CN105561333A - 一种具有磁热疗-化疗协同作用的纳米药物载体、药物及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供的一种具有磁热疗-化疗协同作用的纳米药物载体，用于承载纳米药物颗粒，其特征在于，包括：介孔氧化硅颗粒构成的介孔壳层，介孔壳层内部具有多个介孔孔道，介孔孔道在介孔壳层的表面形成介孔；嵌入在介孔壳层内部的且由Fe3O4纳米颗粒构成的内核；以及包封在介孔上的DNA分子构成的DNA分子层，其中，介孔孔道贯穿介孔壳层，用于承载纳米药物颗粒，介孔孔道从内核向介孔壳层呈呈放射状分布，DNA分子为长度为20～40的核苷酸链。另外还提供一种负载有药物的具有磁热疗-化疗协同作用的纳米药物。其利用DNA分子对介孔孔道进行包封，从而降低了在药物输送过程中发生抗癌药物意外泄漏的概率。

Description

一种具有磁热疗-化疗协同作用的纳米药物载体、药物及其制备方法
技术领域
本发明涉及医药及医药化学领域，特别是一种具有磁热疗-化疗协同作用的纳米药物及相应的制备方法。
背景技术
目前，癌症仍是威胁人类生命和健康的主要疾病之一，全世界癌症发病率呈急剧上升趋势。癌症的治疗一直以来都是国内外研究的难点，临床治疗癌症的方法包括外科手术、放射治疗、热疗和药物化疗。药物化疗是癌症治疗中的常用手段，但是许多化疗药物存在着无法在体内运输、药物易被降解和清除、药物选择性差，难以特异性的到达癌细胞、以及多数化疗药物都对正常细胞存在很大的杀伤作用。因此，可以考虑利用纳米药物载体对抗癌药物进行储藏输送来解决这一问题。
癌症发病机理极为复杂，单一的治疗方法难以得到良好的治疗效果，利用纳米技术，将不同的癌症治疗方法同时应用于同一肿瘤部位，实现多种治疗技术的协同作用是一种重要的治疗手段。而利用具有磁热疗-化疗协同作用的纳米药物载体将热疗和药物化疗结合是其中非常重要途径之一。
磁性介孔氧化硅是一种具有磁核和介孔氧化硅壳层结构的多孔纳米材料，当磁性纳米颗粒置于交变磁场时，由于其磁滞损耗和尼尔松弛等机制而产生热。通过将磁性颗粒经局部注射到达肿瘤细胞或组织中时，并施加以交变磁场，可以迅速升高肿瘤细胞或组织部位的温度，并且可以通过改变磁性颗粒的尺寸、磁性能以及外加交变磁场的参数等，调节所需要的温度，从而达到磁热治疗肿瘤的效果。磁性介孔氧化硅纳米颗粒壳结构具有高的比表面积和孔容、均一可调的介孔孔道，可以高含量储藏抗癌药物，且颗粒孔道表面含有丰富的Si-OH基团使得其易于各种功能基团、配体等修饰，实现药物缓控释、靶向输送等特性。并且研究表明，热疗能够促进阿霉素等抗癌药物快速释放进入肿瘤细胞，从而能够明显提高治疗效果。由于磁性介孔氧化硅纳米颗粒具有开放的孔道，在药物输送过程中不可避免的会产生药物泄漏。然而，现有技术还没有提供一种解决泄漏的方法：该解决方法所使用的方法和材料必须对人体无毒害，或者至少是少毒害。
发明内容
本发明是为解决上述问题而提出的，提供了一种具有磁热疗-化疗协同作用的纳米药物载体和对应的药物及其相应的药物载体和药物的制备方法。其利用DNA分子对介孔孔道进行包封，从而降低了在药物输送过程中发生抗癌药物意外泄漏的概率。因此，利用磁性介孔氧化硅颗粒储藏抗癌药物并且利用DNA包封介孔孔道，可以实现抗癌药物的高效靶向输送，本发明提供的技术方案解决了如何设计制备具有磁热疗-化疗协同作用的纳米药物载体的技术难题，使其获得的抗癌药物具有高效输送和协同磁热疗的效果。
本发明提供的一种具有磁热疗-化疗协同作用的纳米药物载体，用于承载纳米药物颗粒，其特征在于，包括：介孔氧化硅颗粒构成的介孔壳层，介孔壳层内部具有多个介孔孔道，介孔孔道在介孔壳层的表面形成介孔；嵌入在介孔壳层内部的且由Fe3O4纳米颗粒构成的内核；以及包封在介孔上的DNA分子构成的DNA分子层，其中，介孔孔道贯穿介孔壳层，用于承载纳米药物颗粒，介孔孔道从内核向介孔壳层呈呈放射状分布，DNA分子为长度为20～40的核苷酸链。
本发明提供的具有磁热疗-化疗协同作用的纳米药物载体，还可以具有这样的特征：其中，纳米药物载体的颗粒粒径为50～200纳米。
本发明提供的具有磁热疗-化疗协同作用的纳米药物载体，还可以具有这样的特征：其中，介孔孔道的孔径为2～10纳米。
本发明提供的具有磁热疗-化疗协同作用的纳米药物载体，还可以具有这样的特征：其中，Fe3O4纳米颗粒的粒径为10～20纳米。
本发明提供的具有磁热疗-化疗协同作用的纳米药物载体，还可以具有这样的特征：其中，介孔氧化硅颗粒的外表面和介孔孔道的孔道表面修饰有氨基、羧基中的任意一种，DNA分子的5'端修饰有羧基、氨基、巯基中的任意一种。
本发明还提供一种具有磁热疗-化疗协同作用的纳米药物，承载有纳米药物颗粒，其特征在于，包括：纳米药物载体，具有介孔壳层；以及纳米药物颗粒，被介孔壳层承载，其中，纳米药物载体为上述的任意一种的具有磁热疗-化疗协同作用的纳米药物载体。
本发明提供的具有磁热疗-化疗协同作用的纳米药物，还可以具有这样的特征：其中，纳米药物颗粒中的药物包括用于抗癌的药物。
本发明还提供一种制备具有磁热疗-化疗协同作用的纳米药物载体的方法，其特征在于包括以下步骤：
步骤一，制备棕褐色胶体颗粒溶液，
将共沉淀法制备的Fe3O4纳米颗粒超声分散在超纯水中得到Fe3O4纳米颗粒溶液，将十六烷基对甲苯磺酸酯和三乙醇胺加入到Fe3O4纳米颗粒溶液中，并在70℃～90℃温度下搅拌一段时间后将正硅酸乙酯快速加入并继续搅拌1～4小时，得到棕褐色胶体颗粒溶液；
步骤二，制备磁性介孔氧化硅纳米颗粒，
使用磁铁块从步骤一中棕褐色胶体颗粒溶液中收集棕褐色胶体颗粒，分别用去离子水和醇类溶剂多次洗涤棕褐色胶体颗粒，真空干燥，煅烧，得到磁性介孔氧化硅纳米颗粒；
步骤三，表面修饰，
将硅烷偶联剂以3～6毫摩尔硅烷偶联剂混合1克的步骤二中磁性介孔氧化硅纳米颗粒这样的比例加入无水甲苯中分散得到悬浮液，在油浴加热条件下回流24～48小时，过滤悬浮液得到滤饼，用无水甲苯洗涤该滤饼后得到纳米药物载体；
步骤四，活化，
将5'端修饰有修饰基团的DNA分子用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)活化后，加入N-羟基丁二酰亚胺(NSH)再活化即得到活化过的DNA溶液，待活化完成后，将步骤三中纳米药物载体加入到上述活化过的DNA溶液中，避光反应，即得具有磁热疗-化疗协同作用的纳米药物载体。
本发明提供的制备具有磁热疗-化疗协同作用的纳米药物载体的方法，还可以具有这样的特征：其中，步骤一中Fe3O4纳米颗粒、十六烷基对甲苯磺酸酯、三乙醇胺和正硅酸乙酯的摩尔比为1～100:50～80:200～600:400～600，硅烷偶联剂为γ-氨丙基三乙氧基硅烷、N-β(氨乙基)-γ-氨丙基三甲氧基硅烷、N-β(氨乙基)-γ-氨丙基三乙氧基硅烷、氨乙基氨乙基氨丙基三甲氧基硅烷、氨乙基氨乙基氨丙基三乙氧基硅烷、γ-羧丙基三乙氧基硅烷中的任意一种或至少两种的混合物。
本发明还提供一种制备具有磁热疗-化疗协同作用的纳米药物的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一，制备棕褐色胶体颗粒溶液，
将共沉淀法制备的Fe3O4纳米颗粒超声分散在超纯水中得到Fe3O4纳米颗粒溶液，将十六烷基对甲苯磺酸酯和三乙醇胺加入到Fe3O4纳米颗粒溶液中，并在70℃～90℃温度下搅拌一段时间后将正硅酸乙酯快速加入并继续搅拌1～4小时，得到棕褐色胶体颗粒溶液；
步骤二，制备磁性介孔氧化硅纳米颗粒，
使用磁铁块从步骤一中棕褐色胶体颗粒溶液中收集棕褐色胶体颗粒，分别用去离子水和醇类溶剂多次洗涤棕褐色胶体颗粒，真空干燥，煅烧，得到磁性介孔氧化硅纳米颗粒；
步骤三，表面修饰，
将硅烷偶联剂以3～6毫摩尔硅烷偶联剂混合1克的步骤二中磁性介孔氧化硅纳米颗粒这样的比例加入无水甲苯中分散得到悬浮液，在油浴加热条件下回流24～48小时，过滤悬浮液得到滤饼，用无水甲苯洗涤该滤饼后得到纳米药物载体；
步骤四，负载，
将步骤三中的纳米药物载体分散于药物的缓冲溶液中室温、避光条件下摇晃后离心分离，用缓冲溶液洗涤，即得到负载药物的纳米药物载体；
步骤五，活化，
将5'端修饰有修饰基团的DNA分子用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)活化后，加入N-羟基丁二酰亚胺(NSH)再活化即得到活化过的DNA溶液，待活化完成后，将步骤四中负载药物的纳米药物载体加入到上述活化过的DNA溶液中，避光反应，即得具有磁热疗-化疗协同作用的纳米药物。
发明作用与效果
本发明所提供的具有磁热疗-化疗协同作用的纳米药物载体，由于采用了DNA分子包封介孔孔道，因此，在输送药物的过程中，降低了抗癌药物发生泄漏的可能性。
另外，当纳米药物载体处在外加交变磁场时，导致温度升高，能够促进储藏于介孔孔道内的药物(特别是抗癌药物)的释放，促进药物进入肿瘤细胞并诱发肿瘤细胞凋亡，明显提高药物化疗效果。与现有技术相比，该纳米药物输载体能够显著降低抗癌药物对正常组织和细胞的杀伤作用，显著降低治疗的副作用。
其中，DNA长度为20～40个核苷酸，这样的设计是为了满足在43℃～50℃之间DNA分子能够脱离纳米药物载体表面，开放介孔孔道，释放储藏于介孔孔道内的抗癌药物。
附图说明
图1为本发明的具有磁热疗-化疗协同作用的纳米药物载体的结构示意图；
图2为本发明的具有磁热疗-化疗协同作用的纳米药物的结构示意图；
图3为本发明的实施例一制备的具有磁热疗-化疗协同作用的纳米药物载体的透射电镜图(TEM)；
图4为本发明的实施例一制备的具有磁热疗-化疗协同作用的纳米药物载体的吸附-脱附等温线及孔径分布曲线；
图5为本发明的实施例三制备的具有磁热疗-化疗协同作用的纳米药物在pH5.0，温度为37℃和43℃条件下的阿霉素(DOX)释放曲线；
图6为本发明的的实施例三制备的具有磁热疗-化疗协同作用的纳米药物在pH5.0，温度在高温(43℃)-低温(37℃)转换条件下的阿霉素(DOX)释放曲线；图7为本发明的实施例一制备的具有磁热疗-化疗协同作用的纳米药物载体和实施例三制备的具有磁热疗-化疗协同作用的纳米药物的细胞毒性结果；
图8为本发明的实施例一制备的具有磁热疗-化疗协同作用的纳米药物载体和实施例三制备的具有磁热疗-化疗协同作用的纳米药物在磁热和化疗药物协同作用下的细胞毒性结果；以及
图9为本发明的实施例一制备的具有磁热疗-化疗协同作用的纳米药物载体在交变磁场作用下的磁热效应曲线。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，以下实施例结合附图对本发明的具有磁热疗-化疗协同作用的纳米药物载体以及纳米药物的结构和制备方法作具体阐述。
图1为本发明的具有磁热疗-化疗协同作用的纳米药物载体的结构示意图。
如图1所示，具有磁热疗-化疗协同作用的纳米药物载体100具有介孔壳层10、位于介孔壳层10内部的内核20以及包封在介孔壳层10表面的DNA分子层30。
其中，介孔壳层10，由介孔氧化硅颗粒构成，内部具有多个介孔孔道11，介孔孔道11贯穿介孔壳层10而在介孔壳层10外表面形成多个介孔12。
介孔孔道11从内核20向介孔壳层10方向呈放射状排布，内核20和介孔12通过介孔孔道11相连通。
内核20，嵌入在壳层10内部，由Fe3O4纳米颗粒构成。
DNA分子层30，包封在壳层10外，由包封在介孔12上的大量DNA分子31构成，DNA分子31为长度为20～40的核苷酸链。
图2为本发明的具有磁热疗-化疗协同作用的纳米药物的结构示意图。
如图2所示，具有磁热疗-化疗协同作用的纳米药物1000包括上述的具有磁热疗-化疗协同作用的纳米药物载体100和纳米药物颗粒200。
纳米药物颗粒200负载在介孔壳层10内，通过分子间作用力和介孔孔道11的几何空间限制而被转载在具有磁热疗-化疗协同作用的纳米药物载体100内的介孔孔道11中。
图2中对于同图1相同的结构标号其含义同图1相同。
实施例1
γ-氨丙基三乙氧基硅烷修饰的具有磁热疗-化疗协同作用的纳米药物载体的制备操作。
步骤一：取0.4克共沉淀法制备的Fe3O4纳米颗粒超声分散在36毫升超纯水中，将0.6836克十六烷基对甲苯磺酸酯(CTAT)和4克的三乙醇胺(TEA)加入上述Fe3O4纳米颗粒溶液中，并在80℃下搅拌1小时；然后将5.58毫升正硅酸乙酯(TEOS)快速加入并继续搅拌2小时，得到棕褐色胶体颗粒溶液；
步骤二：采用磁铁块收集上述步骤一中的棕褐色胶体颗粒，分别用去离子水和乙醇多次洗涤棕褐色胶体颗粒，然后在60℃下真空干燥24小时，真空干燥产物经过550℃煅烧7小时除去有机模板，得到本实施例的磁性介孔氧化硅纳米颗粒。
步骤三：取0.5克上述步骤二制备的磁性介孔氧化硅纳米颗粒，超声分散于无水甲苯得到悬浮液，然后将0.75毫升γ-氨丙基三乙氧基硅烷快速加入上述悬浮液，密封容器后在油浴加热条件下回流24小时，最后用无水甲苯洗去未反应的γ-氨丙基三乙氧基硅烷并真空干燥得到本实施例所涉及的纳米药物载体。
步骤四：将5'端修饰有羧基的DNA分子，20微升～200微升，浓度为100微摩尔,利用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)活化10分钟，EDC浓度为2.8毫摩尔，用量为3.56微升～35.6微升。继而加入N-羟基丁二酰亚胺(NSH)继续活化20分钟，NSH浓度为2.8毫摩尔，用量为0.72微升～7.2微升。待活化完成后，将上述步骤三制备的纳米药物载体加入上述活化后的溶液中，在避光的反应容器中混合反应24小时，即形成具有磁热疗-化疗协同作用的纳米药物载体。本实施例中DNA分子的5'端修饰有羧基，其也可以为氨基、巯基中的任意一种。
图3为本发明的实施例一制备的具有磁热疗-化疗协同作用的纳米药物载体的透射电镜图(TEM)。
如图3所示，取本实施例制备的纳米药物载体置于透射电镜(TEM)下观察，呈球形颗粒，颗粒粒径为150纳米左右，粒径分布均匀，分散性好，介孔孔道从内核向外呈放射状分布。介孔氧化硅颗粒的平均介孔孔径为3纳米。
另外，本实施例采用的硅烷偶联剂为γ-氨丙基三甲氧基硅烷，本发明的技术方案所涉及的介孔氧化硅颗粒的外表面和介孔孔道的孔道表面修饰有氨基、羧基中的任意一种的纳米药物载体可以采用其他硅烷偶联剂制备，如γ-氨丙基三乙氧基硅烷、N-β(氨乙基)-γ-氨丙基三甲氧基硅烷、N-β(氨乙基)-γ-氨丙基三乙氧基硅烷、氨乙基氨乙基氨丙基三甲氧基硅烷、氨乙基氨乙基氨丙基三乙氧基硅烷、γ-羧丙基三乙氧基硅烷中的任意一种或至少两种的混合物。
图4为本发明的实施例一制备的具有磁热疗-化疗协同作用的纳米药物载体的吸附-脱附等温线及孔径分布曲线。
该曲线为典型的IV型曲线，表明该纳米药物载体具有介孔特征。
实施例的有益作用和效果
本实施例所提供的具有磁热疗-化疗协同作用的纳米药物载体，由于采用了DNA分子包封介孔孔道，因此，在输送药物的过程中，降低了抗癌药物发生泄漏的可能性；
其中，介孔层具有高量储藏抗癌药物和防止药物的输送过程中泄漏的性能优势；
另外，当纳米药物载体处在外加交变磁场时，导致温度升高，能够促进储藏于介孔孔道内的药物(特别是抗癌药物)的释放，促进药物进入肿瘤细胞并诱发肿瘤细胞凋亡，明显提高药物化疗效果。与现有技术相比，该纳米药物输载体能够显著降低抗癌药物对正常组织和细胞的杀伤作用，显著降低治疗的副作用；
其中，DNA长度为20～40个核苷酸，这样的设计是为了满足在43℃～50℃之间DNA分子能够脱离纳米药物载体表面，开放介孔孔道，释放储藏于介孔孔道内的抗癌药物。
本发明所提供的具有磁热疗-化疗协同作用的纳米药物载体的介孔孔径为2～10纳米，适合多种化疗药物在介孔孔道储藏，与背景技术相比，化疗药物储藏量显著提高。
本实施例所提供的具有磁热疗-化疗协同作用的纳米药物载体，其中，介孔氧化硅颗粒的外表面和介孔孔道的孔道表面修饰有氨基、羧基中的任意一种，DNA分子的5'端修饰有羧基、氨基、巯基中的任意一种，由于介孔氧化硅颗粒的外表面和介孔孔道的孔道表面有基团修饰，使得负载的药物分子可以同这些有机基团发生分子间的作用力，更好的负载药物：更多，更牢固。
实施例2
本实施例所提供的纳米药物载体为FITC修饰的具有磁热疗-化疗协同作用的纳米药物载体，用于在共聚焦显微镜下观察细胞摄取纳米药物载体。采用的硅烷偶联剂为FITC-APTES硅烷偶联剂，其制备方法为：
取15毫克的异硫氰酸荧光素(fluoresceinisothiocyanate,FITC)和100微升的γ-氨丙基三乙氧基硅烷加入5毫升无水乙醇，在密封容器并暗室条件下搅拌48小时，得到异硫氰酸荧光素修饰的硅烷偶联剂(FITC-APTES)。
步骤一、二同实施例1的步骤一、二相同。
步骤三，取20毫克实施例一步骤二所制备的磁性介孔氧化硅纳米颗粒，分散于6毫升无水乙醇，并加入1毫升FITC-APTES硅烷偶联剂，在密封容器并暗室条件下搅拌24小时。最后，将上述颗粒溶液离心分离，无水乙醇洗涤多次除去未反应的FITC-APTES硅烷偶联剂，得到FITC修饰的纳米药物载体。
步骤四，同实施例一的步骤四操纵类似，得到上述的FITC修饰的纳米药物载体后进行实施例1步骤四中的操纵，最终得到FITC修饰的具有磁热疗-化疗协同作用的纳米药物载体。
该FITC修饰的纳米药物载体的颗粒粒径为150纳米左右，介孔氧化硅颗粒的平均介孔孔径为3纳米。
实施例的有益作用和效果
本实施例所提供的具有磁热疗-化疗协同作用的纳米药物，由于采用了DNA分子包封介孔孔道，因此，在输送药物的过程中，降低了抗癌药物发生泄漏的可能性；
其中，介孔层具有高量储藏抗癌药物和防止药物的输送过程中泄漏的性能优势；
另外，当纳米药物载体处在外加交变磁场时，导致温度升高，能够促进储藏于介孔孔道内的药物(特别是抗癌药物)的释放，促进药物进入肿瘤细胞并诱发肿瘤细胞凋亡，明显提高药物化疗效果。与现有技术相比，该纳米药物输载体能够显著降低抗癌药物对正常组织和细胞的杀伤作用，显著降低治疗的副作用；
其中，DNA长度为20～40个核苷酸，这样的设计是为了满足在43℃～50℃之间DNA分子能够脱离纳米药物载体表面，开放介孔孔道，释放储藏于介孔孔道内的抗癌药物。
本发明所提供的具有磁热疗-化疗协同作用的纳米药物的介孔孔径为2～10纳米，适合多种化疗药物在介孔孔道储藏，与背景技术相比，化疗药物储藏量显著提高。
本实施例所提供的具有磁热疗-化疗协同作用的纳米药物，其中，介孔氧化硅颗粒的外表面和介孔孔道的孔道表面修饰有氨基、羧基中的任意一种，DNA分子的5'端修饰有羧基、氨基、巯基中的任意一种，由于介孔氧化硅颗粒的外表面和介孔孔道的孔道表面有基团修饰，使得负载的药物分子可以同这些有机基团发生分子间的作用力，更好的负载药物：更多，更牢固。
本实施例所提供的具有磁热疗-化疗协同作用的纳米药物能够在磁场作用下实现药物的靶向输送，并且，在外加交变磁场的作用下，在较短时间内便可以将温度升高到43℃，从而可以促进肿瘤细胞的凋亡，实现磁热疗治疗效果。
本实施例所提供的具有磁热疗-化疗协同作用的纳米药物，由于采用了DNA分子包封介孔孔道，因此，在输送药物的过程中，降低了抗癌药物发生泄漏的可能性，而在外加交变磁场作用，导致温度升高的情况下，能够促进储藏于介孔孔道内的阿霉素等抗癌药物的释放，促进药物进入肿瘤细胞并诱发肿瘤细胞凋亡，明显提高药物化疗效果。与背景技术相比，该纳米药物输送系统能够显著降低抗癌药物对正常组织和细胞的杀伤作用，显著降低治疗的副作用。
本实施例所提供的具有磁热疗-化疗协同作用的纳米药物能够通过改变施加于肿瘤部位的温度，智能的实现抗癌药物的释放，能够根据实际需要提高或暂停给药量。与背景技术相比，该纳米药物输送系统更能满足人性化、个体化、和差异化的用药需求。
与背景技术相比，本实施例所提供的具有磁热疗-化疗协同作用的纳米药物输送系统能够实现磁热疗-化疗协同治疗的目的，显著提高肿瘤的治疗效果。
实施例3
本实施例提供γ-氨丙基三乙氧基硅烷修饰的具有磁热疗-化疗协同作用的纳米药物的制备方法，负责抗癌药物DOX。
步骤一、二、三同实施例1相同。
步骤四，取150毫克实施例一中步骤三制备的纳米药物载体，分散于24毫升阿霉素药物的PBS缓冲溶液中(阿霉素浓度0.5毫克/毫升)，上述混合液在避光的振荡器室温摇晃24小时后离心分离，PBS缓冲液洗涤，最后得到储藏阿霉素药物的纳米药物载体。
步骤五，取链长为20个核苷酸，且5'端修饰有羧基的DNA分子200微升(DNA浓度为100微摩尔),加入35.6微升EDC溶液(EDC溶液浓度为2.8毫摩尔)活化羧基10分钟后，加入7.2微升NHS溶液(NHS溶液浓度为2.8毫摩尔)继续活化羧基20分钟，随后加入上述装载了阿霉素药物的纳米药物载体6毫升(载体浓度为1毫克/毫升)，上述混合液在避光的振荡器室温摇晃24小时后离心分离，PBS缓冲液洗涤，最后得到本实施例所涉及的γ-氨丙基三乙氧基硅烷修饰的具有磁热疗-化疗协同作用的纳米药物。
测定得到阿霉素的储藏量为64微克药物/1毫克纳米药物载体。与相同实验条件下，传统药物载体对阿霉素的储存量(30微克药物/1毫克药物载体)相比，本发明提供的纳米药物载体的储藏量显著增加。
图5为本发明的实施例三制备的具有磁热疗-化疗协同作用的纳米药物在pH5.0，温度为37℃和43℃条件下的阿霉素(DOX)释放曲线。
将上述制备得到的纳米药物载体输送系统在pH值为5.0的缓冲液中，温度控制在37℃和43℃条件下进行阿霉素药物的释放实验。释放药物浓度在NanoDrop2000C超微量分光光度计上测定，实验测定前先测定阿霉素药物在溶液中浓度与吸光度的标准曲线。
结果如图3所示，在37℃时，6小时内只有12％的DOX释放出来；而在43℃时，6小时的释放达到51％。说明输送系统DNA分子包封的情况下，输送过程中在接近于体温的情况下很少释放抗癌药物，而当局部温度升高后可以获得抗癌药物的较快释放。说明DNA分子具有较高的包封效率。能够实现主动控制药物释放的目的。
图6为本发明的的实施例三制备的具有磁热疗-化疗协同作用的纳米药物在pH5.0，温度在高温(43℃)-低温(37℃)转换条件下的阿霉素(DOX)释放曲线。
将上述制备得到的具有磁热疗-化疗协同作用的纳米药物分散在pH值为5.0的缓冲液中，调节实验温度进行高温(43℃，1小时)-低温(37℃，12小时)转换条件下阿霉素(DOX)释放实验。释放药物浓度在NanoDrop2000C超微量分光光度计上测定，实验测定前先测定阿霉素药物在溶液中浓度与吸光度的标准曲线。
结果如图6所示，在43℃条件下，加热1小时后，有9％的DOX释放出来；而当将体系降温至37℃并保持12小时，只有1.45％的DOX释放出来。说明输送系统在DNA分子包封的情况下，能够通过对病灶组织部位温度升温和降温的变化，得到智能控制阿霉素(DOX)释放的目的。从而使得该药物更加适应于个体化和差异化的临床应用。
图7为本发明的实施例一制备的具有磁热疗-化疗协同作用的纳米药物载体和实施例三制备的具有磁热疗-化疗协同作用的纳米药物的细胞毒性结果。
体外细胞毒性测定采用标准的CellCountingKit-8方法。宫颈癌细胞株Hela细胞购买于美国InvivoGen并按供应商提供的方法进行培养。
具体实验过程如下：将三组样品(实施例一制备的具有磁热疗-化疗协同作用的纳米药物载体、实施例三步骤四所制备的储藏阿霉素药物的纳米药物载体和实施例三步骤五所制备的纳米药物)分散于MEM培养液并配制成浓度为1毫克/毫升，当Hela细胞播种在96孔板中(细胞密度5000个/孔)后，将样品悬浮液立刻加到96孔板，最终的样品浓度分别达到25，50，75，和100微克/毫升，溶液体积为100微升。
三组样品悬浮液与细胞共培养24小时后，每孔中加入10微升的CCK-8溶液，细胞继续培养3小时后用酶标仪(MTP-880)测定450纳米波长处的吸光度。样品悬浮液处理过的Hela细胞的活细胞与没有样品悬浮液处理的Hela细胞的活细胞相比为细胞毒性。
结果如图7所示，实施例一所制备的实施例一制备的具有磁热疗-化疗协同作用的纳米药物载体在浓度达到100微克/毫升仍然没有细胞毒性，实施例三步骤四所制备的储藏阿霉素药物的纳米药物载体，如果不经DNA包封介孔孔道，则该纳米药物载体对细胞仍有很高的毒性作用，将此载体利用DNA分子进行孔道包封，即得到实施例三步骤五所制备的具有磁热疗-化疗协同作用的纳米药物，其对细胞的毒性显著降低，说明DNA分子起到了很好的包封孔道的作用，能够显著降低纳米药物在输送药物的过程中发生抗癌药物泄漏的概率。
图8为本发明的实施例一制备的具有磁热疗-化疗协同作用的纳米药物载体和实施例三制备的具有磁热疗-化疗协同作用的纳米药物在磁热和化疗药物协同作用下的细胞毒性结果。
体外细胞毒性测定采用标准的CellCountingKit-8方法。具体培养过程同上，最终的样品浓度为100微克/毫升，溶液体积为100微升。
样品悬浮液分两组与细胞共培养24小时后，将其中一组加热至43℃并保持30分钟，之后于37℃培养24小时，随后向每孔中加入10微升的CCK-8溶液，细胞继续培养24小时后用酶标仪(MTP-880)测定450纳米波长处的吸光度。另一组在加热至43℃并保持30分钟后，于37℃继续培养2小时，随后继续加热至43℃并保持30分钟，之后于37℃继续培养24小时，随后向每孔中加入10微升的CCK-8溶液，细胞继续培养24小时后用酶标仪(MTP-880)测定450纳米波长处的吸光度。样品悬浮液处理过的Hela细胞的活细胞与没有样品悬浮液处理的Hela细胞的活细胞相比为细胞毒性。
结果如图8所示，实施例一所制备的纳米药物载体在两次磁热作用后，对细胞毒性并不明显，而实施例三所制备的纳米药物，高温不仅刺激了通过静电吸引贴附于载体表面的DNA与载体之间作用力的减弱，从而导致被包封的介孔孔道打开，而且还促进了储藏于介孔孔道内的抗癌药物阿霉素的释放，两次加热作用后效果更加明显。说明本实验研究所用的具有磁热疗-化疗协同作用的纳米药物具有显著的磁热和化疗药物协同治疗的效果。
图9为本发明的实施例一制备的具有磁热疗-化疗协同作用的纳米药物载体在交变磁场作用下的磁热效应曲线。
将纳米药物载体分散于去离子水中得到颗粒浓度为10～50毫克/毫升，采用在DM100磁热疗效应分析仪(西班牙nanoscalebiomagnetics公司)测定该纳米药物载体的磁热效应。当设置磁场强度为180高斯，磁场频率409千赫兹，颗粒溶液体积为1毫升时，交变磁场作用45秒使得溶液温度从37℃升温至43℃。
结果如图9所示，1毫升的纳米药物载体溶液(50毫克/毫升)在交变磁场(磁场强度180高斯,磁场频率409千赫兹)作用下快速升温，能够在45秒内从37℃升至43℃。说明纳米药物载体有很好的磁热效应，能够在较短时间内达到磁热疗的温度(磁热疗温度一般在43～48℃)，有利于实际应用。

Claims (10)

1.一种具有磁热疗-化疗协同作用的纳米药物载体，用于承载纳米药物颗粒，其特征在于，包括：
介孔氧化硅颗粒构成的介孔壳层，所述介孔壳层内部具有多个介孔孔道，所述介孔孔道在所述介孔壳层的表面形成介孔；
嵌入在所述介孔壳层内部的且由Fe3O4纳米颗粒构成的内核；以及
包封在所述介孔上的DNA分子构成的DNA分子层，
其中，所述介孔孔道贯穿所述介孔壳层，用于承载所述纳米药物颗粒，
所述介孔孔道从内核向所述介孔壳层呈呈放射状分布，所述DNA分子为长度为20～40的核苷酸链。
2.根据权利要求1所述的具有磁热疗-化疗协同作用的纳米药物载体，其特征在于：
其中，所述纳米药物载体的颗粒粒径为50～200纳米。
3.根据权利要求1所述的具有磁热疗-化疗协同作用的纳米药物载体，其特征在于：
其中，所述介孔孔道的孔径为2～10纳米。
4.根据权利要求1所述的具有磁热疗-化疗协同作用的纳米药物载体，其特征在于：
其中，所述Fe3O4纳米颗粒的粒径为10～20纳米。
5.根据权利要求1所述的具有磁热疗-化疗协同作用的纳米药物载体，其特征在于：
其中，所述介孔氧化硅颗粒的外表面和所述介孔孔道的孔道表面修饰有氨基、羧基中的任意一种，
所述DNA分子的5'端修饰有羧基、氨基、巯基中的任意一种。
6.一种具有磁热疗-化疗协同作用的纳米药物，承载有纳米药物颗粒，其特征在于，包括：
纳米药物载体，具有介孔壳层；以及
纳米药物颗粒，被所述介孔壳层承载，
其中，所述纳米药物载体为权利要求1-5中任意一项所述的具有磁热疗-化疗协同作用的纳米药物载体。
7.根据权利要求6所述的具有磁热疗-化疗协同作用的纳米药物，其特征在于：
其中，所述纳米药物颗粒中的药物包括用于抗癌的药物。
8.一种制备具有磁热疗-化疗协同作用的纳米药物载体的方法，其特征在于包括以下步骤：
步骤一，制备棕褐色胶体颗粒溶液，
将共沉淀法制备的Fe3O4纳米颗粒超声分散在超纯水中得到Fe3O4纳米颗粒溶液，将十六烷基对甲苯磺酸酯和三乙醇胺加入到所述Fe3O4纳米颗粒溶液中，并在70℃～90℃温度下搅拌一段时间后将正硅酸乙酯快速加入并继续搅拌1～4小时，得到棕褐色胶体颗粒溶液；
步骤二，制备磁性介孔氧化硅纳米颗粒，
使用磁铁块从步骤一中所述棕褐色胶体颗粒溶液中收集棕褐色胶体颗粒，分别用去离子水和醇类溶剂多次洗涤所述棕褐色胶体颗粒，真空干燥，煅烧，得到磁性介孔氧化硅纳米颗粒；
步骤三，表面修饰，
将硅烷偶联剂以3～6毫摩尔硅烷偶联剂混合1克的步骤二中所述磁性介孔氧化硅纳米颗粒这样的比例加入无水甲苯中分散得到悬浮液，在油浴加热条件下回流24～48小时，过滤悬浮液得到滤饼，用无水甲苯洗涤该滤饼后得到纳米药物载体；
步骤四，活化
将5'端修饰有修饰基团的DNA分子用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)活化后，加入N-羟基丁二酰亚胺(NSH)再活化即得到活化过的DNA溶液，待活化完成后，将步骤三中所述纳米药物载体加入到上述活化过的DNA溶液中，避光反应，即得具有磁热疗-化疗协同作用的纳米药物载体。
9.根据权利要求8所述的制备具有磁热疗-化疗协同作用的纳米药物载体的方法，其特征在于：
其中，步骤一中所述Fe3O4纳米颗粒、所述十六烷基对甲苯磺酸酯、所述三乙醇胺和所述正硅酸乙酯的摩尔比为1～100:50～80:200～600:400～600，
所述硅烷偶联剂为γ-氨丙基三乙氧基硅烷、N-β(氨乙基)-γ-氨丙基三甲氧基硅烷、N-β(氨乙基)-γ-氨丙基三乙氧基硅烷、氨乙基氨乙基氨丙基三甲氧基硅烷、氨乙基氨乙基氨丙基三乙氧基硅烷、γ-羧丙基三乙氧基硅烷中的任意一种或至少两种的混合物。
10.一种制备具有磁热疗-化疗协同作用的纳米药物的方法，其特征在于：
步骤一，制备棕褐色胶体颗粒溶液，
将共沉淀法制备的Fe3O4纳米颗粒超声分散在超纯水中得到Fe3O4纳米颗粒溶液，将十六烷基对甲苯磺酸酯和三乙醇胺加入到所述Fe3O4纳米颗粒溶液中，并在70℃～90℃温度下搅拌一段时间后将正硅酸乙酯快速加入并继续搅拌1～4小时，得到棕褐色胶体颗粒溶液；
步骤二，制备磁性介孔氧化硅纳米颗粒，
使用磁铁块从步骤一中所述棕褐色胶体颗粒溶液中收集棕褐色胶体颗粒，分别用去离子水和醇类溶剂多次洗涤所述棕褐色胶体颗粒，真空干燥，煅烧，得到磁性介孔氧化硅纳米颗粒；
步骤三，表面修饰，
将硅烷偶联剂以3～6毫摩尔硅烷偶联剂混合1克的步骤二中所述磁性介孔氧化硅纳米颗粒这样的比例加入无水甲苯中分散得到悬浮液，在油浴加热条件下回流24～48小时，过滤悬浮液得到滤饼，用无水甲苯洗涤该滤饼后得到纳米药物载体；
步骤四，负载，
将步骤三中所述的纳米药物载体分散于药物的缓冲溶液中室温、避光条件下摇晃后离心分离，用所述缓冲溶液洗涤，即得到负载药物的纳米药物载体；
步骤五，活化，
将5'端修饰有修饰基团的DNA分子用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)活化后，加入N-羟基丁二酰亚胺(NSH)再活化即得到活化过的DNA溶液，待活化完成后，将步骤四中所述负载药物的纳米药物载体加入到上述活化过的DNA溶液中，避光反应，即得具有磁热疗-化疗协同作用的纳米药物。
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