CN114425043B - 一种基于巨噬细胞的活细胞载药系统及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种基于巨噬细胞的活细胞载药系统，包括活细胞和位于所述活细胞内部的载药酵母仿生微马达，其中，所述活细胞为巨噬细胞，所述载药酵母仿生微马达包括酵母细胞壁，内部的载药纳米粒和半面修饰于所述酵母细胞壁的葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶。在体自组装活细胞药物是由载药酵母仿生微马达进入人体后，主动穿透肠壁，进入肠内的淋巴系统，被其中的巨噬细胞内吞，从而在体自组装为巨噬细胞活细胞药物，能够靶向运输药物。

Description

一种基于巨噬细胞的活细胞载药系统及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于药物载体技术领域，具体涉及一种基于巨噬细胞的活细胞载药系统及其制备方法与应用。
背景技术
巨噬细胞是造血系统中最具可塑性的细胞，存在于所有组织中并显示出巨大的功能多样性。它们在生殖发育、维持稳态、组织修饰和免疫调节中发挥重要作用。巨噬细胞异常与许多炎症引起的相关疾病，包括肿瘤、肥胖、动脉粥样硬化、骨质疏松、骨硬化病、肝炎、神经退行性疾病、关节炎、胃溃疡、结肠炎、糖尿病等密切相关。其已成为炎症相关疾病的重要治疗靶点。近几年，依赖于巨噬细胞在炎症部位的募集作用，研究者通过将小鼠体内巨噬细胞提取载药后，再重新输入体内，或利用葡聚糖、壳聚糖、甘露糖等靶向巨噬细胞的特性，将其修饰于药物载体表面，成功将氧化铁纳米粒、siRNA、和小分子药物递送至炎症病灶，同时在靶向巨噬细胞给药在炎症相关疾病的成像方面也表现出巨大的应用前景。
现有技术中，将体内巨噬细胞提取载药并回输，需要对提取的巨噬细胞进行体外扩增、药物负载、细胞分选等步骤，工艺复杂；利用靶向修饰方法，将抗体等修饰于纳米粒表面，静脉给药或口服给药均需克服众多生理屏障，包括黏液层屏障、肠屏障、胃肠排空、血液粘滞性、蛋白冠形成等，严重影响药物的吸收和疗效。随着微纳技术的发展，微纳机器人因运动特性，可主动穿透生理屏障，主动规避障碍，其在药物递送领域体现了重要的应用价值。如何利用微纳生物机器人技术实现巨噬细胞靶向载药或基因编辑，从而治疗炎症相关疾病是亟待解决的难题。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺陷，本发明提出了一种基于巨噬细胞的活细胞载药系统及其制备方法和应用。所述基于巨噬细胞的活细胞载药系统包括巨噬细胞和位于所述巨噬细胞内部的载药酵母仿生微马达。其中，载药酵母仿生微马达具有自驱动功能，能够主动运动，到达巨噬细胞的所处环境后可被巨噬细胞内吞，从而形成基于巨噬细胞的活细胞载药系统。
具体通过以下技术方案实现：
一种基于巨噬细胞的活细胞载药系统，包括活细胞和位于所述活细胞内部的载药酵母仿生微马达，其中，所述活细胞为巨噬细胞，所述载药酵母仿生微马达包括酵母细胞壁、位于酵母细胞壁内部的载药纳米粒和半面修饰于所述酵母细胞壁的复合酶结构，所述复合酶结构为葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶构成的阴阳结构。
设计成阴阳结构的目的在于使表面的推动力不对称，这样才能运动。葡萄糖氧化酶将葡萄糖氧化为葡萄糖酸和双氧水，过氧化氢酶进一步将双氧水氧化为水和氧气。一方面可以分解有毒的双氧水，另一方面级联反应，产生更大的推动力。
进一步地，所述酵母细胞壁主要成分为β-(1,3)-D-葡聚糖。
进一步地，所述巨噬细胞为M1型或M2型巨噬细胞。
所述载药酵母仿生微马达通过分解葡萄糖产生动力，所述葡萄糖浓度大于等于8mM。
进一步地，所述载药纳米粒所载药物为小分子药物、多肽、大分子蛋白药物和基因药物中的一种或多种。
本发明还提供上述基于巨噬细胞的活细胞载药系统的制备方法，包括如下步骤：
(1)制备载药酵母仿生微马达；
(2)将载药酵母仿生微马达进入具有巨噬细胞的环境，巨噬细胞将所述载药酵母仿生微马达内吞，形成基于巨噬细胞的活细胞载药系统。
进一步地，所述“制备载药酵母仿生微马达”具体包括以下步骤：
(1)将酵母细胞利用酸碱法或酶消化法提取酵母细胞壁；
(2)将载药纳米粒通过静电沉积吸附进入所述酵母细胞壁内，制得载药酵母细胞壁微囊；
(3)将步骤(2)制备的载药酵母细胞壁微囊平铺在容器中，之后加入活化剂，进行表面活化，得到表面活化载药酵母细胞壁；
(4)将葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶与步骤(3)制备的表面活化载药酵母细胞壁共孵育，纯化后，得到载药酵母仿生微马达。
进一步地，步骤(3)中，所述容器为平皿，所述容器经过多聚赖氨酸包被处理。
进一步地，步骤(4)中，过氧化氢酶与葡萄糖氧化酶的质量比为1:(2-5)。
本发明还提供上述基于巨噬细胞的活细胞载药系统在制备靶向治疗巨噬细胞疾病药物中的应用。
进一步地，所述巨噬细胞疾病包括但不限于以下几种：肿瘤、肥胖、动脉粥样硬化、骨质疏松、骨硬化病、肝炎、神经退行性疾病、关节炎、胃溃疡、结肠炎、糖尿病中的一种或多种。
本发明的有益效果包括以下几个方面：
1.载药酵母仿生微马达具有自驱动，可以与巨噬细胞自组装成活细胞载药系统，安全简单方便，不需要复杂的提取巨噬细胞、培养、扩增、载药、分选等步骤；
2.酵母仿生微纳马达具有主动穿透肠屏障等生物组织障碍的作用，大大提高了药物的给药效率；
3.酵母仿生微纳马达具有特异的巨噬细胞靶向性，更加高效治疗由巨噬细胞引起的疾病。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为巨噬细胞活细胞药物的结构示意图；
图2为载药酵母仿生微马达的制备过程示意图；
图3为对载药酵母仿生微马达上的葡萄糖氧化酶及过氧化氢酶的荧光成像图；
图4为巨噬细胞活细胞药物的荧光成像图；
图5为分别口服Free Cur、CP@Y和CP@Y-robot药物后小鼠肠道内的药物分布图；
图6为分别用PBS、Free Cur、CP@Y和CP@Y-robot药物对小鼠结肠炎的治疗效果对比图，其中，图6(1)为口服PBS的对照组，图6(2)为口服游离姜黄素组，图6(3)为口服载姜黄素纳米粒酵母微囊组，图6(4)为口服载姜黄素纳米粒酵母仿生微马达组。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供了一种基于巨噬细胞的活细胞载药系统，包括活细胞和位于所述活细胞内部的载药酵母仿生微马达，其中，所述活细胞为巨噬细胞，所述载药酵母仿生微马达包括囊状结构的酵母细胞壁、位于酵母细胞壁内部的载药纳米粒和半面修饰于所述酵母细胞壁的复合酶结构，所述复合酶结构为葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶构成的阴阳结构。
在本发明中，采用囊状结构的酵母细胞壁，能够为载药纳米粒提供良好的容纳空间，并且具有规整的细胞壁表面，容易进行生物酶的半面修饰。
所述巨噬细胞可以是体外培养，或是活体内自然存在。在本发明中，尤其可应用活体内自然存在的巨噬细胞，可为人源或鼠源等。具体可为M1型巨噬细胞或M2型巨噬细胞。
进一步地，所述酵母细胞壁主要成分为β-(1,3)-D-葡聚糖。
所述载药酵母仿生微马达通过分解葡萄糖产生动力，所述葡萄糖浓度大于等于8mM。
在一些具体实施例中，载药纳米粒所载药物为小分子药物、多肽、大分子蛋白药物和基因药物中的一种或多种。
本发明还提供上述基于巨噬细胞的活细胞载药系统的制备方法，包括如下步骤：
(1)制备载药酵母仿生微马达；
(2)将载药酵母仿生微马达进入具有巨噬细胞的环境，巨噬细胞将所述载药酵母仿生微马达内吞，形成基于巨噬细胞的活细胞载药系统。
进一步地，所述“制备载药酵母仿生微马达”具体包括以下步骤：
(1)将酵母细胞利用酸碱法或酶消化法提取酵母细胞壁；
(2)将载药纳米粒通过静电沉积吸附进入所述酵母细胞壁内，制得载药酵母细胞壁微囊；
(3)将步骤(2)制备的载药酵母细胞壁微囊平铺在容器中，之后加入活化剂，进行表面活化，得到表面活化载药酵母细胞壁；
(4)将葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶与步骤(3)制备的表面活化载药酵母细胞壁共孵育，得到载药酵母仿生微马达。
进一步地，步骤(3)中，所述容器为平皿，所述容器经过多聚赖氨酸包被处理。
进一步地，步骤(4)中，过氧化氢酶与葡萄糖氧化酶的质量比为1:(2-5)。
在本发明中，当所述基于巨噬细胞的活细胞载药系统是在活体内自组装时，还包括以下步骤：用丙烯酸树脂肠衣包裹所述载药酵母仿生微马达，得到可口服的载药酵母仿生微马达。通过肠衣包裹，可以使载药酵母仿生微马达能够进入肠胃等目标区域。
具体的，所述可口服的载药酵母仿生微马达进入体内后，可在肠道派尔式结内形成巨噬细胞活细胞药物，即形成基于巨噬细胞的活细胞载药系统。
本发明还提供上述基于巨噬细胞的活细胞载药系统在制备靶向治疗巨噬细胞疾病药物中的应用。
进一步地，所述巨噬细胞疾病包括但不限于以下几种：肿瘤、肥胖、动脉粥样硬化、骨质疏松、骨硬化病、肝炎、神经退行性疾病、关节炎、胃溃疡、结肠炎、糖尿病中的一种或多种。
实施例
一种在活体内形成基于巨噬细胞的活细胞载药系统的制备方法：
(1)提取酵母细胞壁：将500mg酿酒酵母溶解于10mL浓度为1M的NaOH溶液中，于80℃孵育1h，之后3000rpm离心10min，弃去上清，双蒸水洗涤2次后，加入10mL1M的HCl，60℃孵育1h，之后3000rpm离心水洗2次，再加入50mL异丙醇洗涤4次，用50mL丙酮洗涤2次，离心弃上清，干燥后得到空的带负电荷的酵母细胞壁。
(2)制备负载姜黄素的阳离子纳米粒：将10mg姜黄素和5mg分子量为2kDa的枝化聚乙烯亚胺溶于二甲基亚砜中，在水中透析，得到载姜黄素的阳离子纳米粒。
(3)制备负载药物的酵母细胞壁微囊：将100mg空的带负电的酵母细胞壁溶解于0.1M碳酸氢纳缓冲液中，37℃孵育30min，之后加入载10mg载药阳离子纳米粒，37℃继续孵育24h，阳离子载药纳米粒吸附并沉积进入酵母细胞壁内，离心水洗4次，干燥即得载药酵母细胞壁微囊。
(4)制备多聚赖氨酸包被的平皿：将0.1mg/ml-0.025mg/ml多聚赖氨酸加入平皿中，37℃孵育2h或室温孵育过夜，然后吸取液体，表面晾干，即得多聚赖氨酸包被的平皿。
(5)铺板：将10mg(3)中制得的载药酵母细胞壁微囊水溶液加入到6cm培养皿中。静置1-2h后，吸取上清，双蒸水清洗3遍后，放入37℃烘箱中烘干备用。
(6)活化：将羰基二咪唑溶于四氢呋喃中，配置0.1-1M溶液，并将其加入到(5)平皿中，活化2-3小时，之后水洗3次。
(7)连接：将1-3mg过氧化氢酶和3-9mg葡萄糖氧化酶加入到(6)中，4℃反应过夜，或室温孵育4-6小时。
(8)将(7)制备的酵母微纳马达前体进行水洗3次，之后10kHz超声3-6min，收集溶液离心，沉淀即为酵母仿生微马达。
(9)将1-3mg丙烯酸树脂肠衣与10mg载药酵母仿生微马达放入磁力搅拌器中搅拌6-12小时，即得可口服的载药酵母仿生微马达；
(10)每次口服1-5mg载药酵母仿生微马达后，在肠道派尔式结内形成巨噬细胞活细胞药物，即基于巨噬细胞的活细胞载药系统。
实验例
将3％的葡萄糖硫酸钠(DSS)加入到小鼠饮用水中，连续饮用9天。以制备小鼠结肠炎模型。从第三天开始分为四组：对照组(口服PBS)、游离姜黄素组(Free Cur)、载姜黄素纳米粒酵母微囊组(CP@Y)和载姜黄素纳米粒酵母仿生微马达组(CP@Y-robot)。每隔两天口服以上三种药物(姜黄素当量为10μg/g)。第10天腹腔注射炎症检测探针(L-012)利用小动物成像观察结肠炎的治疗效果。
图1为巨噬细胞活细胞药物的结构示意图，其中，1为巨噬细胞，2为载药酵母仿生微马达。图2为载药酵母仿生微马达制备过程示意图，先将酵母细胞A进行酸碱处理，提取其细胞壁，然后将载药纳米粒通过静电吸附引入到酵母细胞壁中，形成载药酵母细胞壁微囊C。接着将载药酵母细胞壁微囊C进行操作D，即平铺活化，然后超声分散(操作E)，得到半面活化的载药酵母细胞壁微囊F。将载药酵母细胞壁微囊F与葡萄糖氧化酶G和过氧化氢酶H进行反应，得到酵母仿生微马达I，包裹上肠衣(操作J)，得到可口服的酵母仿生微马达。
图3为载药酵母仿生微马达的荧光成像图，其中，图3(1)为对葡萄糖氧化酶进行的荧光成像图，图3(2)为对过氧化氢酶进行的荧光成像图，图3(3)为对葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶同时进行的荧光成像图。可以看出，酵母细胞壁微囊半面修饰有葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶。
图4为巨噬细胞活细胞药物的荧光成像图，其中，图4(1)为负载姜黄素的酵母仿生微马达，图4(2)为Dil标记的巨噬细胞，图4(3)为DAPI染色的酵母细胞细胞核，图4(4)为同时对负载姜黄素的酵母仿生微马达、巨噬细胞以及酵母细胞细胞核进行荧光成像。
图5为药物分布图，口服Free Cur、CP@Y和CP@Y-robot药物后，小鼠安乐死，取出肠道进行小动物成像观察姜黄素在肠道的保留情况结果。其中，图5(1)为口服Free Cur药物后的荧光成像图，图5(2)为口服CP@Y药物后的荧光成像图，图5(3)为口服CP@Y-robot药物后的荧光成像图。从结果可见，Free Cur组无可见荧光，说明几乎没有姜黄素保留在肠道内，CP@Y组有可见荧光，说明有姜黄素保留在肠道内，CP@Y-robot组有非常强的荧光，说明酵母机器人主动穿透肠粘液层并克服了胃肠的排空，显著增加了姜黄素保留，大大提高了给药效率。
图6为第10天后的治疗效果图。当注射炎症探针后(L-012),进行小动物成像，荧光越强，炎症越严重。从结果可见，对照组(参见图6(1))有强烈的荧光，说明结肠炎模型造模成功，当口服Free Cur后(参见图6(2))，并没有降低荧光强度，说明Free Cur很少保留在肠道内，几乎对结肠炎无治疗效果；当口服CP@Y后(参见图6(3))，荧光强度有一定的降低，说明炎症减轻，CP@Y对结肠炎有一定的治疗效果；当口服CP@Y-robot后(参见图6(4))，腹腔部位有微弱的荧光，说明仅有微弱的炎症反应，CP@Y-robot大大增加了药物的治疗效果。因为小鼠一直在口服DSS，炎症刺激一直在，所以CP@Y-robot并不能完全治愈结肠炎。
本发明的有益效果包括以下几个方面：
1.载药酵母仿生微马达具有自驱动，可以与巨噬细胞自组装成活细胞载药系统在体自主装形成活细胞药物，安全简单方便，不需要复杂的提取巨噬细胞、培养、扩增、载药、分选等步骤；
2.酵母仿生微纳马达具有主动穿透肠屏障等生物组织障碍的作用，大大提高了药物的给药效率；
3.酵母仿生微纳马达具有特异的巨噬细胞靶向性，更加高效治疗由巨噬细胞引起的疾病。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种基于巨噬细胞的活细胞载药系统，其特征在于，包括活细胞和位于所述活细胞内部的载药酵母仿生微马达；其中，所述活细胞为巨噬细胞，所述载药酵母仿生微马达包括酵母细胞壁、位于酵母细胞壁内部的载药纳米粒和半面修饰于所述酵母细胞壁的复合酶结构，所述复合酶结构为葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶构成的阴阳结构；
所述载药酵母仿生微马达的制备具体包括以下步骤：
（1）将酵母细胞利用酸碱法或酶消化法提取酵母细胞壁；
（2）将载药纳米粒通过静电沉积吸附进入所述酵母细胞壁内，制得载药酵母细胞壁微囊；
（3）将步骤（2）制备的载药酵母细胞壁微囊平铺在容器中，之后加入活化剂，进行表面活化，得到表面活化载药酵母细胞壁；
（4）将葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶与步骤（3）制备的表面活化载药酵母细胞壁共孵育，得到载药酵母仿生微马达；
步骤（3）中，所述容器为平皿，所述容器经过多聚赖氨酸包被处理；
步骤（4）中，过氧化氢酶与葡萄糖氧化酶的质量比为1:（2-5）。
2.根据权利要求1所述的基于巨噬细胞的活细胞载药系统，其特征在于，所述酵母细胞壁主要成分为β-(1,3)-D-葡聚糖。
3.根据权利要求1所述的基于巨噬细胞的活细胞载药系统，其特征在于，所述巨噬细胞为M1型或M2型巨噬细胞。
4.根据权利要求1所述的基于巨噬细胞的活细胞载药系统，其特征在于，所述载药纳米粒所载药物为小分子药物、多肽、大分子蛋白药物和基因药物中的一种或多种。
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