CN113999835A - 一种口形红细胞结构的载酶胶体囊微马达的制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种口形红细胞结构的载酶胶体囊微马达的制备方法，以二氧化硅、四氧化三铁纳米颗粒和过氧化氢酶以及泊洛沙姆初始材料制备水相溶液，再将水相溶液与正丁醇类有机溶液高速乳化，离心洗涤以及静置沉降制取。本发明微马达具有类似口形红细胞的天然不对称结构，兼具可调运动速率和可控导向的性能，克服了传统微马达运动速率依赖于人为改变燃料浓度、催化剂浓度和运动方向难以精准可控的局限性，制备过程简单，无需使用昂贵仪器，生物相容性良好，在环境修复和生物医学等领域具有巨大的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及自驱动微马达技术领域，具体涉及一种口形红细胞结构的载酶胶体囊微马达的制备方法。
背景技术
在生物系统中，分子常常通过自我组装形成生物分子马达(例如驱动蛋白)，并利用ATP等化学能作为能量来源去执行一些重要的任务。受此启发，在过去的十多年中，科学家们制造了各种能够将化学能或其它形式能量转化为自身机械运动的微纳米马达。其中，气泡驱动型微马达由于强大的推力、超快的移动速度以及通用性等诸多优势受到广泛的研究，已经成功的应用在包括药物递送、生物传感、水质监测、环境修复等领域。对于各种实际应用来说，微马达运动的精准控制是至关重要的。
现阶段，微马达运动控制的研究目前主要集中在运动速度和方向上。其中，目前对微马达运动速率主要依赖于人为改变燃料浓度(Keller S et a1.High-ThroughputDesign ofBiocompatible Enzyme-Based Hydrogel Microparticles with AutonomousMovement[J].Angewandte Chemie International Edition，2018，57(31))或者催化剂浓度(Xueqing Zhang et al.Bubble-Propelled Jellyfish-like Micromotors for DNASensing[J].ACS applied materials&interfaces，2019，11，13581-13588)调控，燃料浓度受限于外部环境条件，催化剂浓度受限于催化剂的固载量，这限制了微马达的实际应用。
最近，Li等人报道了一种借助不同金属催化剂催化特性来调节运动速率的金属有机框架(MOFs)微马达(Jinxing Li et al.Metal-Organic Frameworks as Micromotorswith Tunable Engines and Brakes[J].Journal ofthe American Chemical Society，2017，139(2)：611)，然而，MOFs配位聚合物材料稳定性欠佳，所使用的金属例如钴、锰等存在价格昂贵以及重金属污染带来的环境问题。Zhang等人公开了一种pH响应双向运动的Janus微马达及其制备方法(CN202110678940.6)，但是，该方法仍然需要通过改变外部环境中溶液的pH值来调整微马达的运动速度，对其运动方向难以实现有效调控。Keller等人使用微流控法构建了可调运动的酶驱动凝胶微马达(Keller S et al.A Microfluidic Toolfor Fine-Tuning Motion of Soft Micromotors[J].Advanced Functional Materials，2019：1904889)，展示了凝胶微马达的粗糙度以及形状对运动速率以及轨迹的影响。然而，表面粗糙度对运动速率的调控是有限的，也难以实现对其运动轨迹的精确导向，并且所使用的紫外光照射引发高分子交联的方法存在生物形容性问题。
因此，利用生物友好的方法开发一种兼具可调速率以及可导向的酶驱动微马达来满足各种应用场合的需求仍然是迫切的。
发明内容
本发明针对现有技术存在的问题提供一种口形红细胞结构的载酶胶体囊微马达的制备方法，旨在通过制备得到的不对称性的酶驱动胶体囊微马达具有可调的运动速率以及可导向的多功能特性以及很好的生物相容性，且制备过程简单，无需使用昂贵的仪器设备，可大规模化生产。
为实现上述目的，本发明提供的技术方案是：
一种口形红细胞结构的载酶胶体囊微马达的制备方法，包括以下步骤：
(1)水相溶液的制备：将0.1mL的二氧化硅纳米颗粒分散液、0.2mL的酶溶液和一定量的泊洛沙姆(表面活性剂)使用涡旋混合仪混合均匀，作为A液；或者A液中含有一定量的四氧化三铁；
(2)有机相溶液的准备：量取一定体积作为B液；
(3)将A液与B液按照先后顺序依次添加到试管中，然后使用高速均质分散器以10000rpm的转速乳化1min，进行上下翻转的操作后转移至含有B液的离心管中静置6h；
(4)随后，使用去离子水对上述离心管内混合液进行离心洗涤操作，再加入一定量的去离子水分散；
(5)载酶胶体囊微马达的获得：转移上述步骤(4)所获得的分散液到一次性培养皿中，自然静置沉降3-5min，弃去底部的胶体囊，收集上清溶液，即可得到口形红细胞结构的载酶胶体囊微马达。
进一步的，二氧化硅纳米颗粒分散液是质量分数为30wt％-40wt％，二氧化硅纳米颗粒的粒径为10nm-30nm。
进一步的，酶溶液是将50mg的过氧化氢酶分散在5mL磷酸盐缓冲液中，(配制0.05mol·L-1的磷酸氢二钠溶液，记为甲溶液；配置0.05mol.L-1的磷酸二氢钠溶液，记为乙溶液；将甲溶液逐渐滴加至一定量的乙溶液中，直至混合液的pH值为7)通过磁力搅拌器混匀，磁力搅拌的转速为200转/分，充分混合后所得。
进一步的，所述步骤(1)中加入泊洛沙姆的质量为A液(水相溶液)的百分之一。
进一步的，所述步骤(2)中有机相溶液包括正丁醇、三乙酸甘油酯以及丙烯乙二醇中的一种或者多种混合。
进一步的，所述步骤(3)中B液与A液的体积比大于等于30。
进一步的，离心机的转速为4000转/分，时间为5min，共洗涤3次。
进一步的，口形红细胞结构的载酶胶体囊微马达直径为4-16μm。
步骤(1)中所述水相溶液里的纳米颗粒类型不局限于二氧化硅纳米颗粒。
步骤(1)中所述水相溶液里的酶作为微马达的催化剂来源不局限于过氧化氢酶。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1)本发明制备得到的口形红细胞结构的载酶胶体囊微马达具有可调节的运动速率，通过自组装不同大小的纳米颗粒导致胶体囊的孔隙变化，影响外部燃料如过氧化氢扩散进胶体囊的快慢，来调控微马达的运动速率，满足不同应用场景中对微马达运动性能的需求。
(2)本发明制备得到的口形红细胞结构的载酶胶体囊微马达具有可控导向的特性，可通过外场磁铁对微马达的运动行为进行精准控制。
(3)本发明的制备方法与其他制备酶催化微纳米马达的方法相比，酶在自组装过程中更加温和地固定在胶体囊微马达壳间，无需任何化学交联，弥补了现有酶驱动微纳米马达的制备过程繁琐、酶活保留低的不足。
(4)本发明的制备方法无需使用昂贵的仪器设备，制备过程简单，易于大规模化生产。
附图说明
图1为磁性口形红细胞结构的载酶胶体囊微马达的形成机理图(颗粒团内部是水相，外部是正丁醇相)。
图2为磁性口形红细胞结构的载酶胶体囊微马达的运动示意图。
图3为磁性口形红细胞结构的载酶胶体囊微马达在磁铁引导下形成的“I”形运动轨迹。
图4为磁性口形红细胞结构的载酶胶体囊微马达在磁铁引导下形成的“L”形运动轨迹。
图5为磁性口形红细胞结构的载酶胶体囊微马达在磁铁引导下形成的“J”形运动轨迹。
图6为磁性口形红细胞结构的载酶胶体囊微马达在磁铁引导下形成的“V”形运动轨迹。
图7为口形红细胞结构的载酶胶体囊微马达表面形貌的扫描电镜图。
图8为口形红细胞结构的载酶胶体囊微马达断面结构的扫描电镜图。
图9为口形红细胞结构的载酶胶体囊微马达在不同时间段对污染物(亚甲基蓝)的去除率。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1
一种口形红细胞结构的载酶胶体囊微马达及其制备方法，包括以下步骤：
(1)水相溶液的制备：将0.1mL的二氧化硅纳米颗粒分散液(粒径30nm，浓度40wt％即是，二氧化硅纳米颗粒为40wt％，水为60wt％)、0.2mL的过氧化氢酶溶液(浓度10mg·mL-1)、3.3mg的泊洛沙姆和5.2mg的四氧化三铁纳米颗粒(粒径25nm)使用涡旋混合仪混合均匀，作为A液；
(2)有机相溶液的准备：量取9mL的正丁醇溶液作为B液；
(3)将A液与B液按照先后顺序依次添加到试管中，然后使用高速均质分散器以10000rpm的转速乳化1min，进行上下翻转的操作后转移至含有6mL正丁醇的离心管中静置6h；
(4)随后，使用去离子水对上述离心管内混合液进行离心洗涤操作，再加入一定量的去离子水分散；
(5)磁性载酶微马达的获得：转移上述步骤(4)所获得的分散液到一次性培养皿中，自然静置沉降3-5min，弃去底部的胶体囊，收集上清溶液，即可得到磁性口形红细胞结构的载酶胶体囊微马达。
本实施例制备得到的磁性口形红细胞结构的载酶胶体囊微马达形成机理如图1所示。最初，在总界面自由能最小化的驱动下，乳液界面上自发吸收一层纳米颗粒(t0)；接着，由于水在正丁醇中有着较大的溶解度，产生了类似强力“泵”的效应，使得内部水相快速扩散到周围的正丁醇相，原形成的纳米颗粒层收缩，颗粒之间紧密接触(t1)；自组装后期，随着水向正丁醇的继续扩散，形成的多壳层胶体囊进一步向内收缩(t2)，引起纳米颗粒与酶的拉伸与挤出，形成了“口形”的缺口(t3)，最终形成的具有口形红细胞结构的磁性载酶胶体囊微马达。图2为过氧化氢溶液中的磁性口形红细胞结构的载酶胶体囊微马达在外部磁铁引导下自由导向的自驱动示意图。图3-6所示，磁性口形红细胞结构的载酶胶体囊微马达在外部磁铁引导下轻易地实现“I”、“L”、“J”和“V”等不同字母轨迹的定向运动。
实施例2
一种口形红细胞结构的载酶胶体囊微马达及其制备方法，包括以下步骤：
(1)水相溶液的制备：将0.1mL的二氧化硅纳米颗粒分散液(粒径30nm，浓度40wt％)、0.2mL的过氧化氢酶溶液(浓度10mg·mL-1)、3.3mg的泊洛沙姆使用涡旋混合仪混合均匀，作为A液；
(2)有机相溶液的准备：量取9mL的正丁醇溶液作为B液；
(3)将A液与B液按照先后顺序依次添加到试管中，然后使用高速均质分散器以10000rpm的转速乳化1min，进行上下翻转的操作后转移至含有6mL正丁醇的离心管中静置6h；
(4)随后，使用去离子水对上述离心管内混合液进行离心洗涤操作，再加入一定量的去离子水分散；
(5)载酶胶体囊微马达的获得：转移上述步骤(4)所获得的分散液到一次性培养皿中，自然静置沉降3-5min，弃去底部的胶体囊，收集上清溶液，即可得到口形红细胞结构的载酶胶体囊微马达。所制备的微马达中过氧化氢酶的酶活力保留率为90％。
将制备的口形红细胞结构的载酶胶体囊微马达分散在载玻片上，使用生物显微镜下对所制备微马达进行显微拍照，并利用软件Image-J测量200个微马达的直径。制备得到的口形红细胞结构的载酶胶体囊微马达大小比较均一，粒径大小范围在4-16μm之间，经软件统计计算可得平均粒径大小为8.07μm。
将制备的口形红细胞结构的载酶胶体囊微马达分散在载玻片上，置于恒温干燥箱中在37℃下烘干处理，随后对其进行场发射扫描电镜的表征。如图7和图8所示，其中图7为扫描电镜拍摄的载酶胶体囊微马达的表面形貌图，图8为载酶胶体囊微马达的断面扫描电镜图，以上结果表明载酶胶体囊微马达具有类似口形红细胞的不对称结构。
将制备的口形红细胞结构的载酶胶体囊微马达置于过氧化氢溶液中，发现口形红细胞结构的载酶胶体囊微马达在其负载的过氧化氢酶与过氧化氢发生催化反应下，实现了喷气式的自驱动，在2％的过氧化氢浓度下微马达具有最大的运动速率。
实施例3
一种口形红细胞结构的载酶胶体囊微马达及其制备方法，包括以下步骤：
(1)水相溶液的制备：将0.1mL的二氧化硅纳米颗粒分散液(粒径10nm，浓度30wt％)、0.1mL的过氧化氢酶溶液(浓度10mg·mL-1)和2.2mg的泊洛沙姆使用涡旋混合仪混合均匀，作为A液；
(2)有机相溶液的准备：量取6mL的正丁醇溶液作为B液；
(3)将A液与B液按照先后顺序依次添加到试管中，然后使用高速均质分散器以10000rpm的转速乳化1min，进行上下翻转的操作后转移至含有4mL正丁醇的离心管中静置6h；
(4)随后，使用去离子水对上述离心管内混合液进行离心洗涤操作，再加入一定量的去离子水分散；
(5)载酶胶体囊微马达的获得：转移上述步骤(4)所获得的分散液到一次性培养皿中，自然静置沉降3-5min，弃去底部的胶体囊，收集上清溶液，即可得到口形红细胞结构的载酶胶体囊微马达。
将制备的口形红细胞结构的载酶胶体囊微马达置于2wt％的过氧化氢溶液中，拍摄记录其自主运动的视频。经Image J软件分析计算微马达的平均运动速率为29.87μm·s-1。
实施例4
一种口形红细胞结构的载酶胶体囊微马达及其制备方法，包括以下步骤：
(1)水相溶液的制备：将0.1mL的二氧化硅纳米颗粒分散液(粒径20nm，浓度30wt％)、0.1mL的过氧化氢酶溶液(浓度10mg.mL-1)和2.2mg的泊洛沙姆使用涡旋混合仪混合均匀，作为A液；
(2)有机相溶液的准备：量取6mL的正丁醇溶液作为B液；
(3)将A液与B液按照先后顺序依次添加到试管中，然后使用高速均质分散器以10000rpm的转速乳化1min，进行上下翻转的操作后转移至含有4mL正丁醇的离心管中静置6h；
(4)随后，使用去离子水对上述离心管内混合液进行离心洗涤操作，再加入一定量的去离子水分散；
(5)载酶胶体囊微马达的获得：转移上述步骤(4)所获得的分散液到一次性培养皿中，自然静置沉降3-5min，弃去底部的胶体囊，收集上清溶液，即可得到口形红细胞结构的载酶胶体囊微马达。
将制备的口形红细胞结构的载酶胶体囊微马达置于2wt％的过氧化氢溶液中，拍摄记录其自主运动的视频。经Image J软件分析计算微马达的平均运动速率为56.48μm·s-1。
实施例5
一种口形红细胞结构的载酶胶体囊微马达及其制备方法，包括以下步骤：
(1)水相溶液的制备：将0.07mL的二氧化硅纳米颗粒分散液(粒径30nm，浓度40wt％)、0.03mL的磷酸盐缓冲液(配制0.05mol.L-1的磷酸氢二钠溶液，记为甲溶液；配置0.05mol·L-1的磷酸二氢钠溶液，记为乙溶液；将甲溶液逐渐滴加至一定量的乙溶液中，直至混合液的pH值为7)、0.1mL的过氧化氢酶溶液(浓度10mg·mL-1)和2.2mg的泊洛沙姆使用涡旋混合仪混合均匀，作为A液；
(2)有机相溶液的准备：量取6mL的正丁醇溶液作为B液；
(3)将A液与B液按照先后顺序依次添加到试管中，然后使用高速均质分散器以10000rpm的转速乳化1min，进行上下翻转的操作后转移至含有4mL正丁醇的离心管中静置6h；
(4)随后，使用去离子水对上述离心管内混合液进行离心洗涤操作，再加入一定量的去离子水分散；
(5)载酶胶体囊微马达的获得：转移上述步骤(4)所获得的分散液到一次性培养皿中，自然静置沉降3-5min，弃去底部的胶体囊，收集上清溶液，即可得到口形红细胞结构的载酶胶体囊微马达。
将制备的口形红细胞结构的载酶胶体囊微马达置于2wt％的过氧化氢溶液中，拍摄记录其自主运动的视频。经Image J软件分析计算微马达的平均运动速率为191.93μm·s-1。
实施例6
一种口形红细胞结构的载酶胶体囊微马达及其制备方法，包括以下步骤：
(1)水相溶液的制备：将0.1mL的二氧化硅纳米颗粒分散液(粒径30nm，浓度40wt％)、0.2mL的过氧化氢酶溶液(浓度1mg·mL-1)和3.3mg的泊洛沙姆使用涡旋混合仪混合均匀，作为A液；
(2)有机相溶液的准备：量取9mL的正丁醇溶液作为B液；
(3)将A液与B液按照先后顺序依次添加到试管中，然后使用高速均质分散器以10000rpm的转速乳化1min，进行上下翻转的操作后转移至含有6mL正丁醇的离心管中静置6h；
(4)随后，使用去离子水对上述离心管内混合液进行离心洗涤操作，再加入一定量的去离子水分散；
(5)载酶胶体囊微马达的获得：转移上述步骤(4)所获得的分散液到一次性培养皿中，自然静置沉降3-5min，弃去底部的胶体囊，收集上清溶液，即可得到口形红细胞结构的载酶胶体囊微马达。
将制备的口形红细胞结构的载酶胶体囊微马达置于含有亚基机蓝(20g·L-1)的2wt％过氧化氢溶液中，使用紫外-可见分光光度计每间隔15min对去除过程进行定量研究。如图9所示，在t＝120min时，样品I(空白)和样品II(过氧化氢酶溶液)中亚甲基蓝(MB)的最终去除率分别从0提高到4.7％和2.4％，基本保持不变，表明MB仅发生轻微的降解。在t＝120min时，样品III(胶体囊)的去除率从0提高到41.7％，表明静态的胶体囊具备吸附MB的能力。样品IV(载酶胶体囊微马达)结果显示，MB的去除率从0显著提高到92.1％，表明载酶胶体囊微马达具有增强吸附去除MB的能力。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上的限制，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，依据本发明的技术实质，对以上实施例所作的任何简单的修改、等同替换与改进等，均仍属于本发明技术方案的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种口形红细胞结构的载酶胶体囊微马达的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)水相溶液的制备：将0.1mL的二氧化硅纳米颗粒分散液、0.2mL的酶溶液和一定量的泊洛沙姆(表面活性剂)使用涡旋混合仪混合均匀，作为A液，或者，A液中含有一定量的四氧化三铁纳米颗粒；
(2)有机相溶液的准备：量取一定体积作为B液；
(3)将A液与B液按照先后顺序依次添加到试管中，然后使用高速均质分散器以10000rpm的转速乳化1min，进行上下翻转的操作后转移至含有B液的离心管中静置6h；
(4)随后，使用去离子水对上述离心管内混合液进行离心洗涤操作，再加入一定量的去离子水分散；
(5)载酶胶体囊微马达的获得：转移上述步骤(4)所获得的分散液到一次性培养皿中，自然静置沉降3-5min，弃去底部的胶体囊，收集上清溶液，即可得到口形红细胞结构的载酶胶体囊微马达。
2.根据权利要求1所述口形红细胞结构的载酶胶体囊微马达的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中二氧化硅纳米颗粒分散液的质量分数为30wt％-40wt％，二氧化硅纳米颗粒的粒径为10nm-30nm。
3.根据权利要求1所述口形红细胞结构的载酶胶体囊微马达的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中酶溶液是将50mg的过氧化氢酶分散在5mL磷酸盐缓冲液中，(配制0.05mol·L-1的磷酸氢二钠溶液，记为甲溶液；配置0.05mol·L-1的磷酸二氢钠溶液，记为乙溶液；将甲溶液逐渐滴加至一定量的乙溶液中，直至混合液的pH值为7)通过磁力搅拌器混匀，磁力搅拌的转速为200转/分，充分混合后所得。
4.根据权利要求1所述口形红细胞结构的载酶胶体囊微马达的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中加入泊洛沙姆的质量为A液(水相溶液)的百分之一。
5.根据权利要求1所述口形红细胞结构的载酶胶体囊微马达的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中B液与A液的体积比大于等于30；所述步骤(2)中有机相溶液包括正丁醇、三乙酸甘油酯以及丙烯乙二醇中的一种或多种。
6.根据权利要求1所述口形红细胞结构的载酶胶体囊微马达的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中的离心洗涤操作，离心机的转速为4000转/分，时间为5min，共洗涤3次。
7.根据权利要求1所述一种口形红细胞结构的载酶胶体囊微马达的制备方法，其特征在于，所述载酶胶体囊微马达的直径为4-16μm。
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