CN114425089B - 一种酵母仿生微纳生物机器人及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种酵母仿生微纳生物机器人及其制备方法，所述酵母仿生微纳生物机器人包括囊状结构的酵母细胞壁、位于所述酵母细胞壁内部的载药纳米粒以及不对称分布于所述酵母细胞壁表面的生物酶构成，所述酵母仿生微纳生物机器人具有优良的生物相容性，可极大的提高药物的负载率，能够利用葡萄糖、过氧化氢、尿素等产生驱动力，推动微纳生物机器人的应用研究，具有显著的现实意义和实用价值。

Description

一种酵母仿生微纳生物机器人及其制备方法
技术领域
本发明属于药物载体技术领域，具体涉及一种酵母仿生微纳生物机器人及其制备方法。
背景技术
自驱动微纳米生物机器人是一种尺寸在微纳米级别，可以将环境中的其他形式能量转化为自身动能，并可自动执行复杂任务的仿生微纳米粒子。由于具有独特的运动特性，在药物运输、生物传感、微手术、细胞分离和环境治理等方面有着重要的变革性应用前景。
近几年来，微纳米生物机器人发展迅速，其制备方法和应用领域得到了很大发展。目前研究最多的自驱动微纳米机器人多以化学能作为动力源，如通过铂催化介质环境中的过氧化氢进行自驱动、通过金属镁催化介质环境中的水进行自驱动。该类自驱动微纳机器人用于药物运输面临主要挑战有：1)制备成本昂贵，工艺复杂，而且产量小，不适合大规模制备；2)药物通过粘附的方式负载于机器人表面，载药量低；3)制备过程通过金属沉积或喷涂等方式，无法保证药物活性。因此，为了实现微纳生物机器人的实际应用，急需开发一种简单、低成本、大规模合成、载药量高、生物相容性优良的微纳生物机器人。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺陷，本发明提出了一种酵母仿生微纳生物机器人及其制备方法。所述酵母仿生微纳生物机器人包括囊状结构的酵母细胞壁以及内部的载药纳米粒和不对称分布于所述酵母细胞壁表面的生物酶，能够利用葡萄糖、脂肪、尿素等原料，产生自主运动，推动微纳生物机器人的应用研究，具有显著的现实意义和实用价值。
具体通过以下技术方案实现：
一种酵母仿生微纳生物机器人，包括囊状结构的酵母细胞壁、位于所述酵母细胞壁内部的载药纳米粒以及不对称分布于所述酵母细胞壁表面的生物酶。
进一步地，所述囊状结构的酵母细胞壁取自酵母细胞，所述酵母细胞为酿酒酵母、葡萄汁有孢汉逊酵母、季也蒙有孢汉逊酵母、东方伊萨酵母、毕赤克鲁维酵母、膜璞毕赤酵母、美极梅奇酵母、红冬孢酵母或假丝酵母中的一种或多种。
进一步地，所述载药纳米粒中的纳米粒为带电脂质聚合物纳米粒、脂质体、聚合物纳米粒或白蛋白纳米粒。
进一步地，所述载药纳米粒所载药物为小分子药物、多肽、大分子蛋白药物、基因药物、重金属捕获剂、病毒捕获剂或细菌捕获剂中的一种或多种。
进一步地，所述生物酶包括但不限于葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶、脲酶、脂肪酶、胰蛋白酶、乙酰胆碱酯酶、脱氧核糖核酸酶(DNA酶)、三磷酸腺苷酶(ATP酶)中的至少一种。
进一步地，所述生物酶不对称半面分布于酵母细胞壁的表面，形成阴阳结构，阴阳结构是指酵母细胞壁表面不完全修饰生物酶，如半面修饰。酶的不对成分布可以产生推动力，推动酵母仿生微纳生物机器人运动。
本发明还提供上述酵母仿生微纳生物机器人的制备方法，包括以下步骤：
(1)获取酵母细胞壁；
(2)在载药纳米粒通过静电沉积方式包埋入酵母细胞壁内，得到载药酵母微囊；
(3)在步骤(2)制备的载药酵母微囊中加入掩蔽剂的水溶液，同时置于一定温度下孵育，等水分蒸发后，所述掩蔽剂将载药酵母细胞壁微囊束缚于平皿上，进行部分掩蔽；
(4)在步骤(3)中制备的部分掩蔽的载药酵母微囊中加入活化剂，活化剂将浮于掩蔽剂上方，对载药酵母微囊未掩蔽的部分进行表面活化，得到表面部分活化的载药酵母微囊；
(5)将生物酶与步骤(4)制备的表面部分活化的载药酵母微囊共孵育，得到酵母仿生微纳生物机器人前体；
(6)将步骤(5)制备的酵母仿生微纳生物机器人前体纯化后，得到酵母仿生微纳生物机器人。
进一步地，所述掩蔽剂包括但不限于乙二醇、甘油、丙二醇水溶液、聚乙二醇、麦芽糖醇、木糖醇和山梨醇中的至少一种。
进一步地，所述活化剂为羟基活化剂，包括但不限于甲苯磺酰基氯、溴化氰、二琥珀酰亚胺碳酸酯、N-羟基琥珀酰亚胺基氯甲酸酯、羰基二咪唑、高碘酸钠、N-乙酰-D-半乳糖胺、半乳糖氧化酶、氯乙酸或异硫氰酸酯。
优选地，步骤(3)中，所述载药酵母微囊与所述掩蔽剂的质量比为1:(0.01-0.25)，这样的质量比能够保证载药酵母细胞壁微囊进行部分掩蔽，避免出现因为载药酵母细胞壁微囊被全部掩蔽而导致无法修饰上生物酶的情况。
优选地，步骤(4)中，所述部分掩蔽的载药酵母微囊与所述活化剂的质量比为1:(40-80)。
优选地，步骤(5)中，所述生物酶相对于所述表面部分活化的酵母微囊过量添加，一方面可以保证生物酶的成功修饰，另一方面，过量的生物酶还可以回收重复利用。
本发明的有益效果包括以下几个方面：
1.本发明提供的酵母仿生微纳生物机器人以酵母细胞壁为基底，成本低、制备工艺简单、可大规模合成；
2.本发明提供的酵母仿生微纳生物机器人不对称修饰的生物酶可以利用葡萄糖、过氧化氢、尿素等为原料，产生驱动力，安全性高；
3.本发明使用的酵母壁微囊来源于可食用酵母细胞，具有优良生物相容性，同时利用静电沉积原理，可以高效地负载载药纳米粒。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明提供的酵母仿生微纳生物机器人的结构示意图；
图2为内部包埋有载纳米粒药物的酵母细胞壁微囊的荧光显微镜图；
图2(1)为酵母细胞壁微囊的荧光显微镜图，图2(2)为负载吲哚菁绿纳米粒的荧光显微镜图；图2(3)为内部包埋有负载吲哚菁绿纳米粒的酵母细胞壁微囊的荧光显微镜图；
图3为酵母细胞壁和葡萄糖氧化酶修饰的酵母仿生微纳生物机器人的透射电镜图(bar＝10μm)，其中，图3(1)为酵母细胞壁的透射电镜图，图3(2)为葡萄糖氧化酶修饰的酵母仿生微纳生物机器人的透射电镜图；
图4为实施例2制得的葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶修饰的酵母仿生微纳生物机器人的荧光成像图(bar＝5μm)，其中，图4(1)为对酵母仿生微纳生物机器人上修饰的葡萄糖氧化酶进行的荧光成像，图4(2)为对酵母仿生微纳生物机器人上修饰的过氧化氢酶进行的荧光成像。；
图5为酵母细胞壁和实施例2制得的酵母仿生微纳生物机器人的运动轨迹的对比图。图5(1)为酵母细胞壁的运动轨迹；图5(2)为酵母仿生微纳生物机器人的运动轨迹。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供了一种酵母仿生微纳生物机器人，包括囊状结构的酵母细胞壁、位于酵母细胞壁内部的载药纳米粒以及不对称分布于酵母细胞壁微囊表面的生物酶。生物酶不对称分布于酵母细胞壁微囊的表面，形成阴阳结构。阴阳结构是指生物酶不完全修饰于酵母细胞壁微囊的表面，如半面修饰。
酵母细胞壁取自酵母细胞，在一些具体的实施例中，酵母细胞为酿酒酵母、葡萄汁有孢汉逊酵母、季也蒙有孢汉逊酵母、东方伊萨酵母、毕赤克鲁维酵母、膜璞毕赤酵母、美极梅奇酵母、红冬孢酵母或假丝酵母中的一种或多种。
在一些具体的实施例中，载药纳米粒中的纳米粒为带电脂质聚合物纳米粒、脂质体、聚合物纳米粒或白蛋白纳米粒。
在一些具体的实施例中，载药纳米粒所载药物为小分子药物、多肽、大分子蛋白药物、基因药物、重金属捕获剂、病毒捕获剂或细菌捕获剂中的一种或多种。
在一些具体的实施例中，生物酶包括但不限于葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶、脲酶、脂肪酶、胰蛋白酶、乙酰胆碱酯酶、脱氧核糖核酸酶(DNA酶)、三磷酸腺苷酶(ATP酶)中的至少一种。
本发明还提供上述酵母仿生微纳生物机器人的制备方法，包括以下步骤：
(1)获取酵母细胞壁；
(2)将载药纳米粒通过静电沉积方式包埋入酵母细胞壁内，得到载药酵母微囊；
(3)在步骤(2)制备的载药酵母微囊中加入掩蔽剂的水溶液，同时置于一定温度下孵育，等水分蒸发后，所述掩蔽剂将载药酵母微囊束缚于平皿上，进行部分掩蔽；
(4)在步骤(3)中制备的部分掩蔽的载药酵母微囊中加入活化剂，活化剂将浮于掩蔽剂上方，对载药酵母微囊未掩蔽的部分进行表面活化，得到表面部分活化的载药酵母微囊；
载药酵母细胞壁微囊与掩蔽剂的质量比优选为1:(0.01-0.25)，这样的质量比能够保证载药酵母细胞壁微囊进行部分掩蔽，避免出现因为载药酵母细胞壁微囊被全部掩蔽而导致无法修饰上生物酶的情况；载药酵母细胞壁微囊与活化剂的质量比优选为1:(40-80)；
(5)将生物酶与步骤(4)制备的表面部分活化的载药酵母微囊共孵育，得到酵母仿生微纳生物机器人前体；生物酶相对于表面部分活化的酵母微囊过量添加，一方面可以保证生物酶的成功修饰，另一方面，过量的生物酶还可以回收重复利用；
(6)将步骤(5)制备的酵母仿生微纳生物机器人前体纯化后，得到酵母仿生微纳生物机器人。
在一些具体的实施例中，所述掩蔽剂包括但不限于乙二醇、甘油、丙二醇水溶液、聚乙二醇、麦芽糖醇、木糖醇和山梨醇中的至少一种。
在一些具体的实施例中，所述活化剂为羟基活化剂，包括但不限于甲苯磺酰基氯、溴化氰、二琥珀酰亚胺碳酸酯、N-羟基琥珀酰亚胺基氯甲酸酯、羰基二咪唑、高碘酸钠、N-乙酰-D-半乳糖胺、半乳糖氧化酶、氯乙酸、异硫氰酸酯。
优选地，步骤(5)中，生物酶相对于表面部分活化的酵母微囊过量添加，一方面可以保证生物酶的成功修饰，另一方面，过量的生物酶还可以回收重复利用。
实施例1
一种葡萄糖氧化酶修饰的酵母仿生微纳生物机器人的制备方法，包括以下步骤：
(1)将500mg酿酒酵母溶解于10mL浓度为1M的NaOH溶液中，于80℃孵育1h，之后3000rpm离心10min，弃去上清液，双蒸水洗涤2次后，加入10mL1M的HCl，60℃孵育1h，之后3000rpm离心水洗2次，再加入50mL异丙醇洗涤4次，用50mL丙酮洗涤2次，离心弃上清，干燥后得到中空的酵母细胞壁。
(2)将20mg吲哚美辛和10mg分子量为2kDa的枝化聚乙烯亚胺溶于二甲基亚砜中，在水中透析，得到载吲哚美辛的纳米粒。将100mg空的酵母细胞壁溶解于0.1M碳酸氢纳缓冲液中，37℃孵育30min，之后加入载10mg载吲哚美辛的纳米粒，37℃继续孵育24h，直至上清液澄清后，离心水洗，干燥即得载药酵母细胞壁微囊。
(3)将10mg载药酵母细胞壁微囊溶于5mL甘油水溶液(甘油质量为0.1mg)中，混合均匀，之后倒入平皿中，置于50-60℃环境中，干燥后，甘油能够将载药酵母细胞壁微囊束缚于平皿上；
加入40mg/mL羰基二咪唑四氢呋喃溶液活化剂，活化剂将会浮于甘油的上方，室温活化1-2h，得到表面部分活化的酵母微囊；
(4)用去离子水洗涤3-4次，去除活化剂，将表面部分活化的酵母微囊超声取下，溶于10ml去离子水中，并加入1mg葡萄糖氧化酶，4℃孵育12-24h，得到酵母仿生微纳生物机器人前体；
(5)将酵母仿生微纳生物机器人前体3000rpm离心去除未连接的酶，最后去离子水清洗三次，即得具有阴阳结构、半面葡萄糖氧化酶修饰的酵母仿生微纳生物机器人。
酵母仿生微纳生物机器人的载药率按照以下公式计算：载药率＝(加入的纳米药物的量-上清中的纳米药物的量)/加入的纳米药物的量。
本实施例制得的酵母仿生微纳生物机器人的载药率为86.32±3.5％
图1为本发明提供的酵母仿生微纳生物机器人的结构示意图，其中，A为载药纳米粒，B为酵母细胞壁微囊，C为生物酶。生物酶修饰于在酵母细胞壁微囊的半表面，呈阴阳结构。
图2为内部包埋有载纳米粒药物的酵母细胞壁微囊的荧光显微镜图(bar＝10μm)，其中，图2(1)为酵母细胞壁微囊的荧光显微镜图，图2(2)为负载吲哚菁绿纳米粒的荧光显微镜图；图2(3)为图2(1)和图2(2)的组合图，为内部包埋有负载吲哚菁绿纳米粒的酵母细胞壁微囊的荧光显微镜图，说明吲哚菁绿高效成功地包埋入酵母细胞壁微囊内。
图3为酵母细胞壁和葡萄糖氧化酶修饰的酵母仿生微纳生物机器人的透射电镜图(bar＝10μm)，其中，图3(1)为酵母细胞壁的透射电镜图，图3(2)为葡萄糖氧化酶修饰的酵母仿生微纳生物机器人的透射电镜图，从结果可以看出，葡萄糖氧化酶修饰到酵母细胞壁微囊半面，形成阴阳结构。
实施例2
一种葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶修饰的酵母仿生微纳生物机器人的制备方法，包括以下步骤：
(1)将100mg空的酵母细胞壁溶解于0.25mg木瓜蛋白酶中，55℃孵育8h，之后离心干燥得到酵母细胞壁微囊。
(2)将1μg siRNA和1mg分子量为2kDa的枝化聚乙烯亚胺溶于二甲基亚砜中，在水中透析，得到载siRNA的纳米粒；
将1mg酵母细胞壁微囊与载siRNA的纳米粒混合，37℃继续孵育24h，离心水洗，干燥即得载siRNA药物的酵母细胞壁微囊。
(3)将1mg载siRNA的载药酵母细胞壁微囊溶于0.25mg丙三醇中，混合均匀，之后倒入平皿中，丙三醇能够将载药酵母细胞壁微囊束缚于平皿上，55℃烘箱中干燥1-2小时，水洗3次，再干燥；
加入10mg N-羟基琥珀酰亚胺基氯甲酸酯活化剂，活化剂将浮于丙三醇的上方，活化2h，得到表面部分活化的酵母微囊；
(4)去除活化剂，将表面部分活化的酵母微囊超声取下，溶于10ml去离子水中，并加入1.5mg葡萄糖氧化酶和1mg过氧化氢酶，4℃孵育12-24h，得到酵母仿生微纳生物机器人前体；
(5)将溶液放入30kD的超滤管中，3000rpm离心去除未连接的酶，最后去离子水清洗三次，即得具有阴阳结构、半面葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶修饰的酵母仿生微纳生物机器人。
酵母仿生微纳生物机器人的载药率按照以下公式计算：载药率＝(加入的纳米药物的量-上清中的纳米药物的量)/加入的纳米药物的量
本实施例制得的酵母仿生微纳生物机器人的载药率为91.23±2.2％
图4为实施例2制得的葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶修饰的酵母仿生微纳生物机器人的荧光成像图(bar＝5μm)，其中，图4(1)为对酵母仿生微纳生物机器人上修饰的葡萄糖氧化酶进行的荧光成像，图4(2)为对酵母仿生微纳生物机器人上修饰的过氧化氢酶进行的荧光成像。从结果看出，葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶同时修饰在酵母细胞壁微囊半面。
葡萄糖氧化酶可以将葡萄糖分解为葡萄糖酸和过氧化氢，过氧化氢酶可进一步将过氧化氢分解为水和氧气，因此酵母细胞壁表面产生葡萄糖浓度差，导致酵母仿生微纳机器人自驱运动。图5为酵母细胞壁和实施例2制得的葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶修饰的酵母仿生微纳生物机器人在20mM葡萄糖的浓度下10s内的运动轨迹(bar＝10μm)的对比图，其中，图5(1)为酵母细胞壁的运动轨迹；图5(2)为酵母仿生微纳生物机器人的运动轨迹。可见酵母仿生微纳生物机器人在葡萄糖的驱动下产生自主运动，其运动速度为6.3μm/s。
结论：本发明所提供的酵母仿生微纳生物机器人，可作为药物的载体，且具有极高的载药量，能够自我驱动，推动微纳生物机器人的应用研究，具有显著的现实意义和实用价值。
本发明提供的酵母仿生微纳生物机器人以酵母细胞壁为模板，成本低、制备工艺简单、可大规模合成；另外，本发明提供的酵母仿生微纳生物机器人不对称修饰的生物酶可以以体内葡萄糖、脂肪等为原料，产生驱动力，安全性高。而且，本发明使用的酵母壁微囊来源于可食用酵母细胞，具有优良生物相容性，同时利用静电沉积原理，可以高效的负载载药纳米粒。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种酵母仿生微纳生物机器人，其特征在于，包括囊状结构的酵母细胞壁、位于所述酵母细胞壁内部的载药纳米粒以及不对称分布于所述酵母细胞壁表面的生物酶；
所述酵母仿生微纳生物机器人的制备方法包括以下步骤：
(1)获取酵母细胞壁；
(2)将载药纳米粒通过静电沉积方式包埋入酵母细胞壁内，得到载药酵母微囊；
(3)在步骤(2)制备的载药酵母微囊中加入掩蔽剂的水溶液，同时置于一定温度下孵育，等水分蒸发后，所述掩蔽剂将载药酵母微囊束缚于平皿上，进行部分掩蔽；
(4)在步骤(3)中制备的部分掩蔽的载药酵母微囊中加入活化剂，活化剂将浮于掩蔽剂上方，对载药酵母微囊未掩蔽的部分进行表面活化，得到表面部分活化的载药酵母微囊；
(5)将生物酶与步骤(4)制备的表面部分活化的载药酵母微囊共孵育，得到酵母仿生微纳生物机器人前体；
(6)将步骤(5)制备的酵母仿生微纳生物机器人前体纯化后，得到酵母仿生微纳生物机器人；
步骤(3)中，所述载药酵母微囊的质量与所述掩蔽剂的质量比为1:(0.01-0.25)；
所述生物酶包括但不限于葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶、脲酶、脂肪酶、胰蛋白酶、乙酰胆碱酯酶、脱氧核糖核酸酶、三磷酸腺苷酶中的至少一种；
所述掩蔽剂包括但不限于乙二醇、甘油、丙二醇水溶液、聚乙二醇、麦芽糖醇、木糖醇和山梨醇中的至少一种；
所述活化剂为羟基活化剂。
2.根据权利要求1所述的酵母仿生微纳生物机器人，其特征在于，所述载药纳米粒所载药物为小分子药物、多肽、大分子蛋白药物、基因药物、重金属捕获剂、病毒捕获剂或细菌捕获剂中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的酵母仿生微纳生物机器人，其特征在于，所述生物酶不对称半面分布于酵母细胞壁的表面，形成阴阳结构。
4.根据权利要求1-3任一项所述的酵母仿生微纳生物机器人的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)获取酵母细胞壁；
(2)将载药纳米粒通过静电沉积方式包埋入酵母细胞壁内，得到载药酵母微囊；
(3)在步骤(2)制备的载药酵母微囊中加入掩蔽剂的水溶液，同时置于一定温度下孵育，等水分蒸发后，所述掩蔽剂将载药酵母微囊束缚于平皿上，进行部分掩蔽；
(4)在步骤(3)中制备的部分掩蔽的载药酵母微囊中加入活化剂，活化剂将浮于掩蔽剂上方，对载药酵母微囊未掩蔽的部分进行表面活化，得到表面部分活化的载药酵母微囊；
(5)将生物酶与步骤(4)制备的表面部分活化的载药酵母微囊共孵育，得到酵母仿生微纳生物机器人前体；
(6)将步骤(5)制备的酵母仿生微纳生物机器人前体纯化后，得到酵母仿生微纳生物机器人。
5.根据权利要求4所述的酵母仿生微纳生物机器人的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，所述部分掩蔽的载药酵母微囊与所述活化剂的质量比为1:(40-80)。
6.根据权利要求4所述的酵母仿生微纳生物机器人的制备方法，其特征在于，步骤(5)中，所述生物酶相对于所述表面部分活化的酵母微囊过量添加。
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