CN108524941B - 一种酶驱动瓶状纳米马达及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种酶驱动瓶状纳米马达及其制备方法，其步骤在于，以瓶状纳米粒子、葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶为材料，利用真空灌注法和超声灌注法，将葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶同时装载在瓶状纳米粒子的内部，制备出酶驱动的瓶状纳米马达，与现有技术相比，本发明的有益效果在于，本发明制备过程简单，制备的纳米马达生物相容性好，控制性强，能在葡萄糖溶液，沿着葡萄糖浓度梯度运动，实现酶驱动瓶状纳米马达的趋化运动，在药物携载、毒素清除、肿瘤治疗等生物医学领域具有广泛的应用前景。

Description

一种酶驱动瓶状纳米马达及其制备方法
技术领域
本发明涉及医学生物材料技术领域，具体涉及一种酶驱动瓶状纳米马达及其制备方法。
背景技术
在人们对于未来的展望中，经常有微纳米尺度的器械或机器人进入人体的场景，人们想象这些微纳米器械可以在体内运动并可以治疗一些常规手段难以治疗的疾病的场景。近些年，这些想象逐渐的走向现实，科学家们开展了关于人造微纳米马达的研究。微纳米马达是利用环境中的能量，将化学能，光能，电能等能量转化为自身动能的装置，其驱动方式可分为两类，一类是利用环境中的化学物质，通过局部化学反应将化学能转化为动能以驱动马达运动；而另一类则是无燃料系统，这是通过如光、磁场、超声波等外界刺激以驱动马达运动。其中，化学驱动马达多以过氧化氢为燃料。由于过氧化氢在人体内的含量较低、且对人体具有一定的毒副作用，因此气泡驱动马达的生物实用性较差，而外场驱动马达的控制性较差，难以对其运动进行定位和控制。
鉴于上述缺陷，本发明创作者经过长时间的研究和实践提出了本发明。
发明内容
为解决上述技术缺陷，本发明采用的技术方案在于，提供一种酶驱动瓶状纳米马达，其包括瓶状纳米粒子骨架、位于所述骨架内部的两种酶，且所述酶驱动瓶状纳米马达能沿葡萄糖浓度梯度进行趋化运动，且所述酶驱动瓶状纳米马达采用如下方法制备：
步骤一、制备瓶状纳米粒子，
a、将0.0218-0.087 g聚环氧乙烷-聚环氧丙烷-聚环氧乙烷三嵌段共聚物和0.0182-0.073 g油酸钠加入10 mL-30 mL去离子水中，得到混合溶液A，并在25 ℃水浴中以100 rpm的速度搅拌0.5-2 h；
b、将2-5 g核糖溶于20-50 mL去离子水中，并加入到所述混合溶液A中，在温度为25 ℃水浴中，以100 rpm 的速度搅拌20-40 min，得到混合溶液B；
c、将所述混合溶液B转移到75 mL反应釜中，放入烘箱中，在160 ℃温度下时，保持8-20 h，并以8500 rpm 的速度离心10-30 min，收集得到瓶状纳米粒子粗产品；
d、用20mL-50 mL去离子水清洗所述粗产品3-5次，再用20mL-50 mL乙醇清洗2-3次，每次以8500 rpm 的速度离心15-25 min收集，最后在真空度130Pa-140 Pa，80 ℃环境下干燥，最终得到干燥的瓶状纳米粒子；
且所述瓶状纳米粒子为水热碳化的碳基高分子，且所述瓶状纳米粒子的瓶壁厚为50-120 nm，瓶直径为300-1000 nm，瓶长为400-1500 nm；
步骤二、将葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶加入到缓冲溶液中，制备酶混合溶液；
步骤三、通过真空灌注法和超声灌注法，将步骤二中所述酶混合溶液灌注进入步骤一所述的瓶状纳米粒子中；
步骤四、利用高速离心法去除步骤三所述瓶状纳米粒子外部多余的葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶，最终获得酶驱动瓶状纳米马达。
本发明还提供了一种酶驱动瓶状纳米马达的方法，其包括以下步骤：
步骤一、制备瓶状纳米粒子；
a、将0.0218-0.087 g聚环氧乙烷-聚环氧丙烷-聚环氧乙烷三嵌段共聚物和0.0182-0.073 g油酸钠加入10 mL-30 mL去离子水中，得到混合溶液A，并在25 ℃水浴中以100 rpm的速度搅拌0.5-2 h；
b、将2-5 g核糖溶于20-50 mL去离子水中，并加入到所述混合溶液A中，在温度为25 ℃水浴中，以100 rpm 的速度搅拌20-40 min，得到混合溶液B；
c、将所述混合溶液B转移到75 mL反应釜中，放入烘箱中，在160 ℃温度下时，保持8-20 h，并以8500 rpm 的速度离心10-30 min，收集得到瓶状纳米粒子粗产品；
d、用20mL-50 mL去离子水清洗所述粗产品3-5次，再用20mL-50 mL乙醇清洗2-3次，每次以8500 rpm 的速度离心15-25 min收集，最后在真空度130Pa-140 Pa，80 ℃环境下干燥，最终得到干燥的瓶状纳米粒子；
且所述瓶状纳米粒子为水热碳化的碳基高分子，且所述瓶状纳米粒子的瓶壁厚为50-120 nm，瓶直径为300-1000 nm，瓶长为400-1500 nm；
步骤二、将葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶加入到缓冲溶液中，制备酶混合溶液；
步骤三、通过真空灌注法和超声灌注法，将步骤二中所述酶混合溶液灌注进入步骤一所述的瓶状纳米粒子中；
步骤四、利用高速离心法去除步骤三所述瓶状纳米粒子外部多余的葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶，最终获得酶驱动瓶状纳米马达。
较佳的，步骤二中所述缓冲溶液为磷酸盐缓冲液。
较佳的，一种制备酶驱动瓶状纳米马达的方法，包括以下步骤：
步骤一、制备瓶状纳米粒子；
a、将0.0218-0.087 g聚环氧乙烷-聚环氧丙烷-聚环氧乙烷三嵌段共聚物（P123）和0.0182-0.073 g油酸钠（SO）加入10 mL-30 mL去离子水中，得到混合溶液A，并在25 ℃水浴中以100 rpm的速度搅拌0.5-2 h；
b、将2-5 g核糖溶于20-50 mL去离子水中，并加入到所述混合溶液A中，在温度为25 ℃水浴中，以100 rpm 的速度搅拌20-40 min，得到混合溶液B；
c、将所述混合溶液B转移到75 mL反应釜中，放入烘箱中，在160 ℃温度下时，保持8-20 h，并以8500 rpm 的速度离心10-30 min，收集得到瓶状纳米粒子粗产品；
d、用20mL-50 mL去离子水清洗所述粗产品3-5次，再用20mL-50 mL乙醇清洗2-3次，每次以8500 rpm 的速度离心15-25 min收集，最后在真空度130Pa-140 Pa，80 ℃环境下干燥，最终得到干燥的瓶状纳米粒子；
步骤二、制备酶混合溶液；
将0.0025-0.02 g的葡萄糖氧化酶和0.0025-0.02 g的过氧化氢酶加入到1 mL的pH为6.5的磷酸盐缓冲液中，超声5-10 min，得到酶混合溶液C；
步骤三、灌注酶混合溶液进入瓶状纳米粒子中；
将0.15 mg-0.3 mg的步骤一所述的瓶状纳米粒子加入步骤二所述的酶混合溶液C中,超声5-15 min,得到分散液D；将所述分散液D放入真空干燥箱中，干燥10-13 h后，取出分散液D，超声20-40 min；
步骤四、去除多余的酶；
a、 将分散液D从超声环境中取出，以8000 rpm 的速度离心8-15min，分离、收集瓶状纳米马达粗产品；
b、向a中所述瓶状纳米马达粗产品中加入10 mL pH为6.5的磷酸盐缓冲液，以8000rpm 的速度离心8-15 min后，去除上层清液；
c、重复b中步骤3-5次，最终得到酶驱动瓶状纳米马达。
与现有技术比较，本发明的有益效果在于，本发明制备过程简单，制备的纳米马达生物相容性好，控制性强，能在葡萄糖溶液中沿着葡萄糖浓度梯度运动，实现酶驱动瓶状纳米马达的靶向运动，在药物携载、毒素清除、肿瘤治疗等生物医学领域具有广泛的应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明各实施例中的技术方案,下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1是本发明实施例1中酶驱动瓶状纳米马达游动的原理图；
图2是本发明实施例1中酶驱动瓶状纳米马达在化学驱动下运动的光学显微镜照片；
图3是本发明实施例1中酶驱动瓶状纳米马达在葡萄糖浓度梯度下趋化运动的光学显微镜照片；
图4是本发明实施例2中酶驱动瓶状纳米马达的制备方法中步骤三和步骤四的示意图；
图5是本发明实施例2中制备的酶驱动瓶状纳米马达的透射电子显微镜照片和能量色散X射线探测照片。
具体实施方式
以下结合附图，对本发明上述的和另外的技术特征和优点作更详细的说明。
实施例1
请参见图1、图2、图3，
图1是本实施例中酶驱动瓶状纳米马达游动的原理图；
图2是本实施例中酶驱动瓶状纳米马达在化学驱动下运动的光学显微镜照片；
图3是本实施例中制备的酶驱动瓶状纳米马达在葡萄糖浓度梯度下趋化运动的光学显微镜照片。
本实施例提供了一种酶驱动瓶状纳米马达，其包括瓶状纳米粒子骨架、位于所述骨架内部的两种酶。其中所述瓶状纳米粒子为水热碳化的碳基高分子，所述两种酶为葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶。且本实施例中所用葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶均为市售产品，其中葡萄糖氧化酶可以分解葡萄糖，将环境中的化学能转化为动能以驱动瓶状纳米马达运动；而过氧化氢酶能分解葡萄糖氧化酶与葡萄糖反应过程中产生的过氧化氢，由此可消除过氧化氢对生物体的损伤。所述两种酶均为生物体内已知存在的酶，其使酶驱动瓶状纳米马达具有良好的生物相容性。
本实施例中提供的酶驱动瓶状纳米马达能沿葡萄糖浓度梯度进行趋化运动，溶液条件是：葡萄糖浓度为0 mM、10 mM、25 mM、50 mM、100 mM、400 mM。
通过图1可以清晰地看到酶驱动瓶状纳米马达在葡萄糖溶液中游动的原理。其中“
Figure DEST_PATH_IMAGE001
”代表瓶状纳米粒子，“
Figure 65457DEST_PATH_IMAGE002
”代表葡萄糖氧化酶（GOx），“
Figure DEST_PATH_IMAGE003
”代表过氧化氢酶（CAT），“
Figure 326805DEST_PATH_IMAGE004
”代表葡萄糖（C6H12O6），“
Figure DEST_PATH_IMAGE005
”代表氧气（O2）。其反应过程如下：
Figure 575383DEST_PATH_IMAGE006
其中，瓶口的葡萄糖和氧气进入瓶状纳米马达的内部被葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶催化发生反应导致瓶状纳米马达外部的葡萄糖浓度分布不均。瓶底的葡萄糖浓度高于瓶口的葡萄糖浓度，导致瓶状纳米马达瓶底受到的压力高于瓶口，致使马达向瓶口运动。
由图2酶驱动瓶状纳米马达的化学驱动下运动的光学显微镜照片可知，当将瓶状纳米马达放置于100 mM葡萄糖溶液中，3秒内马达按图中轨迹进行自推进运动。图中标尺为2 μm。
图3左边的“Glu”为400 mM葡萄糖制备的琼脂糖凝胶，将该凝胶放置在溶液中以建立葡萄糖的浓度梯度，在另一侧放入瓶状纳米马达，在显微镜下观察到马达向着凝胶运动，可以看出瓶状纳米马达会向着葡萄糖浓度升高的方向运动。
实施例2
请参见图4、图5，
图4是本实施例中酶驱动瓶状纳米马达的制备方法中步骤三和步骤四的示意图；
图5是本实施例中制备的酶驱动瓶状纳米马达的透射电子显微镜照片和能量色散X射线探测照片。
本实施例以瓶状纳米粒子、葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶为材料，利用真空灌注法和超声灌注法，将葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶同时装载在瓶状纳米粒子的内部，制备出酶驱动的瓶状纳米马达。具体包括以下步骤：
步骤一、制备瓶状纳米粒子：
a、将0.0435 g聚环氧乙烷-聚环氧丙烷-聚环氧乙烷三嵌段共聚物（P123）和0.0365 g油酸钠（SO）加入20 mL去离子水中，得到混合溶液A，并在25 ℃水浴中100 rpm搅拌1 h；
b、将3 g核糖溶于40 mL去离子水中，并加入到所述混合溶液A中，在温度为25 ℃水浴中，以100 rpm 的速度搅拌30 min，得到混合溶液B；
c、将所述混合溶液B转移到75 mL反应釜中，放入烘箱中，在160 ℃温度下时，保持8-20 h，并以8500 rpm 的速度离心20 min，收集得到瓶状纳米粒子粗产品；
d、用40 mL去离子水清洗所述粗产品3次，再用40 mL乙醇清洗2次，每次以8500rpm 的速度离心20 min收集，最后在真空度133 Pa，80 ℃环境下干燥，最终得到干燥的瓶状纳米粒子。
步骤二、制备酶混合溶液；
将0.005 g的葡萄糖氧化酶和0.005 g的过氧化氢酶加入到1 mL的pH为6.5的磷酸盐缓冲液中，以配置5 mg/mL的葡萄糖氧化酶和5 mg/mL的过氧化氢酶混合溶液，超声5-10min，使上述两种酶完全溶解，得到酶混合溶液C；
步骤三、灌注酶混合溶液进入瓶状纳米粒子中；
将0.2 mg的步骤一所述的瓶状纳米粒子加入步骤二所述的酶混合溶液C中,超声10 min,使所述瓶状纳米粒子完全分散到所述酶混合溶液C中，得到分散液D；将所述分散液D放入真空干燥箱中，干燥12 h后，取出分散液D，超声30 min。
步骤四、去除多余的酶：
a、 将分散液D从超声环境中取出，以8000 rpm 的速度离心10 min，分离、收集瓶状纳米马达粗产品；
b、向a中所述瓶状纳米马达粗产品中加入10 mL pH为6.5的磷酸盐缓冲液，以8000rpm 的速度离心10 min后，去除上层清液；
c、重复b中步骤3-5次，最终得到酶驱动瓶状纳米马达。
通过图4可清晰地看到所述步骤三和步骤四中酶驱动瓶状纳米马达的形成过程，其中“
Figure DEST_PATH_IMAGE007
”代表瓶状纳米粒子，“
Figure 813336DEST_PATH_IMAGE008
”代表葡萄糖氧化酶，“
Figure 893287DEST_PATH_IMAGE009
”代表过氧化氢酶，“
Figure 122274DEST_PATH_IMAGE011
” 代表酶驱动瓶状纳米马达。
由图5可知，透射电子显微镜照片显示本实施例制备的瓶状纳米马达形貌均一，该瓶状纳米粒子瓶壁厚为100 nm，瓶直径为500 nm，瓶长为800 nm。能量色散X射线探测照片中显示马达中含有N，Fe，P元素，其中N为酶中特有元素，Fe为过氧化氢酶中特有元素，P为葡萄糖氧化酶中特有元素，该结果表明两种酶成功装载在了瓶状纳米粒子中。图中标尺为500nm。
本发明制备过程简单，制备的纳米马达生物相容性好，控制性强，能在葡萄糖溶液中沿着葡萄糖浓度梯度运动，实现酶驱动瓶状纳米马达的靶向运动，在药物携载、毒素清除、肿瘤治疗等生物医学领域具有广泛的应用前景。
实施例3
本实施例以瓶状纳米粒子、葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶为材料，利用真空灌注法和超声灌注法，将葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶同时装载在瓶状纳米粒子的内部，制备出酶驱动的瓶状纳米马达。具体包括以下步骤：
步骤一、制备瓶状纳米粒子：
a、将0.0435 g聚环氧乙烷-聚环氧丙烷-聚环氧乙烷三嵌段共聚物（P123）和0.0365 g油酸钠（SO）加入10 mL去离子水中，得到混合溶液A，并在25 ℃水浴中以100 rpm的速度搅拌0.5 h；
b、将2 g核糖溶于20 mL去离子水中，并加入到所述混合溶液A中，在温度为25 ℃水浴中，以100 rpm 的速度搅拌20 min，得到混合溶液B；
c、将所述混合溶液B转移到75 mL反应釜中，放入烘箱中，在160 ℃温度下时，保持8-20 h，并以8500 rpm 的速度离心10 min，收集得到瓶状纳米粒子粗产品；
d、用20 mL去离子水清洗所述粗产品4次，再用20 mL乙醇清洗2次，每次以8500rpm 的速度离心15 min收集，最后在真空度130 Pa，80 ℃环境下干燥，最终得到干燥的瓶状纳米粒子。
步骤二、制备酶混合溶液；
将0.005 g的葡萄糖氧化酶和0.005 g的过氧化氢酶加入到1 mL的pH为6.5的磷酸盐缓冲液中，以配置5 mg/mL的葡萄糖氧化酶和5 mg/mL的过氧化氢酶混合溶液，超声5-10min，使上述两种酶完全溶解，得到酶混合溶液C；
步骤三、灌注酶混合溶液进入瓶状纳米粒子中；
将0.15 mg的步骤一所述的瓶状纳米粒子加入步骤二所述的酶混合溶液C中,超声5 min,使所述瓶状纳米粒子完全分散到所述酶混合溶液C中，得到分散液D；将所述分散液D放入真空干燥箱中，干燥10 h后，取出分散液D，超声20 min。
步骤四、去除多余的酶：
a、 将分散液D从超声环境中取出，以8000 rpm 的速度离心8 min，分离、收集瓶状纳米马达粗产品；
b、向a中所述瓶状纳米马达粗产品中加入10 mL pH为6.5的磷酸盐缓冲液，以8000rpm 的速度离心8 min后，去除上层清液；
c、重复b中步骤3-5次，最终得到酶驱动瓶状纳米马达。
本发明制备过程简单，制备的纳米马达生物相容性好，控制性强，能在葡萄糖溶液中沿着葡萄糖浓度梯度运动，实现酶驱动瓶状纳米马达的靶向运动，在药物携载、毒素清除、肿瘤治疗等生物医学领域具有广泛的应用前景。
实施例4
本实施例以瓶状纳米粒子、葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶为材料，利用真空灌注法和超声灌注法，将葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶同时装载在瓶状纳米粒子的内部，制备出酶驱动的瓶状纳米马达。具体包括以下步骤：
步骤一、制备瓶状纳米粒子：
a、将0.0435 g聚环氧乙烷-聚环氧丙烷-聚环氧乙烷三嵌段共聚物（P123）和0.0365 g油酸钠（SO）加入30 mL去离子水中，得到混合溶液A，并在25 ℃水浴中以100 rpm的速度搅拌2 h；
b、将5 g核糖溶于50 mL去离子水中，并加入到所述混合溶液A中，在温度为25 ℃水浴中，以100 rpm 的速度搅拌40 min，得到混合溶液B；
c、将所述混合溶液B转移到75 mL反应釜中，放入烘箱中，在160 ℃温度下时，保持8-20 h，并以8500 rpm 的速度离心30 min，收集得到瓶状纳米粒子粗产品；
d、用50 mL去离子水清洗所述粗产品5次，再用50 mL乙醇清洗3次，每次以8500rpm 的速度离心25 min收集，最后在真空度140 Pa，80 ℃环境下干燥，最终得到干燥的瓶状纳米粒子。
步骤二、制备酶混合溶液；
将0.005 g的葡萄糖氧化酶和0.005 g的过氧化氢酶加入到1 mL的pH为6.5的磷酸盐缓冲液中，以配置5 mg/mL的葡萄糖氧化酶和5 mg/mL的过氧化氢酶混合溶液，超声5-10min，使上述两种酶完全溶解，得到酶混合溶液C；
步骤三、灌注酶混合溶液进入瓶状纳米粒子中；
将0.3 mg的步骤一所述的瓶状纳米粒子加入步骤二所述的酶混合溶液C中,超声15 min,使所述瓶状纳米粒子完全分散到所述酶混合溶液C中，得到分散液D；将所述分散液D放入真空干燥箱中，干燥13 h后，取出分散液D，超声40 min。
步骤四、去除多余的酶：
a、 将分散液D从超声环境中取出，以8000 rpm 的速度离心15 min，分离、收集瓶状纳米马达粗产品；
b、向a中所述瓶状纳米马达粗产品中加入10 mL pH为6.5的磷酸盐缓冲液，以8000rpm 的速度离心15 min后，去除上层清液；
c、重复b中步骤3-5次，最终得到酶驱动瓶状纳米马达。
本发明制备过程简单，制备的纳米马达生物相容性好，控制性强，能在葡萄糖溶液中沿着葡萄糖浓度梯度运动，实现酶驱动瓶状纳米马达的靶向运动，在药物携载、毒素清除、肿瘤治疗等生物医学领域具有广泛的应用前景。
实施例5
本实施例与实施例2的区别之处在于，步骤一中将0.087 g聚环氧乙烷-聚环氧丙烷-聚环氧乙烷三嵌段共聚物（P123）和0.073 g油酸钠（SO）加入20 mL去离子水中，得到瓶壁厚为50 nm，瓶直径为1μm，瓶长为1.5μm的瓶状纳米粒子，其他与实施例2相同。本实施例中P123和SO的浓度与实施例2相比同时增加一倍，导致P123和SO形成的乳液球体积增大，即模板体积增大，致使围绕乳液球生长的瓶状纳米粒子体积增大，即瓶直径会随之增大；而由于P123和SO的用量增加，致使乳液球内部压力增大，乳液球周围生长的纳米粒子更容易破裂，瓶颈的形成更早，使其瓶颈长度增加；P123和SO的用量增加的同时，反应物核糖的用料不变致使形成的瓶壁厚度减小。
本发明制备过程简单，制备的纳米马达生物相容性好，控制性强，能在葡萄糖溶液中沿着葡萄糖浓度梯度运动，实现酶驱动瓶状纳米马达的靶向运动，在药物携载、毒素清除、肿瘤治疗等生物医学领域具有广泛的应用前景。
实施例6
本实施例与实施例2的区别之处在于，步骤一中将0.0218 g聚环氧乙烷-聚环氧丙烷-聚环氧乙烷三嵌段共聚物（P123）和0.0182 g油酸钠（SO）加入20 mL去离子水中，得到瓶壁厚为120 nm，瓶直径为300 nm，瓶长为400 nm的瓶状纳米粒子，其他与实施例2相同。本实施例中P123和SO的浓度与实施例2相比同时减少一半，导致P123和SO形成的乳液球体积减小，即模板体积减小，致使围绕乳液球生长的瓶状纳米粒子体积减小，即瓶直径会随之减小；而由于P123和SO的用量减少，致使乳液球内部压力减小，乳液球周围生长的纳米粒子更难破裂，瓶颈的形成更晚，使其瓶颈长度下降；P123和SO的用量减少的同时，反应物核糖的用料不变致使形成的瓶壁厚度增大。
本发明制备过程简单，制备的纳米马达生物相容性好，控制性强，能在葡萄糖溶液中沿着葡萄糖浓度梯度运动，实现酶驱动瓶状纳米马达的靶向运动，在药物携载、毒素清除、肿瘤治疗等生物医学领域具有广泛的应用前景。
实施例7
本实施例与实施例2的区别之处在于，步骤一中将0.0365 g油酸钠（SO）分别和0g、0.0182 g、0.0365 g、0.073 g聚环氧乙烷-聚环氧丙烷-聚环氧乙烷三嵌段共聚物（P123）加入20 mL去离子水中，分别得到20-400 nm大小不均的纳米球、200 nm左右大小均一的纳米球、壁厚为100 nm，直径为500 nm，长度为800 nm的瓶状纳米粒子和大小500 nm的碗状纳米粒子。这是由于随着P123比例的提高，SO和P123形成的乳液球内部压力增大，致使乳液球外部生长的纳米球更容易破裂导致这种情形的发生。
本发明制备过程简单，制备的纳米马达生物相容性好，控制性强，能在葡萄糖溶液中沿着葡萄糖浓度梯度运动，实现酶驱动瓶状纳米马达的靶向运动，在药物携载、毒素清除、肿瘤治疗等生物医学领域具有广泛的应用前景。
实施例8
本实施例与实施例2的区别之处在于，步骤二中将0.01 g的葡萄糖氧化酶和0.01g的过氧化氢酶加入到1 mL的pH为6.5的磷酸盐缓冲液中以配置10 mg/mL的葡萄糖氧化酶和10 mg/mL的过氧化氢酶混合溶液C，其他与实施例2相同。与实施例2相比，本实施例制备的瓶状纳米马达在葡萄糖溶液中移动的速度增加20%，扩散能力提高40%，这是由于酶更多时催化反应更强，为瓶状纳米马达提供更多的动能，导致瓶状纳米马达在葡萄糖溶液中移动的速度和扩散能力增加。
本发明制备过程简单，制备的纳米马达生物相容性好，控制性强，能在葡萄糖溶液中沿着葡萄糖浓度梯度运动，实现酶驱动瓶状纳米马达的靶向运动，在药物携载、毒素清除、肿瘤治疗等生物医学领域具有广泛的应用前景。
实施例9
本实施例与实施例2的区别之处在于，步骤二中将0.015 g的葡萄糖氧化酶和0.015 g的过氧化氢酶加入到1 mL的pH为6.5的磷酸盐缓冲液中以配置15 mg/mL的葡萄糖氧化酶和15 mg/mL的过氧化氢酶混合溶液C，其他与实施例4相同。与实施例2相比，本实施例制备的瓶状纳米马达在葡萄糖溶液中移动的速度增加30%，扩散能力提高70%，这是由于酶更多时催化反应更强，为瓶状纳米马达提供更多的动能，导致瓶状纳米马达在葡萄糖溶液中移动的速度和扩散能力增加。
本发明制备过程简单，制备的纳米马达生物相容性好，控制性强，能在葡萄糖溶液中沿着葡萄糖浓度梯度运动，实现酶驱动瓶状纳米马达的靶向运动，在药物携载、毒素清除、肿瘤治疗等生物医学领域具有广泛的应用前景。
实施例10
本实施例与实施例2的区别之处在于，步骤二中将0.02 g的葡萄糖氧化酶和0.02g的过氧化氢酶加入到1 mL的pH为6.5的磷酸盐缓冲液中以配置20 mg/mL的葡萄糖氧化酶和20 mg/mL的过氧化氢酶混合溶液C，其他与实施例2相同，与实施例2相比，本实施例制备的瓶状纳米马达速度增加35%，扩散能力提高80%。这是由于酶更多时催化反应更强，为瓶状纳米马达提供更多的动能，导致瓶状纳米马达在葡萄糖溶液中移动的速度和扩散能力增加。
本发明制备过程简单，制备的纳米马达生物相容性好，控制性强，能在葡萄糖溶液中沿着葡萄糖浓度梯度运动，实现酶驱动瓶状纳米马达的靶向运动，在药物携载、毒素清除、肿瘤治疗等生物医学领域具有广泛的应用前景
实施例11
本实施例与实施例2的区别之处在于，步骤二中将0.0025 g的葡萄糖氧化酶和0.0075 g的过氧化氢酶加入到1 mL的pH为6.5的磷酸盐缓冲液中以配置2.5 mg/mL的葡萄糖氧化酶和7.5 mg/mL的过氧化氢酶混合溶液C，其他与实施例2相同。与实施例2相比，本实施例制备的瓶状纳米马达在葡萄糖溶液中移动的速度降低20%，扩散能力下降40%，这是由于酶减少时催化反应较弱，为瓶状纳米马达提供的动能较少，导致瓶状纳米马达在葡萄糖溶液中移动的速度和扩散能力降低。
本发明制备过程简单，制备的纳米马达生物相容性好，控制性强，能在葡萄糖溶液中沿着葡萄糖浓度梯度运动，实现酶驱动瓶状纳米马达的靶向运动，在药物携载、毒素清除、肿瘤治疗等生物医学领域具有广泛的应用前景。
实施例12
本实施例与实施例2的区别之处在于，步骤二中将0.0075 g的葡萄糖氧化酶和0.0025 g的过氧化氢酶加入到1 mL的pH为6.5的磷酸盐缓冲液中以配置2.5 mg/mL的葡萄糖氧化酶和7.5 mg/mL的过氧化氢酶混合溶液C，其他与实施例2相同。与实施例2相比，本实施例制备的瓶状纳米马达在葡萄糖溶液中移动的速度增加15%，扩散能力提高30%，这是由于酶更多时催化反应更强，为瓶状纳米马达提供更多的动能，导致瓶状纳米马达在葡萄糖溶液中移动的速度和扩散能力增加。
本发明制备过程简单，制备的纳米马达生物相容性好，控制性强，能在葡萄糖溶液中沿着葡萄糖浓度梯度运动，实现酶驱动瓶状纳米马达的靶向运动，在药物携载、毒素清除、肿瘤治疗等生物医学领域具有广泛的应用前景。
实施例13
本实施例与实施例2的区别之处在于，步骤一中将所述混合溶液B转移到75 mL反应釜中，放入烘箱中，在160 ℃温度下时，保持8 h，并以8500 rpm 的速度离心20 min，收集得到瓶状纳米粒子粗产品，本实施例制备的瓶状纳米马达可形成瓶口但瓶颈未形成，瓶壁较薄约为50 nm，瓶直径变化不大，约为500 nm，这是由于放入烘箱中的时间增加，导致形成马达的反应物更多地在瓶壁和瓶颈周围聚集，导致瓶壁和瓶颈长度增加，因而瓶壁和瓶长度都会有所不同，但瓶直径变化不大。
本发明制备过程简单，制备的纳米马达生物相容性好，控制性强，能在葡萄糖溶液中沿着葡萄糖浓度梯度运动，实现酶驱动瓶状纳米马达的靶向运动，在药物携载、毒素清除、肿瘤治疗等生物医学领域具有广泛的应用前景。
实施例14
本实施例与实施例2的区别之处在于，步骤一中将所述混合溶液B转移到75 mL反应釜中，放入烘箱中，在160 ℃温度下时，保持20 h，并以8500 rpm 的速度离心20 min，收集得到瓶状纳米粒子粗产品，本实施例制备的瓶状纳米马达可形成较长瓶颈，瓶长度约为1μm，瓶壁较厚，约为200 nm，瓶直径变化不大，约为500 nm；这是由于放入烘箱中的时间增加，导致形成马达的反应物更多地在瓶壁和瓶颈周围聚集，导致瓶壁和瓶颈长度增加，因而瓶壁和瓶长度都会有所不同，但瓶直径变化不大。
本发明制备过程简单，制备的纳米马达生物相容性好，控制性强，能在葡萄糖溶液中沿着葡萄糖浓度梯度运动，实现酶驱动瓶状纳米马达的靶向运动，在药物携载、毒素清除、肿瘤治疗等生物医学领域具有广泛的应用前景。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，对本发明而言仅仅是说明性的，而非限制性的。本专业技术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效，但都将落入本发明的保护范围内。

Claims (4)

1.一种酶驱动瓶状纳米马达，其特征在于，其包括瓶状纳米粒子骨架、位于所述骨架内部的两种酶，且所述酶驱动瓶状纳米马达能沿葡萄糖浓度梯度进行趋化运动，且所述酶驱动瓶状纳米马达采用如下方法制备：
步骤一、制备瓶状纳米粒子，
a、将0.0218-0.087 g聚环氧乙烷-聚环氧丙烷-聚环氧乙烷三嵌段共聚物和0.0182-0.073 g油酸钠加入10 mL-30 mL去离子水中，得到混合溶液A，并在25 ℃水浴中以100 rpm的速度搅拌0.5-2 h；
b、将2-5 g核糖溶于20-50 mL去离子水中，并加入到所述混合溶液A中，在温度为25 ℃水浴中，以100 rpm 的速度搅拌20-40 min，得到混合溶液B；
c、将所述混合溶液B转移到75 mL反应釜中，放入烘箱中，在160 ℃温度下时，保持8-20h，并以8500 rpm 的速度离心10-30 min，收集得到瓶状纳米粒子粗产品；
d、用20mL-50 mL去离子水清洗所述粗产品3-5次，再用20mL-50 mL乙醇清洗2-3次，每次以8500 rpm 的速度离心15-25 min收集，最后在真空度130Pa-140 Pa，80 ℃环境下干燥，最终得到干燥的瓶状纳米粒子；
且所述瓶状纳米粒子为水热碳化的碳基高分子，且所述瓶状纳米粒子的瓶壁厚为50-120 nm，瓶直径为300-1000 nm，瓶长为400-1500 nm；
步骤二、将葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶加入到缓冲溶液中，制备酶混合溶液；
步骤三、通过真空灌注法和超声灌注法，将步骤二中所述酶混合溶液灌注进入步骤一所述的瓶状纳米粒子中；
步骤四、利用高速离心法去除步骤三所述瓶状纳米粒子外部多余的葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶，最终获得酶驱动瓶状纳米马达。
2.一种如权利要求1所述的酶驱动瓶状纳米马达的制备方法，其特征在于，其包括以下步骤：
步骤一、制备瓶状纳米粒子，
a、将0.0218-0.087 g聚环氧乙烷-聚环氧丙烷-聚环氧乙烷三嵌段共聚物和0.0182-0.073 g油酸钠加入10 mL-30 mL去离子水中，得到混合溶液A，并在25 ℃水浴中以100 rpm的速度搅拌0.5-2 h；
b、将2-5 g核糖溶于20-50 mL去离子水中，并加入到所述混合溶液A中，在温度为25 ℃水浴中，以100 rpm 的速度搅拌20-40 min，得到混合溶液B；
c、将所述混合溶液B转移到75 mL反应釜中，放入烘箱中，在160 ℃温度下时，保持8-20h，并以8500 rpm 的速度离心10-30 min，收集得到瓶状纳米粒子粗产品；
d、用20mL-50 mL去离子水清洗所述粗产品3-5次，再用20mL-50 mL乙醇清洗2-3次，每次以8500 rpm 的速度离心15-25 min收集，最后在真空度130Pa-140 Pa，80 ℃环境下干燥，最终得到干燥的瓶状纳米粒子；
且所述瓶状纳米粒子为水热碳化的碳基高分子，且所述瓶状纳米粒子的瓶壁厚为50-120 nm，瓶直径为300-1000 nm，瓶长为400-1500 nm；
步骤二、将葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶加入到缓冲溶液中，制备酶混合溶液；
步骤三、通过真空灌注法和超声灌注法，将步骤二中所述酶混合溶液灌注进入步骤一所述的瓶状纳米粒子中；
步骤四、利用高速离心法去除步骤三所述瓶状纳米粒子外部多余的葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶，最终获得酶驱动瓶状纳米马达。
3.根据权利要求2所述的酶驱动瓶状纳米马达的制备方法，其特征在于，步骤二中所述缓冲溶液为磷酸盐缓冲液。
4.根据权利要求2所述的酶驱动瓶状纳米马达的制备方法，其特征在于，其包括以下步骤：
步骤一、制备瓶状纳米粒子；
a、将0.0218-0.087 g聚环氧乙烷-聚环氧丙烷-聚环氧乙烷三嵌段共聚物和0.0182-0.073 g油酸钠加入10 mL-30 mL去离子水中，得到混合溶液A，并在25 ℃水浴中以100 rpm的速度搅拌0.5-2 h；
b、将2-5 g核糖溶于20-50 mL去离子水中，并加入到所述混合溶液A中，在温度为25 ℃水浴中，以100 rpm 的速度搅拌20-40 min，得到混合溶液B；
c、将所述混合溶液B转移到75 mL反应釜中，放入烘箱中，在160 ℃温度下时，保持8-20h，并以8500 rpm 的速度离心10-30 min，收集得到瓶状纳米粒子粗产品；
d、用20mL-50 mL去离子水清洗所述粗产品3-5次，再用20mL-50 mL乙醇清洗2-3次，每次以8500 rpm 的速度离心15-25 min收集，最后在真空度130Pa-140 Pa，80 ℃环境下干燥，最终得到干燥的瓶状纳米粒子；
步骤二、制备酶混合溶液；
将0.0025-0.02 g的葡萄糖氧化酶和0.0025-0.02 g的过氧化氢酶加入到1 mL的pH为6.5的磷酸盐缓冲液中，超声5-10 min，得到酶混合溶液C；
步骤三、灌注酶混合溶液进入瓶状纳米粒子中；
将0.15 mg-0.3 mg的步骤一所述的瓶状纳米粒子加入步骤二所述的酶混合溶液C中,超声5-15 min,得到分散液D；将所述分散液D放入真空干燥箱中，干燥10-13 h后，取出分散液D，超声20-40 min；
步骤四、去除多余的酶；
a、 将分散液D从超声环境中取出，以8000 rpm 的速度离心8-15min，分离、收集瓶状纳米马达粗产品；
b、向a中所述瓶状纳米马达粗产品中加入10 mL pH为6.5的磷酸盐缓冲液，以8000 rpm的速度离心8-15 min后，去除上层清液；
c、重复b中步骤3-5次，最终得到酶驱动瓶状纳米马达。
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