KR20230114227A - Sting 길항제가 충진된 요소분해효소 추진 나노모터 기반 방광암 면역 치료제 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 키토산-헤파린 나노모터 및 이의 제조 방법에 관한 것이다. STING 길항제가 충진된 요소분해효소 기반 키토산-헤파린 나노모터는 방광 내에서 STING 길항제를 방광의 점막 세포에 직접 전달함으로 면역반응을 유도할 수 있다.
Description
본 발명은 STING 길항제가 충진된 요소분해효소 추진 나노모터 기반 방광암 면역 치료제의 제조 방법 및 이의 용도에 관한 것이다.
방광암은 전 세계적으로 9 번째로 흔한 암으로서, 매년 43 만 명이 새롭게 진단되고 방광암과 관련된 사망률은 13번째로 높다. 방광암은 특히 남성에서 더 많이 발생하며, 미국에서는 남성 암 중 4 번째로 많이 발생하는 암이다. 국내 보고에 따르면, 방광암은 2017년에 남성에서 새로 진단된 암 중 10 번째로 높은 발생률을 보이며, 2019년 암 관련 사망률 또한 10 번째 순위를 보이는 중요한 암종이다.
방광암은 혈뇨의 증상을 동반하기 때문에 75-80%의 경우 비근육 침윤성 방광암으로 발견된다. 이중 Ta stage이면서 high grade의 분화도를 갖거나 T1 stage 혹은 Tis인 경우, 경요도 종양 절제술을 시행한 후 방광 내 BCG 주입 요법을 시행하게 된다. 그럼에도 불구하고 30%가량의 환자에서는 근육침윤성 방광암으로 진행하여 방광 전 절제술을 요하는 단계까지 진행하게 된다.
비근육 침윤성 방광암의 5년 생존율이 70% 이상인데 반해, 근육 침윤성 방광암의 5년 생존율은 36%, 전이가 동반된 경우는 10% 미만으로 그 예후가 극히 악화된다. 더군다나 근육 침윤성 방광암의 치료로 시행되는 근치적 방광 전 절제술은 장 폐색, 요로감염, 수술 부위 탈장 등으로 인한 합병증이 발생할 수 있으며 수술 후 심각한 삶의 질 저하를 야기한다.
STING은 cyclid dinucleotide(CDN)을 인식하여 type I 경로를 활성화시켜 선천면역 반응 및 이를 통한 adaptive T cell response를 증가시킨다. 대표적인 STING 길항제인 cyclic GMP-AMP(cGAMP)는 세포질 내에 누출된 DNA를 인식하여 ATP, GTP 로부터 합성된다. cGAMP는 type II transmembrane glycoprotein인 ENPP1에 의해 분해될 수 있으며, 전신 주사요법에는 충분한 효과를 보여주지 못하여 종양 내부에 직접 주사하는 방식으로 항 종양 효과를 보이게 된다.
따라서 STING 길항제를 활용한 치료는 degradation을 억제하면서 조직 내 잔류 시간을 증가시켜 주는 것이 가장 중요하다. 이런 점에 있어서 방광암은 방광 점막에 노출되어 있어 방광 내 약물 주입을 하게 되면 내포작용의 과정으로 약물을 흡수할 수 있어 적적한 매개체 혹은 전달체가 담보된다면 STING 길항제 치료에 적합한 타겟이 될 수 있다.
하지만 장시간 오줌에 노출되어 STING 길항제의 기능이 저하될 수 있으며, 방광점막이 글리코사미노글리칸 층으로 덮여있어 글리코사미노글리칸 층 투과율 향상을 통한 약물의 세포전달력이 중요한 문제가 된다.
본 발명에서는 요소분해효소 추진 나노모터, 구체적으로는 STING 길항제를 전달하는 요소분해효소 추진 나노모터를 제안하고자 한다. 요소분해효소 추진 나노모터는 점막 접착성이 좋은 키토산-헤파린 나노복합체 또는 PLGA 나노입자에 요소분해효소를 결합시킨 구조로, 소변으로부터 약물의 기능 저하를 차단시킬 뿐 만 아니라, 나노모터의 추진력을 통해 점막을 통한 방광 세포로의 전달 효율을 높여 줄 수 있는 새로운 약물 전달 플랫폼이다. 따라서 STING 길항제와 요소분해효소 추진 나노모터의 합성으로 방광암 조직의 STING 활성화를 극대화시킬 수 있을 것으로 기대 된다.
본 발명은 생체 조건에서 방광 벽을 통해 침투해 방광 내에 오래도록 잔류할 수 있는 생체적합한 나노모터를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 방광 내에서 STING 길항제를 방광의 점막 세포에 직접 전달함으로써, 면역반응을 유도하여 방광 질환을 치료할 수 있는 나노모터를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 생체적합성 고분자 나노입자; 및
상기 생체적합성 고분자 나노입자의 표면에 결합된 요소분해효소를 포함하고,
상기 생체적합성 고분자 나노입자는 키토산, 헤파린 및 PLGA(poly(Poly(lactide-co-glycolide))로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상을 포함하며,
상기 요소분해효소는 요소의 존재하에서 기체를 발생시켜 나노모터의 자가 추진을 유도하는 것인 생체적합성 고분자 나노모터를 제공한다.
또한, 본 발명은 생체적합성 고분자 나노입자의 표면에 요소분해효소를 결합시켜 요소분해효소가 결합된 생체적합성 고분자 나노입자를 제조하는 단계를 포함하며,
상기 생체적합성 고분자 나노입자는 키토산, 헤파린 및 PLGA(poly(Poly(lactide-co-glycolide))로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는, 제1항에 따른 생체적합성 고분자 나노모터의 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 전술한 생체적합성 고분자 나노모터를 포함하는 약물 전달체용 담체를 제공한다.
본 발명에 따른 생체적합성 고분자 나노모터는 방광 내 점막층을 통하여 깊이 침투하여 방광 벽 내에서 오랫동안 잔류하여 방광암 치료를 할 수 있다.
특히, 키토산-헤파린 나노모터는 요소의 존재 하에서 자율적으로 움직이고, 방광 벽에 도달한 후 나노모터 표면의 키토산으로 인해 점막층에 효과적으로 부착된다.
방광 내에 주사 후, 상기 생체적합성 고분자 나노모터는 자가 추진에 의해 깊은 방광 조직에 침투할 수 있고, 따라서 배뇨 후에도 많은 나노모터가 방광 내에 유지될 수 있다. 이를 통해, 방광 내 약물 전달 효율이 우수하며, 치료 효과를 극대화할 수 있다.
도 1에서 a는 STING 길항제 충진 키토산-헤파린 나노모터의 합성과정을 나타내는 모식도이고, b는 방광암 치료과정을 나타내는 모식도이다.
도 2에서 a는 키토산-헤파린 나노복합체에의 STING 길항제의 충진 효율을 나타내고, b는 STING 길항제의 충진 후 나노복합체의 zeta potential을 나타내낸다. c는 STING 길항제 충진 키토산-헤파린 나노모터의 TEM 이미지를 나타내고, d는 수용액에서의 크기를 나타낸다. 또한, e는 요소분해효소의 부착 전 및 후의 STING 길항제 충진 키토산-헤파린 나노복합체의 zeta potential을 나타내고, f는 나노복합체에 부착된 요소분해효소와 부착되지 않은 요소분해효소의 활성 효율 비교 결과를 나타낸다. 또한, g는 STING 길항제가 충진된 키토산-헤파린 나노복합체와 나노모터의 absorbance를 나타내고, h는 STING 길항제의 중성, 약산성 내에서의 방출 실험 결과를 나타낸다.
도 3에서 a는 수지상 세포의 형광이미지로, 형광 표지한 STING 길항제 충진 키토산-헤파린 나노모터와 2 시간동안 함께 배양했을 때의 나노모터 유입양을 나타낸다. b 및 c는 STING 길항제 충진 키토산-헤파린 나노모터의 수지상 세포로의 유입 메커니즘을 나타내고, d 및 e는 STING 길항제 충진 키토산-헤파린 나노모터의 수지상 세포 활성화를 나타낸다.
도 4에서 a는 요소 농도(0, 50, 100 및 200 mM)에 따른 STING 길항제 충진 키토산-헤파린 나노모터의 평균제곱변위(MSD) 값을 나타내고, b는 STING 길항제 충진 키토산-헤파린 나노모터 추적선 및 속도를 나타내며, c는 90 초 동안의 STING 길항제 충진 키토산-헤파린 나노모터 군집의 확산 영역을 나타낸다.
도 5에서 a는 방광내 침투 및 잔류효능을 확인하기 위한 생체영상 측정 모식도를 나타낸다. b는 키토산-헤파린 나노복합체와 키토산-헤파린 나노모터의 120 분동안 이광자현미경을 통한 방광 침투 깊이 비교 결과를 나타내며, c 및 d는 각각 0 분 및 120 분에서의 형광세기를 나타낸다. 또한, e는 키토산-헤파린 나노복합체와 키토산-헤파린 나노모터의 주입 12 시간 후의 방광 형광 이미지를 나타내고, f는 IVIS 이미지를 나타내며, G는 형광 세기를 나타낸다.
도 6에서 a는 방광암 모델 제작 및 치료 스케줄을 나타내고, b는 2 주 후, 대표 방광조직 이미지를 나타낸다. 또한, c 및 d는 각각 방광암 두께 비교 및 방광내 T 세포 수 비교결과를 나타내며(방광암 치료효능 확인), e는 면역관련 mRNA expression 비교 결과를 나타낸다.
도 2에서 a는 키토산-헤파린 나노복합체에의 STING 길항제의 충진 효율을 나타내고, b는 STING 길항제의 충진 후 나노복합체의 zeta potential을 나타내낸다. c는 STING 길항제 충진 키토산-헤파린 나노모터의 TEM 이미지를 나타내고, d는 수용액에서의 크기를 나타낸다. 또한, e는 요소분해효소의 부착 전 및 후의 STING 길항제 충진 키토산-헤파린 나노복합체의 zeta potential을 나타내고, f는 나노복합체에 부착된 요소분해효소와 부착되지 않은 요소분해효소의 활성 효율 비교 결과를 나타낸다. 또한, g는 STING 길항제가 충진된 키토산-헤파린 나노복합체와 나노모터의 absorbance를 나타내고, h는 STING 길항제의 중성, 약산성 내에서의 방출 실험 결과를 나타낸다.
도 3에서 a는 수지상 세포의 형광이미지로, 형광 표지한 STING 길항제 충진 키토산-헤파린 나노모터와 2 시간동안 함께 배양했을 때의 나노모터 유입양을 나타낸다. b 및 c는 STING 길항제 충진 키토산-헤파린 나노모터의 수지상 세포로의 유입 메커니즘을 나타내고, d 및 e는 STING 길항제 충진 키토산-헤파린 나노모터의 수지상 세포 활성화를 나타낸다.
도 4에서 a는 요소 농도(0, 50, 100 및 200 mM)에 따른 STING 길항제 충진 키토산-헤파린 나노모터의 평균제곱변위(MSD) 값을 나타내고, b는 STING 길항제 충진 키토산-헤파린 나노모터 추적선 및 속도를 나타내며, c는 90 초 동안의 STING 길항제 충진 키토산-헤파린 나노모터 군집의 확산 영역을 나타낸다.
도 5에서 a는 방광내 침투 및 잔류효능을 확인하기 위한 생체영상 측정 모식도를 나타낸다. b는 키토산-헤파린 나노복합체와 키토산-헤파린 나노모터의 120 분동안 이광자현미경을 통한 방광 침투 깊이 비교 결과를 나타내며, c 및 d는 각각 0 분 및 120 분에서의 형광세기를 나타낸다. 또한, e는 키토산-헤파린 나노복합체와 키토산-헤파린 나노모터의 주입 12 시간 후의 방광 형광 이미지를 나타내고, f는 IVIS 이미지를 나타내며, G는 형광 세기를 나타낸다.
도 6에서 a는 방광암 모델 제작 및 치료 스케줄을 나타내고, b는 2 주 후, 대표 방광조직 이미지를 나타낸다. 또한, c 및 d는 각각 방광암 두께 비교 및 방광내 T 세포 수 비교결과를 나타내며(방광암 치료효능 확인), e는 면역관련 mRNA expression 비교 결과를 나타낸다.
본 발명은 생체적합성 고분자 나노입자; 및
상기 생체적합성 고분자 나노입자의 표면에 결합된 요소분해효소를 포함하고,
상기 요소분해효소는 요소의 존재하에서 기체를 발생시켜 나노모터의 자가 추진을 유도하는 것인 생체적합성 고분자 나노모터에 관한 것이다.
본 발명에서는 생체적합성 고분자 나노입자에 요소분해효소가 결합된 구조를 생체적합성 고분자 나노모터라 표현할 수 있다. 그리고, 생체적합성 고분자 나노입자 내부에 STING 길항제가 충진된 구조를 STING 길항제 충진 생체적합성 고분자 나노입자라 표현할 수 있으며, 상기 STING 길항제 충진 생체적합성 고분자 나노입자에 요소분해효소가 결합된 구조를 STING 길항제 충진 생체적합성 고분자 나노모터라 표현할 수 있다.
일례로, 생체적합성 고분자 나노입자로 키토산-헤파린 나노복합체를 사용하는 경우, 상기 키토산-헤파린 나노복합체(nanocomplex)에 요소분해효소가 결합된 구조를 키토산-헤파린 나노모터(nanomotor)라 표현할 수 있다. 그리고, 상기 키토산-헤파린 나노복합체 내부에 STING 길항제가 충진된 구조를 STING 길항제 충진 키토산-헤파린 나노복합체(STING@nanocomplex)라 표현할 수 있으며, 상기 STING 길항제 충진 키토산-헤파린 나노복합체에 요소분해효소가 결합된 구조를 STING 길항제 충진 키토산-헤파린 나노모터(STING@nanomotor)라 표현할 수 있다.
이하, 본 발명의 생체적합성 고분자 나노모터를 보다 상세하게 설명한다.
본 발명에서 용어 “나노모터(nanomoter)”는 다양한 외부의 자극에 의해 힘을 가져 추진될 수 있는 나노입자로서, 액체 속에서 촉매의 화학반응에 의해 자기 스스로 추진력을 갖는 미세한 고안물로 정의된다. 이러한 나노모터는 액체에서 자기-추진력을 유지하고 임무를 부여받는 동안 복잡하고 난해한 문제들을 해결하는데 기여할 수 있다.
본 발명에 따른 생체적합성 고분자 나노모터는 생체적합성 고분자 나노입자; 및
상기 생체적합성 고분자 나노입자의 표면에 결합된 요소분해효소를 포함한다.
본 발명에서 생체적합성 고분자 나노입자는 점막 접착성이 우수하므로, 점막을 통한 방광 세포로의 약물 전달 효율을 높일 수 있다.
일 구체예에서, 생체적합성 고분자 나노입자는 키토산, 헤파린 및 PLGA(poly(Poly(lactide-co-glycolide))로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다.
본 발명에서 키토산은 아미노다당류 구조 및 양이온성 성질을 갖는 천연 중합체로, 화학식 1의 단량체 단위의 반복을 포함한다.
[화학식 1]
화학식 1에서, n은 정수로서 중합도를 나타낸다. 즉 키토산 사슬에서 단량체 단위의 수를 나타낸다.
상기 키토산은 일반적으로 아미노기가 아세틸화된 단량체 단위들의 비율을 함유한다. 실제로, 키토산은 키틴(100% 아세틸화됨)의 탈아세틸화에 의해 수득된다. 상기 탈아세틸화도는 일반적으로 30 내지 95, 바람직하게는 55 내지 90일 수 있으며, 이는 10% 내지 45%의 아미노기들이 아세틸화되어 있음을 나타낸다.
일 구체예에서, 키토산의 분자량은 50 내지 190 kDa, 바람직하게는 20 내지 100 kDa 또는 50 내지 150 kDa일 수 있다.
본 발명에서 헤파린은 혈액 중의 천연 물질로, 혈액 응고 과정에 연루되는 다당류이다.
일 구체예에서, 헤파린의 분자량은 17 내지 19 kDa 일 수 있다.
본 발명에서 PLGA는 Lactide(LA)와 Glycolide(GA)를 합성하여 제조한 고분자로, 상기 LA 및 GA의 비율을 조절함에 따라 분해속도 및 물성을 조절할 수 있다.
본 발명에서, 생체적합성 고분자 나노입자는 키토산-헤파린 나노복합체일 수 있다. 상기 키토산-헤파린 나노복합체는 키토산의 아민기와 헤파린의 설페이트기가 이온 결합(ionic crosslinking)을 통해 복합체를 형성할 수 있다. 이러한 나노복합체는 양전하를 가지는 키토산 및 음전하를 가지는 헤파린 간의 정전기적 상호작용에 의해 유지될 수 있다.
일 구체예에서, 키토산-헤파린 나노복합체의 평균 크기는 200 내지 1000 nm일 수 있다. 본 발명에서 "평균 크기"는 수성 매질 중에서의 키토산-헤파린 나노복합체의 평균 직경을 의미할 수 있다. 상기 평균 크기는 하기 실험예의 방법을 통해 측정할 수 있다. 평균 크기는 키토산 및 헤파린의 분자량, 키토산의 탈아세틸화도, 키토산 및 헤파린의 농도 및 비율에 따라 달라질 수 있다.
일 구체예에서, 키토산-헤파린 나노복합체는 표면 전하를 가질 수 있으며, 이는 키토산 및 헤파린의 구성 비율에 따라 달라질 수 있다. 양전하는 키토산의 아민기에 의한 것이며, 음전하는 헤파린의 카르복실 및/또는 설페이트기에 의한 것이다.
일 구체예에서, 키토산-헤파린 나노복합체의 표면은 양전하를 나타낼 수 있다. 이를 통해, 상기 키토산-헤파린 나노복합체와 요소분해효소를 결합시킬 수 있다.
일 구체예에서, 키토산과 헤파린의 비율(부피비)은 1 : 0.25 내지 0.3일 수 있으며, 구체적으로 1 : 0.25 일 수 있다. 상기 함량 범위에서 표면이 양전하를 가지는 나노복합체를 제조할 수 있으며, 요소분해효소와의 결합 및 STING 길항제의 충진이 용이하게 이루어질 수 있다.
또한, 본 발명에서, 생체적합성 고분자 나노입자는 PLGA 나노입자일 수 있다.
상기 PLGA 나노입자의 표면은 아민기로 개질된 것일 수 있다.
상기 PLGA 나노입자의 평균 크기는 200 내지 1000 nm일 수 있다.
일 구체예에서, 생체적합성 고분자 나노입자의 표면은 생체 효소인 요소분해효소(우레아제, urease)와 결합될 수 있다. 구체적으로, 생체적합성 고분자 나노입자의 표면에 위치하는 아민기는 요소분해효소와 다이알데하이드 화합물을 매개로 결합을 형성할 수 있다.
상기 요소분해효소는 요소를 가수분해하는 효소이다. 상기 요소분해효소는 방광 내에 높은 농도로 존재하는 요소를 분해하면서 나노모터를 움직일 수 있도록 하는 엔진 역할을 수행할 수 있으며, 또한 생체적합성을 가진다. 상기 요소분해소에 의해 요소는 암모니아 및 이산화탄소로 분해될 수 있다.
상기 다이알데하이드 화합물은 구조 중에 두 개의 알데하이드기를 포함하는 화합물을 의마한다. 이러한 다이알데하이드 화합물로 글루타알데하이드, 글리옥살(glyoxal) 및 숙신알데하이드(succinaldehyde)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상을 사용할 수 있고, 구체적으로는 글루타알데하이드를 사용할 수 있다.
일 구체예에서, 요소분해효소의 아민기는 다이알데하이드 화합물의 하나의 아민기와 반응하여, 환원 반응(reductive amination)에 의해 이민 결합(imine bond)이 환원된 -C-N- 결합을 형성할 수 있다. 그리고, 다이알데하이드 화합물의 다른 아민기는 생체적합성 고분자 나노입자의 표면의 아민기와 반응하여, 환원 반응에 의해 이민 결합이 환원된 -C-N- 결합을 형성할 수 있다.
일 구체예에서, 키토산-헤파린 나노모터는 글루타알데하이드를 링커로 요소분해효소의 아민기와 키토산의 아민기가 결합을 형성할 수 있다. 또한, 일 구체예에서, PLGA 나노모터는 글루타알데하이드를 링커로 요소분해효소의 아민기와 PLGA 나노입자의 표면의 아민기가 결합을 형성할 수 있다.
일 구체예에서, 요소분해효소의 함량은 생체적합성 고분자 나노입자의 표면의 아민기의 수에 따라 달라질 수 있다.
본 발명에서, 생체적합성 고분자 나노모터는 요소분해효소의 작용에 의해 기체를 발생시켜 자가 추진을 유도할 수 있다.
요소분해효소는 요소 환경하에서 상기 요소를 분해하여 이산화탄소를 발생시키고, 상기 발생된 아산화탄소를 통해 나노모터가 추진 및 구동될 수 있다. 이를 통해, 나노모터는 방광 벽 등의 점막에 부착되며, 또한 점막 내로 침투할 수 있다. 따라서, 생체적합성 고분자 나노모터를 요소분해효소 접합(또는 추진) 생체적합성 고분자 나노모터로 표현할 수도 있다.
일 구체예에서, 생체적합성 고분자 나노모터의 크기는 200 내지 1,000 nm 일 수 있다. 상기 크기 범위에서 생체 부착 및 생체 내 침투가 용이하다는 장점을 가진다. 상기 크기가 너무 작으면, 나노모터로서의 추진력을 얻을 수 없으며, 크기가 너무 크면, 생체 침투력이 저하될 우려가 있다.
본 발명의 생체적합성 고분자 나노모터는 생체적합성 고분자 나노입자의 내부에 충진된 약물을 추가로 포함할 수 있으며, 상기 약물은 STING 길항제일 수 있다.
STING 길항제는 cyclid dinucleotide(CDN)을 인식하여 type I 경로를 활성화시켜 선천면역 반응 및 이를 통한 adaptive T cell response를 증가시킬 수 있다. 상기 STING 길항제는 종양 내부에 직접 주사하는 방식으로 항 종양 효과를 나타낼 수 있다.
이러한 STING 길항제는 음전하를 가지며, 생체적합성 고분자 나노입자와 반응하여 상기 나노입자의 내부로 충진될 수 있다. 상기 STING 길항제는 장시간 오줌에 노출될 경우 기능이 저하될 우려가 있다. 따라서, 본 발명에서는 STING 길항제를 나노입자의 내부에 충진하여 외부로의 노출을 방지할 수 있으며, 나노모터가 글리코사미노글리칸 층으로 덮여있는 방광점막을 투과할 수 있으므로 STING 길항제의 세포전달력을 보다 향상시킬 수 있다.
일 구체예에서, STING 길항제는 ADU-S100, MK-1454, MK-2118, SB11285, GSK3745417, BMS-986301, E7765, TAK-676, SNX-281 및 SYNB1891 로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.
일 구체예에서, STING 길항제의 함량은 나노입자의 함량(중량) 대비 1 : 0.1 내지 0.2일 수 있다. 특히 키토산-헤파린 나노복합체를 사용하는 경우, 키토산의 함량(중량) 대비 1 : 0.1 내지 0.2일 수 있다. 상기 함량 범위에서 STING 길항제가 생체적합성 고분자 나노입자의 내부에 충진되며, STING 길항제 자체의 효과를 나타낼 수 있다.
본 발명에서 생체적합성 고분자 나노모터는 약물을 추가로 포함할 수 있다. 이때, 약물은 생체적합성 고분자 나노입자의 표면과 결합을 형성할 수 있다.
상기 약물의 종류는 특별히 제한되지 않으며, 본 발명에서는 항암제를 사용할 수 있다. 상기 항암제로는 파클리탁셀, 텍소티어, 아드리아마이신, 엔도스타틴, 앤지오스타틴, 미토마이신, 블레오마이신, 시스플레틴, 카보플레틴, 독소루비신, 다우노루비신, 이다루비신, 5-플로로우라실 및 메토트렉세이트, 엑티노마이신-D로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상을 사용할 수 있다.
일 구체예에서, 생체적합성 고분자 나노모터는 방광 질환의 치료용으로 사용될 수 있다. 이때, 방광 질환의 종류는 특별히 제한되지 않으며, 예를 들어, 과민성 방광, 간질성 방광염 및 방광암으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.
일반적으로 방광 질환의 치료는 방광 내로 카테터를 이용하여 약물을 주입하는 방법을 이용하는데, 이때 약물은 방광 벽에 잘 붙지 못하고 빈번한 배뇨작용에 의해 씻겨 내려가 약효의 지속성이 떨어진다는 단점을 가진다. 본 발명에서는 생체적합성 고분자 나노모터를 사용하여, 상기 생체적합성 고분자 나노모터를 방광 내로 주입하면 방광 내 높은 요소 농도에 의해 나노모터가 추진되게 되고, 방광 벽의 점막층을 효율적으로 투과할 수 있다. 또한, 병광 벽 내에 배뇨작용 후에도 더 오래 존재할 있다. 이러한 나노모터의 향상된 침투 및 잔류는, 상기 나노모터가 다양한 방광 질환의 치료를 위한 새로운 방법으로 이용될 수 있음을 시사한다.
또한, 본 발명은 전술한 생체적합성 고분자 나노모터의 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 생체적합성 고분자 나노모터는 생체적합성 고분자 나노입자의 표면에 요소분해효소를 결합시켜 요소분해효소가 결합된 생체적합성 고분자 나노입자를 제조하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명에서 요소분해효소가 결합된 생체적합성 고분자 나노입자를 제조하는 단계는 생체적합성 고분자 나노입자의 표면에 요소분해효소를 결합시키는 단계로, 생체적합성 고분자 나노모터를 제조하는 단계이다.
일 구체예에서, 상기 단계는 요소분해효소를 다이알데하이드 화합물의 수용액에 반응시켜 활성화된 요소분해효소를 제조한 다음, 생체적합성 고분자 나노입자 수용액에 상기 활성화된 요소분해효소를 첨가하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 단계를 통해 다이알데하이드 화합물을 링커로 요소분해효소의 아민기와 생체적합성 고분자 나노입자의 표면의 아민기가 결합을 형성할 수 있다.
일 구체예에서, 활성화된 요소분해효소의 반응은 20 내지 30℃ 또는 상온에서 30 분 내지 3 시간 또는 1 내지 2 시간 동안 수행될 수 있다.
일 구체예에서, 생체적합성 고분자 나노모터의 크기는 200 내지 1,000 nm 일 수 있다.
본 발명에서, 생체적합성 고분자 나노입자로 키토산-헤파린 나노복합체를 사용하는 경우, 키토산-헤파린 나노모터는 키토산 및 헤파린을 이온 결합시켜 키토산-헤파린 나노복합체를 제조하는 단계; 및
상기 키토산-헤파린 나노복합체의 표면에 요소분해효소를 결합시켜 요소분해효소가 결합된 키토산-헤파린 나노복합체를 제조하는 단계를 통해 제조할 수 있다.
상기 키토산-헤파린 나노복합체를 제조하는 단계는 키토산 및 헤파린을 이온 결합시켜 나노복합체를 제조하는 단계이다.
상기 단계에서는 헤파린 용액과 키토산 수용액을 혼합하여 나노복합체를 형성할 수 있으며, 구체적으로, 키토산 수용액에 헤파린 용액을 드롭 바이 드롭(drop by drop) 방식으로 천천히 첨가하여 나노복합체를 형성할 수 있다.
키토산은 양전하를 가지고, 헤파린은 음전하를 가지므로, 상기 키토산 및 헤파린은 이온 결합을 통해 구형의 나노복합체를 형성할 수 있다.
일 구체예에서, 키토산과 헤파린의 비율(부피비)은 1 : 0.25 내지 0.3일 수 있으며, 구체적으로 1 : 0.25 일 수 있다. 상기 함량 범위에서 표면이 양전하를 가지는 나노복합체를 제조할 수 있으며, STING 길항제의 충진이 용이하게 이루어질 수 있다.
일 구체예에서, 키토산-헤파린 나노복합체의 평균 크기는 200 내지 1000 nm일 수 있다.
또한, 본 발명에서, 생체적합성 고분자 나노입자로 PLGA 나노입자를 사용하는 경우, PLGA 나노모터는 표면에 아민기가 접합된 PLGA 나노입자의 표면에 요소분해효소를 결합시켜 요소분해효소가 결합된 PLGA 나노입자를 제조하는 단계를 통해 제조할 수 있다.
본 발명의 제조방법은 생체적합성 고분자 나노입자의 내부에 STING 길항제를 충진시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 단계는 생체적합성 고분자 나노입자와 요소분해소를 반응시키기 전에 수행될 수 있다.
일 구체예에서, 상기 단계는 생체적합성 고분자 나노입자를 포함하는 수용액에 STING 길항제 수용액을 첨가하는 방법으로 수행될 수 있다. 또한, 반응은 초음파 분산을 이용하여 수행될 수 있다.
일 구체예에서, STING 길항제의 함량은 생체적합성 고분자 나노입자의 함량(중량) 대비 1 : 0.1 내지 0.2일 수 있다.
본 발명의 제조방법은 생체적합성 고분자 나노입자의 표면에 약물을 결합시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 이때, 나노입자에의 약물의 결합은 요소분해효소가 결합된 후에 수행될 수 있으나, 요소분해효소를 결합시키기 전에 상기 약물을 먼저 결합시킬 수도 있다.
일 구체예에서, 약물은 전술한 종류를 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 전술한 생체적합성 고분자 나노모터의 용도에 관한 것이다.
본 발명에 따른 생체적합성 고분자 나노모터는 약물 전달체용 담체로서 사용될 수 있다. 또한, 상기 생체적합성 고분자 나노모터는 카테터 등의 의료 장비에 코팅되어 생체 내로 주입될 수 있다.
상기 생체적합성 고분자 나노모터는 약물을 포함할 수 있으며, 상기 약물은 나노모터의 추진에 의해 점막을 통해 생체 내로 전달될 수 있다. 이때, 약물의 종류로 전술한 종류를 사용할 수 있다.
본 발명의 생체적합성 고분자 나노모터는 약물의 종류에 따라 다양한 질환의 치료에 사용될 수 있으며, 구체적으로 방광 질환의 치료에 사용될 수 있다. 상기 방광 질환은 과민성 방광, 간질성 방광염 및 방광암으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다. 또한, 방광암의 면역치료용으로 사용될 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예.
<참고> 통계분석
SigmaPlot10.0의 소프트웨어를 사용하여 t-test를 통해 통계 분석을 수행하였다.
*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.005, ****P<0.001의 값은 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다. 데이터는 여러 개별 실험에서 평균 ± 표준편차(SD)로 표시된다. 모든 실험을 3회 수행하고 각 그룹에 대해 20 개의 나노모터를 측정하였다.
실시예 1. STING 길항제 충진 키토산-헤파린 나노모터 합성
(1) STING 길항제 충진 키토산-헤파린 나노복합체(NC) 합성
0.4, 0.5 및 0.6 ml의 헤파린 용액(1 mg/ml)을 2 ml의 키토산 수용액(1 mg/ml)에 드롭 바이 드롭(drop by drop) 방식으로 천천히 첨가하여 키토산-헤파린 나노복합체를 형성하였다.
그 후, 0.1 또는 0.2 ml의 STING 길항제(ADU-S100)를 수용액을 팁 소니케이션을 치는 동안 키토산-헤파린 수용액에 서서히 첨가하여 나노복합체에 충진시켰다. 과량의 STING 길항제를 제거하기 위하여, 3일 동안 물에 투석(dialysis)하였다.
(2) STING 길항제 충진 키토산-헤파린 나노모터 합성
1 ml의 요소분해효소(2 mg/ml)를 3 ml의 글루타알데하이드 수용액(2.5 %)에 반응시켰다. 반응하지 않은 글루타알데하이드를 제거하기 위하여, 3일 동안 투석하였다.
그 후, 1 ml의 활성화된 요소분해효소를 (1)에서 합성된 나노복합체 수용액에 첨가하고, 1 시간 동안 반응시켰다. 그 후, 키토산-헤파린 나노모터 용액을 PBS로 3 회 세척한 후 원심 분리(4000 rpm에서 5 분 수행)하였다.
이하, 키토산-헤파린 나노복합체를 nanocomplex라 표현하고, 키토산-헤파린 나노모터를 nanomotor라 표현한다. 또한, STING 길항제 충진 키토산-헤파린 나노복합체를 STING@nanocomplex라 표현하고, STING 길항제 충진 키토산-헤파린 나노모터를 STING@nanomotor라 표현한다.
본 발명에서 도 1의 a는 STING 길항제 충진 키토산-헤파린 나노모터(STING@nanomotor)의 제조 방법을 나타내는 모식도이다.
또한, 도 1의 b는 제조된 STING 길항제 충진 키토산-헤파린 나노모터의 방광 벽 침투 및 수지상 세포의 면역 반응 활성화의 개략적인 모식도이다.
도 1에 나타난 바와 같이, STING@nanomotor는 3 단계 공정에 의해 설계되고 제조될 수 있다. 먼저, 키토산과 헤파린 고분자를 ionic crosslink를 통하여 nanocomplex를 형성한다. 그 다음, STING 길항제를 electrostatic interaction을 통해 충진한다. 마지막으로, 글루타알데하이드 linker를 통해 요소분해효소의 아민기와 키토산의 아민기를 접합시킨다.
실험예 1. STING 길항제 충진 키토산-헤파린 나노모터의 특성 분석
(1) 방법
실시예 1에서 제조된 STING 길항제 충진 키토산-헤파린 나노모터의 특징적인 형태를 투과전자현미경(TEM)으로 확인하였으며, 크기와 제타 전위를 동적광산란방식(DLS)를 통해 측정하였다. 나노모터의 표면에 존재하는 요소분해효소의 농도는 bradford 단백질 분석 키트를 사용하여 측정하였다. 또한, 나노복합체에 결합된 요소분해효소의 효소 활성을 Berthelot의 방법에 의해 생성된 암모니아의 농도를 결정하는 상용 키트를 사용하여 평가하였다. 이때, 나노모터의 농도는 0.5 mg/ml이며, 제조사의 지시에 따라 실험을 수행하였다. STING 길항제의 방출 실험은 37℃의 PBS 용액에서 60 시간 동안 측정하였다. STING 길항제의 방출 여부는 자외선 가시선 분광분석법(uv-vis spectroscopy)를 통해 측정하였다.
(2) 결과
도 2의 a는 키토산-헤파린 나노복합체에서 STING 길항제의 충진 효율을 나타낸다.
STING 길항제는 중성의 pH에서 음이온성 성질을 띈다. 그리고, 도면에 나타난 바와 같이, STING 길항제는 키토산-헤파린 나노복합체에 70~83.5% 효율로 충진되는 것을 확인할 수 있다.
도 2의 b는 STING 길항제 충진 키토산-헤파린 나노복합체의 zeta potential을 나타낸다.
도면에 나타난 바와 같이, STING 길항제가 충진된 키토산-헤파린 나노복합체는 양이온성 성질을 띠는 것을 확인할 수 있다.
도 2의 c 및 d는 STING 길항제 충진 키토산-헤파린 나노모터의 TEM 사진 및 DLS를 나타낸다.
도면에 나타난 바와 같이, STING 길항제 충진 키토산-헤파린 나노모터의 크기는 200 내지 1000 nm인 것을 확인할 수 있다.
도 2의 e는 요소분해효소의 부착 전 및 후의 STING 길항제 충진 키토산-헤파린 나노복합체의 zeta potential을 나타내고, f는 프리 요소분해효소와 요소분해효소가 부착된 STING 길항제 충진 키토산-헤파린 나노복합체(즉, STING@nanomotor)의 활성 효율 비교 결과를 나타낸다.
도면에 나타난 바와 같이, STING@nanomotor는 요소분해효소의 부착으로 인해 물 안에서 음이온성 성질을 띨 수 있다. 또한, 부착된 효소는 부착되지 않은 같은 양의 효소에 비해 1~1.5 배 효율이 높아짐을 확인할 수 있다. 이는 요소분해효소는 수용액 내에서 불안정하여 서로 엉겨붙게 되고 효소활성도가 떨어지게 되는 반면, 상기 나노모터의 표면에 위치하는 요소분해효소의 경우 수용액 내에서의 안정성은 높게 유지되어 효소활성도가 보존는 것이다.
또한, 도 2의 g는 STING@nanocomplex 및 STING@nanomotor의 absorbance를 나타내고, h는 STING 길항제의 중성, 약산성 내에서의 방출 실험 결과를 나타낸다.
도면에 나타난 바와 같이, STING 길항제는 중성 및 약산성에서 60 시간 동안 천천히 나노모터로부터 방출되는 것을 확인할 수 있다.
실험예 2. STING 길항제 충진 키토산-헤파린 나노모터의의 수지상 세포 내로의 유입 및 활성화 분석.
(1) 방법
Murine 수지상세포(JAWS II)를 알파 MEM 배지에서 배양하였다. 수지상 세포는 미리 10 μg/ml의 크로프로마진 용액과 70 μg/ml의 제니스테인 용액을 통해 세포 표면의 receptor를 막았다. 그 후, FITC 형광체가 표지된 STING 길항제 충진 키토산-헤파린 나노모터를 2시간 동안 함께 배양하였다. STING 활성화 실험을 위하여, 수지상세포와 PBS, STING, nanomotor 및 STING@nanomotor를 12시간 동안 함께 배양하고, CD86, CD40을 통해 수지상세포의 활성도를 측정하였다.
(2) 결과
도 3의 a는 수지상 세포의 형광이미지로 STING@nanomotor의 수지상 세포로의 유입 유무를 나타낸 것이고, b 및 c는 수지상 세포의 표면의 여러 receptor를 막은 후, STING@nanomotor와 함께 배양하여 STING@nanomotor의 유입경로 메커니즘을 확인하여 나타낸 것이며, d 및 e는 STING@nanomotor의 수지상 세포 활성화를 나타낸다.
a에 나타난 바와 같이, STING@nanomotor는 수지상 세포 내로 유입 될 수 있으며, 시간이 지남에 따라 더 많은 양의 STING@nanomotor가 유입됨을 확인할 수 있다. 또한, b 및 c에 나타난 바와 같이, STING@nanomotor의 유입의 양이 변화함을 통해 유입 경로 메커니즘을 확인한 결과, 유입 메커니즘은 대부분 caveolin 및 clathrin receptor 관련 세포 유입임을 확인할 수 있다.
또한, d 및 e에 나타난 바와 같이, STING@nanomotor는 수지상 세포 내로 유입되어 수지상세포를 활성화시킬 수 있으며, STING 길항제는 나노모터로부터 빠져나와 수지상 세포를 활성화 시킬 수 있다. 수지상 세포표면의 CD 80, CD 40의 expression을 통해 수지상 세포의 활성도를 분석한 결과, 활성도는 CD 80, CD 40 표적 분자를 통해 확인할 수 있으며, 각각, 82.1 및 79.6%의 활성도를 가지는 것을 확인할 수 있다.
실험예 3. 비디오 녹화 및 나노모터 운동성 분석.
(1) 방법
광학 현미경이 사용하여 STING@nanomotor의 움직임을 비디오를 관찰하고 기록하였다.
나노모터의 수용액 샘플을 유리 슬라이드에 놓고 다양한 요소 수용액(0, 50, 100 및 200 mM의 농도)과 혼합하였다. STING@nanomotor의 운동은 40 fps의 프레임 속도로 15 초 동안 기록되었다. 조건 당 20 개 이상의 STING@nanomotor를 분석하고 STING@nanomotor의 추적 경로, 평균 제곱 변위(MSD) 및 속도를 파이썬 프로그램을 통해 자동으로 분석하였다. 그 후, MSD 데이터를 다음과 같은 식 1에 맞추어 속도를 얻었다.
<식 1>
MSD (Δt) = (VΔt)2 + 4DΔt
식 1에서, V는 속도, De는 유효 확산 계수를 나타내고, Δt는 시간 간격을 나타낸다.
2.5 배율의 광학현미경을 사용하여, STING@nanomotor 군집 운동성을 분석하였다.
2 ml의 PBS 및 요소 수용액이 든 petri dish에 5 μL의 STING@nanomotor 용액을 떨어뜨리고 90 초 동안 운동성을 측정하였다.
(2) 결과
요소분해효소로 구동되는 STING@nanomotor는 하기 식 2와 같이 요소를 암모니아와 이산화탄소로 전환한다.
<식 2>
(NH2)2CO + H2O → CO2 + 2NH3
비록 합성모터의 기하학적 비대칭이 추진을 생성하기 위한 중요한 필요 사항으로 여겨 왔지만, 최근의 연구에 따르면 나노모터 표면에 접합된 분자의 불균형 분포만으로도 효소의 생체 촉매 변환을 통해 추진되는 합성 모터의 추진에 충분하다는 것이 밝혀졌다. STING@nanomotor의 운동 프로파일은 0, 50, 100 및 200 mM의 요소 농도에서 평가되었다.
도 4의 a 및 b는 MSD 데이터 및 속도를 나타낸다. 도 4에서 추적 궤도는 초당 40 프레임으로 15 초 동안 기록되었다. 또한, 속도와 평균 제곱 변위(MSD)를 추적된 궤도를 통해 계산하였다.
요소가 없으면, STING@nanomotor는 브라운 운동을 보였으며 방향성을 나타내지 않았다. 그러나, 요소가 첨가된 후(50, 100 및 200 mM), STING@nanomotor는 각각 향상된 속도를 보였으며 방향성을 가지는 것을 확인할 수 있다. MSD는 비선형적으로 증가하는 것을 확인할 수 있으며, 요소 농도가 증가함에 따라 더 높은 변화율을 가지는 것을 확인할 수 있다.
또한, 도 4의 c는 90 초 동안의 STING@nanomotor 군집의 확산 영역을 나타낸다.
요소가 없으면, STING@nanomotor 군집은 거의 확장되지 않았다. 반면에, 요소가 첨가된 용액에 떨어뜨린 STING@nanomotor 군집은 빠르게 확장되었으며 90 초 후에 더 많은 영역으로 퍼져 나가는 것을 확인할 수 있다. 또한, 이 영역은 요소 농도와 연관이 있음을 확인할 수 있다. 상기 결과로부터, 요소농도가 높은 방광내에서 STING@nanomotor 군집이 효과적으로 방광내에서 움직이는지를 확인할 수 있다.
실험예 4. 생체 영상 측정
(1) 방법
나노모터의 방광 벽 침투 및 방광 내 잔류 능력을 조사하기 위하여, 형광 물질을 nanomotor 표면에 표지하였다. 또한, 대조군으로서 추진 능력이 없는 nanocomplex에도 형광물질을 표지하였다.
nanocomplex 및 nanomotor를 FITC 형광 염료로 라벨링하기 위하여, 100 μL의 FITC 용액(1 mM)을 2 mL의 nanocomplex 및 nanomotor 수용액에 각각 첨가하였다. 혼합물을 12 시간동안 실온에서 배양하여 반응을 진행하였다. 이어서, 표지된 nanocomplex 및 nanomotor 용액을 원심분리를 통해 반응하지 않은 FITC 분자를 제거하였다.
Balb/c 암컷 쥐를 무작위로 두 그룹(nanomotor, nanocomplex)(n=3)으로 나누고, 쥐를 흡입마취를 통해 마취시켰다. 형광 표지된 샘플 50 μL 현탁액을 카테터를 통해 방광 내로 투여하였다. 투여 후, 마우스를 희생시키고, 방광 벽을 관찰하기 위해 그대로 방광을 절개하고 절단하였다. 이어서, 조직을 PBS로 헹구고 평평하게 하고, 이광자 현광 현미경을 사용하여 시각화하였다. 이미지를 512×512 픽셀에서 Z-스택(xyz, 400 Hz)으로 수집하고 Leica의 LAS AF Lite 2.6.1로 분석하였다. 방광 내 나노모터의 잔류를 확인하기 위해, 12 시간 후에 방광을 희생된 쥐로부터 추출하고 절제하여 4% paraformaldehyde에 고정시켰다. 고정된 방광은 파라핀 블록에 매립되었고, H&E 염색을 위해 4 μm 두께의 섹션이 만들어졌다. 염색된 부분을 광학 현미경으로 관찰하였다. 또한, 12 시간 후 IVIS 이미징을 통해 생체 영상 이미지를 얻었다.
(2) 결과
그 결과를 도 5에 나타내었다. 도 5의 a는 방광내 침투 및 잔류효능을 확인하기 위한 생체영상 측정 모식도를 나타낸다.
생체영상은 세가지 방법으로 측정하는데, 이광자 현미경을 통해 방광 벽 내로의 침투정도를 확인하였고, 방광조직의 단면을 통해 형광 이미지를 얻었다. 또한, IVIS 이미지를 통해 전체적인 방광내 조직 내의 샘플 잔류를 확인하였다.
도 5의 b, c 및 d는 이광자 현미경을 통해 측정된 방광조직 및 침투 깊이에 따른 형광세기를 나타낸다.
도면에 나타난 바와 같이, nanocomplex 그룹의 경우 120 분 동안 방광 벽내로 침투가 nanomotor 그룹보다 현저히 떨어짐을 확인할 수 있다.
도 5의 e는 nanocomplex와 nanomotor 주입 12 시간 후 방광 형광 이미지를 나타낸다.
도면에 나타난 바와 같이, 12 시간 후 추출된 방광조직의 단면을 통해 nanomotor 그룹이 nanocomplex 그룹보다 훨씬 높은 잔류를 확인할 수 있다.
또한, 도 5의 f 및 g는 IVIS 이미징을 통해 얻은 전체적인 IVIS 이미지 방광이미지 및 형광 세기를 나타낸다.
도면에 나타난 바와 같이, nanomotor 그룹에서 nanocomplex 그룹보다 더 높은 형광세기를 확인할 수 있다. 이를 통해 nanomotor 그룹에서 방광 내 주입된 후, 더 높은 침투능력과 잔류능력을 확인할 수 있다.
실험예 5. 방광암 모델 제작 및 방광암 치료 효능 확인.
(1) 방법
8주령 C57BL/6J 마우스를 사용하여 방광암 모델을 제작하였다. MB49 세포를 방광암 모델 제작에 사용하였다. 먼저, 암세포의 implantation 효능을 향상시키기 위해 100 μL의 HCl 을 3 분 동안 방광에 주입하였다. 그 후, 100 μL의 1 x 106 세포가 들어있는 PBS 용액을 방광 내로 24 G angiocath 카테터를 통해 주입하였다. 항암 효과를 확인하기 위해, 방광암 세포 주입 후 4 일, 8 일 후에 STING(10 μg/100 μl), 나노모터(nanomotor), STING 길항제 충진 나노복합체(STING@nanocomplex)(10 μg for STING/100 μl), STING 길항제 충진 나노모터(STING@nanomotor)(10 μg for STING/100 μl)를 방광내로 주입하였다.
방광은 RNA 추출을 위해 갈고 전체 RNA는 cDNA로 역전사하였다. 실시간 중합 효소 연쇄 반응기(RT-PCR)를 통해 cytokine을 확인하였다. GAPDH를 레퍼런스 gene으로 사용하였다. PCR 프라이머 시퀀스는 하기 표 1에 기재하였다.
| GAPDH | Forward | AGGTCGGTGTGAACGGATTTG | 서열번호 1 |
| Reverse | TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA | 서열번호 2 | |
| IL-1βq | Forward | GCAACTGTTCCTGAACTCAACT | 서열번호 3 |
| Reverse | ATCTTTTGGGGTCCGTCAACT | 서열번호 4 | |
| IL-6 | Forward | TGGGGCTCTTCAAAAGCTCC | 서열번호 5 |
| Reverse | AGGAACTATCACCGGATCTTCAA | 서열번호 6 | |
| IFN β | Forward | CAGCTCCAAGAAAGGACGAAC | 서열번호 7 |
| Reverse | GGCAGTGTAACTCTTCTGCAT | 서열번호 8 | |
| CXCL10 | Forward | CCAAGTGCTGCCGTCATTTTC | 서열번호 9 |
| Reverse | GGCTCGCAGGGATGATTTCAA | 서열번호 10 |
(2) 결과
도 6의 a는 방광암 모델 제작 및 치료 스케줄을 나타낸다.
본 실험예에서는 방광암 세포 주입 4 일, 8 일 후 치료를 하였으며, 2 주 후에 방광조직을 떼내어 항암효과를 확인하였다.
도 6의 b, c 및 d는 2 주 후, 방광의 단면도, 암 조직 두께 및 면역세포 수를 나타낸다.
도면에 나타난 바와 같이, STING@nanomotor 그룹에서 가장 높은 항암효과를 확인할 수 있으며, 이는 면역세포 수의 증가에 따른 결과임을 확인할 수 있다. 세포독성을 가진 T 세포는 방광내로 유입 되어, 방광암을 효과적으로 죽일 수 있음을 확인할 수 있다.
또한, 도 6의 e는 면역관련 mRNA expression 비교 결과를 나타낸다. IL-6, IL-1B, IFN B, CXCL10를 측정하였으며, 이는 면역반응과 관련된 mRNA이다.
도면에 나타난 바와 같이, STING@nanomotor 그룹에서 가장 높은 mRNA expression을 확인할 수 있다.
실시예 2. STING 길항제 충진 PLGA 나노모터 합성
(1) PLGA 나노입자 합성
PLGA는 Methylene chloride에 2 wt%로 용해되어 준비되고(PLGA 용액), PVA(poly(vinyl alcohol))은 증류수에 용해되어 준비되었다(PVA 용액). 상기 PVA 용액에 PLGA 용액을 조금씩 떨어뜨렸다. 그 후, 5 분동안 초음파를 가하여 입자를 형성하고, 상기 입자가 형성된 수용액을 증발시켜 입자만을 수득하였다.
(2) STING 길항제 충진 PLGA 나노입자 합성
아민 그룹 접합 PLGA 나노입자를 0.5 ml 다이클로로메탄 유기용매에 20 mg/ml로 녹였다. 상기 용액을 폴리비닐알코올(10 mg/ml), STING 길항제(2 mg/ml)를 포함하는 수용액 2 ml에 드롭 바이 드롭 형태로 첨가하였다. 팁소니케이터를 통해 입자 균질화 작업을 진행하였다(입자 현탁액 제조).
입자 현탁액을 40 ml 물에 드롭 바이 드롭 형태로 첨가하고, 유기용매를 휘발시키기 위해 3 시간동안 후드내에서 반응을 진행하였다. 원심분리(8000 rpm에서 5 분 수행)를 통해 분리하였다.
(3) STING 길항제 충진 PLGA 나노모터 합성
1 ml의 요소분해효소(2 mg/ml)를 3 ml의 글루타알데하이드 수용액(2.5 %)에 반응시켰다. 반응하지 않은 글루타알데하이드를 제거하기 위하여, 3일 동안 투석하였다.
그 후, 1 ml의 활성화된 요소분해효소를 (2)에서 합성된 나노입자 수용액에 첨가하고, 1 시간 동안 반응시켰다. 그 후, PLGA 나노모터 용액을 PBS로 3 회 세척한 후 원심 분리(8000 rpm에서 5 분 수행)하였다.
Claims (16)
- 생체적합성 고분자 나노입자; 및
상기 생체적합성 고분자 나노입자의 표면에 결합된 요소분해효소를 포함하고,
상기 생체적합성 고분자 나노입자는 키토산, 헤파린 및 PLGA(poly(Poly(lactide-co-glycolide))로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상을 포함하며,
상기 요소분해효소는 요소의 존재하에서 기체를 발생시켜 나노모터의 자가 추진을 유도하는 것인 생체적합성 고분자 나노모터.
- 제 1 항에 있어서,
생체적합성 고분자 나노입자는 키토산-헤파린 나노복합체인 생체적합성 고분자 나노모터.
- 제 2 항에 있어서,
키토산-헤파린 나노복합체는 키토산의 아민기와 헤파린의 설페이트기가 이온 결합(ionic crosslinking)을 통해 복합체를 형성하는 것인 생체적합성 고분자 나노모터.
- 제 1 항에 있어서,
생체적합성 고분자 나노입자는 PLGA 나노입자이며,
상기 PLGA 나노입자의 표면은 아민기로 개질된 것인 생체적합성 고분자 나노모터.
- 제 1 항에 있어서,
다이알데하이드 화합물을 링커로 요소분해효소의 아민기와 생체적합성 고분자의 표면의 아민기가 결합을 형성하는 것인 생체적합성 고분자 나노모터.
- 제 1 항에 있어서,
생체적합성 고분자 나노모터의 크기는 200 내지 1,000 nm인 생체적합성 고분자 나노모터.
- 제 1 항에 있어서,
생체적합성 고분자 나노입자의 내부에 충진된 약물을 추가로 포함하는 것인 생체적합성 고분자 나노모터.
- 제 7 항에 있어서,
약물은 STING 길항제인 생체적합성 고분자 나노모터.
- 제 1 항에 있어서,
생체적합성 고분자 나노입자의 표면에 결합된 약물을 추가로 포함하며,
상기 약물은 파클리탁셀, 텍소티어, 아드리아마이신, 엔도스타틴, 앤지오스타틴, 미토마이신, 블레오마이신, 시스플레틴, 카보플레틴, 독소루비신, 다우노루비신, 이다루비신, 5-플로로우라실 및 메토트렉세이트, 엑티노마이신-D로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 항암제인 생체적합성 고분자 나노모터.
- 제 1 항에 있어서,
과민성 방광, 간질성 방광염 및 방광암으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 방광 질환의 치료용으로 사용되는 것인 생체적합성 고분자 나노모터.
- 생체적합성 고분자 나노입자의 표면에 요소분해효소를 결합시켜 요소분해효소가 결합된 생체적합성 고분자 나노입자를 제조하는 단계를 포함하며,
상기 생체적합성 고분자 나노입자는 키토산, 헤파린 및 PLGA(poly(Poly(lactide-co-glycolide))로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는, 제 1 항에 따른 생체적합성 고분자 나노모터의 제조 방법.
- 제 11 항에 있어서,
요소분해효소가 결합된 생체적합성 고분자 나노입자를 제조하는 단계는 다이알데하이드 화합물을 링커로 생체적합성 고분자 나노입자의 표면의 아민기와 요소분해효소의 아민기가 결합을 형성하는 것인 생체적합성 고분자 나노모터의 제조 방법.
- 제 11 항에 있어서,
키토산 및 헤파린을 이온 결합시켜 키토산-헤파린 나노복합체를 제조하는 단계; 및
상기 키토산-헤파린 나노복합체의 표면에 요소분해효소를 결합시켜 요소분해효소가 결합된 키토산-헤파린 나노복합체를 제조하는 단계를 포함하는 생체적합성 고분자 나노모터의 제조 방법.
- 제 11 항에 있어서,
표면에 아민기가 접합된 PLGA 나노입자의 표면에 요소분해효소를 결합시켜 요소분해효소가 결합된 PLGA 나노입자를 제조하는 단계를 포함하는 생체적합성 고분자 나노모터의 제조 방법.
- 제 11 항에 있어서,
생체적합성 고분자 나노입자의 내부에 STING 길항제를 충진시키는 단계를 추가로 포함하는 것인 생체적합성 고분자 나노모터의 제조 방법.
- 제 1 항에 따른 생체적합성 고분자 나노모터를 포함하는 약물 전달체용 담체.
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