BR112021010861A2 - Nanomotores alimentados com enzimas funcionalizadas - Google Patents

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Samuel Sánchez Ordóñez
Tania Patiño Padial
Ana Candida Lopes Hortelão
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Fundació Institut De Bioenginyeria De Catalunya
Institució Catalana De Recerca I Estudis Avançats
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Abstract

a presente invenção fornece um nanomotor alimentado por enzima, que compreende uma partícula com uma superfície, anenzima e uma molécula heteróloga; caracterizado por a enzima e a molécula heteróloga serem ligadas descontinuamente sobre toda a superfície da partícula. a invenção também fornece o nanomotor para uso em terapia, diagnóstico e prognóstico, em particular, para o tratamento de câncer. além disso, a invenção fornece o uso do nanomotor para detectar um analito em uma amostra isolada.

Description

“NANOMOTORES ALIMENTADOS COM ENZIMAS FUNCIONALIZADAS”
[0001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido de Patente Europeia EP18382896 depositado em 5 de dezembro de 2018.
CAMPO DA TÉCNICA
[0002] A presente invenção pertence ao campo da nanotecnologia. Em particular, a invenção refere-se a nanomotores alimentados por enzimas externamente funcionalizados. Os nanomotores da invenção são particularmente úteis para terapia e biodetecção.
ANTECEDENTES DA TÉCNICA
[0003] Micronadadores catalíticos são sistemas artificiais capazes de se autopropelirem graças à conversão de energia química em uma força mecânica que, em última análise, se traduz em movimento ativo.
[0004] Embora os micro e nanomotores quimicamente alimentados tenham mostrado aplicabilidade promissora em muitos campos, como remediação ambiental, transporte e entrega de carga, penetração de tecidos e células e entrega de drogas ativas ao estômago in vivo, sua implementação na biomedicina é frequentemente restrita pela toxicidade inerente do combustível ou sua disponibilidade limitada dentro do organismo.
[0005] Recentemente, o uso de catálise enzimática surgiu como uma alternativa atraente para substituir os combustíveis tóxicos comumente usados, uma vez que oferece recursos exclusivos, incluindo biocompatibilidade, versatilidade e biodisponibilidade de combustível. Nesse sentido, o uso de urease, catalase e glicose oxidase mostrou aumentar a difusão de nanopartículas em concentrações fisiologicamente relevantes do substrato enzimático.
[0006] Além disso, uma propulsão direcional pode ser alcançada ao usar urease para alimentar partículas ocas de sílica Janus - isto é, partículas com dois hemisférios nos quais apenas um deles está acoplado à enzima. Seu movimento pode ser ligado e desligado pela adição de sais inibidores de enzimas e as trajetórias podem ser modificadas sob demanda pela aplicação de um campo magnético, permitindo um alto grau de controlabilidade (Xing MA et al., “Motion Control of Urea-Powered Biocompatible Hollow Microcapsules”, ACS Nano., 2016, vol. 10 (3), páginas 3.597 a 3.605).
[0007] Também foi descrito o uso de nanomotores propelidos por enzimas para aumentar a eficiência de entrega de doxorrubicina às células cancerosas in vitro (Ana C. et al., “Enzyme-Powered Nanobots Enhance Anticancer Drug Delivery”, Advanced Functional Materials, 2017, vol. 28 (25)).
[0008] No entanto, a produção de partículas esféricas de Janus envolve técnicas dispendiosas e demoradas que podem comprometer sua escalabilidade e, portanto, sua aplicabilidade.
[0009] Mais recentemente, e apesar do fato de que uma estrutura assimétrica e distribuição do catalisador têm sido tradicionalmente reivindicadas como essenciais para a geração de movimento ativo, foi mostrada a autopropulsão de motores esféricos não Janus alimentados por catálise enzimática localizada sobre o superfície inteira da partícula (Patino T. et al., “Influence of Enzyme Quantity and Distribution on the Self-Propulsion of Non- Janus Urease-Powered Micromotors”, J. Am. Chem. Soc., 2018, vol. 140 (25), páginas 7.896 a 7.903) No entanto, o movimento desse tipo de nanomotores se mostrou extremamente sensível à cobertura enzimática. Na verdade, foi constatado que um grande número de moléculas de enzimas por nanomotor era necessário para atingir o movimento desejado. Isso tem dificultado fortemente o uso e aplicabilidade desses nanomotores devido às limitações que impõe à funcionalização externa.
[0010] Portanto, apesar dos esforços feitos até agora, ainda há necessidade de nanomotores movidos a enzimas que sejam fáceis de produzir e se adaptar a várias aplicações, mantendo uma alta capacidade de movimento.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0011] Os presentes inventores desenvolveram novos nanomotores funcionalizados com propulsão de enzima que são úteis em uma variedade de aplicações biomédicas, químicas e ambientais.
[0012] Surpreendentemente, os inventores constataram que ao anexar externamente uma molécula a nanomotores não- Janus alimentados por enzimas, poderiam manter ou mesmo aumentar os padrões de velocidade e movimento das partículas (consulte a Figura 2D e a Figura 7B).
[0013] Isso foi altamente inesperado, uma vez que foi mostrado anteriormente que os nanomotores nos quais as enzimas de propulsão são fixadas em toda a superfície da partícula têm um movimento altamente dependente da cobertura da enzima. Portanto, quando o número de enzimas cai abaixo de um determinado limite, foi mostrado que o movimento da partícula foi completamente abolido (Patiño T. et al., supra). Assim, ficou evidente que qualquer modificação realizada na superfície dessas partículas, que necessariamente reduza a superfície disponível para fixação da enzima, deveria reduzir a capacidade de movimento nanomotor e, portanto, sua aplicabilidade.
[0014] Conforme mostrado nos exemplos abaixo, os inventores constataram que a ligação externa de diferentes tipos de moléculas volumosas, como anticorpos ou estruturas de DNA, não só não afeta o movimento dos nanomotores, mas também aumenta sua capacidade de penetração celular, estabilidade e evita sua agregação. A Figura 4 mostra a maior capacidade dos nanomotores funcionalizados com um anticorpo para penetrar nas células tumorais, apesar da falta de qualquer peptídeo de penetração celular.
[0015] Além disso, os inventores constataram surpreendentemente que os nanomotores alimentados por enzimas funcionalizados fornecidos no presente documento apresentam uma atividade tão forte que são capazes de aumentar a morte de células cancerosas, mesmo quando não são carregados com qualquer droga citotóxica (consulte a Figura
4D). Isso constitui uma grande vantagem, pois permite o desenvolvimento de tratamentos anticâncer com maior especificidade e menores efeitos secundários.
[0016] Uma vantagem importante dos nanomotores da invenção é sua versatilidade - podem ser projetados com diferentes enzimas para tornar os mesmos ativos apenas nos locais em que o substrato está presente. Isso oferece ainda a vantagem de permitir o desenvolvimento de tratamentos com altos efeitos específicos e baixos efeitos secundários.
[0017] Tendo em conta o que precede, os nanomotores da invenção fornecem uma ferramenta muito valiosa, útil em uma variedade de campos, como tratamento de doenças e biossensorização.
[0018] Assim, em um primeiro aspecto, a invenção fornece um nanomotor alimentado por enzima, que compreende uma partícula com uma superfície; uma enzima; e uma molécula heteróloga; caracterizado por a enzima e a molécula heteróloga serem ligadas descontinuamente sobre toda a superfície da partícula. A invenção também fornece um nanomotor alimentado por enzima, que compreende uma partícula com uma superfície; uma enzima; e uma molécula heteróloga; em que a enzima e a molécula heteróloga são ligadas descontinuamente ao longo de toda a superfície da partícula.
[0019] Em um segundo aspecto, a invenção fornece uma composição farmacêutica que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz do nanomotor, conforme definido no primeiro aspecto, e um excipiente e/ou carreador farmaceuticamente aceitável.
[0020] Em um terceiro aspecto, a invenção fornece o nanomotor conforme definido no primeiro aspecto ou a composição farmacêutica conforme definida no segundo aspecto, para uso em terapia, diagnóstico ou prognóstico.
[0021] Em um quarto aspecto, a invenção fornece um kit de peças que compreende um nanomotor conforme definido no primeiro aspecto ou a composição farmacêutica conforme definida no segundo aspecto e, opcionalmente, instruções para seu uso. A invenção também fornece um kit de peças que compreende um nanomotor conforme definido no primeiro aspecto ou a composição farmacêutica conforme definida no segundo aspecto e instruções para seu uso. O kit da invenção pode compreender ainda um tampão adequado para diluir os nanomotores da invenção, ou um tampão para suspender novamente os nanomotores secos ou liofilizados da invenção.
[0022] Em um quinto aspecto, a invenção fornece um método in vitro de detecção de um analito em uma amostra isolada, que compreende o contato do nanomotor conforme definido o primeiro aspecto com a amostra.
[0023] Em um sexto aspecto, a invenção fornece o uso do nanomotor conforme definido no primeiro aspecto em um método in vitro para detectar um analito em uma amostra isolada.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0024] A Figura 1, relacionada ao Exemplo 1, mostra a fabricação e caracterização de nanomotores de urease/PEG (MSNP-Ur/PEG) e nanomotores de urease modificados por anticorpo (MSNP-Ur/PEG-Ab). A) Esquema que ilustra o processo de fabricação em etapas para obter os nanomotores.
[0025] A Figura 2, relacionada ao Exemplo 1, mostra a análise de movimento de MSNP-Ur/PEG e MSNP-Ur/PEG-Ab. Trajetórias monitoradas representativas de A) nanomotores MSNP-Ur/PEG e B) nanomotores MSNP-Ur/PEG-Ab a 0 mM, 50 mM e 100 mM de ureia e C) Deslocamentos quadrados médios representativos (MSD) de ambos os tipos de nanomotores em 0 mM, 50 mM e 100 mM. D) Coeficientes de difusão eficazes obtidos por análise de MSD em diferentes concentrações de ureia (N = 20, as barras de erro representam SE, p < 0,001).
[0026] A Figura 3, relacionada ao Exemplo 1, mostra o efeito dos nanomotores com e sem anticorpo na viabilidade dos esferoides na presença de diferentes concentrações de ureia. Quantificação da viabilidade dos esferoides após incubação de 4 horas com MSNP-Ur/PEG (originalmente em azul) e MSNP-Ur/PEG-Ab (originalmente em vermelho), em diferentes concentrações de ureia (N = 3, as barras de erro representam SE).
[0027] A Figura 4, relacionada ao Exemplo 1, mostra as capacidades de direcionamento e penetração de nanomotores modificados com anticorpo em esferoides de câncer de bexiga. Quantificação da internalização de nanomotores modificados por anticorpos em esferoides de câncer de bexiga na presença (40 mM) e ausência de ureia após 4 horas de incubação e quantificação da proliferação de esferoides incubados com MSNP- Ur/PEG e MSNP-Ur/PEG -Ab por 4 horas, na presença (40 mM) e ausência de ureia após medido após um período de repouso de 48 horas.
[0028] A Figura 5, relacionada ao Exemplo 2, mostra a abordagem de fabricação e caracterização de micromotores de DNA. A) Representação esquemática da fabricação de micromotores, em que uma camada de dióxido de silício é cultivada em um modelo comercial de poliestireno adicionando APTES e precursores de sílica TEOS. O núcleo de poliestireno é então removido por DMF e as microcápsulas são funcionalizadas com urease e armação de DNA através do uso de ligante de glutaraldeído (GA). B) O nanointerruptor de DNA responsivo ao pH hibridiza com a armação de DNA complementar que está covalentemente ligado no micromotor. A autopropulsão é obtida pela conversão da ureia em amônia e dióxido de carbono, mediada pela enzima urease. C) A transição triplex-para-duplex dependente do pH da nanomudança de DNA unimolecular resulta na mudança da eficiência de FRET. D) Micrografia eletrônica de varredura de microcápsulas de SiO 2. A inserção mostra uma ampliação da área selecionada. Barra de escala = 2 μm. E) Imagem topográfica obtida por microscopia eletrônica de transmissão. A barra de calibração indica a altura em μm. F) Medições do potencial Z da superfície da micropartícula ao longo do processo de funcionalização (NH2 = partículas revestidas com amina resultantes da síntese; GA = micropartículas após incubação com glutaraldeído, UR = micropartículas funcionalizadas com urease; UR + DNAss = micropartículas funcionalizadas com ambos urease e armação de DNA; Interruptor = micropartículas funcionalizadas de urease e armação de DNA, após sua hibridização com a troca de DNA por 30 min.)
[0029] A Figura 6, relacionada ao Exemplo 2, mostra que nanointerruptor de DNA responsivo ao pH com base em triplex é capaz de detectar mudanças de pH em solução e conjugado à estrutura do micromotor. A) Nanointerruptor triplex de DNA forma uma estrutura intramolecular em gancho duplo através da formação de interações Watson-Crick insensíveis ao pH (linha tracejada) e interações Hoogsteen sensíveis ao pH (pontos). Nanointerruptor triplex que contém tripletos CGC e TAT se desdobra em uma conformação duplex, o que aumenta pH da solução. Emissão de FRET ratiométrica (esquerda) que mostra a transição triplex-para-duplex do nanointerruptor de DNA como uma função das mudanças de pH na solução. B) Análise CSLM do efeito FRET das micropartículas funcionalizadas com nanointerruptor de DNA, que mostra da direita para a esquerda o canal Cy3, o canal FRET e o valor da razão FRET/Cy3, indicados na barra de calibração. Barra de escala = 2 µm. As setas brancas indicam as micropartículas funcionalizadas (originalmente em vermelho para o canal Cy3, em verde para o canal FRET e amarelo para a fusão Cy3/FRET). Medição quantitativa de pH por micromotores funcionalizados com DNA para pH- sensível (C) e não pH específico (D), mostrado como os valores médios de emissão FRET/Cy3, mostrados como a média ± erro padrão da média.
[0030] A Figura 7, relacionada ao Exemplo 2. A) MSDs de micromotores de troca de DNA. Os resultados são apresentados como a média ± erro padrão da média. B) Velocidade calculada a partir dos MSDs. Os resultados são apresentados como a média ± erro padrão da média.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[0031] Todos os termos usados no presente documento neste pedido, a menos que indicado de outra forma, devem ser entendidos em seu significado comum, conforme conhecido na técnica. Outras definições mais específicas para certos termos, conforme usados no presente pedido, são as estabelecidas abaixo e se destinam a ser aplicadas uniformemente em todo o relatório descritivo e reivindicações, a menos que uma definição expressamente estabelecida de outra forma forneça uma definição mais ampla.
[0032] Conforme usado no presente documento, os artigos indefinidos "um" e "uma" são sinônimos de "pelo menos um" ou "um ou mais". A menos que indicado de outra forma, artigos definidos usados no presente documento, como "o", também incluem o plural do substantivo.
[0033] O termo "nanomotor movido por enzima" ou "nanomotor movido por enzima" se refere a um dispositivo molecular, em escala micro ou nano, capaz de converter energia química em movimento por meio da ação de uma enzima localizada na superfície do dispositivo. Em outras palavras, um nanomotor é uma nanopartícula ou micropartícula funcionalizada externamente com enzimas. Sem serem limitadas pela teoria, as enzimas geram movimento através da liberação assimétrica de produtos envolvidos na reação catalítica, criando forças interfaciais dependendo de gradientes osmóticos, cargas ou outras propriedades. Os termos "nanomotor" e "micromotor" são usados de forma intercambiável no presente pedido.
[0034] Conforme usado no presente documento, "molécula heteróloga" se refere a qualquer molécula diferente da enzima (ou enzimas), a dita enzima (ou enzimas) responsável pela propulsão do nanomotor, e que é ligada descontinuamente sobre toda a superfície da partícula. As modalidades permitem, assim, basicamente, qualquer tipo de molécula que pode ser ligada à partícula a ser imobilizada em uma superfície por meio de sua conexão direta ou indireta à partícula.
[0035] A lista fornecida abaixo de moléculas heterólogas deve ser vista meramente como uma lista ilustrativa e não limitativa de moléculas que podem ser usadas nos nanomotores da invenção. As modalidades são, no entanto, não limitadas às mesmas e abrangem qualquer molécula heteróloga que pode ser ligada direta ou indiretamente a um nanomotor das modalidades.
[0036] A molécula heteróloga de interesse pode ser selecionada entre marcadores, como marcadores fluorescentes, isto é, um fluoróforo, por exemplo, isotiocianato de fluoresceína (FITC), isotiocianato de tetrametilrodamina (TRITC) e outros isotiocianatos; N-hidroxissuccinimida (NHS) fluoresceína e outros ésteres de succinimidila; fluoresceína-5-maleimida e outros fluoróforos ativados por maleimida; fluoróforos de cianina; fluoróforos de fluroesceína; fluoróforos de rodamina; corantes atto; corantes dylight fluor; corantes alexa fluor; e corantes boro-dipirrometeno (BODIPY). Outros exemplos incluem marcadores ou marcadores de isótopos, marcadores quimioluminescentes, marcadores radiopacos etc. Nesse caso, o nanomotor pode ser usado como uma molécula de teste para permitir a detecção, usando o marcador, do nanomotor em uma superfície.
[0037] Outros exemplos de moléculas heterólogas incluem moléculas de adesão celular e de fixação celular, como moléculas de adesão celular (CAMs), incluindo superfamília de imunoglobulina (Ig), integrinas, cadereínas e selectinas.
[0038] Um outro exemplo de uma molécula heteróloga são moléculas de matriz extracelular (ECM) incluindo, por exemplo, proteoglicanos (PGs), glicosaminoglicanos (GAGs), sulfato de heparano (HS), sulfatos de condroitina, sulfatos de queratina, colágeno, elastinas etc.
[0039] Um tipo relacionado de molecular de interesse são as moléculas da lâmina basal que incluem moléculas da lâmina basal, que é uma camada de MEC secretada por células epiteliais. Exemplos não limitativos de tais moléculas de lâmina basal incluem laminina, colágeno tipo IV, entactina e perlecan.
[0040] Ainda outro exemplo de uma molécula heteróloga de interesse é uma molécula anti-inflamatória, como corticosteroides; glicocorticoides; fármacos anti-inflamatórios não esteroides (NSAIDs), como ácido acetilsalicílico, ácido iso-butil-propanoico-fenólico e naproxeno sódico (INN); lipoxinas; antagonista do receptor da interleucina-1 (IL-1RA); etc.
[0041] Os antibióticos também podem ser usados como moléculas heterólogas de interesse para inibir o crescimento bacteriano ou matar bactérias. Exemplos não limitativos de antibióticos incluem penicilinas; cefalosporinas; polimixinas; rifamicinas; lipiarmicinas; quinolonas; sulfonamidas; macrolídeos; lincosamidas; tetracilinas; aminoglicosídeos bactericidas; lipopeptídeos cíclicos, como daptomicina; glicililinas, como tigeciclina; oxazolidonas, como linezolida; e lipiarmicinas, como fidaxomicina.
[0042] De forma semelhante, moléculas direcionadas a outros tipos de micróbios, como moléculas antifúngicas, por exemplo, antifúngicos de polieno, como anfotericina B, candicidina, filipina, hamicina, natamicina, nistatina e rimocidina; antifúngicos azólicos, como imidazóis, por exemplo, bifonazol, butoconazol, clotrimazol, econazol, fenticonazol, isoconazol, miconazol, omoconazol, oxiconazol, sertaconazol, sulconazol e tioconazol; triazóis, por exemplo, albaconazol, fluconazol, isavuconazol, itraconazol, posaconazol, ravuconazol, terconazol e voriconazol; e tiazóis, por exemplo, abafungina; alilaminas, como amorolfina, butenafina, naftifina e terbinafina; equinocandinas, como anidulafungina, caspofungina e micafungina; ácido benzoico; ciclopirox olamina; flucitosina; griseofulvina; tolnaftato e ácido undecilênico. Também moléculas antivirais, por exemplo, anticorpos anti- idiotípicos de proteína assistida por vírus (VAP); amantadina; rimantadina; pleconarila; aciclovir; zidovudina (AZT); lamivudina; integrase; fomivirsen; rifampicina; zanamivir e oseltamivir e moléculas antiparasitárias, como mebendazol; pamoato de pirantel; tiabendazol; dietilcarbamazina; ivermectrin; niclosamida; praziquantel; albendazol; praziquantel; rifampicina; anfotericina B; melarosprol; elfornitina; metronidazol; tinidazol e miltefosina, podem ser usados como molécula heteróloga de interesse.
[0043] Um outro exemplo de moléculas heterólogas incluem fatores de crescimento, como adenomedulina (AM), angiopoietina (Ang), fator de motilidade autócrina, proteínas morfogenéticas ósseas (BMPs), fator neutrófico derivado do cérebro (BDNF), fator de crescimento epidérmico (EGF),
eritropoietina (EPO), fator de crescimento de fibroblastos (FGF), fator neutrófico derivado da linha de células gliais (GDNF), fator estimulador de colônia de granulócitos (G-CSF), fator estimulador de colônia de granulócitos macrófagos (GM-CSF), fator de diferenciação de crescimento-9 (GDF9), fator de crescimento de hepatócitos (HGF), fator de crescimento derivado de hepatoma (HDGF), fator de crescimento semelhante à insulina (IGF), mistatina (GDF-8), fator de crescimento nervoso (NGF), fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), trombopoietina (TPO), fator de crescimento transformante alfa (TGF-α), fator de crescimento transformante beta (TGF-β), fator de necrose tumoral alfa (TNF-α), fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), fator de crescimento placentário (PIGF) etc. Um nanomotor com um fator de crescimento ligado a um peptídeo de ligação à superfície pode ser usado para fornecer de uma superfície com, por exemplo, capacidade de estimular o crescimento celular, proliferação e/ou diferenciação celular.
[0044] Outros exemplos de moléculas heterólogas de interesse incluem inibidores do crescimento celular e agentes quimioterápicos. Esse tipo de moléculas heterólogas irá, quando incluído no nanomotor, fornecer um efeito inibidor do crescimento celular local. Exemplos não limitativos de tais moléculas heterólogas de interesse incluem inibidores de farnesil transferase; agentes alquilantes, como mostardas de nitrogênio, por exemplo, mecloretamina, ciclofosfamida, melfalan, clorambucila, ifosfamida e busulfan; nitrosoureias, por exemplo, N-nitroso-N-metilureia (MNU), carmustina (BCNU), lomustina (CCNU), semustina (MeCCNU), fotemustina e estreptozotocina; tetrazinas, por exemplo, dacarbazina, mitozolomida e temozolomida e aziridinas, por exemplo, tiotepa, mitomicina, diaziquona (AZQ); e cisplatinas, por exemplo, cisplatina, carboplatina e oxaplatina; antimetabolitos, como antifolatos, por exemplo, metotrexato e pemetrexedo; fluropirimidinas, por exemplo, fluorouracila e capecitabina; análogos de deocinucleosídeos, como citarabina, gencitabina, decitabina, Vidaza, fludarabina, nelarabina, cladribina, clofarabina e pentostatina; e tiopurinas, por exemplo, tiguanina e mercaptopurina; agentes antimicrotúbulos, como alcaloides de vinca, por exemplo, vincristina, vimblastina, vinorelbina, vindesina e vinflunina; e taxanos, por exemplo, paclitaxel e docetaxel; e podofilotxina; inibidores da topoisomerase, como irinotecano, topotecano, captotecina, etoposídeo, doxorrubicina, mitoxantrona, teniposídeo, novobiocina, merbarona e aclarubicina; antibióticos citotóxicos, como antraciclinas, por exemplo, doxorrubicina, daumorrubicina, epirrubicina, idarrubicina, pirarrubicina, aclarubicina, mitoxantrona, actinomicina, bleomicina, plicamicina e mitomicina.
[0045] Outros grupos de moléculas heterólogas de interesse incluem polinucleotídeos, como moléculas de DNA ou RNA. A molécula heteróloga também pode ser um nanossensor ou uma porta molecular.
[0046] “Ligado descontinuamente em toda a superfície” se refere a uma distribuição discreta que não se restringe a uma única face ou hemisfério da partícula, ou seja, se refere a uma distribuição apolar. Isso não significa, entretanto, que a molécula esteja cobrindo toda a superfície da partícula de maneira homogênea. As partículas da invenção podem apresentar as moléculas ligadas externamente que formam manchas discretas ao longo de toda a superfície da partícula, ou que é a mesma, que apresenta lacunas em que nenhuma molécula está ligada.
[0047] Conforme usado no presente documento, "molécula de direcionamento" se refere a uma molécula com especificidade para uma célula, tecido ou órgão particular. Os exemplos preferidos de moléculas de direcionamento incluem, mas sem limitação, anticorpos, fatores de crescimento e polissacarídeos.
[0048] Conforme usado no presente documento, "nanossensor" se refere a qualquer dispositivo de detecção de nano ou microescala. Os nanossensores da invenção são capazes de detectar e responder a mudanças no ambiente em que estão localizados. Em particular, os nanossensores da invenção podem ser nanointerruptores, que são nanossensores capazes de alternar entre duas formas distintas. Os nanointerruptores de DNA contêm uma molécula de DNA de fita única com uma conformação que muda em resposta a uma mudança ambiental, por exemplo, uma mudança de pH. A molécula de DNA pode ser acoplada a moléculas fluorescentes que permitem a detecção da mudança conformacional.
[0049] Conforme usado no presente documento, "molécula de marcação" se refere a uma molécula que pode ser quimicamente ligada ao nanomotor e que emite um sinal detectável o que permite que o nanomotor seja detectado. Exemplos particularmente preferidos de moléculas de marcação incluem, mas sem limitação, moléculas quimioluminescentes, moléculas fluorescentes e isótopos.
[0050] Conforme usado no presente documento, "porta molecular" ou "nanoválvula" se refere a um sistema molecular em uma escala nano ou micro que alterna entre uma primeira forma fechada e uma segunda forma aberta em resposta a um gatilho selecionado, como luz, temperatura, campos magnéticos e pH. A forma fechada é projetada para bloquear a liberação da carga contida na partícula à qual a porta molecular está fixada. Ao ser acionado o gatilho, o portão muda para a forma aberta permitindo a liberação da carga.
[0051] Um "anticorpo anticâncer" se refere a um anticorpo com a capacidade de prender ou eliminar células cancerosas.
[0052] Como mencionado acima, a invenção fornece em um primeiro aspecto um nanomotor alimentado por enzima externamente funcionalizado com uma molécula heteróloga.
[0053] Em uma modalidade particular do primeiro aspecto, opcionalmente em combinação com qualquer uma das modalidades fornecidas acima ou abaixo, a partícula é uma nanopartícula ou uma micropartícula. O termo "nanopartícula", conforme usado no presente documento, se refere a uma partícula com pelo menos duas dimensões na nanoescala, particularmente com todas as três dimensões na nanoescala. Por analogia, o termo "micropartícula", conforme usado no presente documento, se refere a uma partícula com pelo menos duas dimensões na microescala, particularmente com todas as três dimensões na microescala. Em uma modalidade particular, a partícula é de 1 nm a 100 μm. Em particular, de 30 nm a 2 μm. Mais em particular, de 100 nm a 1 μm. Ainda mais em particular, de 400 nm a 600 nm.
[0054] No que diz respeito à forma das nanopartículas ou micropartículas descritas no presente documento, estão incluídas esferas, poliédricas e em formato de bastonete. Particularmente, quando a nanopartícula ou micropartícula é substancialmente em formato de haste com uma seção transversal substancialmente circular, como um nanofio ou um nanotubo, microfio ou microtubo, a "nanopartícula" ou "micropartícula" se refere a uma partícula com pelo menos duas dimensões em a nanoescala ou microescala, sendo que essas duas dimensões são o corte transversal da nanopartícula ou da micropartícula.
[0055] Em uma modalidade particular do primeiro aspecto, opcionalmente em combinação com qualquer uma das modalidades fornecidas acima ou abaixo, a partícula é esférica.
[0056] Conforme usado no presente documento, o termo "tamanho" se refere a uma dimensão física característica. Por exemplo, no caso de uma nanopartícula/micropartícula que é substancialmente esférica, o tamanho da nanopartícula/micropartícula corresponde ao diâmetro da nanopartícula/micropartícula. Ao se referir a um conjunto de nanopartículas/micropartículas como sendo de um tamanho específico, é contemplado que o conjunto pode ter uma distribuição de tamanhos em torno do tamanho especificado. Assim, conforme usado no presente documento, um tamanho de um conjunto de nanopartículas/micropartículas pode se referir a um modo de uma distribuição de tamanhos, como um tamanho de pico da distribuição de tamanhos. Além disso, quando não é perfeitamente esférico, o diâmetro é o diâmetro equivalente do corpo esférico incluindo o objeto. Este diâmetro é geralmente chamado de o “diâmetro hidrodinâmico”, cujas medições podem ser realizadas com uso de um Wyatt Mobius acoplado a um sistema de pressurização de célula Atlas ou Malvern. Imagens de microscopia eletrônica de transmissão (TEM) ou microscopia eletrônica de varredura (SEM) também fornecem informações sobre os diâmetros.
[0057] Uma grande variedade de materiais particulados está disponível para o especialista, e entenderia que o material escolhido dependeria da aplicação pretendida do nanomotor, por exemplo, nanomotores para usos terapêuticos deveriam ser feitos com partículas biocompatíveis.
[0058] Assim, em uma modalidade particular do primeiro aspecto, opcionalmente em combinação com qualquer uma das modalidades fornecidas acima ou abaixo, a partícula é produzida a partir de um material selecionado do grupo que consiste em metal, óxido de metal, polímero, lipídio, proteína, membrana celular, corpo celular, material carbonáceo e suas misturas. Em uma modalidade particular, o metal é alumínio (Al), platina (Pt), paládio (Pd) ou magnésio (Mg). Em uma modalidade particular, o óxido de metal é selecionado de sílica (SiO2), óxido de manganês (MnO2) e óxido de titânio (TiO2). Em uma modalidade particular, o polímero é poliestireno ou estruturas orgânicas metálicas. Em uma modalidade particular, o material carbonáceo é selecionado a partir de carbono, grafeno e fulereno. Em uma modalidade de partícula, o material da partícula é um polímero. Em uma modalidade de partícula, a partícula é uma partícula à base de proteína (proteinoma). Em uma modalidade particular, o corpo celular é uma plaqueta ou um glóbulo vermelho (RBC).
[0059] O termo "estrutura orgânica metálica" ou "MOF" se refere a compostos que compreendem íons metálicos ou aglomerados coordenados a ligadores orgânicos. O elemento metálico central pode ser pelo menos um selecionado do grupo que consiste em zinco (Zn), cobalto (Co), cádmio (Cd), níquel (Ni), manganês (Mn), cromo (Cr), cobre (Cu), lantânio (La), ferro (Fe), platina (Pt), paládio (Pd), prata (Ag), ouro (Au), ródio (Rh), irídio (Ir),
rutênio (Ru), chumbo (Pb), estanho (Sn), alumínio (Al), titânio (Ti), molibdênio (Mo), tungstênio (W), vanádio (V), nióbio (Nb), tântalo (Ta), escândio (Sc), ítrio (Y), gálio (Ga), germânio (Ge), índio (In), bismuto (Bi), selênio (Se) e antimônio (Sb). O ligador orgânico pode incluir um grupo funcional que pode ser ligado a pelo menos dois íons metálicos.
[0060] "Membrana celular" se refere à bicamada lipídica que forma uma barreira contínua em torno das células. As partículas da invenção podem ser formadas por membranas celulares procarióticas ou eucarióticas.
[0061] Conforme usado no presente documento, "corpo celular" se refere à parte de uma célula que contém o material genético rodeado pelo citoplasma e a membrana plasmática.
[0062] O termo “polimersoma" se refere a vesículas artificiais feitas de copolímeros em bloco sintéticos anfifílicos.
[0063] O termo "proteinossomo" se refere a partículas compostas de proteínas automontadas ou conjugados de proteína-polímero.
[0064] Em uma modalidade particular, opcionalmente em combinação com qualquer uma das modalidades fornecidas acima ou abaixo, a partícula é produzida a partir de sílica mesoporosa. Conforme usado no presente documento, "sílica mesoporosa" se refere à sílica porosa com poros de tamanho médio regularmente dispostos, especificamente, os poros são de 2 nm a 50 nm e, mais especificamente, de 4 nm a cerca de 40 nm.
[0065] Em uma modalidade particular do primeiro aspecto, opcionalmente em combinação com qualquer uma das modalidades fornecidas acima ou abaixo, a enzima é selecionada a partir do grupo que consiste em oxidorredutase, hidrolase e liase. Em uma modalidade mais particular, a enzima é selecionada a partir do grupo que consiste em glicose oxidase, urease, catalase, glutamato oxidase, xantina oxidase, peroxidase, bilirrubina oxidase, lipase, protease e combinações do mesmo. Em uma modalidade mais particular, a enzima é urease. O termo urease (EC 3.5.1.5) se refere ao grupo de enzimas que catalisam a hidrólise da ureia em dióxido de carbono e amônia. Em uma modalidade particular da invenção, a urease é de Canavalia ensiformis (Número CAS 9002-13-5). Em uma modalidade mais particular, é uma urease de Tipo IX de Canavalia ensiformis (Número CAS 9002- 13-5). A sequência da enzima pode ser encontrada em vários bancos de dados, como o Uniprot (P07374 UREA_CANEN, atualização 01/02/1994).
[0066] Em uma modalidade particular do primeiro aspecto, opcionalmente em combinação com qualquer uma das modalidades fornecidas acima ou abaixo, a molécula heteróloga é selecionada a partir do grupo que consiste em uma molécula de direcionamento, uma molécula de marcação, um nanossensor e um portão molecular.
[0067] Em uma modalidade particular do primeiro aspecto, opcionalmente em combinação com qualquer uma das modalidades fornecidas acima ou abaixo, a molécula heteróloga é um anticorpo. Em uma modalidade mais particular, o anticorpo é um anticorpo anticâncer. Em uma modalidade mais particular, o anticorpo anticâncer se liga a um receptor de membrana. Em uma modalidade mais particular, o receptor de membrana é um FGFR (receptor do fator de crescimento de fibroblastos) selecionado do grupo que consiste em FGFR1, FGFR2, FGFR3 e FGFR4. Em uma modalidade mais particular, o FGFR é FGFR3.
[0068] Em uma modalidade particular do primeiro aspecto, opcionalmente em combinação com qualquer uma das modalidades fornecidas acima ou abaixo, a molécula heteróloga é um nanossensor. Existem numerosos nanossensores disponíveis para os versados na técnica (Campuzano S. et al., “Motion-driven sensing and biosensing using electrochemically propelled nanomotors”, Analyst. 2011, vol. 36 (22), páginas
4.621 a 4.630). Em uma modalidade particular, o nanossensor é um nanointerruptor de DNA. Os nanointerruptores de DNA são complexos moleculares que compreendem uma molécula de DNA de fita simples acoplada a um par fluoróforo-supressor. Em uma modalidade particular, a sequência da molécula de DNA do nanointerruptor de DNA tem pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95 %, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 1.
[0069] Em uma modalidade particular, o nanossensor é uma nanopartícula. Em uma modalidade mais particular, o nanossensor é uma nanopartícula de metal. Mais particularmente, a nanopartícula de metal é uma nanopartícula de ouro (Au). Os versados na técnica entenderiam que a nanopartícula que forma o nanossensor deve ser menor do que a nanopartícula ou micropartícula que forma o nanomotor.
[0070] Na presente invenção, o termo "identidade" se refere à porcentagem de resíduos que são idênticos nas duas sequências quando as sequências estão alinhadas de forma otimizada. Se, no alinhamento ideal, uma posição em uma primeira sequência é ocupada pelo mesmo resíduo de aminoácido que a posição correspondente na segunda sequência, as sequências exibem identidade em relação a essa posição. O nível de identidade entre duas sequências (ou "identidade de sequência percentual") é medido como uma razão do número de posições idênticas compartilhadas pelas sequências em relação ao tamanho das sequências (isto é, identidade de sequência percentual = (número de posições idênticas/número total de posições) x 100).
[0071] Vários algoritmos matemáticos para obter rapidamente o alinhamento ideal e calcular a identidade entre duas ou mais sequências são conhecidos e incorporados em vários programas de software disponíveis. Exemplos de tais programas incluem os programas MATCH-BOX, MULTAIN, GCG, FASTA e ROBUST para análise de sequência de aminoácidos, entre outros. Os programas de análise de software preferidos incluem os programas ALIGN, CLUSTAL W e BLAST (por exemplo, BLAST 2.1, BL2SEQ e versões posteriores dos mesmos).
[0072] Para a análise da sequência de aminoácidos, uma matriz de peso, como as matrizes BLOSUM (por exemplo, as matrizes BLOSUM45, BLOSUM50, BLOSUM62 e BLOSUM80), matrizes Gonnet ou matrizes PAM (por exemplo, as matrizes PAM30, PAM70, PAM120, PAM160, PAM250, e matrizes PAM350), são usados na determinação da identidade.
[0073] Os programas BLAST fornecem análise de pelo menos duas sequências de aminoácidos, alinhando-se uma sequência selecionada contra várias sequências em um banco de dados (por exemplo, GenSeq), ou, com BL2SEQ, entre duas sequências selecionadas. Os programas BLAST são preferencialmente modificados por programas de filtragem de baixa complexidade, como os programas DUST ou SEG, que são preferencialmente integrados nas operações do programa BLAST. Se os custos de existência de lacuna (ou pontuações de lacuna) forem usados, o custo de existência de lacuna de preferência é definido entre cerca de -5 e -15. Parâmetros de intervalo semelhantes podem ser usados com outros programas, conforme apropriado. Os programas BLAST e os princípios subjacentes a eles são descritos posteriormente em, por exemplo, Altschul et al., “Basic local alignment search tool”, 1990, J. Mol. Biol, v. 215, páginas 403 a 410.
[0074] Para análise de sequência múltipla, o programa CLUSTAL W pode ser usado. O programa CLUSTAL W desejavelmente é executado usando configurações "dinâmicas" (versus "rápidas"). As sequências de aminoácidos são avaliadas usando um conjunto variável de matrizes BLOSUM dependendo do nível de identidade entre as sequências. O programa CLUSTAL W e os princípios de operação subjacentes são ainda descritos em, por exemplo, Higgins et al., “CLUSTAL V: improved software for multiple sequence alignment”, 1992, CABIOS, 8 (2), páginas 189 a
191.
[0075] Em uma modalidade particular do primeiro aspecto, opcionalmente em combinação com qualquer uma das modalidades fornecidas acima ou abaixo, o nanomotor compreende ainda uma carga. Em uma modalidade particular, a carga é selecionada a partir da lista que consiste em um medicamento, em que o medicamento é selecionado a partir do grupo que consiste em uma pequena molécula, um ácido nucleico, uma enzima terapêutica,
um peptídeo, uma proteína ou um hormônio. Por "carga" entende-se qualquer molécula transportada dentro do nanomotor para ser entregue no alvo desejado. Dependendo do material da superfície e da porosidade da partícula, a carga pode estar dentro da partícula ou adsorvida em sua superfície.
[0076] Em uma modalidade particular, o fármaco é um fármaco citotóxico. Mais particularmente, é uma droga anticâncer.
[0077] Em uma modalidade particular do primeiro aspecto, opcionalmente em combinação com qualquer uma das modalidades fornecidas acima ou abaixo, a enzima e a molécula heteróloga são ligadas à superfície da partícula diretamente ou através de um ligante. Em uma modalidade mais particular, o ligante é selecionado a partir do grupo que consiste em anidridos, álcoois, ácidos, aminas, epóxis, isocianatos, silanos, grupos halogenados e grupos polimerizáveis, de preferência 3- aminopropiltrietoxissilano (APTES). Em uma modalidade ainda mais particular, o ligante é glutaraldeído.
[0078] Em tal aspecto, uma parte do ligante é ligada à superfície da partícula e outra parte do ligante é ligada à enzima ou molécula heteróloga, formando assim uma ligação covalente entre a enzima ou molécula heteróloga e a superfície. A ligação entre o ligante e a dita superfície e a dita enzima ou molécula heteróloga é efetuada por reações químicas que ocorrem entre o ligante e a enzima ou molécula heteróloga, garantindo assim uma ligação covalente entre a superfície e a dita enzima ou molécula heteróloga. Em uma modalidade, a enzima e/ou a molécula heteróloga são ligadas à superfície da partícula após um pré-tratamento químico da dita superfície da partícula.
[0079] Conforme mencionado acima, em um segundo aspecto, a invenção fornece uma composição farmacêutica que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz do nanomotor do primeiro aspecto e um excipiente e/ou carreador farmaceuticamente aceitável.
[0080] A expressão "quantidade terapeuticamente eficaz", conforme usado no presente documento, se refere à quantidade do nanomotor que, quando administrado, é suficiente para prevenir o desenvolvimento de, ou aliviar até certo ponto, um ou mais dos sintomas da doença ou distúrbio que é abordado. A dose particular do agente administrado de acordo com esta invenção será certamente determinada pelas circunstâncias particulares que envolvem o caso, incluindo o nanomotor administrado, a via de administração, a condição particular a ser tratada e as considerações semelhantes.
[0081] A expressão "composição farmacêutica" abrange ambas as composições destinadas a animais humanos e não humanos (isto é, composições veterinárias).
[0082] A expressão "transportadores ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis" se refere a materiais, composições ou carreadores farmaceuticamente aceitáveis. Cada componente deve ser farmaceuticamente aceitável no sentido de ser compatível com os outros ingredientes da composição farmacêutica. Também deve ser adequado para uso em contato com o tecido ou órgão de humanos e animais não humanos sem toxicidade excessiva, irritação, resposta alérgica, imunogenicidade ou outros problemas ou complicações proporcionais a uma relação risco/benefício razoável.
[0083] Exemplos de excipientes farmaceuticamente aceitáveis adequados são solventes, meios de dispersão, diluentes ou outros carreadores líquidos, auxiliares de dispersão ou suspensão, agentes tensoativos, agentes isotônicos, agentes espessantes ou emulsificantes, conservantes, aglutinantes sólidos, lubrificantes e semelhantes. Exceto na medida em que qualquer meio excipiente convencional seja incompatível com uma substância ou seus derivados, como ao produzir qualquer efeito biológico indesejável ou de outra forma interagir de forma deletéria com qualquer outro componente (ou componentes) da composição farmacêutica, seu uso é contemplado como estando dentro de âmbito desta invenção.
[0084] As quantidades relativas do nanomotor, os excipientes farmaceuticamente aceitáveis e/ou quaisquer ingredientes adicionais em uma composição farmacêutica da invenção irão variar, dependendo da identidade, tamanho e/ou condição do sujeito tratado e ainda dependendo da via por qual a composição deve ser administrada.
[0085] Excipientes farmaceuticamente aceitáveis usados na fabricação de composições farmacêuticas incluem, mas sem limitação, diluentes inertes, agentes dispersantes e/ou granulantes, agentes tensoativos e/ou emulsificantes, agentes desintegrantes, agentes de ligação, conservantes, agentes tamponantes, agentes lubrificantes e/ou óleos. Excipientes como agentes corantes, agentes de revestimento, agentes edulcorantes e aromatizantes podem estar presentes na composição, de acordo com o julgamento do formulador.
[0086] As composições farmacêuticas que contém o nanomotor da invenção podem ser apresentadas em qualquer forma de dosagem, por exemplo, sólida ou líquida, e podem ser administradas por qualquer via adequada, por exemplo, via oral, parenteral, retal, tópica, intranasal ou sublingual, para que incluirão os excipientes farmaceuticamente aceitáveis necessários para a formulação da forma de dosagem desejada, por exemplo, formulações tópicas (pomada, cremes, lipogel, hidrogel etc.), colírios, sprays de aerossol, soluções injetáveis, bombas osmóticas etc.
[0087] Os diluentes exemplares incluem, mas sem limitação, carbonato de cálcio, carbonato de sódio, fosfato de cálcio, fosfato dicálcico, sulfato de cálcio, hidrogenofosfato de cálcio, fosfato de sódio, lactose, sacarose, celulose, celulose microcristalina, caulim, manitol, sorbitol, inositol, cloreto de sódio, amido seco, amido de milho, açúcar em pó e combinações dos mesmos.
[0088] Agentes de granulação e/ou dispersão exemplares incluem, mas sem limitação, amido de batata, amido de milho, amido de tapioca, glicolato de amido de sódio, argilas, ácido algínico, goma guar, polpa cítrica, ágar, bentonita, celulose e produtos de madeira, esponja natural, resinas de troca catiônica, carbonato de cálcio, silicatos, carbonato de sódio, polivinilpirrolidona reticulada) (crospovidona), carboximetilamido de sódio (glicolato de amido sódico), carboximetilcelulose, carboximetilcelulose de sódio reticulada (croscarmelose), metilcelulose, amido pré-gelatinizado (amido 1500), amido microcristalino, amido insolúvel em água, carboximetilcelulose de cálcio, silicato de alumínio e magnésio (Veegum), sulfato de sódio de laurila, compostos de amônio quaternário e combinações dos mesmos.
[0089] Excipientes de ligação exemplificativos incluem, mas sem limitação, amido (por exemplo, amido de milho e pasta de amido); gelatina; açúcares (por exemplo, sacarose, glicose, dextrose, dextrina, melaço, lactose, lactitol, manitol); gomas naturais e sintéticas (por exemplo, acácia, alginato de sódio, extrato de musgo irlandês, goma panwar, goma ghatti, mucilagem de cascas de isapol, carboximetilcelulose, metilcelulose, etilcelulose, hidroxietilcelulose, hidroxipropilcelulose, hidroxipropilmetilcelulose, polivinilcelulose, acetato de celulose microcristalina, silicato de magnésio e alumínio (Veegum) e lariço arabogalactano); alginatos; óxido de polietileno; polietileno glicol; sais de cálcio inorgânicos; ácido silícico; polimetacrilatos; ceras; agua; álcool; e combinações dos mesmos.
[0090] Conservantes exemplares podem incluir antioxidantes, agentes quelantes, conservantes antimicrobianos, conservantes antifúngicos, conservantes de álcool, conservantes ácidos e outros conservantes. Antioxidantes exemplares incluem, mas sem limitação, alfa tocoferol, ácido ascórbico, palmitato de ascorbila, estearato de ascorbila, oleato de ascorbila, hidroxianisol butilado, hidroxitolueno butilado, monotioglicerol, metabissulfito de potássio, ácido propiônico, propil galato de sódio, ascorbito de sódio, metabissulfito de sódio, metabissulfito de sódio e sulfito de sódio. Os agentes quelantes exemplares incluem ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA), ácido cítrico mono-hidratado, edetato dissódico, edetato dipotássico, ácido edético, ácido fumárico, ácido málico, ácido fosfórico, edetato de sódio, ácido tartárico e edetato trissódico.
[0091] Os agentes tampão exemplares incluem, mas sem limitação, soluções tampão de citrato, soluções tampão de acetato, soluções tampão de fosfato, cloreto de amônio, carbonato de cálcio, cloreto de cálcio, citrato de cálcio, glubionato de cálcio, gluceptato de cálcio, gluconato de cálcio, ácido D-glucônico, cálcio glicerofosfato, lactato de cálcio, ácido propanoico, levulinato de cálcio, ácido pentanoico, fosfato de cálcio dibásico, ácido fosfórico, fosfato de cálcio tribásico, fosfato de hidróxido de cálcio, acetato de potássio, cloreto de potássio, gluconato de potássio, misturas de potássio, fosfato de potássio dibásico, fosfato de potássio monobásico, misturas de fosfato, acetato de sódio, bicarbonato de sódio, cloreto de sódio, citrato de sódio, lactato de sódio, fosfato de sódio dibásico, fosfato de sódio monobásico, misturas de fosfato de sódio, trometamina, hidróxido de magnésio, hidróxido de alumínio, ácido algínico, água apirogênica, solução salina isotônica, solução de Ringer, álcool etílico e combinações dos mesmos.
[0092] Os agentes lubrificantes exemplares incluem, mas sem limitação, estearato de magnésio, estearato de cálcio, ácido esteárico, sílica, talco, malte, butanato de glicerila, óleos vegetais hidrogenados, polietilenoglicol, benzoato de sódio, acetato de sódio, cloreto de sódio, leucina, sulfato de magnésio de laurila, sulfato de sódio de laurila e combinações dos mesmos.
[0093] Como mencionado antes, a invenção também fornece em um terceiro aspecto o nanomotor ou a composição farmacêutica da invenção para uso em terapia, diagnóstico ou prognóstico.
[0094] Os nanomotores propelidos por urease são capazes de se mover não apenas em meio líquido, como a urina, mas também em meio viscoso, como o ácido hialurônico. Além disso, também são ativos nas secreções mucosas. Portanto, os nanomotores da invenção podem ser usados em tecidos líquidos e viscosos, como no humor aquoso do olho.
[0095] Em uma modalidade particular do terceiro aspecto, opcionalmente em combinação com qualquer uma das modalidades fornecidas acima ou abaixo, o nanomotor do primeiro aspecto ou a composição farmacêutica do segundo aspecto é para uso no tratamento de câncer.
[0096] Essa modalidade também pode ser formulada como o uso do nanomotor do primeiro aspecto, ou a composição farmacêutica do segundo aspecto para a fabricação de um medicamento para o tratamento e/ou prevenção do câncer. Esse aspecto também pode ser formulado como um método para tratar e/ou prevenir câncer, o método que compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz do nanomotor do primeiro aspecto ou da composição farmacêutica do segundo aspecto, a um sujeito em necessidade.
[0097] Exemplos ilustrativos não limitativos de câncer que podem ser tratados com o nanomotor ou a composição farmacêutica da invenção incluem, embora não estejam limitados a, papilomas, adenomas, lipomas, osteomas, miomas, angiomas, nevos, teratomas maduros, carcinomas, sarcomas, teratomas imaturos, melanoma, mieloma, leucemia, linfoma de Hodgkin, basalioma, espinalioma, câncer de mama, câncer de ovário, câncer de útero, câncer de bexiga, câncer de pulmão, câncer brônquico, câncer de próstata, câncer de cólon, câncer de pâncreas, câncer de rim, câncer de esôfago, hepatocarcinoma, câncer de cabeça e pescoço etc. Em uma modalidade particular do terceiro aspecto, o câncer é câncer de bexiga. A partir dos dados fornecidos no presente documento, os versados na técnica entenderiam que os nanomotores e as composições farmacêuticas da invenção também podem ser úteis no tratamento de outras doenças, como doenças metabólicas, neurológicas e inflamatórias.
[0098] Como mencionado acima, em um quinto aspecto, a invenção fornece um método in vitro de detecção de um analito em uma amostra isolada, que compreende o contato do nanomotor conforme definido no primeiro aspecto com a amostra. Os versados na técnica entenderiam que os nanomotores da invenção podem ser adaptados para detectar diferentes analitos por meio de sua funcionalização com sensores dos referidos analitos.
[0099] Em uma modalidade particular do quinto aspecto, opcionalmente em combinação com qualquer uma das modalidades fornecidas acima ou abaixo, a amostra é uma amostra isolada biológica. Mais particularmente, a amostra biológica isolada é sangue, plasma ou soro.
[0100] Como mencionado acima, em um sexto aspecto, a invenção fornece o uso do nanomotor conforme definido no primeiro aspecto em um método in vitro para detectar um analito em uma amostra isolada.
[0101] Em uma modalidade particular do quinto ou sexto aspectos, opcionalmente em combinação com qualquer uma das modalidades fornecidas acima ou abaixo, a amostra é uma amostra líquida. Como mencionado antes, os nanomotores dos inventores são capazes de se mover em líquidos com vários graus de viscosidade. Por exemplo, podem se mover na urina, que tem uma viscosidade cinemática de: 1,07 mm²/s (1,0700 cSt) a 20 °C (medido por Inman et al., “The impact of temperature and urinary constituents on urine viscosity and its relevance to bladder hyperthermia treatment”, Int J Hyperthermia, 2013, vol. 29 (3), páginas 206 a 210), e ácido hialurônico na concentração encontrada nos fluidos sinoviais (1 mg/ml, cerca de 10-2 Pa*s para uma faixa de 1 a 10 Hz de taxa de cisalhamento, medida em um reômetro).
[0102] Os nanomotores da invenção são particularmente úteis para a detecção de uma ampla variedade de analitos, como poluentes ou biomarcadores,
[0103] Ao longo da descrição e reivindicações, a palavra "compreende" e variações da palavra, não se destinam a excluir outras características técnicas, aditivos, componentes ou etapas. Além disso, a palavra “compreender” abrange o caso de “consistir em”. Objetos, vantagens e características adicionais da invenção se tornarão evidentes para os especialistas na técnica após o exame da descrição ou podem ser aprendidos pela prática da invenção. Os seguintes exemplos e desenhos são fornecidos a título de ilustração e não se destinam a limitar a presente invenção. Os sinais de referência relacionados aos desenhos e colocados entre parênteses em uma reivindicação, são unicamente para tentar aumentar a inteligibilidade da reivindicação e não devem ser interpretados como limitando o escopo da reivindicação. Além disso, a presente invenção cobre todas as combinações possíveis de modalidades particulares e preferidas descritas no presente documento.
EXEMPLOS
1. VISANDO ESFEROIDES 3D DO CÂNCER DE BEXIGA
COM NANOMOTORES MOVIDOS A UREASE
1.1. MÉTODOS
MATERIAIS
[0104] Etanol (EtOH, 99%), metanol (MeOH, 99%), ácido clorídrico (37% em água), hidróxido de amônio (25% em água), tetraetilortossilicato (TEOS, 99%), trietanolamina (TEOA, 99%), brometo de cetiltrimetilamônio (CTAB, 99%), 3-aminopropiltrietoxissilano (APTES, 99%), glutaraldeído (GA, 25% em água), urease (de Canavalia ensiformis, Tipo IX, pó,
50.000 a 100.000 unidades/g de sólido), Kit de Ensaio de Atividade de Urease (Sigma-Aldrich), ureia (99,9%), glicerol (99%), pó de boro-hidreto de sódio (NaBH4, 98,0%), solução de formaldeído (37% em água), albumina de soro bovino (pó liofilizado), solução de 4-nitrofenol (10 mM), pureza de cloreto de sódio. (NaCI), cloreto de potássio anidro (KCI), fosfato de sódio monobásico (NaH2PO4), bicarbonato de sódio BioXtra (99,5-100,5%, NaHCO3), dimetilsulfóxido (DMSO, 99,9%) e HS-PEG5K-NH2 (Sal de HCI) foram adquiridos da Sigma-Aldrich. Pierce™. Kit de Matriz de Proteína BCA, aglutinina do germe de trigo (WGA AlexaFluor ™ 647 conjugado), IgG anti-rato de cabra (H+L) Alexa FluorTM 488 conjugado, 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio brometo (MTT) e solução salina de tampão fosfato (PBS) foram adquiridos da Thermo Fisher Scientific. A matriz de base Matrigel™ foi adquirida da Corning. O anticorpo anti-FGFR3 (ab89660) foi adquirido da Abcam. O Hoechst 33342 foi adquirido da Life Sciences. O tubo de diálise pré-tratado Spectra/Por® 7 Standard RC (3,5 kD) foi adquirido da Spectrum. O éster de cianina3 NHS foi adquirido da Lumiprobe. O meio 5A (modificado) de McCoy, solução de estreptomicina de penicilina, soro bovino fetal (FBS) e tripsina 0,5% EDTA foram adquiridos da Gibco. O kit de viabilidade/citotoxicidade LIVE/DEAD™ foi adquirido da Invitrogen. Células RT4 de papiloma de células transicionais da bexiga urinária humana foram obtidas na ATCC (Rockville, MA).
INSTRUMENTOS
[0105] Imagens de microscopia eletrônica de transmissão (TEM) foram capturadas usando um microscópio JEOL JEM-2100. Imagens de Microscopia Eletrônica de Varredura (SEM) foram capturadas usando um FEI NOVA NanoSEM 230 a 10 kV. As medidas dos raios hidrodinâmicos e da mobilidade eletroforética foram realizadas usando um Wyatt Möbius acoplado a um sistema de pressurização de células Atlas. A análise Brunauer-Emmett-Teller (BET) foi realizada em analisador automático Micromeritics Tristar II Plus. Vídeos ópticos, bem como imagens de cultura de células foram realizadas usando um microscópio óptico invertido (Leica DMi8) equipado com uma objetiva de água 63x, um estágio galvo e cubos de filtro para FITC, Rodamina, DAPI e CY5. A quantificação de proteínas e os ensaios de atividade enzimática foram realizados usando um leitor de microplacas multimodo Infinite M200 PRO. A análise de microscopia confocal foi realizada usando um LSM 800 - Zeiss equipado com uma objetiva de óleo 63x.
[0106] Síntese de nanopartículas de sílica mesoporosa (MSNPs): Os MSNPs foram preparados usando um método sol-gel. Resumidamente, uma solução que contém CTAB (570 mg), TEOA (35 g) e água (20 ml) foi aquecida a 95 °C em um banho de óleo de silício. Essa mistura foi agitada durante 30 minutos e subsequentemente TEOS (1,5 ml) foi adicionado gota a gota. A mistura foi posteriormente agitada a 95 °C, durante 2 horas. As partículas produzidas foram coletadas por centrifugação e lavadas com etanol (3 vezes, 1350 g, 10 minutos). Em seguida, as partículas foram suspensas em uma mistura de MeOH: HCI (30 ml, 10: 0,6) e refluxadas a 80 °C por 24 horas, para remoção do CTAB dos poros dos MSNPs. Finalmente, as partículas são coletadas por centrifugação e lavadas em etanol (3 vezes, 1350 g, 10 minutos), sonicando 20 minutos entre cada centrifugação. Alíquotas (0,5 ml) foram coletadas, centrifugadas e secas ao ar para determinar a concentração da suspensão de MSNPs.
[0107] Funcionalização de Amina de MSNPs (MSNP- NH2): Os MSNPs previamente sintetizados foram suspensos em EtOH (2 mg/ml). Em seguida, foi adicionado APTES à suspensão (10 μl/mg de MSNP) e agitada por 24 horas em temperatura ambiente, em agitador rotativo de ponta a ponta. Finalmente, as partículas foram coletadas por centrifugação e lavadas em etanol (3 vezes, 1350 g, 10 minutos) e em água (3 vezes, 1928 g, 10 minutos), sonicando 20 minutos entre cada centrifugação. Alíquotas (0,5 ml) foram coletadas, centrifugadas e secas ao ar para determinar a concentração da suspensão de MSNPs. Funcionalização de MSNP-NH2 com Urease e Heterobifuncional H2N-PEG-SH (MSNP-Ur/PEG): MSNP-NH2 foram centrifugados a 1340 g por 10 minutos, suspensos em 900 μl de PBS (2 mg/ml) e sonicado por 20 minutos. Em seguida, foram adicionados 100 μl de glutaraldeído e a mistura foi agitada em vórtex por 30 segundos para obter uma boa dispersão. A mistura foi colocada em um agitador rotativo de ponta a ponta durante 2,5 horas, à temperatura ambiente. As nanopartículas foram então coletadas e lavadas três vezes com PBS (1340 g, 10 minutos) e sonicadas por 20 minutos entre cada lavagem. Em seguida, as nanopartículas ativadas por GA foram suspensas em solução de PBS que contém urease (3 mg/ml) e H 2N-PEG- SH (1 μg/mg de MSNP-NH2). A mistura foi então colocada em um agitador rotativo de ponta a ponta durante a noite, à temperatura ambiente. Os nanomotores resultantes foram lavados três vezes com PBS por centrifugação (1340 g, 10 minutos), intercalando as lavagens com 3 minutos de sonicação.
[0108] Funcionalização de nanomotores de Urease PEGuilados com anticorpo anti-FGFR3 (MSNP-Ur/PEG-Ab): Os nanomotores foram suspensos em PBS (2 mg/ml) e anticorpo anti-FGFR3 (30 µg de anticorpo por mg de nanomotores) foi adicionado. A mistura foi então incubada durante a noite no agitador rotativo, à temperatura ambiente. Finalmente, os nanomotores modificados com anticorpos foram coletados por centrifugação (1340 g, 10 minutos) e lavados três vezes com PBS, intercalando as lavagens com 3 minutos de sonicação. Análise de raios hidrodinâmicos e carga superficial: Um Wyatt Mobius DLS, acoplado a um pressurizador ATLAS foi usado para caracterizar a distribuição de tamanho e carga superficial de MSNP, MSNP-NH2, MSNP- Ur/PEG e MSNP-Ur/PEG-Ab. O equipamento utiliza laser de comprimento de onda de 532 nm e ângulo detector de 163,5°. As amostras analisadas foram diluídas para uma concentração de 0,3 mg/ml e analisadas para espalhamento de luz e mobilidade eletroforética simultaneamente, com um tempo de aquisição de 5 segundos, realizando 3 execuções por medição. Um total de 9 medições foram realizadas para obter dados estatísticos relevantes.
[0109] Quantificação da quantidade de urease e de anticorpos no MSNP: A concentração de urease presente no MSNP-Ur/PEG foi medida usando o Kit de Matriz de Proteína BCA da Thermo Fisher Scientific, de acordo com as instruções do fabricante. Esse kit correlaciona a quantidade de proteínas com a redução do cobre por ligações peptídicas. O mesmo procedimento foi repetido para MSNP-Ur/PEG-Ab, para quantificar a quantidade de anticorpo ligado aos nanomotores.
[0110] Ensaio de atividade de urease: a atividade enzimática da urease enquanto ligada a MSNPs foi avaliada usando um kit comercial que determina a concentração de amônia gerada pelo método de Berthelot (Patton, C. J. et al., “Spectrophotometric and Kinetics Investigation of the Berthelot Reaction for the Determination of Ammonia”, Anal. Chem., 1977, vol. 49, páginas 464 a 469). Os nanomotores estavam na concentração de 0,5 mg/ml e o experimento foi realizado de acordo com as instruções do fabricante.
[0111] Rotulagem da Urease com Cy3: A urease (22 mg) foi dissolvida em 1 ml de tampão de bicarbonato de sódio (100 mM). Em seguida, 7 μl de uma solução Cy 3 em DMSO (5 mM) foram adicionados à solução de urease, e a mistura foi incubada por 4 horas, em temperatura ambiente e agitando no escuro. A solução de urease marcada foi então dialisada (membrana de poro de 3,5 kD) durante 24 horas para eliminar as moléculas Cy3 não reagidas.
[0112] Quantificação da Produção de Amônia por MSNP-Ur/PEG: A amônia produzida por nanomotores foi quantificada por meio de um método de titulação. Para isso, os nanomotores foram incubados com diferentes concentrações de ureia (12,5, 25, 50, 100, 200 e 300 mM) e as amostras foram analisadas em diferentes momentos (5, 15, 60, 120, 240 minutos e 24 horas). Em cada momento, as suspensões dos nanomotores foram centrifugadas e o sobrenadante foi titulado com HCl (10 mM), utilizando p- nitrofenol como indicador.
[0113] Gravação ótica de vídeo de nanomotores e análise de MSD: Um microscópio invertido equipado com uma objetiva de água de 63x foi usado para observar e gravar vídeos do movimento dos nanomotores. Amostras de soluções aquosas de urina simulada que contém nanomotores foram colocadas em uma lâmina de vidro e bem misturadas com urina simulada em uma faixa de concentrações de ureia (12,5, 25, 50, 100, 200 e 300 mM). As amostras foram então cobertas com uma lâmina de vidro para evitar artefatos causados por deriva e vídeos de 30 segundos foram gravados. Os vídeos foram adquiridos com uma câmera Hamamatsu, a uma taxa de quadros de 50 fps, em campo claro. Pelo menos 20 nanomotores são analisados por condição. Os vídeos foram analisados usando um código com base em phyton para obter as trajetórias dos nanomotores e calcular o deslocamento quadrático médio (MSD) a seguir: MSD (∆t) = 〈(x_i (t + ∆t) − x_i (t))^2 〉, i = 2, para análise 2D
[0114] Em seguida, o coeficiente de difusão (D e) foi obtido pelo ajuste dos dados MSD à equação 2, que é válida em intervalos curtos de tempo para partículas pequenas, com baixa difusão rotacional. Cultura de células 3D: células de papiloma de células transicionais da bexiga urinária humana RT4 foram cultivadas em meio 5A (modificado) de McCoy, suplementado com FBS (10%) e solução de penicilina-estreptomicina (1%), em uma atmosfera de 37 °C e 5% de CO2. As células foram divididas a cada 4 dias na razão de 1:2. Para obter culturas de células 3D RT4, placas de ibidi de 8 poços foram pré-revestidas com 23 μl de Matrigel™ (5 mg/ml) e incubadas a 37 °C por 30 minutos, permitindo a formação do gel. Em seguida, 30 μl de uma suspensão de células RT4 a uma densidade de 5x10 6 células/ml foram espalhados uniformemente em cada poço e as placas foram incubadas por 30 minutos a 37 °C. Finalmente, 150 μl de meio RT4 McCoy que contém 10% de Matrigel™ foram adicionados. As culturas foram cultivadas por 7 dias antes dos experimentos, trocando o meio a cada 2 dias.
[0115] Imunocoloração da Proteína Transmembrana FGFR3 em Culturas de Células 3D RT4: as culturas 3D descritas acima foram lavadas 3 vezes com PBS 1x. Em seguida, a superfície dos poços foi riscada suavemente com uma ponta de pipeta e a cultura foi suspensa em meio de McCoy em um tubo. Os tubos foram girados brevemente e o sobrenadante foi removido. Em seguida, as células foram suspensas em formaldeído (3,7%), colocadas em placa de 8 poços e incubadas por 15 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, a cultura foi lavada com PBS 1x, uma solução de PBS- BSA (5%) foi adicionada e a placa foi incubada por 40 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, o anti-FGFR3 foi adicionado à cultura em uma proporção de 1:50, e o prato foi incubado durante 24 horas, a 37 °C, em uma atmosfera de 5% de CO2. Depois disso, a cultura foi lavada 3 vezes com PBS 1x, o anticorpo secundário (marcado com AlexaFluor 488) foi adicionado na proporção de 1:500 e a placa foi incubada por 40 minutos, em temperatura ambiente no escuro. Finalmente, a cultura foi lavada 3 vezes com PBS 1x, os núcleos foram marcados com Hoescht e foi adicionada uma solução de glicerol em PBS (70%). A cultura foi observada usando microscopia confocal.
[0116] Ensaios de citotoxicidade: A viabilidade de culturas RT4 3D foi quantificada usando o ensaio Alamar Blue e visualizada usando o kit de viabilidade LIVE/DEAD seguindo as instruções do fabricante. Para isso, as células RT4 foram cultivadas como mencionado acima e no dia 7 foram incubadas com cada tratamento - Amônia (1 mM, 1,5 mM, 3 mM, 5 mM, 10 mM e 20 mM, por 24 horas), Ureia (25 mM, 30 mM, 40 mM e 50 mM, por 24 horas), MSNP-Ur/PEG (12,5 μg/ml, em uma faixa de concentrações de ureia - 25 mM, 30 mM, 40 mM e 50 mM, para 1, 2 e 4 horas). Em seguida, as culturas foram lavadas com meio, mantidas em repouso por 24 horas e investigada a viabilidade de acordo com as instruções do fabricante.
[0117] Além disso, a viabilidade também foi avaliada no ponto de tempo de 48 horas.
[0118] Imagem de culturas e nanomotores RT4 3D: No dia 7, as culturas de células 3D foram incubadas com cada tratamento (MSNP-Ur/PEG ou MSNP-Ur/PEG-Ab, 12,5 μg/ml) por 4 horas. Em cada ponto de tempo, as culturas foram lavadas e mantidas em uma atmosfera de 37 °C e 5% de CO2 por 24 horas. Em seguida, as culturas foram marcadas como WGA 647 (membranas) e fotografadas usando um microscópio de fluorescência invertido equipado com uma objetiva 63x e um estágio galvo, bem como cubos de filtro para Rodamina, FITC, DAPI e Cy5.
1.2. RESULTADOS E DISCUSSÃO
[0119] Nanopartículas de sílica totalmente mesoporosas (MSNPs) foram preparadas usando química sol-gel, em que brometo de cetiltrimetilamônio (CTAB) foi usado como agente porogênico e trietanolamina (TEOA) foi usada como catalisador básico. Os MSNPs preparados foram caracterizados por microscopia eletrônica de varredura (MEV). A análise SEM revelou boa monodispersidade da amostra (índice de polidispersidade = 0,114) e um diâmetro médio de 481 ± 2 nm (N = 150, tamanho médio ± erro padrão da média (SE)). Além disso, a estrutura porosa dos MSNPs foi avaliada por microscopia eletrônica de transmissão. Uma porosidade radial clara foi evidenciada pelo TEM. Essa configuração cristalina foi posteriormente confirmada pela Transformada Rápida de Fourier, que indicava a periodicidade do padrão poroso. A área de superfície das nanopartículas foi estudada por adsorção/dessorção de nitrogênio, com uso do método de análise Brunauer- Emmett-Teller (BET). Os MSNPs mostraram uma isoterma do tipo IV, típica de estruturas de sílica mesoporosa, e uma área superficial específica BET de 1184,8 m2/g, com um tamanho médio de poro de 2 nm.
[0120] As partículas produzidas foram então funcionalizadas com grupos amina usando aminopropiltrietoxissilano (APTES). Os grupos amina na superfície do MSNP são posteriormente ativados com glutaraldeído (GA), que atua como um ligante entre a partícula e a urease e moléculas de polietilenoglicol heterobifuncional (PEG) (Figura 1A). O grupo tiol terminal de PEG permite o acoplamento da porção de direcionamento, fator de crescimento anti-fibroblasto 3 (anti-FGFR3).
[0121] As etapas de funcionalização foram seguidas de espalhamento dinâmico de luz (DLS) e análise de mobilidade eletroforética para obtenção dos raios hidrodinâmicos e da carga superficial, respectivamente. A análise DLS dos MSNPs sintetizados mostrou um pico largo sugerindo a presença de agregados na suspensão. A análise da mobilidade eletroforética de MSNPs indicou uma carga superficial de -26,81 ± 0,35 mV (N = 9, média ± SE), típica para nanopartículas de sílica. O sucesso da funcionalização com aminas foi evidenciado pela pronunciada mudança na carga superficial para um valor fortemente positivo (33,6 ± 1,0 mM, N = 9, média ± SE), característica da presença de grupos amina livres na superfície. Os raios hidrodinâmicos de MSNPs funcionalizados com amina (MSNP-NH2) indicaram um pico mais agudo que pode ser devido a uma estabilização das partículas por carga superficial e química da superfície.
[0122] A etapa de funcionalização subsequente diz respeito ao acoplamento da enzima urease e do PEG heterobifuncional. Normalmente, o PEG é usado como um espaçador ou como um meio de prevenir a agregação em suspensão, fornecendo impedimento estérico entre as partículas. Confirmamos este efeito na estabilidade coloidal de MSNP-Ur/PEG por análise DLS, em que um pico único de população foi observado. Além disso, as moléculas de PEG permitiram a conjugação dos anticorpos às nanopartículas, ligando o grupo tiol livre na extremidade externa do PEG aos resíduos de cisteína dos anticorpos. Essa abordagem fornece mais especificidade na ligação de anticorpos IgG, devido ao alto teor de resíduos de cisteína presentes na região constante da cadeia pesada (Figura 1 A). A conjugação de MSNP-Ur/PEG com anticorpo anti-FGFR3 (MSNP-Ur/PEG-Ab) também foi analisada por DLS, e o pico único observado mostrou que a presença do anticorpo não afetou a estabilidade das partículas em solução. Confirmamos a presença da urease, bem como do anticorpo na superfície dos MSNPs, por meio de um kit que quantifica proteínas a partir da redução do cobre por ligações peptídicas de proteínas e avaliamos a atividade enzimática da urease ligada aos nanomotores.
[0123] A urease presente na superfície do MSNP- Ur/PEG e MSNP-Ur/PEG-Ab permite a conversão biocatalítica da ureia em amônia e dióxido de carbono, seguindo a equação: (NH2)2CO + H2O → CO2 + 2 NH3
[0124] Normalmente, uma assimetria geométrica é induzida nas micro/nanoestruturas (por exemplo, partículas de Janus) para alcançar uma geração assimétrica de forças, que é um requisito importante para produzir movimento em baixo número de Reynolds. No entanto, recentemente, foi relatado que para os motores impulsionados por conversão biocatalítica, uma distribuição desequilibrada molecular de enzimas é suficiente para a geração da assimetria necessária para gerar movimento líquido. No entanto, esse estudo anterior foi relatado para motores de tamanho mícron. Os nanomotores MSNP- Ur/PEG e MSNP-Ur/PEG-Ab relatados neste trabalho contam com tais assimetrias inerentes para a autopropulsão em motores nanoescala. Os perfis de movimento de MSNP-Ur/PEG e MSNP-Ur/PEG-Ab foram avaliados na presença de uma gama de concentrações de ureia (0 mM, 12,5 mM, 25 mM, 50 mM, 100 mM, 200 mM e 300 mM), na urina simulada. Foi utilizada a técnica de rastreamento óptico para obter as trajetórias rastreadas dos nanomotores (Figura 2A e B), que foram então utilizadas para calcular o deslocamento quadrático médio (MSD). A Figura 2C exibe o MSD típico de nanomotores de urease/PEG e nanomotores modificados por anticorpos em urina simulada. Observamos que o MSD aumenta linearmente com o tempo, o que é característico do movimento difusivo, e obtivemos o coeficiente de difusão efetivo para cada condição dada ajustando os MSDs à seguinte equação: MSD (∆t) = 4 De ∆t,
[0125] em que De representa o coeficiente de difusão efetivo e ∆t representa o intervalo de tempo.
[0126] A Figura 2D mostra os coeficientes de difusão efetivos calculados para MSNP-Ur/PEG e MSNP-Ur/PEG-Ab, evidenciando que um aumento significativo na difusão foi alcançado na concentração de ureia 50 mM (p < 0,001). O coeficiente de difusão aumentou ainda mais com o aumento das concentrações de ureia na urina simulada, atingindo um platô. O aumento da difusão em relação ao aumento das concentrações de ureia pode estar relacionado com a cinética da enzima urease de Michaelis-Menten, que obedece à seguinte equação:
[0127] em que Vmáx representa a taxa de reação máxima, S representa a concentração de substrato e Km representa a constante de Michaelis-Menten. Conforme exibido na Figura 2D, nenhuma diferença significativa foi encontrada entre os perfis de movimento de MSNP-Ur/PEG e MSNP-Ur/PEG-Ab, indicando que a presença dessa porção de direcionamento não impede as habilidades de movimento dos nanomotores.
[0128] Estudamos a biocompatibilidade in vitro do substrato necessário para o movimento dos nanomotores (ureia) e o subproduto da biocatálise (amônia) usando culturas 3D (esferoides) de células RT4 do papiloma de células transicionais da bexiga urinária humana. Os esferoides foram obtidos semeando células RT4 em placas revestidas com Matrigel™ que se assemelha à matriz extracelular e fornece um ambiente 3D para o crescimento celular. Em seguida, as culturas puderam proliferar por 7 dias e o crescimento do esferoide foi monitorado todos os dias. Foi então investigado o efeito de uma faixa de concentrações de ureia (0 mM, 25 mM, 50 mM e 100 mM) e amônia (0 mM, 20 mM, 30 mM, 40 mM e 50 mM), incubando os esferoides por 24 horas em cada condição. Em seguida, as culturas foram lavadas com meio e a viabilidade celular e a proliferação avaliada pelo ensaio Alamar Blue. Esse ensaio é baseado na redução da resazurina no composto fluorescente resorufina por células metabolicamente ativas.
[0129] A ureia exibiu boa biocompatibilidade, não afetando a viabilidade do esferoide mesmo na concentração mais alta que estudamos, enquanto a amônia revelou uma tendência citotóxica aumentada com o aumento das concentrações. No entanto, os esferoides permaneceram viáveis (> 70% de viabilidade) em todas as concentrações de amônia testadas.
[0130] Foi investigada ainda a viabilidade dos esferoides quando expostos aos nanomotores (MSNP-Ur/PEG), sob uma faixa de concentrações de ureia e em diferentes períodos de incubação. Os esferoides foram incubados com 12,5 μg/ml de nanomotores nus ou nanomotores modificados com anticorpos a 0 mM, 25 mM, 30 mM e 40 mM de ureia, por 1,2 e 4 horas. Em seguida, as culturas foram minuciosamente lavadas com meio para remover nanomotores e ureia não catalisada e mantidas por 24 horas antes da análise. O efeito dos nanomotores na viabilidade dos esferoides do câncer de bexiga foi visualizado usando o kit de viabilidade LIVE/DEAD® e quantificado usando o ensaio Alamar Blue (Figura 3). Observou-se que os nanomotores não eram tóxicos na ausência de ureia, o que indica a boa biocompatibilidade do chassi dos nanomotores (sílica mesoporosa, tipo MCM-41), bem como do PEG e da enzima. Na presença de concentrações crescentes de ureia, um efeito citotóxico é denotado para ambos os nanomotores, sendo mais pronunciado nos nanomotores modificados com anticorpos (Figura 3). A toxicidade observada para os nanomotores nus se deve à produção de amônia originada da conversão biocatalítica da ureia. Porém, o maior efeito citotóxico verificado para os nanomotores que carregam o anticorpo pode surgir da interação entre o anti- FGFR3 e o antígeno presente nas membranas dos esferoides. Foi relatado que a interação entre essas porções bloqueia a via de sinalização de FGF, que está envolvida no crescimento e proliferação celular.
[0131] Para melhor compreender a contribuição da amônia para o efeito citotóxico observado nos esferoides, foi estudada a concentração efetiva de amônia produzida pelos nanomotores por períodos definidos em diferentes concentrações de ureia. 12,5 μg/ml de nanomotores foram incubados com uma gama de concentrações de ureia (0 mM, 12,5 mM, 25 mM, 50 mM, 100 mM, 200 mM e 300 mM) e usado p-nitrofenol como um indicador de pH. Como a conversão da ureia em amônia e dióxido de carbono pelos nanomotores gera um aumento acentuado do pH, a solução que contém os nanomotores torna-se amarela devido à presença do p-nitrofenol e pode ser titulada com HCI para quantificar a quantidade de amônia presente, de acordo com a seguinte equação: NH3 + HCI → NH4CI
[0132] Verificou-se que nessa concentração de nanomotores, a saída máxima de amônia alcançada foi de 17 mM, que foi considerada biocompatível com esferoides de câncer de bexiga (> 70% de viabilidade para amônia 20 mM). No entanto, na incubação com nanomotores e ureia, o efeito citotóxico observado é mais forte do que com amônia livre. Esse resultado pode surgir da produção de uma concentração localmente maior de amônia pelos nanomotores nas proximidades dos esferoides, levando a uma maior citotoxicidade.
[0133] Levando em consideração as capacidades aprimoradas de difusão e biocompatibilidade dos nanomotores, foi investigado posteriormente seu potencial para atingir e penetrar em esferoides do câncer de bexiga (Figura 4). Primeiramente, foi verificada a expressão do antígeno-alvo (FGFR3) na superfície dos esferoides do câncer de bexiga por imunocitoquímica, técnica utilizada para detectar visualmente a localização de proteínas específicas em uma amostra por meio de anticorpos marcados com fluorescência. Uma imunocitoquímica de um esferoide de câncer de bexiga mostrou fluorescência verde nas membranas celulares, confirmando a presença da proteína transmembrana FGFR3, e o azul representa os núcleos celulares marcados com Hoechst.
[0134] Em seguida, foi investigada a capacidade dos nanomotores de penetrar nos esferoides do câncer de bexiga e o efeito da presença da porção de direcionamento na eficiência de internalização. Além disso, foi avaliada a influência do movimento ativo na eficiência de internalização, incubando os esferoides com nanomotores nus ou nanomotores modificados com anticorpos na presença de ureia 40 mM. Para isso, a urease foi marcada com o marcador fluorescente Cianina3 (Cy3) antes de sua funcionalização no MSNP-NH2, para localização precisa dos nanomotores por meio de microscopia de fluorescência. Em seguida, os nanomotores foram funcionalizados com urease pura e urease marcada (5%) e verificados que as capacidades de movimento foram mantidas apesar da presença da enzima marcada. Em seguida, as culturas 3D foram incubadas com 12,5 μg/ml de MSNP-Ur/PEG-Ab, ou MSNP-Ur/PEG como controle negativo para direcionamento, por 4 horas, na ausência e presença de ureia (40 mM). Em seguida, as culturas foram lavadas, as membranas celulares foram marcadas com aglutinina de gérmen de trigo (WGA). A quantificação da intensidade de fluorescência do Cy3 dentro dos esferoides (50-100 pm de diâmetro) revelou que os motores ativos apresentam uma eficiência de internalização três vezes maior do que na ausência de ureia, o que pode ser devido à força propulsora gerada pelo movimento ativo. Além disso, na presença de ureia, os nanomotores modificados com anticorpo apresentam eficiência de internalização quatro vezes maior do que os nanomotores sem anticorpo (Figura 4). Isso pode ocorrer porque, quando um nanomotor está se movendo ativamente, a probabilidade de o anticorpo interagir com o antígeno alvo é maior do que quando apenas a difusão browniana está ocorrendo. Em nosso caso, uma propulsão nanomotora a 40 mM de ureia cobre 53% mais área em um segundo do que um nanomotor meramente experimentando difusão browniana, como evidenciado pelos MSDs, o que aumenta as chances de o anticorpo entrar em contato com o antígeno e penetrar no esferoide.
[0135] Considerando que o anticorpo usado bloqueia a via de sinalização do FGF das células quando ligado ao antígeno, foi investigado o potencial efeito terapêutico dos nanomotores modificados com anticorpos, analisando a proliferação celular (inserção da Figura 4). Para isso, os esferoides do câncer de bexiga foram incubados com MSNP-Ur/PEG-Ab por 4 horas, com e sem ureia, utilizando nanomotores sem anticorpo como controle. Em seguida, os esferoides foram lavados para remoção de ureia não catalisada e nanomotores não internalizados, e a proliferação foi medida após um período de repouso de 48 horas com o ensaio Alamar Blue. Observou-se que os esferoides incubados com nanomotores nus (sem anticorpo) mantiveram os níveis de viabilidade observados em 24 horas, enquanto os esferoides incubados com nanomotores modificados com anticorpos diminuíram a viabilidade, indicando que a proliferação celular foi interrompida. Esses resultados apontam para a aplicabilidade de nanomotores que transportam o anticorpo anti-FGFR3 como ferramentas para terapia direcionada ao câncer de bexiga.
1.3. CONCLUSÕES
[0136] Nanomotores alimentados por urease que compreende PEG, em que o PEG atua tanto como um impedimento estérico para evitar a agregação e um ligante para conectar um anticorpo específico do câncer de bexiga na superfície dos nanomotores (anti-FGFR3) foram desenvolvidos. Os nanomotores, com e sem anticorpo, apresentam difusão aprimorada na urina simulada em uma faixa de concentrações de ureia encontrada na bexiga, o que pode possibilitar seu uso em aplicações biomédicas nesse órgão. Foi demonstrada a toxicidade induzida dependente de substrato desses nanomotores enzimáticos usando esferoides derivados de células de câncer de bexiga humana (culturas 3D), que são consideradas como melhor imitar os ambientes tumorais quando comparadas às culturas 2D convencionais. O fenômeno de internalização foi monitorado em um período de tempo semelhante aos intervalos de esvaziamento da bexiga e observou que o movimento ativo aumenta a penetração dos nanomotores em 3 vezes. Além disso, os nanomotores modificados com anticorpos ativos exibiram eficiência de internalização 4 vezes maior do que os nanomotores ativos sem o anticorpo, refletindo a influência da autopropulsão e direcionamento na capacidade das partículas ativas de penetrar nos esferoides. Estudos de proliferação celular em esferoides indicaram que os nanomotores direcionados induzem maior perda de viabilidade do que os nanomotores nus (sem anticorpos), indicando o efeito terapêutico do anti-FGFR3 que pode surgir tanto da supressão da proliferação celular quanto das taxas de internalização nanomotora mais altas. Esses resultados apontam para os potenciais de tais nanomotores modificados com anticorpos como ferramentas na terapia direcionada do câncer de bexiga, uma vez que as capacidades de direcionamento das partículas são aumentadas com o movimento ativo, resultando na melhoria do efeito terapêutico do anticorpo anti- FGFR3.
2. MICROMOTORES ACIONADOS POR ENZIMAS
MODIFICADOS COM NANOINTERRUPTORES DE DNA PARA MONITORAMENTO LOCAL DE PH
2.1. MATERIAIS E MÉTODOS
PRODUTOS QUÍMICOS
[0137] Os oligonucleotídeos de DNA não modificados e marcados com fluoróforo foram sintetizados e purificados (purificação por HPLC) por IBA GmBH (Göttingen, Alemanha) e usados sem purificação adicional. As sequências das construções de DNA são relatadas abaixo.
SEQUÊNCIAS DE DNA NANOINTERRUPTOR DE DNA RESPONSIVO AO PH
[0138] 5’-TCCTTGTCTGTCTGTCTGTC TTTTTT GAAGAAGGAA TTT (Cy3) A TTCCTTCTTC GTTTG CTTCTTCCTT (Cy5) - 3’ ARMAÇÃO DE DNA AMINO-MODIFICADA
[0139] 5’-GACAGACAGACAGACAAGGA - NH2 - 3’
INTERRUPTOR DE CONTROLE
[0140] 5’-TCC TTG TCTGTC TGT CTG TC T(Cy3) GAACG TTTTT CGTTC (Cy5) Nome SEQ ID Sequência
TCCTTGTCTGTCTGTCTGTCTTTTTTG nanointerruptor SEQ ID NO: 1 AAGAAGGAATT
TATTCCTTCTTCGTTTGCTTCTTCCTT armação SEQ ID NO: 2 GACAGACAGACAGACAAGGA - NH2 Interruptor de TCCTTGTCTGTCTGTCTGTCTGAACGT SEQ ID NO: 3 Controle TTTTCGTTC
[0141] Para todas as sequências acima, as bases em negrito representam o laço para a porção duplex e as bases sublinhadas representam o laço para a região triplex paralela. Tanto o nanointerruptor de DNA responsivo ao pH quanto o interruptor de controle têm uma parte (aqui em itálico) que é totalmente complementar (20 bases) à armação de DNA modificado com amino.
CONDIÇÕES DE TAMPÃO
[0142] Todos os oligômeros de DNA foram armazenados (100 μΜ) em 1x PBS.
MEDIÇÕES DE FLUORESCÊNCIA
[0143] As medições de fluorescência foram realizadas em um fluorímetro Cary Eclipse (Varian), definindo o comprimento de onda de excitação para λex = 530 nm (fendaex = 5 nm) e aquisição entre 540 e 700 nm (fendaem = 5 nm) usando cubetas de quartzo de volume reduzido (100 μl). Todas as medições foram realizadas a T = 25 °C em HEPES 10 mM. Os interruptores foram primeiro diluídos em HEPES 10 mM na concentração de 1 μΜ. Esta solução estoque foi então diluída para 20 nM no mesmo tampão cujo pH foi ajustado para o valor desejado (pH entre 5,0 a 9,0).
ANÁLISE DE DADOS DE FLUORESCÊNCIA
[0144] O FRET ratiométrico foi calculado da seguinte forma: 𝐹𝐶𝑦5 𝑹𝒂𝒕. 𝑭𝑹𝑬𝑻 = 𝐹𝐶𝑦3 + 𝐹𝐶𝑦5
[0145] Em que FCy5 é a emissão de fluorescência máxima de Cy5 (λem = 670 nm) e FCy3 é a emissão de fluorescência máxima de Cy3 (λem = 570 nm). As curvas de titulação de pH foram obtidas plotando Rat. FRET vs concentração de íons hidrônio e ajustando os dados com a seguinte equação do tipo Langmuir: FRETE [𝐻 + ] ∗ (𝑅𝑎𝑡. 𝐹𝑅𝐸𝑇𝑇𝑅𝐼𝑃𝐿𝐸𝑋 − 𝑅𝑎𝑡. 𝐹𝑅𝐸𝑇𝐷𝑈𝑃𝐿𝐸𝑋 ) 𝑅𝑎𝑡. 𝐹𝑅𝐸𝑇_𝑇𝑅𝐼𝑃𝐿𝐸𝑋 [𝐻 + ] ∗ 𝐾𝐴𝑎𝑝𝑙𝑖𝑐𝑎çã𝑜 RATIOMÉTRICO =
[0146] Em que Rat.FRETTRIPLEX e Rat.FRETDUPLEX representam o sinal FRET do interruptor no estado triplex (fechado) e estado duplex (aberta), respectivamente, e em que [H+] representa a concentração total de ions de hidrogênio e KAalicação é a constante de ácido observada para o interruptor.
FABRICAÇÃO DE MICROCÁPSULAS
[0147] Partículas comerciais de 2 μm com base em poliestireno (PS) (Sigma-Aldrich cat. nº 78452) foram usadas em um invólucro de dióxido de silício por um método de cocondensação relatado anteriormente (Ref. Ma Xing ACS Nano 2016). Resumidamente, 250 μl de partículas de poliestireno (solução estoque, 10% de sólidos) foram misturados com 0,5 ml de etanol 99% (Panreac Applichem nº cat. 131086-1214), 0,4 ml de água Milli-Q e 25 ul de hidróxido de amônio (Sigma-Aldrich cat. nº 221228). A mistura foi agitada à temperatura ambiente (TA) durante 5 min. Em seguida, 2,5 µl de 3- aminopropiltrietoxissilano (APTES) 99% (Sigma-Aldrich cat. nº 440140) foram adicionados à solução, a qual foi incubada por 6 h, sob agitação e à temperatura ambiente. Em seguida, 7,5 μl de tetraetilortossilicato (TEOS) ≥ 99% (Sigma- Aldrich cat. nº 86578) foram adicionados e a mistura resultante foi deixada reagir durante a noite à temperatura ambiente sob agitação magnética. As micropartículas resultantes consistindo em poliestireno revestido com uma concha de dióxido de silício foram lavadas em etanol três vezes, por centrifugação a 3.500 rpm durante 3,5 min. Em seguida, o núcleo de poliestireno foi removido incubando as partículas realizando 4 lavagens em dimetilformamida (DMF) ≥ 99,8% (Acros Organics cat. nº 423640010) durante 15 min. As microcápsulas resultantes foram lavadas três vezes em etanol e armazenadas à temperatura ambiente até ao seu uso. Para caracterizar o tamanho e a morfologia das microcápsulas, foram realizadas Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) (FEI NOVA NanoSEM 230) e Microscopia Eletrônica de Transmissão.
FUNCIONALIZAÇÃO DE NANOINTERRUPTOR DE UREASE E DNA
[0148] Microcápsulas ocas de sílica foram funcionalizadas com urease para fornecer autopropulsão. Para isso, microcápsulas de SiO2 foram lavadas três vezes com Milli-Q por centrifugação a 3500 rpm por 3,5 min. Depois disso, foram realizadas mais três lavagens em solução salina tamponada com fosfato (PBS, pH = 7,4) (Thermo Fischer Scientific cat. Nº 70011-036). As microcápsulas foram então suspensas em uma solução de glutaraldeído a 2,5% (peso) em PBS (Sigma-Aldrich cat. No. G6257) e deixadas em temperatura ambiente por 3 h sob mistura de ponta a ponta. As partículas funcionalizadas com GA foram lavadas 3 vezes em PBS 1x e suspensas em uma solução que contém 200 μg/ml de urease de Canavalia ensiformis (Jack bean) (Sigma-Aldrich cat. No. U4002), e 1 μΜ de armação de DNA, em PBS. A solução resultante foi mantida sob mistura de ponta a ponta durante 2 h. Em seguida, três lavagens foram realizadas em PBS e as partículas funcionalizadas foram mantidas a 4 °C até o seu uso.
ANÁLISE DE MOVIMENTO
[0149] Micromotores foram gravados por 20 s a uma taxa de 25 quadros por segundo em um microscópio óptico invertido (Leica DMi8) equipado com uma objetiva de imersão em água 63x e uma câmera hammamatsu. Para cada condição, pelo menos 15 partículas foram registradas. As trajetórias dos micromotores foram analisadas por um código com base em Phyton customizado, que permitiu calcular o MSD e a velocidade dos motores, aplicando-se a seguinte equação: MSD(∆t) =< (xi(t + ∆t) - xi(t))2 > (1)
[0150] Ajustando-se o MSD à equação 1, a velocidade foi obtida.
MEDIÇÃO DE ATIVIDADE UREASE
[0151] A atividade enzimática foi medida por meio de Kit de atividade de Urease (Sigma-Aldrich), que é baseado no método de Barthelot, um ensaio colorimétrico para medir a produção de amônia pela atividade da urease, seguindo as instruções do fabricante. Primeiro, os micromotores foram incubados com ureia 100 mM. Em seguida, em diferentes momentos, a reação enzimática foi interrompida de acordo com as instruções do fabricante. Posteriormente, para evitar a interferência das partículas nas medições, as amostras foram centrifugadas por 3,5 min a 3.500 rpm. Os sobrenadantes de cada amostra foram coletados e a absorbância foi medida a 670 nm para determinar a atividade da urease.
2.2. RESULTADOS E DISCUSSÃO
[0152] As microcápsulas de sílica oca com grupos amina na superfície foram sintetizadas de acordo com um método de cocondensação relatado anteriormente (Ma, X. et al., “Motion Control of Urea- Powered Biocompatible Hollow Microcapsules”, ACS Nano, 2016, vol. 10(3), páginas 3.597 a 3.605), com base no crescimento de uma casca de SiO2 em micropartículas de poliestireno comercial de 2 µm Ø usando 3- aminopropiltrietoxissilano (APTES) e tetraetilortossilicato (TEOS) como precursores de sílica, seguido pela remoção do núcleo de poliestireno por dimetilformamida, conforme representado na Figura 5A.
[0153] A urease foi conjugada covalentemente à superfície do micromotor usando Glutaraldeído (GA) como um ligante, conforme descrito no Exemplo 1. Durante essa etapa, um DNA de fita simples modificado com amino (DNAss, 20 bases) também foi conjugado, que serviu como a porção de ancoragem para o nanointerruptor de DNA responsivo ao pH (Figura 5B). A Figura 5C mostra uma representação esquemática da estratégia de detecção de pH com base nos estados aberto/fechado do nanointerruptor de DNA, que causa baixa ou alta eficiência de FRET, respectivamente. As microcápsulas ocas resultantes foram estudadas por microscopia eletrônica de varredura e transmissão (SEM e TEM, respectivamente). A Figura 5D mostra uma micrografia SEM em que microcápsulas com um tamanho muito monodisperso (2,04 ± 0,06 µm, média ± erro padrão da média) e uma superfície rugosa podem ser observados. As microcápsulas apresentam um orifício em sua superfície, provavelmente devido à proximidade das partículas durante o crescimento da casca de sílica, conforme relatado anteriormente, o que proporciona uma assimetria estrutural. A Figura 5E mostra uma imagem topográfica obtida por TEM, em que as diferentes pseudocores indicam a altura, em µm.
[0154] O processo de funcionalização foi caracterizado pela medição do potencial ζ das micropartículas após cada etapa (Figura 5F). Primeiro, as microcápsulas exibiram uma superfície carregada positivamente devido à presença de grupos amina, que foi então alterada para carregada negativamente devido à modificação com GA. Após a adição de urease, as cargas superficiais foram ligeiramente reduzidas. A funcionalização com urease e DNAss (UR + DNAss) também resultou em uma diminuição do potencial ζ em relação ao GA.
[0155] Finalmente, as micropartículas foram incubadas em solução salina tamponada com fosfato (PBS) que contém o nanointerruptor de DNA (isto é, 1 μM). Uma incubação de 15 minutos do nanointerruptor com os motores conjugados enzima/fita de ancoragem foi suficiente para funcionalizar as partículas de sílica com o nanointerruptor responsivo ao pH. Digno de nota, o interruptor apresenta uma cauda de flanco longa de 20 bases na extremidade 5’ da sequência complementar com DNAss covalentemente conjugado na microcápsula de sílica. Como resultado da conjugação, uma redução adicional das cargas superficiais foi medida e confirma a funcionalização efetiva do motor com o interruptor. É também digno de nota que o nanointerruptor de DNA responsivo ao pH aqui empregado é um DNA de fita simples formador de triplex que contém um grampo de DNA intramolecular estabilizado com Watson-Crick e interações de Hoogsteen paralelas. Enquanto as interações Watson-Crick (WC) são efetivamente insensíveis ao pH, as interações Hoogsteen mostram forte e programável dependência do pH (Figura 6A). Marcando com um par FRET o nanointerruptor, podemos monitorar a transição triplex dependente do pH para duplex, que pode ser usada para determinar o pH da solução na vizinhança dos micromotores. Mais especificamente, um fluoróforo Cianina-3 (Cy3) é conjugado internamente no laço do DNA duplex em gancho e um fluoróforo Cianina-5 (Cy5) está ligado na extremidade 3 'da porção de DNA formadora de triplex.
[0156] Os ensaios de fluorescência realizados em uma concentração fixa (isto é, 50 nM) do DNA interruptor, que varia o pH da solução tampão em uma microcuveta de fluorescência (solução de 100 μl) mostra claramente as mudanças na eficiência FRET em função do pH. Como esperado, em valores de pH ácidos, a estrutura triplex intramolecular é favorecida e uma alta eficiência de FRET (Cy3 e Cy5 são trazidos em estreita proximidade) é observada. Conforme o pH da solução é aumentado, a estrutura triplex é desestabilizada e uma diminuição gradual do sinal FRET devido à transição triplex-para-duplex (desdobramento) é observada (Figura 6A). Como uma nota, os fluoróforos empregados aqui não são sensíveis ao pH na faixa de pHs investigados (de pH 5,0 a pH 9,5) para evitar quaisquer interferências no sinal. É importante notar que essa classe de interruptores com base em triplex mostra uma cinética de abertura/fechamento suficientemente rápida para permitir o monitoramento em tempo real da variação de pH (constante de tempo média ~100 ms).
[0157] Para testar a funcionalidade do interruptor uma vez conjugado aos micromotores, a eficiência do FRET foi monitorada por meio de um microscópio confocal de varredura a laser Leica-SP5 (CSLM) equipado com uma objetiva de imersão em óleo 63x (Figura 6B). Para isso, os micromotores foram suspensos em PBS a pH 5 ou pH 9 e colocados em um prato de fundo de vidro de 8 poços para sua análise em CSLM. A emissão do doador (Cy3) foi registrada usando um laser de diodo de 564 nm. A imagem FRET foi obtida excitando-se o fluoróforo Cy3 e detectando-se a emissão do aceitador (Cy5). Usando um encaixe ImagemJ customizado, a quantificação da eficiência do FRET foi obtida pelo cálculo da razão FRET/Cy3.
[0158] Esses resultados indicaram que os micromotores modificados com nanointerruptor de DNA foram capazes de detectar mudanças de pH em seu ambiente circundante. Para demonstrar a especificidade da detecção do pH e descartar qualquer efeito do pH na intensidade da fluorescência, os micromotores foram modificados com um interruptor de controle, que não respondeu às mudanças de pH. As Figuras 6C e 6D mostram a quantificação da emissão FRET/Cy3 de micromotores modificados com um nanointerruptor de DNA responsivo ao pH (Figura 6C) ou um nanointerruptor de DNA não responsivo ao pH (Figura 6D). Especificamente, como uma sonda não responsiva ao pH, foi selecionado um DNA de fita simples que contém o mesmo gancho de DNA intramolecular estabilizado através de interações WC e uma cauda de DNA embaralhada que não permite o dobramento triplex. Como esperado, não foram encontradas diferenças significativas ao usar o nanointerruptor não responsivo ao pH apresentando alta eficiência de FRET em todos os pH avaliados.
[0159] A dinâmica de movimento de micromotores ocos duplamente funcionalizados com urease e nanointerruptor de DNA foi analisada por gravação óptica na ausência ou na presença de ureia 100 mM atuando como combustível. Para isso, utilizou-se microscópio invertido de fluorescência Leica DMi8 equipado com objetiva de imersão em água 63x e câmera Hamamatsu. Pelo menos 15 micropartículas por condição foram gravadas durante 20 s a uma taxa de 25 quadros por segundo (FPS). Usando um código baseado em Phyton, as trajetórias dos micromotores foram rastreadas e, a partir das trajetórias, os MSDs foram calculados de acordo com a seguinte equação: MSD(∆t) = < (xi(t + ∆t) - xi(t))2 > (1)
[0160] em que i = 2 para análise 2D. Após a adição do substrato de ureia, o MSD apresenta um formato parabólico, que corresponde a um regime de propulsão de uma micropartícula ativa.
[0161] No entanto, na ausência de combustível, apenas o movimento browniano é observado resultando em um ajuste do liner, indicando que o movimento surge da reação catalítica na superfície dos micromotores. A velocidade das partículas propulsivas foi encontrada em 6,4 ± 0,6 μm/s (média ± erro padrão da média), calculada aplicando-se a seguinte equação: MSD(t) = 4Dtt + v2t2, (2)
[0162] em que Dt = coeficiente de difusão, v = velocidade e t = tempo.
[0163] Surpreendentemente, essa velocidade é comparável às microcápsulas alimentadas por enzima Janus assimétricas relatadas anteriormente (Ma X. et al., supra) e ligeiramente maior do que micropartículas não Janus (Patiño T. et al., Supra). Sem ser limitado por nenhuma teoria, esse efeito poderia ser causado pela assimetria fornecida pela coimobilização do nanointerruptor de DNA e enzimas ao redor das partículas de uma forma estocástica.
[0164] A capacidade dos micromotores de registrar simultaneamente as mudanças locais de pH produzidas enquanto são autopropulsores foi avaliada pela combinação de rastreamento óptico e imagem FRET usando CSLM, em que vídeos de 25 s foram gravados a 3FPS. Na ausência de combustível, foi observada uma razão FRET/Cy3 média de 1,8 ± 0,09 (média ± erro padrão da média). Quando a ureia foi adicionada à solução, a razão FRET/Cy3 imediatamente diminuiu para 1,5 ± 0,05, indicando um aumento do pH devido à atividade dos micromotores. Nenhuma diferença significativa na razão FRET/Cy3 foi observada durante os 25 s de gravação. Na ausência de combustível, os micromotores exibiam apenas movimento browniano e relação FRET/Cy3 próxima a 2. Em contrapartida, no caso de micromotores expostos à ureia, a razão FRET/Cy3 já estava diminuída no momento da análise (0 s), indicando que o pH já havia mudado, pois a reação enzimática à base de urease ocorre imediatamente após a adição de ureia substrato, induzindo uma mudança local de pH em torno das partículas, que é detectada instantaneamente.
[0165] Esses resultados demonstram as capacidades dos micromotores modificados com DNA ativo para detectar o microambiente ao seu redor enquanto produzem uma reação química contínua para a autopropulsão.
[0166] Para obter percepções sobre a mudança instantânea de pH em torno dos micromotores desde o momento inicial da reação, os micromotores foram imobilizados em uma superfície de vidro usando APTES como um agente de revestimento para fornecer cargas superficiais positivas e estabilizar as interações eletrostáticas com os micromotores carregados negativamente. A imobilização de micromotores permitiu a visualização dos mesmos micromotores antes e após a adição do combustível, bem como a análise em períodos de tempo mais longos (2 min e 10 min) antes que deixassem de fora a região de interesse.
[0167] As Figuras 7A e 7B mostram o MSD médio e a velocidade, respectivamente, obtidos a partir do rastreamento óptico dos motores. Uma diminuição contínua do MSD e da velocidade pode ser observada claramente. Curiosamente, enquanto a velocidade diminuía ao longo do tempo, o pH continuou aumentando até 10 min., Quando a velocidade foi encontrada perto de 0.
[0168] Esses resultados sugerem que a diminuição da velocidade não foi atribuída diretamente à diminuição da atividade enzimática e outros fatores, como a geração de produtos iônicos na decomposição da ureia ou o pH elevado não ideal para a reação enzimática, podem estar afetando a dinâmica do movimento.
[0169] O uso da nanotecnologia DNA-interruptor permite a detecção do pH no microambiente dos motores e também pode ser usado para monitorar sua própria atividade ao usar enzimas que induzem alterações de pH, como a urease. Assim, a integração de ferramentas de biossensor em motores acionados por enzimas fornece novas percepções não apenas para sua aplicação como sensores, mas também para monitorar sua atividade intrínseca dos micromotores para entender sua dinâmica de movimento e mecanismo. Além disso, a alta versatilidade do DNA e das enzimas permite o ajuste das propriedades dos micromotores para uma ampla gama de aplicações.
2.3. CONCLUSÕES
[0170] Os dados fornecidos no presente documento demonstram o potencial de combinar tecnologia de DNA com micronadadores biocatalíticos para gerar sistemas ativos e inteligentes capazes de se autopropulsionar simultaneamente enquanto detectam seu ambiente circundante. Análises precisas e quantitativas de mudanças de pH em torno da superfície de micromotores após sua ativação na presença de combustível foram alcançadas através do uso de um nanointerruptor de DNA sensível ao pH e imagens FRET por microscopia confocal. As mudanças locais de pH e dinâmica de movimento de micromotores foram analisadas simultaneamente na presença de combustível em 30 s, 2 min e 10 min. O pH aumentou continuamente enquanto a velocidade era exponencialmente reduzida, indicando que outros fatores, ao invés da atividade da enzima, poderiam estar afetando a autopropulsão dos micromotores.
[0171] Esses resultados destacam a relevância do sensoriamento simultâneo por micromotores de forma precisa e quantitativa não apenas para monitorar as mudanças no microambiente, mas também como um indicador de atividade. As direções futuras levarão à detecção de alterações intracelulares ou localizadas do tecido no pH e em outros analitos. Além disso, esta tecnologia sinérgica abrirá o campo para micromotores multifuncionais, em que as mudanças de pH irão desencadear a liberação de cargas por plataformas de ação sensorial.
LISTA DE CITAÇÕES Patiño T. et al., “Influence of Enzyme Quantity and Distribution on the Self-Propulsion of Non-Janus Urease-Powered Micromotors”, J. Am. Chem. Soc., 2018, vol. 140 (25), página 7.896 a 7.903. Ma, X. et al., “Motion Control of Urea-Powered Biocompatible Hollow Microcapsules”, ACS Nano, 2016, vol. 10 (3), página 3.597 a 3.605. Patton, C. J. et al., “Spectrophotometric and Kinetics Investigation of the Berthelot Reaction for the Determination of Ammonia”, Anal. Chem., 1977, vol. 49, página 464 a 469. Campuzano S. et al., “Motion-driven sensing and biosensing using electrochemically propelled nanomotors”, Analyst. 2011, vol. 36(22), página 4621 a 4.630 Altschul et al., “Basic local alignment search tool”, 1990, J. Mol. Biol, v. 215, páginas 403 a 410 Higgins et al., “CLUSTAL V: improved software for multiple sequence alignment”, 1992, CABIOS, vol. 8 (2), páginas 189 a 191 Inman et al., “The impact of temperature and urinary constituents on urine viscosity and its relevance to bladder hyperthermia treatment”, Int J Hyperthermia, 2013, vol. 29 (3), páginas 206 a 210 Xing MA et al., “Motion Control of Urea-Powered Biocompatible Hollow Microcapsules”, ACS Nano., 2016, vol. 10 (3), páginas
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Claims (16)

REIVINDICAÇÕES
1. Nanomotor alimentado por enzima caracterizado pelo fato de que compreende: - uma partícula com uma superfície; - uma enzima; e - uma molécula heteróloga; - que tem como característica a enzima e a molécula heteróloga que são ligadas descontinuamente sobre toda a superfície da partícula.
2. Nanomotor, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a partícula é uma nanopartícula ou uma micropartícula.
3. Nanomotor, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado pelo fato de que a partícula é produzida a partir de um material selecionado a partir do grupo que consiste em metal, óxido de metal, polímero, lipídio, proteína, membrana celular, corpo celular, material carbonáceo e misturas dos mesmos.
4. Nanomotor, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a partícula é produzida a partir de sílica mesoporosa.
5. Nanomotor, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a enzima é selecionada a partir do grupo que consiste em glicose oxidase, urease, catalase, glutamato oxidase, xantina oxidase, peroxidase, bilirrubina oxidase, lipase, protease, hexoquinase, acetilcolina esterase e tripsina.
6 Nanomotor, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a enzima é urease.
7. Nanomotor, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a molécula heteróloga é selecionada a partir do grupo que consiste em uma molécula de direcionamento,
uma molécula de marcação, um nanossensor e um portão molecular.
8. Nanomotor, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a molécula de direcionamento é um anticorpo.
9. Nanomotor, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o nanossensor é um nanointerruptor de DNA.
10. Nanomotor, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma carga.
11. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz do nanomotor, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, e um excipiente e/ou carreador farmaceuticamente aceitável.
12. Nanomotor, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, ou composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que é para uso em terapia, diagnóstico ou prognóstico.
13. Nanomotor ou composição farmacêutica para uso, de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que é para uso no tratamento de câncer.
14. Nanomotor ou composição farmacêutica para uso, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que o câncer é câncer de bexiga.
15. Kit de peças caracterizado pelo fato de que compreende: - um nanomotor, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, ou a composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 11, e - instruções de uso.
16. Método in vitro de detecção de um analito em uma amostra isolada caracterizado pelo fato de que compreende o contato do nanomotor, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, com a amostra.
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