ES2967598T3 - Nanomotores funcionalizados impulsados por enzimas - Google Patents

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Ordonez Samuel Sanchez
Padial Tania Patino
Hortelão Ana Candida Lopes
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Abstract

La presente invención proporciona un nanomotor impulsado por una enzima, que comprende una partícula con una superficie, una enzima y una molécula heteróloga; caracterizado porque la enzima y la molécula heteróloga están unidas de forma discontinua sobre toda la superficie de la partícula. La invención también proporciona el nanomotor para uso en terapia, diagnóstico y pronóstico, en particular, para el tratamiento del cáncer. Además, la invención proporciona el uso del nanomotor para detectar un analito en una muestra aislada. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Nanomotores funcionalizados impulsados por enzimas
Campo de la técnica
La presente invención pertenece al campo de la nanotecnología. En particular, la invención se refiere a nanomotores impulsados por enzimas externamente funcionalizados. Los nanomotores de la invención son particularmente útiles para terapia y biodetección.
Estado de la técnica
Los micronadadores catalíticos son sistemas artificiales capaces de autopropulsarse gracias a la conversión de energía química en una fuerza mecánica que finalmente se traduce en movimiento activo.
Si bien los micro y nanomotores impulsados químicamente han demostrado una aplicabilidad prometedora en muchos campos, tales como la remediación ambiental, el transporte y el suministro de carga, la penetración de tejidos y células y el suministro activo de fármacos al estómagoin vivo,su implementación en la biomedicina a menudo está restringida por la toxicidad inherente del combustible o su disponibilidad limitada dentro del organismo.
Recientemente, el uso de catálisis enzimática ha surgido como una alternativa atractiva para reemplazar los combustibles tóxicos de uso común, ya que ofrece características únicas que incluyen biocompatibilidad, versatilidad y biodisponibilidad. En este sentido, se ha demostrado que el uso de ureasa, catalasa y glucosa oxidasa aumenta la difusión de partículas de tamaño nanométrico a concentraciones fisiológicamente relevantes del sustrato enzimático. Además, se puede lograr una propulsión direccional cuando se usa ureasa para impulsar partículas huecas de sílice Janus, es decir, partículas con dos hemisferios en los que solo uno de ellos está acoplado a la enzima. Su movimiento puede activarse y desactivarse mediante la adición de sales inhibidoras de enzimas y las trayectorias pueden modificarse bajo demanda mediante la aplicación de un campo magnético, lo que permite un alto grado de controlabilidad (Xing MA y otros, “Motion Control of Urea-Powered Biocompatible Hollow Microcapsules”, ACS Nano., 2016, vol. 10(3), pp. 3597-605).
También se ha descrito el uso de nanomotores propulsados por enzimas para aumentar la eficiencia de suministro de doxorrubicina a las células cancerosasin vitro(Ana C. Hortelao y otros, “Enzyme-Powered Nanobots Enhance Anticancer Drug Delivery”, Advanced Functional Materials, 2017, vol. 28(25)).
Sin embargo, la producción de partículas de Janus esféricas implica técnicas costosas y lentas que pueden comprometer su escalabilidad y, por lo tanto, su aplicabilidad.
Más recientemente, y a pesar del hecho de que tradicionalmente se ha reivindicado que una estructura asimétrica y una distribución del catalizador son esenciales para la generación de movimiento activo, se demostró la autopropulsión de motores esféricos no Janus impulsados por catálisis enzimática ubicados sobre la superficie de partícula completa (Patino T. y otros, “Influence of Enzyme Quantity and Distribution on the Self-Propulsion of Non-Janus Urease-Powered Micromotors”, J. Am. Chem. Soc., 2018, vol. 140(25), pp. 7896-7903). Sin embargo, el movimiento de este tipo de nanomotores demostró ser extremadamente sensible a la cobertura enzimática. De hecho, se encontró que era necesaria una gran cantidad de moléculas de enzimas por nanomotor para lograr el movimiento deseado. Esto ha obstaculizado fuertemente el uso y la aplicabilidad de estos nanomotores debido a las limitaciones que impone a la funcionalización externa.
Por lo tanto, a pesar de los esfuerzos realizados hasta ahora, todavía existe una necesidad de nanomotores impulsados por enzimas que sean fáciles de producir y de adaptarse a diversas aplicaciones mientras se mantiene una alta capacidad de movimiento.
Resumen de la invención
Los presentes inventores han desarrollado nuevos nanomotores funcionalizados propulsados por enzimas que son útiles en una variedad de aplicaciones biomédicas, químicas y medioambientales.
Sorprendentemente, los inventores encontraron que al unir externamente una molécula a nanomotores no Janus impulsados por enzimas, podían mantener o incluso aumentar los patrones de velocidad y movimiento de las partículas (véase, figura 2D y figura 7B).
Esto fue muy inesperado, ya que se demostró anteriormente que los nanomotores en los que las enzimas de propulsión están unidas sobre toda la superficie de la partícula tienen un movimiento que depende en gran medida de la cobertura enzimática. Por lo tanto, cuando el número de enzimas cae por debajo de un umbral dado, se demostró que el movimiento de la partícula estaba completamente abolido (Patiño T. y otros, supra). Por lo tanto, era evidente que cualquier modificación realizada en la superficie de estas partículas, que necesariamente reduce la superficie disponible para la unión de la enzima, se espera que reduzca la capacidad de movimiento del nanomotor y, por lo tanto, su aplicabilidad.
Como se muestra en los ejemplos a continuación, los inventores han descubierto que la unión externa de diferentes tipos de moléculas voluminosas, tales como anticuerpos o estructuras de ADN, no solo no afecta el movimiento de los nanomotores, sino que también aumenta su capacidad de penetración celular, estabilidad y evita su agregación. La figura 4 muestra la mayor capacidad de los nanomotores funcionalizados con un anticuerpo para penetrar en las células tumorales a pesar de carecer de péptidos de penetración celular.
Además, los inventores encontraron sorprendentemente que los nanomotores impulsados por enzimas funcionalizados proporcionados en la presente descripción presentan una actividad tan fuerte que son capaces de aumentar la muerte de las células cancerosas incluso cuando no están cargadas con ningún fármaco citotóxico (véase, figura 4D). Esto constituye una gran ventaja porque permite el desarrollo de tratamientos contra el cáncer con mayor especificidad y menores efectos secundarios.
Una ventaja importante de los nanomotores de la invención es su versatilidad-pueden diseñarse por ingeniería genética con diferentes enzimas para hacerlos activos solo en los lugares donde está presente el sustrato. Esto proporciona además la ventaja de permitir el desarrollo de tratamientos con altos efectos específicos y bajos efectos secundarios.
En vista de lo anterior, los nanomotores de la invención proporcionan una herramienta muy valiosa útil en una variedad de campos tales como el tratamiento de enfermedades y la biodetección.
Por tanto, en un primer aspecto, la invención proporciona un nanomotor impulsado por enzimas, que comprende una partícula con una superficie; una enzima y una molécula heteróloga; caracterizado porque la enzima y la molécula heteróloga están unidas de forma discontinua sobre toda la superficie de la partícula.
En un segundo aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz del nanomotor como se definió en el primer aspecto, y un excipiente y/o portador farmacéuticamente aceptable.
En un tercer aspecto, la invención proporciona el nanomotor como se definió en el primer aspecto o la composición farmacéutica como se definió en el segundo aspecto, para el uso en terapia, diagnóstico o pronóstico.
En un cuarto aspecto, la invención proporciona un kit de partes que comprende un nanomotor como se definió en el primer aspecto o la composición farmacéutica como se definió en el segundo aspecto, y, instrucciones para su uso. La invención también proporciona un kit de partes que comprende un nanomotor como se definió en el primer aspecto o la composición farmacéutica como se definió en el segundo aspecto e instrucciones para su uso. El estuche de la invención puede comprender además un tampón adecuado para diluir los nanomotores de la invención, o un tampón para resuspender los nanomotores secos o liofilizados de la invención.
En un quinto aspecto, la invención proporciona un método in vitro para detectar un analito en una muestra aislada, que comprende poner en contacto el nanomotor como se definió en el primer aspecto con la muestra.
En un sexto aspecto, la invención proporciona el uso del nanomotor como se definió en el primer aspecto en un método in vitro para detectar un analito en una muestra aislada.
Breve descripción de los dibujos
Fig. 1, con relación al ejemplo 1, muestra la fabricación y caracterización de nanomotores de ureasa/PEG (MSNP-Ur/PEG) y nanomotores de anticuerpo-ureasa modificada (MSNP-Ur/PEG-Ab). Esquema que ilustra el proceso de fabricación etapa a etapa para obtener los nanomotores.
Fig. 2, con relación al ejemplo 1, muestran el análisis de movimiento de MSNP-Ur/PEG y MSNP-Ur/PEG-Ab. Trayectorias de seguimiento representativas de 2A) nanomotores de MSNP-Ur/PEG y 2B) nanomotores de MSNP-Ur/PEG-Ab a 0 mM, 50 mM y 100 mM de urea y 2C) desplazamientos medios cuadrados representativos (MSD) de ambos tipos de nanomotores en 0 mM, 50 mM y 100 mM. 2<d>) Coeficientes de difusión eficaces obtenidos por análisis de MSD a diferentes concentraciones de urea (N=20, las barras de error representan SE,p<0.001).
Fig. 3, con relación al ejemplo 1, muestra el efecto de nanomotores con y sin anticuerpo sobre la viabilidad de los esferoides en presencia de diferentes concentraciones de urea. Cuantificación de la viabilidad de los esferoides después de 4 horas de incubación con MSNP-Ur/PEG (originalmente en azul) y MSNP-Ur/PEG-Ab (originalmente en rojo), a diferentes concentraciones de urea (N=3, las barras de error representan SE).
Fig. 4, con relación al ejemplo 1, muestra las capacidades de direccionamiento y penetración de nanomotores modificados con anticuerpos en esferoides de cáncer de vejiga. Cuantificación de la internalización de nanomotores modificados con anticuerpos en esferoides de cáncer de vejiga en presencia (40 mM) y ausencia de urea después de 4 horas de incubación, y cuantificación de la proliferación de esferoides incubados con MSNP-Ur/PEG y MSNP-Ur/PEG-Ab durante 4 horas, en presencia (40 mM) y ausencia de urea después de medido al cabo de un período de reposo de 48 horas.
Fig. 5, con relación al ejemplo 2, muestran el enfoque de fabricación y la caracterización de micromotores de ADN.
5A) Representación esquemática de la fabricación de micromotores, donde se hace crecer una capa de dióxido de silicio sobre una plantilla de poliestireno comercial mediante la adición de precursores de sílice APTES y TEOS. A continuación, el núcleo de poliestireno se elimina mediante DMF y las microcápsulas se funcionalizan con ureasa y un andamio de ADN a través del uso de un enlazador de glutaraldehído (GA). 5B) El nanointerruptor de ADN sensible al pH se hibrida con el andamio de ADN complementario que está unido covalentemente en el micromotor. La autopropulsión se logra mediante la conversión de urea en amoníaco y dióxido de carbono, mediada por la enzima ureasa. 5C) La transición de triple a dúplex dependiente del pH del nanointerruptor de ADN unimolecular da como resultado un cambio de la eficiencia de FRET. 5D) Micrografía electrónica de barrido de microcápsulas de SiO<2>. El recuadro muestra una ampliación del área seleccionada. Barra de escala = 2 pm. 5E) Imagen topográfica obtenida por microscopía electrónica de transmisión. La barra de calibración indica la altura en pm. 5F) Mediciones del potencial Z de la superficie de la micropartícula a lo largo del proceso de funcionalización (NH2 = partículas recubiertas de amina resultantes de la síntesis; GA=micropartículas después de la incubación con glutaraldehído, UR=micropartículas funcionalizadas con ureasa; UR ADNss = micropartículas funcionalizadas con ambos ureasa y andamio de ADN; Interruptor = micropartículas funcionalizadas con ureasa y andamio de ADN, después de su hibridación con el interruptor de ADN durante 30 min.)
Fig. 6, con relación al ejemplo 2, muestra que el nanointerruptor de ADN sensible al pH basado en triple es capaz de detectar cambios de pH en solución y conjugado con la estructura del micromotor. 6A) El nanointerruptor de ADN triple forma una estructura de horquilla doble intramolecular a través de la formación de interacciones de Watson-Crick insensibles al pH (línea discontinua) e interacciones de Hoogsteen sensibles al pH (puntos). El nanointerruptor triple que contiene tripletes de CGC y TAT se despliega en una conformación dúplex al aumentar el pH de la solución. Emisión FRET radiométrica (izquierda) que muestra la transición de triple a dúplex del nanointerruptor de ADN en función de los cambios de pH en la solución. 6B) Análisis CSLM del efecto FRET de micropartículas funcionalizadas con nanointerruptor de ADN, que muestra de derecha a izquierda el canal Cy3, el canal FRE<t>y el valor de la relación FRET/Cy3, indicado en la barra de calibración. Barra de escala = 2 pm. Las flechas blancas indican las micropartículas funcionalizadas (originalmente en rojo para el canal Cy3, en verde para el canal FRET y amarillo para la fusión Cy3/FRET). Medición cuantitativa de pH mediante micromotores funcionalizados con ADN para sensibles al pH (6C) y no específicos al pH (6D), mostrados como los valores medios de emisión de FRET/Cy3, mostrados como la media ± error estándar de la media.
Fig. 7, con relación al ejemplo 2. 7A) MSD de micromotores con interruptores de ADN. Los resultados se muestran como la media ± error estándar de la media. 7B) Velocidad calculada a partir de los MSD. Los resultados se muestran como la media ± error estándar de la media.
Descripción detallada de la invención
Todos los términos como se usan aquí en esta solicitud, a menos que se indique lo contrario, se entenderán en su significado ordinario como se conoce en la técnica. Otras definiciones más específicas para ciertos términos como se usan en la presente solicitud son las que se exponen a continuación y se pretende que se apliquen uniformemente a lo largo de la especificación y las reivindicaciones, a menos que una definición expresamente establecida de otro modo proporcione una definición más amplia.
Como se usa en la presente descripción, los artículos indefinidos “un” y “una” son sinónimos de “al menos uno” o “uno o más.” A menos que se indique lo contrario, los artículos definidos usados en la presente descripción, tales como “el”, también incluyen el plural del sustantivo.
El término “nanomotor propulsado por enzimas” o “nanomotor impulsado por enzimas” se refiere a un dispositivo molecular, a una escala micro o nano, capaz de convertir energía química en movimiento a través de la acción de una enzima ubicada en la superficie del dispositivo. En otras palabras, un nanomotor es una nanopartícula o una micropartícula funcionalizada externamente con enzimas. Sin estar limitados por la teoría, las enzimas generan movimiento a través de la liberación asimétrica de productos involucrados en la reacción catalítica al crear fuerzas interfaciales que dependen de gradientes osmóticos, cargas u otras propiedades. Los términos “nanomotor” y “micromotor” se usan indistintamente en la presente solicitud.
Como se usa en la presente descripción, “molécula heteróloga” se refiere a cualquier molécula diferente de la(s) enzima(s), dicha(s) enzima(s) a cargo de la propulsión del nanomotor, y que está unida de forma discontinua sobre toda la superficie de la partícula. De este modo, las modalidades permiten básicamente que cualquier tipo de molécula que pueda unirse a la partícula se inmovilice sobre una superficie a través de su conexión directa o indirecta a la partícula.
La lista de moléculas heterólogas proporcionada a continuación debe verse simplemente como una lista ilustrativa y no limitante de moléculas que podrían usarse en los nanomotores de la invención. Sin embargo, las modalidades no se limitan a las mismas y abarcan cualquier molécula heteróloga que pueda unirse directa o indirectamente a un nanomotor de las modalidades.
La molécula heteróloga de interés podría seleccionarse entre marcadores, tales como marcadores fluorescentes, es decir, un fluoróforo, por ejemplo, isotiocianato de fluoresceína (FITC), isotiocianato de tetrametilrodamina (TRITC) y otros isotiocianatos; fluoresceína de N-hidroxisuccinimida (NHS) y otros ésteres de succinimidilo; fluoresceína-5-maleimida y otros fluoróforos activados por maleimida; fluoróforos de cianina; fluoróforos de fluoresceína; fluoróforos de rodamina; tintes ATTO; tintes DyLight Fluor; tintes Alexa Fluor y colorantes de boro-dipirrometeno (BODIPY). Otros ejemplos incluyen marcadores o marcadores isotópicos, marcadores quimioluminiscentes, marcadores radiopacos, etc. En tal caso, el nanomotor puede usarse como una molécula de prueba para permitir la detección, mediante el uso del marcador, del nanomotor en una superficie.
Otros ejemplos de moléculas heterólogas incluyen moléculas de adhesión celular y de unión celular, tales como moléculas de adhesión celular (CAM), incluida la superfamilia de inmunoglobulinas (Ig), integrinas, cadherinas y selectinas.
Otro ejemplo de una molécula heteróloga son las moléculas de matriz extracelular (ECM) que incluyen, por ejemplo, proteoglicanos (PG), glicosaminoglicanos (GAG), heparán sulfato (HS), condroitín sulfatos, queratín sulfatos, colágeno, elastinas, etc.
Un tipo de molecular relacionado de interés son las moléculas de lámina basal que incluyen moléculas de la lámina basal, que es una capa de ECM secretada por las células epiteliales. Los ejemplos no limitantes de tales moléculas de lámina basal incluyen laminina, colágeno de tipo IV, entactina y perlecano.
Otro ejemplo más de una molécula de interés heteróloga es una molécula antiinflamatoria, tal como corticosteroides; glucocorticoides; fármacos antiinflamatorios no esteroideos (NSAID), tal como ácido acetilsalicílico, ácido iso-butilpropanoico-fenólico y naproxeno sódico (INN); lipoxinas; antagonista del receptor de interleuquina-1 (IL-1RA); etc.
Los antibióticos también se pueden usar como moléculas heterólogas de interés para inhibir el crecimiento bacteriano o matar bacterias. Los ejemplos no limitantes de antibióticos incluyen penicilinas; cefalosporinas; polimixinas; rifamicinas; lipiarmicinas; quinolonas; sulfonamidas; macrólidos; lincosamidas; tetraciclinas; aminoglucósidos bactericidas; lipopéptidos cíclicos, tales como daptomicina; glicilcilinas, tales como tigeciclina; oxazolidonas, tales como linezolid y lipiarmicinas, tal como fidaxomicina.
De manera similar, moléculas que se dirigen a otros tipos de microbios, tales como moléculas antifúngicas, por ejemplo, antifúngicos poliénicos, tales como anfotericina B, candicidina, filipina, hamicina, natamicina, nistatina y rimocidina; antifúngicos azólicos, tales como imidazoles, por ejemplo bifonazol, butoconazol, clotrimazol, econazol, fenticonazol, isoconazol, miconazol, omoconazol, oxiconazol, sertaconazol, sulconazol y tioconazol; triazoles, por ejemplo, albaconazol, fluconazol, isavuconazol, itraconazol, posaconazol, ravuconazol, terconazol y voriconazol y tiazoles, por ejemplo, abafungina; alilaminas, tales como amorolfina, butenafina, naftifina y terbinafina; equinocandinas, tales como anidulafungina, caspofungina y micafungina; ácido benzoico; ciclopirox olamina; flucitosina; griseofulvina; tolnaftato y ácido undecilénico. También moléculas antivirales, por ejemplo, anticuerpos antiidiotípicos de proteína asistida por virus (VAP); amantadina; rimantadina; pleconaril; aciclovir; zidovudina (AZT); lamivudina; integrasa; fomivirsen; rifampicina; zanamivir y oseltamivir, y moléculas antiparasitarias, tales como mebendazol; pamoato de pirantel; tiabendazol; dietilcarbamazina; ivermectrina; niclosamida; praziquantel; albendazol; praziquantel; rifampicina; anfotericina B; melarosprol; elfornitina; metronidazol; tinidazol y miltefosina, podrían usarse como molécula heteróloga de interés.
Otro ejemplo de moléculas heterólogas incluyen factores de crecimiento, tales como adenomedulina (AM), angiopoyetina (Ang), factor de motilidad autocrina, proteínas morfogenéticas óseas (BMP), factor neutrófico derivado del cerebro (BDNF), factor de crecimiento epidérmico (EGF), eritropoyetina (EPO), factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), factor neutrófico derivado de la línea celular glial (GDNF), factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF), factor de diferenciación del crecimiento-9 (GDF9), factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), factor de crecimiento derivado de hepatoma (HDGF), factor de crecimiento similar a la insulina (IGF), mistatina (GDF-8), factor de crecimiento nervioso (NGF), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), trombopoyetina (TPO), factor de crecimiento transformante alfa (TGF-a), factor de crecimiento transformante beta (TGF-p), factor de necrosis tumoral alfa (TNF-a), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), factor de crecimiento placentario (PIGF), etc. Un nanomotor con un factor de crecimiento unido a un péptido de unión a la superficie puede usarse para proporcionar una superficie con, por ejemplo, capacidad de estimular el crecimiento celular, la proliferación y/o la diferenciación celular.
Otros ejemplos de moléculas heterólogas de interés incluyen inhibidores del crecimiento celular y agentes quimioterapéuticos. Este tipo de moléculas heterólogas, cuando se incluyen en el nanomotor, proporcionan un efecto inhibidor del crecimiento celular local. Los ejemplos no limitantes de tales moléculas heterólogas de interés incluyen inhibidores de farnesil transferasa; agentes alquilantes, tales como mostazas de nitrógeno, por ejemplo, mecloretamina, ciclofosfamida, melfalán, clorambucil, ifosfamida y busulfán; nitrosoureas, por ejemplo, N-nitroso-N-metilurea (MNU), carmustina (BCNU), lomustina (CCNU), semustina (MeCCNU), fotemustina y estreptozotocina; tetrazinas, por ejemplo, dacarbazina, mitozolomida y temozolomida y aziridinas, por ejemplo, tiotepa, mitomicina, diaziquona (AZQ) y cisplatinos, por ejemplo, cisplatino, carboplatino y oxaplatino; antimetabolitos, tales como antifolatos, por ejemplo, metotrexato y pemetrexed; fluropirimidinas, por ejemplo, fluorouracilo y capecitabina; análogos de deoxinucleósidos, tales como citarabina, gemcitabina, decitabina, Vidaza, fludarabina, nelarabina, cladribina, clofarabina y pentostatina y tiopurinas, por ejemplo, tiguanina y mercaptopurina; agentes anti-microtúbulos, tales como alcaloides de la vinca, por ejemplo, vincristina, vinblastina, vinorelbina, vindesina y vinflunina y taxanos, por ejemplo, paclitaxel y docetaxel y podofilotoxina; inhibidores de topoisomerasa, tales como irinotecan, topotecan, captotecina, etopósido, doxorrubicina, mitoxantrona, tenipósido, novobiocina, merbarona y aclarrubicina; antibióticos citotóxicos, tales como antraciclinas, por ejemplo, doxorrubicina, daunorrubicina, epirrubicina, idarrubicina, pirarrubicina, aclarrubicina, mitoxantrona, actinomicina, bleomicina, plicamicina y mitomicina.
Otros grupos de moléculas heterólogas de interés incluyen polinucleótidos tales como moléculas de ADN o ARN. La molécula heteróloga también puede ser un nanosensor o una puerta molecular.
“Unido de forma discontinua sobre toda la superficie” se refiere a una distribución discreta que no está restringida a una sola cara o hemisferio de la partícula, es decir, se refiere a una distribución no polar. Sin embargo, no significa que la molécula cubra toda la superficie de la partícula de manera homogénea. Las partículas de la invención pueden presentar las moléculas unidas externamente al formar parches discretos sobre toda la superficie de la partícula, o lo que es lo mismo, al presentar brechas en donde no se unen moléculas.
Como se usa en la presente descripción, “molécula dirigida” se refiere a una molécula que tiene especificidad para una célula, tejido u órgano particular. Los ejemplos preferidos de moléculas dirigidas incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos, factores de crecimiento y polisacáridos.
Como se usa en la presente descripción, “nanosensor” se refiere a cualquier dispositivo sensor de nano o microescala. Los nanosensores de la invención son capaces de detectar y responder a cambios en el entorno donde se ubican. En particular, los nanosensores de la invención pueden ser nanointerruptores, que son nanosensores capaces de cambiar entre dos formas distintas. Los nanointerruptores de ADN contienen una molécula de ADN de simple cadena con una conformación que cambia en respuesta a un cambio ambiental, por ejemplo, un cambio de pH. La molécula de ADN puede acoplarse a moléculas fluorescentes que permiten la detección del cambio conformacional.
Como se usa en la presente descripción, “molécula marcadora” se refiere a una molécula que puede unirse químicamente al nanomotor y que emite una señal detectable que permite detectar el nanomotor. Los ejemplos particularmente preferidos de moléculas marcadoras incluyen, pero no se limitan a, moléculas quimioluminiscentes, moléculas fluorescentes e isótopos.
Como se usa en la presente descripción, “puerta molecular” o “nanoválvula” se refiere a un sistema molecular en una nano o microescala que cambia entre una primera forma cerrada y una segunda forma abierta en respuesta a un disparador seleccionado, tal como luz, temperatura, campos magnéticos. y pH. La forma cerrada está diseñada para bloquear la liberación de la carga contenida en la partícula a la que está adherida la puerta molecular. Al aplicar el gatillo, la puerta cambia a la forma abierta que permite la liberación de la carga.
Un “anticuerpo contra el cáncer” se refiere a un anticuerpo con la capacidad de detener o eliminar las células cancerosas.
Como se mencionó anteriormente, la invención proporciona en un primer aspecto un nanomotor impulsado por enzimas funcionalizado externamente con una molécula heteróloga.
En una modalidad particular del primer aspecto, opcionalmente en combinación con cualquiera de las modalidades proporcionadas anteriormente o a continuación, la partícula es una nanopartícula o una micropartícula. El término “nanopartícula”, como se usa en la presente descripción, se refiere a una partícula con al menos dos dimensiones en la nanoescala, particularmente con las tres dimensiones en la nanoescala. Por analogía, el término “micropartícula” como se usa en la presente descripción, se refiere a una partícula con al menos dos dimensiones en la microescala, particularmente con las tres dimensiones en la microescala. En una modalidad particular, la partícula es de 1 nm a 100 |jm. En particular, de 30 nm a 2 jm . Más en particular, de 100 nm a 1 jm . Aún más en particular, de 400 nm a 600 nm.
En cuanto a la forma de las nanopartículas o micropartículas descritas en la presente descripción, se incluyen esferas, poliédricas y en forma de varilla. Particularmente, cuando la nanopartícula o micropartícula está sustancialmente en forma de varilla con una sección transversal sustancialmente circular, tal como un nanocable o un nanotubo, microcable o microtubo, la "nanopartícula" o “micropartícula” se refiere a una partícula con al menos dos dimensiones en la nanoescala o microescala, al ser estas dos dimensiones la sección transversal de la nanopartícula o la micropartícula.
En una modalidad particular del primer aspecto, opcionalmente en combinación con cualquiera de las modalidades proporcionadas anteriormente o a continuación, la partícula es esférica.
Como se usa en la presente descripción, el término "tamaño" se refiere a una dimensión física característica. Por ejemplo, en el caso de una nanopartícula/micropartícula que es sustancialmente esférica, el tamaño de la nanopartícula/micropartícula corresponde al diámetro de la nanopartícula/micropartícula. Cuando se hace referencia a un conjunto de nanopartículas/micropartículas como de un tamaño particular, se contempla que el conjunto puede tener una distribución de tamaños alrededor del tamaño especificado. Por tanto, como se usa en la presente descripción, un tamaño de un conjunto de nanopartículas/micropartículas puede referirse a un modo de distribución de tamaños, tal como un tamaño de pico de la distribución de tamaños. Además, cuando no es perfectamente esférico, el diámetro es el diámetro equivalente del cuerpo esférico incluido el objeto. Este diámetro se denomina generalmente “diámetro hidrodinámico”, y las mediciones pueden realizarse mediante el uso de un Wyatt Mobius junto con un sistema de presurización celular Atlas o Malvern. Las imágenes de Microscopía Electrónica de Transmisión (TEM) o Microscopía Electrónica de Barrido (SEM) también brindan información sobre los diámetros.
El experto en la técnica dispone de una amplia variedad de materiales de partículas, y comprenderá que el material elegido dependerá de la aplicación prevista del nanomotor, por ejemplo, los nanomotores para usos terapéuticos deberían fabricarse con partículas biocompatibles.
Así, en una modalidad particular del primer aspecto, opcionalmente en combinación con cualquiera de las modalidades proporcionadas anteriormente o a continuación, la partícula está hecha de un material seleccionado del grupo que consiste de metal, óxido metálico, polímero, lípido, proteína, membrana celular, cuerpo celular, material carbonoso y mezclas de los mismos. En una modalidad particular, el metal es aluminio (Al), platino (Pt), paladio (Pd) o magnesio (Mg). En una modalidad particular, el óxido metálico se selecciona de sílice (SO<2>), óxido de manganeso (MnO<2>) y óxido de titanio (TO<2>). En una modalidad particular, el polímero es poliestireno o marcos orgánicos metálicos. En una modalidad particular, el material carbonoso se selecciona de carbono, grafeno y fullereno. En una modalidad de partículas, el material de la partícula es un polimerosoma. En una forma de modalidad de partículas, la partícula es una partícula basada en proteínas (proteinosoma). En una modalidad particular, el cuerpo celular es una plaqueta o un glóbulo rojo (RBC).
El término “marco orgánico metálico” o “MOF” se refiere a compuestos que comprenden iones metálicos o agrupaciones coordinadas a ligandos orgánicos. El elemento metálico central puede ser al menos uno seleccionado del grupo que consiste de zinc (Zn), cobalto (Co), cadmio (Cd), níquel (Ni), manganeso (Mn), cromo (Cr), cobre (Cu), lantano (La), hierro (Fe), platino (Pt), paladio (Pd), plata (Ag), oro (Au), rodio (Rh), iridio (Ir), rutenio (Ru), plomo (Pb), estaño (Sn), aluminio (Al), titanio (Ti), molibdeno (Mo), tungsteno (W), vanadio (V), niobio (Nb), tantalio (Ta), escandio (Sc), itrio (Y), galio (Ga), germanio (Ge), indio (In), bismuto (Bi), selenio (Se) y antimonio (Sb). El ligando orgánico puede incluir un grupo funcional que se pueda enlazar con al menos dos iones metálicos.
“Membrana celular” se refiere a la bicapa lipídica que forma una barrera continua alrededor de las células. Las partículas de la invención pueden estar formadas por membranas de células procariotas o eucariotas.
Como se usa en la presente descripción, “cuerpo celular” se refiere a la parte de una célula que contiene el material genético rodeado por el citoplasma y la membrana plasmática.
El término “polimerosoma” se refiere a vesículas artificiales hechas de copolímeros de bloques sintéticos anfifílicos,
El término “proteinosoma” se refiere a partículas compuestas de proteínas autoensambladas o conjugados proteínapolímero.
En una modalidad particular, opcionalmente en combinación con cualquiera de las modalidades proporcionadas anteriormente o a continuación, la partícula está hecha de sílice mesoporosa. Como se usa en la presente descripción, “sílice mesoporosa” se refiere a sílice porosa que tiene poros de tamaño mediano dispuestos regularmente, específicamente, los poros son de 2 nm a 50 nm, y más específicamente, de 4 nm a aproximadamente 40 nm.
En una modalidad particular del primer aspecto, opcionalmente en combinación con cualquiera de las modalidades proporcionadas anteriormente o a continuación, la enzima se selecciona del grupo que consiste de oxidorreductasa, hidrolasa y liasa. En una modalidad más particular, la enzima se selecciona del grupo que consiste de glucosa oxidasa, ureasa, catalasa, glutamato oxidasa, xantina oxidasa, peroxidasa, bilirrubina oxidasa, lipasa, proteasa y combinaciones de las mismas. En una modalidad más particular, la enzima es ureasa. El término ureasa (EC 3.5.1.5) se refiere al grupo de enzimas que catalizan la hidrólisis de urea en dióxido de carbono y amoníaco. En una modalidad particular de la invención, la ureasa es deCanavalia ensiformis(número CAS 9002-13-5). En una modalidad más particular, es una ureasa de Tipo IX deCanavalia ensiformis(Número CAS 9002-13-5). La secuencia de la enzima puede encontrarse en varias bases de datos, tales como Uniprot (P07374 UREA_CANEN, actualización 01/02/1994).
En una modalidad particular del primer aspecto, opcionalmente en combinación con cualquiera de las modalidades proporcionadas anteriormente o a continuación, la molécula heteróloga se selecciona del grupo que consiste de una molécula dirigida, una molécula marcadora, un nanosensor y una puerta molecular.
En una modalidad particular del primer aspecto, opcionalmente en combinación con cualquiera de las modalidades proporcionadas anteriormente o a continuación, la molécula heteróloga es un anticuerpo. En una modalidad más particular, el anticuerpo es un anticuerpo contra el cáncer. En una modalidad más particular, el anticuerpo contra el cáncer se une a un receptor de membrana. En una modalidad más particular, el receptor de membrana es un FGFR (receptor del factor de crecimiento de fibroblastos) seleccionado del grupo que consiste de FGFR1, FGFR2, FGFR3 y FGFR4. En una modalidad más particular, el FGFR es FGFR3.
En una modalidad particular del primer aspecto, opcionalmente en combinación con cualquiera de las modalidades proporcionadas anteriormente o a continuación, la molécula heteróloga es un nanosensor. Hay numerosos nanosensores disponibles para los expertos en la técnica (Campuzano S. y otros, “Motion-driven sensing and biosensing using electrochemically propelled nanomotors”, Analyst. 2011, vol. 36(22), pp. 4621-30). En una modalidad particular, el nanosensor es un nanointerruptor de ADN. Los nanointerruptores de ADN son complejos moleculares que comprenden una molécula de ADN de simple cadena acoplada a un par fluoróforo-extintor. En una modalidad particular, la secuencia de la molécula de ADN del nanointerruptor de ADN tiene al menos 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1.
En una modalidad particular, el nanosensor es una nanopartícula. En una modalidad más particular, el nanosensor es una nanopartícula de metal. Más particularmente, la nanopartícula de metal es una nanopartícula de oro (Au). Los expertos en la técnica entenderán que la nanopartícula que forma el nanosensor tiene que ser más pequeña que la nanopartícula o micropartícula que forma el nanomotor.
En la presente invención, el término "identidad" se refiere al porcentaje de residuos que son idénticos en las dos secuencias cuando las secuencias están alineadas de manera óptima. Si, en el alineamiento óptimo, una posición en una primera secuencia está ocupada por el mismo residuo de aminoácido que la posición correspondiente en la segunda secuencia, las secuencias exhiben identidad con respecto a esa posición. El nivel de identidad entre dos secuencias (o "porciento de identidad de secuencia") se mide como una relación del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias con respecto al tamaño de las secuencias (es decir, porciento de identidad de secuencia = (número de posiciones idénticas/número total de posiciones) x 100).
Se conocen varios algoritmos matemáticos para obtener rápidamente el alineamiento óptimo y calcular la identidad entre dos o más secuencias y se incorporan en varios programas de software disponibles. Los ejemplos de tales programas incluyen los programas MATCH-BOX, MULTAIN, GCG, FASTA y ROBUST para el análisis de secuencias de aminoácidos, entre otros. Los programas de análisis de software preferidos incluyen los programas ALIGN, CLUSTAL W y BLAST (por ejemplo, BLAST 2.1, BL2SEQ y versiones posteriores de los mismos).
Para el análisis de la secuencia de aminoácidos, una matriz de peso, tales como las matrices BLOSUM (por ejemplo, las matrices BLOSUM45, BLOSUM50, BLOSUM62 y BLOSUM80), matrices Gonnet o matrices PAM (por ejemplo, PAM30, PAM70, PAM120, PAM160, PAM250, y matrices PAM350), se usan para determinar la identidad.
Los programas BLAST proporcionan análisis de al menos dos secuencias de aminoácidos, ya sea al alinear una secuencia seleccionada con múltiples secuencias en una base de datos (por ejemplo, GenSeq) o, con BL2SEQ, entre dos secuencias seleccionadas. Los programas BLAST se modifican preferentemente mediante programas de filtrado de baja complejidad tales como los programas DUST o SEG, que preferentemente se integran en las operaciones del programa BLAST. Si se usan costos de existencia de brechas (o puntuaciones de brechas), el costo de existencia de brecha se establece preferentemente entre -5 y -15. Pueden usarse parámetros de brechas similares con otros programas según corresponda. Los programas BLAST y los principios subyacentes a ellos se describen adicionalmente en, por ejemplo, Altschul y otros, “Basic local alignment search tool”, 1990, J. Mol. Biol, v. 215, páginas 403-410.
Para el análisis de múltiples secuencias, se puede usar el programa CLUSTAL W. Deseablemente, el programa CLUSTAL W se ejecuta mediante el uso de configuraciones "dinámicas" (frente a "rápidas"). Las secuencias de aminoácidos se evalúan mediante el uso de un conjunto variable de matrices BLOSUM en dependencia del nivel de identidad entre las secuencias. El programa CLUSTAL W y los principios subyacentes de funcionamiento se describen con más detalle en, por ejemplo, Higgins y otros, “CLUSTAL V: improved software for multiple sequence alignment”, 1992, CABIOS, 8(2), páginas 189-191.
En una modalidad particular del primer aspecto, opcionalmente en combinación con cualquiera de las modalidades proporcionadas anteriormente o a continuación, el nanomotor comprende además una carga. En una modalidad particular, la carga se selecciona de la lista que consiste de un fármaco, en donde el fármaco se selecciona del grupo que consiste de una molécula pequeña, un ácido nucleico, una enzima terapéutica, un péptido, una proteína o una hormona. Por “carga” se entiende cualquier molécula transportada dentro del nanomotor para ser suministrada a la diana deseada. En dependencia del material de la superficie y la porosidad de la partícula, la carga puede estar dentro de la partícula o adsorbida en su superficie.
En una modalidad particular, el fármaco es un fármaco citotóxico. Más particularmente, es un fármaco contra el cáncer. En una modalidad particular del primer aspecto, opcionalmente en combinación con cualquiera de las modalidades proporcionadas anteriormente o a continuación, la enzima y la molécula heteróloga se unen a la superficie de la partícula directamente o a través de un enlazador. En una modalidad más particular, el enlazador se selecciona del grupo que consiste de anhídridos, alcoholes, ácidos, aminas, epoxis, isocianatos, silanos, grupos halogenados y grupos polimerizables, preferentemente 3-aminopropiltrietoxisilano (APTES). En una modalidad aún más particular, el enlazador es glutaraldehído.
En tal aspecto, una parte del enlazador se une a la superficie de la partícula y otra parte del enlazador se une a la enzima o molécula heteróloga, lo que forma así un enlace covalente entre la enzima o molécula heteróloga y la superficie. El enlace entre el enlazador y dicha superficie y dicha enzima o molécula heteróloga se efectúa por reacciones químicas que ocurren entre el enlazador y la enzima o molécula heteróloga lo que asegura así un enlace covalente entre la superficie y dicha enzima o molécula heteróloga. En una modalidad, la enzima y/o la molécula heteróloga se unen a la superficie de la partícula después de un pretratamiento químico de dicha superficie de la partícula.
Como se mencionó anteriormente, en un segundo aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz del nanomotor del primer aspecto y un excipiente y/o portador farmacéuticamente aceptable.
La expresión "cantidad terapéuticamente eficaz" como se usa en la presente descripción, se refiere a la cantidad del nanomotor que, cuando se administra, es suficiente para prevenir el desarrollo de, o aliviar en cierta medida, uno o más de los síntomas de la enfermedad o trastorno que se aborda. La dosis particular de agente administrado de acuerdo con esta invención, por supuesto, estará determinada por las circunstancias particulares que rodean el caso, que incluyen el nanomotor administrado, la vía de administración, la condición particular a ser tratada y las consideraciones similares.
La expresión "composición farmacéutica" abarca tanto composiciones destinadas a humanos así como a animales no humanos (es decir, composiciones veterinarias).
La expresión "portadores o excipientes farmacéuticamente aceptables" se refiere a materiales, composiciones o vehículos farmacéuticamente aceptables. Cada componente debe ser farmacéuticamente aceptable en el sentido de ser compatible con los demás ingredientes de la composición farmacéutica. También debe ser adecuado para el uso en contacto con el tejido u órgano de seres humanos y animales no humanos sin excesiva toxicidad, irritación, respuesta alérgica, inmunogenicidad u otros problemas o complicaciones proporcionales con una relación beneficio/riesgo razonable.
Los ejemplos de excipientes farmacéuticamente aceptables adecuados son disolventes, medios de dispersión, diluyentes u otros vehículos líquidos, adyuvantes de dispersión o suspensión, agentes tensioactivos, agentes isotónicos, agentes espesantes o emulsionantes, conservantes, aglutinantes sólidos, lubricantes y similares. Excepto en la medida en que cualquier medio de excipiente convencional sea incompatible con una sustancia o sus derivados, tal como, al producir cualquier efecto biológico indeseable o de cualquier otra manera, al interactuar de una manera perjudicial con cualesquiera otros componentes de la composición farmacéutica, se contempla que su uso esté dentro del alcance de esta invención.
Las cantidades relativas del nanomotor, los excipientes farmacéuticamente aceptables y/o cualquier ingrediente adicional en una composición farmacéutica de la invención variarán, en dependencia de la identidad, tamaño y/o condición del sujeto tratado y en dependencia además de la ruta por cuál es la composición que se administrará.
Los excipientes farmacéuticamente aceptables usados en la fabricación de composiciones farmacéuticas incluyen, pero no se limitan a, diluyentes inertes, agentes dispersantes y/o granulantes, agentes tensioactivos y/o emulsionantes, agentes desintegrantes, agentes de unión, conservantes, agentes tamponantes, agentes lubricantes, y/o aceites. Los excipientes tales como agentes colorantes, agentes de recubrimiento, agentes edulcorantes y aromatizantes pueden estar presentes en la composición, de acuerdo con el criterio del formulador.
Las composiciones farmacéuticas que contienen el nanomotor de la invención pueden presentarse en cualquier forma de dosificación, por ejemplo, sólido o líquido, y pueden administrarse por cualquier vía adecuada, por ejemplo, vía oral, parenteral, rectal, tópica, intranasal o sublingual, para lo que incluirán los excipientes farmacéuticamente aceptables necesarios para la formulación de la forma de dosificación deseada, por ejemplo, formulaciones tópicas (pomada, cremas, lipogel, hidrogel, etc.), colirios, aerosoles, soluciones inyectables, bombas osmóticas, etc.
Los diluyentes ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, carbonato de calcio, carbonato de sodio, fosfato de calcio, fosfato dicálcico, sulfato de calcio, hidrogenofosfato de calcio, lactosa fosfato de sodio, sacarosa, celulosa, celulosa microcristalina, caolín, manitol, sorbitol, inositol, cloruro de sodio, almidón seco, almidón de maíz, azúcar en polvo y combinaciones de los mismos.
Los agentes granulantes y/o dispersantes ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, almidón de patata, almidón de maíz, almidón de tapioca, glicolato de almidón de sodio, arcillas, ácido algínico, goma guar, pulpa de cítricos, agar, bentonita, celulosa y productos de madera, esponja natural, resinas de intercambio catiónico, carbonato de calcio, silicatos, carbonato de sodio, polivinilpirrolidona reticulada (crospovidona), carboximetil almidón de sodio (glicolato de almidón de sodio), carboximetilcelulosa, carboximetilcelulosa de sodio reticulada (croscarmelosa), metilcelulosa, almidón pregelatinizado (almidón 1500), almidón microcristalino, almidón insoluble en agua, carboximetilcelulosa de calcio, silicato de magnesio y aluminio (Veegum), lauril sulfato de sodio, compuestos de amonio cuaternario y combinaciones de los mismos.
Los excipientes de unión ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, almidón (por ejemplo, almidón de maíz y pasta de almidón); gelatina; azúcares (por ejemplo, sacarosa, glucosa, dextrosa, dextrina, melazas, lactosa, lactitol, manitol); gomas naturales y sintéticas (por ejemplo, goma arábiga, alginato de sodio, extracto de musgo irlandés, goma panward, goma ghatti, mucílago de cáscaras de isapol, carboximetilcelulosa, metilcelulosa, etilcelulosa, hidroxietilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, celulosa microcristalina, acetato de celulosa, polivinilpirrolidona), silicato de magnesio y aluminio (Veegum) y alerce arabinogalactano); alginatos; óxido de polietileno; polietilenglicol; sales de calcio inorgánicas; ácido silícico; polimetacrilatos; ceras, agua; alcohol y combinaciones de los mismos.
Los conservantes ilustrativos pueden incluir antioxidantes, agentes quelantes, conservantes antimicrobianos, conservantes antifúngicos, conservantes de alcohol, conservantes ácidos y otros conservantes. Los antioxidantes ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, alfa tocoferol, ácido ascórbico, palmitato de ascorbilo, estearato de ascorbilo, oleato de ascorbilo, hidroxianisol butilado, hidroxitolueno butilado, monotioglicerol, metabisulfito de potasio, ácido propiónico, galato de propilo, ascorbato de sodio, bisulfito de sodio, metabisulfito de sodio y sulfito de sodio. Los agentes quelantes ilustrativos incluyen ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), ácido cítrico monohidratado, edetato disódico, edetato dipotásico, ácido edético, ácido fumárico, ácido málico, ácido fosfórico, edetato sódico, ácido tartárico y edetato trisódico.
Los agentes tamponantes ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, soluciones tampón de citrato, soluciones tampón de acetato, soluciones tampón de fosfato, cloruro de amonio, carbonato de calcio, cloruro de calcio, citrato de calcio, glubionato de calcio, gluceptato de calcio, gluconato de calcio, ácido D-glucónico, glicerofosfato de calcio, lactato de calcio, ácido propanoico, levulinato de calcio, ácido pentanoico, fosfato de calcio dibásico, ácido fosfórico, fosfato de calcio tribásico, hidróxido fosfato de calcio, acetato de potasio, cloruro de potasio, gluconato de potasio, mezclas de potasio, fosfato de potasio dibásico, fosfato de potasio monobásico, mezclas de fosfato de potasio, acetato de sodio, bicarbonato de sodio, cloruro de sodio, citrato de sodio, lactato de sodio, fosfato de sodio dibásico, fosfato de sodio monobásico, mezclas de fosfato de sodio, trometamina, hidróxido de magnesio, hidróxido de aluminio, ácido algínico, agua libre de pirógenos, solución salina isotónica, solución de Ringer, alcohol etílico y combinaciones de los mismos.
Los agentes lubricantes ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, estearato de magnesio, estearato de calcio, ácido esteárico, sílice, talco, malta, behanato de glicerilo, aceites vegetales hidrogenados, polietilenglicol, benzoato de sodio, acetato de sodio, cloruro de sodio, leucina, lauril sulfato de magnesio, lauril sulfato de sodio y combinaciones de los mismos.
Como se mencionó anteriormente, la invención también proporciona en un tercer aspecto el nanomotor o la composición farmacéutica de la invención para el uso en terapia, diagnóstico o pronóstico.
Los nanomotores propulsados por ureasa son capaces de moverse no solo en medios líquidos, tales como la orina, sino también en medios viscosos tales como el ácido hialurónico. Además, también son activos en las secreciones mucosas. Por tanto, los nanomotores de la invención pueden usarse tanto en tejidos líquidos como viscosos, tales como en el humor acuoso del ojo.
En una modalidad particular del tercer aspecto, opcionalmente en combinación con cualquiera de las modalidades proporcionadas anteriormente o a continuación, el nanomotor del primer aspecto o la composición farmacéutica del segundo aspecto es para el uso en el tratamiento del cáncer.
Esta modalidad también puede formularse como el uso del nanomotor del primer aspecto, o la composición farmacéutica del segundo aspecto para la fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o prevención del cáncer. Este aspecto también puede formularse como un método para tratar y/o prevenir el cáncer, el método que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz del nanomotor del primer aspecto o la composición farmacéutica del segundo aspecto, a un sujeto que lo necesite.
Los ejemplos ilustrativos no limitantes de cáncer que pueden tratarse con el nanomotor o la composición farmacéutica de la invención incluyen, aunque no se limitan a, papilomas, adenomas, lipomas, osteomas, miomas, angiomas, nevos, teratomas maduros, carcinomas, sarcomas, teratomas inmaduros, melanoma, mieloma, leucemia, linfoma de Hodgkin, basalioma, espinalioma, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de útero, cáncer de vejiga, cáncer de pulmón, cáncer de bronquios, cáncer de próstata, cáncer de colon, cáncer pancréatico, cáncer de riñón, cáncer de esófago, hepatocarcinoma, cáncer de cabeza y cuello, etc. En una modalidad particular del tercer aspecto, el cáncer es cáncer de vejiga.
A partir de los datos proporcionados en la presente descripción, los expertos en la técnica comprenderán que los nanomotores y las composiciones farmacéuticas de la invención también pueden ser útiles en el tratamiento de otras enfermedades tales como enfermedades metabólicas, neurológicas e inflamatorias.
Como se mencionó anteriormente, en un quinto aspecto la invención proporciona un método in vitro para detectar un analito en una muestra aislada, que comprende poner en contacto el nanomotor como se definió en el primer aspecto con la muestra. El experto en la técnica entenderá que los nanomotores de la invención pueden adaptarse para detectar diferentes analitos a través de su funcionalización con sensores de dichos analitos.
En una modalidad particular del quinto aspecto, opcionalmente en combinación con cualquiera de las modalidades proporcionadas anteriormente o a continuación, la muestra es una muestra biológica aislada. Más particularmente, la muestra biológica aislada es sangre, plasma o suero.
Como se mencionó anteriormente, en un sexto aspecto, la invención proporciona el uso del nanomotor como se definió en el primer aspecto en un método in vitro para detectar un analito en una muestra aislada.
En una modalidad particular del quinto o sexto aspecto, opcionalmente en combinación con cualquiera de las modalidades proporcionadas anteriormente o a continuación, la muestra es una muestra líquida. Como se mencionó anteriormente, los nanomotores de los inventores son capaces de moverse en líquidos con varios grados de viscosidad. Por ejemplo, pueden moverse en la orina, que tiene una viscosidad cinemática de: 1.0700 cSt a 20 °C (medida por Inman y otros, “The impact of temperature and urinary constituents on urine viscosity and its relevance to bladder hyperthermia treatment”, Int J Hyperthermia, 2013, vol. 29(3), pp. 206-10), y ácido hialurónico en la concentración encontrada en los líquidos sinoviales (1 mg/mL, alrededor de 10-2 Pa*s para un intervalo de 1 a 10 Hz de velocidad de corte, medida en un reómetro).
Los nanomotores de la invención son particularmente útiles para la detección de una amplia variedad de analitos, tales como contaminantes o biomarcadores,
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones, la palabra "comprende" y las variaciones de la palabra no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o etapas. Además, la palabra “comprende” engloba el caso de “consiste de”. Los objetos, ventajas y características adicionales de la invención resultarán evidentes para los expertos en la técnica tras el examen de la descripción o pueden aprenderse mediante la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración y no pretenden limitar la presente invención. Los letreros de referencia con relación a los dibujos y colocados entre paréntesis en una reivindicación, son únicamente para intentar aumentar la inteligibilidad de la reivindicación y no deben interpretarse como limitación del alcance de la reivindicación. Además, la presente invención cubre todas las combinaciones posibles de modalidades particulares y preferidas descritas en la presente descripción.
Ejemplos
1. Esferoides de cáncer de vejiga diana en 3D con nanomotores impulsados por ureasa
1.1. Métodos
Materiales
Etanol (EtOH, 99 %), metanol (MeOH, 99 %), ácido clorhídrico (37 % en agua), hidróxido de amonio (25 % en agua), tetraetilortosilicato (TEOS, 99 %), trietanolamina (TEOA, 99 %), bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB, 99 %), 3-aminopropiltrietoxisilano (APTES, 99 %), glutaraldehído (GA, 25 % en agua), ureasa (deCanavalia ensiformis,tipo IX, polvo, 50 000-100 000 unidades/g sólido), estuche de ensayo de actividad de la ureasa (Sigma-Aldrich), urea (99.9 %), glicerol (99 %), polvo de borohidruro de sodio (NaBH<4>, 98.0 %), solución de formaldehído (37 % en agua), albúmina de suero bovino (polvo liofilizado), solución de 4-nitrofenol (10 mM), cloruro de sodio puriss. (NaCl), cloruro de potasio anhidro (KCI), fosfato de sodio monobásico (NaH<2>PO<4>), bicarbonato de sodio BioXtra (99.5-100.5 %, NaHCO3), dimetilsulfóxido (DMSO, 99.9 %) y HS-PEG5K-NH<2>(sal de HCl) se adquirieron de Sigma-Aldrich. Pierce™. Estuche de ensayo de proteínas BCA, aglutinina de germen de trigo (conjugado WGA AlexaFluor™ 647), conjugado de IgG anti-ratón de cabra (H+L) Alexa FluorTM 488, bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (MTT) y solución salina tamponada con fosfato (PBS) se adquirieron de Thermo Fisher Scientific. La matriz de sótano Matrigel™ se adquirió de Corning. El anticuerpo anti-FGFR3 (ab89660) se adquirió de Abcam. Hoechst 33342 se adquirió de Life Sciences. El tubo de diálisis pretratado de RC estándar Spectra/Por® 7 (3.5 kD) se adquirió de Spectrum. El éster Cianina3 NHS se adquirió de Lumiprobe. El medio de McCoy 5A (modificado), la solución de penicilina estreptomicina, el suero fetal bovino (FBS) y la tripsina EDTA al 0.5 % se adquirieron de Gibco. El estuche de viabilidad/citotoxicidad LIVE/DEAD™ se adquirió de Invitrogen. Se obtuvieron células RT4 de papiloma de células de transición de vejiga urinaria humana de ATCC (Rockville, MA).
Instrumentos
Las imágenes de Microscopía Electrónica de Transmisión (TEM) se capturaron mediante el uso de un microscopio JEOL JEM-2100. Las imágenes de Microscopía Electrónica de Barrido (SEM) se capturaron mediante el uso de un FEI NOVA NanoSEM 230 a 10 kV. Las mediciones de los radios hidrodinámicos y la movilidad electroforética se realizaron mediante el uso de un Wyatt Mobius acoplado con un sistema de presurización celular Atlas. El análisis Brunauer-Emmett-Teller (BET) se llevó a cabo mediante el uso de un analizador automático Micromeritics Tristar II Plus. Los videos ópticos así como las imágenes de cultivos celulares se realizaron mediante el uso de un microscopio óptico invertido (Leica DMi8) equipado con un objetivo de agua de 63<x>, una platina galvo y cubos de filtro para FIT<c>, Rodamina, DAPI y CY5. Los ensayos de cuantificación de proteínas y actividad enzimática se llevaron a cabo mediante el uso de un lector de microplacas multimodo Infinite M200 PRO. El análisis de microscopía confocal se realizó mediante el uso de un LSM 80o - Zeiss equipado con un objetivo de aceite de 63<x>.
Síntesis de nanopartículas de sílice mesoporosa (MSNP): Las MSNP se prepararon mediante el uso de un método sol-gel. Brevemente, se calentó una solución que contenía CTAB (570 mg), TEOA (35 g) y agua (20 mL) a 95 °C en un baño de aceite de silicio. Esta mezcla se agitó durante 30 minutos y posteriormente se añadió gota a gota TEOS (1.5 mL). La mezcla se agitó adicionalmente a 95 °C durante 2 horas. Las partículas producidas se recolectaron por centrifugación y se lavaron con etanol (3 veces, 1350 g, 10 minutos). Luego, las partículas se suspendieron en una mezcla de MeOH:HCl (30 mL, 10:0.6) y se sometieron a reflujo a 80 °C durante 24 horas, para eliminar el CTAB de los poros de las MSNP. Finalmente, las partículas se recolectan por centrifugación y se lavan en etanol (3 veces, 1350 g, 10 minutos), al sonicar 20 minutos entre cada centrifugación. Se recolectaron alícuotas (0.5 mL), se centrifugaron y se secaron al aire para determinar la concentración de la suspensión de MSNP.
Funcionalización de amina de MSNP (MSNP-NH2): Las MSNP sintetizadas previamente se suspendieron en EtOH (2 mg/mL). Luego, se añadió APTES a la suspensión (10 pL/mg de MSNP) y se agitó durante 24 horas a temperatura ambiente, mediante el uso de un agitador rotatorio de extremo a extremo. Finalmente, las partículas se recolectaron por centrifugación y se lavaron en etanol (3 veces, 1350g10 minutos) y en agua (3 veces, 1928g10 minutos), al sonicar 20 minutos entre cada centrifugación. Se recolectaron alícuotas (0.5 mL), se centrifugaron y se secaron al aire para determinar la concentración de la suspensión de MSNP. Funcionalización de MSNP-NH<2>con ureasa y H<2>N-PEG-SH heterobifuncional (MSNP-Ur/PEG): Se centrifugaron MSNP-NH2 a 1340gdurante 10 minutos, se suspendieron en 900 pL de PBS (2 mg/mL) y sonicaron durante 20 minutos. Después de esto, se añadieron 100 pL de glutaraldehído y la mezcla se agitó durante 30 segundos para obtener una buena dispersión. La mezcla se colocó en un agitador rotatorio de extremo a extremo durante 2.5 horas, a temperatura ambiente. A continuación, se recolectaron las nanopartículas y se lavaron tres veces con PBS (1340g,10 minutos) y se sonicaron durante 20 minutos entre cada lavado. Después, las nanopartículas activadas por GA se suspendieron en una solución de PBS que contenía ureasa (3 mg/mL) y H<2>N-PEG-SH (1 pg/mg de MSNP-NH2). A continuación, la mezcla se colocó en un agitador rotatorio de extremo a extremo durante la noche, a temperatura ambiente. Los nanomotores resultantes se lavaron tres veces con PBS mediante centrifugación (1340g,10 minutos), al intercalar los lavados con 3 minutos de sonicación.
Funcionalización de nanomotores de ureasa PEGilada con anticuerpo anti-FGFR3 (MSNP-Ur/PEG-Ab): Los nanomotores se suspendieron en PBS (2 mg/mL) y se añadió el anticuerpo anti-FGFR3 (30 pg de anticuerpo por mg de nanomotores). Después, la mezcla se incubó durante la noche en el agitador rotatorio, a temperatura ambiente. Finalmente, los nanomotores modificados con anticuerpo se recolectaron por centrifugación (1340g,10 minutos) y se lavaron tres veces con PBS, al intercalar los lavados con 3 minutos de sonicación. Radios hidrodinámicos y análisis de carga superficial: se usó un Wyatt Mobius DLS, acoplado a un presurizador ATLAS para caracterizar la distribución de tamaño y la carga superficial de MSNP, MSNP-NH2, MSNP-Ur/PEG y MSNP-Ur/PEG-Ab. El equipo usa un láser de longitud de onda de 532 nm y un ángulo detector de 163.5°. Las muestras analizadas se diluyeron a una concentración de 0.3 mg/mL y se analizaron para dispersión de luz y movilidad electroforética simultáneamente, con un tiempo de adquisición de 5 segundos, al realizar 3 corridas por medición. Se realizaron un total de 9 mediciones para obtener datos estadísticamente relevantes.
Cuantificación de cantidades de ureasa y anticuerpos en MSNP: La concentración de ureasa presente en MSNP-Ur/PEG se midió mediante el uso del estuche de ensayo de proteínas BCA de Thermo Fisher Scientific, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Este estuche correlaciona la cantidad de proteínas con la reducción de cobre por enlaces peptídicos. Se repitió el mismo procedimiento para MSNP-Ur/PEG-Ab, con el fin de cuantificar la cantidad de anticuerpo unido a los nanomotores.
Ensayo de actividad de la ureasa: la actividad enzimática de la ureasa mientras está unida a MSNP se evaluó mediante el uso de un estuche comercial que determina la concentración de amoníaco generado por el método de Berthelot (Patton, C. J. y otros, “Spectrophotometric and Kinetics Investigation of the Berthelot Reaction for the Determination of Ammonia”, Anal. Chem., 1977, vol. 49, pp. 464-469). Los nanomotores estaban a una concentración de 0.5 mg/mL y el experimento se realizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Marcaje de ureasa con Cy3: Se disolvió ureasa (22 mg) en 1 mL de tampón de bicarbonato de sodio (100 mM). A continuación, se añadieron 7 pL de una solución C y 3 en DMSO (5 mM) a la solución de ureasa, y la mezcla se incubó durante 4 horas, a temperatura ambiente y se agitó en la oscuridad. Después, la solución de ureasa marcada se dializó (membrana de poro de 3.5 kD) durante 24 horas para eliminar las moléculas Cy3 que no reaccionan.
Cuantificación de la producción de amoniaco por MSNP-Ur/PEG: El amoniaco producido por nanomotores se cuantificó mediante el uso de un método de titulación. Para ello, los nanomotores se incubaron con diferentes concentraciones de urea (12.5, 25, 50, 100, 200 y 300 mM) y las muestras se analizaron en diferentes momentos (5, 15, 60, 120, 240 minutos y a las 24 horas). En cada momento, se centrifugaron las suspensiones de nanomotores y se tituló el sobrenadante con HCl (10 mM), mediante el uso de p-nitrofenol como indicador.
Grabación de video óptico de nanomotores y análisis de MSD: Se usó un microscopio invertido equipado con un objetivo de agua de 63x para observar y grabar videos del movimiento de los nanomotores. Se colocaron muestras de soluciones acuosas de orina simulada que contenían nanomotores en un portaobjetos de vidrio y se mezclaron bien con orina simulada en un intervalo de concentraciones de urea (12.5, 25, 50, 100, 200 y 300 mM). Luego, las muestras se cubrieron con un portaobjetos de vidrio para evitar artefactos causados por la deriva y se grabaron videos de 30 segundos. Los videos se adquirieron mediante el uso de una cámara Hamamatsu, a una velocidad de fotogramas de 50 fps, en campo brillante. Se analizan al menos 20 nanomotores por condición. Los videos se analizaron mediante el uso de un código basado en Python para obtener las trayectorias de los nanomotores y calcular el desplazamiento cuadrático medio (MSD) siguiente:
MSD (A t) = ((x_i ( t A t) — x_i ( t ) ) A2 ) , i = 2, para anális is 2D
Posteriormente, se obtuvo el coeficiente de difusión (D<e>) al ajustar los datos de MSD a la ecuación 2, que es válida en intervalos de tiempo cortos para partículas pequeñas, con baja difusión rotacional. Cultivo celular 3D: Se cultivaron células RT4 de papiloma de células de transición de vejiga urinaria humana en medio McCoy 5A (modificado), suplementado con FBS (10 %) y solución de penicilina-estreptomicina (1 %), en una atmósfera de 37 °C y 5 % de CO<2>. Las células se dividieron cada 4 días en una relación de 1:2. Para obtener cultivos de células 3D de RT4, se recubrieron previamente placas ibidi de 8 pocillos con 23 pL de Matrigel™ (5 mg/mL) y se incubaron a 37 °C durante 30 minutos, lo que permite formar el gel. A continuación, 30 pL de una suspensión de células RT4 a una densidad de 5x10<6>células/mL se extendió uniformemente en cada pocillo y las placas se incubaron durante 30 minutos a 37 °C. Finalmente, se añadieron 150 pL de medio McCoy de RT4 que contenía 10 % de Matrigel™. Los cultivos se dejaron crecer durante 7 días antes de los experimentos, al cambiar el medio cada 2 días.
Inmunotinción de la proteína transmembrana FGFR3 en cultivos de células 3D de RT4: los cultivos 3D descritos anteriormente se lavaron 3 veces con PBS 1x. Luego, la superficie de los pocillos se rascó suavemente con la punta de una pipeta y el cultivo se suspendió en un medio McCoy en un tubo. Los tubos se centrifugaron brevemente y se eliminó el sobrenadante. Después, las células se suspendieron en formaldehído (3.7 %), se colocaron en una placa de 8 pocillos y se incubaron durante 15 minutos a temperatura ambiente. A continuación, se lavó el cultivo con PBS 1x, se añadió una solución de PBS-BSA (5 %) y se incubó la placa durante 40 minutos a temperatura ambiente. Luego, el anti-FGFR3 se añadió al cultivo en una relación de 1:50, y la placa se incubó durante 24 horas, a 37 °C, en una atmósfera de 5 % de CO<2.>Posteriormente, se lavó el cultivo 3 veces con PBS 1x, se añadió el anticuerpo secundario (marcado con AlexaFluor 488) en una relación de 1:500 y se incubó la placa durante 40 minutos, a temperatura ambiente en la oscuridad. Finalmente, el cultivo se lavó 3 veces con PBS 1x, los núcleos se marcaron con Hoescht y se añadió una solución de glicerol en PBS (70 %). El cultivo se observó mediante microscopía confocal.
Ensayos de citotoxicidad: La viabilidad de los cultivos RT43D se cuantificó mediante el uso del ensayo Alamar Blue y se visualizó mediante el uso del estuche de viabilidad LIVE/DEAD al seguir las instrucciones del fabricante. Para ello, se cultivaron células RT4 como se mencionó anteriormente y en el día 7 se incubaron con cada tratamiento - Amoníaco (1 mM, 1.5 mM, 3 mM, 5 mM, 10 mM y 20 mM, durante 24 horas), Urea (25 mM, 30 mM, 40 mM y 50 mM, durante 24 horas), MSNP-Ur/PEG (12.5 pg/mL, en un intervalo de concentraciones de urea - 25 mM, 30 mM, 40 mM y 50 mM, para 1, 2 y 4 horas). Posteriormente, los cultivos se lavaron con medio, se mantuvieron en reposo durante 24 horas y se investigó la viabilidad de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Además, la viabilidad también se evaluó a las 48 h.
Imágenes de cultivos de RT4 3D y nanomotores: en el día 7, los cultivos de células 3D se incubaron con cada tratamiento (MSNP-Ur/PEG o MSNP-Ur/PEG-Ab, 12.5 pg/mL) durante 4 horas. En cada momento, los cultivos se lavaron y se mantuvieron en una atmósfera de 37 °C y CO<2>al 5 % durante 24 horas. Luego, los cultivos se marcaron con WGA 647 (membranas) y se tomaron imágenes mediante el uso de un microscopio de fluorescencia invertido equipado con un objetivo de 63x y una platina galvo, así como cubos de filtro para rodamina, FITC, DAPI y Cy5.
1.2. Resultados y discusión
Se prepararon nanopartículas de sílice mesoporosas (MSNP) completamente mediante el uso de química sol-gel, donde se usó bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB) como agente porogénico y trietanolamina (TEOA) como catalizador base. Los MSNP preparados se caracterizaron mediante microscopía electrónica de barrido (SEM). El análisis SEM reveló una buena monodispersidad de la muestra (índice de polidispersidad = 0.114) y un diámetro medio de 481 ± 2 nm (N = 150, tamaño medio ± error estándar de la media (SE)). Además, la estructura porosa de las MSNP se evaluó mediante microscopía electrónica de transmisión. El TEM evidenció una clara porosidad radial. Esta configuración cristalina fue confirmada por la Transformada Rápida de Fourier, que indicó la periodicidad del patrón poroso. El área superficial de las nanopartículas se estudió mediante la realización de adsorción/desorción de nitrógeno, mediante el uso del método de análisis Brunauer-Emmett-Teller (BET). Las MSNP mostraron una isoterma de tipo IV, típica de las estructuras de sílice mesoporosas, y una superficie específica BET de 1184.8 m2/g, con un tamaño de poro medio de 2 nm.
A continuación, las partículas producidas se funcionalizaron con grupos amina mediante el uso de aminopropiltrietoxisilano (APTES). Los grupos amina en la superficie de la MSNP se activan posteriormente con glutaraldehído (GA), que actúa como enlazador entre la partícula y las moléculas de ureasa y polietilenglicol heterobifuncional (PEG) (figura 1A). El grupo tiol terminal del PEG permite el acoplamiento del resto diana, anti-factor de crecimiento fibroblastos 3 (anti-FGFR3).
Las etapas de funcionalización se siguieron por dispersión dinámica de la luz (DLS) y análisis de movilidad electroforética para obtener los radios hidrodinámicos y la carga superficial, respectivamente. El análisis DLS de las MSNP sintetizados mostró un pico amplio que sugiere la presencia de agregados en la suspensión. El análisis de movilidad electroforética de las MSNP indicó una carga superficial de -26.81 ± 0.35 mV (N = 9, promedio ± SE), típica de las nanopartículas de sílice. La funcionalización exitosa con aminas se evidenció por el cambio pronunciado en la carga superficial a un valor fuertemente positivo (33.6 ± 1.0 mM, N = 9, promedio ± SE), característico de la presencia de grupos amina libres en la superficie. Los radios hidrodinámicos de las MSNP funcionalizadas con amina (MSNP-NH2) indicaron un pico más agudo que puede deberse a una estabilización de las partículas tanto por la carga superficial como por la química de la superficie.
La siguiente etapa de funcionalización se refería al acoplamiento de la enzima ureasa y del PEG heterobifuncional. Normalmente, el PEG se usa como espaciador o como un medio para prevenir la agregación en suspensión al proporcionar un impedimento estérico entre las partículas. Confirmamos este efecto sobre la estabilidad coloidal de MSNP-Ur/PEG mediante análisis DLS, donde se observó un pico de población único agudo. Además, las moléculas de PEG permitieron la conjugación de los anticuerpos a las nanopartículas, al unir el grupo tiol libre en el extremo terminal del PEG a los residuos de cisteína de los anticuerpos. Este enfoque proporciona más especificidad en la unión de anticuerpos IgG, debido al alto contenido de residuos de cisteína presentes en la región constante de la cadena pesada (figura 1 A). La conjugación de MSNP-Ur/PEG con anticuerpo anti-FGFR3 (MSNP-Ur/PEG-Ab) también fue analizada por DLS, y el pico único observado mostró que la presencia del anticuerpo no afectó la estabilidad de las partículas en solución. Hemos confirmado la presencia de ureasa, así como del anticuerpo en la superficie de las MSNP, mediante el uso de un estuche que cuantifica proteínas en base a la reducción de cobre por enlaces peptídicos de proteínas y evaluamos la actividad enzimática de la ureasa mientras está unido a los nanomotores.
La ureasa presente en la superficie de MSNP-Ur/PEG y MSNP-Ur/PEG-Ab permite la conversión biocatalítica de urea en amoníaco y dióxido de carbono, al seguir la ecuación:
(NH<2>ECO H<2>O ^ CO<2>+ 2 NH<3>
Normalmente, se induce una asimetría geométrica en las micro/nanoestructuras (por ejemplo, partículas de Janus) para lograr una generación asimétrica de fuerzas, que es un requisito importante para producir movimiento con un número de Reynolds bajo. Sin embargo, recientemente, se ha informado que para los motores propulsados mediante conversión biocatalítica, una distribución molecular desequilibrada de enzimas es suficiente para la generación de la asimetría necesaria para generar movimiento neto. Sin embargo, ese estudio anterior se informó para motores de tamaño micrométrico. Los nanomotores de MSNP-Ur/PEG y MSNP-Ur/PEG-Ab informados en este trabajo se basan en tales asimetrías inherentes para la autopropulsión en motores a nanoescala. Los perfiles de movimiento de MSNP-Ur/PEG y MSNP-Ur/PEG-Ab se evaluaron en presencia de un intervalo de concentraciones de urea (0 mM, 12.5 mM, 25 mM, 50 mM, 100 mM, 200 mM y 300 mM), en orina simulada. Se usó la técnica de seguimiento óptico para obtener las trayectorias rastreadas de los nanomotores (figuras 2A y 2B), que luego se usaron para calcular el desplazamiento cuadrático medio (MSD). La figura 2C muestra el MSD típico de nanomotores ureasa/PEG y nanomotores modificados con anticuerpos en orina simulada. Observamos que el MSD aumenta linealmente con el tiempo, que es característico del movimiento de difusión, y obtuvimos el coeficiente de difusión eficaz para cada condición dada al ajustar los MSD a la siguiente ecuación:
MSD (At) = 4 De At,
donde De representa el coeficiente de difusión eficaz y At representa el intervalo de tiempo.
La figura 2D muestra los coeficientes de difusión eficaces calculados tanto para MSNP-Ur/PEG como MSNP-Ur/PEG-Ab, lo que evidencia que se logró un aumento significativo en la difusión a una concentración de urea de 50 mM(p<0.001). El coeficiente de difusión aumentó aún más con el aumento de las concentraciones de urea en la orina simulada, al alcanzar una meseta. El aumento de la difusión con respecto al aumento de las concentraciones de urea puede relacionarse con la cinética de Michaelis-Menten de la enzima ureasa, que obedece a la siguiente ecuación:
17 _ — -V--m----a--x----[--]-^
Kni+ [S ]
donde Vmáx representa la máxima velocidad de reacción, S representa la concentración de sustrato y Km representa la constante de Michaelis-Menten. Como se muestra en la figura 2D, no se encontraron diferencias significativas entre los perfiles de movimiento de MSNP-Ur/PEG y MSNP-Ur/PEG-Ab, lo que indica que la presencia de este resto diana no obstaculiza las capacidades de movimiento de los nanomotores.
Estudiamos la biocompatibilidadin vitrodel sustrato requerido para el movimiento de los nanomotores (urea) y el subproducto de la biocatálisis (amoníaco) mediante el uso de cultivos 3D (esferoides) de células RT4 de papiloma de células de transición de vejiga urinaria humanas. Los esferoides se obtuvieron al sembrar células RT4 en placas recubiertas con Matrigel™, que se asemeja a la matriz extracelular y proporciona un entorno 3D para el crecimiento celular. Luego, se dejaron los cultivos proliferar durante 7 días y se monitoreó el crecimiento de esferoides todos los días. Luego se investigó el efecto de un intervalo de concentraciones de urea (0 mM, 25 mM, 50 mM y 100 mM) y amoníaco (0 mM, 20 mM, 30 mM, 40 mM y 50 mM), al incubar los esferoides para 24 horas en cada condición. Después de eso, los cultivos se lavaron con medio y se evaluó la viabilidad y proliferación celular mediante el uso del ensayo Alamar Blue. Este ensayo se basa en la reducción de resazurina en el compuesto fluorescente resorufina por células metabólicamente activas.
La urea exhibió una buena biocompatibilidad, estudiamos que no afecta la viabilidad del esferoide incluso a la concentración más alta, mientras que el amoníaco reveló una tendencia citotóxica aumentada con concentraciones crecientes. No obstante, los esferoides permanecieron viables (> 70 % de viabilidad) en todas las concentraciones de amoniaco ensayadas.
Se investigó más a fondo la viabilidad de los esferoides cuando se expusieron a los nanomotores (MSNP-Ur/PEG), en un intervalo de concentraciones de urea y en diferentes períodos de incubación. Los esferoides se incubaron con 12.5 ^g/mL de nanomotores desnudos o nanomotores modificados con anticuerpos a 0 mM, 25 mM, 30 mM y 40 mM de urea, durante 1, 2 y 4 horas. A continuación, los cultivos se lavaron minuciosamente con medio para eliminar los nanomotores y la urea no catalizada y se mantuvieron durante 24 horas antes del análisis. El efecto de los nanomotores sobre la viabilidad de los esferoides del cáncer de vejiga se visualizó mediante el uso del estuche de viabilidad LIVE/DEAD® y se cuantificó mediante el uso del ensayo Alamar Blue (figura 3). Se observó que los nanomotores no eran tóxicos en ausencia de urea, lo que indica la buena biocompatibilidad del chasis de los nanomotores (sílice mesoporosa, tipo MCM-41), así como el PEG y la enzima. Ante la presencia de concentraciones crecientes de urea, se denota un efecto citotóxico para ambos nanomotores, al ser más pronunciado en nanomotores modificados con anticuerpos (figura 3). La toxicidad observada para los nanomotores desnudos se debe a la producción de amoníaco originado a partir de la conversión biocatalítica de urea. Sin embargo, el mayor efecto citotóxico verificado para los nanomotores que llevan el anticuerpo puede surgir de la interacción entre el anti-FGFR3 y el antígeno presente en las membranas de los esferoides. Se ha informado que la interacción entre estos restos bloquea la vía de señalización de FGF, que está implicada en el crecimiento y la proliferación celular.
Para comprender mejor la contribución del amoníaco al efecto citotóxico observado sobre los esferoides, se estudió la concentración eficaz de amoníaco producido por los nanomotores durante períodos definidos a diferentes concentraciones de urea. Se incubaron 12.5 ^g/mL de nanomotores con un intervalo de concentraciones de urea (0 mM, 12.5 mM, 25 mM, 50 mM, 100 mM, 200 mM y 300 mM) y se usó p-nitrofenol como indicador del pH. Dado que la conversión de urea en amoníaco y dióxido de carbono por nanomotores genera un fuerte aumento en el pH, la solución que contiene nanomotores se vuelve amarilla debido a la presencia de p-nitrofenol y puede titularse con HCl para cuantificar la cantidad de amoníaco presente, de acuerdo con la siguiente ecuación:
NH<3>+ HCI ^ NH<4>CI
Se encontró que a esta concentración de nanomotores, la salida máxima de amoníaco alcanzada fue 17 mM, que resultó ser biocompatible con esferoides de cáncer de vejiga (> 70 % de viabilidad para amoníaco 20 mM). Sin embargo, tras la incubación con nanomotores y urea, el efecto citotóxico observado es más fuerte que con amoniaco libre. Este resultado puede surgir de la producción de una mayor concentración localmente de amoníaco por los nanomotores en la vecindad de los esferoides, lo que conduce a una mayor citotoxicidad.
Al tener en cuenta las capacidades mejoradas de difusión y biocompatibilidad de los nanomotores, se investigó posteriormente su potencial para dirigir y penetrar en los esferoides del cáncer de vejiga (figura 4). En primer lugar, se verificó la expresión del antígeno dirigido (FGFR3) en la superficie de los esferoides del cáncer de vejiga mediante inmunocitoquímica, una técnica usada para detectar visualmente la ubicación de proteínas específicas en una muestra por medio de anticuerpos marcados con fluorescencia. Una inmunocitoquímica de un esferoide de cáncer de vejiga mostró fluorescencia verde en las membranas celulares que confirma la presencia de la proteína transmembrana FGFR3, y el azul representa los núcleos celulares marcados con Hoechst.
A continuación, se investigó la capacidad de los nanomotores para penetrar los esferoides del cáncer de vejiga y el efecto de la presencia del resto diana sobre la eficiencia de la internalización. Además, se evaluó la influencia del movimiento activo en la eficiencia de internalización, al incubar los esferoides con nanomotores desnudos o nanomotores modificados con anticuerpos en presencia de urea 40 mM. Para esto, se marcó la ureasa con el marcador fluorescente Cianina3 (Cy3) antes de su funcionalización en la MSNP-NH2, para localizar con precisión los nanomotores mediante el uso de microscopía de fluorescencia. Luego, los nanomotores se funcionalizaron tanto con ureasa pura como con ureasa marcada (5 %) y se verificó que las capacidades de movimiento se mantuvieron a pesar de la presencia de la enzima marcada. A continuación, los cultivos 3D se incubaron con 12.5 pg/mL de MSNP-Ur/PEG-Ab, o MSNP-Ur/PEG como control negativo para el direccionamiento, durante 4 horas, en ausencia y presencia de urea (40 mM). Posteriormente, se lavaron los cultivos, se marcaron las membranas celulares con aglutinina de germen de trigo (WGA). La cuantificación de la intensidad de fluorescencia de Cy3 dentro de los esferoides (50-100 pm de diámetro) reveló que los motores activos presentan una eficiencia de internalización tres veces mayor que en ausencia de urea, lo que puede deberse a la fuerza propulsora generada por el movimiento activo. Además, en presencia de urea, los nanomotores modificados con anticuerpos presentan una eficiencia de internalización cuatro veces mayor que los nanomotores sin anticuerpos (figura 4). Esto podría deberse a que cuando un nanomotor se mueve activamente, la probabilidad de que el anticuerpo interactúe con el antígeno diana es mayor que cuando solo se produce la difusión browniana. En nuestro caso, un nanomotor propulsado a 40 mM de urea cubre un 53 % más de área en un segundo que un nanomotor que simplemente experimenta difusión browniana, como lo demuestran los MSD, que mejora las posibilidades de que el anticuerpo entre en contacto con el antígeno y penetre en el esferoide.
Al tener en cuenta que el anticuerpo usado bloquea la vía de señalización de FGF de las células cuando se une al antígeno, se investigó aún más el efecto terapéutico potencial de los nanomotores modificados con anticuerpos al analizar la proliferación celular (recuadro de la figura 4). Para ello, los esferoides de cáncer de vejiga se incubaron con MSNP-Ur/PEG-Ab durante 4 horas, con y sin urea, mediante el uso de nanomotores sin anticuerpo como control. Después, los esferoides se lavaron para eliminar la urea no catalizada y los nanomotores no internalizados, y se midió la proliferación después de un período de reposo de 48 horas mediante el uso del ensayo Alamar Blue. Se observó que los esferoides incubados con nanomotores desnudos (sin anticuerpo) mantuvieron los niveles de viabilidad observados a las 24 horas, mientras que los esferoides incubados con nanomotores modificados con anticuerpos disminuyeron la viabilidad, lo que indica que se detuvo la proliferación celular. Estos resultados apuntan hacia la aplicabilidad de los nanomotores que llevan el anticuerpo anti-FGFR3 como herramientas para la terapia dirigida contra el cáncer de vejiga.
1.3. Conclusiones
Se han desarrollado nanomotores impulsados por ureasa que comprenden PEG, donde el PEG actúa tanto como un impedimento estérico para prevenir la agregación como un enlazador para conectar un anticuerpo específico contra el cáncer de vejiga en la superficie de los nanomotores (anti-FGFR3). Los nanomotores, con y sin anticuerpo, presentan una difusión mejorada en orina simulada en un intervalo de concentraciones de urea encontradas en la vejiga, lo que puede permitir su uso en aplicaciones biomédicas en este órgano. Se ha demostrado la toxicidad inducida dependiente del sustrato de estos nanomotores enzimáticos mediante el uso de esferoides derivados de células cancerosas de vejiga humana (cultivos 3D), que se considera que imitan mejor los entornos tumorales en comparación con los cultivos 2D convencionales. El fenómeno de internalización se monitoreó en un período de tiempo similar a los intervalos de evacuación de la vejiga y se observó que el movimiento activo mejora la penetración de los nanomotores en tres veces. Además, los nanomotores activos modificados con anticuerpos exhibieron una eficiencia de internalización 4 veces mayor que los nanomotores activos sin el anticuerpo, lo que refleja la influencia de la autopropulsión y el direccionamiento en la capacidad de las partículas activas para penetrar esferoides. Los estudios de proliferación celular en esferoides indicaron que los nanomotores dirigidos inducen una mayor pérdida de viabilidad que los nanomotores desnudos (sin anticuerpo), lo que indica el efecto terapéutico del anti-FGFR3 que podría surgir tanto de la supresión de la proliferación celular como de mayores tasas de internalización del nanomotor. Estos resultados apuntan hacia los potenciales de tales nanomotores modificados con anticuerpos como herramientas en la terapia dirigida contra el cáncer de vejiga, ya que las capacidades de direccionamiento de las partículas se mejoran con el movimiento activo, lo que resulta en la mejora del efecto terapéutico del anticuerpo anti-FGFR3.
2. Micromotores impulsados por enzimas modificados con nanointerruptores de ADN para la monitorización del pH local
2.1. Materiales y métodos
Productos químicos
Se sintetizaron y purificaron oligonucleótidos de ADN sin modificar y marcados con fluoróforo (purificación por HPLC) mediante IBA GmBH (Gottingen, Alemania) y se usaron sin purificación adicional. Las secuencias de los constructos de ADN se describen a continuación.
Secuencias de ADN
Nanointerruptor de ADN sensible al pH
5'-TCCTTGTCTGTCTGTCTGTC TTTTTT GAAGAAGGAATTT (Cy3) ATTCCTTCTTC GTTTG CTTCTTCCTT (Cy5) - 3'
Andamio de ADN modificado con amino
5'-GACAGACAGACAGACAAGGA - NH<2>- 3'
Interruptor de control
5'-TCCTTG TCTGTC TGT CTGTC I(Cy3)GAACGTTTTTCGTTC(Cy5)
Para todas las secuencias anteriores, las bases en negrita representan el lazo de la porción dúplex y las bases subrayadas representan el lazo de la región triple paralela. Tanto el nanointerruptor de ADN sensible al pH como el interruptor de control tienen una porción (aquí en cursiva) que es completamente complementaria (20 bases) al andamio de ADN modificado con amino.
Condiciones del tampón
Todos los oligómeros de ADN se almacenaron (100 |j) en PBS 1x.
Mediciones de fluorescencia
Las mediciones de fluorescencia se llevaron a cabo en un fluorímetro Cary Eclipse (Varian), al establecer la longitud de onda de excitación en A<ex>= 530 nm (rendija<ex>= 5 nm) y adquisición entre 540 y 700 nm (rendija<em>= 5 nm) mediante el uso de cubetas de cuarzo de volumen reducido (100 jL). Todas las mediciones se realizaron a T = 25 °C en HEPES 10 mM. Los interruptores se diluyeron primero en HEPEs 10 mM a la concentración de 1 jM . Esta solución madre se diluyó luego a 20 nM en el mismo tampón cuyo pH se ajustó al valor deseado (pH entre 5.0 y 9.0).
Análisis de los datos de fluorescencia
El FRET radiométrico se ha calculado de la siguiente manera:
R a t.F R E TFCy5
Fcy3 Fcy5
DondeFcy5es la máxima emisión de fluorescencia de Cy5 (Aem = 670 nm) yFcy3es la máxima emisión de fluorescencia de Cy3 (Aem = 570 nm). Las curvas de titulación del pH se obtuvieron al representarRat. FRETfrente a la concentración de iones hidronio, y ajustar los datos con la siguiente ecuación tipo Langmuir:
[H+] *(Rat. FRET RET FRET RATIOMÉTRICO = Rat. FRET tr¡ple Rat. F dúpLEX) triple+ (■[H+] * K “vv
DondeRat.FRETrRiPLEyRat.FRETDúPLExrepresentan la señal FRET del interruptor en el estado triple (cerrado) y el estado dúplex (abierto), respectivamente y donde [H+] representa la concentración total de iones de hidrógeno yKAappes la constante ácida observada para el interruptor.
Fabricación de microcápsulas
Se usaron partículas comerciales de 2|jm en base al poliestireno (PS) (Sigma-Aldrich cat. no. 78452), para una cubierta de dióxido de silicio mediante un método de condensación conjunta previamente informado (Ref. Ma Xing ACS Nano 2016). Brevemente, se mezclaron 250 jL de partículas de poliestireno (solución madre, 10 % de sólidos) con 0.5 mL de etanol al 99 % (Panreac Applichem cat. no. 131086-1214), 0.4 mL de agua Milli-Q y 25 uL de hidróxido de amonio (Sigma-Aldrich cat. no. 221228). La mezcla se agitó a temperatura ambiente (RT) durante 5 min. A continuación, se añadieron 2.5 pL de 3-aminopropiltrietoxisilano (APTES) al 99 % (Sigma-Aldrich cat. no. 440140) a la solución, que se incubó durante 6 h, con agitación y a RT. A continuación, se añadieron 7.5 pL de tetraetilortosilicato (TEOS) > 99 % (Sigma-Aldrich cat. no. 86578) y la mezcla resultante se dejó reaccionar durante la noche a RT con agitación magnética. Las micropartículas resultantes que consisten de poliestireno recubierto con una cubierta de dióxido de silicio se lavaron en etanol tres veces, al centrifugarlas a 3500 rpm durante 3.5 min. A continuación, se eliminó el núcleo de poliestireno al incubar las partículas mediante la realización de 4 lavados en dimetilformamida (DMF) > 99.8 % (Acros Organics cat. no. 423640010) durante 15 min. Las microcápsulas resultantes se lavaron tres veces en etanol y se almacenaron a temperatura ambiente hasta su uso. Para caracterizar el tamaño y la morfología de las microcápsulas, se realizaron Microscopía Electrónica de Barrido (SEM) (FEI NOVA NanoSEM 230) y Microscopía Electrónica de Transmisión.
Funcionalización de nanointerruptores de ureasa y ADN
Se funcionalizaron microcápsulas huecas de sílice con ureasa para proporcionarles autopropulsión. Para ello, se lavaron tres veces las microcápsulas de SiO2 con Milli-Q al centrifugarlas a 3500 rpm durante 3.5 min. Después de eso, se realizaron tres lavados más en solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH=7.4) (Thermo Fischer Scientific cat. no. 70011-036). A continuación, se suspendieron las microcápsulas en una solución de glutaraldehído al 2.5 % (en peso) en PBS (Sigma-Aldrich cat. no. G6257) y se dejaron a Rt durante 3 h bajo mezcla de extremo a extremo. Las partículas funcionalizadas con GA se lavaron 3 veces en PBS 1x y se suspendieron en una solución que contenía 200 jg/mL de ureasa deCanavalia ensiformis(frijol Jack) (Sigma-Aldrich cat. no. U4002) y andamio de<a>D<n>1 jM , en PBS. La solución resultante se mantuvo bajo mezcla de extremo a extremo durante 2 h. Luego, se realizaron tres lavados en PBS y las partículas funcionalizadas se mantuvieron a 4 °C hasta su uso.
Análisis de movimiento
Los micromotores se grabaron durante 20 s a una velocidad de 25 fotogramas por segundo bajo un microscopio óptico invertido (Leica DMi8) equipado con un objetivo de inmersión en agua de 63x y una cámara hammamatsu. Para cada condición, se grabaron al menos 15 partículas. Las trayectorias de los micromotores se analizaron mediante un código personalizado basado en Phyton, que permitió calcular el MSD y la velocidad de los motores, al aplicar la siguiente ecuación:
MSD(At) =<(x i( t A t) - Xi( t ) ) 2 >(1)
Al ajustar el MSD a la ecuación 1, se obtuvo la velocidad.
Medición de la actividad de la ureasa
La actividad enzimática se midió mediante el uso del estuche de actividad de la ureasa (Sigma-Aldrich), que se basa en el método de Barthelot, un ensayo colorimétrico para medir la producción de amoníaco mediante la actividad de la ureasa, al seguir las instrucciones del fabricante. Primero, los micromotores se incubaron con urea 100 mM. Luego, en diferentes momentos, la reacción enzimática se detuvo al seguir las instrucciones del fabricante. Posteriormente, para evitar la interferencia de las partículas con las medidas, las muestras se centrifugaron durante 3.5 min a 3500 rpm. Se recolectaron los sobrenadantes de cada muestra y se midió la absorbancia a 670 nm para determinar la actividad de la ureasa.
2.2. Resultados y discusión
Se sintetizaron microcápsulas huecas de sílice con grupos amina en la superficie de acuerdo con un método de condensación conjunta previamente informado (Ma, X. y otros, “Motion Control of Urea-Powered Biocompatible Hollow Microcapsules”,ACS Nano,2016, vol. 10(3), pp. 3597-3605), en base al crecimiento de una cubierta de SiO<2>sobre micropartículas de poliestireno comerciales de 2pm 0 mediante el uso de 3-aminopropiltrietoxisilano (APTES) y tetraetilortosilicato (TEOS) como precursores de sílice, seguido por la eliminación del núcleo de poliestireno por dimetilformamida, como se muestra en la figura 5A.
La ureasa se conjugó covalentemente a la superficie del micromotor mediante el uso de glutaraldehído (GA) como enlazador como se describe en el ejemplo 1. Durante esta etapa, también se conjugó un ADN de simple cadena modificado con amino (ADNss, 20 bases), que sirvió como resto de anclaje para el nanointerruptor de ADN sensible al pH (figura 5B). La figura 5C muestra una representación esquemática de la estrategia de detección de pH en base a los estados abierto/cerrado del nanointerruptor de ADN, que causa eficiencia de FRET baja o alta, respectivamente. Las microcápsulas huecas resultantes se estudiaron mediante microscopía electrónica de barrido y de transmisión (SEM y TEM, respectivamente). La figura 5D muestra una micrografía SEM donde se pueden observar microcápsulas con un tamaño muy monodisperso (2.04 ± 0.06 pm, media ± error estándar de la media) y una superficie rugosa. Las microcápsulas mostraron un agujero en su superficie, probablemente debido a la proximidad de las partículas durante el crecimiento de la cubierta de sílice, como se informó anteriormente, que proporciona una asimetría estructural. La figura 5E muestra una imagen topográfica obtenida por TEM, donde los diferentes pseudocolores indican la altura, en pm.
El proceso de funcionalización se caracterizó al medir el potencial Z de las micropartículas después de cada etapa (figura 5F). Primero, las microcápsulas mostraron una superficie cargada positivamente debido a la presencia de grupos amina, que luego se cambió a cargada negativamente debido a la modificación con GA. Después de la adición de ureasa, las cargas superficiales se redujeron ligeramente. La funcionalización con ureasa y ADNss (UR ADNss) también resultó en una disminución del potencial Z con respecto a GA.
Finalmente, las micropartículas se incubaron en solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contenía el nanointerruptor de<a>D<n>(es decir, 1 pM). Una incubación de 15 minutos del nanointerruptor con los motores conjugados enzima/cadena de anclaje fue suficiente para funcionalizar las partículas de sílice con el nanointerruptor sensible al pH. Es de destacar que el interruptor presenta una cola de flanqueo de 20 bases de largo en el extremo 5' de la secuencia complementaria con ADNss conjugado covalentemente en la microcápsula de sílice. Como resultado de la conjugación, se ha medido una disminución adicional de las cargas superficiales y se confirma la funcionalización eficaz del motor con el interruptor. También es digno de mención que el nanointerruptor de ADN sensible al pH empleado aquí es un ADN de simple cadena formador de triple que contiene una horquilla de ADN intramolecular estabilizada con interacciones de Watson-Crick y Hoogsteen paralelas. Mientras que las interacciones de Watson-Crick (W-C) son efectivamente insensibles al pH, las interacciones Hoogsteen muestran una fuerte y programable dependencia del pH (figura 6A). Al marcar con un par FRET el nanointerruptor, podemos monitorear la transición de triple a dúplex dependiente del pH que puede usarse para determinar el pH de la solución en las proximidades de los micromotores. Más específicamente, un fluoróforo de cianina-3 (Cy3) se conjuga internamente en el lazo del ADN dúplex de horquilla y un fluoróforo de cianina-5 (Cy5) se une en el extremo 3' de la porción de ADN que forma el triple.
Los ensayos de fluorescencia realizados a una concentración fija (es decir, 50 nM) del interruptor de ADN al variar el pH de la solución tampón en una microcubeta de fluorescencia (solución de 100 pL) muestran claramente cambios en la eficiencia de FRET en función del pH. Como era de esperar, a valores de pH ácido, se favorece la estructura triple intramolecular y se observa una alta eficiencia de FRET (Cy3 y Cy5 se acercan mucho). A medida que aumenta el pH de la solución, la estructura triple se desestabiliza y se observa una disminución gradual de la señal de FRET debido a la transición (desplegamiento) de triple a dúplex (figura 6A). Como nota, los fluoróforos empleados aquí no son sensibles al pH en el intervalo de pH investigado (desde pH 5.0 a pH 9.5) para evitar cualquier interferencia en la señal. Es importante tener en cuenta que esta clase de interruptores basados en triple muestran cinéticas de apertura/cierre lo suficientemente rápida como para permitir el monitoreo en tiempo real de la variación del pH (constante de tiempo promedio ~100 ms).
Para probar la funcionalidad del interruptor una vez conjugado con los micromotores, se monitoreó la eficiencia de FRET a través de un microscopio de barrido láser confocal Leica-SP5 (CSLM) equipado con un objetivo de inmersión en aceite de 63x (figura 6B). Para esto, los micromotores se suspendieron en PBS a pH 5 o pH 9 y se colocaron en una placa de 8 pocillos con fondo de vidrio para su análisis bajo CSLM. La emisión del donante (Cy3) se grabó mediante el uso de un láser de diodo de 564 nm. La imagen de FRET se obtuvo al excitar el fluoróforo Cy3 y detectar la emisión del aceptor (Cy5). Mediante el uso de un complemento ImageJ hecho a medida, se logró la cuantificación de la eficiencia de FRET al calcular la relación FRET/Cy3.
Estos resultados indicaron que los micromotores modificados con nanointerruptores de ADN fueron capaces de detectar cambios de pH en su entorno circundante. Para demostrar la especificidad de la detección del pH y descartar cualquier efecto del pH en la intensidad de la fluorescencia, se modificaron los micromotores con un interruptor de control, que no respondía a los cambios de pH. Las figuras 6C y 6D muestran la cuantificación de la emisión de FRET/Cy3 de micromotores modificados con un nanointerruptor de ADN sensible al pH (figura 6C) o un nanointerruptor de ADN no sensible al pH (figura 6D). Específicamente, como una sonda no sensible al pH, se seleccionó un ADN de simple cadena que contiene la misma horquilla de ADN intramolecular estabilizada a través de interacciones WC y una cola de ADN revuelta que no permite el plegamiento triple. Como era de esperar, no se encontraron diferencias significativas al usar el nanointerruptor no sensible al pH que presenta una alta eficiencia de FRET en todos los pH evaluados.
La dinámica de movimiento de los micromotores huecos doble funcionalizados con ureasa y nanointerruptor de ADN se analizó mediante grabación óptica en ausencia o presencia de urea 100 mM que actúa como combustible. Para esto, se usó un microscopio de fluorescencia invertido Leica DMi8 equipado con un objetivo de inmersión en agua de 63x y una cámara Hamamatsu. Se registraron al menos 15 micropartículas por condición durante 20 s a una velocidad de 25 cuadros por segundo (FPS). Mediante el uso de un código basado en Python, se rastrearon las trayectorias de los micromotores y, a partir de las trayectorias, se calcularon los MSD de acuerdo con la siguiente ecuación:
MSD(At) =< (Xi(t At) - Xi(t))2 >(1)
donde i=2 para análisis 2D. Tras la adición de sustrato de urea, el MSD muestra una forma parabólica, que corresponde a un régimen de propulsión de una micropartícula activa.
Sin embargo, en ausencia de combustible, solo se observa un movimiento browniano que da como resultado un ajuste linear, lo que indica que el movimiento surge de la reacción catalítica en la superficie de los micromotores. Se encontró que la velocidad de las partículas propulsoras era de 6.4 ± 0.6 pm/s (media ± error estándar de la media), calculada al aplicar la siguiente ecuación:
M SD(t) = 4Dtt v2t2,(2)
dondeDt=coeficiente de difusión, v=velocidad y t=tiempo.
Sorprendentemente, esta velocidad es comparable a las microcápsulas asimétricas Janus impulsadas por enzimas descritas anteriormente (Ma X. y otros, supra)y ligeramente superior a las micropartículas no Janus (Patiño T. y otros, supra). Sin estar unido a ninguna teoría, este efecto podría ser causado por la asimetría proporcionada al coinmovilizar el nanointerruptor de ADN y enzimas alrededor de las partículas de una manera estocástica.
La capacidad de los micromotores para registrar simultáneamente los cambios de pH locales producidos mientras son autopropulsados se evaluó al combinar el seguimiento óptico y las imágenes de FRET mediante el uso de CSLM, donde se grabaron videos de 25 s a 3FPS. En ausencia de combustible, se observó una relación FRET/Cy3 media de 1.8 ± 0.09 (media ± error estándar de la media). Cuando se añadió urea a la solución, la relación FRET/Cy3 disminuyó inmediatamente a 1.5 ± 0.05, lo que indica un aumento del pH debido a la actividad de los micromotores. No se observaron diferencias significativas en la relación FRET/Cy3 durante los 25 s de grabación. En ausencia de combustible, los micromotores solo mostraban un movimiento browniano y una relación FRET/Cy3 cercana a 2. Por el contrario, en el caso de los micromotores expuestos a urea, la relación FRET/Cy3 ya estaba disminuida en el momento del análisis (0 s), lo que indica que el pH ya había cambiado como la reacción enzimática basada en ureasa tiene lugar inmediatamente después de la adición del sustrato de urea, lo que induce un cambio de pH local alrededor de las partículas, que se detecta instantáneamente.
Estos resultados demuestran las capacidades de los micromotores activos modificados con ADN para detectar el microambiente que los rodea mientras producen una reacción química continua para la autopropulsión.
Para obtener información sobre el cambio instantáneo de pH alrededor de los micromotores desde el momento inicial de la reacción, los micromotores se inmovilizaron sobre una superficie de vidrio mediante el uso de APTES como agente de recubrimiento para proporcionar cargas superficiales positivas y estabilizar las interacciones electrostáticas con los micromotores cargados negativamente. Los micromotores inmovilizadores permitieron visualizar los mismos micromotores antes y después de la adición de combustible, así como el análisis en periodos de tiempo más largos (2 min y 10 min) antes de que dejaran fuera la región de interés.
Las figuras 7A y 7B muestran el MSD y la velocidad promedio, respectivamente, obtenidos del seguimiento óptico de los motores. Se puede observar claramente una disminución continua del MSD y la velocidad. Curiosamente, mientras la velocidad disminuyó con el tiempo, el pH continuó el aumento hasta 10 min., cuando se encontró que la velocidad era cercana a 0.
Estos resultados sugieren que la disminución de la velocidad no se atribuyó directamente a una disminución en la actividad enzimática y otros factores tales como la generación de productos iónicos tras la descomposición de la urea o el pH alto no ideal para la reacción enzimática, podrían afectar las dinámicas del movimiento.
El uso de la nanotecnología de interruptor de ADN permite la detección de pH en el microambiente de los motores y también puede usarse para controlar su propia actividad cuando se usan enzimas que inducen cambios de pH tales como la ureasa. Por lo tanto, la integración de herramientas de biodetección en motores impulsados por enzimas proporciona nuevos conocimientos no solo para su aplicación como sensores, sino también para monitorear su actividad intrínseca de los micromotores para comprender su dinámica y mecanismo de movimiento. Además, la alta versatilidad del ADN y las enzimas permite ajustar las propiedades de los micromotores para una amplia gama de aplicaciones.
2.3. Conclusiones
Los datos aquí proporcionados demuestran el potencial de combinar la tecnología de ADN con micronadadores biocatalíticos para generar sistemas activos e inteligentes capaces de autopropulsarse simultáneamente mientras detectan su entorno circundante. El análisis preciso y cuantitativo de los cambios de pH alrededor de la superficie de los micromotores tras su activación en presencia de combustible se logró a través del uso de un nanointerruptor de ADN sensible al pH y la obtención de imágenes de FRET mediante microscopía confocal. Los cambios de pH locales y la dinámica de movimiento de los micromotores se analizaron simultáneamente en presencia de combustible a 30 s, 2 min. y 10 min. El pH aumentó continuamente mientras que la velocidad se redujo exponencialmente, lo que indica que otros factores en lugar de la actividad enzimática podrían afectar la autopropulsión de los micromotores.
Estos resultados resaltan la relevancia de la detección simultánea por micromotores de manera precisa y cuantitativa no solo para monitorear los cambios del microambiente sino también como un indicador de actividad. Las direcciones futuras conducirán a la detección de cambios tisulares intracelulares o localizados en el pH y otros analitos. Además, esta tecnología sinérgica abrirá el campo a micromotores multifuncionales donde los cambios de pH desencadenarán la liberación de cargas mediante plataformas de acción sensorial.
Listado de citas
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Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un nanomotor impulsado por enzimas, que comprende:
- una partícula con una superficie;
- una dicha enzima; y
- una molécula heteróloga que es diferente a la enzima;
caracterizado porque la enzima y la molécula heteróloga están unidas de forma discontinua sobre toda la superficie de la partícula.
2. Un nanomotor de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la partícula es una nanopartícula o una micropartícula.
3. Un nanomotor de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en donde la partícula está hecha de un material seleccionado del grupo que consiste de metal, óxido metálico, polímero, lípido, proteína, membrana celular, cuerpo celular, material carbonoso y mezclas de los mismos.
4. Un nanomotor de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde la partícula está hecha de sílice mesoporosa.
5. Un nanomotor de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde la enzima se selecciona del grupo que consiste de glucosa oxidasa, ureasa, catalasa, glutamato oxidasa, xantina oxidasa, peroxidasa, bilirrubina oxidasa, lipasa, proteasa, hexoquinasa, acetilcolina esterasa y tripsina.
6. Un nanomotor de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde la molécula heteróloga se selecciona del grupo que consiste de una molécula dirigida, una molécula marcadora, un nanosensor y una puerta molecular.
7. Un nanomotor de acuerdo con la reivindicación 6, en donde la molécula dirigida es un anticuerpo.
8. Un nanomotor de acuerdo con la reivindicación 6, en donde el nanosensor es un nanointerruptor de ADN.
9. Un nanomotor de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, que comprende además una carga.
10. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz del nanomotor como se definió en cualquiera de las reivindicaciones 1-9, y un excipiente y/o portador farmacéuticamente aceptable.
11. El nanomotor como se definió en cualquiera de las reivindicaciones 1-9, o la composición farmacéutica como se definió en la reivindicación 10, para el uso en terapia, diagnóstico o pronóstico.
12. El nanomotor o la composición farmacéutica para el uso de acuerdo con la reivindicación 11, que es para el uso en el tratamiento del cáncer.
13. El nanomotor o la composición farmacéutica para el uso de acuerdo con la reivindicación 12, en donde el cáncer es cáncer de vejiga.
14. Un kit de partes que comprende:
- un nanomotor como se definió en cualquiera de las reivindicaciones 1-9 o la composición farmacéutica como se definió en la reivindicación 10, e
- instrucciones para su uso.
15. Un método in vitro para detectar un analito en una muestra aislada, que comprende poner en contacto el nanomotor como se definió en cualquiera de las reivindicaciones 1-9 con la muestra.
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