、マイクロモーターの近くの溶液のｐＨを決定するために使用することができるｐＨ依存性の三重鎖から二重鎖への遷移を監視することができる。より具体的には、シアニン－３フルオロフォア（Ｃｙ３）は、ヘアピン二重鎖ＤＮＡのループにおいて内部でコンジュゲートされ、シアニン－５フルオロフォア（Ｃｙ５）は、三重鎖形成ＤＮＡ部分の３’末端で結合する。
蛍光マイクロキュベット中の緩衝溶液（１００μＬ溶液）のｐＨを変動させることによって、ＤＮＡスイッチの固定濃度（すなわち、５０ｎＭ）で行われる蛍光アッセイは、ｐＨの関数としてのＦＲＥＴ効率の変化を明確に示す。予想通り、酸性ｐＨ値では、分子内三重鎖構造が優先され、高いＦＲＥＴ効率（Ｃｙ３およびＣｙ５が近接している）が観察される。溶液のｐＨを増加させると、三重鎖構造が不安定になり、三重鎖から二重鎖への遷移（アンフォールディング）によるＦＲＥＴシグナルの段階的な減少が観察される（図６Ａ）。注意として、ここで使用されるフルオロフォアは、シグナルにおける任意の干渉を回避するために、調査されたｐＨの範囲（ｐＨ５．０～ｐＨ９．５）のｐＨに感受性ではない。このクラスの三重鎖ベースのスイッチは、ｐＨ変動のリアルタイム監視を可能にするのに十分な速さで開放／閉鎖動力学を示すことに注意することが重要である（平均時定数約１００ｍｓ）。
マイクロモーターにコンジュゲートした時点のスイッチの機能性を試験するために、６３倍油浸対物レンズを備えたＬｅｉｃａ－ＳＰ５共焦点レーザー走査顕微鏡（ＣＳＬＭ）を通してＦＲＥＴ効率を監視した（図６Ｂ）。このために、マイクロモーターをｐＨ５またはｐＨ９のいずれかでＰＢＳ中に懸濁させ、ＣＳＬＭ下でのそれらの分析のために８ウェルガラス底皿に入れた。ドナー（Ｃｙ３）の発光は、５６４ｎｍのダイオードレーザーを使用して記録した。ＦＲＥＴ画像は、Ｃｙ３フルオロフォアを励起し、アクセプター（Ｃｙ５）発光を検出することによって取得した。カスタムメイドのＩｍａｇｅＪプラグインを使用して、ＦＲＥＴ／Ｃｙ３比を計算することによってＦＲＥＴ効率の定量化を達成した。
これらの結果は、ＤＮＡナノスイッチ修飾マイクロモーターが、それらの周囲環境においてｐＨ変化を検出することができることを示した。ｐＨ検出の特異性を実証し、蛍光強度におけるｐＨの任意の効果を破棄するために、マイクロモーターは、ｐＨ変化に応答しない、対照スイッチで修飾した。図６Ｃおよび６Ｄは、ｐＨ応答性ＤＮＡナノスイッチ（図６Ｃ）または非ｐＨ応答性ＤＮＡナノスイッチ（図６Ｄ）のいずれかで修飾されたマイクロモーターからのＦＲＥＴ／Ｃｙ３発光の定量化を示す。具体的には、非ｐＨ応答性プローブとして、ＷＣ相互作用を通して安定化された同じ分子内ＤＮＡヘアピンおよび三重鎖フォールディングを可能にしないスクランブルＤＮＡテールを含有する一本鎖ＤＮＡが選択された。予想通り、評価されたすべてのｐＨで高いＦＲＥＴ効率を示す非ｐＨ応答性ナノスイッチを使用する場合、有意差は見られなかった。
ウレアーゼおよびＤＮＡナノスイッチで二重機能化された中空マイクロモーターの運動ダイナミクスを、燃料として作用する１００ｍＭの尿素の不在下または存在下のいずれかでの光学的記録によって分析した。このために、６３倍水浸対物レンズおよび浜松カメラを備えたＬｅｉｃａ ＤＭｉ８倒立蛍光顕微鏡を使用した。条件あたり少なくとも１５個のマイクロ粒子が、２０秒間に２５フレーム／秒（ＦＰＳ）の割合で記録された。Ｐｙｔｈｏｎベースのコードを使用して、マイクロモーターの軌道を追跡し、軌道から、ＭＳＤを以下の式に従って計算され、
ＭＳＤ（Δｔ）＝＜（ｘｉ（ｔ＋Δｔ）－ｘｉ（ｔ））２＞（１）
式中、２Ｄ分析についてｉ＝２である。尿素基質の添加後、ＭＳＤは放物形を示し、これは活性マイクロ粒子の推進レジームに対応する。
しかしながら、燃料の不在下では、ブラウン運動のみが観察され、ライナーフィットをもたらし、運動がマイクロモーターの表面での触媒反応から生じることを示す。推進粒子の速度は、以下の式を適用することによって計算される、６．４±０．６μｍ／ｓ（平均±平均の標準誤差）であることがわかり、
ＭＳＤ（ｔ）＝４Ｄｔｔ＋ｖ２ｔ２ （２）
式中、Ｄｔ＝拡散係数、ｖ＝速度、およびｔ＝時間である。
驚くべきことに、この速度は、以前に報告された非対称ヤヌス酵素駆動マイクロカプセル（Ｍａ Ｘ．ｅｔ ａｌ．、上記）に匹敵し、非ヤヌスマイクロ粒子（Ｐａｔｉｎｏ Ｔ．ｅｔ ａｌ．、上記）よりもわずかに高い。いかなる理論によっても縛られることなく、この効果は、確率論的に粒子の周りのＤＮＡナノスイッチおよび酵素を共固定化することによって提供される非対称性によって引き起こされ得る。
自己推進している間に生成される局所的ｐＨ変化を同時に記録するマイクロモーターの能力は、ＣＳＬＭを使用した光学追跡およびＦＲＥＴイメージングの両方を組み合わせることによって評価し、２５秒ビデオを３ＦＰＳで記録した。燃料の不在下、１．８±０．０９（平均±平均の標準誤差）の平均ＦＲＥＴ／Ｃｙ３比が観察された。尿素が溶液に添加されると、ＦＲＥＴ／Ｃｙ３比はすぐに１．５±０．０５まで低下し、マイクロモーター活性によるｐＨ増加を示した。２５秒の記録中に、ＦＲＥＴ／Ｃｙ３比に有意差は観察されなかった。燃料の不在下、マイクロモーターは、ブラウン運動および２に近いＦＲＥＴ／Ｃｙ３比のみを示した。対照的に、尿素に曝露されたマイクロモーターの場合、ＦＲＥＴ／Ｃｙ３比は、分析の瞬間（０秒）ですでに低下しており、尿素基質を添加した直後にウレアーゼベースの酵素反応が起こり、粒子の周りの局所的なｐＨ変化を誘導し、それは瞬時に検出されるため、ｐＨがすでに変化していることを示した。
これらの結果は、自己推進のための継続的な化学反応を生成しながら、それらの周りの微小環境を感知する能動的なＤＮＡ修飾マイクロモーターの能力を示す。
反応の最初の瞬間からのマイクロモーター周辺の瞬間的なｐＨ変化への洞察を得るために、コーティング剤としてＡＰＴＥＳを使用してマイクロモーターをガラス表面に固定化して、正の表面電荷を提供し、負に帯電したマイクロモーターとの静電相互作用を安定させた。マイクロモーターを固定化することは、燃料の追加前および後で同じマイクロモーターを視覚化すること、ならびに目的の領域を除外する前により長い時間（２分および１０分）での分析を可能にした。
図７Ａおよび７Ｂは、モーターの光学的追跡から得られる、それぞれ、平均ＭＳＤおよび速度を示す。ＭＳＤおよび速度の継続的な低下をはっきりと観察することができる。興味深いことに、速度は時間の経過とともに低下したが、速度が０に近いことがわかったとき、ｐＨは１０分まで上昇し続けた。
これらの結果は、速度の低下が酵素活性の低下に直接起因するものではなく、尿素分解時のイオン生成物の生成または酵素反応に理想的ではない高ｐＨなどの他の因子が運動ダイナミクスに影響を及ぼし得ることを示す。
ＤＮＡスイッチナノテクノロジーの使用は、モーターの微小環境におけるｐＨの検知を可能にし、ウレアーゼなどのｐＨ変化を誘導する酵素を使用する場合にそれら自体の活性を監視するためにも使用することができる。よって、バイオセンシングツールの酵素駆動モーターへの統合は、センサーとしてのそれらの用途だけでなく、マイクロモーターのそれらの固有の活性も監視して、それらの運動ダイナミクスおよびメカニズムを理解するための新しい洞察を提供する。加えて、ＤＮＡおよび酵素の高い汎用性は、幅広い用途のためのマイクロモーター特性の調整を可能にする。
２．３．結論
本明細書で提供されるデータは、ＤＮＡ技術を生体触媒マイクロスイマーと組み合わせて、それらの周囲の環境を検出しながら同時に自己推進することができる能動的でスマートなシステムを生成する可能性を示す。燃料の存在下でのそれらの活性化後のマイクロモーターの表面周辺のｐＨ変化の正確で定量的な分析は、ｐＨ感受性ＤＮＡナノスイッチおよび共焦点顕微鏡法によるＦＲＥＴイメージングの使用を通して達成した。マイクロモーターの局所的ｐＨ変化および運動ダイナミクスは、３０秒、２分、および１０分で燃料の存在下で同時に分析された。速度が指数関数的に低減される間、ｐＨは継続的に増加し、酵素活性ではなく他の因子がマイクロモーターの自己推進に影響を及ぼし得ることを示す。
これらの結果は、微小環境の変化を監視するだけでなく、活性指標としても、正確かつ定量的な様式でマイクロモーターによる同時検知の関連性を強調する。将来の方向性は、細胞内または局在化組織ｐＨ変化、および他の分析物の検出につながるであろう。さらに、この相乗的な技術は、ｐＨ変化がセンスアクトプラットフォームによるカーゴの放出を引き起こす多機能性マイクロモーターへの分野を開くであろう。
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Claims (16)

  1. －表面を有する粒子と、
    －酵素と、
    －異種分子と、を含み、
    前記酵素および前記異種分子が、前記粒子の前記表面全体にかけて不連続に付着していることを特徴とする、酵素駆動ナノモーター。
  2. 前記粒子が、ナノ粒子またはマイクロ粒子である、請求項１に記載のナノモーター。
  3. 前記粒子が、金属、金属酸化物、ポリマー、脂質、タンパク質、細胞膜、細胞体、炭素質材料、およびそれらの混合物からなる群から選択される材料で作製される、請求項１～２のいずれかに記載のナノモーター。
  4. 前記粒子が、メソポーラスシリカで作製される、請求項１～３のいずれかに記載のナノモーター。
  5. 前記酵素が、グルコースオキシダーゼ、尿素、カタラーゼ、グルタミン酸オキシダーゼ、キサンチンオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、ビリルビンオキシダーゼ、リパーゼ、プロテアーゼ、ヘキソキナーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、およびトリプシンからなる群から選択される、請求項１～４のいずれかに記載のナノモーター。
  6. 前記酵素が、ウレアーゼである、請求項５に記載のナノモーター。
  7. 前記異種分子が、標的化分子、標識分子、ナノセンサー、および分子ゲートからなる群から選択される、請求項１～６のいずれかに記載のナノモーター。
  8. 前記標的化分子が、抗体である、請求項７に記載のナノモーター。
  9. 前記ナノセンサーが、ＤＮＡナノスイッチである、請求項７に記載のナノモーター。
  10. カーゴをさらに含む、請求項１～９のいずれかに記載のナノモーター。
  11. 治療有効量の請求項１～１０のいずれかに定義されるナノモーターと、薬学的に許容される賦形剤および／または担体と、を含む、薬学的組成物。
  12. 療法、診断、または予後における使用のための、請求項１～１０のいずれかに定義されるナノモーター、または請求項１１に定義される薬学的組成物。
  13. 癌の治療における使用のためのものである、請求項１２に記載の使用のためのナノモーターまたは薬学的組成物。
  14. 前記癌が、膀胱癌である、請求項１３に記載の使用のためのナノモーターまたは薬学的組成物。
  15. －請求項１～１０のいずれかに定義されるナノモーターまたは請求項１１に定義される薬学的組成物と、
    －その使用のための説明書と、を含む、キットオブパーツ。
  16. 請求項１～１０のいずれかに定義されるナノモーターを試料と接触させることを含む、単離された前記試料中の分析物を検出するインビトロ方法。

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