CN116686994A - 一种仿生矿化制备单分散高存活率益生菌微囊的方法 - Google Patents
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Abstract
一种仿生矿化制备单分散高存活率益生菌微囊的方法。矿化涂覆的益生菌，海藻酸钠，二氧化硅和脲酶充分混合后通入微流控装置内相进料管，在外相的剪切作用下形成单分散液滴；由于外相对内水相的萃取作用，液滴中的二氧化硅被分散到液滴界面并形成初始微囊；初始微囊被收集到含有氯化钙和尿素的溶液中，在脲酶的催化作用下，尿素被分解为碳酸根离子和钙离子在微囊表面生成碳酸钙；海藻酸钠和钙离子进一步凝胶化从得到益生菌微囊。微囊具有顺序胃肠道抵抗能力，具有高的小鼠结肠益生菌定植率，并且对结肠炎小鼠有优异的治疗效果。
Description
技术领域
本发明属于益生菌微胶囊领域，具体涉及一种仿生矿化制备单分散高存活率益生菌微囊的方法。
背景技术
人类自然的与胃肠道中100万亿微生物共生。这些微生物建立了一个复杂但高度有序的生态系统，维持宿主的生理稳态和机体功能。微生物生态系统的紊乱通常会导致肥胖、糖尿病、炎症性肠炎、癌症等疾病的高发，严重影响人类健康。
口服益生菌疗法因其低耐药性和独特的调节肠道菌群的优势，是最有前途的预防和治疗疾病的方法之一。递送的益生菌首先在结肠部位聚集，然后通过抑制病原体的定植和调节微生物的组成发挥积极的治疗作用。然而，口服益生菌给药缺乏足够的递送效率，原因在于益生菌在到达结肠部位前受到来自胃肠道的极端酸性，消化酶和胆汁盐的侵蚀导致活力和生物活性的巨大丧失，极大的限制了治疗效果以及进一步的应用。此外，储存过程中益生菌活性的降低也是影响治疗效果的关键因素。
益生菌封装是最有望用于解决益生菌口服递送限制的方法。公开号为CN114081183A(申请号为202111404381.6)的中国专利公开了一种益生菌微胶囊的制备方法：通过将益生菌和益生元组成的芯材，海藻酸钠，乳清蛋白和淡黄革孔菌提取物组成的囊材高压均质后经喷雾干燥得到益生菌微胶囊。公开号为CN115381101A(申请号为202211061653.1)的中国专利公开了一种基于复合凝聚法制备益生菌微胶囊的方法：通过以改性大豆蛋白和植物或微生物来源的多糖为壁材，以益生菌为芯材，并使用非酶方式的双重固化剂对壁材进行固化处理制备益生菌微胶囊。国内外也进行了很多相关的研究。
例如Rui Wang等人将聚-γ-谷氨酸改性后和益生菌混合，通过微流控装置生成处尺寸均一可控的单分散液滴，并在可见光条件下固化形成益生菌微囊，提高益生菌抗酸性并能够智能响应炎症因子靶向释放(Rui Wang,et al.Advanced Functional Materials2022,DOI:10.1002/adfm.2021130342113034.)。Qikun Cheng等人通过共挤压法首先将益生菌封装在海藻酸钙微胶囊中，接着通过静电相互作用在微胶囊表面交替包覆海藻酸钙和鱼精蛋白，从而制备出具有肠靶向能力的益生菌微胶囊(Qikun Cheng,et al.Adv HealthcMater 2021,10,e2001953.)。虽然上述专利和方法在一定程度上提高了益生菌在胃肠道恶劣环境中的存活率，但他们的保护策略仅仅是提高囊材的传质阻力，不能顺序抵抗胃肠道环境压力，保护能力有待进一步提高。而且，这些方法大多使益生菌在到达结肠部位前就提前释放，可能使对小肠上端环境敏感的益生菌提前死亡，从而导致生物活性下降。
发明内容
本发明的目的是提出一种仿生矿化制备单分散高存活率益生菌微囊的方法，旨在具有顺序抵抗胃肠道环境压力，提高益生菌在长期储存和口服后在胃肠道恶劣环境中的存活率，并将其顺利的按需释放在结肠部位。
本发明的目的是这样实现的：一种仿生矿化制备单分散高存活率益生菌微囊的微流控装置包括内相进料管(100)向右部为锥形管(200)；外相进料管(300)套装在内相进料管(100)和出料管(400)上，出料管(400)套装在内相进料管(100)的锥形管(200)上，外相进料管(300)右端与出料管(400)外壁直接形成封口；内相进料管的左端进料口和出料管的右端出料口向外伸出；上述内相进料管(100)，外箱进料管(300)和出料管(400)同轴设置；内相进料管和外相进料管分别连接注射泵；
本发明的另一目的是提供一种仿生矿化制备单分散高存活率益生菌微囊的方法，包括以下步骤：
步骤1：取2～10mL对数生长期的益生菌，PBS洗涤两次，冷冻离心机4摄氏度6000转/分离心5min，将益生菌和10～50mg脲酶分散于4～20mL的10～25mM氯化钙溶液中，磁力搅拌200转/分，搅拌10～15分钟。
步骤2：将4～20mL的10～25mM尿素溶液加入到步骤1的混合溶液中，磁力搅拌200转/分，搅拌30～60分钟，冷冻离心机4摄氏度6000转/分离心5min，收集沉淀得到矿化涂覆益生菌。
步骤3：将步骤2得到的矿化涂覆益生菌和脲酶，海藻酸钠，二氧化硅充分混合，得到混合溶液A，溶液中益生菌浓度为108～109CFU mL-1，脲酶浓度为2.5～5mg·mL-1，海藻酸钠浓度为1～2wt.％，二氧化硅浓度为8～13wt.％。
步骤4：将氯化钙和尿素加入到去离子水中，形成混合溶液B，混合溶液中氯化钙含量20～50mg·mL-1，尿素含量20～50mg·mL-1。
步骤5：内相进料管和外相进料管分别连接注射泵，分别连续注射入混合溶液A和正丁醇；调节内相进样流量为10～20μL·min-1，外相进样流量为10～100μL·min-1，混合溶液A在内相锥形管处被外相正丁醇剪切为尺寸均一、大小可控的单分散液滴，并由于外相对内水相的萃取作用下，液滴中的二氧化硅纳米颗粒被吸引到液滴界面并紧密堆积形成初始微囊。
步骤5中所述初始微囊在出料管流动1～3min后被收集并分散到混合溶液B中静置反应6～12h，微囊中的脲酶催化混合溶液B中的尿素生成碳酸根离子，并和钙离子反应在微囊表面进一步包覆碳酸钙，海藻酸钠和钙离子凝胶化固定微囊结构，最终得到益生菌微囊。
本发明与现有技术相比，具有如下优点：
(1)本发明基于仿生矿化和微流控技术制备出益生菌微囊，全过程绿色温和，生物相容，能够简单的调节微流控内外相进样流量从而控制囊的大小和益生菌的负载量；
(2)本发明提出的益生菌微囊具有顺序胃肠道环境抵抗能力，最外层碳酸钙层有效中和胃酸，中间层高传质阻力的二氧化硅纳米粒子和海藻酸钙凝胶阻止胆汁盐和消化酶的向内渗透；
(3)本发明制备的益生菌微囊在模拟胃液中2h，益生菌活菌率为64～66％；在模拟肠液中4h，益生菌活菌率为74～78％；包封益生菌连续经过胃肠道后到达结肠的存活率为61％，而游离益生菌这项数据为0。
(4)本发明制备的益生菌微囊能够按需释放在结肠。微囊在模拟胃液和模拟小肠液中8h基本不释放，而在结肠液中能够完全释放益生菌；
(5)通过在益生菌表面矿化涂覆，有限的物质交换和繁殖空间，包封益生菌的微囊分散在水中在长达32天的储存中，活菌率为58～63％。
本发明基于仿生矿化以及正丁醇对水相的萃取能力，设计了同轴环管微流控装置。在微流控管道中，二氧化硅纳米粒子在外相的萃取作用下被吸引并固定在液滴界面；液滴内部的脲酶催化尿素水解生成碳酸根离子，和游离的钙离子发生矿化反应；海藻酸钠也和钙离子凝胶化，固定微胶囊结构，最终形成益生菌微囊。由于特殊的多层结构，微囊能够按顺序的抵抗胃酸，阻止胆汁盐和消化酶的向内扩散，并最终在结肠中释放益生菌。而且，益生菌被矿化涂覆后在储存期间的稳定性大大提高。
本发明基于仿生矿化和微流控技术提出一种具有顺序胃肠道抵抗和按需释放在结肠部位的单分散高存活率益生菌微囊，解决口服益生菌递送领域的问题。单分散有利于精准控制剂量，高存活率有助于提高递送效果。因为益生菌微囊的独特保护能力，封装益生菌表现出在模拟胃液，模拟肠液和长期储存中的超高活力。微囊外壳碳酸钙能够首先中和胃酸，保持益生菌微环境偏中性。微囊中间层填充着二氧化硅纳米粒子和海藻酸钙凝胶，带来了高的传质阻力，阻止了胆汁盐和消化酶对益生菌的破坏。内部益生菌表面矿化涂覆限制其物质交换和繁殖空间，进入休眠状态，提高储存期间的稳定性，并能够在酸刺激下去除涂层重新激活。微囊还能够响应肠道Na+/K+环境，将益生菌按需释放在结肠部位，从而发挥出积极的治疗效果。
附图说明
图1为益生菌微囊结构示意图。
图2为本发明原理示意图。
图3为本发明微流控装置结构示意图。
图4为益生菌微囊扫描电镜图。
图5为益生菌微囊在模拟胃液(pH＝2，胃蛋白酶)中的存活率。
图6为益生菌微囊在模拟肠液(pH＝6.8，胆汁盐，胰蛋白酶)中的存活率。
图7为益生菌微囊在4摄氏度条件下储存32天后的存活率。
图8为益生菌微囊在25摄氏度条件下储存32天后的存活率。
图9为益生菌微囊的释放曲线图。
图10为益生菌微囊口服给药后小鼠胃肠道益生菌定植图。
图11为益生菌微囊口服给药治疗结肠炎小鼠的组织病理学分数。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细阐述,以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。
如图1所示，一种仿生矿化制备单分散高存活率益生菌微囊的结构为：最外层为碳酸钙，微囊中间层填充着二氧化硅纳米粒子和海藻酸钙凝胶，内部为矿化涂覆益生菌。
如图2所示，益生菌首先通过静电相互作用和钙离子结合，接着脲酶催化尿素水解为碳酸根离子，和钙离子进一步反应生成矿化涂覆益生菌。将制备好的矿化涂覆益生菌和海藻酸钠、二氧化硅、脲酶混合后通入微流控装置的内相进料管。
微流控装置包括内相进料管(100)向右部为锥形管(200)；外相进料管(300)套装在内相进料管(100)和出料管(400)上，出料管(400)套装在内相进料管(100)的锥形管(200)上，外相进料管(300)右端与出料管(400)外壁直接形成封口；内相进料管的左端进料口和出料管的右端出料口向外伸出；上述内相进料管(100)，外相进料管(300)和出料管(400)同轴设置；
混合溶液A在内相锥形管处被外相正丁醇剪切为单分散液滴，并在外相的萃取作用下逐渐缩小，液滴中的二氧化硅纳米粒子被吸引到液滴界面并紧密堆积；液滴被收集到氯化钙和尿素的混合溶液B中静置反应，液滴中的脲酶催化尿素水解生成碳酸根离子，和钙离子进一步矿化反应生成碳酸钙，最终制备出益生菌微囊
如图3所示，微流控装置包括内向进料管100，内相锥形管200，外相进料管300，出料管400。内相进料管100一端连接内相进料口110，另一端锥形管出料口210连接总出料口410。外相进料管300套设内相进料管100，一端为外相进料口310，另一端和出料管400外壁直接形成封口。内相，外相进料口分别连接注射泵。
采用玻璃毛细管与不锈钢点胶机针头组和的构造。内相进料管100为长3cm，外径为960μm内径550μm的毛细玻璃管。将中间相进料管100的一端采用拉针仪将圆柱形玻璃毛细管的头部拉成圆锥形，然后在砂纸上滚动打磨至锥口内径约为200μm的平口即第一锥形管200。外相进料管400为长3cm、外径为1200μm、内径1000μm的毛细玻璃管，将玻璃毛细管的两端打磨平整。出料管400为长5cm，外径为960μm内径550μm的毛细玻璃管，将圆柱形玻璃毛细管的两端打磨平整。
各处连接用市售AB胶密封、固定。装置各处尺寸可根据实际情况作出适当调整。
一种仿生矿化制备单分散高存活率益生菌微囊的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：取2～10mL对数生长期的益生菌，PBS洗涤两次，冷冻离心机4摄氏度6000转/分离心5min，将益生菌和10～50mg脲酶分散于4～20mL的10～25mM氯化钙溶液中，磁力搅拌200转/分，搅拌10～15分钟。
步骤2：将4～20mL的10～25mM尿素溶液加入到步骤1的混合溶液中，磁力搅拌200转/分，搅拌30～60分钟，冷冻离心机4摄氏度6000转/分离心5min，收集沉淀得到矿化涂覆益生菌。
步骤3：将步骤2得到的矿化涂覆益生菌与脲酶，海藻酸钠，二氧化硅充分混合，得到混合溶液A，溶液中益生菌浓度为108～109CFU mL-1，脲酶浓度为2.5～5mg·mL-1，海藻酸钠浓度为1～2wt.％，二氧化硅浓度为8～13wt.％；海藻酸钠粘度30mPa·s，二氧化硅粒径为22nm。
步骤4：将氯化钙和尿素加入在去离子水中，形成混合溶液B，混合溶液中氯化钙含量20～50mg·mL-1，尿素含量20～50mg·mL-1。
步骤5：内相进料管注入混合溶液A，外相进料管注入正丁醇；调节内相进样流量为10～20μL·min-1，外相进样流量为10～100μL·min-1，混合溶液A在内相锥形管处被外相正丁醇剪切为尺寸均一、大小可控的单分散液滴，并在正丁醇对内水相的萃取作用下，液滴中的二氧化硅纳米颗粒被吸引到液滴界面并紧密堆积形成初始微囊。
进一步的，所述初始微囊在出料管流动1～3min后被分散到混合溶液B中静置反应6～12h，微囊中的脲酶催化混合溶液B中的尿素生成碳酸根离子，并和钙离子反应，在微囊表面进一步包覆碳酸钙，最终得到益生菌微囊。
实施例1
一种仿生矿化制备单分散高存活率益生菌微囊的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：移液枪吸取5mL处于对数生长期的益生菌，经PBS洗涤两次，冷冻离心机4摄氏度6000转/分，离心5min，得到益生菌沉淀。
步骤2：将步骤2得到的益生菌分散于10mL去离子水中，加入氯化钙和脲酶，溶液中氯化钙浓度为12mM，脲酶浓度为4mg·mL-1，磁力搅拌200转/分，搅拌10min。
进一步的，向溶液中加入10mL浓度为12mM的尿素溶液，继续搅拌30min，离心收集沉淀，得到矿化涂覆益生菌。
步骤3：将步骤2得到的矿化涂覆益生菌与脲酶，海藻酸钠，二氧化硅充分混合，得到混合溶液A，溶液中益生菌浓度109CFU mL-1，脲酶浓度为5mg·mL-1，海藻酸钠浓度为2wt.％，二氧化硅浓度为10wt.％；
步骤4：将氯化钙和尿素加入去离子水中，形成混合溶液B，混合溶液中氯化钙含量20mg·mL-1，尿素含量50mg·mL-1。
步骤5：内相进料管注入混合溶液A，外相进料管注入正丁醇；调节内相进样流量为10μL·min-1，外相进样流量为20μL·min-1，混合溶液A在内相锥形管处被外相正丁醇剪切为尺寸均一、大小可控的单分散液滴，并在正丁醇对内水相的萃取作用下，液滴中的二氧化硅纳米颗粒被吸引到液滴界面并紧密堆积形成初始微囊。
进一步的，所述初始微囊在出料管流动3min后被分散到混合溶液B中静置反应12h，微囊中的脲酶催化混合溶液B中的尿素生成碳酸根离子，并和钙离子反应，在微囊表面进一步包覆碳酸钙，最终得到益生菌微囊。
本实施例得到的益生菌微囊如图4所示，平均直径约为420μm。
实施例2
一种仿生矿化制备单分散高存活率益生菌微囊的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：移液枪吸取5mL处于对数生长期的益生菌，经PBS洗涤两次，冷冻离心机4摄氏度6000转/分，离心5min，得到益生菌沉淀。
步骤2：将步骤2得到的益生菌分散于10mL去离子水中，加入氯化钙和脲酶，溶液中氯化钙浓度为15mM，脲酶浓度为5mg·mL-1，磁力搅拌200转/分，搅拌15min。
进一步的，向溶液中加入10mL浓度为15mM的尿素溶液，继续搅拌30min，离心收集沉淀，得到矿化涂覆益生菌。
步骤3：将步骤2得到的矿化涂覆益生菌与脲酶，海藻酸钠，二氧化硅充分混合，得到混合溶液A，溶液中益生菌浓度109CFU mL-1，脲酶浓度为5mg·mL-1，海藻酸钠浓度为1.5wt.％，二氧化硅浓度为13wt.％；
步骤4：将氯化钙和尿素加入去离子水中，形成混合溶液B，混合溶液中氯化钙含量30mg·mL-1，尿素含量50mg·mL-1。
步骤5：内相进料管注入混合溶液A，外相进料管注入正丁醇；调节内相进样流量为15μL·min-1，外相进样流量为20μL·min-1，混合溶液A在内相锥形管处被外相正丁醇剪切为尺寸均一、大小可控的单分散液滴，并在正丁醇对内水相的萃取作用下，液滴中的二氧化硅纳米颗粒被吸引到液滴界面并紧密堆积形成初始微囊。
进一步的，所述初始微囊在出料管流动2min后被分散到混合溶液B中静置反应12h，得到益生菌微囊。
在模拟胃液(pH＝2，胃蛋白酶)环境中评价了益生菌微囊的抗胃部恶劣环境能力。如图5所示，游离益生菌在模拟胃液中30min就完全死亡，而益生菌微囊在模拟胃液中2h，益生菌活力仍然有66％。原因在于，微囊具有碳酸钙外壳，更够有效中和胃酸，使pH偏中性，最大程度保护益生菌免受胃酸的损害。
实施例3
一种仿生矿化制备单分散高存活率益生菌微囊的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：移液枪吸取5mL处于对数生长期的益生菌，经PBS洗涤两次，冷冻离心机4摄氏度6000转/分，离心5min，得到益生菌沉淀。
步骤2：将步骤2得到的益生菌分散于10mL去离子水中，加入氯化钙和脲酶，溶液中氯化钙浓度为20mM，脲酶浓度为5mg·mL-1，磁力搅拌200转/分，搅拌10min。
进一步的，向溶液中加入10mL浓度为20mM的尿素溶液，继续搅拌30min，离心收集沉淀，得到矿化涂覆益生菌。
步骤3：将步骤2得到的矿化涂覆益生菌与脲酶，海藻酸钠，二氧化硅充分混合，得到混合溶液A，溶液中益生菌浓度109CFU mL-1，脲酶浓度为5mg·mL-1，海藻酸钠浓度为2wt.％，二氧化硅浓度为10wt.％；
步骤4：将氯化钙和尿素加入去离子水中，形成混合溶液B，混合溶液中氯化钙含量30mg·mL-1，尿素含量30mg·mL-1。
步骤5：内相进料管注入混合溶液A，外相进料管注入正丁醇；调节内相进样流量为10μL·min-1，外相进样流量为30μL·min-1，混合溶液A在内相锥形管处被外相正丁醇剪切为尺寸均一、大小可控的单分散液滴，并在正丁醇对内水相的萃取作用下，液滴中的二氧化硅纳米颗粒被吸引到液滴界面并紧密堆积形成初始微囊。
进一步的，所述初始微囊在出料管流动1.5min后被分散到混合溶液B中静置反应12h，得到益生菌微囊。
在模拟肠液(pH＝6.8，胆汁盐，胰蛋白酶)环境中评价了益生菌微囊抗小肠恶劣环境的能力。如图6所示，游离益生菌在模拟肠液中随着时间的增加快速死亡，4h时存活率仅为0.8％。而益生菌微囊在模拟肠液环境中能够最大限度保护益生菌，就算经过4h的模拟肠液浸泡，活菌率依旧有78％。原因在于，微囊高传质阻力的二氧化硅和海藻酸钙凝胶有效减慢胆汁盐，胰蛋白酶和益生菌的直接接触，提高益生菌在模拟肠液中的生存能力。
实施例4
一种仿生矿化制备单分散高存活率益生菌微囊的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：移液枪吸取5mL处于对数生长期的益生菌，经PBS洗涤两次，冷冻离心机4摄氏度6000转/分，离心5min，得到益生菌沉淀。
步骤2：将步骤2得到的益生菌分散于10mL去离子水中，加入氯化钙和脲酶，溶液中氯化钙浓度为15mM，脲酶浓度为3mg·mL-1，磁力搅拌200转/分，搅拌15min。
进一步的，向溶液中加入10mL浓度为15mM的尿素溶液，继续搅拌30min，离心收集沉淀，得到矿化涂覆益生菌。
步骤3：将步骤2得到的矿化涂覆益生菌与脲酶，海藻酸钠，二氧化硅充分混合，得到混合溶液A，溶液中益生菌浓度5×108CFU mL-1，脲酶浓度为5mg·mL-1，海藻酸钠浓度为2wt.％，二氧化硅浓度为10wt.％；
步骤4：将氯化钙和尿素加入去离子水中，形成混合溶液B，混合溶液中氯化钙含量25mg·mL-1，尿素含量25mg·mL-1。
步骤5：内相进料管注入混合溶液A，外相进料管注入正丁醇；调节内相进样流量为10μL·min-1，外相进样流量为20μL·min-1，混合溶液A在内相锥形管处被外相正丁醇剪切为尺寸均一、大小可控的单分散液滴，并在正丁醇对内水相的萃取作用下，液滴中的二氧化硅纳米颗粒被吸引到液滴界面并紧密堆积形成初始微囊。
进一步的，所述初始微囊在出料管流动3min后被分散到混合溶液B中静置反应12h，得到益生菌微囊。
将益生菌微囊保存在4摄氏度的去离子水中，评价其经过32天的长期保存后的活菌率。如图7所示，游离益生菌在长期保存过程中，随着时间的推移，活菌率快速下降，8天后，活菌率降至7.9％，32天后仅有1.2％的益生菌存活。益生菌微囊经过8天储存后活菌率无明显变化，经过32天储存后活菌率为66％。原因在于，益生菌被矿化涂覆，有限的物质交换和繁殖空间使益生菌暂时休眠，极大减慢在储存期间的活力损失。
实施例5
一种仿生矿化制备单分散高存活率益生菌微囊的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：移液枪吸取5mL处于对数生长期的益生菌，经PBS洗涤两次，冷冻离心机4摄氏度5000转/分，离心5min，得到益生菌沉淀。
步骤2：将步骤2得到的益生菌分散于10mL去离子水中，加入氯化钙和脲酶，溶液中氯化钙浓度为18mM，脲酶浓度为5mg·mL-1，磁力搅拌200转/分，搅拌10min。
进一步的，向溶液中加入10mL浓度为18mM的尿素溶液，继续搅拌20min，离心收集沉淀，得到矿化涂覆益生菌。
步骤3：将步骤2得到的矿化涂覆益生菌与脲酶，海藻酸钠，二氧化硅充分混合，得到混合溶液A，溶液中益生菌浓度5×108CFU mL-1，脲酶浓度为4mg·mL-1，海藻酸钠浓度为2wt.％，二氧化硅浓度为10wt.％；
步骤4：将氯化钙和尿素加入去离子水中，形成混合溶液B，混合溶液中氯化钙含量20mg·mL-1，尿素含量40mg·mL-1。
步骤5：内相进料管注入混合溶液A，外相进料管注入正丁醇；调节内相进样流量为20μL·min-1，外相进样流量为40μL·min-1，混合溶液A在内相锥形管处被外相正丁醇剪切为尺寸均一、大小可控的单分散液滴，并在正丁醇对内水相的萃取作用下，液滴中的二氧化硅纳米颗粒被吸引到液滴界面并紧密堆积形成初始微囊。
进一步的，所述初始微囊在出料管流动3min后被分散到混合溶液B中静置反应10h，得到益生菌微囊。
将益生菌微囊保存在25摄氏度的去离子水中，评价其经过32天的长期保存后的活菌率。如图8所示，游离益生菌在长期保存过程中，随着时间的推移，活菌率快速下降，8天后，活菌率降至4.8％，32天后仅有0.2％的益生菌存活。益生菌微囊经过8天储存后活菌率为98％，经过32天储存后活菌率为62％。
实施例6
一种仿生矿化制备单分散高存活率益生菌微囊的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：移液枪吸取5mL处于对数生长期的益生菌，经PBS洗涤两次，冷冻离心机4摄氏度5000转/分，离心5min，得到益生菌沉淀。
步骤2：将步骤2得到的益生菌分散于10mL去离子水中，加入氯化钙和脲酶，溶液中氯化钙浓度为12.5mM，脲酶浓度为4mg·mL-1，磁力搅拌200转/分，搅拌10min。
进一步的，向溶液中加入10mL浓度为12.5mM的尿素溶液，继续搅拌20min，离心收集沉淀，得到矿化涂覆益生菌。
步骤3：将步骤2得到的矿化涂覆益生菌与脲酶，海藻酸钠，二氧化硅充分混合，得到混合溶液A，溶液中益生菌浓度5×108CFU mL-1，脲酶浓度为4mg·mL-1，海藻酸钠浓度为1.5wt.％，二氧化硅浓度为8wt.％；
步骤4：将氯化钙和尿素加入去离子水中，形成混合溶液B，混合溶液中氯化钙含量30mg·mL-1，尿素含量30mg·mL-1。
步骤5：内相进料管注入混合溶液A，外相进料管注入正丁醇；调节内相进样流量为15μL·min-1，外相进样流量为30μL·min-1，混合溶液A在内相锥形管处被外相正丁醇剪切为尺寸均一、大小可控的单分散液滴，并在正丁醇对内水相的萃取作用下，液滴中的二氧化硅纳米颗粒被吸引到液滴界面并紧密堆积形成初始微囊。
进一步的，所述初始微囊在出料管流动3min后被分散到混合溶液B中静置反应8h，得到益生菌微囊。
评价了益生菌微囊在不同消化液环境中的释放情况。如图9所示，微囊在模拟胃液中经过2h的浸泡，无益生菌释放；微囊在模拟小肠液中经过6h的浸泡后，仅有少量益生菌释放，释放率为22.3％；最后，微囊在模拟结肠液中完全释放益生菌。该实验结果表明，益生菌微囊能够按需将益生菌递送到结肠部位。
实施例7
一种仿生矿化制备单分散高存活率益生菌微囊的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：移液枪吸取5mL处于对数生长期的益生菌，经PBS洗涤两次，冷冻离心机4摄氏度5000转/分，离心5min，得到益生菌沉淀。
步骤2：将步骤2得到的益生菌分散于10mL去离子水中，加入氯化钙和脲酶，溶液中氯化钙浓度为15mM，脲酶浓度为5mg·mL-1，磁力搅拌200转/分，搅拌10min。
进一步的，向溶液中加入10mL浓度为15mM的尿素溶液，继续搅拌30min，离心收集沉淀，得到矿化涂覆益生菌。
步骤3：将步骤2得到的矿化涂覆益生菌与脲酶，海藻酸钠，二氧化硅充分混合，得到混合溶液A，溶液中益生菌浓度109CFU mL-1，脲酶浓度为5mg·mL-1，海藻酸钠浓度为2wt.％，二氧化硅浓度为10wt.％；
步骤4：将氯化钙和尿素加入去离子水中，形成混合溶液B，混合溶液中氯化钙含量25mg·mL-1，尿素含量50mg·mL-1。
步骤5：内相进料管注入混合溶液A，外相进料管注入正丁醇；调节内相进样流量为10μL·min-1，外相进样流量为25μL·min-1，混合溶液A在内相锥形管处被外相正丁醇剪切为尺寸均一、大小可控的单分散液滴，并在正丁醇对内水相的萃取作用下，液滴中的二氧化硅纳米颗粒被吸引到液滴界面并紧密堆积形成初始微囊。
进一步的，所述初始微囊在出料管流动3min后被分散到混合溶液B中静置反应8h，得到益生菌微囊。
评价了益生菌微囊经口服给药后在小鼠体内的定植情况。如图10所示，与游离益生菌给药组相比，益生菌微囊给药组在小鼠胃中没有益生菌定植，在小肠中仅有少量益生菌定植，而在结肠部位有较高的益生菌定植。原因在于，益生菌微囊可以保护益生菌通过恶劣的胃和小肠环境，并且将足够数量的益生菌按需释放在结肠部位。
实施例8
一种仿生矿化制备单分散高存活率益生菌微囊的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：移液枪吸取5mL处于对数生长期的益生菌，经PBS洗涤两次，冷冻离心机4摄氏度5000转/分，离心5min，得到益生菌沉淀。
步骤2：将步骤2得到的益生菌分散于10mL去离子水中，加入氯化钙和脲酶，溶液中氯化钙浓度为12.5mM，脲酶浓度为5mg·mL-1，磁力搅拌200转/分，搅拌10min。
进一步的，向溶液中加入10mL浓度为15mM的尿素溶液，继续搅拌30min，离心收集沉淀，得到矿化涂覆益生菌。
步骤3：将步骤2得到的矿化涂覆益生菌与脲酶，海藻酸钠，二氧化硅充分混合，得到混合溶液A，溶液中益生菌浓度109CFU mL-1，脲酶浓度为4mg·mL-1，海藻酸钠浓度为2wt.％，二氧化硅浓度为12wt.％；
步骤4：将氯化钙和尿素加入去离子水中，形成混合溶液B，混合溶液中氯化钙含量30mg·mL-1，尿素含量30mg·mL-1。
步骤5：内相进料管注入混合溶液A，外相进料管注入正丁醇；调节内相进样流量为25μL·min-1，外相进样流量为50μL·min-1，混合溶液A在内相锥形管处被外相正丁醇剪切为尺寸均一、大小可控的单分散液滴，并在正丁醇对内水相的萃取作用下，液滴中的二氧化硅纳米颗粒被吸引到液滴界面并紧密堆积形成初始微囊。
进一步的，所述初始微囊在出料管流动3min后被分散到混合溶液B中静置反应12h，得到益生菌微囊。
评价了益生菌微囊对由葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的结肠炎小鼠的治疗效果。如图11所示，对照组健康小鼠的结肠组织病理学评分为“0”；DSS诱导的结肠炎小鼠再没有经过治疗的情况下，结肠组织病理学评分为“8.6”；游离益生菌口服给药后，结肠组织病理学评分为“6.2”；而益生菌微囊口服给药后，结肠组织病理学评分为“1.8”。上述实验表明，益生菌微囊对小鼠结肠炎具有优异的治疗效果。
Claims (9)
1.一种仿生矿化制备单分散高存活率益生菌微囊的方法，使用的微流控装置包括内相进料管(100)向右部为锥形管(200)；外相进料管(300)套装在内相进料管(100)和出料管(400)上，出料管(400)套装在内相进料管(100)的锥形管(200)上，外相进料管(300)右端与出料管(400)外壁直接形成封口；内相进料管的左端进料口和出料管的右端出料口向外伸出；上述内相进料管(100)，外箱进料管(300)和出料管(400)同轴设置；内相进料管和外相进料管分别连接注射泵；内相进料管为长3cm、外径为960μm、内径550μm的毛细玻璃管，外相进料管为长3cm、外径为1200μm、内径1000μm的毛细玻璃管，出料管为长5cm、外径为960μm、内径550μm的毛细玻璃管，锥形管的锥口内径200μm；其特征在于，具体制备方法包括以下步骤：
步骤1：将益生菌和脲酶分散于含有氯化钙和尿素的混合溶液中，得到矿化层涂敷的益生菌，溶液中氯化钙浓度为10～25mM，尿素浓度为10～25mM，益生菌含量1×108～5×108CFU·mL-1，脲酶含量2.5～5mg·mL-1；
步骤2：将步骤1得到的矿化涂敷益生菌加入含有脲酶，8～13wt.％二氧化硅和1～2wt.％海藻酸钠的混合溶液A中，混合溶液脲酶浓度为2.5～5mg·mL-1；
步骤3：将氯化钙和尿素加入在去离子水中，形成混合溶液B，混合溶液中氯化钙含量20～50mg·mL-1，尿素含量20～50mg·mL-1；
步骤3：内相进料管和外相进料管分别连接注射泵，分别连续注射入混合溶液A和正丁醇，在内相锥形管(200)处生成单分散液滴，在出料管的出料口得到初始微囊；
步骤4：步骤3得到的初始微囊分散于混合溶液B中，得到具有胃肠道顺序抵抗的益生菌微囊。
2.根据权利要求1所述的一种仿生矿化制备单分散高存活率益生菌微囊的方法，其特征在于，所述步骤1中益生菌首先和氯化钙、脲酶混合，磁力搅拌10～15min；接着，加入尿素，磁力搅拌速度为200转/分搅拌30～60min。
3.根据权利要求1所述的一种仿生矿化制备单分散高存活率益生菌微囊的方法，其特征在于，内相进样流量为10～20μL·min-1，外相进样流量为10～100μL·min-1。
4.根据权利要求1所述的一种仿生矿化制备单分散高存活率益生菌微囊的方法，其特征在于，步骤3所述的单分散液滴在外相正丁醇的萃取作用下，SiO2纳米粒子被吸引到液滴界面，形成初始微囊。
5.根据权利要求1所述的一种仿生矿化制备单分散高存活率益生菌微囊的方法，其特征在于，步骤4所述微囊中的脲酶催化尿素生成碳酸根离子，碳酸根离子和钙离子反应生成碳酸钙，反应6～12h后最终制备出益生菌微囊。
6.根据权利要求1所述的一种仿生矿化制备单分散高存活率益生菌微囊的方法，其特征在于，益生菌微囊具有顺序胃肠道抵抗特性，能够中和胃酸和阻止胆汁盐的向内扩散。
7.根据权利要求1所述的一种仿生矿化制备单分散高存活率益生菌微囊的方法，其特征在于，被封装在微囊中的益生菌在pH＝2，含有胃蛋白酶的模拟胃液中2h存活率高达64～66％；在pH＝6.8，含有胆汁盐和胰蛋白酶的模拟肠液中4h存活率高达76～80％；包封益生菌连续经过胃肠道后到达结肠的存活率为61％，而游离益生菌这项数据为0。
8.根据权利要求1所述的一种仿生矿化制备单分散高存活率益生菌微囊的方法，其特征在于，被封装在微囊中的益生菌分散在水中，在4摄氏度和25摄氏度条件下保存1个月后，存活率分别为60～63％和58～62％。
9.据权利要求1所述的一种仿生矿化制备单分散高存活率益生菌微囊的方法，其特征在于，微囊能够响应肠道环境，将益生菌按需释放在结肠部位。
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